Squence de deuxime trimestre de lanne de terminale STL Biotechnologies

Obtention dun lait teneur rduite en lactose de lactase l'aide de micro-organisme producteur de bta-galactosidase Activits technologiques Caractrisation dun microorganisme producteur de beta-galactosidase, Production, extraction (purification) de lenzyme, tude de lactivit enzymatique de lextrait obtenu

Comptences vises : Exploiter des ressources documentaires et des activits exprimentales pour prsenter les proprits structurales et catalytiques des enzymes (beta-galactosidase) ; Identifier des microorganismes (producteurs de beta galactosidase) ; Observer et dcrire les caractristiques morphologiques et microscopiques des moisissures Mettre en uvre une identification de bactrie par une galerie miniaturise ; Mettre en vidence qualitativement une biomolcule (test ONPG) Mettre en uvre un suivi de croissance dune bactrie ( E.coli) Utiliser une technique unitaire de fractionnement pour extraire ou purifier des biomolcules (centrifugation) ; Effectuer une purification denzyme et tablir le tableau de suivi ; Dterminer la vitesse initiale dune raction enzymatique en suivant le produit form (ONPG ONP).

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Contexte mobilisateur : Thme : sant / bioindustries : production de lait teneur rduite en lactose (personnes alactasiques) Situation dclenchante pour une mise en activit des lves : tiquette du lait Viva de Candia, tiquette du lait matin lger de Lactel,

Analyser les deux tiquettes pour mettre en vidence le lien entre largument commercial et la composition du lait

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Questionnaire et recherche de ressources documentaires pour la mise en action des lves. Quest-ce que la lactase ? (enzyme : protine recherche dimages de molcules sur internet, substrat et produits : images de molcules sur internet, en lien avec CBSV). Quel est le rle de la lactase dans la digestion chez l'homme? Quel est le rle de la lactase comme additif dans le lait ? Comment est produite la lactase, quelles sont les conditions de production de cette enzyme chez les bactries ? (induction, TC, pH) Comment mettre en vidence lactivit beta gal dun microorganisme au laboratoire ?

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Planification et contenus de la squence

Sance 1 -La lactase : rle, production Activits technologiques 1 - Exploitation de ressources documentaires : Organisation temporelle 2H, classe entire Recherche documentaire Formes danimation / posture enseignant Travail en groupe / accompagnement Organisation spatiale et logistique CDI Accs internet Ressources pdagogiques TICE (recherche doc) lien CBSV (molcules) Questionnaire Analyse tiquettes questionnaire complt en sance 1 Fiches Comptences de premire (org) Supports thoriques Induction Notice technique API 20 E Support : schmas et/ou photo : identificat ion des moisissures Mthode didentification vue en classe de premire : Support thorique principe croissance : phases, paramtres, effecteurs Trace crite, restitution Prsentation orale : rponses au questionnaire Mise en commun Mode opratoire rdig pour le test ONPG Rsultats obtenus pour les diffrentes souches testes Construction du mode op partir de la notice technique CR identification moisissure & bactrie Courbe de croissance trace au cours du suivi Rinvestissement Collecte dinfos qui seront utilises dans la sance 2

2- Etude de microorganismes producteurs de galactosidase

2-Examen macro et micro de souches moisissures, levures, bactries, repiquage sur milieu lactos, Mise en uvre du test ONPG 3 Mise en vidence de caractres morphologiques, micro et macro, culturaux et mtaboliques d'E.coli et Aspergillus 4 - Suivi de croissance E.coli productrice de galactosidase

2H + 2H : Manipulations

Autonomie dtermination du Mode opratoire pour le test ONPG (principe, ralisation) Accompagnement

Laboratoire Microscope Souches sur milieu solide lactos ractif ONPG Bain thermostat

Vrification cible dun caractre

3 Vrification didentit dun microorganisme producteur de galactosidase

1H travail prliminaire : galerie bactrie et moisissure 3H + 2H : identification Manipulations

Travail binme (mode op API) Mise en uvre individuelle ou en binme Accompagnement

Laboratoire Microscope Bleu coton Sabouraud API 20 E

Choix dirig dune souche pour la sance 4

4 Production de -galactosidase par E.coli

4H : prparation inoculum, mesure absorbance toutes les 15 min Acquisition de concepts Manipulations

Prsentation par le professeur puis accompagnement

Bouillon LB lactos bain agitation thermostat Spectro + cuves

Conservation culture dE.coli avec -gal (mtabolite primaire) pour sance 5

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5 - Rcupration de lenzyme produite par E.coli

5 - Extraction et purification de lenzyme produite par de lenzyme produite par E.coli

1H, Travail prliminaire : rle des tapes ? activit documentaire 3h, Mise en uvre de lextraction Manipulation 2 sances de 3H Dtermination Vi Etude cintique (KM et Vmax)

Travail binme recherche documentaire Groupe datelier

Salle accs internet Labo : bouillon E.coli 48H, centrifugeuse, tampon P, (NH4)2 SO4, alternative la sonication ONPG, spectro, tampon P solution denzyme sance 5 et commerciale

Questionnaire TICE : Annexe 1 purif. CAPET 2005 Mode opratoire adapt au labo

Doc rponse questionnaire rendre au prof (CAPET 2005) Mise en commun Vi, KM et Vmax des deux prparations Compterendu comparaison des deux activits

Les rponses au questionnaire : deviennent support de cours purification denzyme Rcupration de lextrait Commenter et critiquer les rsultats obtenus avec les 2 prparations

