ELECTROPHORESE Migration de particules chargées sous l'effet d'un champ électrique.

La particule atteint très rapidement une vitesse limite v= qE/f avec q: charge de la particule; E: champ électrique; f: coefficient de frottement particule/solvant. I-L'électrophorèse en veine libre est réservée à des grosses particules (organites, cellules). Elle est presque inutilisable avec des macromolécules comme les protéines et les acides nucléiques. II-L'électrophorèse sur support: Pour éviter les inconvénients observés en veine libre, l'électrophorèse se passe sur un support (gel) qui assure un double rôle : -diminuer les courants de diffusions dus à des micro hétérogénéités de température. -servir de tamis moléculaire, dont la maille va dépendre du support utilisé. Les aspects théoriques de la chromatographie sont peu utilisables et seule une description des méthodes

est faite ci-dessous. Papier et acétate de cellulose: surtout utilisée soit pour des peptides (obtenus par digestion protéasique de protéines) soit pour des milieux complexes (plasma).

Gels Une substance chimique forme un gel plus ou moins serré. Les mailles seront d'autant plus lâches que l'on veut séparer des petites molécules. Au contraire,

CH2=CH-CO-NH2 acrylamide (CH2=CHCONH)2CH méthylène bis acrylamide Principe de l'électrophorèse sur gel de polyacrylamide . on obtient des mailles très différentes par polymérisation. DNA) il faut utiliser des mailles très peu serrées. Il existe deux types principaux de gels: Gel de polyacrylamide En faisant varier la concentration d'acrylamide et methylène (bis acrylamide).pour séparer des grosses particules (RNA.

Le gel est surtout utilisé avec les protéines qui .

dont la charge négative et la longueur sont toutes deux proportionnelles à la masse moléculaire de la partie polypeptidique (attention aux protéines glycosylées).peuvent être : -natives(migration en fonction de leur taille et charge sous forme repliée).Na+). Cette méthode permet de déterminer rapidement une masse moléculaire approximative . qui dénature complétement les protéines (surtout en présence d'urée et de ß-mercaptoéthanol qui coupe les ponts disulfure) pour donner des batonnets de 18Å de diamètre. -le plus souvent dénaturées par différents agents tels que le SDS (sodium dodécyl sulfate CH3-(CH2)12OSO3.

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La lecture peut se faire à l'oeil nu (analyse qualitative) ou par densitométrie (enregistrement de l'absorbance en fonction de la distance de migration) . dans ce cas. ou encore le dosage peut être effectué après élution des fractions ...).La révélation des fractions peut être globale (rouge Ponceau. l'intégration des pics permet une analyse quantitative des fractions. vert de lissamine. Amido-schwartz. révélation d'une activité enzymatique. bleu de Coomassie) ou spécifique (révélation des lipoprotéines avec un colorant des lipides.

coli .) par interaction avec le ligand "naturel" (ou synthétique) d'un "récepteur" (overlay) ou avec un anticorps spécifique (immunodétection ou Western). .. Le gènes introduits dans des plasmides d'expression contiennent seulement des fragments de la séquence totale (indiqués par le n° des acides aminés conservés). Cette protéine contient 586 acides aminés dans sa forme entière. correpond à différentes constructions obtenues par expression dans E. Dans le cas où la délétion porte sur des acides aminés situés à l'intérieur de la séquence. dû au Dr Ch.La détection des protéines utilise différentes (méthodes de coloration. directe (les peptides: bleu de coumassie (0. Il s'agit de plusieurs "mutants" de la protéine appelée Ezrine . les résidus glycosylés sont oxydés par PAS) ou indirecte après transfert sur feuille de plastique (nitrocellulose . les acides aminés délétés sont indiqués par le symbole ∆.02ng). Coloration au Bleu de Coumassie Le gel ci-dessous.1ng) ou Ag (0.Roy.

Après lavage pour se débarrasser des anticorps ayant réagi . Les protéines sur le gel sont transférées sur une feuille de plastique (nitrocellulose ou mieux "Immobilon" de chez Millipore) par électroélution.Révélation dite "Western" L'exemple ci-dessous correspond au gel décrit juste au dessus. Cette feuille est ensuite mise en contact avec une solution d'anticorps polyclonaux anti-ezrine. sur lesquels a été fixée de façon covalente de la peroxydase (généralement de raifort). qui avait été révélé au bleu de Coumassie.

Ceux-ci sont très efficacement captés puis transmis au luminol qui est alors oxydé en un composé sous son état excité.de façon non spécifique. . du 4iodophenol et de l'eau oxygénée H2O2. le film est mis en contact avec un milieu d'ECL (enhanced chemiluminescence) contenant du luminol. La peroxydase fabrique des radicaux libres à partir de l'eau oxygénée. Les photons émis sont alors détectés par un film photographique (autoradiographie) ou un phosphore-imageur. qui émettra alors des photons lors de sa désactivation. Finalement le résultat est donné ci-dessous.

avec des systèmes sandwich...avec des anticorps marqués de façon radioactive. ..) ou autre (biotine.avec des anticorps marqués de façon enzymatique (phosphatase alcaline. Agarose . comme dans les immunodosages. ..). protéine A .Bien entendu des révélations similaires sont aussi possibles (quoique parfois moins sensibles) : . peroxydase .

.) après transfert sur feuille de nitrocellulose (Southern et Northern).. soit par une sonde complémentaire marquée (radioactivité. sonde antigénique ..) qui s'intercale entre les bases.L'agarose est un polysaccharide qui forme une gel très lâche. la détection se fait généralement soit par un colorant fluorescent (bromure d'éthidium .. utilisable pour les acides nucléiques. dans ce cas.

