UNIVERSITE D ANTANANARIVO FACULTE DES SCIENCES

DEPARTEMENT DE BIOCHIMIE FONDAMENTALE ET APPLIQUEE

MEMOIRE POUR LOBTENTION DU DIPLOME DETUDES APPROFONDIES (D.E.A) DE BIOCHIMIE

OPTION : BIOCHIMIE APPLIQUEE AUX SCIENCES MEDICALES

Prsent par :

RANDRIANAMBININTSOA Louis Valentin

Matre s Sciences

ETUDE CHIMIQUE ET TOXICOLOGIQUE DEXTRAITS ALCALODIQUES DE TUBERCULES DE Dioscorea esculenta (DIOSCOREACEAE)

Soutenu le : 07 Avril 2006

Devant la commission dexamen compose de :

Prsident Rapporteur

: Professeur RALISON Charlotte : Professeur JEANNODA Victor

Examinateurs : Professeur RAZANAMPARANY Louisette Docteur RADRIANIERENANA Ando

DEDICACES

Par la grce de Dieu je suis ce que je suis, et sa grce envers moi na pas t vaine ; loin de l, jai travaill plus queux tous, non pas moi toutefois, mais la grce de Dieu qui est avec moi. I Corinthiens 15 : 10.

A ma mre, qui a tant de patience et dencouragement pour moi durant toutes mes tudes. Quelle trouve ici les rsultats aprs ces longues annes.

A ma sur, qui ma toujours donn dencouragement et des conseils. Quelle trouve ici limportance de sa prcieuse aide.

A mes neveux Eric et Ericka, quils trouvent ici un des modles suivre.

Valentin

REMERCIEMENTS

Le prsent travail a t ralis au : Laboratoire de Biochimie Applique aux Sciences Mdicales du Dpartement de Biochimie Fondamentale et Applique de la Facult des Sciences de lUniversit dAntananarivo ; Laboratoire Central dAnatomie Pathologique du CHU-JRA ; Laboratoire de Microbiologie de la MPE. Je voudrais adresser mes plus vifs remerciements Monsieur le Professeur Victor JEANNODA, Chef de Dpartement de Biochimie Fondamentale et Applique, Responsable de la formation en 3me cycle en Biochimie, pour mavoir accueilli dans son laboratoire et aimablement accept dencadrer mon stage et de rapporter ce travail. Je lui adresse ma profonde gratitude pour son aide et ses prcieux conseils pendant toute la ralisation de ce mmoire, malgr ses nombreuses responsabilits. Jexprime ma profonde reconnaissance Madame le Docteur Danielle A. D. RAKOTORANOROMALALA, Matre de confrences, davoir bien voulu accepter de co-encadrer mon stage. Je tiens la remercier pour son aide et ses suggestions dans llaboration et la finition de ce travail, malgr ses multiples occupations. Jadresse mes chaleureux remerciements Madame le Professeur Charlotte RALISON qui a aimablement accept de prsider le jury de ce mmoire, malgr ses diverses obligations. Je tiens remercier Madame le Professeur Louisette RAZANAMPARANY et Madame le Docteur Ando RANDRIANIERENANA qui me font lhonneur dexaminer ce prsent travail, malgr leurs nombreuses activits. Ma gratitude sadresse galement : Monsieur le Docteur RAFALIMANANA Christian, Chef du Laboratoire de Microbiologie du CHU-JRA Antananarivo, pour ses conseils et son troite collaboration dans la ralisation des tests sur les micro-organismes ; les chercheurs de la MPE Nanisana, de bien vouloir maccueillir dans leur laboratoire et pour mavoir apport une aide technique pour la ralisation des tests sur les microorganismes ;

ii lquipe de laboratoire Central dAnatomie pathologique du CHU-JRA pour sa collaboration ltude histopathologique ; Madame le Docteur Clara F. RAJEMIARIMOELISOA, Directeur de lUnit de Contrle de Qualit des Denres Alimentaires, pour mavoir aid interprter les coupes histopathologiques; Messieurs le Docteur Ranjna H. RANDRIANARIVO et le Docteur Lovasoa

RAKOTONDRAZANAKA, pour leur aide et conseil tout au long de la ralisation de ce travail au Laboratoire de Biochimie Applique aux Sciences Mdicales. Les chercheurs des Laboratoires du Dpartement de Biochimie Fondamentale et Applique, pour leur prcieuse collaboration durant mon stage. Enfin, jadresse mes plus vifs remerciements tous ceux qui, de prs ou de loin, ont attribu la ralisation de ce mmoire.

TABLE DES MATIERES

Pages Ddicaces Remerciements Table des matiresi Abrviations et acronymesvii Glossaire...viii Liste des figures..ix Liste des tableaux.....x INTRODUCTION GENERALE.............1 GENERALITES SUR LES IGNAMES 1. Gnralits sur Dioscorea esculenta...5 2. Description botanique.5 2.1. Description du genre Dioscorea..5 2.2. Description de Dioscorea esculenta...6 3. Utilisations des ignames..6 3.1. Utilisations alimentaires des ignames.....6 3.2. Utilisations thrapeutiques des ignames......6 3.3. Utilisations des ignames toxiques7 4. Etudes approfondies sur les alcalodes de Dioscorea.9 4.1. Etude chimique....9 4.2. Etude biologique.10 ETUDE CHIMIQUE 1. INTRODUCTION. .. ...11 2. MATERIELS ET METHODES........11 2.1. MATERIELS...11 2.1.1.MATERIEL VEGETAL.....11 2.1.1.1. Classification....11 2.1.1.2. Rpartition gographique.12 2.1.1.3. Date et lieu de rcolte...12 2.1.2. PRODUITS CHIMIQUES .....12

2.2. METHODES.12

ii Pages 2.2.1. PREPARATION DU MATERIEL VEGETAL.12 2.2.2. METHODE DEXTRACTION..12 2.2.2.1. Mthodes dextraction froid.......15 2.2.2.1.1. Extraction en milieu alcalin.....15 2.2.2.1.1.1. Principe.15 2.2.2.1.1.2. Mode opratoire ...15 2.2.2.1.2. Extraction en milieu acide...15 2.2.2.1.2.1. Principe....15 2.2.2.1.2.2. Mode opratoire...16 2.2.2.2. Mthodes dextraction chaud..16 2.2.2.2.1. Extraction mthanolique reflux....16 2.2.2.2.1.1. Principe....16 2.2.2.2.1.2. Mode opratoire.......16 2.2.2.2.2. Extraction mthanolique au soxhlet...17 2.2.2.2.2.1. Principe...17 2.2.2.2.2.2. Mode opratoire .17 2.2.3. METHODES DE PURIFICATION....17 2.2.3.1. Traitement par le mlange actone/dithylther...17 2.2.3.1.1. Principe.....17 2.2.3.1.2. Mode opratoire....17 2.2.3.2. Fractionnement par le chloroforme...18 2.2.3.2.1. Principe.....18 2.2.3.2.2. Mode opratoire....18 2.2.3.2.2.1. Alcalinisation..18 2.2.3.2.2.2. Dcantation.....18 2.2.3.3. Traitement pat lactate dthyle19 2.2.3.3.1. Principe.19 2.2.3.3.2. Mode opratoire....19 2.2.4. METHODE DE CONCENTRATION.19 2.2.5. METHODE DE DETERMINATION DE LA TENEUR EN MATIERE SECHE .20 2.2.6.METHODE DE CALCUL DE RENDEMENT....20 2.2.7. METHODES ANALYTIQUES....21

iii Pages 2.2.7.1. Ractions de dtection des alcalodes..21 2.2.7.1.1. Test prliminaire.......21 2.2.7.1.2. Test de confirmation.....21 2.2.7.1.3. Test de dtection des alcalodes dans les extraits............ 22 2.2.7.2. Chromatographie sur couche mince....22 2.2.7.2.1. Principe...........22 2.2.7.2.2. Mode opratoire.....22 2.2.7.2.2.1. Prparation de la plaque.....22 2.2.7.2.2.2. Dpt des chantillons....22 2.2.7.2.2.3. Dveloppement du chromatogramme..23 2.2.7.2.2.4. Rvlation du chromatogramme.........23 3. RESULTATS....23 3.1. TENEUR EN MATIERE SECHE....23 3.2. PREPARATION DE LEXTRAIT BRUT.......24 3.3. PURIFICATION......25 3.3.1. PRECIPITATION PAR LE MELANGE ACETONE/DIETHYLETHER...25 3.3.2. FRACTIONNEMENT PAR LE CHLOROFORME........25 3.3.3. TRAITEMENT PAR LACETATE DETHYLE.....27 3.4. RENDEMENT....... 27 3.5. ETUDE DE LHOMOGENEITE DES DIFFERENTS EXTRAITS...29 3.6. NATURE CHIMIQUE ET PROPRIETES PHYSICO-CHIMIQUES.....30 4. DISCUSSION ET CONCLUSION.30 ETUDE BIOLOGIQUE 1. INTRODUCTION..32 2. MATERIELS ET METHODES..32 2.1. MATERIELS32 2.1.1. LES ANIMAUX DEXPERIMENTATION..32 2.1.1.1. Les souris..32 2.1.1.2. Le sang de mouton.32 2.1.1.3. Les larves de moustique.33 2.1.1.4. Les ttards de grenouille....33 2.1.1.5. Les poissons..33 2.1.2. LES PLANTES DEXPERIMENTATION.33

iv Pages 2.1.3. LES MICRO-ORGANISMES UTILISES...34 2.1.4. LES MILIEUX DE CULTURE.34 2.1.4. 1. Les milieux denrichissement..34 2.1.4.1.1. Le bouillon nutritif ..34 2.1.4.1.2. La glose nutritive34 2.1.4.2. Les milieux disolement et de purification des germes..34 2.1.4.2.1. Le milieu Salmonella-Shigella (SS)..34 2.1.4.2.2. Le milieu Hektoen.....34 2.1.4.2.3. Le milieu Brillant Green Agar (BGA) ou vert brillant...34 2.1.4.2.4. Le milieu Eosine Methylene Blue (EMB).35 2.1.4.2.5. La glose au sang...35 2.1.4.3. Les milieux de dtermination des caractres biochimiques des bactries...35 2.1.4.3.1. Le milieu citrate de SIMMONS ..35 2.1.4.3.2. Le milieu HAJNA-KLIGLER : lactose-glucose-H2S....36 2.1.4.3.3. Le milieu mannitol-mobilit..36 2.1.4.3.4. Le milieu ure-indole.36 2.1.4.3.5. La lysine dcarboxylase (LDC), lornithine dcarboxylase (ODC) et larginine dihydrolase (ADH)...36 2.1.4.3.6. Les disques36 2.1.4.3.6.1. Les disques ortho-nitro-phnyl D-galactopyranoside (ONPG)36 2.1.4.3.6.2. Les disques pour le test de loxydase.....36 2.1.4.4. Le milieu dtude dactivit antibactrienne...36 2.2. METHODES37 2.2.1. METHODES DETUDE DES EFFETS SUR LES ANIMAUX A SANG CHAUD..37 2.2.1.1. Tests sur souris...37 2.2.1.1.1. Estimation de la toxicit37 2.2.1.1.2.2.Examen histopathologique..37 2.2.1.1.2.2.Prlvement et fixation des organes37 2.2.1.1.2.1. Inclusion.37 2.2.1.1.2.2. Microtomie, circulation et talement des coupes...38 2.2.1.1.2.3. Coloration et observation des coupes38

2.2.1.2. Tests sur les hmaties demouton...38

v Pages 2.2.1.2.1. Principe....38 2.2.1.2.2. Mode opratoire...39 2.2.1.2.2.1. Prlvement et prparation des hmaties.39 2.2.1.2.2.2. Test hmolytique..39 2.2.2. METHODES DETUDE DES EFFETS SUR LES ANIMAUX A SANG FROID.....40 2.2.2.1. Mode opratoire..40 2.2.2.2. Dtermination de la CL50 (24h)..........40 2.2.3. METHODE DETUDE DES EFFETS SUR LES VEGETAUX...41 2.2.3.1. Etude des effets sur le pouvoir germinatif des graines..41 2.2.3.2. Etude de la croissance de jeunes plantules....41 2.2.3.3. Etude de la croissance des bourgeons axillaires ...42 2.2.4. METHODES DETUDE DES EFFETS SUR LES MICRO-ORGANISMES..42 2.2.4.1. Prparation des souches.....42 2.2.4.1.1. Prlvement des germes...42 2.2.4.1.2. Observation ltat frais..43 2.2.4.1.3. Enrichissement des germes..43 2.2.4.1.4. Isolement et purification..43 2.2.4.1.5. Ractivation des souches43 2.2.4.2. Identification et caractrisation des souches.....44 2.2.4.2.1. Mthode de coloration de GRAM..44 2.2.4.2.2. Dtermination des caractres biochimiques...44 2.2.4.2.2.1. Culture sur le milieu citrate de SIMMONS.....44 2.2.4.2.2.2. Culture sur le milieu HAJNA-KLIGLER : lactose-glucose H2S.....44 2.2.4.2.2.3. Culture sur le mannitol-mobilit..45 2.2.4.2.2.4. Culture sur le milieu ure-indole.45 2.2.4.2.2.5. Culture sur milieux LDC, ODC et ADH.45 2.2.4.2.2.6. Test lONPG.45 2.2.4.2.2.7. Test de loxydase.46 2.2.4.3. Mthodes de dtermination des effets sur les bactries......47

vi Pages 2.2.4.3.1. Mthodes en milieu liquide.. 47 2.2.4.3.1.1. Principe.....47 2.2.4.3.1.2. Mode opratoire...47 2.2.4.3.2. Mthode en milieu solide.....48 2.2.4.3.2.1. Principe..48 2.2.4.3.2.2. Mode opratoire.48 2.2.4.3.2.2.1. Prparation de linoculum et ensemencement 48 2.2.4.3.2.2.2. Dpt dextrait.48 3. RESULTATS49 3.1. EFFETS SUR LES ANIMAUX....49 3.1.1. EFFETS SUR LES ANIMAUX A SANG CHAUD...49 3.1.1.1 Effets sur les souris.49 3.1.1.1.1. Influence des diffrentes voies dadministration.49 3.1.1.1.2. Description des symptmes.50 3.1.1.1.3. Examen histopathologique..50 3.1.1.2. Effets sur les hmaties de mouton.....50 3.1.2. EFFETS SUR LES ANIMAUX A SANG FROID....57 3.1.2.1. Effets sur les larves de moustique.....57 3.1.2.2. Effets sur les ttards de grenouille....58 3.1.2.3. Effets sur les poissons..58 3.2. EFFETS DE LEXTRAIT SUR LES VEGETAUX ......59 3.2.1. EFFETS SUR LE POUVOIR GERMINATIF DES GRAINES... 59 3.2.2. EFFETS SUR LA CROISSANCE DE JEUNES PLANTULES60 3.2.3. EFFETS SUR LA CROISSANCE DES BOURGEONS AXILLAIRES...64 3.3. EFFETS SUR LES MICRO-ORGANISMES..65 3.3.1. ISOLEMENT ET IDENTIFICATION DES GERMES..65 3.3.2. SPECTRE DACTIVITE MICROBIENNE....66 3.3.2.1. Activit en milieu liquide.66 3.3.2.2. Activit en milieu solide.....66 4. DISCUSSION ET CONCLUSION....68 CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES...70 REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES.71 ANNEXES79

ABREVIATIONS ET ACRONYMES

vii

ADH : Arginine Dihydrolase BAE : n-Butanol / Acide actique / Eau distille CCM : Chromatographie sur Couche Mince CHU-JRA : Centre Hospitalier Universitaire Joseph Ravoahangy Andrianavalona CL50 : Concentration Ltale 50% DDT : Trichloro 1-1-1-bis (p-chlorophnyl) 2-2-thane EB : Extrait Brut FOFIFA : Foibem-pirenena momba ny Fikarohana ampiharina ho aminny Fampandrosoana ny eny Ambanivohitra IMVAVET : Institut Malgache des Vaccins Vtrinaires ip : intra pritonale IPM : Institut Pasteur de Madagascar LDC : Lysine Dcarboxylase LABASM : Laboratoire de Biochimie Applique aux Sciences Mdicales MPE : Maison de Petit Elevage min : minute N : Normal nm : nanomtre ODC : Ornithine Dcarboxylase ONPG : Ortho-Nitro-Phnyl D-Galactopyranoside OMS : Organisation Mondiale de la Sant PBS : Phosphate Buffered Saline p/p : poids par poids p/p/p/ : poids par poids par poids p/v : poids par volume qsp : quantit suffisante pour UV : Ultra-violet v/v : volume par volume

viii

GLOSSAIRE

Analgsie

: diminution de la sensation douloureuse ne saccompagnant pas de perte de conscience

