CHLORELLA

1) Objectif :
Lobjectif de ce projet est la cration et loptimisation dun photo-bioracteur en continu,
qui permettra la culture et la multiplication dalgues (Chlorella vulgaris), dans le but de les
valoriser par la suite (composs haute valeur ajoute) en extrayant de celles-ci le bta-
carotne par exemple.
2) Prsentation de lalgue utilise :
La Chlorella fait partie de la famille des micro-algues deau douce, apparues sur notre
plante il y environ 2,5 milliards dannes.
Cette petite algue microscopique est un des plus anciens organismes vivant sur notre
plante.

Les organismes appels chlorellaces appartiennent au phylum chlorophyta (algues vertes),
lui-mme inclus dans la classe des trbouxiophyces.

Aujourd'hui, les botanistes considrent que trois espces constituent le groupe Chlorella :
- C. vulgaris
- C. lobophora
- C. sorokiniana

Les chlorellaces quant elles, se divisent en deux groupes apparents : le groupe des
parachlorelles et le groupe des chlorelles, dont fait partie Chlorella vulgaris.
Le genre Chlorella fut dcouvert en 1890 par un microbiologiste hollandais, M.W. Beijerinck.
Il sagit de micro-algues vertes unicellulaires de 2 10 m. Elles sont dun vert profond, du
fait de leur haute teneur en chlorophylle.
Grce la photosynthse, elles peuvent se multiplier rapidement, en ne requrant que du
dioxyde de carbone, de leau, de la lumire et une petite quantit de minraux.




3) Applications :
Elle est utilise des fins alimentaires, du fait de sa grande teneur en protines
(50 %). Elle contient, en outre, de nombreuses vitamines et acides gras essentiels.

Dans certains conditions, elle peut stocker de grandes quantits de lipides,
jusqu 80% de son poids sec. Des recherches sont en cours afin de produire des
biocarburants lipides partir dalgues (projet Shamash).

Ces deux perspectives exploitent le haut pouvoir de division de cette algue, qui est de quatre
divisions toutes les 24 heures.
4) Matriel et mthode :

1 erlenmeyer de 1l
1 erlenmeyer de pompe vide de 1l
1 grand rcipient en verre de 5l
1 pompe dbit constant et 1 pompe dbit rglable (rgl 5% de sa capacit, car
nous avons une bonne division des algues en 40h. Etant donn que nous travaillons
avec 2l, il nous faut un apport de 50ml/h)

2m de tuyaux en plastique de 19mm de diamtre intrieur
2m de tuyaux en plastique de 13mm de diamtre extrieur
1m de tuyaux en plastique de 8mm de diamtre extrieur
60 cm de tuyaux en plastique de 6mm de diamtre extrieur
8m de tubes en verre de 19mm de diamtre extrieur
1 pompe air daquarium pour le bullage dO
2

Un support en bois (5 planches de bois, 8 querres et des vis)
2 bouchons de silicone

5) Ractifs :
Milieu de culture (voir description plus bas)

NaOH (3%)


6) Calculs :
Ce que nous recherchons : la longueur des tuyaux en verre (H). Nous travaillons avec 2l
(2000cm
3
) de milieu de culture et nous avons notre disposition des tuyaux de 19mm de
diamtre intrieur.
Volume cylindre : x.r
2
.H = > H = 2000/x0,7
2
= ?m
7) Mise en place du dispositif :

a) Strilisation (CIP) :

- Nous utilisons un autoclave pour la strilisation des milieux de culture.
- Pour la strilisation du photo-bioracteur : faire passer une solution de NaOH de
concentration 3% et rincer ensuite 2X laide deau distille.
Rem : pour commencer, nous avons utilis une solution dH
2
O
2
0,2%, suivi de deux rinages
leau dminralise pour la strilisation. Mais nous avons abandonn cette technique, car
nous avons eu un problme de croissance des algues (aucune croissance observe). Nous
avons donc prfr changer le mode de strilisation, de crainte que les traces dH
2
O
2

restantes aprs les rinages naient eu pour effet de tuer les algues. En effet, nous avions
ajust le pH 7,55 grce lajout dacide lactique concentr. Celui-ci tait donc correct pour
la croissance des algues et nous avons test larrt de lagitation, afin de voir son influence
sur la croissance (aucune influence observe). Nous avons aussi chang les nons (utilisation
au dbut de nons 2 longueurs dondes, prvus pour lhorticulture), mais nous navons
remarqu aucune influence. Les seuls problmes possibles taient donc la prsence dH
2
O
2
ou le manque daration (pour cela, nous avons ajout une pompe air daquarium). Nous
utilisons donc du NaOH dune concentration de 3%, qui est moins agressif et qui, combin
avec les restes ventuels dH
2
O
2
, va produire de leau.
b) Milieu de culture et facteurs de croissance :
Le milieu de culture de base fourni avec les algues est le suivant :

