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TPsyllabus2bac

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  • Dosage des protéines
  • Electrophorèse sur gel de polyacrylamide
  • Purification des protéines
  • Extraction et dénaturation de l’ADN
  • Analyses des lipides du tissu adipeux et de la cervelle
  • Caractérisation des sucres

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Service de Protéomie et de Biochimie des protéines

Travaux pratiques de Biochimie

Professeur : R.Wattiez Assistante : C. Rosier

2 Bac Biologie 2 Bac Chimie

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Dosage des protéines

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Le dosage des protéines :
Intérêts du dosage :
Il est souvent nécessaire de connaître la concentration totale de l’ensemble des protéines contenues dans un échantillon, par exemple pour suivre les différentes étapes d’une purification. Pour ce faire, on cherche à mesurer stoechiométriquement l’ensemble des protéines contenues dans cet échantillon. Les critères importants pour une bonne technique de dosage des protéines sont :      Le seuil de détection très faible La spécificité importante La facilité de mise en œuvre La rapidité Le coût peu élevé

L’ensemble des techniques de dosage protéique repose sur l’utilisation des propriétés physiques et chimiques intrinsèques des protéines. Citons parmis les plus répandues : 1. Folin (O.H. Lowry, N.J. Rosebrough, A.L. Far rand R.J. Randall (1951). J. Biol. Chem. 193, 265). 2. Absorption U.V. (J. Janin, (1985) Spectroscopie d’absorption. Collection Méthodes, Hermann, 125-135). 3. Bradford (M.M. Bradford (1976) Anal. Biochem. 72, 248-254). 4. Réaction de la fluorescamine avec les amines primaires. (S. Udenfried. (1978) Science 1978, 871-872). Différentes méthodes utilisées pour le dosage des protéines :

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1) Absorption U.V. :
Les mesures d’absorption d’un composé en solution aqueuse sont limitées à l’ultraviolet ou à la partie visible du spectre, zone où le solvant n’absorbe pas ou très peu. Les molécules qui absorbent dans ces longueurs d’onde sont appelées chromophores. Ce sont principalement les molécules comportant des noyaux aromatiques ou des doubles liaisons conjuguées. Dans le cas des protéines, les chromophores sont les résidus d’acides aminés aromatiques (TRP, TYR : absorption à 280nm) et les liaisons peptidiques (absorption à 230nm). L’absorption d’un chromophore à une longueur d’onde donnée (λ) dépend de sa nature, de sa concentration et de la longueur du trajet optique. C’est ce qui est représenté par la relation de BeerLambert :

A λ = ε λ LC
Où A est l’absorption du chromophore à la longueur d’onde λ, ε représente le coefficient d’extinction molaire (mg-1.ml.cm-1), L est la longueur du trajet optique dans la cuvette de mesure (cm) et C est la concentration du chromophore (mg.ml-1). Au vu de cette relation, il est aisé d’imaginer une méthode de dosage des protéines d’un échantillon par mesure de son absorption à une longueur d’onde donnée. Afin d’obtenir une sensibilité maximale, il est préférable de choisir une longueur d’onde correspondant à un pic d’absorption. Les protéines montrent un maximum d’absorption ultraviolette à 280nm. La mesure de l’absorbance à 280nm peut être utilisée comme moyen d’estimer la concentration totale en protéine ; toutefois l’absorbance dépend du contenu des protéines en deux acides aminés seulement, et peut donc varier considérablement d’une protéine à l’autre. D’une manière générale, l’avantage de la technique d’absorption UV pour le dosage du contenu total en protéines d’un échantillon est que cette technique est non destructive. Néanmoins, la présence de substances non protéiques (autres que les acides nucléiques) qui absorbent dans l’UV peut invalidés la technique.

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2) Folin (réactions chimiques)
En 1927, Folin et Colciateu mirent au point la réaction qui porte aujourd’hui leur nom et qui est à la base d’une des méthodes de titration des protéines les plus utilisées. L’acide phosphomolybdo-tungstique (3H2O.P2O5.13WO3.5MoO3.10H2O et 3H2O.P2O5.14WO3.4MoO3.10H2O) est le constituant actif du réactif de Folin. La présence d’une protéine entraîne sa réduction par perte d’un à trois atomes d’oxygène. La fixation de cuivre par chélation faciliterait le transfert d’électrons vers l’acide mixte. On obtient ainsi plusieurs espèces réduites possédant une couleur caractéristique (absorption maximale à 745750nm). 3H2O.P2O5.13WO3.5MoO3.10H2O 3H2O.P2O5.14WO3.4MoO3.10H2O

Espèces réduites colorées (bleues) λ max = 745-750nm

Le mélange d’acides mixtes phosphomolybdo-tungstiques est réduit par une réaction rapide avec des résidus d’acides aminés aromatiques (TYR et TRP) et par une réaction plus lente avec les complexes cuivre-liaisons peptidiques et/ou cuivre-chaînes latérales polaires.

3) Réaction de la fluorescamine avec les amines primaires (fixation covalente sur la protéine)
Il est possible d’utiliser la réactivité de certains groupements d’une protéine pour y greffer des molécules de type chromophore ou fluorophore. La fluorescamine en est un exemple. Cette molécule se fixe sur les amines primaires. A l’état libre, elle n’est pas fluorescente. Très rapidement à pH 9, on obtient un produit de couplage fluorescent entre l’amine primaire et la fluorescamine. Cette réaction se déroule en parallèle avec une réaction de dégradation de la fluorescamine, plus lente, produisant des composés non fluorescents. On mesure la fluorescence à une longueur d’onde d’émission de 475nm consécutive à une excitation à 390nm. Il est alors possible de détecter 0.5µg de protéines (10 fois plus sensible que la méthode de Folin).

il est possible de les utiliser pour doser les protéines en solution. De plus. C’est la forme anionique qui interagit (de manière non covalente) préférentiellement avec les protéines. tampon tris.-6- L’intensité de fluorescence reflète la quantité de fluorescamine couplée. neutre. 4) Bradford (fixation non covalente d’une colorant) Certaines molécules ont une affinité pour les protéines et peuvent donc s’y fixer plus ou moins fortement. . Ce colorant existe sous trois formes différentes (anionique. cette méthode n’est pas absolument spécifique des protéines et ne doit donc être utilisée que pour le dosage des protéines débarrassées de toute contamination par des amines primaires (peptides. Dans le cas où le spectre d’absorption de ces molécules est modifié par la fixation (avec ou sans traitement ultérieur) ou quand une forme ayant un spectre caractéristique se fixe seule (équilibre déplacé vers cette forme). L’exemple le plus courant est certainement la méthode de Bradford qui utilise la fixation du bleu de Coomassie sur les protéines. Glycine…. cationique) ayant chacune un spectre d’absorption caractéristique. c'est-à-dire la quantité d’amine primaire. La fixation du bleu de Coomassie se réalise si la molécule à évaluer comporte des groupements fonctionnels basiques et/ou aromatiques. Bien que très sensible. acides aminés.). cette technique est plus variable que les méthodes vues précédemment puisque la fluorescence est principalement due à un seul acide aminé seulement (LYS).

Cette méthode est très sensible (2-5 µg de protéines) et très rapide. le bleu de Coomassie G250 aux protéines. des interférences possibles avec des contaminants non protéiques puis de la facilité de mise en œuvre. et des bases fortes interfèrent avec celle-ci. comportant souvent un certain nombre de variantes. comme le Triton et le dodécyl sulfate de Na (SDS). 5) Conclusions : Il existe de nombreuses méthodes de dosage des protéines. de la rapidité de la réponse souvent importante en cours de procédé. Seuls les détergents. Elle est aussi assez résistante à la plupart des interférents qui nuisent à la plupart des autres méthodes. .-7- Cette méthode est donc basée sur l'adsorption d’un colorant. Le choix d’une méthode de dosage dépendra avant tout de la quantité de protéines à doser. ainsi que des conditions de dosage.

Pour ce faire.Réaliser un spectre d’absorption dans l’UV d’une solution de blanc d’oeuf diluée entre 250 et 350nm. Pour cela :       Préparer trois séries de tubes numérotés de 1 à 6 Pipeter les quantités de la solution d’albumine bovine indiquées dans le tableau ciaprès Amener le volume. (ε280nm BSA = 0. Diluer cette solution 2X puis la filtrer sur papier Wathman N°1. préparer le réactif colorant.9% nécessaire à la réalisation des différentes dilutions de blanc d’œuf. Une solution stock d’albumine bovine à 1mg/ml a été préparée.66 ) (Concentration théorique de 1mg/ml). ici l’albumine bovine. 1) Absorption UV : .-8- Manipulations expérimentales : But : Au cours de ces travaux pratiques. Manipulation : Dans un premier temps. dans chaque tube. Pour ce faire. mesurer l’absorbance à 595nm par rapport à de l’eau distillée Tracer la courbe d’étalonnage. vous effectuerez une courbe d’étalonnage donnant l’absorbance du réactif colorant en fonction de la concentration de protéine standard. . Celle-ci contient 1g de bleu de Coomassie G250 dissout dans 200ml d’acide phosphorique 88% et 100ml d’éthanol 95%. c'est-à-dire l’absorbance à 595nm en fonction de la quantité d’albumine bovine (µg) . vous utiliserez les techniques d’absorption UV et de Bradford. Cette solution vous permettra de tracer une courbe d’étalonnage. A partir de cette solution. amener à 600ml avec de l’eau distillée. 80ml d’acide phosphorique 88% et 40ml d’éthanol 95%. Préparer une solution de NaCl 0.Mesurer l’absorbance à 280nm d’une solution stock d’albumine bovine afin d’en calculer la concentration protéique exacte. à 100µl à l’aide d’eau distillée Additionner 4ml de réactif colorant à chaque tube et bien homogénéiser à l’aide du vortex Après 5 minutes et avant 1 heure. additionner à 30ml de solution stock. 2) Méthode Bradford : Une solution stock de colorant a été préparée. vous déterminerez la concentration en protéines totale d’une solution diluée de blanc d’œuf.