Anesthsie

: diminution de la sensation douloureuse avec ou sans perte de conscience

Antibiotique

: substance capable dempcher le dveloppement des microorganismes

Ataxie

: incoordination des mouvements volontaires

Barrire hmato-encphalique : obstacle form par les jonctions serres de lendothlium vasculaire et lespace extracellulaire crbral troit Cardiotonique : substance qui augmente lefficacit de la contraction cardiaque Hmolyse Hyperpne Hypoactivit motrice Hypotension Mydriase Pilorection Rcepteur Rsistance priphrique : destruction des globules rouges : acclration de la frquence respiratoire : rduction de la frquence des mouvements : diminution de la tension sanguine : dilatation de la pupille : rection des poils : protine priphrique membranaire recevant un signal : pression applique par les vaisseaux sanguins lextrieur du cur Vasoconstriction : rduction du calibre des vaisseaux sanguins

ix

LISTE DES FIGURES

Figure 1 : Dioscorea esculenta :1) feuilles 2) tubercules13 Figure 2 : Rpartition gographique de Dioscorea esculenta...14 Figure 3 : Schma rcapitulatif de lextraction et des diffrentes tapes de la purification des alcalodes partir de la poudre de tubercules secs...28 Figure 4 : Chromatographie sur couche mince des extraits a) plaque non pulverise b) plaque pulverise 1) extrait brut 2) extrait brut 3) extrait E1 4) extrait E2......29 Figure 5 : Lsions histologiques au niveau de lestomac dues ladministration par voie ip de lextrait la dose de 840mg/kg de poids a) estomac non trait b) estomac trait...51 Figure 6 : Lsions histologiques au niveau du foie dues ladministration par voie ip de lextrait la dose de 840mg/kg de poids c) foie non trait d) foie trait.............52 Figure 7 : Lsions histologiques au niveau de lintestin dues ladministration par voie ip de lextrait la dose de 840mg/kg de poids e) intestin non trait f) intestin trait...53 Figure 8 : Lsions histologiques au niveau des reins dues ladministration par voie ip de lextrait la dose de 840mg/kg de poids g) rein non trait h) rein trait.54 Figure 9 : Lsions histologiques au niveau des poumons dues ladministration par voie ip de lextrait la dose de 840mg/kg de poids i) poumon non trait j) poumon trait.55 Figure 10 : Rsultats des tests hmolytiques sur le sang de mouton....56 Figure 11 : Etapes de lexprience sur la croissance de jeunes plantules60 Figure 12 : Evolution de la longueur de lpicotyle (A) et de lhypocotyle (B) de petit pois en prsence des diffrentes concentrations de lextrait61 Figure 13 : Evolution de la longueur de lpicotyle (C) et de lhypocotyle (D) de mas en prsence des diffrentes concentrations de lextrait...62 Figure 14 : Effets de lextrait (28g) sur la croissance des bourgeons axillaires en comparaison avec ceux de la gibbrelline (28g), de lauxine (28g) et de leau de pluie EP (tmoin)..64

LISTE DES TABLEAUX

Tableau 1 : Indications thrapeutiques de quelques espces de Dioscorea.7 Tableau 2 : Quelques principes actifs de Dioscorea et leurs proprits pharmacologiques.8 Tableau 3 : Quelques utilisations des ignames toxiques...8 Tableau 4 : Norme utilise pour exprimer les rsultats des tests des alcalodes.21 Tableau 5 : Rsultats des diffrents types dextraction..24 Tableau 6 : Caractristiques des extraits obtenus par traitement par le chloroforme en fonction du type dextrait brut.......26 Tableau 7 : Graines utilises pour les expriences sur les vgtaux...33 Tableau 8 : Composition des milieux utiliss pour le test hmolytique.35 Tableau 9 : Milieux spcifiques servant isoler les diffrents germes..40 Tableau 10 : Tableau rcapitulatif des diffrents tests didentification...46 Tableau 11 : Liste des antibiotiques utiliss et leurs germes-cibles....48 Tableau 12 : Normes utilises dans lexpression des rsultats....49 Tableau 13 : Influence des voies dadministration..49 Tableau 14 : Principales lsions histologiques provoques par la dose de 840 mg/kg dextrait administr par voie ip..50 Tableau 15 : Rsultats des tests hmolytiques des extraits E1 et E2..56 Tableau 16 : Rsultats des tests sur les larves de moustique..57 Tableau 17 : Rsultats des tests sur les ttards de grenouille..58 Tableau 18 : Rsultats des tests sur les poissons....................................................................58 Tableau 19 : Effet de lextrait 1mg/kg sur le pouvoir germinatif de graines...59 Tableau 20 : Taux dinhibition de la croissance de lpicotyle et de lhypocotyle de petit pois et de mas au 14me jour de lexprience63 Tableau 21 : Rsultats de lidentification et de la caractrisation des souches...65 Tableau 22 : Composition des milieux utiliss pour le test dactivit antimicrobienne et rsultats....66 Tableau 23 : Rsultats du test dactivit antimicrobienne en milieu solide67 Tableau 24 : Liste des antibiotiques utiliss avec leurs quantits respectives et leurs germes-cibles.67

INTRODUCTION GENERALE

11 Les toxines sont des substances dorigine naturelle capables de troubler ou dinterrompre les fonctions vitales dun organisme auquel elles ont t administres volontairement ou accidentellement. Ces toxines peuvent provenir danimaux, de vgtaux ou dorganismes microbiens (RICHARD et coll., 1997). Lintoxication pourrait tre due la morsure ou la piqre danimaux, ou encore la consommation daliments ou dorganismes toxiques (CALNEK, 1997). La connaissance et lexploitation des toxines remontent des temps trs anciens. Lhomme, bien que conscient des dangers que reprsentent les substances toxiques, a toujours su tirer profit des proprits des organismes toxiques. En effet, il les utilise pour la pche, la chasse, la lutte contre les animaux nuisibles, pour rendre la justice, pour se soigner ou pour empoisonner son prochain. Avec le dveloppement de nombreuses disciplines scientifiques : la physique, la chimie, la physiologie, la pharmacologie, la mdecine et la biochimie, la toxicologie, qui est la science des poisons, a connu un grand essor. La recherche sur les toxines a abouti lisolement de plusieurs molcules actives de nature chimique varie (alcalode, acide amin, protine, strode, ...) et possdant diffrentes proprits biologiques (neurotoxique, cardiotonique, antibiotique, ichtyotoxique,...). Les toxines ainsi obtenues peuvent tre utilises comme outils dans la comprhension de processus biologiques ou dans la thrapeutique de certaines maladies. Ainsi, pour les toxines dorigine animale on peut citer (HABERMEHL, 1981) : la phosphodiestrase dcouverte dans le venin de serpent Naja naja ou Cobra (Elapidae) qui a t utilise pour lucider la biosynthse des acides nucliques ; la toxine du venin de scorpion, un peptide de 61 acides amins provoquant une douleur svre qui aide la connaissance des analgsiques ; Les toxines peuvent aussi provenir de vgtaux. A titre dillustration, on peut citer : la colchicine, un alcalode des graines et des bulbes de Colchicum automnale (crocus dautomne), un antimitotique (cytostatique) qui est utilis comme anticancereux (LESNE, 1982) ; la digitoxine de Digitalis purpurea (Scrofulariaceae), un strode qui accrot la contractilit du muscle cardiaque et augmente lefficacit cardiaque (MOORE et STAUB, 1975) ; labrine de Abrus precatorius (Papillionaceae) et la ricine de Ricinus communis (Euphorbiaceae) (CUATRECASAS, 1977) qui sont des protines provoquant linhibition de

la biosynthse des protines et dont le mcanisme daction a permis de comprendre la rgulation de cette biosynthse. Les vgtaux constituent donc une source importante de toxines. Cest pour cela que le laboratoire de Biochimie Applique aux Sciences Mdicales a orient ses travaux vers lisolement et la caractrisation de principes toxiques de plantes. Beaucoup de toxines ont t isoles dans ce laboratoire. A titre dillustration, on peut citer : la cnestine, un acide amin trouv dans Cnestis glabra, Cnestis polyphylla (JEANNODA, 1986) et Rourea orientalis (RAKOTO-RANOROMALALA, 1984) de la famille de Connaraceae qui est une substance convulsivante ; leupholarine, un ichtyotoxique isol de Euphorbia laro de la famille de Euphorbiaceae (RAHERINIAINA, 2004) ; larnicoline, un saponoside toxique isol de Albizia arenicola (MimosodeaeFabaceae) qui a des proprits bactricides (RANDRIANARIVO, 2003). De nombreuses plantes ont galement donn lieu des travaux approfondis : Rourea orientalis...............................: Connaraceae (RAKOTO-RANOROMALALA, 1984) Cnestis glabra, Cnestis polyphylla.....: Connaraceae (JEANNODA, 1986) Croton mongue..................................: Euphorbiaceae (RALISON, 1987) Boletus affinis Peck........................... : Boletaceae (RAZANAMPARANY, 1987) Tachiadenus longiflorus................... : Gentianaceae (RAKOTO-RANOROMALALA, 1989) Albizia arenicola............................... : Mimosodeae-Fabaceae (RANDRIANARIVO, 1996) Pentatropis madagascariensis......... : Asclepiadaceae (HARINJATOVO, 2001) Henonia scoparia............................ : Amaranthaceae (RAMAHAFALY, 2004) Albizia tulearensis............................ : Mimosodeae-Fabaceae (RAONIHARISOA, 2003) Ocotea madagascariensis................ : Lauraceae (RANDRIAMAHAVALISOA, 2003) Uapaca thouarsii............................. : Euphorbiaceae (RANDRIANANDRASANA, 2004) Physena madagascariensis.............. : Physenaceae (ANDRIANJAKANIRINA, 2004). De nombreux principes toxiques sont des alcalodes cest--dire des bases azotes activits complexes (FOUILLOUZE, 1951). Des tudes approfondies ont permis de connatre leurs proprits toxicologiques. Ainsi, par exemple : la nicotine de Nicotiana sp (Solanaceae) qui provoque des tremblements, des convulsions et des paralysies respiratoires (BRUNETON, 1987), la pyrrolizidine de Crotalaria sp (Leguminosae) et de Senecio jacobea (Compositae), et la crotaline de Crotalaria sp (Leguminosae) qui provoquent des ncroses hpatiques (RICHARD et coll., 1997).

22

33 Dautres alcalodes prsentent des proprits pharmacologiques intressantes : la vincristine, la vinblastine, la vindsine et la vinorelbine sont des alcalodes de la pervenche entrant dans la composition des mdicaments anticancreux ; la colchicine extraite de Colchicum automnale (Liliaceae) (EIGSTI et coll., 1995) est utilise comme anti-inflammatoire spcifique de la goutte (LESNE, 1982 ; MOUTCHEN, 1979) et constitue un antimitotique (COHEN et coll., 1979) ; la morphine extraite de Papaver somniferum (Papaveraceae) est utilise comme analgsique (LADURON, 1978) ; latropine isole de Atropa belladona (Solanaceae) est un cardiotonique ; la cocane de Erythroxylum coca Lam (cocaier) (Erythroxylaceae) est utilise comme anesthsique local (BRUNETON, 1987). Dans le cadre dun projet financ par le FADES ou Fonds dAppui pour le Dveloppement de lEnseignement Suprieur, le laboratoire de Biochimie Applique aux Sciences Mdicales travaille sur les plantes de genre Dioscorea ou ignames. Les activits de ce projet consistent entre autres en ltude des valeurs nutritionnelles ainsi que des proprits mdicinales et toxicologiques des ignames. En effet, Madagascar, les ignames sont encore mal connues et peu exploites. Elles sont surtout consommes pendant la priode de soudure. Or, outre lutilisation alimentaire des ignames, ces dernires possdent aussi des vertus pharmacologiques (GRINDLEY et coll., 2002) (voir gnralits sur les ignames). Pour notre part, nous avons choisi de travailler sur les tubercules de Dioscorea esculenta (Dioscoreaceae) pour les diffrentes raisons suivantes : cette plante introduite Madagascar na pas encore fait lobjet dtudes approfondies autres que botaniques ; sa toxicit na pas t rapporte dans la littrature, et ses tubercules sont comestibles et trs apprcis sur la Cte Est de Madagascar ; daprs les tests prliminaires raliss dans le laboratoire de Biochimie Applique aux Sciences Mdicales, elle contient deux principales familles chimiques : les alcalodes et les saponosides. Nos travaux portent sur ltude des alcalodes. Ils comprennent :

44 la mise en vidence de la prsence dalcalodes dans les tubercules de Dioscorea esculenta, la purification des alcalodes, ltude des proprits physico-chimiques et toxicologiques de lextrait purifi. Les travaux sont prsents en trois parties : la premire partie est consacre aux gnralits sur les ignames, la deuxime partie montre ltude chimique du principe actif et la troisime partie prsente ltude des proprits biologiques.

55

GENERALITES SUR LES IGNAMES

55 Les ignames sont encore mal connues et peu exploites Madagascar. Pourtant dans de nombreuses rgions du monde, notamment en Afrique, en Asie et en Amrique, part lutilisation alimentaire, les ignames prsentent de nombreuses autres utilisations : toxicologique, thrapeutique et chimique.

1. Gnralits sur Dioscorea esculenta (Lour) (BURKILL, 1950) Dioscorea esculenta L. appartient la famille des DIOSCOREACEAE (44me famille) et comprend 600 espces environ qui se trouvent dans des rgions tropicales, subtropicales et (quelques-unes) tempres. Dioscorea esculenta L. est une espce introduite Madagascar. Cultive jadis par les indignes des Comores et de la cte orientale de Madagascar, culture maintenant dlaisse, cette plante nexiste plus dans ces les qu ltat de pieds sporadiques et rares aux alentours de quelques villages indignes ; son introduction est bien moins ancienne que celle de Dioscorea alata mais nanmoins plus ancienne que celle du manioc, de la patate douce et du mas. Cette espce a t cite en 1802 par CHAPPELER. A lEst de Madagascar, elle se trouve autour des villages entre Vatomandry et Mananjary ; elle vit aussi aux Comores et Mayotte. Trs rpandue et trs cultive depuis lantiquit, de lInde aux les situes lEst de la Nouvelle Guine, Dioscorea esculenta L. a t introduite ensuite en Malaisie Occidentale, puis au cours du XVIme sicle sur les Ctes de lAtlantique par les Portugais. Elle est aujourdhui plus ou moins cultive dans presque toutes les rgions tropicales ou subtropicales ; mais plus rarement (jamais de faon extensive) en Afrique et en Amrique. Le nom vernaculaire MAVONDRO (tankarana, betsimisaraka, taifasy et tanosy) qui signifie rassemblement en groupe est celui des Dioscorea qui ont tendance former des peuplements, dont Dioscorea esculenta (Lour) Burkill. 2. Description botanique 2.1. Description du genre Dioscorea (BURKILL, 1950) Le genre Dioscorea est reprsent Madagascar par 33 espces dont 27 endmiques et 6 introduites, anciennement cultives, mais actuellement plus ou moins naturalises. La plupart des tubercules de Dioscorea sont protgs par des racines singulires, pines qui disparaissent chez certaines races cultives. Les feuilles sont alternes et entires. Les fleurs

mles sont solitaires, sessiles ou presque sessiles, en pis ascendants et assez rigides. Les fleurs femelles sont en pis rcurvs. Les graines sont entoures dune aile circulaire. 2.2. Description de Dioscorea esculenta (BURKILL, 1950) La corme est proche de la surface du sol, mettant selon les espces 5 40 tubercules qui sont recouverts par des racines et des radicelles transformes en aiguillons, formant ainsi un appareil de dfense et de protection. La tige est pineuse la base et porte plus haut des aiguillons espacs. Les feuilles adultes sont alternes. Le limbe peut tre aussi large que long (10x10cm) ou plus large que long (10x17cm), largement en forme de cur la base et longuement (1cm environ) acumin au sommet. Il possde 9 15 nervures dont les externes sont bifurques dans les auricules. Les fleurs sont isoles, subsessiles ou trs courtement pdicelles, espaces de 2 6mm. La plante femelle fleurit souvent et fructifie rarement. Les graines sont entoures dune aile circulaire. 3. Utilisations des ignames 3.1. Utilisations alimentaires des ignames Les ignames tiennent une place importante dans lalimentation dans certaines rgions de Madagascar surtout en milieu rural. Elles sont utilises comme aliment de substitution pendant la priode de soudure. En effet, Dioscorea sansibarensis est utilis dans lalimentation humaine pendant la priode de soudure dans la rgion de Port-Berg, province de Mahajanga (RAZAFIMAHEFA, 1994) ; les tubercules de Dioscorea fandra, une espce endmique de Madagascar sont consomms crus, grills ou cuits pendant la priode de soudure Toliara (RATSILEFITRA, 1999). En milieu urbain, les ignames servent traditionnellement daliment de complment. Les tubercules sont soit consomms ltat frais comme Dioscorea sosa, Dioscorea bemandry et Dioscorea fandra, soit consomms en morceaux ou en tranches aprs une simple cuisson (RANDRIAMAMPIANINA, 2003). 3.2. Utilisations thrapeutiques des ignames Diffrentes espces de Dioscorea sont traditionnellement utilises des fins thrapeutiques. Le tableau 1 prsente quelques indications thrapeutiques des diffrentes espces de Dioscorea.

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De nombreux principes actifs ont t par la suite isols et identifis. Le tableau 2 prsente quelques-unes de leurs proprits pharmacologiques.