Placer dans un ballon jaug 500g de terre de jardin (sans pesticides) et ajouter 1 l deau ultra
pure.

Autoclaver 30 minutes 121C. Filtrer sur papier filtre 1m et autoclaver le liquide obtenu
30 minutes 121 C. Conserver 4C.

Ajouter 1900 ml deau ultra pure les quantits suivantes :

volume compos quantit
20 ml Extrait de terre

20 ml K
2
HPO
4
4g/l
20 ml Mg SO
4
3g/l
20 ml CaNO
3
3g/l
4 ml FeCl
3
0,25g/l
20 ml KNO
3
20g/l
2 ml Vitamine (sol.)

Complter 2 l avec de leau ultra pure et autoclaver 30 minutes 121 C. Ensuite, passer le
milieu sur membrane filtrante 0,2m et conserver 4C.

Prparation de la solution de vitamines :
Dans un ballon jaug de 1l, ajouter les quantits suivantes, porter au volume avec de leau
ultra pure et homogniser.
- 6 gr de thiamine (B1)
- 1 gr de biotine (B8)
- 1 gr de cyanocobalamine (B12)
Cependant, des recherches sont effectues pour amliorer ce milieu de culture, en essayant
de remplacer les 500g de terre de dpart, car ce nest pas pratique dutilisation et nous ne
pouvons pas facilement savoir si elle contient ou pas de pesticides.

Le rsultat qui ressort de ces recherches nous montre que le milieu optimal est un milieu
sans extrait de terre, avec aration et la solution de vitamines :

Pour un litre : ajouter 950 ml deau ultra pure les quantits suivantes :

volume compos quantit
10 ml K
2
HPO
4
4g/l
10 ml Mg SO
4
3g/l
10 ml CaNO
3
3g/l
2 ml FeCl
3
0,25g/l
10 ml KNO
3
20g/l
1 ml Vitamine (sol.)

Nous avons donc remis en route un nouvel inoculum dans le photo-bioracteur
(aprs strilisation avec le NaOH) avec ce milieu de culture, une aration continue
et un pH de 7,66.

Au dpart, nous plaons 0,5g dalgues dans 1l de milieu de culture (concentration
trouve dans la littrature) et nous les laissons se multiplier pendant 1 semaine
environ. Ensuite, nous rajoutons du milieu via un autre erlen grce une pompe
dbit constant (50ml/h). Au del dun certain temps, il y aura donc un trop plein, qui
sera rcupr par gravitation et rcolt dans un erlenmeyer. Cest ce surplus,
contenant les algues, qui sera utilis par aprs pour extraire par exemple les F
carotnes.

En ce qui concerne la photopriode, nous avons laiss un clairage de dure
maximale, car les algues nont pas spcialement besoin de priode sans lumire. Les
algues seront donc claires par trois nons de 30W, ce qui daprs la littrature est
suffisant.

La temprature idale pour la multiplication est denviron 24C, ce qui est la
temprature ambiante lintrieur de la pice de culture.

Ajuster le pH sil le faut, pour quil soit aux alentours de 7-8.

c) Schma de linstallation :



Dtails pratiques :
- Les erlenmeyers sont ferms par des bouchons en silicone percs.

- La pompe prlevant le milieu de culture est une pompe dbit rglable (nous la
rglons 5% de sa capacit). Lautre pompe est une pompe dbit fixe, qui a un
dbit plus grand que la prcdente.

- Les tuyaux qui relient les diffrents lments, les jonctions entre les tubes en verre et
les coudes sont raliss laide de tuyaux en plastique flexibles.

- La partie solar collector, est celle o se droulera la majorit de la photosynthse et
donc la partie o se droule la majorit de la multiplication des algues. Elle est
compose de 8m de tubes en verre incolore de 19mm de diamtre sur un support en
bois, le tout expos 3 nons de 30W. Le dessous des tubes est recouvert de mylor,
afin de rflchir la lumire et ainsi avoir une meilleure exposition celle-ci.

