ELECTROPHORESE Migration de particules chargées sous l'effet d'un champ électrique.

La particule atteint très rapidement une vitesse limite v= qE/f avec q: charge de la particule; E: champ électrique; f: coefficient de frottement particule/solvant. I-L'électrophorèse en veine libre est réservée à des grosses particules (organites, cellules). Elle est presque inutilisable avec des macromolécules comme les protéines et les acides nucléiques. II-L'électrophorèse sur support: Pour éviter les inconvénients observés en veine libre, l'électrophorèse se passe sur un support (gel) qui assure un double rôle : -diminuer les courants de diffusions dus à des micro hétérogénéités de température. -servir de tamis moléculaire, dont la maille va dépendre du support utilisé. Les aspects théoriques de la chromatographie sont peu utilisables et seule une description des méthodes

est faite ci-dessous. Papier et acétate de cellulose: surtout utilisée soit pour des peptides (obtenus par digestion protéasique de protéines) soit pour des milieux complexes (plasma).

Gels Une substance chimique forme un gel plus ou moins serré. Les mailles seront d'autant plus lâches que l'on veut séparer des petites molécules. Au contraire,

on obtient des mailles très différentes par polymérisation. Il existe deux types principaux de gels: Gel de polyacrylamide En faisant varier la concentration d'acrylamide et methylène (bis acrylamide).pour séparer des grosses particules (RNA. DNA) il faut utiliser des mailles très peu serrées. CH2=CH-CO-NH2 acrylamide (CH2=CHCONH)2CH méthylène bis acrylamide Principe de l'électrophorèse sur gel de polyacrylamide .

Le gel est surtout utilisé avec les protéines qui .

dont la charge négative et la longueur sont toutes deux proportionnelles à la masse moléculaire de la partie polypeptidique (attention aux protéines glycosylées). Cette méthode permet de déterminer rapidement une masse moléculaire approximative . qui dénature complétement les protéines (surtout en présence d'urée et de ß-mercaptoéthanol qui coupe les ponts disulfure) pour donner des batonnets de 18Å de diamètre.peuvent être : -natives(migration en fonction de leur taille et charge sous forme repliée).Na+). -le plus souvent dénaturées par différents agents tels que le SDS (sodium dodécyl sulfate CH3-(CH2)12OSO3.

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dans ce cas. l'intégration des pics permet une analyse quantitative des fractions.).La révélation des fractions peut être globale (rouge Ponceau. bleu de Coomassie) ou spécifique (révélation des lipoprotéines avec un colorant des lipides.. révélation d'une activité enzymatique.. ou encore le dosage peut être effectué après élution des fractions . La lecture peut se faire à l'oeil nu (analyse qualitative) ou par densitométrie (enregistrement de l'absorbance en fonction de la distance de migration) . vert de lissamine. Amido-schwartz.

les résidus glycosylés sont oxydés par PAS) ou indirecte après transfert sur feuille de plastique (nitrocellulose . les acides aminés délétés sont indiqués par le symbole ∆. Le gènes introduits dans des plasmides d'expression contiennent seulement des fragments de la séquence totale (indiqués par le n° des acides aminés conservés).. Cette protéine contient 586 acides aminés dans sa forme entière.coli .Roy.02ng). correpond à différentes constructions obtenues par expression dans E. Dans le cas où la délétion porte sur des acides aminés situés à l'intérieur de la séquence.) par interaction avec le ligand "naturel" (ou synthétique) d'un "récepteur" (overlay) ou avec un anticorps spécifique (immunodétection ou Western). directe (les peptides: bleu de coumassie (0.La détection des protéines utilise différentes (méthodes de coloration. . Il s'agit de plusieurs "mutants" de la protéine appelée Ezrine . Coloration au Bleu de Coumassie Le gel ci-dessous.1ng) ou Ag (0. dû au Dr Ch.

Cette feuille est ensuite mise en contact avec une solution d'anticorps polyclonaux anti-ezrine. Après lavage pour se débarrasser des anticorps ayant réagi .Révélation dite "Western" L'exemple ci-dessous correspond au gel décrit juste au dessus. sur lesquels a été fixée de façon covalente de la peroxydase (généralement de raifort). Les protéines sur le gel sont transférées sur une feuille de plastique (nitrocellulose ou mieux "Immobilon" de chez Millipore) par électroélution. qui avait été révélé au bleu de Coumassie.

La peroxydase fabrique des radicaux libres à partir de l'eau oxygénée. du 4iodophenol et de l'eau oxygénée H2O2. Finalement le résultat est donné ci-dessous. Les photons émis sont alors détectés par un film photographique (autoradiographie) ou un phosphore-imageur. . Ceux-ci sont très efficacement captés puis transmis au luminol qui est alors oxydé en un composé sous son état excité. qui émettra alors des photons lors de sa désactivation.de façon non spécifique. le film est mis en contact avec un milieu d'ECL (enhanced chemiluminescence) contenant du luminol.

. Agarose . . protéine A .avec des anticorps marqués de façon radioactive.) ou autre (biotine.. comme dans les immunodosages.).avec des anticorps marqués de façon enzymatique (phosphatase alcaline. .avec des systèmes sandwich. peroxydase ...Bien entendu des révélations similaires sont aussi possibles (quoique parfois moins sensibles) : .

la détection se fait généralement soit par un colorant fluorescent (bromure d'éthidium . sonde antigénique ....) qui s'intercale entre les bases. .) après transfert sur feuille de nitrocellulose (Southern et Northern). dans ce cas. utilisable pour les acides nucléiques.L'agarose est un polysaccharide qui forme une gel très lâche. soit par une sonde complémentaire marquée (radioactivité.