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Tableau 1 : Indications thrapeutiques de quelques espces de Dioscorea (AKE ASSI, 1998)

Indications Espces Piqre dinsectes Dioscorea alata (Cte dIvoire) et morsure de Dioscorea cayenensis serpent Lam.(Antilles) Dioscorea multifloria (Cte dIvoire) Douleurs Dioscorea dumetorum (Afrique Orientale) Dioscorea smilacifolia (Gabon) Dioscorea cayenensis Lam.(Antilles) Dioscorea alata (Afrique Centrale) Impuissance Dioscorea bulbifera (Guine) sexuelle Parasitose : -mycose cutane Dioscorea bulbifera (Sngal) -schistosomiase Rhumatisme Epilepsie Dioscorea dumetorum (Tanzanie) Dioscorea bulbifera (Sngal) Dioscorea sansibarensis (Tanzanie) Dioscorea smilacifolia (Cte dIvoire) Dioscorea alata (Cte dIvoire) Dioscorea bulbifera (Madagascar) Dioscorea alata (Inde) Dioscorea ovinala (Madagascar) Dioscorea alata (Madagascar) Dioscorea seriflora (Madagascar) Dioscorea alata (Madagascar)

Mode demploi Pte de feuilles fraches (application locale) Dcoct de feuilles fraches (application locale) Poudre de tubercules mlange avec du piment (application locale) Tubercules (application locale) Fragment de tige macr dans leau (sous forme de lavement pour la douleur pelvienne) Tubercules bouillis et rduits en pure (application locale) Feuilles fraches (application locale) Bourgeons vgtatifs ( ingrer)

Hmorrode Abcs Ulcre

Pommade de bulbilles mlange avec de lhuile de palme (application locale) Tubercules ( ingrer) Pommade de bulbilles mlange avec de lhuile de palme (application locale) Dcoct de racine ( ingrer) Extrait de 3 feuilles en friction sur les tempes du malade Pte de feuilles et de racines (application locale) Pte de bulbilles (application locale) Poudre de tubercules ( ingrer) Tubercules crus ( ingrer avant le repas) Tubercules cuits ( ingrer) Pte de tubercules (application locale)

Vermifuge Brlures

3.3. Utilisations des ignames toxiques Certaines ignames sont des sources importantes de poisons exploits dans la vie courante. Le tableau 3 montre les utilisations de principes toxiques des diffrentes espces dignames.

Tableau 2 : Quelques principes actifs de Dioscorea et leurs proprits pharmacologiques (NEUWINGER, 1996)
Principe actif Alcalodes : dioscorine, dihydrodioscorine et dioscortine Polysaccharide Sapognine saponine : Diosgnine et Source Tubercules (Dioscorea sansibarensis) Bulbilles (Dioscorea bulbifera) Proprit Antimicrobienne contre Pseudomonas aeruginosa et Staphylococcus aureus ; et anticancreuse Hypoglycmiante Hypoglycmiante Antimicrobienne contre Aspergillus niger et Streptomyces sp. Hypoglycmiante Fabrication dhormones synthtiques utilises comme anti-inflammatoires, contraceptives

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Racines de tubercule et tubercules (Dioscorea dumetorum) Bulbilles (Dioscorea bulbifera) Tubercules (Dioscorea esculenta, Dioscorea alata) Bulbilles (Dioscorea bulbifera) Racines de tubercule et tubercules (Dioscorea dumetorum)

Tableau 3 : Quelques utilisations des ignames toxiques (NEUWINGER, 1996)

Utilisations Poison de flche Espces Parties utilises Dioscorea dumetorum (Afrique de lEst) Racine de tubercule ( enduire) Diosorea bulbifera (Afrique de lOuest et Dcoct de bulbilles et de Centrale) tubercules ( enduire) Dioscorea sansibarensis (Kenya) Racine de tubercule et bulbilles ( enduire) Ingrdient pour les poisons de Dioscorea quartiniana (Kenya) Racine de tubercule et tubercules chasse Dioscorea sansibarensis (Kenya) (broyat mlang avec dautres Dioscorea smilacifolia (Cameroun) poisons) Poison de pche Dioscorea bulbifera (Afrique de lOuest et Centrale) Tubercules (broyat dans ltang Dioscorea sansibarensis (Afrique de lOuest ou rivire) et Centrale) Appt pour tuer les btes et les Dioscorea bulbifera (Afrique de lOuest) oiseaux Dioscorea dumetorum (Nigria) Dioscorea sansibarensis (Kenya) Racine de tubercule (donne manger) Racine de tubercule (donne manger) Poudre de tubercule et de bulbille mlange avec celle du manioc (donne manger) Tubercules et bulbilles (donns manger) Racine de tubercule et jus de tubercule (donns ingrer) Jus de tubercules et de bulbille (donns boire) Tubercules (donns ingrer)

Homicide

Dioscorea bulbifera (Egypte) Dioscorea dumetorum (Cte dIvoire et Congo) Dioscorea sansibarensis (Tanzanie)

Poison dpreuve

Dioscorea sansibarensis (Madagascar)

Au point de vue clinique, les toxines peuvent tre des alcalodes, des saponines, des tanins, des glucosides

99 4. Etudes approfondies sur les alcalodes de Dioscorea (COURSEY, 1967 ; NEUWINGER, 1996) La plupart des espces de Dioscorea africaines contiennent des alcalodes. Les alcalodes se trouvent en grande quantit dans les espces : Dioscorea dregeana, Dioscorea dumetorum et Dioscorea hispida. Par contre, ils se prsentent en petite quantit dans dautres espces telles que Dioscorea histuda, Dioscorea aculeata et Dioscorea alata. 4.1. Etude chimique La mthode dextraction hydroalcolique est utilise pour extraire les alcalodes totaux de tubercules de Dioscorea. Les tubercules entiers pesant 500g sont laisss macrer dans 1litre dthanol 40% la temprature de la salle (27C) pendant 3 jours. Pour Dioscorea dumetorum le rendement en alcalodes totaux est valu 6,2%.

Les alcalodes extraits de tubercules de Dioscorea, dont notamment Dioscorea hispida et Dioscorea dumetorum, sont essentiellement de la dioscorine, de formule chimique C13H19O2N (Asie) de structure chimique

O O N Dioscorine La dioscorine est obtenue ltat de cristaux de couleur jaune. Elle est soluble dans leau, lalcool et le chloroforme. Un autre type dalcalode qui na pas t obtenu ltat cristaux a t dcouvert dans les tubercules de Dioscorea dumetorum. Il sagit de la dihydrodioscorine de formule chimique C13H21O2N. Elle est obtenue par hydrognation de la dioscorine : O O N Dihydrodioscorine

Dautre part, les tubercules de certaines Dioscorea, comme ceux de Dioscorea dumetorum, contiennent 4 types dalcalodes : la dioscorine, la dihydrodioscorine et 2 autres produits dhydrolyse de la dioscorine. Ces 2 derniers sont encore mal connus. 4.2. Etude biologique La dioscorine et la dihydrodioscorine administres par voie intrapritonale la dose de 150 200mg/kg provoquent des convulsions chez le rat et la souris. Au dbut, les convulsions sont cloniques puis elles deviennent toniques ; la mort survient aprs un spasme. A ces mmes doses, ces alcalodes administrs par voie intraveineuse peuvent aussi affecter la respiration chez le rat et la souris. A la dose de 2mg/kg de souris, ils nont pas deffet sur le cur isol de rat mais rduisent la rponse cardiaque laction de lactylcholine. Labaissement de la pression sanguine provoqu par lactylcholine est rduit par laction de ces alcalodes, tandis que laugmentation de la pression sanguine induite par ladrnaline est potentialise. Ils provoquent aussi la mydriase, stimulent la contraction du muscle lisse intestinal du chat et du singe la dose de 200mg/kg. La toxicit de la dihydrodioscorine est plus faible que celle de la dioscorine. Chez la souris, la DL50 (24h) de la dioscorine extraite de la racine de tubercules de Dioscorea dumetorum, administre par voie intrapritonale, est de 60mg/kg de souris. Elle est de 100mg/kg pour la dihydrodioscorine. Les DL100 pour les 2 alcalodes par voie intrapritonale sont respectivement 110mg/kg et 160mg/kg pour la souris.

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ETUDE CHIMIQUE

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1. INTRODUCTION

Daprs la littrature, part ltude botanique, les travaux concernant les proprits chimiques de Dioscorea esculenta sont encore rares. Nous avons alors ralis une tude chimique en utilisant le tubercule comme matriel dtude. Ainsi nous avons essay : dextraire et de purifier les principes actifs de nature alcalodique, de dterminer les proprits physico-chimiques de ces principes actifs.

2. MATERIELS ET METHODES
2.1. MATERIELS 2.1.1. MATERIEL VEGETAL 2.1.1.1. Classification La classification systmatique de cette plante (MABBERLEY, 1987) est la suivante :

Rgne. : VEGETAL Embranchement. : TRACHEIDOPHYTES Super division : SPERMATOPHYTES Division...: ANGIOSPERMES Classe. : MONOCOTYLEDONES Ordre.. : LILIALES Famille: DIOSCOREACEAE Genre...: Dioscorea Espce.: esculenta Nom vernaculaire: Mavondro

La figure 1 montre la plante et les tubercules.

1212 2.1.1.2. Rpartition gographique A Madagascar, Dioscorea esculenta est certainement dintroduction trs ancienne. Cette igname sest largement naturalise sur la cte Est de Madagascar. On la trouve autour des villages, entre Vatomandry et Mananjary (voir figure 2). 2.1.1.3. Date et lieu de rcolte La plante a t rcolte ltat sauvage dans la rgion de Vatomandry, au mois dAot 2004. 2.1.2. PRODUITS CHIMIQUES Les produits chimiques utiliss sont de qualit pour analyse. Ils sont essentiellement de marque PROLABO ou MERCK. Pour la chromatographie sur couche mince, des plaques de gel de silice de marque MERCK, de type 60F254 (paisseur de la couche : 0,2mm) de dimensions, 20x20cm sont utilises. 2.2. METHODES

2.2.1. PREPARATION DU MATERIEL VEGETAL Les tubercules frais sont pess et dbits en tranches fines qui sont tales sur un plateau. Le tout est sch au soleil pendant 1 2 jours. Le matriel vgtal sec obtenu est pes puis rduit en poudre par une srie de broyages laide dun microbroyeur CULATTI, suivis de tamisages. La poudre fine homogne ainsi obtenue constitue le matriel vgtal de dpart. Elle est conserve dans une boite en plastique la temprature ambiante. 2.2.2. METHODES DEXTRACTION Les alcalodes sont solubles dans les solvants organiques peu polaires (chloroforme, ther, actone, alcools) et peu solubles dans leau (BRUNETON, 1918). Leur extraction peut alors tre faite :

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1)

2)

Figure 1 : Dioscorea esculenta :1) feuilles 2) tubercules

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Figure 2 : Rpartition gographique de Dioscorea esculenta (BURKILL, 1950)

soit en traitant la poudre par un solvant organique aprs avoir dplac les molcules de bases de leurs combinaisons salines par un alcali assez fort (ammoniaque) ; soit en utilisant une solution dacide 2N ou du mthanol comme solvant dextraction dalcalodes sous forme de sels solubles. Compte tenu de ces possibilits, 4 mthodes dextractions ont t utilises dont 2 froid et 2 autres chaud. 2.2.2.1. Mthodes dextraction froid 2.2.2.1.1. Extraction en milieu alcalin 2.2.2.1.1.1. Principe En prsence dun alcali fort, lalcalode sous forme base se dtache par substitution nuclophile de ses combinaisons salines. La base est alors extraite dans le chloroforme. 2.2.2.1.1.2 Mode opratoire Dans une fiole conique, 10g de poudre vgtale sont humects avec de lammoniaque 12N. Aprs 30min de contact, 100ml de chloroforme sont ajouts dans un rapport 1/10 (p/v), cest--dire 1g de poudre pour 10ml dammoniaque. Le mlange est laiss macrer pendant une nuit +4C. Il est ensuite filtr sur 4 paisseurs de gaze. Le filtrat est recueilli et le marc jet. La solution obtenue est centrifuge 16000xg pendant 15min +5C laide dune centrifugeuse BECKMAN (rotor JA20). Le surnageant est recueilli et concentr jusqu un rapport 1/1 (p/v)(voir mthode de concentration 2.2.4. p.19). 2.2.2.1.2. Extraction en milieu acide 2.2.2.1.2.1. Principe Les alcalodes se comportant comme des bases faibles, laddition dun acide fort (acide chlorhydrique) aboutit la formation de sels dalcalodes solubles dans leau.

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2.2.2.1.2.2. Mode opratoire La poudre vgtale (10g) place dans une fiole conique, est mise en suspension dans 100ml dacide chlorhydrique 0,24N. Le mlange est ensuite agit laide dun agitateur magntique pendant 3h la temprature ambiante puis laiss macrer pendant une nuit +4C. Il est ensuite filtr sur 4 paisseurs de gaze, puis centrifug 16000xg pendant 15min +5C. Le surnageant est rcupr, puis aprs addition deau distille, lacide chlorhydrique est vapor sous pression rduite. Lvaporation se poursuit jusqu llimination totale de lacide qui se traduit par la disparition de lodeur piquante et du got aigre. Dautre part, le pH de lextrait est vrifi laide dun papier pH et ventuellement ramen environ 7 par poursuite de lvaporation. La solution aqueuse obtenue est centrifuge dans les mmes conditions que prcdemment, pour liminer le prcipit form pendant lvaporation. Son volume est ajust jusqu un rapport 1/1 (p/v). 2.2.2.2. Mthodes dextraction chaud 2.2.2.2.1. Extraction mthanolique reflux 2.2.2.2.1.1. Principe Les alcalodes sont solubles dans le mthanol. La chaleur dtruit la membrane squelettique et cytoplasmique des cellules vgtales, ce qui permet le contact du mthanol avec les alcalodes. Lextraction se fait volume constant, le mthanol vapor sous leffet du chauffage se condense au contact dun rfrigrant et retombe dans lextrait. 2.2.2.2.1.2. Mode opratoire La poudre vgtale est mise en suspension dans du mthanol dans le rapport 1/10 (p/v). Le mlange obtenu est chauff reflux pendant 1h 60C, puis laiss macrer pendant une nuit +4C. Il est ensuite filtr, puis centrifug 16000xg pendant 15min +5C, et le culot est limin.

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Le mthanol dans le surnageant est vapor et lextrait est repris dans de leau distille. La solution aqueuse obtenue est de nouveau centrifuge dans les mmes conditions que prcdemment. 2.2.2.2.2. Extraction mthanolique au soxhlet 2.2.2.2.2.1. Principe Le principe de lextraction au soxhlet est bas sur lpuisement du matriel vgtal sous forme de poudre par le solvant dextraction qui est le mthanol. Lextraction se droule la temprature dbullition du mthanol (environ 60C). 2.2.2.2.2.2. Mode opratoire La poudre vgtale (30g) est mise dans une cartouche cylindrique en papier filtre. Cette dernire est place dans un soxhlet vertical de 60ml qui est reli un erlenmeyer contenant des billes de verre. Lerlenmeyer lui-mme est plac sur une plaque chauffante. Le soxhlet est rempli de mthanol et un rfrigrant est plac son sommet. Lextraction dure 24h 60C. Lextrait mthanolique obtenu est filtr et aprs vaporation du mthanol, lextrait est repris dans leau dans le rapport 1/1 (v/v). 2.2.3. METHODES DE PURIFICATION 2.2.3.1. Traitement par le mlange actone/dithylther 2.2.3.1.1. Principe Laddition dun mlange volume volume dactone et dther dithylique (ou dithylther) une solution mthanolique de saponosides provoque la prcipitation de ceux-ci suite une diminution de leur solubilit (MAHUZIER et HAMON, 1990). 2.2.3.1.2. Mode opratoire Lextrait traiter est vapor sec. Le rsidu obtenu est pes sur une balance de prcision SARTORIUS et repris dans du mthanol de volume gal 4 fois son poids. La solution mthanolique obtenue est filtre. Le mlange actone/dithylther de volume gal 5 fois le

17 17

1818 poids du rsidu sec, est prpar dans un bcher plong dans un bain de glace. La solution mthanolique est ensuite ajoute goutte goutte sous agitation magntique au mlange actone/dithylther. Lopration est rpte avec le mme volume dactone/dithylther jusqu ce quil ny ait plus de prcipit. Le surnageant est recueilli par aspiration. Les solvants organiques sont limins par vaporation et lextrait est repris dans leau distille dans le rapport 1/1 (v/v). 2.2.3.2. Fractionnement par le chloroforme (MAHUZIER et HAMON, 1990) 2.2.3.2.1. Principe Cette technique est base sur la partition des substances dans 2 solvants non miscibles (eau et chloroforme). 2.2.3.2.2. Mode opratoire 2.2.3.2.2.1. Alcalinisation Lextrait aqueux traiter est dabord alcalinis avec de lammoniaque 12N (pH final compris entre 8 et 9). Le pH est vrifi au pH-mtre (DIGITAL-PH-METTER 646). 2.2.3.2.2.2. Dcantation La solution alcalinise est mlange volume volume avec du chloroforme dans le rapport 1/1 (v/v), dans une ampoule dcanter. Aprs agitation, le tout est laiss dcanter jusqu la sparation nette en 2 phases : la phase aqueuse suprieure et la phase chloroformique infrieure. La phase chloroformique est recueillie. La phase aqueuse est puise 3 fois par le mme volume de chloroforme jusqu ce quelle donne un test de MAYER ngatif. Les phases chloroformiques sont rassembles. Le chloroforme est vapor et lextrait est repris dans de leau distille.