100X. mesurer l’absorbance à 595nm par rapport à de l’eau distillée A partir de la courbe étalon. vous allez déterminer la concentration en protéines du blanc d’œuf. à partir de la droite d’étalonnage. 100µl de la dilution adéquate de blanc d’œuf Additionner 4ml de réactif colorant à chaque tube et bien homogénéiser à l’aide du vortex Après 5 minutes et avant 1 heure. Pour cela :       Réaliser plusieurs dilutions de blanc d’oeuf (10X. 500X. Dans un second temps.9% Numéroter ensuite 2 tubes pour chacune des dilutions réalisées Placer dans ceux-ci. 1000X) dans une solution de NaCl 0. .-9- Tube n° 1 1’ 1’’ 2 2’ 2’’ 3 3’ 3’’ 4 4’ 4’’ 5 5’ 5’’ 6 6’ 6’’ Albumine à 1mg/ml (µl) - Eau distillée (µl) 100 Colorant (ml) 4 Albumine Concentration finale (µg) D. à 595nm D.O. à 595nm blanc 10 90 4 20 80 4 50 50 4 80 20 4 100 0 4 La concentration finale d’albumine dans chaque tube peut être calculée précisément à partir de la concentration réelle de la solution stock d’albumine calculée préalablement par la loi de Beer-Lambert.O. déterminer la concentration protéique du blanc d’œuf.

9% (µl) 100 - Colorant (ml) 4 4 4 4 4 D.O.. à 595nm .O.10 Blanc d’œuf dilué (µl) 100 100 100 100 D. à 595nm blanc Concentration protéique (µg) Tube n° Blanc Blanc’ 10X 10X’ 100X 100X’ 500X 500X’ 1000X 1000X’ NaCl 0.

.11 - Electrophorèse sur gel de polyacrylamide .

Electrophorèses sur gel de polyacrylamide en présence de dénaturant : le dodécyl sulfate de sodium (SDS) : Le SDS est un détergent dont la formule est : CH3-(CH2)11-OSO3-Na+ Comme toutes les substances amphiphiles. Dans le cas des protéines. . Ce détergent s’adsorbe. On parle alors de SDS-PAGE pour SDS-PolyAcrylamide Gel Electrophoresis (voir plus bas). dépend d’une part de la charge de l’ion et d’autre part des forces de viscosité qui ralentissent son mouvement dans le solvant (friction). acides aspartiques et glutamiques. E : champ électrique .12 - L’électrophorèse sur gel de polyacrylamide : Introduction : La technique d’électrophorèse repose sur le déplacement (et la séparation) de particules chargées dans un champ électrique. La charge portée par ces acides aminés dépend du pH et de la constante d’ionisation des groupes fonctionnels. 1. soit une molécule de SDS pour 2 acides aminés. La vitesse de déplacement d’un ion (mobilité). sous l’influence d’un champ électrique. cystéine et tyrosine). sur les protéines et les dénature complètement. La portion protéique du complexe protéine-SDS ainsi obtenu subit un changement de conformation conduisant à un haut degré d’ordre : le complexe (chargé négativement) prend la forme d’un bâtonnet. La technique d’électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de Sodium Dodécyl Sulfate (SDS) permet de séparer les protéines par rapport à leur masse moléculaire.4gr de SDS se lie par gramme de protéine. grâce à sa chaîne aliphatique. On a : mobilité d’une molécule = (champ appliqué * charge de la molécule)/(friction de la molécule) Soit : V=qE/f avec q : charge de la particule . histidine. le SDS est constitué d’une tête polaire (-) et d’une queue hydrophobe. Ce qui permet une séparation des protéines dans un champ électrique en fonction exclusivement de leur masse moléculaire. f : coefficient de frottement entre les particules et le solvant. arginine. la charge est due essentiellement aux groupements fonctionnels des chaînes latérales (lysine..

est l'équivalent de 2 monomères d'acrylamide liés par un groupement méthyl et est utilisé comme agent pontant. Figure 1 : formules des monomères L'acrylamide polymérise en longue chaîne incorporant des molécules de bis acrylamide au sein du polymère ainsi formé. le TEMED catalysant la décomposition des ions persulfates pour donner des radicaux libres. Le gel de polyacrylamide : Le réseau de polyacrylamide est formé par la polymérisation de monomère d'acrylamide (CH2=CH-CO-NH2) (acryl) en présence de bis acrylamide (CH2=CH-CO-NH-CH2-NH-COCH=CH2) (NN'méthylène-bisacrylamide). appelé aussi Bis. La polymérisation de l'acrylamide est un exemple de catalyse par radicaux libres (polymérisation vinylique).. Figure 2 : initiation de la polymérisation Si on représente ce radical R· et M un monomère d'acrylamide. initiée par l'addition de persulfate d'ammonium et de TEMED (NNN'N'-tétraméthyléthylènediamine). on peut alors représenter la polymérisation ainsi : .13 - Cette méthode permet de déterminer rapidement la masse moléculaire des protéines. celles-ci ayant une migration électrophorétique inversement proportionnelle au logarithme de leur masse moléculaire. Le bis acrylamide.

le gel obtenu se comporte donc comme un tamis moléculaire (les macromolécules migrent d’autant moins vite qu’elles sont volumineuses). On obtient ainsi un réseau. interfère avec ce processus de polymérisation.14 - Figure 3 : réaction de polymérisation Figure 4 : structure moléculaire du gel Remarque : L’oxygène. dont les mailles sont de tailles variables en fonction des proportions d’acrylamide et de bisacrylamide utilisées . .. molécule qui peut se transformer en radical libre.

500 % d'acrylamide 15 . le gel de séparation varie entre 5 et 20 % suivant la taille des protéines que l'on veut séparer. Le passage de l'une à l'autre se fait avec un changement de pH et une augmentation de la concentration en acrylamide d’un gel à l’autre.40 40 .100 100 .15 - Champ électrique Plus précisément.. Masse moléculaire (KDa) 10 . L'objectif du gel d'électrophorèse en deux parties est de pallier aux problèmes liés aux faibles quantités de protéines et aux volumes parfois non négligeables déposés dans les puits.15 5 . Le taux de réticulation de ces gels.10 5 . Caractéristiques moléculaires : Un gel SDS-PAGE typique comprend 2 parties distinctes : gel de concentration et gel de séparation. Le gel de concentration est de 4%. dépend des quantités d'acrylamide et de bis acrylamide. qui migreront ensuite dans le gel de séparation (resolving gel).20 10 . On réalise donc une étape de concentration des échantillons jusqu'à l'obtention de zones protéiques très fines dans le gel de concentration (stacking gel).300 300 . qui correspond à la porosité du gel. quelles sont les caractéristiques générales d’un gel électrophorèse SDS-PAGE et comment se déroule la migration des protéines dans celui-ci ? Caractéristiques générales : Un gel SDS-PAGE comprend deux parties distinctes : le gel de concentration d’une part et le gel de séparation d’autre part.

Par contre. le gel de concentration étant à 6. Au niveau de l’interface du gel de concentration et de séparation.8) cette modification de pH ne modifie pas la mobilité des protéines mais augmente la mobilité des ions glycinates complètement ionisés à ce pH. .8 du gel de concentration. les ions glycinates ont une faible mobilité comparés à celles des protéines. L’électrophorèse se déroule dans un tampon Tris-Glycine contenant du SDS (TGS). Celui-ci sert dès lors de tamis moléculaire. il est basique (pH=8. des changements drastiques vont s’opérer. ce sont en fait les vitesses au niveau des protéines si ces ions étaient seuls. principe de la concentration : Le gel de concentration a pour but de concentrer les échantillons déposés. Les complexes protéines-SDS vont donc se concentrer entre les ions chlorures et les ions glycinates. Ces changements se font sur deux niveaux :   Le gel de séparation est plus réticulé que le gel de concentration. Ceci induit la formation de 2 limites mobiles : une entre l'ion d'arrière garde et le complexe SDS-protéines et une entre SDS-protéines et l'ion pilote. les ions chlorures contenus dans le gel ont une mobilité plus importante (ions pilotes).16 Phénomène d’isotachophorèse. Figure 8 : vitesse des différents composés ioniques Les vitesses de migration indiquées dans le tableau de la figure 8 sont celles des différents acteurs de l'électrophorèse. Le gel de séparation a un pH différent..8. A pH 6.

