Procdure prlvement des curs du 06.12.

10
Prlvement du cur
Prlvement sur : Rat femelle (2)
Poids : 325 g / 265 g
Heure du prlvement : 14h15

Pentobarbital utilis : 20 mg (Ceva Sant animal)

Hparine utilise : 200 UI/kg (Hparine Choay)

Poids du VG : non valu

Dcoupe
Tranchage :
Heure de dbut : 14h30
Heure de fin : 16h45
Appareil : Vibratome LEICA VT 1200S
Lame utilise : Gilette S2
Milieu utilis : PBS + P/S (2%) + G (1%)
Glose de bute utilise : Agar (4%) + P/S (1%)
Nombre de morceaux dcoups : 3 moitis
Vitesse de coupe : 0,4 mm / s
Amplitude de vibration : 2 mm
Tranches obtenues : 200 m
Nombre de tranches : 60
Conservation :
Rinage : 3 au PBS
Milieu de conservation :
Traitement direct, pas de conservation.

Lieu de conservation :
Heure de mise en conservation :
Heure de sortie :

Remarques
Tranches destines ltude de la cardioprotection.

Ceva Sant animal)

g (Hparine Choay)

Test de cardioprotections (du 06.12.10 au 07.12.10)

Manipulation effectue sur deux curs de rat tranchs le 06/12/2010 200m
Protocole :
Rfrences : DMEM/F12 : lot 814923
PBS : lot 831348
Ref : 11039-021 500mL
Ref : 10010-015 500 mL
11039-047 10x500 mL
10010-056 10x500 mL
DLC : 07/2011
DLC : 10/2012
ATB : pnicilline + streptomycine, GIBCO et gentamycine, PAA
MTT : solution 0,5g/L (0,109g pour 200 mL), Sigma
PBS/ P/S (2%)/ G (1%) =milieu dischmie 500 L par puits 37C sans O 2 (4h)

DMEM-F12/ P/S (2%)/ G (1%) = milieu de reperfusion 500 L par puits 37C (2h) dilu au demi avec du PBS sauf pour les gro

Evaluation
de
la
viabilit par
test MTT en
fin
de
reperfusion
avec
les
diffrents
traitements ;

Evaluation
de la ncrose
par dosage
des LDH et
CPK
(voire
des
troponine i)
en fin de
reperfusion
avec
les
diffrents
traitements.
Test MTT : cf. fiche procdure
Dosages ncrose: prlvement de 2x200 L de milieu la fin de la reperfusion, traitement lhpital.

Plan de plaque 48 puits :

Ctrl
Ctrl
CsA 200
CsA 200
CsA 500
CsA 500
SN 30%
SN 30%
SN 50%
SN 50%
PostC
PostC

Ctrl = groupe
contrle (n
=8), tmoin
ischmie/rep
erf ;

CsA 200 =
groupe trait
au moment
de la reperf
par ajout de
cyclosporine
A [c]f = 200
nM (n =8) ;

CsA 500 =
groupe trait
au moment
de la reperf
par ajout de
cyclosporine
A [c]f = 500
nM (n =8) ;

Ctrl
CsA 200
CsA 500
SN 30%
SN 50%
PostC

Ctrl
CsA 200
CsA 500
SN 30%
SN 50%
PostC

Ctrl
CsA 200
CsA 500
SN 30%
SN 50%
PostC

Ctrl
CsA 200
CsA 500
SN 30%
SN 50%
PostC

Ctrl
CsA 200
CsA 500
SN 30%
SN 50%
PostC

SN 30% =
groupe trait
au moment
de la reperf
par ajout de
surnageant
de
fibroblastes
ischmis de
ratons
(prpar le
02/12/10)
30% de [c]i
(n =8).

SN 50% =
groupe trait
au moment
de la reperf
par ajout de
surnageant
de
fibroblastes
ischmis de
ratons
(prpar le
02/12/10)
50% de [c]i
(n =8).

PostC
=
groupe trait
au moment
de la reperf
par
postconditio
nnement (n
=8) savoir
aprs
4h
dischmie 7
min reperf +
(7
min
ischmie + 7
min reperf)
x3 + 60 min
reperf.

On prpare
galement
un
groupe
basal (n = 8),
compos de
tranches qui
nauront subi
ni lischmie
ni
la
reperfusion
et dont les
tests seront
fait
au
moment de
la mise en
hypoxie des
autres
groupes.

