UNIVERSITE DANTANANARIVO FACULTE DES SCIENCES DEPARTEMENT DE BIOCHIMIE FONDAMENTALE ET APPLIQUEE

MEMOIRE DE RECHERCHE POUR LOBTENTION DU DIPLOME DETUDES APPROFONDIES (DEA) DE BIOCHIMIE

(Option : BIOCHIMIE APPLIQUEE AUX SCIENCES MEDICALES) Pr !"nt p#r RANDRIANANDRASANA $#on# Matre s sciences

Etude chimique et toxicologique des extraits toxiques dcorces de tige de Uapaca thouarsii (EUPHOR !"#E"E$
So%t"n% p%&'i(%")"nt '" *+ ,%in *--+ ."/#nt '# 0o))i!!ion ."1#)"n 0o)po! " ." : Prsident Rapporteur : Pro2"!!"%r ANDRIANARISOA B'#n.in" : Pro2"!!"%r $EANNODA Vi0tor

Examinateur! : Pro2"!!"%r RA3ANAMPARAN4 $%'i# Lo%i!"tt" Do0t"%r RAMAMON$ISOA D#ni"'

REMER#!EME%&' Le prsent travail a t ralis : au Laboratoire de Biochimie Applique aux Sciences Mdicales du Dpartement de Biochimie Fondamentale et Applique de la Facult des Sciences de LUniversit dAntananarivo au Laboratoire de Microbiolo!ie de l"nvironnement #LM"$ du %entre &ational de 'echerches sur l"nvironnement au Laboratoire %entral dAnatomie patholo!ique du %(U )oseph 'A*+A(A&,-.A&D'/A&A*AL+&A0 )e voudrais adresser toute ma !ratitude 1 Monsieur le 2ro3esseur *ictor )"A&&+DA %he3 de Dpartement de Biochimie Fondamentale et Applique 'esponsable de la Formation en troisi4me c5cle de Biochimie et encadreur de mon sta!e pour mavoir accueilli dans son Laboratoire mal!r ses lourdes responsabilits0 )exprime ma pro3onde reconnaissance 1 Madame le Docteur Danielle 'A6+7+. 'A&+'+MALALA Ma8tre de con3rences et co.encadreur de mon sta!e pour les conseils et su!!estions quelle ma donns le lon! de ce sta!e et pour son apport prcieux dans la ralisation du prsent manuscrit0 9ue mes vi3s remerciements aillent 1 Madame le 2ro3esseur Blandine A&D'/A&A'/S+A qui me 3ait lhonneur de prsider le :ur5 de ce mmoire0 )e remercie !alement Madame le 2ro3esseur Louisette 'A;A&AM2A'A&- et Monsieur le Docteur Daniel 'AMAM+&)/S+A qui ont aimablement accept dexaminer ce travail mal!r leurs multiples obli!ations0 Mes plus sinc4res remerciements sadressent !alement 1 : Monsieur le Docteur Luciano 'AMA'+S+& %he3 du LM" et Monsieur Aurlien 'ASAM/A'/MA&A&A 'esponsable scienti3ique pour mavoir accueilli 3avorablement dans leur laboratoire pour ltude des proprits anti.microbiennes0

Madame le Docteur %lara 'A)"M/A'/M+"L/S+A aimablement accept dtudier lanatomie patholo!ique0

Directeur du

Laboratoire de %ontr<le des Aliments #Minist4re de la Sant$ qui a

)e tiens aussi 1 remercier toutes les personnes qui mont aid et soutenu pour la ralisation de ce travail en particulier Monsieur le Docteur 'an:ana0 'A&D'/A&A'/*+ Monsieur le Docteur Lovasoa 'A6+7+&D'A;A&A6A de m=me que lquipe du Laboratoire du Dpartement de Biochimie Fondamentale et Applique lquipe du Laboratoire %entral dAnatomie patholo!ique et lquipe du LM"0 "n3in :adresse toute ma reconnaissance 1 tous ceux qui de pr4s ou de loin ont contribu 1 llaboration de ce mmoire0

LISTE DES TABLEAUX Tableau n1 : Caractristiques des extraits obtenus par les diffrentes techniques dextraction. Tableau n2 : Rsultats du criblage phytochi ique ! partir de la poudre dcorces de tige. Tableau n" : #raines utilises lors des tests de toxicit sur les $gtaux. Tableau n % : Co position du ilieu utilis dans les tests h olytiques. e. Tableau n& : 'or es utilises pour la lecture des rsultats dantibiogra Tableau n* : Rsultats de la dter ination de la +,&-. Tableau n. : Totaux cu ulatifs des souris ortes et des souris sur$i$antes. g12g de souris. Tableau n/ : ,sions histopathologiques au ni$eau des organes cibles apr0s ad inistration de lextrait ! la dose de (2. Tableau n1- : Rsultat des tests h olytiques. Tableau n11 : 3ffets de lextrait brut sur les t4tards de grenouille. Tableau n12 : 3ffets de lextrait sur les t4tards de grenouille. Tableau n1" : 3ffets de lextrait brut sur les ale$ins de carpes. Tableau n1% : 3ffets de lextrait sur les ale$ins de carpes. Tableau n1& : 5ourcentage de la ger ination de graines en prsence dextrait brut ! 1 g1 l. Tableau n1( : Taux dinhibition et de sti ulation de la croissance des hypocotyles et picotyles de petit pois et de ri6 au dou6i0 e 7our de lexprience. Tableau n1* : Caractristiques des ger es8tests utiliss. Tableau n1. : 9ensibilit des ger es8tests $is8!8$is de lextrait brut et de lextrait. Tableau n1/ : Rsultats de la dter ination de la C:) sur lextrait brut. Tableau n2- : Rsultats de la dter ination de la C:) sur lextrait.

Tableau n( : )nfluence de la $oie dad inistration sur la toxicit de lextrait.

LISTE DES FI5URES ;igure n1 : Uapaca thouarsii > a< plante enti0re= b< ra eau de tige = c< corce de tige. ;igure n2 : Rpartition gographique de la plante. ;igure n" : 9ch a rcapitulatif des diffrentes tapes de lextraction et de la purification des principes toxiques. ;igure n% : Chro atogra e rcapitulatif ontrant l$olution de lho ognit des

diffrents extraits obtenus lors de lextraction et de purification. ;igure n& : Courbes des totaux cu ulatifs des souris fonction des doses utilises. ;igure n( : ,sions histologiques au ni$eau du 0"r/"#% dues ! lad inistration par $oie i.p. de lextrait 32 ! la dose de (2.>. g12g ?#rossisse ent @ %--<. 1 : parenchy e crbral= 2 : capillaire nor al = " : capillaire dilat. ;igure n* : ,sions histologiques au ni$eau du 2oi" dues ! lad inistration par $oie i.p. de lextrait 32 ! la dose de (2.>. g12g ?#rossisse ent @ %--<. 1 : $eine centro8lobulaire = 2 : hpatocyte = " : capillaire sinusoAde nor al = % : capillaire sinusoAde dilat = & : nappe h orragique. ;igure n. : ,sions histologiques au ni$eau du po%)on dues ! lad inistration de lextrait par $oie i.p. de lextrait 32 ! la dose de (2.>. %--<. ( ) al*ole + , ) tissu inter-al*olaire + . ) capillaire normal + / ) capillaire dilat + 0 ) cellule en1lamme2 ;igure n/ : ,sions histologiques au ni$eau de lint"!tin dues ! lad inistration par $oie i.p. de lextrait 32 ! la dose de (2.>. 1: . ;igure n1- : 5hoto de la plaque de ontrant les rsultats des tests h olytiques sur h aties outon de 3B et de 32 ! diffrentes concentrations. g12g de poids ?#rossisse ent @ %--<. uqueuse = 2 : sreuse = " : capillaire nor al = % : $aisseau congestif. g12g de poids ?#rossisse ent @ ortes et des souris sur$i$antes en

;igure11 : 9ch a rcapitulatif de la ger ination des graines en prsence de diffrentes concentrations en extrait brut.

;igure n12 : 3$olution de lpicotyle de ri6 en fonction de la concentration en extrait brut. ;igure n1" : 3$olution de lhypocotyle de ri6 en fonction de la concentration en extrait brut. ;igure n1% : 3$olution de lpicotyle de petit pois en fonction de la concentration en extrait brut. ;igure n1& : 3$olution de lhypocotyle de petit pois en fonction de la concentration en extrait. ;igure n1( : 3ffets de lextrait ! la dose de 2. Cg sur la le$e de la dor ance apicale des 7eunes plantules de petit pois. ;igure n1* : Rsultats de la dter ination de la C:) de lextrait brut $is8 ! $is de "scherichia coli> Shi!ella sonne?> Listeria ivanovii par la thode des disques.

TABLE DES MATIERES

5ages R3:3RC)3:3'T9DDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDD.. ,)9T39 +39 EBR3F)ET)G'9DDDDDDDDDDDDDDDDDDDDD #,G99E)R3DDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDD.. )'TRG+HCT)G' #3'3RE,3DDDDDDDDDDDDDDDDDDDDD Premire partie ) E&U3E #H!M!4UE55555555555555555522 1.)'TRG+HCT)G'DDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDD... 2 :ET3R)3,9 3T :3TIG+39DDDDDDDDDDDDDDDDDDDD.. 2.1.:ET3R)3,9DDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDD 2.1.1. :ET3R)3, F3#3TE,DDDDDDDDDDDDDDDDDDDDD 2.1.1.1. +escription du genre Uapaca DDDDDDDDDDDDDDDDD. 2.1.1.2. +escription de Uapaca thouarii DDDDDDDDDDDDD.D.D... 2.1.1.". Rpartition gographiqueDDDDDDDDDDDDDDDDDDD. 2.1.1.%. 5rparation du atriel $gtalDDDDDDDDDDDDDD.DD.. 2.1.2. 5RG+H)T9 CI):)JH39DDDDDDDDDDDDDDDDDDDD 2.2. :3TIG+39DDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDD 2.2.1. :3TIG+39 +3@TRECT)G'DDDDDDDDDDDDDDDDD 2.2.1.1. 3xtraction aqueuse ! froidDDDDDDDDDDDDDDDDDD 2.2.1.2. 3xtraction hydroalcooliqueDDDDDDDDDDDDDDD.DD.. 2.2.1.". 3xtraction aqueuse ! chaud et ! refluxDDDDDDDDDDDDD. 2.2.2. :3TIG+39 +3 5HR);)CET)G'DDDDDDDDDDDDDD.D.. 2.2.2.1. +ialyseDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDD.. 2.2.2.1.1. 5rincipeDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDD.DD.. 2.2.2.1.2. :ode opratoireDDDDDDDDDDDDDDDDDD.DD. 2.2.2.1.2.1. 5rparation de la e braneDDDDDDDDDDDDDD 2.2.2.1.2.2. Technique de la dialyseDDDDDDDDDDDDDDDD 2.2.2.2. ;ractionne ent par le n8butanolDDDDDDDDDDDDDDD.. 2.2.2.2.1. 5rincipeDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDD.. 2.2.2.2.2. :ode opratoireDDDDDDDDDDDDDDDDDDDD. 2.2.2.". Traite ent par la chaleurDDDDDDDDDDDDDDDDDD.. 2.2.2.".1. 5rincipeDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDD... % % % % % & & . . . . . . / / / / / / / 11111$iii ix 1

5ages 2.2.2.".2. :ode opratoireDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDD 2.2.2.%. Traite ent ! lthanol "-KDDDDDDDDDDDDDDDDDDD 2.2.2.%.1. 5rincipeDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDD.. 2.2.2.%.2. :ode opratoireDDDDDDDDDDDDDDDDDDD.DD 2.2.2.&. Traite ent ! lactate neutre de plo b.DDDDDDDDDD..D.. 2.2.2.&.1. 5rincipeDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDD 2.2.2.&.2. :ode opratoireDDDDDDDDDDDDDDDDDDD... 2.2.2.(. Traite ent par le charbon actifDDDDDDDDDDDDDDD.. 2.2.2.(.1. 5rincipeDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDD.D... 2.2.2.(.2. :ode opratoireDDDDDDDDDDDDDDDDDD.D.. 2.2.". :3TIG+39 E'E,LT)JH39DDDDDDDDDDDDDDDD.. 2.2.".1. :thode de sparation par chro atographie sur couche inceDDD 2.2.".1.1. 5rincipeDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDD 2.2.".1.2.:ode opratoireDDDDDDDDDDDDDDDDDDDD 2.2.".1.2.1.5rparation de lextraitDDDDDDDDDDDDDDD... 2.2.".1.2.2. +pMt de lchantillonDDDDDDDDDDDDD..DD. 2.2.".1.2.". +$eloppe entDDDDDDDDDDDDDDDDDD.. 2.2.".1.2.%. R$lation du chro atogra eDDDDDDDDDDDD 2.2.".2. :thodes de dtection des fa illes chi iquesDDDDDDDDD. 2.2.".2.1. 5rparation des extraits ! analyserDDDDDDDDDDDD.. 2.2.".2.1.1. 3xtrait aqueuxDDDDDDDDDDDDDDDDDDD 2.2.".2.1.2. 3xtrait hydroalcooliqueDDDDDDDDDDDDDDD. 2.2.".2.1.". 3xtrait acideDDDDDDDDDDDDDDDDDDD.. 2.2.".2.1.%. 3xtrait chlorofor iqueDDDDDDDDDDDDDDD.. 2.2.".2.2. +tection des alcaloAdesDDDDDDDDDDDDDDDD.. 2.2.".2.". +tection des fla$onoAdesDDDDDDDDDDDDD.DD.. 2.2.".2.%. +tection des leucoanthocyanesDDDDDDDDDDDDD. 2.2.".2.&. +tection des tanins et polyphnolsDDDDDDDDDDDD 2.2.".2.&.1. Test au chlorure ferriqueDDDDDDDDDDDDDDD 2.2.".2.&.2. Test ! la glatine saleDDDDDDDDDDDDDDD... 2.2.".2.&.". Test ! la glatine ! 1KDDDDDDDDDDDDDDD... 2.2.".2.(. +tection des anthraquinonesDDDDDDDDDDDDDD.. 11111 11 11 11 11 11 11 12 12 12 12 12 12 12 12 1" 1" 1" 1" 1" 1" 1% 1% 1% 1% 1% 1% 1% 1& 5ages

2.2.".2.*. +tection des saponinesDDDDDDDDDDDDDDDD.. 2.2.".2.*.1. )ndice de ousseDDDDDDDDDDDDDDDDDD outonDDDDDDD... 2.2.".2.*.2. Test h olytique sur h aties de

1& 1& 1& 1& 1& 1( 1( 1( 1( 1( 1( 1* 1* 1* 1. 1. 1. 1. 1/ 1/ 2221 21 21 2"

2.2.".2... +tection des desoxy8osesDDDDDDDDDDDD.DDD. 2.2.".2./. +tection des stroAdes et des triterp0nesDDDDDDDDDD 2.2.".2.1-. +tection des iridoAdesDDDDDDDDDDDDDDDD.. 2.2.%. :3TIG+3 +3 CG'C3'TRET)G'DDDDDDDDDDDDDD... ". R39H,TET9DDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDD. ".1. )9G,3:3'T +39 5R)'C)539 TG@)JH39DDDDDDDDDDDDD ".1.1.3@TRECT)G'9DDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDD. ".1.1.1. 3xtraction aqueuse ! froidDDDDDDDDDDDDDDDDDD ".1.1.2. 3xtraction hydroalcooliqueDDDDDDDDDDDDDDDDD.. ".1.1.". 3xtraction aqueuse ! chaud et ! refluxDDDDDDDDDDDDD. ".1.2. 5HR);)CET)G'DDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDD ".1.2.1.+ialyseDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDD.. ".1.2.2. Traite ent par le n8butanolDDDDDDDDDDDDDDDDD.. ".1.2.". Traite ent par la chaleurDDDDDDDDDDDDDDDDDD. ".1.2.%. Traite ent ! lthanol "-KDDDDDDDDDDDDDDDDD.. ".1.2.&. Traite ent par lactate neutre de plo b..DDDDDDDDDDD.. ".1.2.(. Traite ent par le charbon actifDDDDDDDDDDDDDDDD ".2. E'E,L93 +39 3@TRE)T9 5ER CC:DDDDDDDDDDDDDDD ".". R3'+3:3'T 3' 5R)'C)539 TG@)JH39DDDDDDDDDDDDD. ".%.CERECT3R)9ET)G' CI):)JH3DDDDDDDDDDDDDDDDD. ".%.1.5roprits physico8chi iquesDDDDDDDDDDDDDDDDDD. ".%.2.'ature chi iqueDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDD.. %.+)9CH99)G' 3T CG'C,H9)G'DDDDDDDDDDDDDDDDDDDD D"%1i6)" p#rti" : ETUDE TOXICOLO5IQUE 1. )'TRG+HCT)G'DDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDD. 2. :ET3R)3,9 3T :3TIG+39DDDDDDDDDDDDDDDDDDDD. 2.1. :ET3R)3,9DDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDD ,2(2(2 6E' "%!M"U7 3E7P8R!ME%&"&!O%5555555555552 2.1.1.1. ,es sourisDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDD.

2% 2% 2% 2% 2% 5ages

2.1.1.2. ,es t4tardsDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDD 2.1.1.". ,es lar$es de oustiqueDDDDDDDDDDDDDDDDDDD 2.1.1.%. ,es ale$ins de carpesDDDDDDDDDDDDDDDDDDDD 2.1.2. ,39 5,E'T39 +3@53R):3'TET)G'DDDDDDDDDD..DD. 2.1.".,39 :)CRGGR#E')9:39 HT),)939DDDDDDDDDDDD.D.. 2.1.%. ,39 :),)3H@ +3 CH,THR3 +39 :)CRGGR#E')9:39DDDDD 2.1.%.1. :ilieux disole ent et de purification des ger es8testsDDDDD.D. 2.1.%.2. :ilieux didentification des bactriesDDDDDDDDDDDDD.. 2.1.%.2.1.:ilieu de 9)::G' : citrate de sodiu DDDDDDDDDDD. 2.1.%.2.2.:ilieu annitol8 obilitDDDDDDDDDDDDDDDD. 2.1.%.2.".:ilieu IEN'E8O,)#,3R : lactose8glucose8I29DDDDDDD 2.1.%.2.%.:ilieu lysine8ferDDDDDDDDDDDDDDDDDDD... 2.1.%.2.&.:ilieu ure8indoleDDDDDDDDDDDDDDDDDDD 2.1.%.".:ilieu de :H3,,3R8I)'TG'DDDDDDDDDDDDDDD... 2.1.%.%.+isques dantibiogra eDDDDDDDDDDDDDDDDDD.