Différents types de coloration existent. la coloration au bleu de coomassie ou la coloration à l’argent. lorsque le bleu de bromophénol contenu dans les échantillons atteint le bas du gel. le gel est coloré afin de faire apparaître les protéines ainsi séparées. les petites protéines migrant plus bas que les grosses. La mesure des distances de migration parcourue par les protéines de référence permet de tracer une droite étalon représentant le logarithme du poids moléculaire de celles-ci en fonction de leur mobilité..17 Au terme de l’électrophorèse. . Cette masse moléculaire est comparée à des étalons calibrés en unité de masse protéique (Dalton. L’intensité des différentes bandes protéiques reflète partiellement leur abondance dans l’échantillon et la position/migration reflète la masse moléculaire relative de chaque protéine. Pour déterminer la masse moléculaire d’une protéine donnée. parmis les plus courantes. il suffit dès lors de rapporter la distance de migration observée pour celle-ci sur la droite d’étalonnage. on obtient ainsi une droite de pente négative. Da).

5 7. . il faut procéder très rapidement pour couler la solution ainsi préparée entre deux plaques de verre.02 2.014 2. Comme le nom l’indique.681 2.5 10 % 3.1 10 50 5 0. 20kDa. pH 8. vous déterminerez la masse moléculaire des protéines inconnues. déposer sur leur sommet.68 2. 50kDa.18 - Expérimentations : 1.1 10 50 5 0. Préparation des gels : Les gels que vous allez préparer sont constitués de deux parties distinctes : un gel dit de « concentration » et un gel dit de « séparation ».997 4.331 5. quelques gouttes de butanol.Avant que les gels ne polymérisent. gel de séparation : (0.348 2.1 10 50 5 0. le gel de concentration a pour effet de concentrer les différents échantillons de façon à augmenter la résolution de séparation électrophorétique. 150kDa. .1 10 50 5 0.5 % 2. Le gel de séparation est utilisé pour séparer les différents constituants des échantillons en fonction de leur masse.1 10 . Dès ce moment.1 10 50 5 0. 2.1 10 50 5 0.5 8% 2.8475 2.1 10 50 5 0.5 14 % 4.5 12 % 4 3. a) pour cela. 10kDa). 75kDa.1 10 50 5 0.68 2.35 2.5 15 % 5 2.35 2.5 9% 2.5mM pH 8.66 3.33 3. . 37kDa.8) 7% Acryl/Bis (ml) Eau (ml) Tris-HCl 1..664 4. Tableau cidessus) dans 1 petit erlenmeyer.5 50 5 0. b) A partir de cette droite d’étalonnage.375mM Tris-HCl. leur pH et leur concentration en ions.Bien homogénéiser.1 10 50 5 0.33 4.8 (ml) Persulfate (µl) Temed (µl) SDS (ml) Volume total pour 2 mini gels (ml) 2.Mélanger les différentes solutions correspondant au gel de séparation 12% (cf.5 11 % 3. But : Le but de cette manipulation est de déterminer la masse moléculaire de protéines inconnues à l’aide d’une électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS et de déterminer si celle-ci est constituée de plusieurs sous unités reliées par des ponts disulfures. vous établirez un étalonnage du gel à l’aide d’un mélange protéique constitué de différents référents dont les masses respectives sont connues (250kDa. 100kDa.66 2. Ces deux gels diffèrent par leur concentration en acrylamide. 25kDa. 15kDa. très prudemment.5 13 % 4.4975 4.02 2.

5 50 10 0. gel de concentration : (0.8 glycérol SDS 0. placer le peigne en évitant la formation de bulle.125mM Tris-HCl.2 g Quelques grains 12 µl 4.05% bleu de bromophénol Réducteurs : Mercaptoéthanol 3 ml 15 ml 12 ml 1.8) 4% 1. Préparation des échantillons : Préparer les tubes eppendorfs suivants : .19 .8 (ml) Persulfate (µl) Temed (µl) SDS (ml) Volume total pour 2 mini gels (ml) 3.Les gels sont polymérisés après 40 minutes environ.02 2. Couler de la même manière. le gel de concentration.1 10 Acryl/Bis (ml) Eau (ml) Tris-HCl 0.5mM pH 6. pH 6. Avant leur emploi. Electrophorèse : .33 6.5mM pH 6.échantillon inconnu n°2 + tampon échantillon sans réducteurs . éliminer la couche de butanol en les rinçant avec de l’eau distillée.échantillon inconnu n°1 + tampon échantillon avec réducteur .. Avant polymérisation du gel. Ce peigne a pour but de former des créneaux : endroits où se déposeront les différents échantillons.échantillon inconnu n°1 + tampon échantillon sans réducteur .échantillon inconnu n°2 + tampon échantillon avec réducteurs Remarque : composition du tampon échantillon (concentré 4X) Eau distillée Tris-HCl 0.

Coloration et décoloration : solution de coloration : Bleu de coomassie R-250 Méthanol Acide acétique Eau distillée 60 mg 100 ml 17. .20 - . le colorant de référence (contenu dans le tampon échantillon) parcourt les ¾ du gel en 1 heure environ.Mesurer la longueur du gel . glycine 19. SDS 0.Raccorder les électrodes au générateur.3. . Après l’électrophorèse.5mM pH 8. Eliminer soigneusement toutes les bulles d’air éventuelles. Attention. En conséquence.Déposer.01% (w/v).Recouvrir dans l’appareil.. retirer les gels. 5. . les gels à l’aide du tampon d’électrophorèse (Tris-HCl 2. ces gels sont hautement fragiles et cassent facilement. Dans ces conditions. . .Remplir les deux compartiments de l’appareil à l’aide du même tampon.5 ml Les gels sont recouverts de solution colorante pendant 1 heure.Réaliser l’électrophorèse sous courant constant de 20mA/gel.5 ml 132. TRES PRUDEMMENT. les manipuler avec prudence. les échantillons au sommet des gels.2mM.

Déduire à partir de ce graphique. Les laisser dans cette solution jusqu’à décoloration complète (en dehors des zones protéiques). les gels sont retirés de la solution colorante.5 ml . puis placés dans une solution de décoloration. ainsi que les différents échantillons et mesurer leur migration relative (Mr) définie par la relation suivante : Mr = (P/l) * (L/C) P = distance parcourue par la protéine (mm) l = longueur du gel après décoloration (mm) L = longueur du gel avant décoloration (mm) C = distance parcourue par le colorant de référence (mm) .21 . déterminer la masse moléculaire de chacune des différentes sous unités. Tracer la meilleure droite passant par ces points.Porter en graphique le logarithme de la masse moléculaire (pour les référents) en fonction de leur migration relative.5 ml 112.Dénombrer le nombre de bandes protéiques constituant l’échantillon de référence (marqueur de masse moléculaire). rincés à l’eau distillée. Après coloration. la masse moléculaire des protéines inconnues et déterminer si celles-ci sont constituées de plusieurs sous unités. solution de décoloration : Méthanol Acide acétique Eau distillée 125 ml 12. Si oui. ..

.22 - Purification des protéines Purification des protéines : Séparation des protéines par filtration moléculaire : Parmi toutes les méthodes chromatographiques permettant la purification des protéines. Principe de la filtration moléculaire : La filtration moléculaire sur gel est un procédé qui permet de séparer des molécules en fonction de leur taille (masse). la filtration moléculaire sur gel (ou chromatographie d’exclusion) occupe une place déterminante. Les gels utilisés sont constitués de particules insolubles mais solvatées (se présentant sous formes de perle) formant un réseau tridimensionnel. Le degré de réticulation détermine les .

