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Purification Des Prot Ines
Purification Des Prot Ines
1- mesure de l'absorption UV
Les acides amins aromatiques absorbent la lumire dans l'UV. Le maximum
d'absorption lieu 280 nm (W). En mesurant la D.O (densit optique). On peut
revenir la concentration de protine.
:coefficient d'extinction molaire (mol/cm)
A log(
It
) .C.l
Io
Loi de Beer-Lambert
C : concentration (Mol)
l : longueur de la cuve (en gnrale 1 cm)
il faut connatre le coefficient d'extinction molaire. Il faut que la solution soit homogne.
Le coefficient d'extinction molaire est dduit exprimentalement ou connu;
On peut aussi facilement avoir une valeur approximative partir la squence de la
protine.
1mg protine/ml a une absorbance 280 nm d'environ 0.5-2.
Avantage:
Bonne sensibilit (50-100 g)
Facile mette en place
Non destructif
Dsavantage:
Peu adapt au mlanges
Sensible au contamination (ex ADN 260nM, tampon).
L'absorption du tryptophane est module par l'environnement (pH, force ionique)
Mthode exprimentale.
On a une protine de rfrence. En gnrale la BSA (Bovine serum albumin).
On fait une gamme de dilution de 20g/ml 2mg/ml (gamme talon).
On met l'chantillon et la gamme talon au contact des ractif (BCA).
On laisse incuber 30 min 37C
( cette temprature la rduction du cuivre est proportionnelle au nombre de liaisons
peptidiques)
On mesure l'absorbation 562nm. On utilise comme cuve de rfrence un tube sans
protine pour faire le blanc.
La mesure de la DO report sur la courbe talon indique la concentration en protines
de l'chantillon.
Absorbe 410 nm
Avantage:
On peut mesurer la concentration de l'enzyme mme dans un mlange complexe.
C'est un dosage trs utilis en mdecine (ex phosphatase alcaline)
Inconvnient:
Applicable seulement aux enzymes
Il faut une mthode (simple) de mesure de l'activit (substrat chromophorique).
Il faut le faire dans de conditions prcises.
La mesure sera perturbe si plusieurs enzymes dans la solution catalyse la mme
raction
Les anticorps possdent une partie constante sur la chaine lourde qui peut tre
reconnue par d'autres anticorps (anticorps anti-souris, anti-lapin, anti chvre,).
Ces anticorps sont coupl chimiquement des enzymes qui serviront de marqueurs.
ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay).
Enzyme
La peroxydase
Cette raction met des photons.
Dtection par film photos ou camera CCD
C'est une mthode trs sensible
Mthode.
protine
On fixe la solution d'intrt sur la plaque
On sature la plaque avec des protines (lait) pour viter une fixation aspcifique
On incube avec l'anticorps spcifique qui se fixe sur l'antigne.
On incube avec L'anticorps anti-anticorps qui fixe sur le premier anticorps.
On mesure la raction (absorption ou la lumire mise) et peut obtenir la concentration grce
un talonnage
Avantages:
Trs prcis
Trs sensible en particulier avec la peroxydase
automatisable
On a pas besoin de purifier la protine pour la doser
Inconvnients.
Ncessite des anticorps spcifiques
Un peu lourd mettre en place
Electrophorse
Plus la concentration de polyacrylamide est importante, plus les pores seront petits
et plus il sera difficile aux proteines de grande taille de se mouvoir.
En gnral on fait des gels de 5 15% de polyacrylamide
PAGE -natif
Si le pH est en dehors du points isolectrique, une protine est charge.
Ngatif si pH > PI
Positif si PH< PI
Ainsi si on place une protine dans un gel de polyacrylamide et dans un champs
lectrique, elle va migrer.
Il y a une force proportionnelle la charge et une force (frottement) proportionnelle
la taille de la protine
Force de coulomb Felec= Z. E
Champs lectrique
Charge de la protine
Coefficient de viscosit
Ffrot
gnrateur
Felec
vitesse
Comme tout frottement, la vitesse va s'quilibrer lorsque les frottement seront gaux
la force de coulomb.
ZE
Z.E=R.V; Vitesse de migration =
Vitesse de migration =
ZE
R
Avantages.