2& 2& 2& 2& 2( 2( 2( 2( 2( 2( 2* 2* 2* 2* 2* 2* 2* 2* 2* 2. 2. 2. 2. 2/ 2/ 2/ 2/ """"5ages "-

2.2. :3TIG+39DDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDD ,2,2(2 ME&HO3E' 3E&U3E 3E' E99E&' 3E' PR!%#!PE' &O7!4UE' 'UR 6E' "%!M"U7 " '"%: #H"U355555555555522 2.2.1.1.Tests sur sourisDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDD.. 2.2.1.1.1. )nfluence des $oies dad inistrationDDDDDDDDDDDD. 2.2.1.1.1.1.Foie intrapritonaleDDDDDDDDDDDDDDDDD. 2.2.1.1.1.2. #a$ageDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDD.. 2.2.1.1.2. 3sti ation de la toxicit sur sourisDDDDDDDDDDDDD 2.2.1.1.". +ter ination de la +,&- 2%hDDDDDDDDDDDDDD... 2.2.1.1.%. 3xa en histopathologiqueDDDDDDDDDDDDDDDD. 2.2.1.1.%.1. 5rl0$e ent et fixation des organesDDDDDDDDDDD. 2.2.1.1.%.2. )nclusionDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDD... 2.2.1.1.%.". :icroto ie et tale ent des coupesDDDDDD..DDDD.. 2.2.1.1.%.%. Coloration et obser$ation icroscopique des coupesDDDD.. outonDDDDDDDDD. 2.2.1.2. Tests h olytiques sur des h aties de

2.2.1.2.1. 5rincipeDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDD.D. 2.2.1.2.2. :ode opratoireDDDDDDDDDDDDDDDDDDDD. 2.2.1.2.2.1. 5rparation des globules rougesDDDDDDDDDDD.D.

2.2.1.2.2.2. Test h olytiqueDDDDDDDDDDDDDDDDDD. 2.2.2. :PTIG+39 +PTH+3 +39 3;;3T9 +39 5R)'C)539 TG@)JH39 9HR ,39 E'):EH@ Q 9E'# ;RG)+DDDDDDDDDDDDD. 2.2.2.1.Tests sur les t4tards de grenouilleDDDDDDDDDDDDDDD..D. 2.2.2.1.1. :ode opratoireDDDDDDDDDDDDDDDDDDDD.D.. 2.2.2.1.2. +ter ination de la C,&-DDDDDDDDDDDDDDDDDD 2.2.2.2. Tests sur les ale$ins de carpeDDDDDDDDDDDDDDDD.DD. 2.2.2.". Tests sur les lar$es de oustiqueDDDDDDDDDDDDDDDDD 2.2.".:3TIG+39 +3TH+3 +39 3;;3T9 +39 5R)'C)539 TG@)JH39 9HR ,39 F3#3TEH@DDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDD. 2.2.".1. 3tude des effets sur le pou$oir ger inatif des grainesDDDDDDDD.. 2.2.".2. 3tude de la croissance des plantules de deux grainesDDDDDDDDD 2.2.".". :thode dtude sur la le$e de la do inance apicaleDDDDDDDD 2.2.".".1. 5rincipeDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDD.D 2.2.".".2. :ode opratoireDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDD 2.2.%. :3TIG+39 +3TH+3 +39 3;;3T9 +39 5R)'C)539 TG@)JH39 9HR ,39 :)CRGGR#E')9:39DDDDDDDDDDDDDDDDD 2.2.%.1. )sole ent et purificationDDDDDDDDDDDDDDDDDDDD 2.2.%.2. )dentification et caractrisation des souches puresDDDDDDDDD.... 2.2.%.2.1. :thode de coloration #RE: ou test #RE:DDDDDDDDDD 2.2.%.2.2. Culture sur galerie didentificationDDDDDDDDDDDDDD.. 2.2.%.2.2.1. Culture sur 2.2.%.2.2.2. Culture sur 2.2.%.2.2.". Culture sur 2.2.%.2.2.%. Culture sur 2.2.%.2.2.&. Culture sur 2.2.%.".1. :thode en ilieu 9)::G'9DDDDDDDDDDDDDDD ilieu annitol8 obilit DDDDDDDDDDDD ilieu IEN)'E8O,)#,3R : glucose8lactose8I29DD. ilieu lysine8ferDDDDDDDDDDDDDDD.. ilieu ure8indoleDDDDDDDDDDDDDDD

"-

"1 "1 "1 "2 "2 "2 "" "" "" "% "% "% "% "% "& "& "( "( "( "( "( "( "* "* "* "* "* 5ages ". ".

2.2.%.". 3tude du spectre dacti$it anti8 icrobienneDDDDDDDDDDDD. ilieu liquideDDDDDDDDDDDDDDDDDD 2.2.%.".1.1.5rincipeDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDD 2.2.%.".1.2. :ode opratoireDDDDDDDDDDDDDDDDDDDD. 2.2.%.".2. :thode en ilieu solideDDDDDDDDDDDDDDDDDD.

2.2.%.".2.1. 5rincipeDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDD.. 2.2.%.".2.2. :ode opratoireDDDDDDDDDDDDDDDDDDDD.

2.2.%.".2.2.1.)noculation du

ilieuDDDDDDDDDDDDDDDDD

". ". ". "/ "/ "/ "/ "/ "/ %%1 %( %* %* %* %* %. %. %/ &&&&1 && && && &* &* 5ages &* &* &.

2.2.%.".2.2.2. +pMt dextraitDDDDDDDDDDDDDDDDDDD.. 2.2.%.".2.".+ter ination de la concentration ini ale inhibitrice en ilieu solideDDDDDDDDDDDDDDDDDDD.DD ". R39H,TET9DDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDD..D ".1. 3;;3T9 +39 5R)'C)539 TG@)JH39 9HR ,39 E'):EH@ DDDDDD ".1.1.3;;3T9 9HR ,39 E'):EH@ E 9E'# CIEH+DDDDDDDDD.. ".1.1.1. 3ffets sur les sourisDDDDDDDDDDDDDDDDDDDD.. ".1.1.1.1. 3ffets sur les diffrentes $oies dad inistrationDDDDD.DD... ".1.1.1.2. +escription des sy ptM esDDDDDDDDDDDDDDDD ".1.1.1.". 3$aluation de la +,&-DDDDDDDDDDDDDDDDDD ".1.1.1.%. 3xa en histopathologique des coupes dorganesDDDDDDD. ".1.1.2. 3ffets sur les h aties de outonDDDDDDDDDDDDDDD ".1.2.3;;3T9 +39 5R)'C)539 TG@)JH39 9HR ,39 E'):EH@ E 9E'# ;RG)+DDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDD. ".1.2.1. 3ffets sur les t4tards de grenouilleDDDDDDDDDDDDDDD ".1.2.1.1. 3ffets de lextrait brutDDDDDDDDDDDDDDDDDD ".1.2.1.2. 3ffets de lextraitDDDDDDDDDDDDDDDDDDDD ".1.2.2. 3ffets sur les ale$ins de carpesDDDDDDDDDDDDDD.DD ".1.2.2.1. 3ffets de l3xtrait brutDDDDDDDDDDDDDDDDDD ".1.2.2.2. 3ffets de lextraitDDDDDDDDDDDDDDDDDDDD ".1.2.". 3ffets sur les lar$es de oustiqueDD.DDDDDDDDDDDD... ".2. 3;;3T9 +39 5R)'C)539 TG@)JH39 9HR ,39 F3#3TEH@DDDDD. ".2.1. 3;;3T9 9HR ,3 5GHFG)R #3R:)'ET); +39 #RE)'39DDDDD ".2.2. 3;;3T9 9HR ,E CRG)99E'C3 +3 N3H'39 5,E'TH,39 +3 +3H@ #RE)'39DDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDD ".2.". 3;;3T9 9HR ,E ,3F33 +3 ,E +GR:E'C3 E5)CE,3DDDDD.. ".". 3;;3T9 9HR ,39 :)CRGGR#E')9:39DDDDDDDDDDDDD.. ".".1. )sole ent et caractrisation des ger es8testsDDDDDDDDDDDD ".".2. 3ffets sur la croissance des ".".2.1. :thode en ".".2.2. :thode en icroorganis esDDDDDDDDDDDD ilieu liquideDDDDDDDDDDDDDDDDDD ilieu solideDDDDDDDDDDDDDDDDDD.

".".2.2.1. 9ensibilit des ger es8testsDDDDDDDDDDDDDDDD ".".2.2.2. +ter ination de la C:)DDDDDDDDDDDDDDDDD

%.+)9CH99)G' 3T CG'C,H9)G'DDDDDDDDDDDDDDDDDDD. (CG'C,H9)G' #3'3RE,3 3T 53R953CT)F39DDDDDDDDDDDDD. (" R3;3R3'C39 B)B,)G#RE5I)JH39 DDDDDDDDDDDDDDDDD.. (. E''3@39

LISTE DES ABREVIATIONS

B1E13 : Butanol 1 Ecide actique 1 3au C : +egr Celsius CC: : Chro atographie sur couche C,&- : Concentration ltale ! &-K C:B : Concentration :ini ale Bactricide C:) : Concentration :ini ale )nhibitrice C'R3 : Centre 'ational de Recherche sur l3n$ironne ent +a : +alton +,&- : +ose ltale ! &-K 3B : extrait brut 3+ : eau distille ;G;);E : ;oibe 85irenena a inny ;i2arohana a piharina a inny ;a pandrosoana ny eny E bani$ohitra )5 : intrapritonale )5: : )nstitut 5asteur de :adagascar in : inute p1p : poids par poids p1$ : poids par $olu e Cg : Cl : icrogra icrolitre e ince

HF : lu i0re ultra$iolette $1$ : $olu e par $olu e

5LOSSAIRE Anti&ioti(%" : substance capable de p4cher le d$eloppe ent des B#0t ri0i." : substance qui tue les bactries B#0t rio!t#ti(%" : substance qui arr4te la prolifration des bactries sans les tuer Con7"!tion /#!0%'#ir" : dilatation des $aisseaux sanguins Enop8t#')i" : enfonce ent dans la paupi0re du globe oculaire H )o'9!" : destruction des h aties Hor)on" : substance agissant ! distance du site de synth0se dans lorganis e Ino0%'%) : bactrie ! ense encer Mo''%!0i0i." : substance qui tue les ollusques N#pp" 8 )orr#7i(%" : aug entation de la per abilit cellulaire et diffusion ou rupture des globules rouges Pi'o r"0tion : hrisse ent des poils icroorganis es

INTRODUCTION 5ENERALE

)'TRG+HCT)G' #3'3RE,3
Hn poison est dfini co e tant une substance capable de perturber et 4 e de

suppri er les fonctions $itales dun organis e auquel il a t ad inistr $olontaire ent ou accidentelle ent. Hne toxine est un poison naturel dorigine ani ale> $gtale ou icrobienne. :algr les pr7udices causs par les organis es toxiques> lho tirer profit de leur utilisation. E titre dillustration> on peut citer : les plantes ichtyotoxiques telles que +erris sp ?5E5),,)G'EC3E3<> 3uporbia laro ?3H5IGRB)EC3E3< Barringtonia butonica ?,3CLTI)+EC3E3<> utilises pour p4cher = les plantes ! curare co ,es plantes utilises co plantes e Chondrodendron to entosu ?:3')953R:EC3E3<> a$ec lesquelles> les )ndiens dE rique confectionnent des fl0ches e poisonnes. e poisons dpreu$e> cas de Cerbera $enenifera adagascariensis ?E9C,35)E+EC3E3<> ?E5GCL'EC3E3< et Cryptostegia e a tou7ours su

algaches destines ! rendre la 7ustice.

,es $enins de certaines esp0ces ani ales e ploys pour soigner diffrentes aladies. Einsi par exe ple> le $enin de crotale est utilis contre lpilepsie> celui de crapaud contre les rhu atis es> douleurs aladies de cRur> et celui dabeille pour gurir les usculaires et articulaires.

,es plantes et ani aux toxiques utiliss ! des fins ho icides et aborti$es. E$ec les progr0s des sciences> nota ent ceux de la biologie> la chi ie> la

physiologie> la biochi ie> la toxicologie ou science des toxines a pris un grand essor. +e no breuses olcules toxiques ont t isoles de diffrents organis es ani aux> $gtaux> et ise en $idence. ,a canis e daction de ces toxines a per is de co prendre des phno 0nes e branaire et a apport des renseigne ents capitaux taboliques des organis es $i$ants. E icrobiens et la structure de plusieurs poisons naturels a t connaissance du biologiques i portants tels le transport

sur la biosynth0se des protines et diffrentes $oies

titre dexe ples> on peut citer quelques toxines qui ont t ainsi utilises :

8 protines =

labrine

de

Ebrus

precatorius>

la

ricine

de

Ricinus

co

unis

?CHETR3CE9E9> 1/**< ont ser$i doutils pour llucidation de la biosynth0se des 8 la rotnone issue de +erris sp une 5E5),)G'EC33 et lanti ycine E une toxine dorigine fongique contribuent ! la co prhension de la structure et du fonctionne ent de la chaSne respiratoire ?BRH'3TG'> 1/.*< = 8 la toxine ttanique dorigine bactrienne a contribu ! llucidation du fonctionne ent du syst0 e ner$eux central ?B)TT)')> 1/**< = ,es $gtaux constituent une source i portante de toxines et outre les possibilits dexploitation $oques ci8dessus> lutilisation des toxines $gtales co dica ents est asse6 courante. Einsi> 8 la quinine de Juinquina est utilise pour lutter contre le paludis e = 8 la digitaline> un htroside isol de +igitalis purpurea> fa ille des 9CRG;H,ER)EC339> est utilis co 8 la co e analgsique. algaches sont rputes toxiques ou decine traditionnelle e tonique cardiaque = orphine> un alcaloAde de la plante 5apa$er so niferu > est utilise e

E :adagascar> de no breuses plantes

poss0dent des $ertus thrapeutiques et sont utilises dans la 1/*/<.

?BG)T3EH> 1/** et 1/*/ = +3BREL et coll.> 1/*1 = I3CO3,> 1/-" = 53R'3T et coll.>

+epuis plusieurs annes> le ,aboratoire de Biochi ie ;onda entale et Epplique de lHni$ersit dEntananari$o> a orient ses tra$aux $ers les plantes toxiques de :adagascar au sein de son unit de recherche en Toxicologie. ,es ob7ectifs consistent en la caractrisation chi ique et biologique des principes toxiques isols de plantes end iques algaches. 5lusieurs toxines ont d7! t tudies. E titre dillustration> on peut citer principale ent la cnestine de Cnestis glabra et Cnestis pollyphylla> de la fa ille des CG''EREC339 ?N3E''G+E> 1/.(< = la bolaffinine de Boletus affinis> un cha pignon de la fa ille de BG,3TEC3E3 ?RETE'E:5ERE'L> 1/.*< = la onguine de Croton ongue> une 3H5IGRB)EC33 ?RE,)9G'> 1/.*< = les toxines isoles de Tachiadenus longiflorus une #3'T)E'EC33 ?REOGTG8RE'GRG:E,E,E> 1/./<= lalbodorine isole de Elbi6ia

odorata> une ;EBEC33 ? REN3:)ER):G3,)9GE> 2---< et les principes toxiques du genre Elbi6ia arenicola> une autre ;EBEC33 ?RE'+R)E'ER)FG> 1//(<. Concernant la fa ille des 3H5IGRB)EC339> plusieurs de ses e bres sont rputs

toxiques. +es tra$aux ont t effectus sur le plan chi ique et toxicologique sur des 3uphorbiaces end iques ! :adagascar ou sur des esp0ces trang0res. Einsi> 8 des protines ont t isoles de Croton tigliu proprits ont t tudies. ,es tudes ont ?sur Bio phalaria glabrata<> de +,&- de 1>( g12g. 8 3uphorbia laro est rapporte co 8 Hne glycoprotine> la e plante ichtyotoxique ?+3BREL et coll.> ongue a d7! fait lob7et ?O,GG9 et coll.> 1/.*< et leurs olluscicide

ontr que les graines ont une acti$it

4 e quune acti$it tr0s toxique pour la souris> a$ec une

1/*/<. Hne tude approfondie est actuelle ent en cours pour ce genre. onguine> isole de Croton dune tude chi ique et biologique approfondie ?RE,)9G'> 1/.*<. Einsi ce glycoprotine agirait sur la souris en pro$oquant une intoxication au ni$eau du syst0 e ner$eux. 8 Hne protine isole de Eleurites fordii ?RENEG'ER)FG'L> 1/."< pro$oque des anifestations dues aux atteintes du syst0 e respiratoire et cardio 8 $asculaire. 8 ,tude ralise sur 3uphorbia orthoclada ?RE'+R)E> 1//(< diurtique i portante. :algr ces tudes d7! effectues sur les 3uphorbiaces> beaucoup dautres esp0ces algaches restent encore ! explorer. 5our notre part> nous nous so 3uphorbiace algache connue sous le no par les raisons sui$antes : 8 ! linstar des 3uphorbiaces cites ci8dessus> cette plante end ique de :adagascar pourrait renfer er des principes toxiques = 8 Hapaca thouarsii poss0de des $ertus une proprit anti8 icrobienne = 8 dapr0s les enqu4tes enes aupr0s des $illageois> lcorce de tige de cette e fortifiant. plante serait utilise sous for e de dcoction co dicinales> car elle est utilise pour soigner les coliques abdo inaux ?:inist0re de lagriculture> 1//(<. Cette plante aurait donc es intress ! Hapaca thouarii> une atriel a t dict de U$oapa2aV. ,e choix du ontre que la

plante contient des co poss terp0noAdes> des fla$onoAdes> et quelle est doue dune acti$it

,es tra$aux co prennent deux grandes parties : 8 dune part> ltude chi ique en $ue de purifier et de caractriser les principes toxiques sur le plan physico8chi ique = 8 et dautre part> ltude toxicologique co portant des tests raliss sur des reprsentants des r0gnes ani al> $gtal> et icrobien.