Les molécules de taille inférieure à celle des pores des billes peuvent pénétrer librement dans les billes et se répartissent dans l'ensemble des liquides de la colonne (volume de liquide à l'intérieur des billes (phase stationnaire) + volume de liquide à l'extérieur des billes (phase mobile)). Elles sortent donc les dernières. en fonction de leur taille et de leur forme. explique l’action de tamis moléculaire. Les molécules sont donc éluées dans l’ordre des masses moléculaires décroissant. à un volume d'élution Vt ou volume total des liquides de la colonne. Une substance dissoute dans un solvant. si elles sont suffisamment petites pour avoir accès aux pores du gel. Ce phénomène d’équilibre.23 dimensions des mailles du réseau et par conséquent l’accessibilité de ce dernier aux molécules de solutés que l’on souhaite séparer. à un volume d'élution Vo appelé volume mort de la colonne. par un coefficient de distribution Kd. Les molécules situées dans le gel ne sont plus entraînées par le flux et sont retardées. De manière générale : . Chaque type de molécule sera caractérisé. Elution Le principe de la filtration moléculaire sur gel est basé sur la capacité des molécules à pénétrer dans les pores de la phase stationnaire constituée par le gel. . du volume à l’intérieur des grains de gel (Vi) et du volume du gel lui-même (Vg) : .Les molécules de taille supérieure à celle des pores des billes sont totalement exclues du gel et ne se répartissent que dans le volume extérieur aux billes. il s’établit un équilibre entre les deux phases (phase mobile et phase stationnaire). pour un gel de réticulation donnée. Le volume total (V) d’une colonne comportant du gel est égal à la somme du volume de tampon extérieur aux grains de gel (V0). est appliquée sur une colonne contenant un gel : ses molécules se distribuent d’abord librement dans la phase mobile (solvant). . répété tout au long de la colonne. elles pénètrent d'autant moins qu'elles sont plus grosses. c'est-à-dire dans la phase mobile (solvant). Elles sortent les premières.. et elles sont éluées dans l'ordre des masses molaires décroissantes.Les molécules de taille intermédiaire pénètrent dans les billes.

citons :     le Sephadex G formé à partir d’un hydrate de carbone de haut poids moléculaire : le dextrane le Biogel P. Il existe des gels de type organophiles dont les plus courant sont à base de polystyrène ponté. vis-à-vis d’un type de gel déterminé. le volume de l’échantillon ne doit pas être supérieur à Vs. Pour les petites molécules qui pénètrent totalement : Kd = 1 (diffusion libre dans la phase stationnaire)..Kd") x Vi Pour séparer complètement deux substances. - - Deux substances de masses moléculaires différentes auront. Il correspond au volume de liquide nécessaire pour éluer une substance à travers une colonne quand les molécules sont complètement exclues du gel. Les volumes d’élution de ces deux substances diffèreront d’une quantité Vs définie par l’équation : Vs = Ve’-Ve" = (Vo + Kd’ x Vi) .24 - V = Vo + Vi + Vg Vo est également appelé volume mort. .(Vo + Kd" x Vi) Vs = (Kd’ . formé de polyacrylamide Les gels d’agarose (Sepharose. Biogels A) formés généralement à partir de polysaccharides Les gels mixtes formés de polyacrylamide et de polysaccharides copolymérisés (Ultrogel et Sephacryl). Donc il faut que V échantillon < (Kd’ . Vi peut être calculé à partir du poids sec du gel (a) et du coefficient de rétention d’eau (Wr) : Vi = a x Wr Le volume d’élution d’une substance (Ve) dépend du volume extérieur au gel (Vo) et du coefficient de distribution Kd : Ve = Vo + Kd x Vi Donc Kd = (Ve-Vo)/Vi = (Ve-Vo)/(axWr) Pour les grosses molécules qui ne peuvent pénétrer dans la phase stationnaire : Kd = 0 (molécules totalement exclues du gel). des coefficients de distribution Kd’ et Kd".Kd") x Vi. Parmi un grand nombre de gels que l’on peut trouver commercialement. L’ensemble de ces gels est de type hydrophile.

CH-CH2-Cl. Types et qualité de Sephadex Sephadex G-10 Sephadex G-15 Sephadex G-25 Coarse Medium Fine Superfine Sephadex G-50 Coarse Medium Fine Superfine Sephadex G-75 Sephadex G-100 Sephadex G-150 Sephadex G-200 Diamètres des grains (µm) 40-120 40-120 100-300 50-150 20-80 10-40 100-300 50-150 20-80 10-40 10-40 10-40 10-40 10-40 Domaine de fractionnement (Daltons) -700 -1500 1000-5000 Volume de gel en ml/g de Séphadex sec 2-3 2. Les gels de Sephadex diffèrent entre eux par leur degré de réticulation. le plus couramment utilisé.25 Nous nous intéresserons lors de ce TP. Les chaînes de polymères sont reliées les unes aux autres par des ponts de type éther glycérate -O-CH2-CH-CH2-OOH Le grand nombre de groupements hydroxyles (-OH) confère au gel un caractère hydrophile.5 4-6 1500-30000 9-11 3000-70000 4000-100000 5000-150000 5000-250000 12-15 15-20 20-30 30-40 A chaque type de Sephadex est associé un domaine de fractionnement. au gel de Sephadex . le Sephadex gonfle très facilement dans l’eau et les solutions d’électrolytes. préparé par réticulation du dextran à l’aide de l’épichlorhydrine CH3. La limite supérieure de ce domaine est appelée limite d’exclusion. En conséquence.5-3.. Les molécules ayant un poids moléculaire supérieur à cette limite . Le Sephadex est un gel formé de perles. Cet intervalle de poids moléculaire correspond à la zone de séparation.

Ainsi. c'est-à-dire la gamme des masses molaires pour lesquelles il y a diffusion partielle ou totale. Quand les grains ont sédimentés sur une hauteur de quelques cm. homogénéiser la surface du gel sur une profondeur de quelques cm (à l’aide d’une pipette pasteur). celui dont le domaine de fractionnement. Manipulation : Préparation d’une colonne de Sephadex : Pour obtenir une bonne séparation des constituants d’un mélange. les solvants organiques.. puis versé la suspension de Sephadex (robinet fermé). englobe la masse molaire de la molécule à purifier. la préparation de la colonne doit être exécutée avec soin.B : Il faut surtout éviter que le gel ne vienne jamais à sec. les chaînes glycosidiques de la matrice sont hydrolysées. à l’état sec. Celles qui ont un poids moléculaire plus petit que la limite inférieure du domaine de fractionnement sont éluées dans un volume sensiblement égal au volume du gel. Remplir ensuite la colonne au 2/3 à l’aide du tampon. Stabilité chimique : Le Sephadex est insoluble dans la plupart des solvants. il commence à caraméliser. En présence d’acide fort. Il est stable dans l’eau. Stabilité physique : Le Sephadex peut être stérilisé soit à l’état sec soit à l’état humide à pH neutre par autoclave à 120°C. si l'on connaît la masse molaire de la molécule que l'on veut séparer d'un mélange par cette technique. . Par contre. juste avant de rajouter du Sephadex. chauffé à plus de 120°C. les solutions alcalines et faiblement acides. on ouvre le robinet et on fait couler goutte à goutte. les solutions salines. Du Sephadex est dès lors ajouté pour compléter la colonne. il faut choisir le gel le mieux adapté. N. Pour obtenir un remplissage de la colonne homogène.26 sont totalement exclues du gel et sont éluées dans un volume appelé volume mort.   Faire gonfler le Sephadex au minimum une nuit dans le tampon choisi (calculer la quantité nécessaire pour le volume de la colonne d’après le tableau de la page 25).

Faire pénétrer l’échantillon en ouvrant le robinet.9% Sephadex Sephadex NaCl 0.27 - NaCl 0.. Dès que l’échantillon a pénétré dans le gel. C’est un polysaccharide d’un poids moléculaire moyen d’environ 2. On remplit ensuite complètement de tampon la colonne et on la relie au réservoir. Séparer 3 substances de poids moléculaires différents sur deux types de Sephadex G : un Sephadex G100 et un Sephadex G25. déposer de la même manière quelques ml de tampon. (ATTENTION jamais à sec !!!) fermer le robinet Déposer ensuite délicatement et uniformément l’échantillon le long de la colonne avec un mouvement rotatif juste au-dessus de la surface du gel (éviter de perturber la surface du gel). c'est-à-dire que la fraction recueillie dès cet instant portera le n°1.9% Application de l’échantillon :      But : Aspirer (au moyen d’une pipette pasteur) la plus grande partie du liquide se trouvant au dessus de la surface du gel (robinet fermé) Ouvrir le robinet légèrement et lorsque le reste du liquide a disparu dans le gel. Pour cela. La manière dont l’échantillon est déposé est très importante.000. chaque groupe a à sa disposition le matériel suivant : 1) Un mélange constitué de :  un polymère de haut poids moléculaire : le « blue dextran 2000 ». C’est le début de l’élution.000 daltons sur lequel .

Eluer avec du NaCl 0. Sa concentration est de ± 5mg/ml. Le Ferrycianide de potassium (FP). Sa concentration est de ± 2mg/ml.9% de manière à avoir un débit de ± 15 ml/h. 4) Du matériel nécessaire pour la chromatographie (bouchons. 3) Une colonne de G25 conditionnée en NaCl 0. Interpréter les résultats obtenus à la lumière des notions théoriques développées précédemment. Résultats :   Observer les séparations..9%. La concentration en Blue dextran 2000 est de ± 2mg/ml. pipette. L’hémoglobine (Hb).28 est couplé un chromophore polycyclique donnant une couleur bleue. une protéine globulaire (rouge) d’un poids moléculaire de 65000 daltons. soit en jouant sur la hauteur du réservoir à NaCl 0. Observer les séparations au niveau des différents types de Sephadex.9%. Régler le débit soit au moyen de la pince. Tracer une courbe étalon à partir des données obtenues pour la colonne G100 . Pour cela suivre les instructions données précédemment. tuyau.…) Manipulation : Chromatographier ± 500µl de la solution décrite ci-dessus sur les colonnes de Sephadex. pinces seringues. K3 Fe(CN)6 composé jaune d’un poids moléculaire de 329 daltons.   2) Une colonne de G100 conditionnée en NaCl 0.9%.