6 - Etude de lactivit enzymatique de lextrait obtenu compar une solution commerciale de lactase

6 - Dtermination de lactivit enzymatique de lextrait obtenu et de la solution du commerce Manipulation

Groupe datelier Prsentation de la manip puis accompagnement

Support thorique enzymologie Mode opratoire de lactivit technologique

Evaluation formative Sance 2 r-investissement des comptences acquises en premire (utilisation du microscope, colorations usuelles, isolement) Sance 3 vrification didentit des deux microorganismes producteurs de bta-galactosidase : reprage des acquis de la dmarche et des difficults en vue dune remdiation. Sance 4 valuation des comptences lies la manipulation aseptique lors des prlvements rguliers au cours de la croissance Sance 5 Validation des rponses au questionnaire aprs mise en commun Sance 6 compte-rendu : analyse compare des rsultats et contribution des binmes llaboration de lorganigramme final concernant la thmatique bta-galactosidase

Mise en valeur des productions : Organigramme des manipulations et des rsultats associs depuis le dbut avec mise en commun (prsentation par groupes) et change pour constitution dun document final qui pourra tre publi sur le site du lyce. Documents ressources possibles pour la recherche documentaire (sance 1)
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OH

Source : course1.winona.edu, 02/05/12 source : www2.ac-lyon.fr, 02/05/12

Source : cours-de-biochimie.fr, 02/05/12

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Dtermination de lactivit -galactosidase

Lactivit de la b-galactosidase consiste acclrer la vitesse dhydrolyse de la liaison osidique dun disaccharide appel -galactoside. Les oses librs sont mtaboliss et participent la production dnergie via la glycolyse et le cycle de Krebs. -galactosidase lactose + H2O <=> glucose + galactose Les produits naturels de la raction ntant pas colors, ils sont difficilement dtectables, cest pourquoi la dtermination de lactivit seffectue en prsence dun substrat artificiel (ONPG) dont lun des produits dhydrolyse (ONP) est color et peut tre quantifi par spectrophotomtrie 420 nm. -galactosidase ===> o-nitrophenol (ONP) + galactose

o-nitrophenyl--galactoside Conditions opratoire: Temprature optimale dactivit de lenzyme : 37C Substrat non limitant Mthode cintique Arrt de la raction par alcalinisation du milieu.

Reactions catalyzed by -galactosidase

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OVERVIEW OF ASSAY
Using disposable glass tubes for these assays, you will add 10-50 l of sample to 1 ml of Z buffer, a buffer in which -galactosidase has full activity. The Z buffer containing the sample and the ONPG substrate will then be separately pre-incubated to 37C. The enzymatic reaction will begin as soon as you add the substrate to the samples. After you incubate the tubes for a sufficient length of time, you will terminate the reaction in all the tubes, using the STOP solution (NaCO3 ). Read the sample absorbance on the spectrophotometer after transferring the contents of the tube to a plastic cuvette. 1. Make a Flow Chart. Begin your preparations by making a flow chart or outline that details exactly what you are going to do in this assay. Save this flow chart as you did for the Bradford Assay and modify it as you refine and streamline your technique. 2. Turn On The Spec. Turn on the spectrophotometer and set the wavelength to 420 nm. 3. Dilute The Sample(s). In your first assay you will be using a sample of -galactosidase provided by your instructor. It will be your job to determine the activity of this sample. (After starting the purification, you will be using your own samples.) Prepare a few dilutions of this sample. What will be the diluent? 4. Add The Samples and Control To Z Buffer. Add 10-50 l of the diluted sample(s) to 1 ml of Z buffer. As always, remember to write down how much sample you used. 5. Prepare a control tube by adding a volume of buffer that is equal to the volume of sample used in step 4 (10-50 l) to a tube containing 1 ml of Z buffer. This functions as a control for the spontaneous hydrolysis of your substrate, ONPG, and will serve as your calibration blank for the spectrophotometer. 6. Equilibrate. Equilibrate the samples to be assayed to 37C. Make sure the ONPG (4 mg/ml in 0.1 M sodium phosphate buffer pH 7.5) is also at 37C. Prepare fresh ONPG solution each day. 7. Begin The Reaction. Add 0.2 ml of ONPG to each tube and record the time. 8. Incubate. Incubate the samples at 37C until yellow color appears. The color change should take at least 10 minutes but may take longer to result in an absorbance of 0.3 to 0.9. A very rapid color change (1-5 minutes) indicates that there is too much activity to measure accurately. Such samples should be repeated at a higher dilution. Samples containing low concentrations of -galactosidase may take significantly longer than 10 minutes to become yellow. (Why is a rapid color change (0.5 O.D. in 2 minutes) not accurate?) 9. Stop The Reaction. Add 0.5 ml of 1 M NaC03 (Stop Solution) to terminate the reaction and record the time. 10. Read The Samples. Transfer the samples to plastic cuvettes and read the A420 against the blank. 11. Determine The Enzyme Activity: Calculate the enzyme activity present in your sample using the formula shown below: A420 x 0.380 --------------------minutes at 37 C 12. One unit is the amount of enzyme that will hydrolyze 10-6 moles/minute of ONPG at 37C and 0.380 in the above equation is the constant used to convert the A420 reading into these units. This constant is a function of the molar extinction coefficient for ONP+ that, under these conditions, is 4500 M-1cm-1. What is a molar extinction coefficient?
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Units of -galactosidase

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