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La révélation se fait le plus souvent par électrotransfert suivi d'une réaction spécifique avec une sonde (radioactive. marquée comme ci-dessus) de séquence complémentaire de celle recherchée sur un ADN (révélation dite "Southern") ou sur un ARN (révélation dite "Northern") .

la séparation se fait bien en fonction de la taille de la particule. Il quitte donc son chemin préférentiel. Il est plus difficile de séparer des très longs ADN. Electrofocalisation . avec plus ou moins de succès selon les cas. Cela a pour effet de faire que l'ADN se repelotonne. une électrophorèse dite à champ pulsé existe. Ceci a pour effet que la séparation ne se fait plus en fonction de la taille des acides nucléiques puisqu'ils nt tous le même diamètre. Pendant ce temps.Ce type d'électrophorèse marche très bien pour séparer des acides nucléiques de quelques dizaines à quelques centaines de bases (ou de paires de bases). L'idée de base est de changer la polarité du champ électrique de temps à autre. qui ont tendance à se glisser dans les pores comme un vers. Pour éviter cet inconvénient. Il lui faut du temps pour qu'il reprenne la forme d'un vers.

L'électrofocalisation bidimensionnelle est une méthode qui permet d'obtenir une courbe de titrage d'une protéine donnée (charge = fonction du pH). après quoi on tourne la plaque de 90 ° et on fait à nouveau passer un courant électrique. On prépare un gel dans lequel on établit le gradient de pH. . puis on dépose dans une rigole centrale la solution de protéine.Utilisation d'un gradient de pH préformé pour que la particule s'arrète à son pHi.

Electrophorèse à deux dimensions On sépare selon le pHi dans une dimension (IEF) et selon la masse molaire dans l'autre dimension (PAGE-SDS). on sépare ainsi environ 1000 protéines dans le sérum ! .

La lecture nécessite alors un système informatisé d'analyse d'images.On peut établir de cette manière la "carte d'identité protéique" des principaux tissus et organes humains. Exemple de l'ensemble des protéines cellulaires (plaquettes humaines) qui sont passée sur une première dimension (électrofocalisation sur un gradient de pH -voir l'abscisse) qui est ensuite .

La figure ci-dessous (extraite du site Expasy) donne le résultat avec l'ensemble des protéines des plaquettes humaines (attention: beaucoup de protéines transmembranaires sont difficilement solubilisées et n'apparaissent donc pas sur ces électrophorèses -pas plus que sur les autres d'ailleurs).soumis à une électrophorèse en milieu dénaturant dans la direction perpendiculaire à la première (voir l'ordonnée ci-dessous). .

Parmi celles-ci la DIGE (Differential Gel Electrophoresis) .La 2D-DIGE 2D-DIGE (Fluorescence In Gel Electrophoresis) La complexité des échantillons à analyser et à quantifier en protéomique quantitative ont suscités le développement de nouvelles approches plus sensibles et beaucoup plus résolutives. est une des avancées de la protéomique quantitative très utilisé en protéomique du fait de sa fiabilité de quantification dans les tissus complexes Le principe de cette technique réside en la comparaison de deux profils .

sur les groupement ε amines des chaînes latérales des lysines par des fluorophores cyanines ( Cy3. l’un Cy3 et l’autre Cy5 ainsi qu’un standard interne avec le Cy2.électrophorétiques 2D.Cy5 et Cy2). les trois échantillons sont déposés sur un même gel 2D ou les . Le marquage est de type covalent par une réaction spécifique. par l’utilisation de marqueurs fluorescents spécifiques servant à marquer les protéines pour chacun des échantillons. Les deux échantillons protéiques à analyser sont marqués par les cyanines. La procédure expérimentale de la DIGE se divise en sept étapes. Après le marquage.

L’analyse se fait dans un premier temps par excitation de fluorescence du gel aux longueurs d’ondes d’excitation des marqueurs Cy3. Notons que les deux échantillons comigrent sur le même gel.protéines seront séparées dans une dimension en fonction de leur point isoélectrique et ensuite dans une deuxième dimension en fonction de leur taille. Figure IV-1 Propriétés structurales et chimiques des Cyanines Cya 3 ε Cy3= 150000 M-1.cm-1 λAbs:640 nm λEm:670 nm Couleur: bleu .cm-1 λAbs:550 nm λEm:570 nm Couleur: rouge Cya 5 ε Cy5= 250000 M-1. Cy5 et Cy2.

et sert ainsi de standard pour tous les gels . Cy3 et Cy5).l'un des extraits marqué est en fait un mélange à parts égales des extraits à analyser.l'utilisation des 3 fluorochromes permet de marquer 3 extraits différents et de les faire co-migrer sur le même gel . marqueurs compatibles avec la sprcctrometrie de masse Electrophorese bidimensionnelle réalisée sur des extraits préalablements marqués par des fluorochromes de types cyanines (3 disponibles : Cy2.la fluorescence permet une quantification sur une large gamme dynamique et avec une bonne sensibilté .grâce à la présence d'un standard pour chaque gel. Les avantages de ce marquage sont les suivants : .Sensibilité à 125 pg. la détection des variations protéiques est plus sûre Exemple de gel 2D-DIGE réalisé sur P3S : .

soient 12 extraits différents. Deux logiciels d'analyse d'images sont disponibles pour comparer les gels : Decyder (GE Healthcare) et SameSpots (Nonlinear Dynamics). L'acquisition des images en fluorescence est assurée par le scanner Ettan DIGE Imager. .Image Cy2 + Cy3 + Cy5 image Cy3 Image Cy5 Image Cy2 (standard) La plate-forme est équipé d'une cuve permettant la migration simultanée de 6 gels 2D-DIGE.

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