.29 - Extraction et dénaturation de l’ADN .

Chez la personne âgée.2 Méthode d’extraction : Par groupe de 2 étudiants : 1) couper 10g de thymus de veau (1g d’ADN) en petits morceaux 2) homogénéiser au mixer 3 minutes dans 40ml du tampon glacé suivant : NaCl 0. le thymus de veau. Il cesse de croître à l’adolescence. protamines) par dénaturation des protéines (traitement par un détergent. Dans notre cas. Déjà étendu chez le nouveau-né. homogénéiser en agitant fortement et centrifuger à nouveau 10 minutes 5) renouveler l’opération une troisième fois 6) récupérer le culot et homogénéiser 3 minutes dans un récipient contenant 200ml de NaCl 0. Séparation de l’ADN des autres macromolécules par précipitation à l’alcool et extraction en présence de sels. le SDS) .Citrate de Na 0. il s’atrophie graduellement.1 Principe d’extraction : Les étapes d’isolement de l’ADN sont : Libération de l’ADN sous une forme soluble par destruction des membranes cellulaires et nucléaires . période au cours de laquelle il est le plus actif. Il est situé à la base du cou.30 - Extraction et dénaturation de l’ADN : L'ADN peut être extrait et purifié à partir de n'importe quel type de cellules nucléées. Il s’agit d’une glande bilobée qui ne joue un rôle important que pendant les premières années de la vie. Les cellules épithéliales du thymus sécrètent principalement une famille d’hormones peptidiques. dont la thrompoïétine et la thymosine.9% . qui semblent jouer un rôle essentiel dans le développement des lymphocytes T et dans l’établissement de la réponse immunitaire. en arrière du sternum. il se développe pendant l’enfance. et y ajouter 40ml de tampon glacé.. Le thymus de veau (connu sous le terme « ris de veau » dans le commerce) est constitué de cellules jeunes dont le rapport nucléocytoplasmique est élevé. nous utiliserons. Dissociation du complexe ADN-protéines (histones. 1. après quoi. 1. il est presque entièrement remplacé par une masse de tissu conjonctif et adipeux.01M 3) centrifuger à froid à 5000t/min pendant 10 minutes dans un tube à centrifuger 4) récupérer le culot.09% glacé .

.3 Dénaturation de l’ADN purifié : La dénaturation de l’ADN est possible par variation du pH. est suffisante les liaisons H interbrins rompent. citrate de sodium 15mM. 12) Une fois la purification terminée.31 7) ajouter en agitant (agitateur magnétique) 18ml d’une solution Sodium Dodécyl Sulfate (SDS) 5% dans de l’éthanol 45% 8) agiter lentement 1heure à température ambiante 9) ajouter ensuite 13g de NaCl solide et agiter 10 minutes 10) filtrer sur étamine (récupérer le filtrat dans un bécher) 11) ajouter lentement 200ml d’alcool dénaturé en tournant délicatement à la main avec une baguette de verre Remarques : Pendant les manipulations d’extraction. nous allons dénaturer l’ADN. Ce sont les appariements A-T qui se séparent les premiers . Lorsque l'énergie thermique apportée par une augmentation de la température. les températures élevées. Dans notre cas. les faibles forces ioniques. Dans ces conditions. préalablement purifié à partir du thymus de veau en augmentant graduellement la température. Dénaturation de l’ADN par variation de la température : Les deux brins antiparallèles d'ADN sont toujours étroitement reliés entre eux par des liaisons hydrogène formées entre les bases complémentaires A-T et G-C. de la température ou de la concentration en sels. remettre l’ADN en solution dans 100ml d’une solution de NaCl 150mM. les 2 brins d’ADN se séparent pour se retrouver sous forme d’ADN monobrin. il faut faire attention à ne pas altérer l’ADN : éviter les pH extrêmes. 1.

sous forme simple brin). On nomme « température de fusion » Tm (melting temperature). la température pour laquelle 50% des molécules d'ADN sont désappariées (i. Ainsi une molécule d'ADN double brin composée uniquement d'appariements G-C (3 liens H) nécessitera plus d'énergie pour être dénaturée sous la forme de molécules simple-brins. celle-ci augmente au cours du désappariement. La dénaturation de l’ADN peut être mise en évidence par mesure de la densité optique à 260nm.e.. c’est ce qu’on appelle l’effet hyperchrome. En effet. qu'un ADN de même taille composé d'appariements A-T (2 liens H). La séparation des 2 brins d’ADN s’accompagne d’un changement des propriétés de la solution (la viscosité diminue) et a lieu dans un intervalle de température étroit. .32 au cours de la montée de la température car ils ne possèdent que deux liaisons hydrogènes contrairement aux appariements G-C qui en possèdent trois. La dénaturation de l’ADN peut être suivie par mesure de la DO260nm en fonction de la température.

Pour ce faire. l’évolution de la DO260nm en fonction de la température et déterminer sur ce graphe. la Tm de votre ADN purifié. Porter en graphique. tels que la présence de structures secondaires intra ou extra moléculaires (repliement de l'ADN sur lui-même. Dans cette partie de la manipulation. de la salinité du milieu ainsi que de divers facteurs correctifs. votre solution d’ADN purifié est placée dans un bain marie à 90°C..2 (soit 10µg/ml). formation d'appariements entre deux brins). Déterminer ensuite grâce à cette valeur. Prélever 1ml de votre solution à chaque saut de température de 5°C et mesurer la densité optique de celui-ci à 260nm. avec un thermomètre dedans afin de contrôler sa température. Elles tiennent compte du pourcentage de base (G+C). . le % de GC contenu dans votre ADN en vous rapportant à la figure présentée cidessus. diluer votre solution d’ADN purifié pour arriver à cette valeur de départ. vous allez déterminer la Tm et le contenu en GC de votre ADN purifié.33 - Plusieurs formules empiriques permettent de calculer la valeur de la température de fusion. Veuillez à bien homogénéiser votre solution en la mélangeant continuellement. Remarques :   Prendre une mesure de la DO260nm avant toute élévation de la température (ADN sous forme double brins) Il faut que celle-ci avoisine une valeur de 0. Si ce n’est pas le cas.

.34 - Analyses des lipides du tissu adipeux et de la cervelle .

les stéroïdes et une certain nombre d’autres substances lipoïdes. R3) et de glycérol. Le groupe des lipides est diversifié et comprend les graisses neutres. un des deux acides gras est saturé et l'autre ne l'est pas. Les graisses neutres : Les graisses neutres. Ce sont de petites molécules hydrophobes ou amphipathiques principalement constituées de carbone.Sérine Inositol O O Tête hydrophyle . Liaison ester CH2 – O – CO – R1 CH – O – CO – R2 Groupement Acyle CH2 Squelette glycérol Ethanolamine Choline – O – CO -. sont des esters d’acides gras (R1. Les phospholipides diffèrent les uns des autres par le type d'acides gras rattachés au glycérol. ou liquide. les lipides peuvent être à l'état solide. Liaison ester CH2 – O – CO – R1 CH – O – CO – R2 CH2 – O – CO – R3 Squelette glycérol Groupement Acyle Les triglycérides se retrouvent principalement au niveau du tissu adipeux sous cutané et entourant certains organes.35 - Analyses des lipides du tissu adipeux et de la cervelle : Introduction Les lipides constituent la matière grasse des êtres vivants. les phospholipides.O -..P – O -. sont des triglycérides modifiés ayant un groupement contenant du phosphate et deux chaînes d’acides gras au lieu de trois. aussi appelées triglycérides ou triacylglycérols. R2. Les phospholipides : Les phospholipides ou glycérophospholipides. d’hydrogène et d’oxygène et ayant une densité inférieure à celle de l'eau. Généralement. comme dans les huiles. Ils servent de protection et d’isolation à ces organes mais sont également une réserve d’énergie pour l’organisme. Ils diffèrent aussi par différents groupements chimiques qui peuvent se rattacher au groupement phosphate. Ils sont dits « simple » lorsque les 3 acides gras sont identiques et « mixtes » lorsqu’ils contiennent 2 ou 3 acides gras différents. A température ambiante. comme dans les cires.

…. il contribue à leur stabilité et au maintien de leurs structures en s'intercalant entre les phospholipides. Sérine Inositol Les stéroïdes : Les stéroïdes ont une structure très différente des graisses.CH2 – CH2 . Les glycérophospholipides sont les principaux constituants des membranes cellulaires et sont abondants dans le tissu nerveux.OH | CH3 NH2 – CH2 – CH – OH | COOH OH OH OH OH OH OH Les glycérophospholipides sont amphiphiles comportant à la fois une caractères hydrophile et hydrophobe. les hormones stéroïdes sexuelles : progestérone. Le cholestérol est également un précurseur de nombreuses molécules :     la vitamine D3 qui intervient dans la calcification des os.OH CH3 |+ CH3 – N . œstrogène et testostérone les acides biliaires. les hormones stéroïdes : cortisol. Le cholestérol est un composant majeur des membranes cellulaires.36 Le tableau ci-après présente les différents groupements chimiques pouvant se lier au groupement phosphate : Ethanolamine Choline NH2 – CH2 – CH2 . Les stéroïdes le plus courant pour l’être humain est le cholestérol. cortisone et aldostérone. ..