PREMIERE PARTIE ETUDE CHIMIQUE DES PRINCIPES TOXIQUES

; B INTRODUCTION 9uelques "uphorbiaces mal!aches ou tran!4res ont d:1 3ait lob:et dtudes chimiques appro3ondies0 Des principes acti3s de structure varie #protines peptides terp4nes 3lavono?des$ #'AL/S+& @ABC > 'A)A+&A'/*+&- @ABD > S7/'2" et coll0 @ACE > 7"SS/"' et coll0 @ACF$ ont pu ainsi =tre identi3ies0 Mais 1 notre connaissance aucune tude chimique na encore t rapporte dans la littrature concernant le !enre Hapaca thouarsii. Aussi nous nous sommes propos de raliser une tude chimique en utilisant lcorce de ti!e comme matriel dtude0 %et or!ane a t choisi en raison de son utilisation dans la thrapeutique traditionnelle0 Ainsi apr4s avoir vri3i la toxicit sur souris nous avons cherch 1 : . mettre au point un procd dextraction et de puri3ication de principes toxiques > . dterminer leur proprits ph5sico.chimiques > . identi3ier leur nature chimique0 &ous trouverons alors en premier lieu la description des matriels et mthodes utiliss lors de cette tude et en deuxi4me lieu les rsultats obtenus suivis de la discussion et de la conclusion0

* C MATERIELS ET METHODES *:; MATERIELS *:;:;: MATERIEL VE5ETAL *:;:;:; D"!0ription .% 7"nr" Uapaca (LEANDRI< ;=>? @ BOITEAU< ;=A=) Le !enre Hapaca appartient 1 la 3amille des "uphorbiaces re!roupant des arbres et des arbustes soit isols et souvent 1 !randes racines adventives soit !roups en peuplement et dpourvus de racines adventives0 Les 3euilles sont alternes rapproches au sommet le

limbe est entier coriace !labre ordinairement attnu en ptiole court ou asseG lon! les nervures sont pennes0 La 3loraison est br4ve les 3leurs mHles sont !roupes en boule serre et portes par une lon!ue ti!elle0

I0@0@0I0 Description de Hapaca thouarsii %est un arbre de @J 1 IJ m de hauteur prsentant des racines adventives partant de la base du tronc0 Les ramilles peu charnues portent des 3euilles rapproches vers le sommet0 Les ptioles de I 1 K cm sont ren3les et 1 peu pr4s !labres0 Le limbe mesure E 1 B cm de lon!ueur et peut atteindre @K cm > il comporte F 1 C nervures secondaires de chaque cot0 Les 3ruits sont verruqueux sub!lobuleux attei!nant D cm de diam4tre et 1 st5le asseG court0 La classi3ication s5stmatique de cette plante est la suivante : '4!neLLLLLLLL0000L00 : *","7AL "mbranchementLLLL00L0000 : S2"'MA2(-7"S Sous embranchementLLL0L0 : A&,/+S2"'M"S %lasseLLLLLLLLLL00 : D/%+7-L"D+&"S +rdreLLLLLLLLL00L0 : "U2(+'B/AL"S FamilleLLLLLLLLL0000 : "U2(+'B/A%"A" Sous.3amilleLLLLLLLL : 2(-LLA&7(+/DA" ,enreLLLLLLLL0LL0 : Hapaca "sp4ceLLLLLLLLLL : thouarsii &om vernaculaireLLLLLL0 : *oapaMa I0@0@0D0 'partition !o!raphique %ette plante est commune en 3or=t pr4s du littoral :usqu1 FJJ m daltitude dans des Gones 1 climat tempr et humide surtout du cot du versant oriental de Mada!ascar #BA/LL+& @BFB$0

a<

b<

c<

Fi7%r" nD; : U#p#0# t8o%#r!ii< #) P'#nt" "nti6r" @ &) R#)"#% ." ti7" @ 0) 0or0" ." ti7":

Fi7%r" nD* : R p#rtition 7 o7r#p8i(%" ." '# p'#nt":

I0@0@0K0 2rparation du matriel v!tal Les corces de ti!e 3ra8ches de Hapaca thouarsii rcoltes dans la r!ion de MandraMa en mars IJJI sont laves et sches au soleil pendant une semaine puis rduites en poudre au mo5en dun microbro5eur %ULA77/0 La poudre ainsi obtenue conserve 1 la temprature ambiante constitue le matriel dtude0 I0@0I0 2'+DU/7S %(/M/9U"S 7ous les produits chimiques de qualit pour anal5se sont de marque M"'%6 ou 2'+LAB+0 2our la chromato!raphie sur couche mince des plaques de !el de silice de marque M"'%6 EJFIFK tales sur support plastique de dimensions IJ x IJ cm sont utilises0 Lpaisseur de la couche est de J I mm0 I0I0 M"7(+D"S I0I0@0 MN7(+D"S D"O7'A%7/+& I0I0@0@0 "xtraction aqueuse 1 3roid La poudre dcorce est mlan!e 1 leau distille dans le rapport @PDJ #pPv$ #cest.1. dire DJ ml deau distille pour @ ! de poudre$0 Le mlan!e est a!it pendant D h 1 la temprature ambiante et sous a!itation ma!ntique0 La suspension est ensuite laisse macrer pendant deux nuits 1 Q KR%0 Les deux macrations sont intercales dune nouvelle a!itation de D h0 Le macrat obtenu est 3iltr sur quatre paisseurs de !aGe et le 3iltrat est par la suite centri3u! 1 @EJJJx! pendant @J min 1 laide dune centri3u!euse B"%6MA& #)I.I@ rotor )AIJ$0 %ette derni4re sera utilise pour toutes les oprations de centri3u!ation 1 @EJJJx! ultrieures0 Le surna!eant est rcupr et concentr #voir mthode de concentration S I0I0K0 p0@E$0 Une derni4re centri3u!ation permet dliminer le prcipit 3orm au cours de lopration de concentration0

I0I0@0I0 "xtraction h5droalcoolique La poudre est dla5e dans un mlan!e h5droalcoolique CFT #vPv$ dans le rapport @PB #pPv$0 Le tout est a!it pendant D h 1 la temprature ambiante0 La suspension est ensuite laisse macrer une nuit 1 Q KR% puis 3iltre sur quatre paisseurs de !aGe apr4s une a!itation de DJ min0 Le 3iltrat est centri3u! 1 @EJJJx! pendant @J min0 Le surna!eant obtenu est concentr sous pression rduite puis dbarrass du prcipit apparu pendant la concentration par centri3u!ation dans les m=mes conditions que prcdemment0 I0I0@0D0 "xtraction aqueuse 1 chaud et 1 re3lux 6e matriel de dpart est mlang ; leau distille dans le rapport (<(= (p<*$2 6ensem>le est chau11 ; re1lux pendant , h ; ?=@# sous agitation magntique2 6a suspension est ensuite re1roidie puis laisse macrer une nuit ; A /@#2 6e macrat est 1iltr sur quatre paisseurs de gaBe et centri1ug ; (?===xg pendant (= min+ le surnageant ainsi o>tenu est concentr2 I0I0I0 MN7(+D"S D" 2U'/F/%A7/+& I0I0I0@0 Dial5se #AUD/,/"' @AAI> 6AM+U& @AA@ > MA(U;/"' @AAJ$ I0I0I0@0@0 2rincipe La dial5se est une technique base sur laptitude de certaines substances 1 3ranchir les pores calibrs dune membrane 1 permabilit slective appele membrane ou boudin 1 dial5se0 Les substances de poids molculaire suprieur au diam4tre des pores sont retenues 1 lintrieur du boudin tandis que celles de 3aible poids molculaire di33usent librement 1 lextrieur si elles ninter34rent pas avec la membrane0 I0I0I0@0I0 Mode opratoire *:*:*:;:*:;: Pr p#r#tion ." '# )")&r#n" La membrane 1 dial5se utilise se prsente comme un c5lindre plat de D D cm de lar!eur0 "lle est permable aux substances de poids molculaire in3rieur 1 @FJJJ Da0 %ette

membrane est bouillie trois 3ois 1 leau distille pour enlever la couche protectrice de !l5crine puis elle est conserve dans leau distille 1 Q KR%0 "lle est rince 1 leau distille avant son utilisation0 *:*:*:;:*:*: T"08ni(%" ." .i#'9!" Un volume dtermin dextrait 1 traiter est introduit 1 lintrieur du boudin nou 1 une extrmit0 Les bulles dair contenues dans le boudin sont limines avant de nouer lautre bout en laissant su33isamment despace pour les chan!es deau0 Le boudin est alors immer! dans le liquide de contre.dial5se0 Le tout est soumis 1 une l!4re a!itation ma!ntique pour viter la 3ormation de !radient de concentration autour du boudin et laiss 1 la temprature ambiante pendant IKh0 Le liquide de contre.dial5se est chan! 3rquemment pour acclrer la di33usion des substances0 A la 3in de la dial5se la solution 1 lintrieur de la membrane #ladial5sat$ ainsi que celle 1 lextrieur #le dial5sat$ sont concentres par vaporation0 "lles sont centri3u!es 1 DJJJx! pendant @J min pour liminer le prcipit ventuellement 3orm0 I0I0I0I0 Fractionnement par le n.butanol I0I0I0I0@0 2rincipe %est une technique de sparation liquide.liquide base sur la solubilit relative des substances entre deux solvants non miscibles. I0I0I0I0I0 Mode opratoire Lextrait 1 traiter dilu au demi est mlan! volume 1 volume avec du n.butanol dans une ampoule 1 dcanter0 Le mlan!e est a!it ner!iquement puis laiss dcanter :usqu1 la sparation nette de trois phases0 La phase butanolique #suprieure$ et la phase aqueuse #in3rieure$ sont recueillies sparment linter3ace est limine0 La phase aqueuse subit alors I autres extractions au n.butanol0 A la 3in du traitement les 3ractions or!aniques sont rassembles et 3iltres sur du papier 3iltre0 Le butanol des 3ractions or!aniques ainsi que les traces de butanol de la phase aqueuse sont vapors0 Le volume de chaque 3raction est ramen au volume de dpart par vaporation0

I0I0I0D0 7raitement par la chaleur I0I0I0D0@0 2rincipe %est une technique de 3ractionnement base sur la coa!ulation de certaines macromolcules tels les protines et les pol5saccharides sous le33et de la chaleur0 I0I0I0D0I0 Mode opratoire Lextrait 1 traiter est chau33 dans un bain marie 1 AER% pendant @F min0 Le prcipit apparu est limin par centri3u!ation 1 DJJJx! pendant F min 1 laide de la centri3u!euse B'"MS" 7FI qui sera utilise pour toutes les oprations de centri3u!ation 1 DJJJx!0 I0I0I0K 7raitement par lthanol DJT I0I0I0K0@0 2rincipe %ette technique repose sur la prcipitation de certains composs en solution aqueuse sous le33et de la diminution de la polarit du milieu par addition dun solvant or!anique miscible tel que lthanol0 I0I0I0K0I0 Mode opratoire 7rois volumes dthanol absolu sont mlan!s sous a!itation ma!ntique 1 C volumes dextrait #saturation 3inale DJT$0 Le prcipit apparu est limin par centri3u!ation lalcool est vapor et lextrait est concentr0 I0I0I0F0 7raitement par lactate neutre de plomb #A&2$ I0I0I0F0@0 2rincipe Lactate neutre de plomb un sel de mtal lourd permet la prcipitation sous 3orme de sels insolubles de certains composs tels les protines les pol5saccharides et les acides nucliques0

I0I0I0F0I0 Mode opratoire Un volume dtermin dA&2 1 IJT est a:out !outte 1 !outte sous a!itation ma!ntique 1 lextrait0 Le prcipit 3orm est cart par une centri3u!ation 1 DJJJx! pendant F min0 Lexc4s de plomb est prcipit par une solution de phosphate disodique 1 @JT puis limin par une autre centri3u!ation0 Le surna!eant est concentr0 I0I0I0E0 7raitement par le charbon acti3 I0I0I0E0@0 2rincipe Le charbon acti3 est un support chromato!raphique qui adsorbe des nombreuses substances en particulier les composs aromatiques 1 structure c5clique0 %e traitement est couramment utilis pour dcolorer les extraits0 I0I0I0E0I0 Mode opratoire Selon la mthode mise au point par )"A&&+DA #@ABE$ un entonnoir de verre dont le 3ond a t bouch avec de la laine de verre est adapt 1 une 3iole 1 vide0 Le charbon acti3 est tass dans lentonnoir puis humidi3i avec de leau distille0 Lextrait dpos sur le charbon est lu par de leau distille par une l!4re aspiration 1 laide dune pompe 1 vide0 Lopration est suivie de trois rinUa!es 1 leau distille0 Lextrait recueilli dans la 3iole 1 vide est 3iltr sur papier 3iltre pour liminer les 3ines particules de charbon avant de le concentrer par vaporation0

I0I0D0 MN7(+D"S A&AL-7/9U"S I0I0D0@0 %hromato!raphie sur couche mince #%%M$ #'A&D"'A7( @AEK > 6AM+U& @AA@$ I0I0D0@0@0 2rincipe

%ette technique est base sur la sparation des substances en 3onction de leur a33init pour ladsorbant #phase 3ixe ou support de chromato!raphie$ dune part et de leur solubilit dans le s5st4me de solvants #phase mobile$ dautre part0 I0I0D0@0I0 Mode opratoire 2.2.".1.2.1. +pMt de lchantillon Les plaques de !el de silice M"'%6 utilises #c30 Matriels S I0@0I0 p B$ peuvent =tre dcoupes aux dimensions voulues0 Des traits de J C cm espacs de J E cm sont tracs au cra5on 1 @ F cm du bord in3rieur et 1 @ D cm des bords latraux de la plaque0 %haque extrait 1 anal5ser est dpos le lon! dun trait au mo5en dun capillaire de verre0 %haque dp<t est sch immdiatement 1 laide dun schoir 1 main0 2.2.".1.2.2. +$eloppe ent Le s5st4me de solvant qui est le BA" #n.butanol P acide actique P eau$ dans le rapport EJPIJPIJ #pPpPp$ est plac dans une cuve 1 chromato!raphie D"SA,A dont les parois sont pralablement tapisses de papier 3iltre pour saturer latmosph4re intrieure en vapeur de solvants0 La plaque prpare prcdemment est place dans la cuve0 La mi!ration ascendante est arr=te lorsque le 3ront du solvant parvient 1 J F cm du bord suprieur de la plaque qui est alors retire de la cuve puis immdiatement sche avec un schoir 1 main0 2.2.".1.2.". R$lation du chro atogra e

Deux mthodes de rvlation sont utilises : a0 *isualisation 1 la lumi4re ultraviolette #U*$ Les bandes a5ant mi!r peuvent =tre visualises sous lumi4re U* 1 IFK nm et 1 DEE nm0

b0 'vlation par pulvrisation de racti3 Les plaques sont pulvrises 1 laide du racti3 vanilline Pacide sul3urique compos de J F ! de vanilline dans @JJ ml dacide sul3urique concentr0 Les plaques sont sches au mo5en dun schoir 1 main apr4s pulvrisation0 I0I0D0I0 Mthode de dtection de 3amilles chimiques #F+&, et coll0 @ACC$ La dtection des 3amilles chimiques est ralise soit 1 partir de di33rents extraits de poudre dcorce dont la prparation est dcrite ci.dessous soit 1 partir du rsidu dvaporation 1 sec dextrait puri3i repris dans de leau #extrait aqueux$ ou dans de lalcool 1 BJT #extrait h5droalcoolique$ ou dans (%l FT #extrait acide$ ou dans du chloro3orme #extrait chloro3ormique$0 I0I0D0I0@0 2rparation des extraits 2.2.".2.1.1. 3xtrait aqueux Lextrait aqueux se prpare en mlan!eant @! de poudre dcorce avec @J ml deau distille le tout tant ensuite soumis 1 une dcoction de @F min 1 FFR%0 Apr4s re3roidissement la solution est macre une nuit 1 QKR% et 3iltre0 Le 3iltrat constitue lextrait aqueux0 2.2.".2.1.2. 3xtrait hydroalcoolique %ette solution est obtenue en mlan!eant @! de poudre 1 @J ml dune solution h5dralcoolique BJT #BJ ml dthanol et IJ ml deau distille$0 Le mlan!e est macr une nuit 1 QKR% puis 3iltr0 Le 3iltrat constitue lextrait h5droalcoolique0 2.2.".2.1.". 3xtrait acide

Deux !rammes de poudre sont mlan!s avec @J ml dune solution de (%l FT #vPv$ dans un tube 1 essai0 %ette prparation est macre une nuit 1 QKR% et 3iltre > le 3iltrat obtenu constitue lextrait acide0 2.2.".2.1.%. 3xtrait chlorofor ique Un !ramme de poudre est mlan! avec Kml de chloro3orme dans un tube 1 essai0 Le tube est hermtiquement 3erm et laiss macr 1 QKR%0 Lextrait chloro3omique est obtenu par 3iltration de la suspension0

I0I0D0I0I0 Dtection des alcalo?des 7rois tubes 1 essai sont prpars0 J F ml dextrait acide est vers dans chacun deux0 7rois 1 quatre !outtes de racti3 de MA-"' de VA,&"' et de D'A,,"&D+'FF #voir composition en annexe$ 5 sont a:outes respectivement0 Lapparition dans les trois tubes de prcipit qui se dissout apr4s a:out dthanol indique la prsence dalcalo?des dans lextrait0 I0I0D0I0D0 Dtection des 3lavono?des #7est de V/LS7A7"'$ Dans un tube 1 essai contenant @ml dextrait h5droalcoolique on verse @ml de (%l I& et on a:oute I tournures de ma!nsium0 Apr4s a:out de I ml dalcool isoam5lique le vira!e de la coloration de lextrait au rou!e caractrise la prsence de 3lavones au rou!e violac celles des 3lavonones et au pourpre celles des 3lavonols0 I0I0D0I0K0 Dtection des leucoanthoc5anes #7est de BA7".SM/7($ Un millilitre de (%l concentr est vers le lon! de la paroi dun tube 1 essai contenant @ml dextrait h5droalcoolique0 La solution est chau33e dans un bain marie 1 @JJR% pendant DJ min0 Lapparition dune coloration rou!e violet apr4s re3roidissement indique la prsence de leucoanthoc5anes0 I0I0D0I0F0 Dtection des tanins et pol5phnols #("M/&,VA- 6A'%("S- @ABA$

2.2.".2.&.1. Test au chlorure ferrique ?;eCl"< Un tube 1 essai reUoit @ml dextrait aqueux et quelques !outtes de chlorure 3errique dans du mthanol0 Lapparition dun prcipit indique la prsence soit de tanins de t5pe catchol #couleur verte$ soit de tanins de t5pe p5ro!allol #couleur bleue$0 2.2.".2.&.2. Test ! la glatine sale 7rois 1 quatre !outtes de !latine sale #@J ! de &a%l dans @JJ ml de !latine 1 @T$ sont a:outes 1 @ ml dextrait aqueux0 Un test positi3 se traduit par la prsence dun prcipit blanc0 2.2.".2.&.". Test ! la glatine Un millilitre dextrait aqueux est mlan! 1 @ ml de !latine 1 @T0 Lapparition dune 3loculation blanche indique un test positi30 Si les D tests ci.dessus sont tous positi3s lextrait 1 tester contient des tanins0 2ar contre si les tests 1 la !latine sale ou non sont n!ati3s mais le test au chlorure 3errique donne une coloration verte lextrait contient des pol5phnols au lieu des tanins0 I0I0D0I0E0 Dtection des anthraquinones #7est de B+'&7'W,"'$ Un millilitre dextrait aqueux est mlan! 1 F ml de benG4ne0 Le mlan!e est a!it puis laiss dcanter0 Apr4s dcantation la phase or!anique #phase suprieure$ est recueillie et mlan!e 1 @ ml dammoniaque IFT0 Le chan!ement de la coloration en rou!e indique la prsence danthraquinones0 I0I0D0I0C0 Dtection des saponines Deux mthodes sont utilises pour dtecter les saponines0 2.2.".2.*.1. )ndice de ousse

Un millilitre dextrait aqueux est plac dans un tube 1 essai de @ cm de diam4tre0 %e tube est a!it ner!iquement pendant DJ s > la 3ormation de mousse de D cm de hauteur persistant pendant @F min montre la prsence de saponines0 2.2.".2.*.2. Test h olytique sur h aties de outon

%e test permet de con3irmer la prsence de saponines dans lextrait0 "n e33et les saponines l5sent les membranes des hmaties qui lib4rent alors lhmo!lobine0 La mthode est dcrite dans la partie relative 1 ltude toxicolo!ique #S I0I0@0I0p0DJ$0 I0I0D0I0B0 Dtection des dsox5.oses #7est de 6"LL"' . 6/L/A&/$ Dans un tube 1 essai @ ml de solution aqueuse de chlorure 3errique 1 @JT et @ ml dacide actique !lacial sont a:outs 1 @ ml dextrait aqueux0 Deux millilitres dacide sul3urique concentr sont couls le lon! de la paroi du tube inclin 1 KFR0 Lapparition dun anneau pourpre 1 linter3ace montre la prsence de dsox5 . oses0 I0I0D0I0A0 Dtection des stro?des et des triterp4nes #7est de L/"B"'MA&& . BU'%(A'D$ 7rois tubes 1 essai reUoivent chacun @ ml dextrait chloro3ormique0 Dans le premier tube lapparition dune coloration verte apr4s a:out de K 1 F !outtes danh5dride actique indique la prsence de stro?des0 Dans le second tube la 3ormation dun anneau rou!e apr4s a:out de K 1 F !outtes dacide sul3urique concentr suivi dune l!4re a!itation dnote la prsence de triterp4nes0 Dans le troisi4me tube la prsence de strols insaturs est mise en vidence par la 3ormation dun anneau rou!e apr4s addition dacide sul3urique concentr2 I0I0D0I0@J0 Dtection des irido?des Un millilitre de (%l concentr est a:out 1 @ ml dextrait aqueux0 Lapparition dune coloration bleue apr4s DJ min dbullition montre la prsence dirido?des0