- Pour vider linstallation, nous retirons le bouchon du tube en verre de sortie et nous
inclinons le montage. Pour amliorer ce systme il faudrait ajouter un petit T
chaque bout de tube en verre, pour avoir une sortie ouvrable chaque tube du
photo-bioracteur.

- Nous avons remarqu quavec la croissance des algues, des dpts se posent dans le
fond (photos ci-dessous) des tubes en verre ce qui rend la rcupration de ces algues
difficile. Cela est d au dbit de la pompe qui nest pas suffisant. Une solution serait
dutiliser des pompes plus puissantes qui creraient ainsi un flux plus important ce
qui emporterait les algues en empchant ainsi ces dpts. Une autre solution serait
dutiliser un photo-bioracteur avec des tubes verticaux ce qui provoquerait des
dpts dalgues dans le fond des tubes, ceux-ci seraient donc plus facile rcuprer.



d) Photos dtailles de linstallation :




Pompe air
Erlenmeyer
contenant le milieu
de culture ajouter
par la suite.






























Pompe
dbit fixe
Pompe
dbit rglable
Erlenmeyer o lon injecte le milieu de culture ainsi que linoculum dalgue et o laration seffectue.
Grce notre pompe dbit fixe, ce milieu est prlev et envoy dans la partie Solar collector pour
ensuite revenir dans cette erlenmeyer, nous avons donc un circuit en boucle.
Partie dinjection
dans le solar
collector
Solar collector
clair par 3
nons de 30W
Rcipient pour
la rcupration
du surplus
Jonctions entre
les diffrents
tubes de verre








8) Conclusion :
Dans le cadre de ce projet nous avons dabord d effectuer des recherches thoriques sur le
sujet pour ensuite passer sa ralisation pratique avec une srie de problmes techniques
que nous avons d rgler sur le moment mme. Malgr cela nous avons russi mener
bien la construction de notre photo-bioracteur ave le matriel mis notre disposition.
Une fois lexprience lance nous avons observs quelques problmes pratiques et nous
avons ainsi rflchi aux amliorations possibles amener notre installation comme
lutilisation de pompes plus puissantes et un systme plus pratique pour vider ce photo-
bioracteur une fois son utilisation termine.
Etant donn que ctait la premire fois que nous travaillons avec des algues, nous navions
pas normment de connaissance sur le sujet et nous nous sommes vite rendu compte
quun ou plusieurs facteurs empchaient la survie et la croissance des algues dans notre
installation. Nous avons donc rflchi aux diffrentes causes possibles et nous avons pu ainsi
ajuster notre mthode en apportant une aration continue, en utilisant un milieu de culture
optimal et en changeant notre systme de dsinfection. Nous avons donc relanc une 2
me

exprience qui a t concluante, la croissance des algues tant nettement visible aprs 2
jours, ctait bien le ou les paramtres de laration et /ou du systme de dsinfection qui
posaient problme.
Ce projet nous a permis de nous retrouver dans une vraie situation de recherche ce qui nous
semble enrichissant pour le futur. Nous nous sommes retrouvs face certains problmes
que nous voulions rsoudre pour aboutir notre objectif ce qui nous a amen effectuer
des changements, tester diffrents paramtres pour enfin arriver au bon fonctionnement
de notre photo-bioracteur avec une croissance satisfaisante dalgues. Ce projet nous a donc
paru trs motivant car il a t totalement imagin, fabriqu et amlior grce notre
imagination, nos recherches, nos observations et nos rflexions.




Tube de verre
constituant le
solar collector
Dpts dalgue







Protocoles du suivi de la croissance des algues Chlorella :

1 Mesure de la densit optique :

Les algues vertes possdent comme pigments les chlorophylles A+B et les carotnodes.
Les chlorophylles et les carotnodes absorbent dans la gamme de longueurs d'onde visibles,
comprises entre 500 et 700 nm.