à savoir le lard et la cervelle. Matériel : (pour 10 groupes) Solvant chloroforme/méthanol (1 :2) Chloroforme Méthanol 300ml 600ml Lard Cervelle Solution de KOH saturée (dans une bouteille en plastique) KOH H2Od 50g 45ml 20ml 180ml 300ml 300ml 28g 19.6ml 450ml 260ml 100ml 4ml 16ml 29. sur base de leur solubilité dans divers milieux.. A cette fin.37 Autres substances lipoïdes : Manipulations : Le but de la manipulation est de passer en revue les principaux lipides des mammifères. A partir de ces tissus. nous allons analyser deux tissus riches en lipides. les phospholipides et le cholestérol.4g 100ml Solution KOH dans l’alcool Solution KOH saturée Alcool dénaturé Alcool éthylique H2Od CdCl2 1/2H2O H2Od Alcool dénaturé Chloroforme Méthanol Acide acétique H2Od Alcool éthylique (alcool dénaturé) 50% Chlorure de cadmium (solution saturée dans l’alcool éthylique) Solvant chromatographie (65 : 25 : 1 : 4) Chlorure de calcium 2M CaCl2 H2Od Ether diéthylique 200ml . A. nous allons préparer des extraits dont nous séparerons les trois principales classes de lipides : les graisses neutres ou triacylglycérols.

Le cholestérol cristallise en aiguille. sont très inflammables. dissoudre le résidu de l’évaporation dans 2ml d’éther. Les acides gras libérés sont présents sous formes de sels de potassium (savons). Chauffer jusqu’à évaporation (SOUS HOTTE !!!!!). Après refroidissement. Les résidus insolubles sont ensuite éliminés par filtration. Ajouter 5 gouttes de la solution de CdCl2 et 6ml d’acétone. Il est donc interdit d’allumer une flamme à proximité de ceux-ci. B. Préparation des extraits de lard et de cervelle : L’extrait de lard et de cervelle est réalisé avec l’assistant (45g de tissu / 300ml de solvant). Après séparation des deux phases. spécialement l’éther et l’éther de pétrole. 3. Séparation des savons et du cholestérol : (l’assistant le fait pour tout le monde) Après refroidissement. C. Pendant l’évaporation. Laisser évaporer pour voir les savons se déposer sous forme de masse visqueuse dans le fond du bécher. on laisse s’écouler la phase aqueuse. . Ajouter 6ml de la solution KOH-alcool et mélanger. verser cette solution dans un tube à centrifuger marqué lard ou cervelle selon le cas.. L’analyse des lipides de ces deux tissus se fait en parallèle. Transvaser le tout dans une ampoule à décanter et ajouter 10ml d’éther de pétrole. tandis que les savons restent dans la phase aqueuse.38 Acétone Ninhydrine Ninhydrine Butanol 300ml 25mg 50ml Ether de pétrole Molybdenum blue 200ml !!!! Remarque importante : les solvants organiques. commencer à préparer les chromatographies (exercice II). Par agitation. Evaporer sur la paque électrique jusqu’à élimination complète du solvant (SOUS HOTTE !!!!!). Il consiste en un broyage mécanique du tissu dans un mélange chloroforme : méthanol (1 : 2). 2. L’éther de pétrole est recueilli dans un bécher sec marqué. et est laissé sous la hotte jusqu’à évaporation. Les graisses sont saponifiées. pipeter 20ml de l’extrait correspondant. dissoudre le résidu du bécher « cervelle » à l’aide de 7ml d’alcool à 50%. Décanter ce surnageant dans un bécher marqué lard ou cervelle selon le cas. 1. Précipitation des phospholipides : Les phospholipides et spécialement leurs sels de cadmium sont insolubles dans un mélange acétone : éther (3 :1). le cholestérol est extrait dans cette phase organique. Saponification des graisses neutres : Le surnageant de la centrifugation contient les graisses neutres et le cholestérol. Exercice I : Séparation des 3 groupes de lipides : Dans un bécher marqué lard ou cervelle. Centrifuger quelques minutes et comparer l’importance des précipités obtenus dans chacun des tubes.

Ajouter. Il s’agit d’une méthode physique de séparation des différents constituants d’un mélange. il rencontre l'échantillon et l'entraîne. Une fois la migration terminée. goutte à goutte. La solution de savon peut être assez visqueuse lorsque ceux-ci sont abondants. Cet échantillon est adsorbé par la silice . rincer l’ampoule à décanter avec une dizaine de ml de la solution alcool à 50%. Pendant que le solvant (éluant) monte le long de la plaque à chromatographie par capillarité. ce qui signifie que les molécules interagissent avec cette dernière et qu'elles auront tendance à rester au même endroit. Une petite quantité de la ou des solutions à analyser est déposée sur le bord d'une plaque de chromatographie. Par la suite le résultat de la migration. Agiter vigoureusement et éliminer le liquide à l’évier. Les différentes substances constituant l'échantillon migrent à différentes vitesses selon qu'elles interagissent plus ou moins fortement avec la silice. Agiter vigoureusement. Cette technique est basée sur les différences d’affinité des substances à l’égard de deux phases : la phase stationnaire fixée sur une plaque de verre (la silice) et la phase mobile (solvant ou un mélange de solvants) qui progresse le long de la phase stationnaire. Précipitation des savons calciques : Reprendre le résidu du bécher « lard » à l’aide de 20ml d’eau. Mélanger. 10 gouttes de la solution de CaCl2 2M à l’un des deux tubes et 10 gouttes d’acide acétique à l’autre. le chromatogramme. Plaque de chromatographie . celle-ci est retirée de la cuve et le solvant est évaporé. Séparer ces 20ml en deux tubes contenant 10ml chacun. ou acide silicilique amorphe. renfermant 13% de CaSO4. 4. Exercice II : Chromatographie sur couche mince : La chromatographie sur couche mince se réalise sur des plaques de verre recouvertes d’une mince couche de silice. généralement quand le front de solvant (éluant) est presque arrivé en haut de la plaque à chromatographie.39 Remarque : A la fin des manipulations. peut-être révélé de différentes manières. La plaque de chromatographie est ensuite trempée dans un solvant (éluant) et placée dans un récipient fermé. Bien observer le phénomène.. D.H2O. Les sels d’acides gras précipitent.

noter L ou C pour lard ou cervelle respectivement. L C Gel de séparation 1 3 5 1 3 5 Gel de concentration L’application des échantillons est une opération délicate : attendre la démonstration par l’assistant. Recommencer à côté en appliquant 3 gouttes puis 5. Noter également les initiales de votre groupe dans un coin. une fois préparée est disposée dans une cuve (les bords correspondant aux tâches trempent dans le solvant). à l’endroit prévu sur la plaque. Laisser sécher. Laisser migrer le solvant jusqu’au moment où il atteint la ligne transversale. laisser bien sécher avant l’application des gouttes successives.40 - 1. Fermer la cuve hermétiquement. Le diamètre de la tâche formée ne peut pas excéder 4 à 5 mm. Un petit volume de l’échantillon à analyser est prélevé par capillarité. 2. par simple contact. Le liquide diffuse dans le gel à partir du point de contact. tracer dans le gel de silice. Le solvant utilisé pour la chromatographie est constitué d’un mélange acide (chloroforme (65vol) – méthanol (25vol.) – acide acétique (1vol) – eau (4vol)) qui assure une migration complète des lipides neutres et une rétention partielle des lipides polaires et surtout chargés. continuez l’exercice I. Procéder de manière similaire pour chacun des échantillons (lard ou cervelle). dans une pointe de pipette pasteur. Pendant la migration. Préparation des plaques : Préparer une plaque de chromatographie en prenant comme modèle le dessin suivant : A l’aide d’un crayon fin. 3. Révélations : (réalisées par l’assistant) . Chromatographie : La plaque. Il est appliqué délicatement. une ligne divisant la plaque de chromatographie en deux parties égales. Le solvant monte dans le gel par capillarité (chromatographie ascendante). (!!!!! ne pas appuyer trop fort avec la pointe du crayon)..