I0I0K0 MN7(+D" D" %+&%"&7'A7/+& 7outes les oprations de concentration et dvaporation de solvant sont e33ectues au mo5en dun vaporateur rotati3 de marque ("/D+L2( 1 FJR%0 La pression est rduite 1 laide dune pompe 1 vide0 E B RESULTATS

Des expriences prliminaires ont montr que les principes toxiques sont thermostables0 2ar consquent .toutes les manipulations sont e33ectues 1 la temprature ambiante .toutes les oprations de concentration et dvaporation de solvant se droulent 1 FJR% 1 lvaporateur rotati30 D0@0 /S+L"M"&7 D"S 2'/&%/2"S 7+O/9U"S D0@0@0 "O7'A%7/+& 2lusieurs mthodes ont t testes pour extraire les principes toxiques de la poudre dcorce #voir S I0I0@ p B de Matriels et mthodes$0 La toxicit de chaque extrait brut obtenu est teste sur souris0 D0@0@0@0 "xtraction aqueuse 1 3roid "n partant de KJ ! de poudre mis en suspension dans @IJJ ml deau distille @J ml dextrait brut sont obtenus selon la mthode dcrite au para!raphe I0I0@0@0 #p B0 Matriels et mthodes$0 %et extrait brut de couleur noire est de consistance sirupeuse0 /l a un !oXt amer happant la lan!ue son p( est !al 1 E IF0 /l est toxique sur souris2

D0@0@0I0 "xtraction h5droalcoolique "n appliquant la mthode dcrite au S I0I0@0I0 #p B$ @J ml dextrait brut sont obtenus 1 partir de KJ ! de poudre apr4s rduction de volume et centri3u!ation0 Apr4s la derri4re centri3u!ation lextrait brut obtenu est limpide non visqueux de couleur rou!e pHle0 /l a un !oXt 3ade et son p( est !al 1 E0 %et extrait est toxique sur souris0 D0@0@0D0 "xtraction aqueuse 1 chaud et 1 re3lux Dix !rammes de poudres sont mlan!s 1 @JJ ml deau distille0 Le mlan!e est chau33 1 re3lux pendant deux heures sous a!itation ma!ntique et lextraction se poursuit suivant la mthode dcrite au S I0I0@0D0 #p A$0 Lextrait obtenu apr4s centri3u!ation de volume @J ml est concentr K 3ois0 Lextrait 3inal est visqueux de couleur noir 3onc et a un !oXt amer0 /l sav4re !alement toxique sur souris0 Les rsultats des trois t5pes dextraction sont rsums dans le tableau suivant : T#&'"#% nD; C#r#0t ri!ti(%"! ."! "1tr#it! o&t"n%! p#r '"! .i22 r"nt"! t"08ni(%"! ."1tr#0tion: 75pe dextraction %onsistance %ouleur p( ,oXt 7oxicit #temps de survie$ Aqueuse 1 3roid visqueuse noire E IF amer @F 1 @Bh (5droalcoolique 1 3roid non visqueuse rou!e pHle E 3ade IDh A chaud 1 re3lux visqueuse noire EI amer IJh

La comparaison des di33rents extraits bruts obtenus montre que lextrait brut aqueux 1 3roid est le plus toxique0 Aussi avons . nous adopt la mthode dextraction aqueuse 1 3roid qui est en outre plus conomique pour la suite des oprations0

D0@0I0 2U'/F/%A7/+& 2lusieurs mthodes de puri3ication ont t testes en vue dtablir un procd de puri3ication adquat pour les principes toxiques0 Les mthodes peu per3ormantes nont pas t retenues mais ont permis par contre de caractriser les principes toxiques sur le plan ph5sico.chimique0 /l 3aut remarquer que la puri3ication est bio!uide par des tests de toxicit sur souris #voir mthode S I0I0@0@0 p IC$ et lhomo!nit des extraits obtenus apr4s chaque tape est apprcie par %%M # %30S I0I0D0@0 p @I$0 D0@0I0@0 Dial5se Dix millilitres dextrait brut sont dial5ss contre de leau distille pendant IKh selon la mthode dcrite au S I0I0I0@ #p A$0 Le dial5sat et ladial5sat obtenus sont vapors0 Apr4s centri3u!ation le volume des I solutions est a:ust 1 @J ml0 Ladial5sat sav4re toxique sur souris0 %et extrait limpide de couleur marron 3onc et prsentant un !oXt amer est dnomm "@0 D0@0I0I0 7raitement par le n.butanol Deux millilitres dextrait brut sont traits par le n.butanol selon la mthode dcrite au S I0I0I0I0 #p0@J$0 7rois traitements successi3s suivis chacun dune nuit de dcantation ont t e33ectus0 La phase aqueuse est toxique sur souris0 %ette mthode sest avre per3ormante sur lextrait brut aussi lavons.nous retenue dans le protocole de puri3ication mais en lappliquant 1 "@0 Dix millilitres dextrait "@ sont alors traits de la m=me mani4re que prcdemment0 La phase aqueuse toxique sur souris limpide de couleur rou!e san! et de volume !al 1 @J ml est dnomme extrait "I0 D0@0I0D0 7raitement par la chaleur Lextrait brut #I ml$ et lextrait "I #I ml$ sont chau33s 1 AER% selon la technique dcrite au S I0I0I0D #p @J$0 Les surna!eant obtenus prsentent une activit toxique sur souris seulement aucun prcipit ne sYest 3orm au cours du traitement0 Dautre part lanal5se des

extraits par %%M montre quaucun contaminant nest limin0 %ette technique peu per3ormante na donc pas t retenue dans le protocole0 D0@0I0K0 7raitement par lthanol 1 DJT 7rois millilitres dextrait brut sont traits par C ml dthanol absolu sous a!itation ma!ntique #voir mthode S I0I0I0K0 p @J$0 Aucun prcipit nappara8t0 Bien que le surna!eant soit toxique sur souris nous navons pas introduit cette technique dans le procd de puri3ication car daprs la ##MC elle ne permet pas dcarter des contaminants2 D0@0I0F0 7raitement par lactate neutre de plomb 3eux millilitres dextrait brut sont traits par I ml dA&2 selon la mthode dcrite au S I0I0I0F #p @@$0 Le prcipit abondant apparu est limin par F min de centri3u!ation0 Lexc4s de plomb est prcipit par addition de B ml de solution de phosphate disodique 1 @JT0 Lextrait obtenu concentr est incolore mais il na aucune activit sur souris0 2ar consquent ce traitement na pas t retenu dans la mthode de puri3ication0 D0@0I0E0 7raitement par le charbon acti3 Deux millilitres dextrait brut sont 3iltrs sur charbon acti3 selon la mthode dcrite au S I0I0I0E0 #p @@$0 Le 3iltrat obtenu est limpide et incolore0 'amen au volume de dpart et test il ne prsente aucune activit toxique sur souris0 %ette mthode na donc pas t retenue0 Ainsi sur les six mthodes de puri3ication testes deux mthodes seulement ont t slectionnes pour le protocole de puri3ication0 %e sont : la dial5se suivie du 3ractionnement par le n.butanol0 Lextraction et les di33rentes tapes de la puri3ication sont rsumes sur la 3i!ure nRD :

2+UD'" D"%+'%" D" 7/," KJ ! 3@TRECT)G' EJH3H93 E ;RG)+ "O7'A/7 B'U7 (.DCE mg 3!"6F'E 2%h AD4AL4SAT E7&R"!& E( /->1 g ;RECT)G''3:3'T 5ER ,3 n8BHTE'G, 2(AS" A9U"US" "O7'A/7 "I &2>% g

+ialysat li in

5hase organique li in

Fi7%r" nDE : S08 )# r 0#pit%'#ti2 ."! .i22 r"nt"! t#p"! ." '"1tr#0tion "t ." '# p%ri2i0#tion ."! prin0ip"! to1i(%"!: L"! 08i22r"! r"pr !"nt"nt '" poi.! ."! r !i.%! . /#por#tion F !"0 ."! "1tr#it!: D0I0 A&AL-S" D"S "O7'A/7S 2A' %('+MA7+,'A2(/" SU' %+U%(" M/&%" Lvolution de lhomo!nit des di33rents extraits a t apprcie par chromato!raphie sur couche mince utilisant le BPAP" EJPIJPIJ comme s5st4me de solvants0 Lextrait brut montre @J bandes ma:eures visibles sous U0*0 1 DEE nm0 La dial5se permet dliminer F bandes ma:eures et apr4s le 3ractionnement par le n.butanol de lextrait "@ il ne reste que D bandes ma:eures0 Le nombre de bandes contaminantes limines est donc !al 1 C0 La pulvrisation 1 la vanilline rv4le les m=mes bandes #3i!ure nRK$0

Fi7%r" nD+ : C8ro)#to7r#))" r 0#pit%'#ti2 )ontr#nt ' /o'%tion ." '8o)o7 n it ."! .i22 r"nt! "1tr#it! o&t"n%! 'or! ." '"1tr#0tion "t ." '# p%ri2i0#tion: ; : EB @ * : E1tr#it E; @ E : E1tr#it E* @ + : P8#!" or7#ni(%": D0D0'"&D"M"&7 "& 2'/&%/2"S 7+O/9U"S A partir de KJ ! de poudre dcorce de ti!es le rsidu dvaporation 1 sec de lextrait brut p4se @DA B m! ce qui correspond 1 un rendement dextraction de J DKT0 Le rsidu dvaporation 1 sec de lextrait "I p4se FI K m! ce qui donne un rendement en principes toxiques de J @DT par rapport 1 la poudre de dpart0 D0K0 %A'A%7"'/SA7/+& %(/M/9U" D0K0@0 2roprits ph5sico.chimiques Les techniques dextraction et de puri3ication utilises 5 compris celles qui ne 3ont pas partie du protocole d3initi3 disolement des principes toxiques ont permis dobtenir des in3ormations sur leurs proprits ph5sico.chimiques0 Ainsi . ils sont solubles dans leau distille et dans certains solvants or!aniques polaires tel que lthanol

. ils sont insolubles dans les solvants apolaires comme le n.butanol . ils sont prcipitables par lactate neutre de plomb . ils sont thermostables > les oprations de con!lation et de dcon!lation rptes ne les a33ectent pas . ils sont 3ortement adsorbs sur le charbon acti3 . ils ne traversent pas la membrane 1 dial5se . ils ont un !oXt amer0 D0K0I0 &ature chimique Le cribla!e a t ralis dans un premier temps sur des extraits de poudre dcorce prpars selon la mthode dcrite au S I0I0D0I0 #p0@D$0 Les rsultats sont consi!ns dans le tableau nRI :

T#&'"#% nD* : R !%'t#t! .% 0ri&'#7" p89to08i)i(%" F p#rtir ." '# po%.r" . 0or0"! ." ti7":

Famille chimique

7est MA-"'

+bservations Absence de prcipit Absence de prcipit Absence de prcipit Absence de coloration %oloration rou!e Absence de prcipit Absence de prcipit 2as de coloration 2rsence danneau 2rsence danneau rou!e 2as de coloration verte 2as danneau rou!e 1 linter3ace Absence de coloration bleue (auteur de mousse : @cm

'sultat

. . . . Q . . . Q Q . . . [

Alcalo?des Flavono?des Leucoanthoc5anes

VA,&"' D'A,,"&D+'FF V/LS7A7"' BA7".SM/7( ,latine ,latine sale

7anins et pol5phnols Strols insaturs 7riterp4nes Stro?des Dsox5.oses /ridZides Saponines

Chlorure ferrique SAL6+VS6/ L/"B"'MA&. BU'%(A'D O3,,3R8 O),,)E') /ndice de mousse

W : test positif> 8 : test ngatif> X : faible ent positif Dapr4s ces rsultats les extraits de poudre ra!issent positivement aux tests des leucoanthoc5anes des strols insaturs des triterp4nes et 3aiblement 1 lindice de mousse0 %es tests positi3s ont t rpts sur le rsidu dvaporation 1 sec de lextrait " I #voir mthode S I0I0D0I0 p @D$0 Les m=mes rsultats ont t obtenus0

K . D/S%USS/+& "7 %+&%LUS/+&

LYtude chimique ralise sur Hapaca thouarsii a permis de mettre en vidence une activit toxique dans lcorce de ti!e. Une mthode dextraction aqueuse 1 3roid des principes toxiques a t mise au point0 Un extrait brut sirupeux de couleur noire a t obtenu avec un rendement dextraction de J DKT0 %et extrait brut au !oXt amer est plus toxique sur souris que les extraits bruts obtenus par les autres mthodes dextraction testes0 Un procd simple comprenant une dial5se et un 3ractionnement par le n.butanol a permis dobtenir 1 partir de lextrait brut un extrait partiellement puri3i avec un rendement en principes toxiques de J @DT0 Les autres mthodes de puri3ication bien que moins per3ormantes ont apport des rensei!nements importants sur les proprits ph5sico. chimiques des principes toxiques0 Ainsi ceux.ci ont une a33init pour les solvants polaires comme leau et lthanol0 /ls sont prcipitables par lactate neutre de plomb ce qui suppose la prsence de !roupements acides ou un poids molculaire lev0 /ls sont adsorbs par le charbon acti3 ce qui su!!4re la prsence de no5au aromatique dans leur structure0 Dautre part ils sont thermostables car les oprations de con!lation et de dcon!lation rptes ainsi que le traitement 1 haute temprature ne les a33ectent pas0 Les principes toxiques ne 3ranchissent pas la membrane de dial5se de seuil de @F JJJ Da 1 moins quils ninter34rent avec celle.ci0 Les principes acti3s pourraient =tre des leucoanthoc5anes des strols insaturs ou des triterp4nes0

DEUXIEME PARTIE ETUDE DES PROPRIETES TOXICOLO5IQUES DES EXTRAITS

; B INTRODUCTION Aucune tude de toxicit na encore t rapporte dans la littrature concernant Hapaca thouarsii0 2ourtant la plante est utilise dans la thrapeutique traditionnelle sous 3orme de dcoction de ti!e pour soi!ner les coliques abdominaux #Minist4re de lA!riculture000 @ABC$ ou encore comme 3orti3iant0 Ltude chimique ralise sur Hapaca thouarsii nous a permis dextraire et de puri3ier partiellement 1 partir des corces de ti!e des principes acti3s toxiques sur souris0 Dans la prsente tude toxicolo!ique nous avons dune part appro3ondi les e33ets des principes toxiques sur souris et dautre part et les microor!anismes0 2our les expriences sur les animaux 1 san! 3roid nous avons pu comparer les e33ets de lextrait puri3i "I 1 ceux de lextrait brut0 %heG les v!taux 1 lexception de lexprience sur la leve de dormance apicale les travaux ont t e33ectus avec lextrait brut0 2our des raisons de commodit lextrait puri3i "I sera appel \ extrait ]0 prospect leur action sur dautres reprsentants du r4!ne animal0 &ous avons par la suite tudi leurs e33ets sur les v!taux

* B MATERIELS ET METHODES

I0@0 MA7"'/"LS I0@0@0 L"S A&/MAUO D"O2N'/M"&7A7/+& I0@0@0@0 Les souris Les souris blanches :us usculus utilises pour les di33rents tests proviennent de

lanimalerie du Laboratoire de Biochimie Fondamentale et Applique de la Facult des Sciences dAntananarivo0 "lles sont issues de la souche \ 7A&A.SV/SS ] stabilise depuis plusieurs annes 1 l/nstitut 2asteur de Mada!ascar0 I0@0@0I0 Les t=tards Les t=tards de !renouille 5tychadena des tests0 I0@0@0D0 Les larves de moustique 6es lar*es du moustique C%'"1 (%in(%"2#!0i#t%! au .e stade de d*eloppement ont t rcoltes aux en*irons du campus de lUni*ersit d"ntananari*o2 I0@0@0K0 Les alevins de carpe Les alevins de carpe Cyprius carpio> H!s de K semaines et pesant en mo5enne @ I! proviennent dun centre dleva!e a!r situ 1 MaharidaGa0 %es alevins sont stabiliss une semaine dans laquarium du laboratoire avant d=tre utiliss0 ascareniensis au stade dit \ sans patte ]

proviennent des plans deau du campus de lUniversit dAntanarivo0 /ls sont capturs le :our

I0@0I0 L"S 2LA&7"S D"O2N'/M"&7A7/+& Les !raines utilises lors des tests de toxicit sur les v!taux sont prsents dans le tableau ci.dessous0 T#&'"#% nDE : 5r#in"! %ti'i! "! 'or! ."! t"!t! ." to1i0it !%r '"! / 7 t#%1: Famille FABA%"A" AS7"'A%"A" B'ASS/%A%"A" L/L/A%"A" L/L/A%"A" S+LA&A%"A" %U%U'B/7A%"A" A2/A%"A" ,'AM/&""S &om scienti3ique 5haseolus $ulgaris 5isu sati$u Figna indicata ,actuca sati$a Brassica sp. Elliu cepa Gci u basilicu 9olanu nigru ,ycopersicu esculentu Cucurbita pepo +aucus carotta Gry6a sati$a Tea ays &om vernaculaire (aricot 2etit pois Dolique Laitue 7issam ^hite +i!non Basilic Morelle noire 7omate %our!ette %arotte 'iG Ma?s

%es !raines proviennent de la collection du centre de production du F+F/FA 1 Ambatobe0 I0@0D0 L"S M/%'++',A&/SM"S U7/L/SNS Les microor!anismes utiliss comme !ermes . tests proviennent de la collection du Laboratoire de Microbiolo!ie de lenvironnement #L0M0"0$ du %entre &ational de 'echerche "nvironnementale #%0&0'0"0$ 1 7simbaGaGa0 /ls ont t isols et identi3is par nos soins #voir S I0I0K0 p0DK$0 I0@0K0 L"S M/L/"UO D" %UL7U'" D"S M/%'++',A&/SM"S Les milieux de culture peuvent =tre solides ou liquides0 Leurs compositions sont indiques en annexe ///0

I0@0K0@0 Milieux disolement et de puri3ication des !ermes.tests ,es deux types : 8 le bouillon nutritif : cest un ilieu liquide qui per et la croissance des ilieu solide utilis pour ilieux de culture utiliss pour lisole ent et la purification des ger es sont de

icroorganis es nayant pas dexigence particuli0re. 8 ,a glose ordinaire ou 5late Count Egar ?5.C.E.< : cest un lisole ent des colonies icrobiennes ainsi que leur nu ration.

*:;:+:*: Mi'i"%1 .i."nti2i0#tion ."! &#0t ri"! (LEFEVRE< ;==A) *:;:+:*:; Mi'i"% ." SIMMONS : 0itr#t" ." !o.i%) ,e ilieu de 9)::G'9 est un ilieu solide per ettant lidentification des bactries

utilisant le citrate co

e seule source de carbone et dnergie.

*:;:+:*:* Mi'i"% )#nnito' B )o&i'it Cest un leur obilit. ilieu se i8 ou qui per et la ise en $idence de la fer entation du

annitol et la rduction des nitrates en nitrites par les bactries. )l per et gale ent dtudier

*:;:+:*:E: Mi'i"% HA$NABGLI5LER : '#0to!" C 7'%0o!" B H*S Cest un ilieu solide utilis pour la ise en $idence de lutilisation du glucose et du lactose par les icroorganis es. )l per et aussi de dtecter la production de I29.