19 19

2.2.3.3. Traitement par lactate dthyle 2.2.3.3.1. Principe Ce traitement utilise aussi le partage des soluts vis--vis de 2 solvants non miscibles (eau et actate dthyle).

2.2.3.3.2. Mode opratoire Lextrait aqueux est mlang avec le mme volume dactate dthyle dans une ampoule dcanter. Le mlange est agit fortement puis laiss au repos jusqu sa sparation en 2 phases. La phase organique suprieure est recueillie par aspiration et la phase aqueuse infrieure est traite 3 fois par le mme volume dactate dthyle. Les phases organiques sont rassembles et lactate dthyle est vapor sous vide. Lextrait obtenu est repris dans de leau distille et son volume est ramen celui de lextrait de dpart (volume initial). La phase aqueuse est aussi vapore pour liminer le solvant organique rsiduel. Elle est concentre jusquau volume initial. Les alcalodes sont recherchs dans les 2 extraits obtenus (phase aqueuse et phase organique) laide des tests de MAYER, WAGNER et DRAGENDORFF (voir . 2.2.7.1.3.p.22). 2.2.4. METHODE DE CONCENTRATION Toutes les oprations de concentration dextraits et dvaporation de solvants sont effectues au moyen dun vaporateur rotatif (ROTAVAPOR R110) la temprature 50C, la pression tant rduite laide dune pompe vide ALCATEL. Apres rduction de volume, les extraits concentrs sont centrifugs +5C laide dune centrifugeuse BECKMAN ROTOR JA20, la vitesse 16000xg pendant 15min pour liminer le prcipit ventuel form lors de lvaporation.

2020

2.2.5. METHODE DE DETERMINATION DE LA TENEUR EN MATIERE SECHE La matire sche est obtenue par schage des tubercules frais au soleil. La teneur en matire sche est exprime en pourcentage par rapport au poids de tubercule frais. Elle est donne par la relation : Ps x 100 Ts = Pf

O Ts : teneur en matire sche, en % Ps : poids de tubercule sec, en g Pf : poids de tubercule frais, en g. 2.2.6. METHODE DE CALCUL DE RENDEMENT Le rendement en toxines chaque tape dextraction et de purification est exprim en pourcentage par rapport au poids du matriel vgtal de dpart. Le rendement de purification est valu en pourcentage par rapport au poids du rsidu dvaporation sec de lextrait brut. Pour dterminer ces diffrents rendements, lextrait est vapor sec, puis le rsidu est pes sur une balance de prcision SARTORIUS. Le rendement est alors calcul daprs la relation suivante : (Pt Pv) x 100 R= Pp

O R : rendement, en %
Pt : poids total du ballon avec le rsidu dvaporation sec, en g Pv : poids du ballon vide, en g Pp : poids de la poudre de dpart, ou poids du rsidu dvaporation sec de lextrait, en g.

21 21 2.2.7. METHODES ANALYTIQUES 2.2.7.1. Ractions de dtection des alcalodes (DELORT-LAVAL, 1981) Plusieurs types de tests sont utiliss : - les tests effectus avant lextraction pour mettre en vidence la prsence dalcalodes dans le matriel vgtal (test prliminaire et test de confirmation) ; - les tests qui servent guider la purification des alcalodes (tests de dtection des alcalodes). 2.2.7.1.1. Test prliminaire La poudre vgtale (5g) est mise macrer dans 50ml dacide chlorhydrique 0,24 N pendant 30min. Lextrait acide obtenu est ensuite filtr sur du coton card et rparti dans 4 tubes essai dont le premier sert de tmoin. Cinq gouttes de chacun des ractifs de MAYER, WAGNER et DRAGENDORFF sont ajoutes respectivement dans les 3 tubes prcdents. Lapparition dun trouble, dune floculation ou dun prcipit indique la prsence dalcalodes. Les rsultats sont exprims selon la norme suivante : Tableau 4 : Norme utilise pour exprimer les rsultats des tests des alcalodes OBSERVATIONS Lger trouble ou trouble opaque Floculation Floculation abondante ou prcipit RESULTAT + ++ +++

2.2.7.1.2. Test de confirmation Lextrait acide ci-dessus est vapor sec. Le rsidu sec obtenu est humect par lammoniaque 12N pendant 30min. Le mlange ainsi alcalinis est repris dans du chloroforme. La solution chloroformique obtenue est alors additionne deau distille puis vapore sec. Le nouveau rsidu sec est repris dans lacide chlorhydrique 2N. La solution acide est ensuite rpartie dans 4 tubes essai dont lun sert de tmoin. Les 3 tubes sont soumis aux 3 tests des

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alcalodes (tests de MAYER, WAGNER et DRAGENDORFF). Lapparition dun trouble, dune floculation ou dun prcipit solubles dans lthanol 80% confirme la prsence dalcalodes.

2.2.7.1.3. Tests de dtection des alcalodes dans les extraits 2ml dextrait aqueux tester sont acidifis par 2 3 gouttes dacide chlorhydrique 2N. Lextrait est divis dans 4 tubes dont lun sert de tmoin. Les 3 autres tubes sont additionns respectivement des ractifs de MAYER, WAGNER et DRAGENDORFF pour les tests des alcalodes. Les rsultats sont apprcis selon la norme donne dans le tableau 4. 2.2.7.2. Chromatographie sur couche mince (RANDERATH, 1964 ; KAMOUN,1991) 2.2.7.2.1. Principe

Cest une technique de microanalyse base sur les phnomnes dadsorption et de partage des substances sparer entre une phase stationnaire hydrophile (ladsorbant) et une phase mobile organique (le systme de solvants). 2.2.7.2.2. Mode opratoire 2.2.7.2.2.1. Prparation de la plaque La plaque chromatographique (voir caractristiques 3.5.p.29) peut tre dcoupe aux dimensions voulues : 10cm pour la hauteur et selon le nombre dchantillons analyser pour la largeur. 2.2.7.2.2.2. Dpt des chantillons Les extraits analyser sont dposs laide dun capillaire, en tirets fins horizontaux de 7mm de longueur espacs de 6mm. Ces tirets sont situs 15mm du bord infrieur et 13mm de chaque bord latral de la plaque. Chaque dpt est suivi dun schage au schoir main.

23 23 2.2.7.2.2.3. Dveloppement du chromatogramme Le chromatogramme est mis dvelopper dans une cuve chromatographie DESAGA contenant le systme de solvants B/A/E (n-butanol/acide actique/eau distille) dans le rapport 60/20/20 (p/p/p). Les parois intrieures de la cuve ont t pralablement tapisses de papier filtre pour saturer latmosphre intrieure en vapeur de solvants.

Il sagit dune chromatographie ascendante. La plaque est retire de la cuve quand le front du solvant parvient 5mm du bord suprieur du support, puis elle est sche avec un schoir main. 2.2.7.2.2.4. Rvlation du chromatogramme Pour visualiser la sparation des molcules sur le gel, la plaque est : observe sous lumire UV 2 longueurs donde diffrentes : 254nm et 366nm. Les substances apparaissent sous forme de bandes fluorescentes ; pulvrise avec le ractif modifi de DRAGENDORFF (voir composition en

annexe I). Les bandes sont colores en rose.

3. RESULTATS

3.1. TENEUR EN MATIERE SECHE Un tubercule frais pesant 1kg, trait selon la mthode dcrite en 2.2.1.p.12, donne aprs 2 jours de schage 352,15g de poudre sche.

En appliquant la mthode de calcul donne au paragraphe 2.2.5.p.20, la teneur en matire sche du tubercule est de 35,21%. Plus de la moiti du tubercule frais est donc constitue par de leau.

2424

3.2. PREPARATION DE LEXTRAIT BRUT (EB) Quatre techniques ont t essayes pour extraire le maximum dalcalodes partir de la poudre de tubercules secs. Pour chaque type dextraction, 10g de poudre sont utiliss.

Les rsultats sont prsents dans le tableau 5.

Daprs ces rsultats, les tests de MAYER, WAGNER et DRAGENDORFF sont positifs pour les 4 types dextrait brut. Il faut noter quil napparat pas de vritable prcipit mais seulement un trouble opaque et une floculation.

Etant donn que les alcalodes sont extraits avec beaucoup dautres substances, le rendement en alcalodes na t valu quaprs purification de ces derniers. Tableau 5 : Rsultats des diffrents types dextraction

CARACTERISTIQUES DE LEXTRAIT BRUT TYPE DEXTRACTION GOUT En milieu alcalin En milieu acide Fade Fade ASPECT Limpide mousseux Limpide mousseux Limpide mousseux Limpide mousseux COULEUR Jaune verdtre Jaune verdtre

TESTS ALCALODES M W D + + +

A FROID

Mthanolique Lgrement amer reflux A CHAUD Mthanolique au soxhlet Lgrement amer

Jaune rougetre ++ ++ ++ Jaune verdtre ++ ++ ++

M : Mayer W : Wagner D : Dragendorff

+ : Prsence dun trouble, ++ : Prsence dune floculation

25 25 3.3. PURIFICATION Plusieurs mthodes de purification ont t testes pour sparer les alcalodes de leurs contaminants. La purification est guide par les 3 tests de dtection des alcalodes et lhomognit des extraits est apprcie par CCM.

3.3.1. PRECIPITATION PAR LE MELANGE ACETONE/DIETHYLETHER

30ml de chacun des 4 extraits bruts obtenus prcdemment sont vapors sec. Le rsidu sec pesant 2g est repris dans 8ml de mthanol (rapport 1/4 : p/v). Lextrait mthanolique ainsi prpar est prcipit par 10ml de mlange actone/dithylther (ce volume est gal 5 fois les poids du rsidu sec ; voir mthode 2.2.3.1. p.17).

La solution mthanolique doit tre traite 3 fois par le mme volume de solvant pour quil ny ait plus de prcipit. Lextrait aqueux obtenu aprs limination des solvants organiques, ragit positivement avec les 3 tests des alcalodes.

Lapplication de cette mthode facilite la sparation en 2 phases lors du traitement ultrieur par le chloroforme (la phase intermdiaire entre les 2 phases est rduite), mais elle namliore pas le rendement de la purification. Aussi, pour conomiser du solvant, nous navons pas retenu cette technique dans le procd de purification.

3.3.2. FRACTIONNEMENT PAR LE CHLOROFORME

Chacun des 4 extraits bruts (30ml de volume) obtenus prcdemment (voir 3.2. p.24) est alcalinis par de lammoniaque 12N pour avoir un pH de 8 9, puis trait 3 fois par le chloroforme selon la mthode dcrite au paragraphe 2.2.3.2 p.18. Les phases chloroformiques sont rassembles et aprs vaporation du solvant, elles constituent les extraits purifis. Les caractristiques de ces derniers sont prsentes dans le tableau 6 suivant :

2626

Tableau 6 : Caractristiques des extraits obtenus par traitement par le chloroforme en fonction du type dextrait brut

TYPE DEXTRAIT BRUT Alcalin A FROID Acide Mthanolique reflux Mthanolique au soxhlet

CARACTERISTIQUES DES EXTRAITS GOUT ASPECT COULEUR amer limpide jaune paille

TEST M ++ W ++ D ++

RENDEMENT (%) 0,014

amer amer amer

limpide limpide limpide

jaune paille

++

++

++

0,016 0,105 0,175

A CHAUD

jaune paille +++ +++ +++ jaune paille +++ +++ +++

M : Mayer W : Wagner D : Dragendorff ++ : Prsence dune floculation +++ : Prsence de prcipit

Compte tenu de ces rsultats, nous avons choisi pour la suite de notre travail la mthode dextraction mthanolique au soxhlet pour les raisons suivantes :

elle permet dobtenir le rendement le plus lev aprs traitement de lextrait brut correspondant par le chloroforme, elle exige moins de solvant par rapport lextraction mthanolique chaud et reflux.

Ainsi, lextrait obtenu par traitement de lextrait brut mthanolique par le chloroforme constitue lextrait purifi E1, de couleur jaune paille, daspect limpide et de got amer. Il comporte 2 bandes rvlables sous UV 254nm : une bande suprieure jaune et une bande infrieure violette.

27 27

3.3.3. TRAITEMENT PAR LACETATE DETHYLE Lextrait E1 (30ml) est trait par lactate dthyle suivant la mthode dcrite au paragraphe 2.2.3.3 p.19. Les 3 tests des alcalodes sont positifs pour la phase organique et ngatifs pour la phase aqueuse.

La phase organique reprise dans leau distille aprs vaporation de lactate dthyle, constitue alors lextrait E2 de couleur jaune paille, daspect limpide, de got amer. Il prsente une seule bande aussi bien par rvlation sous UV 254nm et 366nm quaprs pulvrisation avec le ractif de DRAGENDORFF modifi.

Cette technique a t maintenue car elle permet de sparer en CCM les 2 bandes rvlatrices sous UV (254nm) de lextrait E1 prcdent.

En rsum, partir de lextrait brut mthanolique obtenu par extraction au soxhlet, le protocole de purification dfinitif, destin purifier spcifiquement les alcalodes, comporte 2 tapes qui sont : le fractionnement par le chloroforme et le traitement par lactate dthyle.

3.4. RENDEMENT

Le poids du rsidu dvaporation sec de lextrait brut obtenu partir de 100g de poudre est de 3,818g, correspondant un rendement dextraction de 3,818%. On obtient ensuite un rsidu sec dextrait E1 pesant 0,175g, do un rendement en toxines de 0,175% et un rsidu sec dextrait E2 pesant 0,173g, donnant un rendement en toxines de 0,173%, par rapport la poudre de dpart. Les rendements de purification (par rapport lextrait brut), dtermins selon la mthode donne au paragraphe 2.2.6.p.20, sont respectivement de 4,58% et 40,53% pour lextrait E1 et lextrait E2.

Lextraction et les diffrentes tapes de purification avec les poids des rsidus dvaporation sec des extraits de chaque tape, sont rsumes sur la figure 3.

2828

100g de poudre de tubercules

Extraction mthanolique chaud au soxhlet

Marc et culot limins

Extrait brut 3,818g

Alcalinisation avec lammoniaque jusqu pH 8 9 puis traitement par le chloroforme

Phase aqueuse limine

Extrait E1 0,175g Traitement par lactate dthyle

Phase aqueuse limine

Extrait E2
0,173g

Figure 3 : Schma rcapitulatif de lextraction et des diffrentes tapes de purification des alcalodes partir de la poudre de tubercules secs. Les chiffres reprsentent le poids des rsidus dvaporation sec des extraits

29 29 3.5. ETUDE DE LHOMOGENEITE DES DIFFERENTS EXTRAITS Lvolution de lhomognit des extraits au cours de la purification est apprcie par chromatographie sur couche mince (voir figure 4).

Lextrait brut montre 10 bandes majeures rvlables sous lumire UV 254nm et une seule bande rvlable 366nm. Lextrait E1 ne prsente plus que 2 bandes rvlables sous UV 254nm. Le fractionnement par le chloroforme a donc permis dliminer 8 bandes majeures. Le traitement par lactate dthyle a par la suite permis dliminer le contaminant de lextrait E1 car lextrait E2 obtenu ne contient plus quune seule bande jaune sous lumire UV 254nm.

Seuls les alcalodes sont rvls par pulvrisation de la plaque au ractif de DRAGENDORFF. Ainsi, le chromatogramme des 2 extraits E1 et E2 contenant les alcalodes purifis montre aprs rvlation laide de ce ractif une seule bande. Le chromatogramme rcapitulatif est montr par la figure 4.

(a)

(b)

Figure 4 : Chromatographie sur couche mince des extraits : a) plaque non pulverise b) plaque pulverise1) extrait brut 2) extrait brut 3) extrait E1 4) extrait E2

3030 3.6. NATURE CHIMIQUE ET PROPRIETES PHYSICO-CHIMIQUES

Toutes les techniques dextraction et de purification, y compris celles qui nont pas t adoptes, ainsi que les tests chimiques ont permis dobtenir des informations sur la nature chimique et les proprits physico-chimiques des principes actifs isols.

Ainsi, daprs nos rsultats :

les principes actifs sont peu soluble dans leau : la solution aqueuse dalcalode est trouble forte concentration (au-dessus de 70mg/ml) ; ils sont solubles dans leau acidule (HCl 2%) et trs solubles dans les solvants organiques tels que le mthanol, lthanol, le mlange actone/dithylther, le chloroforme et lactate dthyle ;

ils sont thermostables : les oprations de conglation et de dconglation rptes ainsi que le chauffage ne laffectent pas ; ils ont une couleur jaune paille ; ils ont un got amer.

4. DISCUSSION ET CONCLUSION

Cette tude chimique a t oriente vers lisolement des alcalodes. Une extraction mthanolique chaud au soxhlet a donn les meilleurs rsultats avec un rendement en extrait brut de 3,818%. Le procd de purification comporte 2 tapes bases sur la diffrence de solubilit : un traitement par le chloroforme et un fractionnement par lactate dthyle. Lextrait obtenu la premire tape de purification aurait pu tre soumis un nouveau traitement par le chloroforme selon la technique classiquement utilise par les chimistes, mais comme ce solvant est trs volatile, il est difficile manipuler. Aussi, lactate dthyle a t choisi sa place.

Lextrait purifi E2 contient un seul alcalode reprsent par une seule bande rvlable au ractif de DRAGENDORFF.

31 31

Le rendement final en toxines est de 0,173%. Ce rendement est faible sil est compar par exemple celui de Anacampta diticha (APOCYNACEAE) dont les rendements en alcalodes sont de : 0,62% partir de lcorce de racine, 0,47% pour les feuilles, et 0,43% pour lcorce de tronc (MIET et coll., 1980) ; et celui des graines de Albizia arenicola (MIMOSOIDAEFABACEAE) qui est de 0,64% (RANDRIANARIVO, 2003).

Lextrait purifi ne comporte en CCM quune seule bande rvlable par le ractif modifi de DRAGENDORFF. Lutilisation dautres systmes de solvants ou de techniques plus performantes comme la chromatographie en phase gazeuse permettrait de savoir si cette bande unique contient une ou plusieurs substances. Des tudes spectrales permettraient de savoir si le ou les alcalodes de Dioscorea esculenta est la dioscorine ou lun de ses drivs (BRUNETON, 1987) ou encore une nouvelle substance.

Le principe est peu soluble dans leau. Par contre, il est soluble dans lacide dilu 2% et dans beaucoup de solvants organiques tels que : le chloroforme, lactate dthyle, le mlange actone/dithylther, le mthanol, lthanol. Il est thermostable ; les oprations de conglation et le traitement haute temprature ne laffectent pas.

Ltude chimique ralise sur le tubercule de Dioscorea esculenta nous a permis dextraire et de purifier une substance alcalodique active sur laquelle ltude des proprits toxicologiques sera effectue.

11 11

ETU D E BIOLOGIQUE

3232

1. INTRODUCTION
Dans ltude chimique prcdente, nous avons pu obtenir une prparation contenant un ou plusieurs alcalodes partir des tubercules de Dioscorea esculenta.

Nous avons alors ralis ltude des proprits toxicologiques de lextrait purifi. Pour cela, nous avons test la toxicit du principe sur des Mammifres comme les souris, et sur les hmaties de mouton et aussi sur dautres reprsentants du rgne animal tels que les larves de moustique, les ttards de grenouille et les poissons. Nous avons galement tudi ses effets sur des vgtaux notamment sur la germination de graines, la croissance de jeunes plantules et la croissance des bourgeons axillaires et enfin nous avons recherch les effets du principe sur la croissance de micro-organismes.

Pour les diffrentes expriences, nous navons pas utilis lextrait brut parce quil contient encore beaucoup dautres substances non alcalodiques pouvant tre actives. Nous avons uniquement test lextrait alcalodique E2 (ou extrait) sauf pour le test hmolytique o nous avons utilis les deux extraits purifis E1 et E2.

2. MATERIELS ET METHODES

2.1. MATERIELS

2.1.1. LES ANIMAUX DEXPERIMENTATION

2.1.1.1. Les souris

Pour les diffrents tests, des souris blanches Mus musculus de race Swiss sont utilises. Elles proviennent de lanimalerie du laboratoire de Biochimie Fondamentale et Applique de la Facult des Sciences dAntananarivo.

2.1.1.2. Le sang de mouton

Le sang utilis a t prlev sur un mouton sain lev lInstitut Malgache des Vaccins Vtrinaires ou IMVAVET, Antananarivo.

2.1.1.3. Les larves de moustique Les larves de moustique Culex quinquefasciatus sont au 3me stade de dveloppement. Elles proviennent des plans deau des environs du Campus universitaire dAntananarivo. Elles sont captures le jour des tests.

33 33

2.1.1.4. Les ttards de grenouille

Les ttards de grenouille Ptychadena mascareniensis au stade sans patte sont capturs le jour des tests dans les plans deau des environs du Campus universitaire dAntananarivo.

2.1.1.5. Les poissons

Les petits poissons Gambusia holbrooki ou pirina utiliss sont capturs le jour des tests dans les rizires des environs de lUniversit dAntananarivo.

2.1.2. LES PLANTES DEXPERIMENTATION

Des graines de plusieurs espces de Monocotyldones et de Dicotyldones sont utilises pour les tests sur les vgtaux. Elles proviennent de la collection du centre de production du FOFIFA Ambatobe, Antananarivo. Ces graines sont prsentes dans le tableau 7.

Tableau 7 : Graines utilises pour les expriences sur les vgtaux

FAMILLE APIACEAE BRASSICACEAE COMPOSITAE DICOTYLEDONES CUCURBITACEAE

ESPECE Daucus carota Petroselium crispum Brassica sp Lactuca sativa Cucumus sativus Cucurbita pepo

NOM VERNACULAIRE Carotte Persil chinois Tissam-white Laitue Concombre Courgette Haricot Petit pois Morelle noire Oignon Riz Mas

FABACEAE SOLANACEAE LILIACEAE MONOCOTYLEDONES POACEAE

Phaseolus vulgaris Pisum sativum Solanum nigrum Allium cepa Oryza sativa Zea mays

2.1.3. LES MICRO-ORGANISMES UTILISES Les souches utilises ont t soit prleves, puis isoles et identifies au laboratoire de Microbiologie de la Maison du Petit Elevage (MPE), soit isoles partir de cultures disponibles au mme laboratoire. 2.1.4. LES MILIEUX DE CULTURE Les milieux de culture peuvent tre solides ou liquides. Leur composition est indique en annexe V. Ils peuvent tre classs en 4 types. 2.1.4.1. Les milieux denrichissement Les milieux denrichissement permettent la multiplication de divers micro-organismes nouvellement prlevs. Deux milieux denrichissement sont utiliss. 2.1.4.1.1. Le bouillon nutritif Cest un milieu liquide permettant la croissance de la plupart des micro-organismes. 2.1.4.1.2. La glose nutritive Ce milieu solide permet la pousse des micro-organismes ne prsentant pas dexigence particulire. 2.1.4.2. Les milieux disolement et de purification des germes 2.1.4.2.1. Le milieu Salmonella-Shigella (SS) Cest un milieu solide slectif utilis pour la culture des Salmonelles et des Shigelles. 2.1.4.2.2. Le milieu Hektoen Cest un milieu solide utilis pour lisolement des Entrobactries. 2.1.4.2.3. Le milieu brillant green agar (BGA) ou vert brillant Le vert brillant est un milieu solide utilis pour lisolement des Salmonelles autres que Salmonella typhi.

3434

35 35 2.1.4.2.4. Le milieu eosine methylene blue (EMB) Ce milieu solide permet lisolement de bactries du genre Pseudomonas et Klebsiella. 2.1.4.2.5. La glose au sang

Cest un milieu solide constitu de glose de base enrichie de sang, adapt la culture des Staphylococcus et Streptococcus.

Ces milieux spcifiques pour lisolement et la purification des germes sont donns dans le tableau 8.

Tableau 8 : Milieux spcifiques servant isoler les diffrents germes (DIFCO MANUAL, 1984)

Milieux spcifiques SALMONELLA-SHIGELLA (SS)

Germes isoler Salmonella sauf S.typhi Shigella Escherichia coli Enterobacter Salmonella typhi Klebsiella Pseudomonas Proteus

HEKTOEN BRILLANT GREEN AGAR (BGA) EOSINE METHYLENE BLUE (EMB)

GELOSE AU SANG (GS)

Staphylococcus Streptococcus Pasteurella

2.1.4.3. Les milieux de dtermination des caractres biochimiques des bactries (LEFEVRE, 1997) 2.1.4.3.1. Le milieu citrate de SIMMONS Cest un milieu solide permettant didentifier les bactries utilisant le citrate de sodium comme seule source de carbone et dnergie.

2.1.4.3.2. Le milieu HAJNA-KLIGLER : lactose-glucose-H2S Cest un milieu solide complexe. Il permet la mise en vidence de lutilisation du lactose, du glucose par les bactries et la production de sulfure dhydrogne (H2S).

3636

2.1.4.3.3. Le milieu mannitol-mobilit

Ce milieu faiblement glos sert la mise en vidence de la fermentation du mannitol, de la rduction des nitrates en nitrites et lobservation de la mobilit des bactries.

2.1.4.3.4. Le milieu ure-indole

Cest un milieu liquide utilis pour la recherche de lurase et la tryptophane dsaminase (TDA) dans les micro-organismes ainsi que la production dindole. 2.1.4.3.5. La lysine dcarboxylase (LDC), lornithine dcarboxylase (ODC) et larginine dihydrolase (ADH) Ce sont des milieux liquides destins la recherche des dcarboxylases et dihydrolases bactriennes. 2.1.4.3.6. Les disques 2.1.4.3.6.1. Les disques ortho-nitro-phnyl D-galactopyranoside (ONPG) Ce sont des disques de 5mm de diamtre imprgns dONPG permettant la recherche de -galactosidase bactrienne. 2.1.4.3.6.2. Les disques pour le test de loxydase Ce sont des disques de 5mm de diamtre marqus ox . Ils sont imprgns doxalate de dimthylparaphnylne diamine et sont utiliss pour la recherche de loxydase bactrienne. 2.1.4.4. Le milieu dtude dactivit antibactrienne

Les tests dactivit antibactrienne sont raliss sur le milieu solide de Meller-Hinton.

2.2. METHODES

37 37 2.2.1. METHODES DETUDE DES EFFETS SUR LES ANIMAUX A SANG CHAUD 2.2.1.1. Tests sur souris 2.2.1.1.1. Estimation de la toxicit Deux voies dadministration ont t utilises pour tester les extraits : la voie orale et la voie intra pritonale (ip). Pour chaque voie, un volume de 0,3ml dextrait tester est inject une souris de 25g. Deux lots de deux souris sont utiliss pour chaque test, le 1er lot recevant du srum physiologique sert de tmoin tandis que lextrait tester est administr au deuxime lot. Lexprience dure 24h. 2.2.1.1.2. Examen histopathologique (VERNE, 1960 ; BOYD, 1966 ; GANTER et JOLLES, 1969 ; LUSSIER, 1989) Lexamen histopathologique permet dobserver microscopiquement le changement de la structure tissulaire ou lapparition des lsions dans diffrents organes dune souris ayant reu lextrait toxique, par comparaison avec les organes dune souris non traite. Il comporte les tapes suivantes : le prlvement, la fixation des organes, linclusion, la microtomie, la circulation, ltalement, la coloration et lobservation des coupes. 2.2.1.1.2.1. Prlvement et fixation des organes Deux souris sont injectes par voie ip dune dose dextrait tudier provoquant de symptmes dintoxication. Aprs lapparition de tous les symptmes, elles sont sacrifies par longation cervicale. Les organes tels que le cur, le foie, le poumon, les reins, lestomac, le cerveau et lintestin sont prlevs juste aprs avoir sacrifi la souris. Une souris recevant du srum physiologique par voie ip, est traite de la mme manire ; ses organes servent de tmoin. Les organes prlevs sont plongs dans le liquide de BOUIN pendant 48h, pour conserver les tissus dans ltat le plus proche possible de ltat normal. La composition de liquide de BOUIN est donne en annexe II. 2.2.1.1.2.2. Inclusion Chaque organe est dcoup en minces fragments de 5mm dpaisseur. Les fragments

subissent une dshydratation par lalcool, opration pendant laquelle leau tissulaire est remplace par lalcool. Ils sont ensuite imprgns de tolune pour permettre la fixation de la paraffine. La prparation est alors plonge dans la paraffine liquide 56C coule dans un moule en mtal. Le moule est ensuite port +4C pour solidifier son contenu. Ainsi, les fragments sont inclus dans la paraffine solide. 2.2.1.1.2.3. Microtomie, circulation et talement des coupes Des coupes minces de 5m dpaisseur sont obtenues par lutilisation dun microtome rotatif LEKA. Ils sont ensuite introduits dans un circulateur automatique (CITADEL 2000) pour liminer la paraffine. La circulation comprend : limprgnation par le tolune pour dissoudre la paraffine,

3838

le traitement par lalcool pour liminer le tolune, la rhydratation des tissus par lavage leau. Les coupes ainsi traites sont tales sur une lame. 2.2.1.1.2.4. Coloration et observation des coupes La coloration des tissus rhydrats se fait laide de divers colorants : lhmatoxyline, colorant basique, qui teinte le noyau en bleu ou noir, losine, colorant acide, qui colore le cytoplasme en rose ou rouge, le safran qui se fixe sur les tissus conjonctifs. Les coupes sont ensuite recouvertes de lamelles portant une goutte de rsine synthtique. Lobservation des coupes se fait au microscope optique, au grossissement x 400. 2.2.1.2. Test sur les hmaties de mouton 2.2.1.2.1. Principe (POLNOVSKI et coll., 1963) Lorsque le sang est trait par divers ractifs hmolytiques, ou simplement dilu dans leau distille en quantit suffisante, les globules rouges sont lyss et leur hmoglobine est libre. Cest le laquage ou hmolyse.

2.2.1.2.2. Mode opratoire

39 39 2.2.1.2.2.1. Prlvement et prparation des hmaties Les hmaties utilises proviennent du sang veineux dun mouton, prlev partir de la veine jugulaire de celui-ci selon la technique suivante : sous leffet de la compression la veine gonfle ; une aiguille relie un flacon contenant des billes de verre est alors enfonce le long de la veine. Le sang qui tombe dans le flacon est agit lgrement pour empcher la formation de caillots de fibrine. Du sang dfibrin est ainsi obtenu.

Le sang (50ml) est lav 3 fois avec un mme volume de tampon phosphate buffered saline (PBS). Le mlange est centrifug chaque lavage et le surnageant est limin. Le culot final est repris dans du PBS pour avoir une suspension dhmaties 2% (v/v : volume du sang par rapport au volume total de la suspension). 2.2.1.2.2.2. Test hmolytique Le test hmolytique est ralis dans une plaque de microtitration fond en U ou en V. A partir dune solution dextrait tudier 1mg/ml, des dilutions en cascade sont effectues (coefficient de dilution 1/2) de manire obtenir diffrentes concentrations. 50 l de chaque solution ainsi obtenue sont verss dans les cupules de la microplaque.50 l de suspension dhmaties 2% sont ajouts dans chaque cupule de la plaque. Deux tmoins sont prpars : un tmoin positif constitu de 50 l deau distille et 50 l dhmaties un tmoin ngatif constitu de 50 l de PBS et 50 l dhmaties.

La plaque est recouverte et porte dans ltuve 37C pendant 1h puis laisse +4C pendant une nuit avant la lecture. La composition des milieux utiliss pour le test hmolytique est montre dans le tableau 9.

Tableau 9 : Composition des milieux utiliss pour le test hmolytique

Concentration en extrait tudier (g/ml) Suspension dhmaties 2% (l) Extrait (l) Eau distille (l) PBS
50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 T+ T- 1000 500 250 125 62,5 31,25 15,62 7,81 3,95 1,97

4040

T+ : Tmoin positif T- : Tmoin ngatif Lhmolyse se traduit par lapparition dune plage de lyse rouge dans la cupule. En cas dabsence dhmolyse, les hmaties intactes se dposent en un point rouge au fond de la cupule. Lapparition de ces deux phnomnes dans une mme cupule indique une hmolyse partielle.

2.2.2. METHODES DETUDE DES EFFETS SUR LES ANIMAUX A SANG FROID
Les tests se font sur des larves de moustique, des ttards de grenouille et des poissons (voir 2.1.1.p.32).

2.2.2.1. Mode opratoire

Les animaux de mme taille sont rpartis en 6 lots de 7 individus. Chaque lot est plac dans 200ml deau de pluie. Diffrentes concentrations dcroissantes de lextrait tester sont prpares partir dune solution mre par dilution en cascade, avec un coefficient de dilution dtermin. Chaque lot est soumis une concentration dtermine en extrait tester. Un 7me lot plac dans 200ml deau de pluie sert de tmoin. La lecture des rsultats se fait aprs 24h au bout desquelles les individus morts dans chaque lot sont compts.

2.2.2.2. Dtermination de la CL50 (24h)

La CL50 ou concentration ltale 50% est la concentration qui tue 50% de la population teste pendant 24h. La dtermination de la CL50 utilise la mthode graphique de rgression linaire de la relation suivante :

41 41

% de dcs = f (log C)
O C est la concentration du milieu en g/ml Lquation de la droite de rgression linaire est donne par la formule suivante : Y = A + B log C O Y : pourcentage de la mortalit (%) A : constante B : coefficient de rgression linaire C : concentration en g/ml

2.2.3. METHODES DETUDE DES EFFETS SUR LES VEGETAUX 2.2.3.1. Etude des effets sur le pouvoir germinatif de graines
Lexprience est ralise sur des graines de diffrentes plantes Monocotyldones et Dicotyldones (voir liste 2.1.2.p.33). Elle consiste les faire germer en prsence dune concentration connue dextrait tudier. Les rsultats sont apprcis par comparaison avec des graines mises germer dans leau de pluie. Pour chaque espce, un lot de 10 graines est mis germer dans une boite de Ptri contenant du coton imbib de 20ml dextrait tester la concentration unique de 1mg/ml. Les graines sont arroses tous les 2 jours avec le mme extrait. dans leau de pluie. Lexprience dure 7 jours la temprature ambiante et lobscurit. Un lot tmoin est mis germer

2.2.3.2. tude de la croissance de jeunes plantules

Cette tude est ralise sur les graines dun reprsentant des Monocotyldones et dun reprsentant des Dicotyldones. Les graines de chaque espce sont rparties en 7 lots de 10 graines. Deux lots sont tremps dans lextrait tester de concentration dtermine la temprature ambiante et lobscurit pendant 2 jours. Ensuite, lun des lots est mis en germer et arros en prsence du mme extrait, tandis que le 2me lot, aprs lavage, est mis germer et arros en prsence deau de pluie.