. En effet. 6. et on laisse sécher.41 - On enlève la plaque de la cuve. Pulvériser de façon homogène la solution de ninhydrine et mettre la plaque de chromatographie à l’étuve quelques instants. Compléter à nouveau le chromatogramme. par ordre croissant. Ces deux dernières méthodes de révélations n’étant pas applicables en même temps sur une même plaque de chromatographie. Seuls les phospholipides réagissent. des principaux lipides d’intérêt biologique : 1. Placer la plaque de chromatographie sur le support approprié dans la hotte. Placer la plaque de chromatographie sur le support approprié dans la hotte. 3. Ceux-ci apparaissent alors sous forme de tâches jaunes brunes. Sortir la plaque et dessiner le chromatogramme sur la plaque à chromatographie à l’aide d’un crayon fin.  Ninhydrine : certains phospholipides portent une fonction NH2 libre que l’on peut révéler à la ninhydrine. 5. En présence de phosphore. colorer les tâches qui ont réagis à ce test. Trois révélations différentes sont appliquées à cette chromatographie.  Réactif du phosphore : ce réactif contient du molybdate et un réducteur. les lipides neutres et cholestérol glycolipides phosphatidyléthanolamine phosphatidylcholine phosphatydylsérine sphingomyéline . Placer votre plaque à chromatographie dans une cuve contenant des paillettes d’iode. 2. Lorsque l’iode est sublimé. Les tâches de lipides apparaissent après quelques minutes. sans toucher la couche de gel. Cette adsorption est réversible. Sur le chromatogramme déjà réalisé. Pulvériser prudemment et de façon homogène la solution de molybdène bleu (le liquide est très acide). Des tâches colorées apparaissent. appliquer le second révélateur. 4. certains groupes appliqueront la première et d’autres groupes la deuxième.  vapeur d’iode : la vapeur d’iode a la propriété de s’adsorber au niveau des différents lipides séparés. L’ensemble de ces méthodes permet la détection. Les résultats seront donc mis en commun afin d’identifier les différentes tâches révélées sur la plaques de chromatographie que ce soit pour l’extrait lard ou pour l’extrait cervelle. l’iode se désorbe à l’air libre. il se forme un complexe phosphomolybdique qui est réduit en phosphomolybdyle bleu.

42 - Caractérisation des sucres ..

ils jouent un rôle structural important. glycéraldéhyde . les autres carbones étant porteur d'une fonction alcool primaire ou secondaire selon la position. Les glucides sont constitués d’une ou de plusieurs unités aldéhydiques ou cétoniques polyhydroxylées. Exemples :  la cellulose de la paroi cellulaire végétale  la chitine des exosquelettes d’insectes et de crustacés Au niveau intracellulaire. le glucose va réduire le Cu2+ (bleu) de la liqueur de Fehling. la photosynthèse synthétise. réserve sous forme de cellulose chez les végétaux et sous forme de glycogène chez les animaux. Chez les végétaux. érythrulose.  Ils sont caractérisés par leur nombre de carbone : formule générale : Cn(H2O)n Les trioses possèdent 3 carbones : dihydroxyacétone. formés de deux sous unités (le saccharose par exemple = glucose + fructose) les oligosaccharides.…) et métabolique important. en milieu alcalin. Le rôle des glucides est multiple. les glucides peuvent également être synthétisés à partir de molécules non glucidiques. formés de plus de 10 unités ou plus Les monosaccharides : Les monosaccharides possèdent tous une fonction carbonyle :  Aldéhyde pour les aldoses (exemple : glucose) qui sont composés d'une chaîne d'alcools secondaires ayant à une extrémité un alcool primaire et un aldéhyde à l'autre extrémité. Cétone pour les cétoses (exemple : fructose). Tout d’abord. au niveau extracellulaire. la majeure partie des glucides est apportée par l’alimentation et est d’origine végétale . ils ont un rôle énergétique (production d’énergie. le glucose qui est stocké sous forme d’amidon ou transformé en cellulose. . soutenant et protégeant les structures biologiques. Les tetroses possèdent 4 carbones : érythrose. thréose. à partir du gaz carbonique et de l’eau. On classe les glucides de la manière suivante :     les monosaccharides. Ce groupement aldéhyde ou cétone leur confère un caractère réducteur. formés d’une seule sous unité (le glucose par exemple) les disaccharides. néanmoins. En effet.43 - Caractérisation des sucres : Les glucides sont les biomolécules les plus abondantes de la terre. Chez les animaux. formés de 3 unités ou plus les polysaccharides.. en Cu+ (précipité rouge brique).

idose. le saccharose (-D-glucopyranosyl(12)-Dfructofuranose). ribulose. psicose. xylose. glucose. L'une des fonctions alcool primaire peut être oxydée en fonction acide carboxylique. Les heptoses possèdent 7 carbones . Dihydroxyacétone Les disaccharides : Ribose Galactose Fructose Glucose Ils sont constitués de 2 oses liés par une liaison osidique. fructose... La fonction aldéhydique est oxydée en fonction acide carboxylique. gulose. lyxose.. arabinose. galactose. altrose. . mannose. Saccharose Maltose Lactose Les saccharides simples et les disaccharides ayant de libre leur carbone hémiacétalique sont réducteurs de par leur fonction aldéhyde. le lactose (-D-galactopyranosyl(14)-D-glucopyranose). . Les hexoses possèdent 6 carbones : allose. talose. tagatose. Par exemple : le maltose (-Dglucopyranosyl(14)-D-glucopyranose).44 Les pentoses possèdent 5 carbones : ribose. sedoheptulose. xylulose. sorbose.

Les polysaccharides : Association d'un très grand nombre de molécules liées par des liaisons O-glycosidiques. Il est exploité dans l'industrie pour ses propriétés d'épaississant et de gélifiant. il possède plus de ramifications que ce dernier (ramification environ toutes les 10 unités de glucose).. on obtient l'empois d’amidon. α(1→4) α(1→6) L'amylose s'organise en une hélice droite à six glucoses par tour. il est mis en jeu dans la liaison osidique. C'est un polysaccharide (C6H10O5)n constitué de deux composés :   L'amylose. ce qui a pour conséquence la transformation de l'amylose en molécules de maltose (disaccharides de α-glucose). les amylases. …) au même titre que le glycogène chez les animaux. amylose ramifié par une liaison α(1→6) environ toutes les 20 unités de glucose. En le traitant par l'eau chaude. Ces enzymes sont présentes dans la salive. il est pratiquement identique à l'amidon. ainsi que dans le suc pancréatique. Toutefois. L'amidon est insoluble dans l'eau froide. les racines. L'amidon L'amidon est un glucide de réserve utilisé par les végétaux supérieurs pour stocker de l'énergie (dans les graines. L’amidon peut-être mis en évidence par le lugol (eau iodée) qui conduit à une coloration noire caractéristique (réaction entre l'amylose et l'iode). tout le . Le glycogène Au niveau de sa structure. Il se dissocie en glucose assimilable sous l'action d'enzymes. Les chaînes sont soit linéaires soit ramifiées. L'alpha-amylase est spécifique des liens α(1-4) glycosidiques.45 Les disaccharides non réducteurs sont ceux dont aucun carbone hémiacétalique n'est libre. molécule formée d'environ 600 molécules de glucose chaînées linéairement par une liaison α(1→4) L'amylopectine.

La cellulose La principale molécule structurelle des plantes est la cellulose. C'est une molécule très longue et rigide. dont la structure lui confère ses propriétés mécaniques telles qu'observées chez les plantes. tandis que le papier et le coton sont de la cellulose presque pure. L'α-amylase rompt les liaisons osidiques à l'intérieur de la chaîne d'amylose . elle est spécifique et réalisée par des hydrolases. Elle peut être réalisée en présence d'acide chlorhydrique. Le bois est en partie composé de cellulose.. La β-amylase hydrolyse les liaisons osidiques à partir des extrémités. . elle n'est alors pas spécifique et elle conduit à la formation de plus petites sous unités : les monosaccharides. L'hydrolyse du lien osidique peut également être enzymatique. La cellulose est un polymère de glucose liés par une liaison β(1→4). C'est la substance de réserve glucidique des animaux. Dans ce cas.46 reste de la structure est identique à l'amidon.    la β-glucosidase hydrolyse les liaisons osidiques mettant en jeu un glucose dont l'OH hémiacétalique est en position β . Le lien osidique L'hydrolyse du lien osidique peut être chimique.

) Pour l'essentiel. (* : En milieu alcalin.47g de CuSO4. Au cours de la réaction. ajouter 3 gouttes de H2SO4 concentré et compléter à 50ml avec de l’eau distillée Solution B : dissoudre avec précaution 17.5H2O. En effet. la solution de Fehling (ou liqueur de Fehling) est un complexe basique d’ions cuivriques par les ions tartrates. le cuivre oxyde l'aldéhyde pour donner un acide selon la réaction bilan d'oxydo-réduction générale : R-CHO + 2Cu(OH)2 → RCOOH + Cu2O(s) + 2H2O En présence de sucres réducteurs.47 - Manipulations : Tests de la mise en évidence des glucides : 1) Test à la liqueur de Fehling : La réaction de Fehling est une réaction caractéristique des aldéhydes.4H2O) et 5g de NaOH en pastille dans H2Od et amener le volume de la solution à 50ml Les solutions A et B sont mélangées à volumes égaux au moment de l’utilisation pour le test. Ainsi. le cétose est isomérisé en aldose et se comporte donc comme un sucre réducteur. l’hydroxyde cuivrique est déshydraté par la réaction suivante : Cu(OH)2 → H2O + CuO Noir insoluble . le NaOH réagit avec le CuSO4 par la réaction suivante : CuSO4 + 2NaOH → Na2SO4 + Cu(OH)2 Bleu insoluble Puis. le test à la liqueur de Fehling met en évidence la présence des glucides (aldose ou cétose*) par l’action réductrice d’une solution de sel cuivrique. Préparation de la liqueur de Fehling :   Solution A : 3.. le cuivre présent dans le complexe bleu est réduit et précipite sous forme d’oxyde cuivreux Cu2O de couleur jaune rouge. si ce dernier n’est pas présent. mais encore plus si on chauffe. déjà à température ambiante.3g de tartrate sodico-potassique (KNaC4H4O6. Remarque : Il est indispensable d’ajouter le tartrate sodico-potassique afin que le cuivre reste en solution sous forme de complexe bleu soluble.