*:;:+:*:+: Mi'i"% '9!in" B 2"r Cest un ilieu solide enrichi en lysine. )l per et la ise en $idence de la production

par les bactries de la lysine dcarboxylase ?,+C< et de la lysine dsa inase ?,+E<> ainsi que la for ation de sulfure dhydrog0ne ?I29<. *:;:+:*:>: Mi'i"% %r " B in.o'" Cest un ilieu liquide utilis pour la recherche de lurase> et la tryptophane

dsa inase ?T+E<. ,a production dindole peut 4tre aussi dter ine.

*:;:+:E: Mi'i"% ." MUELLER B HINTON (7 'o!" ." toni0it nor)#'") Ce ilieu solide est utilis pour ltude de la sensibilit des icroorganis es aux

antibiotiques. *:;:+:+: Di!(%"! .#nti&io7r#))" +es disques de ( 12-C a$ant usage. *:*: METHODES *:*:;: MHTHODES DHTUDE DES EFFETS DES PRINCIPES TOXIQUES SUR LES ANIMAUX A SAN5 CHAUD *:*:;:;: T"!t! !%r !o%ri! *:*:;:;:;: In2'%"n0" ."! /oi"! .#.)ini!tr#tion (DUMAS< ;=>E @ TALBOT< ;=?=) ,a $itesse de pntration des principes toxiques che6 un organis e ani al et leurs effets $arient en fonction des $oies dad inistration. +iffrentes $oies dad inistration telles la $oie intrapritonale ?)5<> et la $oie orale ?per os< sont testes. 5our chaque $oie> un $olu e de ->" l est in7ect ! une souris de 2& g> les ani aux sont obser$s pendant 2% h. de dia 0tre sont e ploys. )ls sont striliss ! lautocla$e !

I0I0@0@0@0@0 *oie intra pritonale #/2$ ,a nuque de la souris est aintenue entre le pouce et lindex dune ain. ,autre ain

in7ecte lextrait ! tester dans la partie abdo inale gauche ou droite de la souris> lani al est secou lg0re ent apr0s lin7ection. I0I0@0@0@0I0 *oie orale #!ava!e$ 5our cette $oie> laiguille ! ga$er est introduite ! tra$ers la bouche de lani al 7usqu! lesto ac. ,extrait est alors in7ect lente ent.

*:*:;:;:*: E!ti)#tion ." '# to1i0it !%r !o%ri! ,a toxicit des diffrents extraits est esti e par ad inistration par $oie intrapritonale dun $olu e de ->" l dextrait ! tester ! un lot de deux souris de 2& g chacune. Hne souris in7ecte deau distille sert de t oin ngatif. *:*:;:;:E: D t"r)in#tion ." '# DL>- (*+8) (REED "t MUENCH< ;=E?) ,a +,&- ?2%h< est la dose qui tue &-K des ani aux sou is au test pendant 2%h. 3lle est dter ine selon deux a8,a thodes :

thode de R33+ et :H3'CI ?1/".< Yles ou fe elles ! raison de ->" l par ani al

@ doses en progression go trique de raison dter ine sont in7ectes par $oie intrapritonale chacune ! un lot de & souris donne par la for ule sui$ante : de 2& X 2 g ?@ lots au total<. ,e no bre des ani aux orts est co pt. ,a +,&- ?2%h< est

?->& &< 'o7DL>- I 'o7 B J ?M &< 'o7 R GZ B : dose immdiatement in3rieure 1 la DLFJ N : mortalit provoque par la dose B #exprime en 3raction dcimale$ M : mortalit provoque par la dose immdiatement suprieure 1 la DLFJ R : raison de la pro!ression !omtrique0

b8 ,a

thode graphique ?R33+ et :H3'CI> 1/".< orts et des ani aux

3lle utilise les courbes de totaux cu ulatifs des ani aux de ces deux courbes.

sur$i$ants en fonction des doses utilises. ,a +,&- est la dose correspondant ! lintersection

*:*:;:;:+: E1#)"n 8i!top#t8o'o7i(%" (BO4D< ;=KK @ 5ANTER< $OLLES< ;=K= @ LUSSIER< ;=?= @ VERNE< ;=K-) Cette tude a pour ob7ectif dobser$er icroscopique ent les lsions occasionnes par

les principes toxiques sur les diffrents organes des souris sou ises au test de toxicit> et cela par co paraison a$ec les organes dune souris nor ale. Hn lot de % souris est in7ect dune dose ltale de substances toxiques. +eux dentre elles sont sacrifies peu de te ps a$ant leur dc0s par longation cer$icale. ,es principaux organes co e le cRur> lesto ac> les reins> les pou ons> lintestin> le foie> le cer$eau sont physiologique est traite de la 4 e ani0re. prle$s. Hne souris t oin rece$ant du sru

I0I0@0@0K0@0 2rl4vement et 3ixation des or!anes ,e but de cette anipulation est de aintenir les organes dans ltat oZ ils taient diate ent plongs dans un liquide

a$ant leur prl0$e ent. ,es organes prle$s sont i

fixateur qui est le liquide de BGH)' ?$oir co position en annexe ))< pendant %.h. I0I0@0@0K0I0 /nclusion Chaque organe est dcoup en coupes inces de & dpaisseur ! laide dun oules contenant de la

bistouri. ,es coupes tissulaires sont dshydrates ! lalcool et i prgns de tolu0ne pour faciliter la fixation de la paraffine. 3lles sont incorpores dans des paraffine liquide ! &(C. Ces oules sont placs ! W%C pour solidifier leur contenu.

I0I0@0@0K0D0 Microtomie et talement des coupes +es coupes inces de & C dpaisseur sont ralises ! laide dun icroto e rotatif

,3OE. ,es coupes sont places dans des cassettes T)99H38T3O et

ises ! circuler dans un

circulateur auto atique C)TE+3, 2--- pour enle$er la couche de paraffine. ,a circulation co prend une tape di prgnation par le tolu0ne> un sol$ant qui dissout la paraffine> sui$ie dune dshydratation ! lalcool qui $a per ettre lli ination du tolu0ne et faciliter lhydratation des tissus. Ces oprations sont rptes 7usqu! li ination totale de la paraffine. I0I0@0@0K0K0 %oloration et observation microscopique des coupes ,a coloration seffectue en ilieu aqueux. Hne hydratation est ncessaire apr0s

lli ination de la paraffine par le tolu0ne. ,e tissu incolore obtenu est color : 8 ! lh atoxyline> un colorant basique qui colore les noyaux en bleu ou noir =

8 ! losine> un colorant acide qui teinte le cytoplas e en rose. ,es tissus con7onctifs sont fixs par le safran = 5our les protger> les coupes sont recou$ertes dune goutte de rsine synthtique qui poly rise ! lair. ,es coupes colores sont obser$es au grossisse ent x %-- et sont photographies. *:*:;:*: T"!t 8 )o'9ti(%" !%r ."! 8 )#ti"! ." )o%ton *:*:;:*:;: Prin0ip" (BRUNETON< ;=?A) ,es saponosides se fixent au ni$eau de la lclate ent des cellules. Cet effet est exploit pour saponines dans un extrait ! tester. *:*:;:*:*: Mo." op r#toir" I0I0@0I0I0@0 2rparation des !lobules rou!es ,e sang de in au outon est la$ $olu e ! $olu e a$ec une solution de 5B9 ?5hosphate e brane des globules rouges et ettre en $idence la prsence de icroscope optique ,EBGRH@ au

aug entent la per abilit cellulaire. Cela entraSne la libration de lh oglobine> $oire

buffered saline> co position : $oir annexe<. ,a suspension est ensuite centrifuge pendant & oyen dune centrifugeuse de paillasse. ,e surnageant est li in tandis que le culot 4 e $olu e de 5B9> et centrifug. ,e la$age est effectu trois fois. ,e est repris dans le

culot final est repris dans du 5B9 pour a$oir une suspension dh aties ! 2K ?$olu e de sang par rapport au $olu e total<. I0I0@0I0I0I0 7est hmol5tique Hne plaque de icrotitration en H ou en F est utilise pour le test.

Hn t oin positif oZ on obser$e la lyse totale des h aties est prpar : dans la pre i0re cupule de la 10re range > &- Cl deau distille sont dposs. Hn t oin ngatif pour lequel les h aties sont intactes est gale ent pr$u : dans la 2e cupule de la 10re range> &- Cl de 5B9 sont dposs. ,a concentration de lextrait utilis est ra ene ! 2 laide dune icropipette> &- Cl de cet extrait sont g1 l par dilution au 5B9. E is dans la "e et la %e cupule de la pre i0re

range de la plaque = puis lextrait de la %e cupule est dilu en cascade a$ec &- Cl de 5B9 ?coefficient de dilution : [< le long de la range.

Toutes les cupules re\oi$ent en plus &- Cl de suspension dh aties ! 2K. ,a plaque ainsi prpare est incube pendant 1h ! "*C> puis laisse une nuit ! W%C a$ant la lecture des rsultats. ,exprience> ralise sur 2 ranges de cupules> est rsu e dans le tableau n%. 7ableau nRK : %omposition du milieu utilis dans les tests hmol5tiques0 Con0"ntr#tion "n "1tr#it (L7M)') S%!p"n!ion .8 )#ti"! F *N (L') E1tr#it (L') E#% .i!ti'' "(L') PBS(L') &&7#Q$ &7#.$ &&-- 2&- 12& (2>& "1>2& 1&>( *>. ">/ 1>/ ->/ &&&&&&&&&&&&&- &- &- &&- &- &- &-

7#Q$ : eau distille 7#.$ : solution de 2BS ,h olyse se traduit par la for ation> au fond de la cupule> dune plage de lyse rsultant de la libration de lh oglobine = et labsence dh olyse se reconnaSt par la sdi entation des h aties sous for e de point rouge au fond de la cupule. *:*:*: METHODES DETUDE DES EFFETS DES PRINCIPES TOXIQUES SUR LES ANIMAUX A SAN5 FROID *:*:*:; T"!t! !%r '"! tOt#r.! ." 7r"no%i''" *:*:*:;:;:Mo." op r#toir" ,exprience consiste ! obser$er les effets de lintroduction de principes toxiques dans le ilieu de $ie des t4tards de grenouille U sans patte V. +es lots de x ani aux sont ?$olu e final 2-is en prsence de diffrentes concentrations en toxines l<> en progression go trique de raison dter ine. ,es solutions sont

prpares par dilution en cascade de lextrait ! tester. ,exprience dure 2%h. *:*:*:;:*: D t"r)in#tion ." '# CL>- (*+8) ,a C,&- ?2%h< est la concentration qui tue &-K de la population teste pendant 2%h.

+es dilutions de lextrait ! tester sont ralises de ter e la concentration la plus faible donnant 1--K de ,a dter ination de la C,&- est faite linaire de la relation sui$ante :

ani0re ! ce que le pre ier ter e ortalit et le dernier

de la progression soit la concentration la plus le$e donnant -K de ortalit. par la

thode graphique de rgression

N ." . 06! = 3?log%< oZ % _ concentration en `!Pml ,quation de la droite de rgression linaire est donne par la for ule sui$ante : 4 = A J B 'o7 X 4 : le pourcenta!e de mortalit A : une constante B : coe33icient de r!ression linaire X : concentration en `!Pml *:*:*:*: T"!t! !%r '"! #'"/in! ." 0#rp" ,es tests sur les ale$ins de carpe Ygs de % se aines> sont raliss de la que pour les t4tards de grenouilles ?] 2.2.2.1. p "1<. *:*:*:E: T"!t! !%r '"! '#r/"! ." )o%!ti(%" ,extrait ! tester est introduit dans un rcipient contenant 2-a biante. ,es lar$es sont considres co oribondes quand elles ont du les contient. e ortes quand elles restent i obiles> et l deau de source. 4 e ani0re

Hn lot de 1- lar$es au "e stade y est introduit. ,exprience dure 2%h ! la te prature

al ! se dplacer apr0s une lg0re secousse sur le rcipient qui

*:*:E: MHTHODES DHTUDE DES EFFETS DES PRINCIPES TOXIQUES SUR LES VH5HTAUX *:*:E:;: Et%." ."! "22"t! !%r '" po%/oir 7"r)in#ti2 ."! 7r#in"! Cette tude a t ralise sur les graines de quelques reprsentants des :onocotyldones et des +icotyldones> dont la liste est donne au ] 2.1.2. ?p.2&< 0 ,a sensibilit des graines est apprcie en les ettant ! ger er en prsence dune concentration donne de lextrait ! tester et par co paraison ! des graines non traites ?t oin<. Mo." op r#toir" Hn lot de 1- graines par esp0ce est lextrait ! tudier ! la concentration de 1 is ! ger er sur du coton hydrophile i bib de g1 l. Hn arrosage a$ec lextrait est effectu tous is ! ger er sur du coton

les 2 7ours pour $iter le dess0che ent des graines. Hn lot t oin type de graine. ,exprience dure %.h ! lobscurit et ! "-C.

hydrophile i bib deau de robinet et arros a$ec de leau de robinet> est ralis pour chaque

*:*:E:*: Et%." ." '# 0roi!!#n0" ."! ,"%n"! p'#nt%'"! ." ."%1 7r#in"! Cette tude est ralise sur les graines dun reprsentant des :onocotyldones ?+r5Ga sativa > #ra ines$ et un reprsentant des +icotyldones ?2isum sativum > ;abaces$ ?Cf. rsultats au ] ".2.1. p &-<. ,$olution du d$eloppe ent des picotyles et hypocotyles des 7eunes plantules est sui$ie en prsence de plusieurs concentrations de lextrait ! tester. Mo." op r#toir" Toutes les graines utilises sont pralable ent dsinfectes par i solution dhypochlorite de sodiu ! 1K> pendant 1ersion dans une

in. 5our chaque esp0ce tudie> deux

lots de dix graines sont tre ps 2%h dans lextrait ! tester et . lots dont 1 lot t oin dans leau de robinet. Epr0s le tre page>: 8 un des lots tre ps dans lextrait est i bib dextrait et arros rguli0re ent a$ec le is ! ger er sur du coton hydrophile is ! ger er sur

4 e extrait= lautre lot est

du coton i bib deau de robinet et arros a$ec leau de robinet. 8 les lots qui ont t tre ps dans leau de robinet sont solutions. ,e lot t oin est is ! ger er en prsence 4 es des diffrentes concentrations de lextrait ! tester> et arross respecti$e ent a$ec les is ! ger er dans leau de robinet et arros deau de robinet.

,a ger ination a dabord lieu ! "-C ! lobscurit pendant %.h> puis elle se poursuit ! la te prature a biante pour le reste de lexprience qui dure au total 1% 7ours. ,a longueur des picotyles et celle des hypocotyles sont esures tous les 2 7ours.

*:*:E:E: M t8o." . t%." ."! "22"t! !%r '# '"/ " ." .o)in#n0" #pi0#'" (HELLER "t 0o'':< ;==>) *:*:E:E:;: Prin0ip" ,a croissance des bourgeons axillaires sous leffet des principes toxiques est apprcie par co paraison a$ec les effets de certaines hor ones de croissance telles que la gibbrelline ?#E"<> qui a un effet sti ulateur sur la croissance du bourgeon axillaire et lauxine ?E)E ou acide "8indole actique< qui a un effet inhibiteur. Ces hor ones sont utilises respecti$e ent co e t oins positif et ngatif a$ec une dose identique ! celle de lextrait test. *:*:E:E:*: Mo." op r#toir" +es plantules de petit pois ?2isum sativum< Yges de * ! . 7ours sont utilises. 3lles sont dcapites au8dessus du deuxi0 e bourgeon axillaire. ,extrait ! analyser est dilu pour a$oir une concentration de 2. icroseringue et g1 l. Hn $olu e de 1 Cl de cet extrait est prle$ a$ec une lang dans une boSte de 5tri a$ec de la lanoline ?agent fixateur<. ,e

lange est dpos sur la partie sectionne des plantules. ,exprience est aussi ralise a$ec la gibbrelline et lauxine ! la dose de 2. Cg dans 1 Cl. Hn lot arros a$ec leau distille sert de t oin. ,es plantules ainsi traites sont arroses rguli0re ent a$ec de leau distille = la longueur des bourgeons axillaires est esure tous les 2 7ours pendant 1% 7ours.

*:*:+: MHTHODES DHTUDE DES EFFETS DES PRINCIPES TOXIQUES SUR LES MICROO5ANISMES ,es souches ayant ser$i pour les tests ont dabord t isoles et caractrises par nos soins. *:*:+:;: I!o'")"nt "t p%ri2i0#tion (LARPENT "t 0o'':< ;=A= @ FERRON< ;==+ @ LE MINOR "t 0o'':< ;==E @ LEFEVRE< ;==A @ SCHAECHTER "t 0o'':< ;===) Cette anipulation $ise ! obtenir une souche exe pte de toute conta ination. ,es

souches sont purifies par repiquages successifs sur glose ordinaire.

,a culture de ger e conser$e sur glose incline est relance sur du bouillon nutritif strile> puis incube ! "*C pendant 2%h. ,a turbidit du ger e. Hne ^se de cette suspension est ense ence sur de la glose ordinaire pralable ent coule dans une boite de 5tri par la technique dpuise ent. ,a boSte est gale ent incube ! "*C pendant 2%h. ,es souches se prsentant en colonies unifor es sont considres co e pures. ,apprciation icroscopique de la puret de la souche se fait par la coloration #RE:. *:*:+:* I."nti2i0#tion "t 0#r#0t ri!#tion ."! !o%08"! p%r"! (MARCHAL "t 0o'':<;=?A @ SIN5LETON< ;==+) *:*:+:*:;: M t8o." ." 0o'or#tion 5RAM o% TEST B 5RAM ,a coloration #RE: per et la classification des bactries en deux grands groupes : les bactries U #RE: positif V et les bactries U #RE: ngatif. V Mo." op r#toir" Hne colonie isole ! partir de la culture sur glose ordinaire est prle$e ! laide dune ^se et tale en frottis dans une goutte deau distille dpose sur une la e. ,ense ble est sch par un ou$e ent de $a8et8$ient au8dessus de la fla inute> successi$e ent a$ec : e dun bec bunsen. ,e frottis est par la suite color pendant une ilieu indique la croissance du

8 du $iolet de gentiane phniqu> 8 une solution iodo8iodur ou lugol> puis rinc ensuite ! leau distille. ,a la e est ensuite dcolore a$ec de lalcool /& pendant une nou$eau rince ! leau distille pour li iner lexc0s dalcool. ,e frottis ainsi trait est recolor a$ec de la fuschine de T)3I, pendant "- s. ,exc0s de colorant est li in par rin\age ! leau distille. Epr0s schage de la la e au8dessus de la fla e dun bec bunsen> la prparation est recou$erte dune huile di icroscope ,3)TT ?x1--<. ersion ?huile de c0dre< a$ant d4tre obser$e au inute> puis de

,es bactries U #RE: positif Vgardent la coloration $iolette tandis que les U #RE: ngatif V perdent cette coloration sous leffet de lalcool et sont recolores en rose par la fuschine.