Matriel :
- 2 tubes en verre
- 2 pipettes jauges de 10ml + poire
- Spectrophotomtre UV-visible

Protocole :
a) Prlever 10ml de milieu de dpart et le placer dans un tube en verre (propre et sec). Celui-ci
servira de blanc.
b) Prlever ensuite 10ml de milieu final, cest--dire celui qui se trouve dans le surplus. Le
placer lui aussi dans un tube en verre.
c) Effectuer dans une petite cuvette en verre un balayage entre 500 et 700nm au
spectrophotomtre, avec un peu de milieu rcolt dans le surplus, afin de dterminer la
longueur donde optimale laquelle travailler.
d) Une fois la longueur donde dtermine, placer le tube contenant le blanc, laisser lappareil
se stabiliser et ensuite le mettre 0. Attention bien mesurer en absorbance et non en
transmittance.
e) Rpter la mme opration avec le milieu rcolt dans le surplus. Cette fois ne pas remettre
0 mais noter la valeur de la DO lue sur lappareil.
f) Rpter cette opration autant de fois que ncessaire au cours de la culture et intervalles
rguliers.


2 Mesure du taux de matire sche :

Matriel :
- Plaquettes daluminium
- Balance analytique => utiliser plutt la balance de lappareil de schage
- Appareil de mesure de la matire sche

Protocole :
a) Prlever exactement 1g ( adapter si ncessaire) dalgues dans le surplus, sans prendre trop
de milieu en mme temps. Hacher finement si ncessaire.
b) Les placer sur une petite plaquette daluminium. Peser la coupelle avant schage, laide de
la balance de lappareil de schage.
c) Scher le tout 80C en plaant cette plaquette dans lappareil.
d) Programmer un schage de 5 minutes. Se rfrer au mode demploi pour la programmation.
Recommencer si ncessaire jusqu un poids constant.
e) Repeser la coupelle sche.
f) Faire le rapport des 2 masses et calculer le % de MS de la quantit dalgues pese.

3 Corrlation entre la DO, la MS et la cellule de Thoma :

Grce une cellule de Thoma, nous alors pouvoir vrifier la rciprocit des rsultats obtenus via la
mesure de la densit optique et de la matire sche.

Matriel :
- La cellule de Thoma se prsente comme une lame porte-objet sur laquelle on a trac 16
grands carrs, lintrieur desquels sont tracs 16 petits carrs destins aider la lecture.
- Lamelle en verre
- Microscope

Protocole :
a) Prlever 1ml dchantillon dalgues dans le surplus et le placer dans un tube essai.
b) Diluer si ncessaire pour faciliter le comptage et homogniser.
c) Remplir la cellule de Thoma
d) Poser une lamelle couvre-objet avant de passer au microscope.
e) Compter le nombre dalgues prsentes dans chacune des 16 cellules dun grand carr.
Sachant que 1 grand carr est gal 1/250mm
3
(0,004mm
3
), dterminer la concentration en
algues/ml.
Attention bien tenir compte dune ventuelle dilution.
Exemple : si on compte 10 algues par petit carr. Cela fait 160 algues pour un grand carr. Soit
160x16 algues dans une cellule de Thoma. Etant donn que le volume total dune cellule de Thoma
est de 0,1mm
3
, cela reprsente donc 25600 algues/mm
3
. Soit 25600000 algues/ml.

4 Teneur en huile des algues produites :

70% de teneur en huile si extraction par pressage, jusque 99% si utilisation dun solvant organique.
Ractifs et matriel :
- Sulfate de sodium anhydre (Na
2
SO
4
)
- Cyclohexane
- Extracteur
- Cuvettes dextraction
- Pilon + mortier
- Balance analytique
- Etuve 102C
Protocole :
Dosage de la teneur en matire grasse (huile):
a) Extraction Soxhlet
Attention bien tarer les cuvettes dextraction avant de les remplir ! Pour raliser lextraction, suivre
le protocole donn par le fabriquant et utiliser les paramtres suivants :
- Poids de lchantillon : 5g dalgues broyes + 5g de sulfate de sodium anhydre
- Solvant : cyclohexane
- Temprature du bain : entre 140 et 150C
- Dure dextraction immerge : 1h
- Dure dextraction suspendue : 2h
(Autre extraction possible : digestion de lalgue par du carbonate de sodium ?)
b) Dtermination de la matire grasse
Lextraction termine, mettre les cuvettes dextraction scher durant 2h 102C jusqu obtenir un
poids constant.
Dterminer partir de ce poids la teneur en matire grasse (huile) des algues par rapport la masse
introduite au dpart, en %.