) - Pour l'essentiel la solution de Tollens est un complexe de nitrate d'argent en solution ammoniacale. 2) Test de Tollens : La réaction de Tollens est une réaction caractéristique des aldéhydes.. Indiquer les tubes où la réaction est positive et expliquer les différents résultats obtenus. Placer les tubes dans un bain-marie à 100°C pendant 5 minutes Indiquer les tubes où la réaction est positive et expliquer les différents résultats obtenus. Préparation du réactif de Tollens : Préparer une solution de 2ml d’AgNO3 5% Ajouter 1ml de NaOH 10% pour précipiter Ag2O Ajouter par petites portions (environ 0. Au cours de la réaction l'ion argent I oxyde l'aldéhyde pour donner un acide selon la réaction bilan d’oxydo-réduction générale : R-CHO + 2Ag(NH3)2OH + NaOH → RCOONa + 2Ag + 2H2O + 4NH3 Un dépôt d’argent se forme alors sur les parois du tube évoquant un miroir. ajouter respectivement 1ml de fructose 5% (w/v). amidon 5%.5ml) NH4 OH 10% en agitant fréquemment le tube jusqu'à dissolution du précipité (3ml de NH4OH devraient suffire) Compléter à 10ml avec H2O Test de Tollens : Répartir dans 4 tubes à essai 1ml de réactif de Tollens Dans chaque tube. glucose 5%(w/v). ce qui confère à ce test le nom de « test du miroir d'argent ». on ajoute le tartrate sodicopotassique. Test de Fehling : Répartir dans 5 tubes à essai 1ml de la solution A et 1ml de la solution B Dans chaque tube. sucrose 5% (w/v) et sucrose 5% (w/v) acidifié de 4 gouttes d’HCl concentré. glucose 5% (w/v). ajouter respectivement 1ml de fructose 5% (w/v). si avant d’ajouter NaOH à CuSO4 en solution. (* : En milieu alcalin. le cétose est isomérisé en aldose et se comporte donc comme un sucre réducteur. le cuivre restera en solution sous forme de complexe bleu soluble. Hydrolyse de l’amidon par les α-amylases: L’étudie de l’hydrolyse de l’amidon par les α-amylases salivaires consiste en une analyse des produits formés au cours du temps. Cette hydrolyse se réalise en plusieurs étapes : .48 Par contre. Il met donc en évidence la présence des glucides (aldose ou cétose*). amidon 5% (w/v) et sucrose 5% (w/v).

le test à la liqueur de Fehling d’une part et le test de l’iode d’autre part. Pour ce faire. La . 2.5ml de salive Répartir le mélange dans 6 tubes à essai (solution bien homogène) et les placer dans un bain-marie à 37°C Sortir un tube à la fois après 0. La couleur du complexe formé dépend de la longueur entre branchements du polysaccharide considéré. elle peut donc avoir lieu en milieu anaérobie. Verser cette suspension dans 20ml d’H2O bouillante.4g d’empois d’amidon dans 10ml d’H2Od. alors que dans le cas de la fermentation. Laisser refroidir dans la glace.. Laisser bouillir 2 minutes. La molécule présentant le plus grand nombre de branchement étant l’amidon.49 Amidon soluble → dextrines de longueurs variables → maltose Afin de mettre en évidence. Cette réaction devrait ensuite diminuer graduellement en fonction de la digestion de l’amidon par les α-amylases. 30 et 60 minutes et stopper la réaction en plongeant le tube dans un bac de glace. prélever 2ml du tube à essai puis leurs ajouter 2ml H2O et 1 goutte de réactif à l’iode (lugol = 5g I2 + 1g KI + 100ml H2O) Effectuer ensuite un test à la liqueur de Fehling comme expliqué précédemment sur 1ml d’échantillon. ajouter 0. 15. de l'oxygène (milieu aérobie). 5. levures) vivant de manière permanente ou occasionnelle dans des milieux dépourvus d'oxygène. Quand l’amidon est refroidi. celui-ci devrait réagir fortement avec l’iode. Observer et expliquer les différents résultats obtenus. Lors de la respiration. tels que le pyruvate entraînant la formation d’éthanol. C6H12O6 + 2 ADP + 2 Pi → 2 C2H5OH + 2 CO2 + 2 ATP La fermentation alcoolique est réalisée par de nombreux organismes (bactéries. deux tests vont être réalisés. les électrons sont transférés à des composés des voies métaboliques. Test de l’iode pour les polysaccharides : L’iode se complexe avec les polysaccharides (amidon. Bien mélanger. glycogène) en formant vraisemblablement une structure de coordination résultant de sa fixation entre les chaînes adoptant une conformation hélicoïdale. Amener à 40ml avec H2O. Mode opératoire : Mélanger 0. La fermentation ne nécessite pas de dioxygène. elle. par son faible rendement énergétique. H+ sont transférés à l'oxygène.4 à 0. qui nécessite. l’hydrolyse de l’amidon. - - Métabolisme du glucose chez la levure : La fermentation alcoolique est une réaction biochimique consistant à libérer de l'énergie à partir de sucre (du glucose la plupart du temps). Effectuer immédiatement le test de l’iode. l'accepteur final des électrons provenant des cofacteurs réduits NADH. de la respiration cellulaire. Elle se distingue.

. b) fermentation du glucose : Dans 3 fioles coniques avec un compartiment central.5ml 0. … reprendre le culot de levure dans 5ml H2Od. centrifuger. porter le volume à 40ml centrifuger 5 minutes (centrifugeuse de table).5ml 0.6ml Fermer les 3 fioles avec 2 feuilles de parafilm afin que le système soit bien hermétique .50 propriété de certaines levures à transformer le sucre en éthanol est utilisée par l'homme dans la production de boissons alcoolisées et pour la fabrication du pain.6ml Fiole n° 3 1.5ml 2. placer les différentes solutions comme indiqué dans le tableau ci après : Fiole n° 1 (contrôle) Compartiment extérieur : Suspension de levure H2O Solution de glucose 20mg/ml Solution de glucose 40mg/ml Compartiment intérieur : Solution de NaOH 3M 1.5ml 2. amenant à la production d’un précipité de BaCO3. nous ajouterons dans le système du BaCl2. lors du titrage de NaOH restant. et donc de ne pas provoquer une libération du CO2 produit. dans un système hermétique.5ml 2. Le meilleur milieu de température est à 35°C-40°C.6ml Fiole n° 2 1. nous allons pouvoir par la suite titrer la quantité restante de celui-ci après un temps donné puisque ce dernier va réagir avec le CO2 produit de la manière suivante : CO2 + 2 NaOH → Na2CO3 + H2O Afin de ne pas renverser la réaction. Pour ce faire.5ml 0. Na2CO3 + BaCl2 → BaCO3 + 2 NaCl Mode opératoire : a) préparation de la levure : peser 4g de levure par groupe placer la levure dans un tube à centrifuger la suspendre dans 10ml H2Od. décanter et jeter le surnageant laver une deuxième fois la levure de la même manière. La réaction suivante va alors avoir lieu : 1 glucose → 2 pyruvate → 2CO2 + 2 éthanol En intégrant dans notre système une quantité connue de NaOH. Le but de l’expérience est d’observer le métabolisme du glucose chez la levure et donc sa consommation. Ceci peut-être réaliser par mesure du CO2 produit au cours de la fermentation. Ceci constitue la suspension de levure. nous allons mettre en présence des levures avec différentes concentrations de glucose.

Titrer le tout avec 10ml de HCl 0.51 Incuber les fioles 45 minutes à 25°C (étuve). injecter à travers le parafilm 1ml de TCA 20% dans le compartiment extérieur des 3 fioles pour stopper la fermentation Refermer avec une nouvelle feuille de parafilm Incuber 15 minutes à 25°C (étuve) Titrer le CO2 produit par la fermentation*. vous pouvez à présent calculer combien de molécules de glucose ont été consommées et quels sont les rendements observés dans chaque cas.5ml du NaOH de votre fiole conique.5ml NaOH 3M normalement.3M *Remarque : réaliser au préalable un titrage test afin de connaître quelle est la quantité maximum de HCl qu’il faut pour neutraliser 0. Grâce aux différents volumes de titration obtenus pour les 3 fioles. ajouter dans un bécher. agiter très délicatement de temps en temps Au terme des 45 minutes. . Pour ce faire. 2ml de BaCl2 1M + 1ml H2Od + 3 gouttes de phénophtaléine + 0.. Pour ce faire réaliser la même opération mais placer dans votre bécher du NaOH frais (n’ayant fixer aucune molécule de CO2).

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