-On spare les diffrentes protines
-Les tats d'oligomerisations sont conserves
-on peut faire migrer les protines dans des condition non dnaturante
-Rvlation par l'activit
Inconvnients
-Les bandes de protines sont larges ( cause du dpt)
-On ne peut pas dterminer la masse molculaire des protines
-Rflchir sur la polarit de l'lectrophorse (en fonction du pH)
PAGE-natif en gradient
On coule un gel de polyacrylamide avec un gradient de 4 20%
Les protines migrent, la concentration de
polyacrylamide est de plus en plus forte.
Elle finissent par stopper en fonction de leurs
tailles.
4%
20%
Avantages
-bandes mieux focalises
-dtermination de la masse molculaire
-dtermination des formes oligomriques (non dnaturant)
Gel retard
Cette technique permet de dtecter l'interaction d'une protine avec une autre protine,
de l'ADN ou de l'ARN.
On fait migrer dans un gel natif sur une piste la protine seule, puis sur une autre le
mlange protine-ADN (ou ARN ou autres protines).
Etant donn que la migration s'effectue en fonction du rapport charge/masse, toute
interaction changera ce rapport.
Protine seule
Avantage
-met en vidence les interactions.
-Permet de dterminer les conditions d'association (plusieurs partenaires, cofacteurs,)
- On peut dterminer approximativement la constante d'association
Mercaptoethanol
Rduit les ponts disulfure intra ou
intermolculaire
1 gel de concentration
tampon Tris/HCl pH 6.5
Polyacrylamide 4%
tampon:Tris/Hcl
pH 8.8 et
glycine
1 gel de migration
tampon Tris/HCl pH 8.8
Polyacrylamide de 6
15% (selon la taille des
protines)
Lorsqu'on a applique le courant, les espces ngatives vont migrer vers l'anode
le PI de la glycine 6.5:
Peu charge dans le gel de concentration (pH 6.5)
Trs charge dans le gel de migration (pH 8.8)
------------------
Dans le staking
gly
prot
Cl-
++++++++++++
------------------
gly
prot
Cl++++++++++++
prot
gly
Cl++++++++++++
MW
Les protines arrivent en
mmes temps dans la gel
de migration et restent sous
formes de fine bandes.
La
migration
se
fait
principalement en fonction
de leurs masse molculaire
Souvent les marqueurs ne sont pas parfaitement purs, c'est pourquoi on utilise 2 kit de
marqueurs diffrents pour identifier les protines qui sont communes.
45-400 kDa
22-300 kDa
13-200 kDa
2.5-100kDa
+
acide
Gel +
ampholytes
+
gnrateur
acide
base
base
pH
Selon les ampholytes choisies, on peut avoir un gradient plus ou moins resserrs.
Il existe aussi des gels de gradient de pH avec des ampholytes immobilises prt
l'usage
+
6
PI
pH
L'IEF permet:
-De dterminer exprimentalement le point isolectrique d'une protine
-De sparer les protines en fonctions du points isolectrique
-De mettre en vidence certains variant de la protines mutations (charge)
-modification post-traductionnelle (phosphorylation, glycosylation,)
Gels bidimensionnelles
On peut coupler un gel IEF avec un gel SDS dans l'autre dimension.
Les protines sont spares dans une dimension selon leurs points isolectriques puis
par leurs masses molculaires dans l'autre dimension.
Monocyte 2D gel
45kDa
HPON1
39kDa
HPBP
Western Blot
Les anticorps ne vont diffuser librement dans le gel. Par consquent on fait sortir les
proteines du gel et on les fixe sur une feuille de nitrocellulose ou de polyVinyldene
Fluoride (PVDF).
cathode
----
proteines
PVDF ou nitrocellulose
Papier imbibe de tampon
anode
++++
Si les protines sont en SDS, elle sont charges ngativement, elles vont
migrer vers l'anode et se fixer sur la membrane de nitrocellulose ou de PVDF.
Si gel natif, on travaille pH basique, (protines charges ngativement)
membrane
no
GF
rm
M
ale
ris
So
u
Il y a beaucoup de
protines dans le plasma