*:*:+:*:*: C%'t%r" !%r 7#'"ri" .i."nti2i0#tion ,a coloration #RE: est suffisante pour identifier les bactries de type U #RE: positif V. Einsi> laspect> la for e> la couleur et le ode de regroupe ent des colonies icrobiennes de type U #RE: constituent leurs crit0res didentification . 5ar contre> une culture sur galerie didentification est ncessaire pour caractriser biochi ique ent les souches ngatif V. 5our chaque culture> le Epr0s lense ence ent> lincubation a lieu ! "*C pendant 2%h. I0I0K0I0I0@0 %ulture sur milieu de S/MM+&S ,ense ence ent de la souche ! tudier se fait le long de la pente du la coloration bleue au bleu8$ert. I0I0K0I0I0I0 %ulture sur milieu mannitol . mobilit ,es bactries sont ense ences par piq_re centrale sur ce de la coloration du rouge au 7aune traduit la fer entation du bactries est apprcie par la turbidit du ilieu. ilieu se i8 ou. ,e $irage annitol. ,a obilit des ilieu du ilieu est coul strile ent en pente dans des tubes ! essai.

fond $ers la surface. ,es bactries sont dites citrate8positi$es quand il se produit un $irage de

I0I0K0I0I0D0 %ulture sur milieu de (A)&A a 6L/,L"' : lactose a !lucose a (IS ,e ilieu utilis> celui de IEN'E8O,)#,3R est ! base de glucose et de lactose. Hne ou$e ent de stries du ilieu. ,a for ation de ilieu. ,utilisation de glucose et celle du lactose se traduisent par le

^se de la suspension de la souche ! tudier est ense ence par un fond $ers la surface du change ent de la coloration rouge au 7aune du culot et de la pente du

sulfure dhydrog0ne ?I29< est indique par lapparition dune coloration noire dans le culot. I0I0K0I0I0K0 %ulture sur milieu l5sine . 3er ,ense ence ent seffectue de la prsence de ,+C bactrienne est 4 e ani0re que pour le ilieu prcdent. ,a ilieu

ise en $idence par lapparition dune coloration $iolette

du culot> celle de la ,+E par une coloration rouge de la pente. ,e noircisse ent du r$0le la production bactrienne de sulfure dhydrog0ne. I0I0K0I0I0F0 %ulture sur milieu ure . indole

,a suspension de la coloration du

icrobienne est

ise directe ent dans le

ilieu ure8indole. ,e $irage

ilieu de lorang au rouge

et en $idence lutilisation de lure par la ilieu ense enc.

bactrie. ,a prsence dindole est indique par lapparition dun anneau rouge en surface apr0s laddition de trois gouttes de ractif de OGFEC9 dans le Ractif de OGFEC9 : 8 8 8 paradi thyla ino8 ben6aldehyde DDDDD...&g alcool a yliqueDDDDDDDDDDD...D.*& l acide chlorhydrique DDDDDDD.DD...D.2& l ise en $idence par la for ation de prcipit ilieu.

,a tryptophane dsa inase ?T+E< est

blanc apr0s a7out de trois gouttes de ractif hyperchlorure de fer dans le

*:*:+:E: Et%." .% !p"0tr" .#0ti/it #ntiB)i0ro&i"nn" (COURVALIN "t 0o'':< ;=?> @ DUVAL "t 0o'':< ;==-) ,a sensibilit des soit en thode de dilution. *:*:+:E:;: M t8o." "n )i'i"% 'i(%i." I0I0K0D0@0@0 2rincipe ,a croissance des bactries en labsence de turbidit du ilieu liquide est inhibe en prsence dune certaine icroorganis es $is8!8$is des agents anti8infectieux est dter ine thode de diffusion sur glose> soit en ilieu liquide par la

ilieu solide par la

concentration en agent anti8bactrien. :acroscopique ent> cette inhibition est indique par ilieu ense enc.

I0I0K0D0@0I0 Mode opratoire ,a culture de la souche $eille de la ->. icrobienne ! tudier est relance dans du bouillon nutritif la lang a$ec / l de bouillon et ->2 l de la

anipulation. 5lusieurs dilutions de lextrait sont ralises. +ans un tube ! essai>

l de chaque solution ! tudier est ,a lecture se fait ! lRil nu : un

suspension bactrienne. ,a suspension est laisse incuber ! "*C pendant 2%h. ilieu trouble indique la croissance des ger es tandis quun ilieu li pide t oigne de linhibition de cette croissance. *:*:+:E:*: M t8o." "n )i'i"% !o'i."

I0I0K0D0I0@0 2rincipe Juand un antibiotique est dpos ! la surface de la glose unifor ent ense ence a$ec la bactrie ! tudier> il y diffuse en crant une 6one circulaire dans laquelle ses concentrations sont dcroissantes du centre $ers la priphrie. Hn halo dinhibition se cre apr0s incubation si lantibiotique est actif sur le ger e8test. ,a dia 0tre de la 6one dinhibition $arie a$ec le degr de sensibilit de la bactrie ! lantibiotique ?+HFE, et coll.> 1//-<. I0I0K0D0I0I0 Mode opratoire I0I0K0D0I0I0@0 /noculation du milieu Hne prculture de 2%h sur bouillon nutritif de la souche ! tudier est ralise. ,e ilieu pralable ent coul dans une boite de 5tri est inond a$ec cette prculture puis laiss incuber pendant 1& in ! "*C pour per ettre li prgnation de la bactrie ! la surface de la est ensuite aspir. glose. ,exc0s dinoculu

I0I0K0D0I0I0I0 Dp<t dextrait ,extrait ! tester ?2- Cl<> de concentration dter ine> est dpos sur des disques dantibiogra e de ( de dia 0tre. ,es disques ainsi traits sont placs ! la surface de la ise ! glose de :H3,,3R 8 I)'TG' pralable ent ense enc ci8dessus. ,a boSte est incuber ! "*C pendant 2%h. ,es rsultats> lus en les nor es ci8dessous : 7ableau nRF : &ormes utilises pour la lecture des rsultats dantibio!ramme0 Di#)6tr" ." 8#'o R !%'t#t! S"n!i&i'it .% 7"r)" esurant le dia 0tre des halos dinhibition> sont expri s selon

x `* x . * x/ . sensible x a /

8
X W WW

)nsensible Esse6 sensible 9ensible Tr0s sensible

I0I0K0D0I0D0 Dtermination de la concentration minimale inhibitrice #%M/$ en milieu solide ,a C:) est la plus faible concentration dextrait pour laquelle il ny a pas de croissance $isible des ger es. +apr0s les nor es ci8dessus> cette $aleur correspond ! un dia 0tre de * lextrait ! tudier. ,es boites sont incubes pendant 2%h ! "*C a$ant la lecture. . 5lusieurs concentrations sont prpares par dilution en cascade de

EB RESULTATS E:;: EFFETS DES PRINCIPES TOXIQUES SUR LES ANIMAUX E:;:;: EFFETS SUR LES ANIMAUX A SAN5 CHAUD E:;:;:;: E22"t! !%r '"! !o%ri! E:;:;:;:;: E22"t! ."! .i22 r"nt"! /oi"! .#.)ini!tr#tion +eux types de $oie dad inistration ont t tests pour lextrait 32 ?ou extrait< selon la thode dcrite au ] 2.2.1.1.1. ?p 2*<. ,es ractions des souris $arient selon la $oie ontrs dans le tableau n(. dad inistration. ,es rsultats sont

7ableau nRE : /n3luence de la voie dadministration sur la toxicit de lextrait0 Voi" .#.)ini!tr#tion Rsultats P :intrapritonale = E:;:;:;:*: D"!0ription ."! !9)ptP)"! ,in7ection de la dose ltale (2.>. sui$ants : Hne ! deux inutes apr0s lin7ection> les souris anifestent des torsions abdo inales inter ittentes. Epr0s 2 heures> les oreilles sont tires $ers la$ant et une dilatation est obser$e au ni$eau des capillaires auriculaires. Fers la sixi0 e heure> une enophtal ie est g12g dextrait pro$oque les sy ptM es cliniques IP :ort au bout de 1&! 1.h 7#/#7" 5as dapparition de sy ptM es

note = les poils sont hrisss> les souris se blottissent dans un coin de la cage et une hypoacti$it eurent au bout de 1& ! 1. h par une difficult respiratoire. E la suite de lin7ection de la dose subltale 2&2>( lin7ection. g12g> les souris

anifestent

otrice. +es diarrhes inter ittentes sont aussi obser$es. ,es souris anifestent les

4 es sy ptM es ! lexception de la difficult respiratoire. 3lles se re ettent %.h apr0s

E:;:;:;:E: E/#'%#tion ." '# DL>,a +,&- est $alue selon la thode dcrite au ] 2.2.1.1.".?p 2.<. g12g. ,es

9ix doses en progression go trique de raison 1>2 ont t testes sur ( lots de & souris fe elles. ,a pre i0re dose est de 2&2>( rsultats sont ontrs dans le tableau sui$ant :

7ableau nR C : 'sultats de la dtermination de la DLFJ0 No)&r" ." . 06! Do!" "n )7MQ7 12h 1"h 1%h 1&h 1(h 1*h 1.h 1/h 2-h 21h 22h 2"h 2%h (2.>. &2">/2 %"(>&( "(">.% 1 "-">2% 2&2>( 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 Tot#' ."! )ort! & % " 2 2 N ." )ort#'it 1-.(%%-

,e tableau ci8dessous ortes.

ontre les totaux cu ulatifs des souris sur$i$antes et des souris

7ableau nRB : 7otaux cumulati3s des souris survivantes et des souris mortes0 Do!" "n )7MQ7 (2.>. &2">/2 %"(>&( "(">.% "-">2% 2&2>( No)&r" ." !%r/i/#nt! 1 2 " " & No)&r" ." )ort! & % " 2 2 Tot#%1 0%)%'#ti2! ." !%r/i/#nt! 1 " ( / 1% Tot#%1 0%)%'#ti2! ."! )ort! 1( 11 * % 2 -

+apr0s la for ule de R33+ et :H3'CI ?$oir ] 2.2.1.1.". p.2.<> la +,&- est gale ! E=?<>K )7MQ7 de souris.

+apr0s la )7MQ7.

thode graphique de la figure n& > cette $aleur est $alue ! E=K<;*

nombre de souris tests

18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 252,6 303,24 363,84 436,56 523,92 628,8

DL50

doses en mg/kg
totaux cumulatifs des morts totaux cumulatifs des vivants

Fi!ure nRF : %ourbes des totaux cumulati3s des souris mortes et des souris survivantes en 3onction des doses utilises0 E:;:;:;:+: E1#)"n 8i!top#t8o'o7i(%" ."! 0o%p"! .or7#n"! ,in7ection de lextrait par $oie )5 de la dose ltale de (2.>. g12g pro$oque latteinte

de quelques organes tels que le lintestin> le cer$eau> les pou ons> et le foie. +es congestions $asculaires pou$ant aller 7usqu! des nappes h orragiques ?cas du foie< sont surtout notes. ,e tableau n/ rsu e ces lsions qui sont ontres sur les figures n( ! n/.

7ableau nRA : Lsions histopatholo!iques au niveau des or!anes cibles apr4s administration de lextrait 1 la dose de EIB B m!PM! de souris OR5ANES Cer$eau 5ou ons ;oie )ntestin LESIONS HISTOPATHOLO5IQUES Capillaire dilat

Capillaire al$olaire dilat

Capillaire sinusoAde dilat 'appe h orragique $aisseaux congestifs

C"r/"#% non tr#it

C"r/"#% tr#it

Fi!ure nRE : Lsions histolo!iques au niveau du cer*eau dues 1 ladministration par voie i0p0 de lextrait "I 1 la dose de EIB B m!PM! #,rossissement O KJJ$0 @ : parench5me crbral> I : capillaire normal > D : capillaire dilat0

Foi" ;oie non non trait tr#it

E *

Foi" tr#it

+ >

Fi!ure nRC : Lsions histolo!iques au niveau du 1oie dues 1 ladministration par voie i0p0 de lextrait "I 1 la dose de EIB B m!PM! #,rossissement O KJJ$0 @ : veine centro.lobulaire > I : hpatoc5te > D : capillaire sinuso?de normal > K : capillaire sinuso?de dilat > F : nappe hmorra!ique0

CRur trait 5ou on non trait

E * " 1 ; 2

Po%)on tr#it

&

>

Fi!ure nRB : Lsions histolo!iques au niveau du poumon dues 1 ladministration de lextrait par voie i0p0 de lextrait "I 1 la dose de EIB B m!PM! de poids #,rossissement O KJJ$0 @ : alvole > I : tissu inter.alvolaire > D : capillaire normal > K : capillaire dilat > F : cellule en3lamme0

Int"!tin non tr#it

*

2 E ; 1

Rein trait

Int"!tin tr#it

Fi!ure nRA : Lsions histolo!iques au niveau de lintestin dues 1 ladministration par voie i0p0 de lextrait "I 1 la dose de EIB B m!PM! de poids #,rossissement O KJJ$0 @ : muqueuse > I : sreuse > D : capillaire normal > K : vaisseau con!esti30 0

E:;:;:*: E22"t! !%r '"! 8 )#ti"! ." )o%ton ,extrait brut et lextrait ont t utiliss pour le test h olytique sur les h aties de outon selon la thode dcrite au paragraphe 2.2.1.2. ?p "-<. +apr0s les rsultats qui sont consigns dans le tableau n1-> l3xtrait Brut et lextrait pro$oquent la lyse des h aties de outon. Ces rsultats sont sch atiss ! la figure n1-. 7ableau nR@J : 'sultats des tests hmol5tiques0 Con0"ntr#tion "n L7M)' 3xtrait brut 3xtrait 7#.$ 7#Q$ &-W W 2&W W 12& W W (2>& "1>2& 1&>( *>. ">/ 1>/ X 8 ->/ 8 8

W W W X X 8 8 8 5B9 W sang de outon 3au distille W sang de outon

Q : (mol5se totale [ : (mol5se partielle . : Absence dhmol5se 7#.$ : 7moin n!ati3 7#Q$ : 7moin positi3 Hne h olyse totale est obser$e ! partir de la concentration 1&>( Cg1 l pour l3B et ! partir de 12& Cg1 l pour lextrait. Hne h olyse partielle est note entre 1>/ Cg1 l et ->/ Cg1 l pour l3B et pour (2>& Cg1 l et "1>2& Cg1 l pour lextrait. ,a figure n11 rsultats. Cg1 l ->/
1>/ ">/ *>. 1&>( "1>2& (2>& 12& 2&&-TW T

ontre ces

EB

E*

Fi!ure nR@J : 2hoto de la plaque montrant les rsultats des tests hmol5tiques sur hmaties de mouton de "B et de "I 1 di33rentes concentrations0

E:;:*: EFFETS DES PRINCIPES TOXIQUES SUR LES ANIMAUX A SAN5 FROID E:;:*:;: E22"t! !%r '"! tOt#r.! ." 7r"no%i''" ,es t4tards de grenouille ont t tests a$ec lextrait brut et lextrait ! diffrentes concentrations> selon la thode donne au ] 2.2.2.1. ?p "1<. E:;:*:;:;: E22"t! ." '"1tr#it &r%t Juatre lots de 1- t4tards ont t tests a$ec % concentrations en progression go trique de lextrait brut. ,e 1er ter e de la progression est de 2( Cg1 l et la raison est de 1>2. ,es t4tards sont sensibles ! laction de l3B. ,a concentration apr0s un dlai de 2%h. ,es rsultats sont prsents dans le tableau n11 : 7ableau nR@@ : "33ets de lextrait brut sur les t=tards de !renouille0 Con0"ntr#tion "n EB (C) (L7M)') %. %1 "" 2* No)&r" ." tOt#r.! %ti'i! ! 1111No)&r" ." )ort! 1. 1 No)&r" ." !%r/i/#nt! 2 / 1ini ale qui tue 1--K des ani aux est de %. Cg1 l. E la concentration de 2( Cg1 l> tous les t4tards tests sur$i$ent

'o7C 1>(. 1>(1>&1 1>%1

N ." . 06! 1-.1-

9elon la

thode de rgression linaire> la droite a lquation sui$ante :

y b %1->2(x W (%2>"*
oZ x : lo!arithme de la concentration en extrait brut y : T de mortalit E$ec un coefficient de corrlation de ->.*> log C,&- b 1>"&> doZ la $aleur de la C,&est gale ! E> L7M)'. E:;:*:;:*: E22"t! ." '"1tr#it

9ept lots de 1- t4tards ont t tests a$ec * concentrations de lextrait en progression go trique de raison 1>1&. ,a 10re concentration est de 1* Cg1 l. ,es t4tards sont gale ent sensibles ! lextrait. ,a concentration des ani aux tests est $alue ! %->" Cg1 l et celle pour laquelle la esti e ! 1* Cg1 l. 7ableau nR@I : "33ets de lextrait sur les t=tards de !renouille0 Con0"ntr#tion "n "1tr#it (C) (L7M)') %->" "& "->" 2( 2" 21* No)&r" ." tOt#r.! %ti'i! ! 1111111No)&r" ." !%r/i/#nt! 1 " " % / 1No)&r" ." )ort! 1/ * * ( 1 1 N ." . 06! 1-/**(1ini ale tuant 1--K ortalit est de -K est

'o7C 1>( 1>&% 1>%. 1>%1 1>"( 1>"1>2"

,quation de la droite de rgression linaire est :

y b2*1>"/x W 21">"/
oZ y : T de dc4s x : lo!arithme de la concentration en extrait E$ec un coefficient de corrlation gal ! ->/-> log C,&- b 1>"/*> doZ la C,&- est $alue ! *> L7M)'. E:;:*:*: E22"t! !%r '"! #'"/in! ." 0#rp" ,es ale$ins ont t tests selon la E:;:*:*:;:E22"t! ." '"1tr#it &r%t 9ix concentrations ?"">2 = 1(>& = .>2 = %>1 = 2 = 1< expri es en Cg1 l> ont t adoptes pour lextrait brut ?la raison de la progression go trique est den$iron 2<. Hn lot de ( ale$ins est utilis pour chaque concentration. ,es ale$ins de carpe sont sensibles ! lextrait brut. ,es rsultats sont prsents dans le tableau n1". thode dcrite au ] 2.2.2.1. ?p "1<.

7ableau nR@D : "33ets de lextrait brut sur les alevins de carpe0 Con0"ntr#tio n "n EB (C) (L7M)') "">1 1(>& .>2 %>1 2>1 'o7C 1>&1 1>21 ->/1 ->(1 ->"No)&r" ."! #'"/in! %ti'i! ! ( ( ( ( ( ( No)&r" ." !%r/i/#nt! ( ( No)&r" ." )ort! ( ( ( ( N ." . 06! 1-1-1-1--

,a concentration ! %>1 Cg1 l. Hne

ini ale en extrait brut pro$oquant une

ortalit de 1--K est gale

ortalit de -K a t obser$e en8de\! de la concentration 2 Cg1 l. Eucun

taux inter diaire na t trou$> les effets de lextrait brut sur les ale$ins de carpe rpondant ! la loi du tout ou rien. 5ar consquent> la $aleur de la C,&- na pas pu 4tre dter ine. E:;:*:*:*:E22"t! ." '"1tr#it Iuit concentrations de lextrait ?%>1 = ">%1 = 2>.% = 2>"* = 1>/* = 1>1( = 1>1" = 1>11< expri es en Cg1 l> ont t testes ?la raison de la progression go trique est de 1>2<. Hn lot de ( ale$ins a t utilis pour chaque concentration. ,es rsultats obtenus> consigns dans le tableau sui$ant> carpe sont gale ent sensibles ! lextrait. 7ableau nR@K : "33ets de lextrait sur les alevins de carpe0 Con0"ntr#tion "n "1tr#it (C) (L7M)') No)&r" ."! No)&r" ." No)&r" ." #'"/in! N ." . 06! !%r/i/#nt! )ort! %ti'i! ! %>1 ->(1 ( ( 1-">%1 ->&" ( ( 1-2>.% ->%& ( ( 1-2>"* ->"* ( ( 1-1>/* ->2/ ( ( 1>1( ->-( ( ( 1>1" ->-& ( ( 1>11 ->-% ( ( +apr0s ces rsultats> il na pas t possible de dter iner la $aleur de la C,&- car les 'o7C ontrent que les ale$ins de

effets de lextrait sur les ale$ins de carpe sui$ent gale ent la loi du tout ou rien.