Pour
le
passage de
lischmie
la
reperfusion,
on fait une
deuxime
plaque avec
du milieu de
reperfusion
afin
de
faciliter
le
traitement
des tranches
du
groupe
PostC
qui
sont
transfres
la
pince
dune plaque

lautre
comme
dcrit.
Les
autres
tranches
restent dans
la plaque de
reperfusion
Timing :
Prlvement
LDH : 300 L
de tous les
milieux
de
reperfusion
14h30
Prlvement
tranches
MTT Basal :
MTT :
de 8h20
9h50
DMSO :
de 10h
9h30

Poids
frais : 10h
Etuve :
110C pdt 5h
Poids
sec : 16h
Prlvement
tranches
MTT
Protections +
Ctrl :
MTT :
de 15h10
16h40
DMSO :
de 16h45
9h30
Poids
frais : 10h
Etuve :
110C pdt 5h
Poids
sec : 16h

u demi avec du PBS sauf pour les groupes SN 30% et 50% o on rajoute respectivement 300 L de SN + 200 L de PBS et 500 L de SN.

n, traitement lhpital.

Ctrl
CsA 200
CsA 500
SN 30%
SN 50%
PostC

N + 200 L de PBS et 500 L de SN.

Rsultats des tests de cardioprotection (du 06.12.10 au 07.12.10)

Rsultats Test de la Cardioprotection (le 07/12/2010)
Basal
Mesures avant ischmie
DO brute
0.453
0.775
0.149
0.113
0.251
0.452
DO corrige
0.355
0.677
0.051
0.015
0.153
0.354
Poids frais
4.12
6.98
2.9
2.81
2.02
2.91
(mg)
Poids sec
0.82
1.36
0.8
0.76
0.49
0.66
(mg)
DO/g pds 86.1650485 96.991404 17.5862069 5.33807829 75.7425743 121.649485
frais
DO/G pds 432.926829 497.794118
63.75
19.7368421 312.244898 536.363636
sec
Contrle
Mesures aprs ischmie 4h + reperfusion 2h
DO brute
0.309
0.144
0.208
0.202
0.172
0.239
DO corrige
0.231
0.066
0.13
0.124
0.094
0.161
Poids frais
7.24
6.19
3.52
12.4
8.43
3.84
(mg)
Poids sec
1.65
1.53
0.91
2.53
2.32
0.95
(mg)
DO/g pds 31.9060773 10.6623586 36.9318182
10
11.1506524 41.9270833
frais
DO/G pds
140
43.1372549 142.857143 49.0118577 40.5172414 169.473684
sec
CsA 200
Mesures aprs ischmie 4h + reperfusion 2h avec CsA 200 nM
DO brute
0.378
0.292
0.262
0.357
0.291
0.431
DO corrige
0.3
0.214
0.184
0.279
0.213
0.353
Poids frais
4.9
6.02
4.86
6.96
5.36
9.96
(mg)
Poids sec
1.02
1.66
1.35
2
1.51
2.86
(mg)
DO/g pds 61.2244898 35.5481728 37.8600823 40.0862069 39.738806 35.4417671
frais
DO/G pds 294.117647 128.915663 136.296296
139.5
141.059603 123.426573
sec
CsA 500
DO brute
DO corrige
Poids frais
(mg)

0.203
0.125
12.72

Mesures aprs ischmie 4h + reperfusion 2h avec CsA 500 nM

0.228
0.178
0.253
0.175
0.188
0.15
0.1
0.175
0.097
0.11
3.52
7.16
5.18
7.71
8.46

Poids sec
(mg)
DO/g pds
frais
DO/G pds
sec

3.1

0.86

1.75

1.26

2.11

2.61

9.82704403 42.6136364 13.9664804 33.7837838 12.5810636 13.0023641

40.3225806 174.418605 57.1428571 138.888889

45.971564

42.1455939

SN 30%
Mesures aprs ischmie 4h + reperfusion 2h avec surnageant FB ischmis 30 %
DO brute
0.167
0.181
0.374
0.411
0.487
0.312
DO corrige
0.089
0.103
0.296
0.333
0.409
0.234
Poids frais
7.93
9.37
10.11
8.85
10.25
3.92
(mg)
Poids sec
2.07
2.68
2.07
2.51
2.18
1.13
(mg)
DO/g pds
11.223203 10.9925293 29.2779426 37.6271186 39.902439 59.6938776
frais
DO/G pds 42.9951691 38.4328358 142.995169 132.669323 187.614679 207.079646
sec
SN 50%
Mesures aprs ischmie 4h + reperfusion 2h avec surnageant FB ischmis 50 %
DO brute
0.5
0.344
0.215
0.244
0.268
0.391
DO corrige
0.422
0.266
0.137
0.166
0.19
0.313
Poids frais
13.88
5.88
9.05
1.99
2.88
5.98
(mg)
Poids sec
3.32
1.49
2.36
0.53
0.76
1.7
(mg)
DO/g pds 30.4034582 45.2380952 15.1381215 83.4170854 65.9722222 52.3411371
frais
DO/G pds 127.108434 178.52349 58.0508475 313.207547
250
184.117647
sec
PostC
Mesures aprs ischmie 4h + squence de postconditionement + reperfusion 1h
DO brute
0.293
0.355
0.23
0.338
0.125
0.313
DO corrige
0.215
0.277
0.152
0.26
0.047
0.235
Poids frais
8.31
6.82
3.42
6.15
2.56
7.82
(mg)
Poids sec
2.09
1.98
0.95
1.64
0.66
2.33
(mg)
DO/g pds 25.8724428 40.6158358 44.4444444 42.2764228 18.359375 30.0511509
frais
DO/G pds 102.870813 139.89899
160
158.536585 71.2121212 100.858369
sec

Groupes
Basal

Moy DO frais Ecartype frais Moy DO sec Ecartype sec

96.2065792 6.47105929 434.598637 34.3714549

Contrle
SN 30 %
SN 50 %
CsA 200 nM
PostC

22.7744129
25.4559396
45.9840149
38.1634263
33.2865145

5.198958
5.05352959
7.34178056
0.91481295
4.11700283

88.7614495
105.561922
168.008817
135.155612
120.244747

20.1473129
23.9815776
25.8187024
3.02674028
13.795996

5 2.23606798
6 2.44948974
***
100 7 2.64575131
8
2.828427

500
450
400

80

350

*
60

300

**

250
200

40

150
100

20

50
0
Basal

Contrle

SN 30 %

SN 50 %

CsA 200 nM

PostC

0.098
0.283
0.185
2.01

0.368
0.27
2.58

0.51

0.58

92.039801

104.651163
moyenne DO/g pds
96.2065792
frais :

362.745098 465.517241
moyenne DO/g pds
434.598637
sec :

on 2h

15.8507934
84.1925263

0.078
0.325
0.247
7.25

0.182
0.104
8.72

2.13

2.5

34.0689655 11.9266055
moyenne DO/g pds
22.7744129
frais :
115.962441

41.6
moyenne DO/g pds
88.7614495
sec :

c CsA 200 nM

12.7347943
49.3506364

0.078
0.19
0.112
10.26

0.421
0.343
8.51

2.33

2.42

10.9161793 40.3055229
moyenne DO/g pds
38.1634263
frais :
48.0686695 141.735537
moyenne DO/g pds
135.155612
sec :

c CsA 500 nM

0.078
0.139
0.061
4.53

0.387
0.309
7.36

2.24082493
7.41396928

1.32

2.18

13.4657837 41.9836957
moyenne DO/g pds
26.3218373
frais :
46.2121212 141.743119
moyenne DO/g pds
100.051771
sec :

ant FB ischmis 30 %
0.228
0.15
6.56
1.76

2.46

85.2272727 41.8699187
moyenne DO/g pds
105.561922
sec :

58.7426283

0.99

67.2932331 201.010101
moyenne DO/g pds
168.008817
sec :

17.9836162
63.2426467

0.078
0.272
0.194
4.56
1.31

14.4329897 42.5438596
moyenne DO/g pds
33.2865145
frais :
50

12.3785689

0.277
0.199
3.21

moyenne DO/g pds

45.9840149
frais :

0.84

0.078

19.9554069 61.9937695

ement + reperfusion 1h
0.12
0.042
2.91

58.1306894

0.181
0.103
8.7

moyenne DO/g pds

25.4559396
frais :

2.66

14.7327475

0.078

22.8658537 11.8390805

ant FB ischmis 50 %
0.257
0.179
8.97

148.091603
moyenne DO/g pds
120.244747
sec :

10.0845562
33.7931506

500
450
400
350
300
250
200
150
100
50
0
Basal

Contrle

SN 30 %

SN 50 %

CsA 200 nM

PostC

% viabilit frais :

100

% viabilit sec :

100

% viabilit frais :23.6724069

% viabilit sec : 20.4237754

% viabilit frais :39.6682084

% viabilit sec : 31.0989498

% viabilit frais :27.3597061

% viabilit sec : 23.0216487

% viabilit frais :26.4596661

% viabilit sec : 24.2895198

% viabilit frais :47.7971624

% viabilit sec : 38.6583858

% viabilit frais :34.5990002

% viabilit sec : 27.6679991