Les 5 autres lots sont tremps dans leau de pluie la temprature ambiante et lobscurit pendant 2 jours, puis rpartis comme suit : un lot tmoin est mis germer dans leau de pluie, les autres sont mis germer et arros en prsence de diffrentes concentrations dextrait tudier. Pour tous les lots, larrosage se fait tous les 2 jours. La longueur des picotyles et des hypocotyles est mesure tous les 2 jours pendant 2 semaines.

4242

2.2.3.3. Etude de la croissance de bourgeons axillaires

Les effets de lextrait tester sur la croissance des bourgeons axillaires sont observs par comparaison avec ceux de la gibbrelline et de lauxine. Ces 2 dernires sont des hormones vgtales qui ont respectivement des effets stimulateurs et inhibiteurs de la croissance des bougeons axillaires. Lexprience est ralise sur des plantules de petit pois obtenues par germination de graines dans leau de pluie pendant 7 jours. Les tigelles sont sectionnes au-dessus du 2me bourgeon axillaire. Un volume de 1 l dextrait tudier 28 g/l est mlang avec un agent fixateur tel que la lanoline. Le mlange est appliqu sur la partie sectionne des plantules. Les mmes manipulations sont effectues avec des solutions de gibbrelline et dauxine 28 g/l chacune. De leau de pluie (1 l ) sert de tmoin. Les plantules sont arroses rgulirement avec leau de pluie et la longueur des bourgeons axillaires est mesure chaque jour pendant 7 jours.

2.2.4. METHODES DETUDE DES EFFETS SUR LES MICRO-ORGANISMES 2.2.4.1. Prparation des souches 2.2.4.1.1. Prlvement des germes
Les micro-organismes sont prlevs soit de lintrieur dun organe danimal : lintestin par exemple, ou du trou dune dent carie laide dune se ; soit partir des cultures disponibles dans le laboratoire de Microbiologie de la MPE.

43 43 Le frottis obtenu est mont entre lame et lamelle dans une goutte deau pour tre observ ltat frais.

2.2.4.1.2. Observation ltat frais

Lobservation au microscope optique au grossissement x 400 des micro-organismes vivants permet dtudier :

leur morphologie : btonnet, coque, virgule, leur mobilit : mobiles ou immobiles ; leur mode de groupement : isols ou groups : diplodes, en grappe, en chanette, 2.2.4.1.3. Enrichissement des germes
Aprs avoir confirm la prsence des micro-organismes dans le prlvement par observation ltat frais, un frottis est ensemenc dans un bouillon nutritif ou mis en culture sur de la glose nutritive solide pour permettre la multiplication des cellules microbiennes. La prparation est incube ltuve 37C pendant 18 24h.

2.2.4.1.4. Isolement et purification

La purification consiste cultiver plusieurs fois successives sur un milieu spcifique, les germes prlevs partir de la culture enrichie prcdente, jusqu lobtention de souches pures. Les souches pures sont caractrises par :

des colonies homognes, uniformes et identiques du point de vue de la forme, la

transparence, laspect de la surface, la consistance, la couleur,

des cellules uniformes et identiques du point de vue de la taille, la forme, la mobilit, le

mode de groupement,

des micro-organismes caractres biochimiques identiques. 2.2.4.1.5. Ractivation des souches

Certains milieux spcifiques de bactries dtermines contiennent des inhibiteurs de la croissance dautres micro-organismes. Les bactries qui poussent sur ces milieux sont aussi exposes ces inhibiteurs. Aprs lobtention de souches pures sur ces milieux, il est par consquent ncessaire de recultiver les bactries sur de la glose nutritive pour rtablir le mtabolisme bactrien.

4444

2.2.4.2. Identification et caractrisation des souches

(SINGLETON, 1994 ; MAURY, 1987)

2.2.4.2.1. Mthode de coloration de GRAM

Cette mthode permet la classification des bactries en deux groupes : les bactries GRAM positif dont la paroi est trs riche en muco-complexes et pauvre en lipides ; et les bactries GRAM ngatif dont la paroi est pauvre en muco-complexes mais riche en lipides. Un frottis de souche pure est tal en couche mince sur une lame laide dune se. Il est fix sur la lame par 3 passages successifs au-dessus de la flamme dun bec Bunsen. Le frottis est rhydrat, recouvert dune solution de violet de gentiane phniqu pendant 1min, puis rinc leau. Il est ensuite recouvert de lugol puis rinc leau. La lame est dcolore par lalcool 95 puis rince avec leau. Le frottis ainsi trait est ensuite recolor avec de la fuschine phnique de ZIEHL pendant 30s et lav leau. La lame est sche lair libre et la prparation est recouverte dhuile dimmersion (huile de cdre) pour augmenter la visibilit des cellules au microscope. Les bactries GRAM positif gardent la coloration violette aprs laction de lalcool tandis que les bactries GRAM ngatif sont dcolores par lalcool et teintes en rose plus ou moins vif par la fuschine.

2.2.4.2.2. Dtermination des caractres biochimiques (BARTOLI et coll., 1972)

Les bactries peuvent tre identifies grce leurs caractres biochimiques. La dtermination consiste ensemencer les souches sur des milieux didentification spcifiques et observer le changement de coloration de ces milieux. Lincubation a lieu 37C pendant 18 24h.

2.2.4.2.2.1. Culture sur milieu citrate de SIMMONS

Lensemencement de la souche tudier se fait par piqre du milieu du fond vers la surface. Les bactries utilisant le citrate sont dites citrate positif (test positif). Dans ce cas, la coloration vire du jaune au bleu.

2.2.3.2.2.2. Culture sur milieu HAJNA-KLIGLER : lactose-glucose-H2S

Le milieu est base de lactose et de glucose. Lensemencement se fait du fond vers la surface par un mouvement de stries. La fermentation du glucose est observe au fond du tube,

celle du lactose la surface du milieu. La coloration rouge indique que le test est ngatif ; quand elle devient jaune, le test est positif. La formation de sulfure dhydrogne se traduit par lapparition dune coloration noire dans le milieu.

45 45

2.2.4.2.2.3. Culture sur milieu mannitol-mobilit

Ce milieu semi-mou est ensemenc par piqre centrale. Lutilisation du mannitol se traduit par le virage de la coloration du rouge au jaune. La mobilit des bactries est reconnaissable par lapparition de pousses de bactries en dehors de la ligne densemencement, sous forme dune turbidit.

2.2.4.2.2.4. Culture sur milieu ure-indole

Une se de cellules bactriennes est mise en suspension dans 0,5ml deau physiologique, et la suspension est mlange directement avec le milieu ure-indole. Le virage de la coloration du jaune au rouge violac tmoigne de la prsence de lurase bactrienne. Lorsque la coloration reste jaune, le test est ngatif. La prsence dindole dans le milieu est rvle par lapparition dun anneau rouge en surface, aprs addition de 3 gouttes de ractif de KOVACS

2.2.4.2.2.5. Culture sur milieux LDC, ODC et ADH

La culture dans ces milieux est pratique en anarobiose. Elle consiste remplir les 3 tubes contenant respectivement les milieux LDC, ODC et ADH (milieux liquides prts lemploi) par la suspension microbienne. Les tubes sont ferms fond aprs lensemencement. Dans chaque tube, lapparition dune coloration rouge violace indique que le test est positif (prsence de dcarboxylase dans les milieux LDC et ODC et prsence de dihydrolase dans le milieu ADH).

2.2.4.2.2.6. Test lONPG

Un disque imprgn dONPG est plong dans 0,5ml de suspension bactrienne. La prsence de la -galactosidase bactrienne se traduit par lapparition dune coloration jaune.

2.2.4.2.2.7. Test de loxydase

Un frottis prlev avec une se est plac sur un disque imprgn doxalate de dimthylparaphnylne diamine et pralablement imbib deau distille. Le test est positif lorsque la coloration du disque devient violette. Les modalits de lecture des rsultats des diffrents tests didentification sont rsumes dans le tableau 10.

4646

Tableau 10 : Tableau rcapitulatif des diffrents tests didentification

(LIVRET TECHNIQUE, 1996)
COLORATION Test ngatif Citrate de Simmons Lactose Glucose H 2S Mannitol Mobilit Ure Indole ONPG LDC Ure Tryptophane Ortho-nitro-phnyl D-galactopyranoside Lysine Lactose Glucose Thiosulfate de sodium Mannitol Citrate de sodium Utilisation de sodium Fermentation/oxydation Fermentation/oxydation Production de H2S Fermentation/oxydation Mobilit Urase Production dindole -glycosidase Jaune Rouge Rouge Incolore Rouge Immobile Jaune Jaune Incolore Test positif Bleu Jaune Jaune Noir Jaune Mobile Rouge violac Rouge Jaune Rouge violac Rouge violac Rouge violac Violet

MILIEU

SUBSTRAT ou REACTIFS

REACTIONS ou ENZYMES

Lysine dcarboxylase

Jaune

ODC

Ornithine

Ornithine dcarboxylase

Jaune

ADH

Arginine Oxalate de dimthylparaphnylamine diamine

Arginine dihydrolase

Jaune

Oxydase

Cytochrome oxydase

Incolore

47 47

2.2.4.3. Mthodes de dtermination des effets sur les bactries

(CHABBERT et TERRIAL, 1963) La sensibilit des micro-organismes vis--vis dun agent anti-microbien peut tre dtermine soit en milieu liquide soit en milieu solide.

2.2.4.3.1. Mthode en milieu liquide 2.2.4.3.1.1. Principe

En milieu liquide, linhibition de la croissance bactrienne par un agent anti-microbien se traduit par labsence de turbidit dans le milieu.

2.2.4.3.1.2. Mode opratoire

La culture de la souche tudier est relance dans le milieu liquide de Meller-Hinton. Diffrentes concentrations de lextrait tester sont prpares par dilutions successives dune solution mre de concentration dtermine. La dilution se fait au demi avec de leau physiologique. Les solutions ainsi prpares sont ajoutes 2ml de milieu de Meller-Hinton pralablement prpars dans des tubes hmolyse. Une se de bactries est ensemence dans chaque tube. Le volume final dans chaque tube est toujours 2,4ml. Deux tmoins sont constitus :

un tmoin positif contenant seulement 2ml de milieu, montrant labsence de

croissance bactrienne,

un tmoin ngatif contenant 2ml de milieu ensemenc avec une se de germes,

montrant la croissance bactrienne. Le volume dans les tubes tmoins est ajust 2,4ml avec leau physiologique. Les tubes sont incubs 37C pendant 18 24h. La lecture des rsultats se fait lil nu, la turbidit dans le milieu indique la croissance des bactries alors que sa limpidit tmoigne de linhibition de cette croissance.

2.2.4.3.2. Mthode en milieu solide 2.2.4.3.2.1. Principe

Lorsquun antibiotique est dpos en un point dune surface uniformment ensemence avec des germes, une zone dinhibition de la croissance microbienne ou halo dinhibition est observe autour de lantibiotique en cas de sensibilit. Le diamtre de cette zone est fonction directe du degr de sensibilit du microbe tudi.

4848

2.2.4.3.2.2. Mode opratoire 2.2.4.3.2.2.1. Prparation de linoculum et ensemencement

Une suspension microbienne est prpare en mlangeant une se de bactries avec 1ml de srum physiologique. La surface du milieu glos de Meller-Hinton pralablement coul dans une boite de Ptri est uniformment inonde avec la suspension ainsi obtenue. Lexcs de suspension est aspir et jet.

2.2.4.3.2.2.2. Dpt dextrait

Un disque dantibiogramme vierge est imbib de 20l dextrait tester de concentration connue. Le disque ainsi trait est plac la surface de la glose pralablement ensemence cidessus. Dans chaque bote, 4 disques sont dposs sur le milieu : 2 disques imprgns de lextrait tester et 2 autres imprgns dantibiotiques de rfrence de quantit connue. La liste des antibiotiques utiliss et leurs germes-cibles est donne dans le tableau 11.

Tableau 11 : Liste des antibiotiques utiliss et leurs germes-cibles

Nom des antibiotiques Amoxicilline Ampicilline Pasteurella Germes-cibles Salmonella Shigella Klebsiella Proteus Pseudomonas

Colistine

Erythromycine

Escherichia coli Streptococcus Enterobacter Staphylococcus

La boite est incube 37C pendant 18 24h. La lecture des rsultats consiste mesurer le diamtre du halo dinhibition selon les normes prconises par lInstitut Pasteur de Madagascar (IPM) suivantes :

49 49

Tableau 12 : Normes utilises dans lexpression des rsultats des tests en milieu solide Diamtre du halo (x) Sensibilit des germes Expression de rsultats
x < 7mm 7mm x 8mm 8mm < x 9mm x > 9mm Insensible Assez sensible Sensible Trs sensible + ++ +++

3. RESULTATS

3.1. EFFETS SUR LES ANIMAUX 3.1.1. EFFETS SUR LES ANIMAUX A SANG CHAUD 3.1.1.1. Effets sur la souris 3.1.1.1.1. Influence des diffrentes voies dadministration
Les effets des principes actifs administrs un animal peuvent tre influencs par la voie dadministration (DUMAS, 1953 ; TALBOT, 1989). Deux voies dadministration ont t essayes pour tester les effets de lextrait purifi E2 ou extrait : voie orale et voie intrapritonale (mthode dcrite au 2.2.1.1.p.37). Les rsultats montrent qu la mme dose 840mg/kg (dose laquelle les souris dveloppent les mieux les symptmes par voie ip) administre 2 lots de 2 souris, les effets varient selon la voie dadministration (tableau 13).

Tableau 13 : Influence des voies dadministration Voie dadministration

Intrapritonale Orale Observation Apparition de symptmes Absence de symptmes

Ladministration de lextrait 840mg/kg par voie orale ne suscite aucun symptme chez la souris, tandis que celle par voie intrapritonale provoque lapparition de symptmes qui sont dcrits dans le paragraphe suivant.

5050

3.1.1.1.2. Description des symptmes

Les symptmes dvelopps par ladministration par voie ip de lextrait E2 la dose de 840mg/kg sont les suivants : 4min aprs linjection, la souris prsente une hypoactivit motrice. Les yeux sont rouges et une exophtalmie est note. Vers la 6me minute, une lgre ataxie accompagne dune hyperpne sont observes. Les poils sont hrisss, les oreilles tires vers lavant. Vers la 24me minute, la tte de la souris tremble. Puis la souris se rtablit progressivement et vers la 36me minute, elle est remise.

2.1.1.1.3. Examen histopathologique

Lexamen histopathologique (voir mthode 2.2.1.1.2.p.37) est pratiqu aprs ladministration de la dose dextrait 840mg/kg par voie ip. Les animaux sont sacrifis 12h aprs linjection, temps au bout duquel les symptmes se sont bien dvelopps. Lextrait provoque chez la souris latteinte des organes suivants: lestomac, le foie, lintestin, les reins et les poumons. Les lsions se traduisent toutes par lapparition dune nappe hmorragique mais elles sont plus accentues au niveau du foie et des reins.

Par contre, aucune lsion nest observe au niveau du cur et du cerveau. Les diffrentes lsions sont montres sur les figures 5 9 et rsumes dans le tableau 14.

Tableau 14 : Les principales lsions histologiques provoques par la dose de 840mg/kg dextrait, administre par voie ip Organes Lsions de lorgane Localisation

Estomac Nappe hmorragique Sreuse Foie Intestin Reins Nappe hmorragique Veine centro-lobulaire Nappe hmorragique Sreuse Nappe hmorragique Glomrule
Alvole

Poumons Nappe hmorragique

3.1.1.2. Effets sur les hmaties de mouton

Les extraits E1 et E2 ont t simultanment tests, titre comparatif (voir mthode 2.2.1.2.2.2.p.39). Les rsultats obtenus sont prsents dans le tableau 15 et sur la figure 10.

51 51 Estomac non

Estomac non

3 5 2 1 4

a)

Estomac trait

b)

Figure 5 :

Lsions histologiques au niveau de lestomac dues ladministration par voie ip de lextrait la dose de 840mg/kg de poids (Grossissement x400) a) estomac non trait b) estomac trait 1) muqueuse 2) bordure pithliale 3) glande 4) cavit gastrique 5) muscle 6) nappe hmorragique

5252

Foie non trait

3 2

1 c)

d) Figure 6 : Lsions histologiques au niveau du foie dues ladministration par voie ip de lextrait la dose de 840mg/kg de poids (Grossissement x400) c) foie non trait d) foie trait1) veine centro-lobulaire 2) hpatocyte 3) capillaire sinusode 4) nappe hmorragique

53 53

Intestin non trait

2

1
1

Rein trait

e)

f)

Figure 7 : Lsions histologiques au niveau de lintestin dues ladministration par voie ip de lextrait la dose de 840mg/kg de poids (Grossissement x400) e) intestin non trait f) intestin trait 1) muqueuse 2) sreuse 3) nappe hmorragique

5454 Rein non trait

g)

h)

Figure 8 : Lsions histologiques au niveau des reins dues ladministration par voie ip de lextrait la dose de 840mg/kg de poids (Grossissement x400) g) rein non trait h) rein trait 1) glomrule 2) tubule 3) capillaire 4) nappe hmorragique

55 55

Poumon non trait

3 2
3 1

1
2

i)

j)

Figure 9 : Lsions histologiques au niveau des poumons dues ladministration par voie ip de lextrait la dose de 840mg/kg de poids (Grossissement x400) i) poumon non trait j) poumon trait 1) alvole 2) tissu inter-alvolaire 3) capillaire 4) nappe hmorragique

Tableau 15 : Rsultats des tests hmolytiques des extraits E1et E2

T T + 0, 0,2 0,12 0,06 0,03 0,01 0,00 0,00 5 5 + 5 + 2 + 1 + 5 + 7 + 3 +

5656

Concentration (mg/ml)

0,001 -

Rsultats pour lextrait E1 +

Rsultats pour lextrait E2 +

- + + - + +

T+: tmoin positif (eau distille) T- : tmoin ngatif (PBS)

+ : hmolyse totale + : hmolyse partielle - : absence dhmolyse

T+

T-

C1

C2

C3

C4

C5

C6

C7

C8

C9

C10

E2

E1

Figure 10 : Rsultats des tests hmolytiques sur le sang de mouton pour les extraits E1 et E2 ; Concentrations en mg/ml C1 : 1 ; C2 : 0,5 ; C3 : 0,25 ; C4 : 0,125 ; C5 : 0,062 ; C6 : 0,031 ; C7 : 0,015 ; C8 : 0,007 ; C9 : 0,003 ; C10 : 0,001
Les extraits montrent une activit hmolytique. Cependant, cette activit varie selon les concentrations de chaque extrait test. Pour lextrait E1, les rsultats suivants sont observs :

lhmolyse est totale des concentrations suprieures ou gales 1mg/ml ; lhmolyse est partielle 0,5mg/ml ; une absence dhmolyse est observe des concentrations infrieures ou gales 0,25mg/ml. Pour lextrait E2, les rsultats sont les suivants :

une hmolyse totale est obtenue des concentrations suprieures ou gales 0,062mg/ml ; une hmolyse partielle apparat des concentrations comprises entre 0,031mg/ml et 0,003mg/ml ; une absence dhmolyse est observe des concentrations infrieures ou gales 0,001mg/ml.

57 57 Il apparat ainsi que le pouvoir hmolytique de lextrait E2 est plus lev que celui de lextrait E1.

3.1.2. EFFETS SUR LES ANIMAUX A SANG FROID

Les effets de lextrait E2 ont t tests sur les larves de moustique, les ttards de grenouille et les poissons.

3.1.2.1. Effets sur les larves de moustique

Six lots de 7 larves de moustique ont t soumis diffrentes concentrations dextrait purifi E2. Lextrait initial de concentration de 16g/ml (100% de mortalit) est dilu en cascade avec un coefficient de dilution de 1/1,1 selon la mthode prsente au 2.2.2.1.p.40.

Les larves mortes ne bougent pas lorsquon les touche avec une aiguille dans la rgion cervicale. Les larves moribondes sont incapables datteindre la surface ou prsentent des mouvements dsordonns ou un tat de rigidit. Les larves moribondes sont comptes comme mortes. Les rsultats obtenus sont exprims dans le tableau 16.

Tableau 16 : Rsultats des tests sur les larves de moustique Concentration C (g/ml)
16 14,4 12 ,96 11,66 10,5 9,45

log C
1,204 1,158 1,112 1,064 1,021 0,975

Nombre de larves Mortes Survivantes

7 5 4 3 1 0 0 2 3 4 6 7

% de dcs
100 71,42 57,14 42,86 14,29 0

Daprs ces rsultats, lextrait est toxique pour les larves de moustique. Un effet-dose est observ. Lquation de la droite de rgression linaire de la relation % de dcs=f(log C) est de Y=-417,45+427,06 log C avec un coefficient de corrlation r=0,99. Daprs cette quation, la CL50 (24h) est estime 12,43g/ml.

3.1.2.2. Effets sur les ttards de grenouille

Les 6 lots de 7 ttards ont t traits avec diffrentes concentrations dcroissantes dextrait, allant de 15g /ml 8,86g/ml et prpares selon la mthode dcrite en 2.2.2.1 p.40. Le coefficient de dilution est de1/1,1. Les rsultats obtenus sont donns dans le tableau 17.

5858

Tableau 17 : Rsultats des tests sur les ttards de grenouille Concentration C (g/ml)
15 13,5 12,15 10,94 9,84

log C
1,176 1,13 1,084 1,039 0,992

Nombre de ttards Morts Survivants

7 6 5 3 0 0 1 2 4 7

% de dcs
100 85,71 71,42 42,86 0

A partir de la concentration 10,94g /ml, lextrait est toxique pour les ttards de grenouille. Un effet-dose est observ. Lquation de la droite de rgression linaire de la relation % de dcs=f(log C) est de Y=-470,15+490,09 log C avec un coefficient de corrlation r=0,97. Daprs cette quation la CL50 (24h) est value 11,51g/ml.

3.1.2.3. Effets sur les poissons

Les 6 lots de 7 poissons ont t soumis des concentrations dcroissantes dextrait de 20g/ml 15,48g/ml avec un coefficient de dilution 1/1,05 (voir 2.2.2.1. p.40). Les rsultats sont rsums dans le tableau 18.

Tableau 18 : Rsultats des tests sur les poissons Concentration C (g/ml)

20 19 18,05 17,15 16,29 15,48

log C
1,301 1,278 1,256 1,234 1,211 1,189

Nombre de poissons Morts Survivants

7 6 5 3 1 0 0 1 2 4 6 7

% de dcs
100 85,42 71,42 42,86 14,29 0

Lextrait E2 montre une toxicit sur les poissons. On note un effet-dose. Lquation de la droite de rgression linaire de la relation % de dcs=f(log C) est de Y=-1128,53+948,65 log C avec un coefficient de corrlation r=0,99. Daprs cette quation la valeur de la CL50 (24h) est value 17,47g/ml.

59 59

3.2. EFFETS DE LEXTRAIT SUR LES VEGETAUX

Trois expriences ont t ralises pour tudier les effets de lextrait E2 sur les vgtaux : tude des effets sur le pouvoir germinatif de graines, sur la croissance des jeunes plantules et sur la croissance des bourgeons axillaires.

3.2.1. EFFETS SUR LE POUVOIR GERMINATIF DE GRAINES

La mthode utilise pour dterminer ces effets est prsente au paragraphe 2.2.3.1.p.41. Les effets de lextrait E2 1mg/ml sur le pouvoir germinatif de graines sont prsents dans le

tableau 19. Tableau 19 : Effets de lextrait 1mg/ml sur le pouvoir germinatif de graines NOM VERNACULAIRE
Carotte Persil chinois Tissam-white Laitue Concombre Courgette Haricot Petit pois Morelle noire Oignon Riz

FAMILLE

ESPECE Daucus carota

% DE GERMINATION
40 10 20 50 100 100 100 50 0 10 60

APIACEAE
DICOTYLEDONES

Petroselium crispum Brassica sp Lactuca sativa Cucumus sativus Cucurbita pepo

BRASSICACEAE COMPOSITAE CUCURBITACEAE

FABACEAE SOLANACEAE
MONOCOTYLEDONES

Phaseolus vulgaris Pisum sativum Solanum nigrum Allium cepa Oryza sativa

LILIACEAE

POACEAE

Zea mays

Mas

60

La germination de graines de morelle noire est compltement inhibe par lextrait ; par contre, celle du haricot, de la courgette et du concombre nest pas affecte. La germination des autres graines est affecte des taux variables. Linhibition de cette germination varie de 40% pour les graines de riz et mas, 90% pour les graines de persil chinois.

6060

3.2.2. EFFETS SUR LA CROISSANCE DE JEUNES PLANTULES

En se basant sur les rsultats ci-dessus, 2 espces sensibles lextrait : le mas (Monocotyldones) et le petit pois (Dicotyldones) ont t choisies pour raliser les tests sur la croissance de jeunes plantules. Les tapes de lexprience sont rcapitules sur la figure 11. La mthode utilise est celle dcrite au paragraphe 2.2.3.2.p.41.

7lots de 10 graines de mas ou de petit pois

TREMPAGE

2 lots dans lextrait 1mg/ml

5 lots dans leau de pluie

GERMINATION

1 lot dans lextrait 1mg/ml

1 lot dans leau de pluie

1 lot dans leau de pluie

1 lot dans lextrait 0,45mg/ml

1 lot dans lextrait 0,59mg/ml

1 lot dans lextrait 0,77mg/ml

1 lot dans lextrait 1mg/ml

Figure 11 : tapes de lexprience sur la croissance de jeunes plantules

Lvolution de la longueur de lpicotyle et de lhypocotyle de petit pois et de mas pendant 14 jours est montre sur les figures 12 et 13.

61 61

Epicotyle de petit pois

Longueurs (mm) 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 2 EP 0,77mg/ml 4 6 8 0,45mg/ml 1mg/ml 10 12 0,59mg/ml 14 Jours

(A)

Hypocotyle de petits pois

Longueurs (mm)

30 25 20 15 10 5 0 2
EP

10

12

14
Jours 1 mg/ml

0,45 mg/ml

0,59 mg/ml

0,77 mg/ml

(B)

Figure 12 : Evolution de la longueur de lpicotyle (A) et de lhypocotyle (B) de petit pois en prsence des diffrentes concentrations de lextrait. EP : Eau de pluie

6262

Epicotyle de mas
Longueurs (mm)

60 50 40 30 20 10 0 2 4 6 8 10 12 14
Jours

EP

0,45mg/ml

0,59mg/ml

0,77mg/ml

1mg/ml

(C)

Hypocotyle de mas
Longueurs (mm) 25 20 15 10 5 0 2 4 6 8 10 12 14 Jours
EP 0,45mg/ml 0,59mg/ml 0,77mg/ml 1mg/ml

(D)

Figure 13 : Evolution de la longueur de lpicotyle (C) et de lhypocotyle (D) de mas en prsence de diffrentes concentrations de lextrait. EP : Eau de pluie

Lextrait E2 provoque des degrs variables une inhibition de la croissance de lpicotyle et de lhypocotyle de petit pois et de mas. Pour le petit pois, linhibition de la croissance de lpicotyle apparat ds le 1er jour, puis saccentue au 10me jour. Celle de l hypocotyle napparat qu partir du 8me jour, sauf pour la concentration 0,45mg/ml qui provoque une inhibition ds le 2me jour. La croissance de lpicotyle de mas est peu affecte par lactivit de lextrait. Pour lhypocotyle, linhibition se manifeste au 10me jour. Le taux dinhibition de la croissance de lpicotyle et de lhypocotyle des deux plantes au 14
me

63 63

jour, en fonction de la concentration de lextrait est donn dans le tableau 20.

Tableau 20 : Taux dinhibition de la croissance de lpicotyle et de l hypocotyle de petit pois et de mas au 14me jour de lexprience Graines trempes dans lextrait Eau de pluie Extrait 1mg/ml

Graines trempes dans leau de pluie Eau de pluie

Longueur de lpicotyle (mm) Taux dinhibition Longueur de lhypocotyle (mm) Taux dinhibition Longueur de lpicotyle (mm) Taux dinhibition Longueur de lhypocotyle (mm) Taux dinhibition 155

Extrait 0,45mg/ml

Extrait 0,59mg/ml

Extrait Extrait 0,77mg/ml 1mg/ml

113

96

89

45

76

12

Petit pois

0%
27

27,1%
20

38,07%
13

42,58%
12

70,96%
11

50,96%
24

92,25%
8

0%
57

25,02%
38

51,85%
33

55,55%
27

59,25%
20

11,11%
42

70,37%
13

Mas

0%
22

33,33%
5

42,1%
4

52,63%
4

64,91%
1

26,31%
14

77,19%
2

0%

77,27%

81,81%

81,81%

95,45%

36,36%

90,9%

Pour le mas, linhibition de la croissance de lhypocotyle et plus importante que celle de lepicotyle et celle-ci augmente en fonction de la dose. Pour le petit pois, cest la croissance de lpicotyle qui est la plus touche. Un effet-dose est observ dans ce dernier cas.

3.2.3. EFFETS SUR LA CROISSANCE DES BOURGEONS AXILLAIRES

Lexprience est ralise sur des jeunes plantules de petit pois ges de 7 jours (voir mthode au 2.2.3.3.p.42). Les rsultats des effets de E2 (28g) sont tudis paralllement aux effets de lauxine (une hormone inhibitrice de la croissance vgtale) et de la gibbrelline (une hormone stimulatrice de la croissance vgtale) la mme quantit. Leau de pluie est utilise comme tmoin. Les effets de lextrait sur la croissance des bourgeons axillaires en comparaison avec ceux de la gibbrelline, de lauxine et leau de pluie sont donns sur la figure 14.

6464

Croissance des bourgeons axillaires

Longueurs (mm) 40 35 30 25 20 15 10 5 0 1 2 3 4 5 6 7 Jours

EP

Extrait

Auxine

Gibbrelline

Figure 14 : Effet de lextrait (28g) sur la croissance des bourgeons axillaires en comparaison avec ceux de la gibbrelline (28g), lauxine (28g) et leau de pluie ou EP (tmoin)
Daprs ces rsultats, lextrait stimule la croissance des bourgeons axillaires. Cependant, cette stimulation est faible par rapport celle provoque par la gibbrelline.

65 65

3.3. EFFETS SUR LES MICRO-ORGANISMES 3.3.1. ISOLEMENT ET IDENTIFICATION DES GERMES

Treize souches microbiennes ont t isoles et identifies partir de prlvements ou de cultures disponibles au laboratoire de la MPE (mthode 2.2.4.p.42). La morphologie et les caractres biochimiques des micro-organismes sont indiqus dans le tableau 21.

Tableau 21 : Rsultats de lidentification et de la caractrisation des souches

Mannitol

Gram

ODC

Escherichia coli Klebsiella pneumoniae Salmonella typhi Salmonella paratyphi Shigella sonne Proteus mirabilis Proteus vulgaris Pasteurella multocida Pasteurella aerogenes Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus Streptococcus Enterobacter cloacae

B B B B B B B B B B

+ + d -

+ + + + + + + d + +

+ + + + -

+ + + + d d + -

+ + + + +

+ + + -

+ d d d + -

+ + + + -

d + -

d d + d + + -

ADH d d + + + +

LDC

Ure

Nom des souches

d d +

C C B

+ + -

+ +

+ +

+ + d

+ -

+ + -

+ +

B : btonnet C : coque

+ : test positif - : test ngatif d : test douteux

Oxydase + -

Mobilit

Glucose

Lactose

Citrate

ONPG

Forme

Indole

H 2S

6666

3.3.2. SPECTRE DACTIVITE MICROBIENNE 3.3.2.1. Activit en milieu liquide

Les compositions des milieux utiliss (voir 2.2.4.3.1.2.p.47) pour le test ainsi que les rsultats obtenus sont prsents dans le tableau 22.

Tableau 22 : Composition des milieux utiliss pour le test dactivit antimicrobienne et rsultats du test Tmoins
T+ T2 0 1 0,4 2,4 0 Tube 1 2 0,4 1 0 2,4 6,33

Tests
Tube 2 2 0,2 1 0,2 2,4 3,16 Tube3 2 0,1 1 0,3 2,4 1,08

Milieu Meller-Hinton (ml) Extrait 38mg/ml (ml) Germes (se) Eau physiologique (ml) Volume final Concentration finale de lextrait (mg/ml) Observation aprs 18 24h

2 0 0 0,4 2,4 0

Limpide Trouble Trouble Trouble Trouble T+ : tmoin positif, T- : tmoin ngatif

Daprs ces rsultats, mme pour la plus grande concentration utilise pour tester lextrait (6,33mg/ml), la croissance des bactries nest pas inhibe. Les germes tests sont donc insensibles lextrait des concentrations infrieures ou gales 6,33mg/ml.

3.3.2.2. Activit en milieu solide

Les disques utiliss ont reu 20l dextrait 38mg/ml, cest--dire chaque disque contient 720g dextrait. Les rsultats sont rsums dans le tableau 23. Les antibiotiques utiliss avec leurs quantits respectives sont prsents dans le tableau 24.

67 67

Tableau 23 : Rsultats du test dactivit antimicrobienne en milieu solide Souches testes Escherichia coli Klebsiella pneumoniae Salmonella typhi Salmonella paratyphi Shigella sonne Proteus mirabilis Proteus vulgaris Pasteurella multocida Pasteurella aerogenes Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus Streptococcus Enterobacter cloacae Diamtre du halo (mm) Sensibilit
7 5 5 5 5 5 5 5 5 6 7 6 5 + : assez sensible - : insensible + + + + -

Tableau 24 : Liste des antibiotiques utiliss avec leurs quantits respectives et leurs germes-cibles Quantit sur un disque

Nom des antibiotiques

Germes-cibles Pasteurella

Amoxicilline

25g

Salmonella Shigella Klebsiella

Ampicilline

10g

Proteus Pseudomonas

Colistine

50g

Escherichia coli Enterobacter Streptococcus Staphylococcus

Erythromycine

15g

Sur les 13 souches testes, seules 4 souches sont assez sensibles leffet inhibiteur de lextrait : Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Streptococcus et Escherichia

6868

coli. Lextrait na aucun effet sur la croissance de Klebsiella pneumoniae, Salmonella typhi, Salmonella paratyphi, Shigella sonne, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Pasteurella multocida, Pasteurella aerogenes et Enterobacter cloacae.

4. DISCUSSION ET CONCLUSION
Ltude toxicologique de lextrait E2 obtenu partir de tubercules de Dioscorea

esculenta montre quil a une activit sur des animaux, des vgtaux et des micro-organismes.
Lextrait, administr par voie orale la dose de 840mg/kg, ne provoque aucun symptme sur la souris. Lalcalode administr pourrait soit tre dtruit par diverses enzymes du tube digestif, soit subir des modifications (mthylation, oxydation, hydrolyse,) qui le rendraient inactif, soit encore ne pas tre absorb au niveau de lintestin. Dans tous les cas, lextrait ne prsente pas la toxicit de la dioscorine ou de la dihydrodioscorine dont les DL100 sont respectivement de 110mg/kg et 160mg/kg (COURSEY, 1967 et NEUWINGER, 1996). Par voie ip, lextrait ne tue pas la souris la dose de 840mg/kg, mme si elle provoque des symptmes visibles : hypoactivit motrice, exophtalmie, lgre ataxie, hyperpne, pilorection et tremblement. La mydriase et la pilorection pourraient tre dues la stimulation des rcepteurs adrnergiques (ou rcepteurs ) au niveau du muscle lisse viscral (COHEN, 1978). En effet, on sait que ces rcepteurs sont stimuls par les alcalodes animaux tels que la dopamine, la noradrnaline, ladrnaline. Daprs lexamen histopathologique, cette mme dose provoque des lsions dans diffrents organes de la souris. Au niveau du foie, des reins, des poumons, de lestomac et de lintestin, on observe des nappes hmorragiques qui pourraient tre la consquence de la contraction intense des muscles lisses au niveau des artrioles et des veinules et de laugmentation de la permabilit. En effet, la stimulation des rcepteurs provoque une vasoconstriction, qui implique une contraction des muscles lisses vasculaires. Dautre part, le foie est le plus touch parce quil est le premier organe de dtoxification. Le cur et le cerveau ne prsentent aucune lsion. Pour le coeur, ni le muscle stri cardiaque, ni le tissu nodal ne contiennent de rcepteurs . Lextrait a pu atteindre le cur mais il na pas pu probablement se fixer sur la membrane cellulaire cardiaque, ni la traverser.

Les cellules cervicales par contre contiennent des rcepteurs , mais les vaisseaux irriguant le cerveau prsentent une barrire hmato-encphalique pouvant filtrer le sang. Lextrait ne franchirait probablement pas cette barrire, ou bien il la franchie mais sous une forme inactive. Lextrait E2 provoque une hmolyse totale des concentrations suprieures ou gales 125g/ml, tandis que lextrait E1 ne prsente une hmolyse totale qu des concentrations suprieures ou gales 1000g/ml. Lextrait E2 montre donc une activit hmolytique suprieure celle de lextrait E1. Concernant les animaux sang froid, lextrait est toxique pour les larves de moustique, les ttards de grenouille et les poissons ; les CL50 pour ces animaux sont estimes respectivement 12,43g/ml ; 11,51g/ml et 17,47g/ml. Lextrait est plus toxique sur les animaux sang froid : poissons et ttards de grenouille, que lextrait toxique de Dioscorea

69 69

antaly

dont

ces

derniers

restent

insensibles

la

concentration

de

300g/ml

(RANDRIAMAMONJY, 2005). Lextrait est beaucoup moins actif sur les larves de moustique par rapport au DDT dont la CL50 est de 0,012g/ml (OMS, 1970). Nanmoins, lutilisation de lextrait comme insecticide est envisageable. Chez les vgtaux, lextrait affecte le pouvoir germinatif de graines de quelques Monocotyldones et Dicotyldones des taux variables. Pour les jeunes plantules de petit pois et de mas, la croissance de lhypocotyle est la plus touche mais celle de lpicotyle est aussi affecte. Pour le petit pois, la comparaison des effets de lextrait sur la croissance des bourgeons axillaires avec ceux des hormones stimulatrices (la gibbrelline) et inhibitrices (lauxine) permet de dire que lextrait stimule faiblement la croissance des bourgeons axillaires. Cette activit pourrait tre exploite dans le greffage pour amliorer la croissance des greffons. La plupart des micro-organismes tests sont insensibles lextrait la concentration de 38mg/ml. Seules quelques bactries : Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus,

Streptococcus et Escherichia coli sont assez sensibles. Les principes toxiques ne pourraient pas
pntrer la paroi de certaines bactries ou lextrait inhiberait leur croissance mais une dose plus leve.

7070

CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES

Les rsultats que nous avons obtenus bien quils soient encore prliminaires, ont permis : de mettre en vidence la prsence dalcalodes dans les tubercules de Dioscorea

esculenta ;
de proposer une mthode dextraction et de purification des alcalodes ; davoir les premires informations sur les proprits physico-chimiques et toxicologiques de ces alcalodes ; dapporter des connaissances sur les Dioscoraces toxiques.

Pour approfondir ltude des proprits de ces principes actifs, nous envisageons dans lavenir :

dtudier la distribution des principes actifs dans les diffrentes assises des cellules de tubercules de Dioscorea esculenta ; damliorer le procd dextraction et de purification afin dobtenir les principes actifs ltat pur avec un bon rendement; dapprofondir ltude de leurs proprits physico-chimiques et dlucider leur structure chimique ; dapprofondir ltude de leurs proprits biologiques et de procder la recherche dautres activits ; dtudier leur mcanisme daction.

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79 79

ANNEXES

Annexe I. COMPOSITION DES REACTIFS DE DETECTION DES ALCALOIDES 1-Composition des ractifs de rvlation : ractif de DRAGENDORFF modifi o Solution mre
Nitrate de bismuth.17g Acide tartrique.....200g Iodure de potassium.....160g Eau distille..1200ml

8080

Avant la pulvrisation, 50ml de solution mre sont dilus dans 500ml deau distille, et le tout est additionn de 100g dacide tartrique.

2-Composition des ractifs pour la dtection des alcalodes Ractif de DRAGENDORFF o Solution A o
Silicate de bismuth1,7g Acide tartrique20g Eau distille...30ml

Solution B
Iodure de potassium.10g Eau distille40ml

Les solutions A et B sont mlanges (v/v) puis le mlange est ajout de 10g dacide tartrique et deau distille (qsp 100ml).

Ractif de WAGNER
Iodure de potassium...2g Iode...1,27g Eau distille...qsp 100ml

81 81

Ractif de MAYER
Chlorure mercurique..13,5g Iodure de potassium..60g Eau distilleqsp 100ml

Annexe II. COMPOSITION DU LIQUIDE DE BOUIN

Acide picrique....75ml Formol 40%.........................................20ml Acide actique glacial.20ml

Annexe III. COMPOSITION DU TAMPON PHOSPHATE BUFFERED SALINE (PBS)

NaCl....8,5g NaH2PO4, H2O......0,39g Na2HPO4, H2O..1,34g Eau distille.qsp 1000ml

Ajuster le pH 7,2 par : une solution concentre de Na2HPO4 (solution basique) une solution concentre de NaH2PO4 (solution acide).

Annexe IV. COMPOSITION DES MILIEUX DE CULTURE 1- Milieux denrichissement o Glose nutritive
Peptone...5g Extrait de viande.....1g Chlorure de sodium5g Extrait de levure.....2g Agar..15g Eau distille1000ml

pH final = 7,4.

8282

o Bouillon nutritif
Peptone bactriologique.5g Extrait de viande........3g Extrait de levure.....4g Glucose...5g Eau distille.qsp 1000ml

pH final = 7,4.

o Bouillon de Meller-Hinton
Infusion de viande de buf dshydrate....6g Hydrolysat de casine17,5g Amidon....1,5g

Les ingrdients sont mlangs, puis 25g du mlange sont dissous dans leau distille qsp 1000ml.

o
pH final = 7,4.

Glose de Meller-Hinton
Infusion de viande de buf dshydrate.....300g Hydrolysat acide de casine.....17,5g Amidon de mas........1,5g Agar....10g Eau distille...........qsp 1000ml

2- Milieux disolement et de purification o Milieu de Salmonella-Shigella (SS)

Peptone....5g Extrait de viande de buf......5g Sels biliaires...4,2g Citrate de sodium....10g Thiosulfate de sodium.....8,5g Citrate de fer.....2g

83 83

Lactose...10g Rouge neutre..0,025g Vert brillant...0,0003g Agar....12g Eau distille ....qsp 1000ml

pH final = 7,3 + 0,2.

Milieu de HEKTOEN (Hek)

Protose peptone....12g Extrait de levure....3g Chlorure de sodium...5g Sels biliaires..9g Citrate de fer ammoniacal...........1,5g Salicine..2g Lactose12g Saccharose...12g Fuschine acide.0,1g Bleu de bromotymol....0,065g Eau distille .....qsp 1000ml

pH final = 7,5 + 0,2.

Milieu brillant green agar (BGA)

Proteose peptone.............10g Extrait de levure......3g Saccharose...........................................10g Lactose..............10g Chlorure de sodium ........5g Agar.....................................................20g Rouge de phnol.............0,08g Eau distille .....qsp 1000ml ;

pH final = 6,9 + 2.

8484

o Milieu eosine methylene blue (EMB)

Peptone ......10g Lactose.....10g Phosphate dipotassique.......2g Agar.....15g Eosine..0,4g Bleu de mthylne .......0,065g Eau distille ......qsp 1000ml

pH final = 7,4 + 0,2

o Milieu glose au sang

Peptone.....5g Extrait de viande....1g Chlorure de sodium...5g Extrait de levure.....2g Agar..15g Eau distille..qsp 1000ml Sang dfibrin pour recouvrir la surface

3- Milieux de caractrisation et didentification o Milieu de SIMMONS Citrate de sodium........1g Chlorure de sodium.....5g Sulfate de magnsium......0,2g Phosphate mono ammoniaque.....1g Phosphate dipotassique....1g Bleu de bromotymol.......0,08g Agar...15g Eau distille ....qsp 1000ml

85 85

Milieu KLIGLER-HAJNA : lactose-glucose-H2S

Peptone.....15g Extrait de viande de buf....3g Extrait de levure.......3g Peptone pepsique de viande.....5g Chlorure de sodium..5g Sulfate ferreux.......0,2g Thiosulfate de sodium....0,3g Lactose....10g Glucose.....1g Rouge de phnol....0,024g Agar.......11g Eau distille..qsp 1000ml

Les ingrdients sont mlangs, puis 53,5g du mlange sont dissous dans leau distille qsp 1000ml ; pH final = 7,5.

Milieu mannitol-mobilit-nitrate
Hydrolysat trypsique de casine..10g Nitrate de potassium.......7,5g Mannitol.....7,5g Rouge de phnol 1%..0,04g Agar....3,5g Eau distille......qsp 1000ml

Les ingrdients sont mlangs, puis 22g du mlange sont dissous dans leau distille qsp 1000ml, pH final = 7,6 + 0,2.

Milieu ure-indole
L-tryptophane......0,3g KH2PO4....0,1g K2HPO4....0,1g

8686

NaCl......0,5g Ure.........2g Alcool 95...........................................................1ml Rouge de phnol 1%......................................0,25ml Eau distille........100ml

Ractif de KOVACS
Para-mthylaminobenzaldehyde..................5g Alcool isoamylique.....75mg Acide chlorhydrique 12,07N...........25ml

Milieux LDC, ODC, ADH Solut Milieu ODC Milieu ADH Milieu LDC
5g 3g 5g 1g 1ml 1000ml 5g 3g 5g 1g 1ml 1000ml 5g 3g 5g 1g 1ml 1000ml

L-ornithine (monochlorhydrate) L-arginine (monochlorhydrate) L-lysine (monochlorhydrate) Extrait de levure Chlorure de sodium Glucose Bromothymol pourpre (1,6g/100ml dalcool 95) Eau distille qsp

Annexe V. COMPOSITION DU REACTIF POUR LA COLORATION GRAM 1- Violet de gentiane phniqu

Broyer dans un mortier :

Violet de gentiane...............2g Acide phniqu cristallis...............2g Alcool 95........10ml

Le mortier est rinc avec 100ml deau distille, le mlange est laiss reposer pendant 24h 37, puis filtr.

87 87

2- Lugol
Iode..........1g Iodure de potassium.........2g Eau distille....200ml

3- Fuschine phnique de Ziehl

Broyer dans un mortier :

100ml et filtrer.

Fuschine basique.......1g Alcool phniqu cristallis....5g Alcool 95..10ml

Reprendre avec 10 20ml deau distille chaude et laisser reposer 24h, puis complter

79 79 Name : RANDRIANAMBININTSOA First name : Louis Valentin Title of memory : Chemical and toxicological studies of the tubers alkaloidic extracts of

Dioscorea esculenta (DIOSCOREACEAE)

ABSTRACT A toxic activity was found in the tubers of Dioscorea esculenta or Mavondro a Dioscoreaceae introduced in Madagascar. The crude extract is prepared from the tuber powder by a methanolic extraction with the soxhlet at 60C during 24h. The purification procedure including a chloroform fractionation and an ethyl acetate treatment gives a purified extract with a final yield of 0.173%. Alkaloids have been detected in the extracts using MAYER, WAGNER and DRAGENDORFF tests. The extract administrated by intraperitoneal route at a dose of 840mg/kg provokes symptoms of poisoning to the mice displaying an attack of the nervous system. Tissue lesions characterized by haemorrhages are noted in the stomach, the liver, the kidneys , and the lungs regions. The purified extract induces the lysis of sheeps red blood cells with 0.062mg/ml. It is toxic for animals with cold blood such as tadpoles and fishes. The LC50 (24h) are respectively 11.51l/ml and 17.47g/ml. It also has an effect on mosquito larvae with a LC50 (24h) of 12.43g/ml. The purified extract affects seeds germination, inhibits the growth of corn and rice seedlings. However it stimulates the growth of axillary buds of young plants of pea. A weak inhibitory activity of the purified extract is observed on the growth of Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Streptococcus and Pseudomonas aeruginosa.

Keywords : Dioscorea esculenta, Dioscoreaceae, alkaloids, symptoms, tissue lesions, LC50,

haemolysis, inhibition germination. Supervisors : Professor Victor JEANNODA Doctor Danielle A. D. RAKOTO-RANOROMALALA

Nom : RANDRIANAMBININTSOA Prnoms : Louis Valentin Titre de mmoire : Etude chimique et toxicologique dextraits alcalodiques de tubercules de

8080

Dioscorea esculenta ( DIOSCOREACEAE)

RESUME Une activit toxique a t mise en vidence dans les tubercules de Dioscorea esculenta ou Mavondro , une Dioscoreace introduite Madagascar. Lextrait brut est prpar laide dune extraction mthanolique au soxhlet 60C pendant 24h partir de la poudre de tubercules. Le procd de purification comportant un fractionnement au chloroforme et un traitement par lactate dthyle permet dobtenir un extrait purifi avec un rendement de 0,173% . Daprs les tests de MAYER, WAGNER et DRAGENDORFF, des alcalodes ont t dtects dans les extraits. Lextrait administr par voie ip la dose de 840mg/kg provoque chez la souris des symptmes dintoxication traduisant une atteinte du systme nerveux. Des lsions tissulaires caractrises essentiellement par des nappes hmorragiques sont observes au niveau de lestomac, du foie, de lintestin, des reins et des poumons. Lextrait purifi provoque la lyse des hmaties de mouton partir de 0,062 mg/ml. Il est toxique pour les animaux sang froid tels que les ttards de grenouille et les poissons. Les CL50 (24h) sont respectivement de 11,51g/ml et 17,47g/ml. Il agit galement sur les larves de moustique avec une CL50 de 12,43g/ml. Chez les vgtaux, lextrait purifi affecte le pouvoir germinatif des graines, inhibe la croissance de jeunes plantules de mas et de riz. Par contre, il stimule la croissance des bourgeons axillaires de jeunes plantes de petit pois. Une faible activit inhibitrice de lextrait purifi a t observe sur la croissance de Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Streptococcus et Pseudomonas aeruginosa.

Mots cls : Dioscorea esculenta, Dioscoreaceae, alcalodes, symptmes, lsions tissulaires,

CL50, hmolyse, inhibition germination. Encadreurs : Professeur Victor JEANNODA Docteur Danielle A. D. RAKOTO - RANOROMALALA