E:;:*:E:E22"t! !%r '"! '#r/"! ." )o%!ti(%" ,extrait brut ?2 l< est introduit dans un rcipient contenant 2-?concentration finale : 1>"./ ,exprience dure 2%h ! la te prature a biante ?$oir ,es rsultats ont l deau de source

g1 l. Hn lot de 1- lar$es au "e stade y est introduit. thode au ] 2.2.2.". p "2<.

ontr que les lar$es de culex sont insensibles ! l3B ! cette ilieu opaque

concentration. 5our des concentrations plus le$es> lexprience na pas pu 4tre effectue parce que la forte coloration de lextrait rendait le et le co ptage des lar$es difficile. E:*: EFFETS DES PRINCIPES TOXIQUES SUR LES VH5HTAUX Trois expriences ont t ralises sur les $gtaux: la pre i0re consistait ! dter iner leffet de lextrait brut sur le pou$oir ger inatif de quelques graines de :onocotyldones et de +icotyldones = la deuxi0 e a$ait pour ob7ectif d$aluer la croissance des 7eunes plantules dun reprsentant de chacune des classes prcdentes sous laction de lextrait brut et la troisi0 e co portait lobser$ation de la le$e de dor ance apicale en prsence de lextrait. E:*:;: EFFETS SUR LE POUVOIR 5ERMINATIF DES DIVERSES 5RAINES ,es graines dont la liste est prsente ! la page 2& ?:atriels et testes a$ec l3B ! 1 leau de robinet. ,es rsultats de cette tude de la sensibilit de quelques graines ! laction de l3B ! 1 g1 l sont prsents dans le tableau n1&. thodes< ont t

g1 l ?$oir ] 2.2.". p ""<> dose qui a t dter ine par des expriences

prli inaires. ,eur ger ination a t co pare a$ec celle des graines t oin arroses a$ec

7ableau nR @F : 2ourcenta!e de !ermination des !raines en prsence d"B 1 @m!Pm0

F#)i''"

No) !0i"nti2i(%" P8#!"o'% ! /%'7#ri!

No) 0o))%n Iaricot 5etit pois +olique ,aitue :orelle noire To ate Courgette Carotte Basilic Tissa chite

N ." 7"r)in#tion &1-1-1&.1-1-aAs nest pas

;EBEC3E3

Pi!%) !#ti/%) Gigna indicata

Lactuca sativa So'#n%) ni7r%) 9G,E'EC3E3 L90op"r! i0%) "!0%'"nt%) C%0%r&it CHCHRB)TEC3E3 # p"po E5)EC3E3 3aucus carotta ,E:)EC3E3 BRE99)CEC3E3 ,),)EC3E3 #RE:)'339 !p: A''i%) 0"p# +r5Ga sativa ;ea ma5s Ocimum >asilicum Br#!!i0#

E9T3REC3E3

oignon Ri6 :aAs

,e pou$oir ger inatif des graines de petit pois> de dolique> de ri6> et de affect par l3B ! 1

g1 l. 5ar contre> aucune ger ination nest obser$e ni pour la laitue> ni

pour la to ate> ni pour la courgette> ni pour le basilic. 5our les autres graines> la ger ination est inhibe ! un taux $ariable> allant de 2-K ?.-K de ger ination< pour loignon> ! /-K ?1-K de ger ination< pour la orelle noire.

E:*:*:EFFETS SUR LA CROISSANCE DES $EUNES PLANTULES DE DEUX 5RAINES ,es graines de ri6 et de petit pois ne sont pas affectes par lextrait brut ! 1 Eussi> des concentrations plus le$es en extrait brut ont t testes pour de lextrait brut sur ces graines. ,a figure n11 rsu e lense ble des expriences. g1 l.

ieux tudier leffet

7r#in"! tr")p "! .#n! 'EB F;E?<= )7M)' p"n.#nt *+8

7r#in"! tr")p "! .#n! '"#% ." ro&in"t Croi!!#n0" "n pr !"n0" ." 5r#in"! )i!" F 7"r)"r "n pr !"n0" .EB
5r#in"! )i!" F 7"r)"r "n pr !"n0" .EB F +<E+ )7M)'

#rro!#7" #/"0 'EB F 5r#in"! )i!" F 7"r)"r "n pr !"n0" .EB

Arro!#7" #/"0 ." '"#% 5r#in"! )i!" F 7"r)"r "n pr !"n0" .EB

5r#in"! )i!" F 7"r)"r "n pr !"n0" .EB F *<;A )7M)' Fi!ure nR@@ : Schma rcapitulati3 de la !ermination des !raines en prsence de di33rentes concentrations en extrait brut0 5our les graines de ri6 et de petit pois tre pes dans lextrait brut ! 1".>/ aucune des graines des lots is ! ger er en prsence du les graines de petit pois arroses a$ec de leau de robinet ont ger ! partir du (0 e 7our. 3n ce qui concerne les graines tre pes pendant 2%h ! leau distille et ont t esures et reportes sur les figures n12 ! n1&. ises ! ger er dans diffrentes concentrations dextrait brut> les longueurs de lepicotyle et de lhypocotyle g1 l>

4 e extrait na ger . 5ar contre>

e picotyle de riz 3,5 longueur d'epicotyle en cm 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 2 4 17mg/ml 2,17mg/ml 0,27mg/ml 6 8 8,16mg/ml tmoin 10 12 14 nom bre de jours 4,34mg/ml 0,54mg/ml

Fi!ure nR@I : "volution de lpicot5le de riG en 3onction de la concentration en extrait brut0

1,6 longueur d'hypocotyle en cm 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0 17,36mg/ml tmoin 2 4 6 8 10 12 14 nom bre de jours 4,34mg/ml 2,17mg/ml 0,27mg/ml hypocotyle de riz

8,161mg/ml 0,542mg/ml

Fi!ure nR@D : "volution de lh5pocot5le de riG en 3onction de la concentration en extrait Brut0 Che6 le ri6> leffet de lextrait brut sur la croissance des 7eunes plantules $arie selon la concentration en 3B. 5our lpicotyle> une inhibition est obser$e pour les concentrations : 1*>"( .>1( g1 l et %>". g1 l.. 5our les concentrations infrieures ou gales ! 2>1* g1 l = g1 l> il ny

a pas deffet8dose net et lacti$it de lextrait brut se traduit soit par une inhibition soit par une sti ulation de la croissance de lorgane.

5our lhypocotyle> la croissance est nette ent inhibe pour des concentrations suprieures ou gales ! 2>1* g1 l et ->&% g1 l> ais elle est sti ule a$ec les concentrations : ->2* g1 l. ,es taux dinhibition et de sti ulation de lhypocotyle et lpicotyle
longueur de l'picotyle en cm

sont rsu s dans le tableau n1(.

picotyle de pe tit pois
16 14 12 10 8 6 4 2 0 0 2 4 6

nombre de s jours
8,16m g/m l 2,17m g/m l 0,54m g/m l

10

12

14

17,36m g/m l 4,34m g/m l tm oin 0,27m g/m l

Fi!ure nR@K : "volution de lepicot5le de petit pois en 3onction de la concentration en extrait brut
longueur de l'hypocotyle en cm

hypocotyle de petit pois

9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 0 2
17 36mg/ml 0 54mg/ml

6
8 16mg/ml 0 27mg/ml

10 12 14 nombre de jours
4 34mg/ml tmoin 2 17mg/ml

Fi!ure nR@F : "volution de lh5pocot5le de petit pois en 3onction de la concentration en brut extrait0 Che6 le petit pois> une inhibition de la croissance a t obser$e au ni$eau de lpicotyle ! partir de la concentration 2>1* concentrations ->2* g1 l et ->&% g1 l. g1 l. 5our lhypocotyle> g1 l et une sti ulation de celle8ci pour les

algr labsence deffet8dose> la croissance de cet organe est

inhibe ! partir du .0 e 7our pour les concentrations en 3B suprieures ou gales ! ->&%

9eule la concentration ->2*

g1 l pro$oque une nette sti ulation de la croissance de

lhypocotyle. ,es taux dinhibition et de sti ulation des hypocotyles et des picotyles de petit pois sont gale ent prsents dans le tableau n1(. 7ableau nR@E : 7aux dinhibition et de stimulation de la croissance des h5pocot5les et picot5les de petit pois et de riG au douGi4me :our de lexprience0 N .in8i&ition Do!" P"tit poi! RiR E H E H 1*>"( &&>& ((>(( (&>*. &(>&2 .>1( &((>(( 2">(. %">%* 2>1* &&>& ((>(( 2.>/ "%>%* ->&% 1(>(( 2">(. ->2* E :picot5le = I : h5pocot5le N ." !ti)%'#tion P"tit poi! RiR E H E H

111 211>11

1%%>%%

1&2>1* 1&2>1*

E:*:E: EFFETS SUR LA LEVEE DE LA DOMINANCE APICALE +es plantules de petit pois Yges de * ! . 7ours ont t utilises pour cette tude. ,utilisation dune dose dextrait de 2.Cg dans un $olu e de 1Cl dune part> et de la quantit de gibbrelline et dauxine dans le
25 longueur du bourgeon axillaire en cm 20 15 10 5 0 0 4 6 8 10 12 14 nom bre de jours

4 e

4 e $olu e donne les rsultats sui$ants :

extrait 24!g gi"""relline

auxine eau dis tille

Fi!ure nR@E : "33ets de lextrait 1 la dose de IB `! sur la leve de la dormance apicale des plantules de petit pois0 +apr0s ces rsultats> lextrait a un effet sti ulateur se rapprochant de celui de la gibbrelline> sur la croissance du bourgeon axillaire.

E:E: EFFETS SUR LES MICROOR5ANISMES E:E:;: ISOLEMENT ET CARACTHRISATION DES 5ERMESBTESTS ,es ger es isols et identifis en utilisant les thodes dcrites au ] 2.2.%.1.?p "&<

sont prsents dans le tableau 1* a$ec leurs caractristiques biochi iques.

7ableau nR@C : %aractristique des !ermes.test utiliss0 Ma mo &it red !lu Lac (IS !aG LDA LD% cit Ur A A A A /n 7DA ,ram A A A A A A A A - Garia>le A - Garia>le A

&om scienti3ique P#!t"%r"''# )%'to0i.# S"rr#ti# )#r0"!0"n! S#')on"''# t9p8i S8i7"''# !onn"S A'0#'"!0"n! .i!p#r E!08"ri08i# 0o'i St#89'o0o00%! #%r"%! Str"pto0o00%! D Li!t"ri# !""'i7"ri Li!t"ri# T"'!8i)"ri Li!t"ri# i/#no/ii 5#r.n"r"''# /#7in#'i! R8o.o0o00%! N"i!!"ri# 7onorr8o"#"
# # # #

A A A A A A -

A A A A A A A A A A A

A A A A A A A A A -

A
A A A A A A -

A A -

A -

A A A A -

A A A A A -

A A A A A A -

C#n.i.# #'&i0#n!#6Champignon

:a : )#nnito'=

o: )o&i'it = nit red: nitr#t" r .%0t#!" = glu : 7'%0o!" = lact :

'#0to!"= I*9 : !%'2%r" .89.ro76n" = ,+E : '9!in" . !#)in#!" = ,+C : '9!in" . 0#r&o19'#!" = cit : 0itr#t" r .%0t#!" = ur : %r " = i : in.o'" = T+E : tr9ptop8#n" . !#)in#!". B : &#0t ri"! ." 2or)" &#0i''#ir" = C : &#0t ri"! ." 2or)" 0o00i(%":

E:E:*: EFFETS SUR LA CROISSANCE DES MICROOR5ANISMES E:E:*:;: M t8o." "n )i'i"% 'i(%i." ,utilisation de cette thode na pas abouti ! de rsultats nets car les principes actifs

ont prcipit au contact du bouillon nutritif. 5ar consquent> elle a t re place par la thode de diffusion sur glose. E:E:*:*: M t8o." "n )i'i"% !o'i." E:E:*:*:;: S"n!i&i'it ."! 7"r)"!Bt"!t! ,es icroorganis es isols ci8dessus ont ser$i de ger es8tests = leur sensibilit ! thode dcrite au ] 2.2.%. ?p"%<. ,es rsultats

lextrait brut et ! lextrait a t teste selon la des tests sont rsu s dans le tableau 1..

7ableau nR@B : Sensibilit des !ermes.tests vis.1.vis de lextrait brut et de lextrait0 :icroorganis es @.Serratia marcescens I.Salmonella t5phi D.Shi!ella sonne? K.2astereulla multocida F.%andida albicans E.Alcalescens dispar C."scherichia coli B.Staph5lococcus aureus A.Steptococcus D @J.Listeria ^elhsimeri @@.Listeria seeli!eri @I.Listeria ivanovii @D.'hodococcus 1%8#ardnerella $aginalis @F.&eisseria !onorhoeae N#t%r" Di#)6tr" .% 8#'o .in8i&ition "n )) EB S"n!i&i'it "1tr#it S"n!i&i'it ( ( / ( ( ( / ( ( . . 1( ( (

actrie :R"M Bactrie #RE: 8 Bactrie #RE: 8 Bactrie #RE: 8 Cha pignon Bactrie #RE: 8 Bactrie #RE: 8 Bactrie #RE:W Bactrie #RE:W Bactrie #RE:W Bactrie #RE:W Bactrie #RE:W Bactrie #RE:W $ariable

( ( 1. ( ( ( 1/ ( ( . 1( 1. ( (

8 8
WW

8 8
W

8 8 8
WW

8 8 8
WW

8 8
X WW WW

8 8
X X W

8 8

8 8 8

$ariable ( 8 WW :Tr0s sensible = W :9ensible = X : asse6 sensible = 8 : insensible =

+es ger es tels que Shi!ella sonne?> "cherichia coli> Listeria seeli!eri> et Listeria ivanovii sont tr0s sensibles ! lextrait brut. Listeria ^ebslinneri est asse6 sensible et les autres ger es tests sont insensibles. 3n ce qui concerne lextrait> les tests ont r$l que Listeria ivanovii> "scherichia coli> et Shi!ella sonne? sont tr0s sensibles> Listeria ^elshimeri et Listeria seeli!eri sont asse6 sensibles> et les autres ger es sont insensibles. E:E:*:*:*:D t r)in#tion ." '# CMI ,a $aleur de la C:) a t dter ine pour les ger es qui sont tr0s sensibles aussi bien ! l3B qu! lextrait. Ce sont : "scherichia coli> Shi!ella sonne? et Listeria ivanovii. 9ix concentrations de l3B ?1".>/ = (/>%& = "%>*2 = 1*>"( = .>(. = %>"%<> en g1 l> ont t testes. ,es rsultats sont consigns dans le tableau sui$ant : T#&'"#% nD;= : R !%'t#t! ." '# . t"r)in#tion ." '# CMI !%r '"1tr#it &r%t: #er e8test Escherichia coli 'higella sonneH 6isteria i*ano*ii ,a figure 1* CMI ()7M)') .>(. .>(. .>(.

ontre ces rsultats.

" s C&

6isteria i*ano*ii C2

C2 C1 C& C% C" T T C(

C% T C(

C2 C1 C% C" C( T C&

;igure1* : Rsultats de la dter ination de la C:) de lextrait brut $is8 ! $is de 3scherichia coli> 9higella sonneA> ,isteria i$ano$ii par la des disques. ##( _ @DB A m!Pml> #,_ EA KF m!Pml > #. _ DK CI m!Pml > #/ _ @C DE m!Pml > #0 _B EB m!Pml > #? _ K DKm!Pml > & : F`! de pero3loxaxine$0 5our l3B> la concentration ini ale inhibitrice> cest8!8dire celle qui a donn un se situe ! la concentration de .>(. g1 l thode

dia 0tre dinhibition gale ! * pour les trois souches testes. 5our lextrait> ( concentrations expri es en ont t testes. ,es rsultats sont

g1 l ?&2>% = 2(>2 = 1"%>"% = 2.1* = 1>-.&< ontrs dans le tableau sui$ant.

7ableau nRIJ : 'sultats de la dtermination de la %M/ sur lextrait0 5"r)"Bt"!t Ei!0 8"ri08i# 0o'i S8i7 "''# !onn"S Listeria ivanovii ,a C:) est la ivanovii> et de 2(>2 4 e> cest8!8dire 1">1 2(>2 1">1 g1 l pour "scherichia coli et Listeria CMI ()7M)') 1">1

g1 l pour Shi!ella sonne?0

+BDISCUSSION ET CONLUSION )n7ects par $oie )5> lextrait brut et lextrait sont toxiques sur les souris. Cette $oie dad inistration per et dobser$er des sy ptM es dintoxication dont principale ent une torsion abdo inale> une dilatation au ni$eau des capillaires auriculaires> une pilorection> une enophtal ie et une difficult ! respirer. ,ad inistration de lextrait par $oie orale na> par contre> pro$oqu aucun sy ptM e dintoxication ! la dose utilise. Ceci pourrait 4tre d_ soit ! la destruction des principes toxiques par lacidit du tractus digestif> soit ! leur inacti$ation en6y atique> soit encore ! leur non absorption au ni$eau de la paroi intestinale. ,a $aleur de la +,&- se situe entre "/.>&( toxiques car elle est large ent suprieure ! 2& g12g et "/(>12 g12g de souris. Hne

$aleur aussi le$e per et de classer les principes toxiques par i les substances faible ent g12g ?RE:E+3> 1/*"<. Cette faible toxicit rend possible lutilisation traditionnelle de lcorce de tige en tisane fortifiante. ,exa en histopathologique des coupes dorganes des souris traites r$0lent des atteintes qui consistent surtout en des congestions $asculaires au ni$eau de certains organes $itaux tels que les pou ons> lintestin> le cer$eau et le foie. ,es congestions peu$ent $oluer en nappes h orragiques dans le foie. Ceci pourrait 4tre d_ ! laug entation de la per abilit des capillaires sanguins ! lh oglobine ou la fixation de principes actifs sur les h aties. ,e test sur les h aties de saponosides na pas t outon r$0le que les principes toxiques lysent les globules rouges ! partir de 12& Cg1 l pour lextrait et de 1&>( Cg1 l pour l3B. Gr> la prsence de ise en $idence au cours du criblage phytochi ique. +es tra$aux plus approfondis pourraient apporter des explications sur la lyse des globules rouges. Che6 les ani aux ! sang froid> lextrait brut tout co e lextrait agissent sur les 4 e ! leur clate ent ! la suite de

t4tards de grenouille et les ale$ins de carpe. ,es ale$ins sont beaucoup plus sensibles que les t4tards. +e plus> che6 les pre iers> les effets obissent ! la loi de tout ou de rien. 5ar contre> un effet8dose a t obser$ pour les t4tards de grenouille et la $aleur de la C,&- est de lordre de "& Cg1 l pour l3B et de 2& Cg1 l pour lextrait. ,es lar$es de 1>"./ oustique sont insensibles ! lextrait brut 7usqu! la concentration de

g1 l. ,e test na pas pu 4tre ralis au8del! de cette concentration> tant donn que la

$isualisation des lar$es est rendue i possible du fait que lextrait tr0s concentr colore le ilieu. Che6 les $gtaux> la sensibilit des graines testes ! lextrait brut ! 1 graines de g1 l est

$ariable. ,inhibition de la ger ination $a de 2- ! 1--K. 5ar contre> la ger ination des aAs> de dolique> de ri6 et de petit pois nest pas du tout affecte dans les conditions de lexprience. Gr> les expriences sur la croissance des 7eunes plantules de ri6 et de petit pois ontrent que les effets dpendent de la concentration de lextrait. 3n effet> les lots de ces 2 graines qui ont t tre ps dans lextrait brut de concentration 1".>/ Ceci pourrait 4tre d_ soit ! linacti$ation des en6y es du des graines> soit ! la destruction de le bryon. +autre part> la croissance de lhypocotyle est plus affecte que celle de lpicotyle> pour les 2 graines. 5ar ailleurs> on obser$e une sti ulation de la croissance de lpicotyle et de lhypocotyle pour des faibles concentrations en 3B. 3nfin> les grains de ri6 sont dune graines de petit pois. ,es principes toxiques agissent gale ent sur les lextrait brut et ! lextrait. 3n sonne?> 1">1 icroorganis es. ,es bactries g1 l ani0re gnrale> beaucoup plus sensibles que les g1 l nont pas ger . tabolis e qui sont ! la

disposition des graines> soit ! le p4che ent de lacc0s de le bryon aux rser$es nutriti$es

telles que "scherichia coli> Listeria ivanovii> Shi!ella sonne? prsentent une forte sensibilit ! ilieu solide> la $aleur de la C:) est de lordre de .>(. pour lextrait brut pour les trois bactries et respecti$e ent de 2(>2 g1 l pour "scherichia coli et Listeria ivanovii ! lextrait. aladies diarrhiques pourrait 4tre a$ance. Cela explique aux de $entre V ?:inist0re de g1 l pour Shi!ella

E la lu i0re de ces rsultats> une action des principes toxiques contre les icroorganis es responsables des lagriculture> 1//(<. 3tant donn la faible toxicit de ces principes toxiques ?cf. la $aleur de la +,&-<> et leur action $is8!8$is de certaines bactries pathog0nes> leur utilisation en thrapeutique co e des agents bactriostatiques $oire 4 e bactricides pourrait 4tre en$isageable. lutilisation traditionnelle de la plante pour soigner U les

CONCLUSION 5ENERALE ET PERSPECTIVES

CONCLUSION 5ENERALE ET PERSPECTIVES ,es tra$aux raliss sur Uapaca thouarsii> une plante end ique prli inaires> nous ont per is de : 8 8 8 8 8 8 ettre en $idence la prsence dune acti$it toxique dans lcorce de tige de cette plante = ettre au point un procd dextraction et de purification des principes toxiques = noter certaines de leurs proprits physico8chi iques = apporter les pre i0res infor ations sur la chi ie de Uapaca thouarsii = enrichir les connaissances sur les 3uphorbiaces animalesC *gtalesC et micro>iennes + algaches = initier ltude de la toxicit des principes toxiques sur di11rentes espces algache> bien que

+ans la$enir> nous en$isageons : 8 8 8 8 da liorer les diffrentes thodes dextraction et de purification> en $ue

dobtenir des toxines haute ent purifies et daccroStre le rende ent en toxines = didentifier et de dter iner la structure chi ique des toxines prsentes = de prospecter les effets sur dautres organis es ani aux> $gtaux et et dlucider les leur utilisation co canis es daction des toxines = e antibiotiques. icrobiens

de rechercher lapplication des principes toxiques en thrapeutique> en particulier

REFERENCES BIBLIO5RAPHIQUES

REFERENCES BIBLIO5RAPHIQUES
18 E,GH; N.3. Cell e brane and cytolytic toxins. )n : The specificity and actions of

ani al> bacterial> and plant toxins ?Receptors and recognition series B> 1<. ,ondon: Cuatrecasas 5.> Chap an and Iall> 1/**= 22182*-. 28 E'+R)E'T9GE I. Contribution ! la purification et ! la caractrisation dun principe anti icrobien de graine dune legu ineuse> AlbiGia lebecM0 d: oire de +3E : Biochi iee. Entananari$o : Hni$ersit dEntananari$o> 1/.". "8 EH+)#)3R C.> +H5G'T #.> TG'TE)' 3. 5rincipes des biochi ique> "e d. 5aris : +oin diteur>1//2. = ?T2<. %8 BE),,G' I. 3tude gnrale des 3uphorbiaces.1.&.. &/(p &8 B)TT)') B. Tetanus toxin structure as a basis for elucidating its i unological and thodes danalyse

neurophar acological acti$ities. )n: The specificity and actions of ani al> bacterial> and plant toxins ?Receptors and recognition series B> 1 <. ,ondon: Cuatrecasas 5.> Chap an and Iall>1/** = 1*&821.. (8 BG)T3EH 5.> E,,GR#38BG)T3EH ,. 5lantes ECCT et dition Oarthala> 1//". *8 BG)T3EH 5.> BG)T3EH :.> E,,GR#38BG)T3EH ,. )ndex des no s scientifiques a$ec leurs qui$alents algaches ?3xtrait du +ictionnaire des no s algaches des $gtaux<. Collection 'ature : ;lore de :adagascar. #renoble : El6ieu diteur> 1//* = %/-p. .8 BGL+. ;unda entals of i unology. %e d. 'ec Lor2: filey and sons> 1/((. dicinales de :adagascar. 5aris :

/8 BRH'3TG' N. 3l ent de phytochi ie et de phar acognosie. 5aris : T3C8+GC ,a$oisier> 1/.* = &.&p. 1-8 BH#')CGHRT :. +ictionnaire de :icrobiologie gnrale. 5aris : 3llipse editor ar2eting 9.E.> 1//&= //1p. 118 CGHRFE,)' 5.> #G,+9T3)' ;.> 5I),,)5G' E.> 9)9RGT N. ,antibiogra 5aris : :asson> 1//- = "%"p. e> 1e d.

128 CHETR3CE9E9 5. The specificity and action of ani al> bacterial and plant toxins. 'ec Lor2 : Nohn filey and sons> 1/**= "%&p. 1"8 +3BREL :.> NECJH3:)' I.> RETE;)'+RE:BEG R. Contribution ! l in$entaire des plantes dicinales de :adagascar. Entananari$o : GR9TG:> 1/*1. ode dinoculation des ani aux. 5aris :

1%8 +H:E9 N. ,es ani aux de ,aboratoire> ;la arion> 1/&" = (&18(&*.

1&8 +HFE, N.> 9GH99L C.N. Entibiothrapie> %e d. 5aris : :asson> 1//1 = 1..p. 1(8 ;3RRG' E. Bactriologie dicale. 5aris : C. et R.> 1//% = %22p.

1*8 ;G'# I.I.N.> T)'8fE :.> ;ER'9fGRTI '. R. 5hytoche ical screening. Re$iec. Chicago : Hni$ersity of )llinois> 1/**. 1.8 #E'T3R 5.> NG,,39 #. Iistochi ie nor ale et pathologie. 5aris : #EHTI)3R 8 F),,ER9> 1/(/ = /2"p. ?T2<. 1/8 I3CO3, 3. ,es plantes toxiques de :adagascar a$ec leur no 5aris : Challa el> 1/-" = "*2p. 2-8 I3,,3R R.> 39'EH,T R.> ,E'C3 C. 5hysiologie $gtale : d$eloppe ent> &e d. 5aris : :asson> 1//& = "1&p. 218 I3:)'#fEL R. f.> OERCI39L N.N. Che istry and significance of condensed tannins. 'ec Lor2 : 5lenu 5ress> 1/./ = 2%/82(%. et leur e plois indig0nes.

22 g NEf3TT 3.> :3,')CO N.> E+3,B3R# 3. E. Re$iec of :edical :icrobiology> 1%th d. California : ,anges edical 5ublication> 1/.- = &/"p.

2"8 N3E''G+E F.,.R. 3tude chi ique> biologique et toxicologique du principe con$ulsi$ant des Connaraces de :adagascar. dTh0se de +octorat d3tat : 9ciencese. 9trasbourg : Hni$ersit de ,ouis 5asteur de 9trasbourg> 1/.(. 2%8 OE:GH' 5. Eppareils et 2"*p. thodes en biochi ie> "e d. 5aris : ;la arion> 1//1 =

2&8 O,GG9 I.> :cCH,,GH#I ;. 9. 5lants cith Recogni6ed

ollucidal acti$ity. )n : 5lants

olluscicides edited by Oenneth 3. :. 'ec Lor2 : Nohn filey and sons> 1/.* =%&81-/. 2(8 ,ER53'T N. 5.> ,ER53'T :.> #GHR#E' #. : ento Technique de "e d. 5aris : T3C8+GC ,a$oisier> 1//* = %1*p. 2*8 ,3E'+R) N. ,es arbres et grands arbustes de :adagascar : 3uphorbiaces. Ecad ie :algache> Tananari$e = 1/&.. 2.8 ,3;3FR3 N. #. :anuel de icrobiologie> 1//* = p1&". icrobiologie>

2/8 ,3 8:)'GR ,.> R)CIER+ C. :thode de laboratoire pour lidentification des 3nterobacteriaceae. 5aris : )nstitut 5asteur> 1//". "-8 ,H99)3R #. Iistologie et Iistochi ie. )n : 5ierre 5.> :ichel T. :anuel de techniques $irologiques. Jubec : Hni$ersit francophone H3R3;> 1/./ = &*8(- ?chap/<. "18 :EIHT)3R #.> IE:G' I. Ebrg de chi ie analytique : d. 5aris : :asson> 1//- = 2 = 2(2p. "28 :ERCIE, '.> BGHR+G' N. ,.> R)CIER+ C. ,es ilieux de culture pour lisole ent thode de sparation> 2e

et lidentification biochi ique des bactries> "e d. 5aris : +oin diteur> 1/.*. ""8 :)')9ThR3 +3 ,E#R)CH,THR3 3T +H +PF3,G553:3'T RHRE,> 5lan daction en$ironne ental. )n$entaire cologique et forestier national> recueil botanique de 2-- esp0ces foresti0res. +irection de 3aux et ;or4t> +eutsche ;orest ser$ice> 3ntreprise dtude de d$eloppe ent :a o2atra> ;oiben8taontsarintanini :adagasi2ara = 2"/p> 1//(. "%8 :H3,,3R N. I.> I)'TG' N. :ilieux de culture. 5ro. 9oc. 3xp. Biol. :ed.> 1/%1= %.= ""-8""/. "&8 G,9'39 9.> 5)I, E. Ebrin> ricin and their associated agglutinins. )n : The specificity and actions of ani al> bacterial> and plant toxins ?Receptors and recognition series B> 1 <. ,ondon: Cuatrecasas 5.> Chap an and Iall>1/**= 12/81*". "(8 53R'3T R. ,es plantes dicinales algaches ?suite de notes analytiques<. : . )nst.

9c. :adagascar> 1/&/ = /= 21*8"-".

"*8 53R'3T R.> :3L3R #. 5har acope de :adagascar. )nst. Recherche 9cient. de Tananari$e> 1/&* = %28(*. ".8 REN3:)ER):G3,)9GE C. ;. )sole ent> caractrisation chi ique et biologique du principe actif de AlbiGia odorata ?:i osoidae 8 ;abaceae<. dTh0se de +octorat de "e cycle : Biochi iee. Entananari$o : Hni$ersit dEntananari$o> 2---. "/8 RENEG'ER)FG'L N. ). Contribution ! ltude chi ique et biologique des principes toxiques de Aleurites 3ordii ?3uphorbiaceae<. d: oire de +3E : Biochi iee. Entananari$o : Hni$ersit dEntananari$o> 1//(. %-8 REOGTG'+RETE'EOE ,. )sole ent caractrisation chi ique et biologique du principe toxique de +dosic5os boseri ?Cucurbitaceae<. dTh0se de +octorat : 9ciencese. Entananari$o : Hni$ersit dEntananari$o> 2--". %18 REOGTG8RE'GRG:E,E,E +.E.+. 5urification et tude des proprits physico8 chi iques et biologiques des principes toxiques de 7achiadenus lon!i3lorus ?#entianaceae<. dTh0se de +octorat de "e cycle : Biochi ie85har acodyna iee. Entananari$o : Hni$ersit dEntananari$o> 1/./. %28 RE,)9G' C. )sole ent et tude biochi ique> toxicologique et biologique de la onguine> principe toxique de %roton mon!ue une 3uphorbiacee algache. dTh0se de +octorat d3tat : Biochi iee. Entananari$o : Hni$ersit dEntananari$o> 1/.*. %"8 RE:E+3 3. 3cotoxicologie. 5aris : :asson> 1/*/ = 22.p. %%8 RE:E:G'N)9G' 3. Contribution ! ltude chi ique et biologique du principe toxique de graines dAlbiGia species ?:i osiodae8;abaceae<. d: oire de +3E : Biochi iee. Entananari$o : Hni$ersit dEntananari$o>1/... %&8 RE'+3RETI O. Chro atographie sur couche 1/(% =2/(p. %(8 RE'+R)E N. '. Contribution ! ltude phar acologique et toxicologique de "uphorbia orthoclada ?3uphorbiaceae<. d: oire de +3E : Chi iee. Entananari$o : Hni$ersit dEntananari$o> 1//(. ince. 5aris : #EHTI)3R8F),,ER9>

%*8 RE'+R)E'ER)FG I. R. 5urification et caractrisation partielle des principes actifs de AlbiGia arenicola ?:i osiodae8;abaceae<. d: oire de +3E : Biochi iee. Entananari$o : Hni$ersit dEntananari$o> 1//(. %.8 RETE'E:5ERE'L ,. 5urification et tude des proprits physico8chi iques et biologiques de la bolaffinine> toxine protique extraite de Boletus a33inis 5ec2 ?Boletaceae< dTh0se de +octorat d3tat : 9ciencese. Entananari$o : Hni$ersit dEntananari$o> 1/.*. %/8 R33+ ,. N.> :H3'CI I. E si ple N. Iyg.> 2* > 1/". = %/"p. &-8 RGB)'3EH ,.> f3')#3R B. Recherche scientifique et usage populaire des plantes dicinales dans la caraAbe> 2e d. 9anto8+o ingo : 9e inaire TRE:),, 2> 1/... &18 9CIE3CIT3R :.> 9CI,399)'#3R +. ,es toxines bactriennes. )n : 9chaechter> :edoff> 3isenstein. :icrobiologie et pathologie infectieuse> 2e d. 5aris : +e boec2 Hni$ersit i ,arcier s.a.> 1/// = 1("81(&. &28 9)'#,3TG' 5. Bactriologie> 2e d. 5aris : :asson> 1//% = 2%*p. &"8 9T)R53 ;.> 5399)G' BR)TT) E.> ,GR3'TG') 3.> 9TRGCC) 5.> :G'TE'ERG ,.> 953RT) 9. 9tudies on the proteins fro seeds of %roton ti!lium and )atropha curcas toxic properties and inhibition of protein synthesis in $itro. Bioche . N. 1&( > 1/*(= 18(. &%8 TE,BGT 5. N. Technique din7ection des ani aux. )n : 5ierre 5.> :ichel T. :anuel de technique $irologique. Juebec : Hni$ersit francophone H3R3;> 1/./ = *& 8 (-. ?chap&<. &&8 T3RREC :. ,. Contribution ! ltude des plantes Entananari$o : GR9TG:> 1/*1. &(8 T399)3R E. :.> 5ER)9 R.R.> BGHJH3T E. 9ur quelques 3uphorbiaces toxiques africaines. 5lantes dicinales et phytothrapie> 1/*& = 2".82%/.?T1-<. dicinales de :adagascar. ethod of esti ating fifty per cent ends points. E .

&*8 F3R'3 N. 5rcis dhistologie> &e d. 5aris : :asson et Cie diteurs> 1/(- = (.&p.

ANNEXES

E''3@39

ANNEXE I
Co)po!ition 08i)i(%" ."! r #0ti2! : 8 Ractif de :EL3R Chlorure de ercureDDDDD....1>"(g )odure de potassiu DDDDDD&g 3au distilleDDDDDDD.qsp 1-- l 8 Ractif de +RE#3'+GR;; )l sagit de dun 8 9olution E : 'itrate de bis uthDDDDDDD..1>*g Ecide tartrique concentrDDDD.2-g 3au distilleDDDDDDDDD.."- l lange de $olu e ! $olu e de deux solutions E et B.

8 9olution B : ,e )odure de potassiu DDDDD..D.1-g 3au distilleDDDDDDDD..D...%- l

lange est ensuite additionn de 1-g dacide tartrique et deau distille> qsp 1-- l. 8 Ractif de fE#'3R )odure de potassiu DDDDDD..2g )odeDDDDDDDDDD..D.D.1>2*g 3au distille qsp 1-- l

"%%E7E !! #omposition du liquide de OU!% ) Ecide picriqueDDDDDD.*& l ;or ol ! %-KDDDDDD..2- l Ecide actique glacialDDD...& l

#omposition de la solution de P ' Chlorure de sodiu DDDDDDDDD.DDD.*>(&- g 5hosphate dissodiqueDDDDDD->*2% g 5hosphate onopotassiqueDDD...->21- g

 "%%E7E !!!

3au distilleDDDDDDD....qsp 1l

#omposition de milieux de culture micro>ienne ) 8 :ilieux disole ent et de purification : Le bouillon nutriti3 Co position en g1l : 5eptone bactriologiqueDDDDD.D.& 3xtrait de $iandeDDDDDDD.DD" 3xtrait de le$ureDDDDDDDDD.% #lucoseDDDDDDDDDD.DD..& 3au distilleDDDDDD...D.D.qsp 1l L# 7 'o!" or.in#ir" Co position en g1l 5eptoneDDDDDDDDDD.D.D& 3xtrait de $iandeDDDDDDD.D..1 Chlorure de sodiu DDDDDDD..& 3xtrait de le$ureDDDDDDDD...2 EgarDDDDDDDDDDD...D.1& 3au distilleDDDDDDD...Dqsp 1l pI gal ! *>% 8 :ilieux didentification et de caractrisation biochi ique 8Milieu de S/MM+&S Co position en g1l 9ulfate de 5hosphate agnsiu DDDDD...D->2 ono a oniaqueDDD..1

5hosphate dipotassiqueDDDDDD.1 Citrate de sodiu DDDDDDDD..2 Chlorure de sodiu DDDDD....D...& Bleu de bro othi olDDDDDD.D->-. EgarDDDDDDDDDDDDD..1&

3au distilleDDDDD...DD..Dqsp 1l pI b*>1 8 :ilieu annitol8 obilit

Co position en g1l Iydrolysat trypsique de casineD..1'itrate de potassiu DDDDD...1 :annitolDDDDDDDDD.....*>& Rouge de phnol ! 1KDDD..D..->-% Egar DDDDDDDDDD..D.">& 3au distilleDDDD..DDDqsp 1l pIb*>( 8 :ilieu IEN'E8O,)#,3R Co position en g1l 3xtrait de $iande de bRufDDD..." 3xtrait de le$ureDDDDDD..D" 5eptone DDDDDDDDD.....1& 5eptone pepsique de $iandeDD....& ,actoseDDDDDDDDDD..1#lucoseDDDDDDDDDD...1 9ulfate ferreux DDDDDDD...2 Chlorure de sodiu DDDDDD& Thiosulfate de sodiu DDDDD->" