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ELECTROPHORESE Migration de particules charges sous l'effet d'un champ lectrique.

La particule atteint trs rapidement une vitesse limite v= qE/f avec q: charge de la particule; E: champ lectrique; f: coefficient de frottement particule/solvant. I-L'lectrophorse en veine libre est rserve des grosses particules (organites, cellules). Elle est presque inutilisable avec des macromolcules comme les protines et les acides nucliques. II-L'lectrophorse sur support: Pour viter les inconvnients observs en veine libre, l'lectrophorse se passe sur un support (gel) qui assure un double rle : -diminuer les courants de diffusions dus des micro htrognits de temprature. -servir de tamis molculaire, dont la maille va dpendre du support utilis. Les aspects thoriques de la chromatographie sont peu utilisables et seule une description des mthodes

est faite ci-dessous. Papier et actate de cellulose: surtout utilise soit pour des peptides (obtenus par digestion protasique de protines) soit pour des milieux complexes (plasma).

Gels Une substance chimique forme un gel plus ou moins serr. Les mailles seront d'autant plus lches que l'on veut sparer des petites molcules. Au contraire,

pour sparer des grosses particules (RNA, DNA) il faut utiliser des mailles trs peu serres. Il existe deux types principaux de gels: Gel de polyacrylamide En faisant varier la concentration d'acrylamide et methylne (bis acrylamide), on obtient des mailles trs diffrentes par polymrisation. CH2=CH-CO-NH2 acrylamide (CH2=CHCONH)2CH mthylne bis acrylamide

Principe de l'lectrophorse sur gel de polyacrylamide

Le gel est surtout utilis avec les protines qui

peuvent tre : -natives(migration en fonction de leur taille et charge sous forme replie). -le plus souvent dnatures par diffrents agents tels que le SDS (sodium dodcyl sulfate CH3-(CH2)12OSO3- Na+), qui dnature compltement les protines (surtout en prsence d'ure et de -mercaptothanol qui coupe les ponts disulfure) pour donner des batonnets de 18 de diamtre, dont la charge ngative et la longueur sont toutes deux proportionnelles la masse molculaire de la partie polypeptidique (attention aux protines glycosyles). Cette mthode permet de dterminer rapidement une masse molculaire approximative

La rvlation des fractions peut tre globale (rouge Ponceau, Amido-schwartz, vert de lissamine, bleu de Coomassie) ou spcifique (rvlation des lipoprotines avec un colorant des lipides, rvlation d'une activit enzymatique...). La lecture peut se faire l'oeil nu (analyse qualitative) ou par densitomtrie (enregistrement de l'absorbance en fonction de la distance de migration) ; dans ce cas, l'intgration des pics permet une analyse quantitative des fractions; ou encore le dosage peut tre effectu aprs lution des fractions

La dtection des protines utilise diffrentes (mthodes de coloration, directe (les peptides: bleu de coumassie (0,1ng) ou Ag (0,02ng); les rsidus glycosyls sont oxyds par PAS) ou indirecte aprs transfert sur feuille de plastique (nitrocellulose ..) par interaction avec le ligand "naturel" (ou synthtique) d'un "rcepteur" (overlay) ou avec un anticorps spcifique (immunodtection ou Western). Coloration au Bleu de Coumassie Le gel ci-dessous, d au Dr Ch.Roy, correpond diffrentes constructions obtenues par expression dans E.coli . Il s'agit de plusieurs "mutants" de la protine appele Ezrine . Cette protine contient 586 acides amins dans sa forme entire. Le gnes introduits dans des plasmides d'expression contiennent seulement des fragments de la squence totale (indiqus par le n des acides amins conservs). Dans le cas o la dltion porte sur des acides amins situs l'intrieur de la squence, les acides amins dlts sont indiqus par le symbole .

Rvlation dite "Western" L'exemple ci-dessous correspond au gel dcrit juste au dessus, qui avait t rvl au bleu de Coumassie. Les protines sur le gel sont transfres sur une feuille de plastique (nitrocellulose ou mieux "Immobilon" de chez Millipore) par lectrolution. Cette feuille est ensuite mise en contact avec une solution d'anticorps polyclonaux anti-ezrine, sur lesquels a t fixe de faon covalente de la peroxydase (gnralement de raifort). Aprs lavage pour se dbarrasser des anticorps ayant ragi

de faon non spcifique, le film est mis en contact avec un milieu d'ECL (enhanced chemiluminescence) contenant du luminol, du 4iodophenol et de l'eau oxygne H2O2. La peroxydase fabrique des radicaux libres partir de l'eau oxygne. Ceux-ci sont trs efficacement capts puis transmis au luminol qui est alors oxyd en un compos sous son tat excit, qui mettra alors des photons lors de sa dsactivation. Les photons mis sont alors dtects par un film photographique (autoradiographie) ou un phosphore-imageur. Finalement le rsultat est donn ci-dessous.

Bien entendu des rvlations similaires sont aussi possibles (quoique parfois moins sensibles) : - avec des anticorps marqus de faon radioactive. - avec des anticorps marqus de faon enzymatique (phosphatase alcaline, peroxydase ...) ou autre (biotine, protine A ...). - avec des systmes sandwich, comme dans les immunodosages. Agarose

L'agarose est un polysaccharide qui forme une gel trs lche, utilisable pour les acides nucliques. dans ce cas, la dtection se fait gnralement soit par un colorant fluorescent (bromure d'thidium ..) qui s'intercale entre les bases, soit par une sonde complmentaire marque (radioactivit, sonde antignique ...) aprs transfert sur feuille de nitrocellulose (Southern et Northern).

La rvlation se fait le plus souvent par lectrotransfert suivi d'une raction spcifique avec une sonde (radioactive, marque comme ci-dessus) de squence complmentaire de celle recherche sur un ADN (rvlation dite "Southern") ou sur un ARN (rvlation dite "Northern")

Ce type d'lectrophorse marche trs bien pour sparer des acides nucliques de quelques dizaines quelques centaines de bases (ou de paires de bases). Il est plus difficile de sparer des trs longs ADN, qui ont tendance se glisser dans les pores comme un vers. Ceci a pour effet que la sparation ne se fait plus en fonction de la taille des acides nucliques puisqu'ils nt tous le mme diamtre. Pour viter cet inconvnient, une lectrophorse dite champ puls existe, avec plus ou moins de succs selon les cas. L'ide de base est de changer la polarit du champ lectrique de temps autre. Cela a pour effet de faire que l'ADN se repelotonne. Il quitte donc son chemin prfrentiel. Il lui faut du temps pour qu'il reprenne la forme d'un vers. Pendant ce temps, la sparation se fait bien en fonction de la taille de la particule. Electrofocalisation

Utilisation d'un gradient de pH prform pour que la particule s'arrte son pHi.

L'lectrofocalisation bidimensionnelle est une mthode qui permet d'obtenir une courbe de titrage d'une protine donne (charge = fonction du pH). On prpare un gel dans lequel on tablit le gradient de pH, puis on dpose dans une rigole centrale la solution de protine, aprs quoi on tourne la plaque de 90 et on fait nouveau passer un courant lectrique.

Electrophorse deux dimensions On spare selon le pHi dans une dimension (IEF) et selon la masse molaire dans l'autre dimension (PAGE-SDS); on spare ainsi environ 1000 protines dans le srum !

On peut tablir de cette manire la "carte d'identit protique" des principaux tissus et organes humains. La lecture ncessite alors un systme informatis d'analyse d'images.

Exemple de l'ensemble des protines cellulaires (plaquettes humaines) qui sont passe sur une premire dimension (lectrofocalisation sur un gradient de pH -voir l'abscisse) qui est ensuite

soumis une lectrophorse en milieu dnaturant dans la direction perpendiculaire la premire (voir l'ordonne ci-dessous). La figure ci-dessous (extraite du site Expasy) donne le rsultat avec l'ensemble des protines des plaquettes humaines (attention: beaucoup de protines transmembranaires sont difficilement solubilises et n'apparaissent donc pas sur ces lectrophorses -pas plus que sur les autres d'ailleurs).

La 2D-DIGE 2D-DIGE (Fluorescence In Gel Electrophoresis) La complexit des chantillons analyser et quantifier en protomique quantitative ont suscits le dveloppement de nouvelles approches plus sensibles et beaucoup plus rsolutives. Parmi celles-ci la DIGE (Differential Gel Electrophoresis) , est une des avances de la protomique quantitative trs utilis en protomique du fait de sa fiabilit de quantification dans les tissus complexes Le principe de cette technique rside en la comparaison de deux profils

lectrophortiques 2D, par lutilisation de marqueurs fluorescents spcifiques servant marquer les protines pour chacun des chantillons. Le marquage est de type covalent par une raction spcifique, sur les groupement amines des chanes latrales des lysines par des fluorophores cyanines ( Cy3,Cy5 et Cy2).

La procdure exprimentale de la DIGE se divise en sept tapes. Les deux chantillons protiques analyser sont marqus par les cyanines, lun Cy3 et lautre Cy5 ainsi quun standard interne avec le Cy2. Aprs le marquage, les trois chantillons sont dposs sur un mme gel 2D ou les

protines seront spares dans une dimension en fonction de leur point isolectrique et ensuite dans une deuxime dimension en fonction de leur taille. Notons que les deux chantillons comigrent sur le mme gel. Lanalyse se fait dans un premier temps par excitation de fluorescence du gel aux longueurs dondes dexcitation des marqueurs Cy3, Cy5 et Cy2.

Figure IV-1 Proprits structurales et chimiques des Cyanines Cya 3 Cy3= 150000 M-1.cm-1 Abs:550 nm Em:570 nm Couleur: rouge Cya 5 Cy5= 250000 M-1.cm-1 Abs:640 nm Em:670 nm Couleur: bleu

Sensibilit 125 pg, marqueurs compatibles avec la sprcctrometrie de masse Electrophorese bidimensionnelle ralise sur des extraits pralablements marqus par des fluorochromes de types cyanines (3 disponibles : Cy2, Cy3 et Cy5). Les avantages de ce marquage sont les suivants : - l'utilisation des 3 fluorochromes permet de marquer 3 extraits diffrents et de les faire co-migrer sur le mme gel - l'un des extraits marqu est en fait un mlange parts gales des extraits analyser, et sert ainsi de standard pour tous les gels - la fluorescence permet une quantification sur une large gamme dynamique et avec une bonne sensibilt - grce la prsence d'un standard pour chaque gel, la dtection des variations protiques est plus sre Exemple de gel 2D-DIGE ralis sur P3S :

Image Cy2 + Cy3 + Cy5

image Cy3

Image Cy5

Image Cy2 (standard)

La plate-forme est quip d'une cuve permettant la migration simultane de 6 gels 2D-DIGE, soient 12 extraits diffrents. L'acquisition des images en fluorescence est assure par le scanner Ettan DIGE Imager. Deux logiciels d'analyse d'images sont disponibles pour comparer les gels : Decyder (GE Healthcare) et SameSpots (Nonlinear Dynamics).