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marquée comme ci-dessus) de séquence complémentaire de celle recherchée sur un ADN (révélation dite "Southern") ou sur un ARN (révélation dite "Northern") .La révélation se fait le plus souvent par électrotransfert suivi d'une réaction spécifique avec une sonde (radioactive.

Electrofocalisation . Pour éviter cet inconvénient. Il est plus difficile de séparer des très longs ADN. avec plus ou moins de succès selon les cas. qui ont tendance à se glisser dans les pores comme un vers. Ceci a pour effet que la séparation ne se fait plus en fonction de la taille des acides nucléiques puisqu'ils nt tous le même diamètre.Ce type d'électrophorèse marche très bien pour séparer des acides nucléiques de quelques dizaines à quelques centaines de bases (ou de paires de bases). Il lui faut du temps pour qu'il reprenne la forme d'un vers. la séparation se fait bien en fonction de la taille de la particule. Cela a pour effet de faire que l'ADN se repelotonne. Pendant ce temps. une électrophorèse dite à champ pulsé existe. L'idée de base est de changer la polarité du champ électrique de temps à autre. Il quitte donc son chemin préférentiel.

après quoi on tourne la plaque de 90 ° et on fait à nouveau passer un courant électrique. L'électrofocalisation bidimensionnelle est une méthode qui permet d'obtenir une courbe de titrage d'une protéine donnée (charge = fonction du pH). puis on dépose dans une rigole centrale la solution de protéine.Utilisation d'un gradient de pH préformé pour que la particule s'arrète à son pHi. . On prépare un gel dans lequel on établit le gradient de pH.

on sépare ainsi environ 1000 protéines dans le sérum ! .Electrophorèse à deux dimensions On sépare selon le pHi dans une dimension (IEF) et selon la masse molaire dans l'autre dimension (PAGE-SDS).

Exemple de l'ensemble des protéines cellulaires (plaquettes humaines) qui sont passée sur une première dimension (électrofocalisation sur un gradient de pH -voir l'abscisse) qui est ensuite . La lecture nécessite alors un système informatisé d'analyse d'images.On peut établir de cette manière la "carte d'identité protéique" des principaux tissus et organes humains.

La figure ci-dessous (extraite du site Expasy) donne le résultat avec l'ensemble des protéines des plaquettes humaines (attention: beaucoup de protéines transmembranaires sont difficilement solubilisées et n'apparaissent donc pas sur ces électrophorèses -pas plus que sur les autres d'ailleurs).soumis à une électrophorèse en milieu dénaturant dans la direction perpendiculaire à la première (voir l'ordonnée ci-dessous). .

Parmi celles-ci la DIGE (Differential Gel Electrophoresis) .La 2D-DIGE 2D-DIGE (Fluorescence In Gel Electrophoresis) La complexité des échantillons à analyser et à quantifier en protéomique quantitative ont suscités le développement de nouvelles approches plus sensibles et beaucoup plus résolutives. est une des avancées de la protéomique quantitative très utilisé en protéomique du fait de sa fiabilité de quantification dans les tissus complexes Le principe de cette technique réside en la comparaison de deux profils .

Les deux échantillons protéiques à analyser sont marqués par les cyanines. Après le marquage. par l’utilisation de marqueurs fluorescents spécifiques servant à marquer les protéines pour chacun des échantillons. La procédure expérimentale de la DIGE se divise en sept étapes. l’un Cy3 et l’autre Cy5 ainsi qu’un standard interne avec le Cy2. les trois échantillons sont déposés sur un même gel 2D ou les .Cy5 et Cy2).électrophorétiques 2D. sur les groupement ε amines des chaînes latérales des lysines par des fluorophores cyanines ( Cy3. Le marquage est de type covalent par une réaction spécifique.

cm-1 λAbs:550 nm λEm:570 nm Couleur: rouge Cya 5 ε Cy5= 250000 M-1.protéines seront séparées dans une dimension en fonction de leur point isoélectrique et ensuite dans une deuxième dimension en fonction de leur taille. Figure IV-1 Propriétés structurales et chimiques des Cyanines Cya 3 ε Cy3= 150000 M-1. Notons que les deux échantillons comigrent sur le même gel. Cy5 et Cy2. L’analyse se fait dans un premier temps par excitation de fluorescence du gel aux longueurs d’ondes d’excitation des marqueurs Cy3.cm-1 λAbs:640 nm λEm:670 nm Couleur: bleu .

grâce à la présence d'un standard pour chaque gel.l'utilisation des 3 fluorochromes permet de marquer 3 extraits différents et de les faire co-migrer sur le même gel .la fluorescence permet une quantification sur une large gamme dynamique et avec une bonne sensibilté . Les avantages de ce marquage sont les suivants : . la détection des variations protéiques est plus sûre Exemple de gel 2D-DIGE réalisé sur P3S : .l'un des extraits marqué est en fait un mélange à parts égales des extraits à analyser. marqueurs compatibles avec la sprcctrometrie de masse Electrophorese bidimensionnelle réalisée sur des extraits préalablements marqués par des fluorochromes de types cyanines (3 disponibles : Cy2. Cy3 et Cy5). et sert ainsi de standard pour tous les gels .Sensibilité à 125 pg.

L'acquisition des images en fluorescence est assurée par le scanner Ettan DIGE Imager. .Image Cy2 + Cy3 + Cy5 image Cy3 Image Cy5 Image Cy2 (standard) La plate-forme est équipé d'une cuve permettant la migration simultanée de 6 gels 2D-DIGE. Deux logiciels d'analyse d'images sont disponibles pour comparer les gels : Decyder (GE Healthcare) et SameSpots (Nonlinear Dynamics). soient 12 extraits différents.

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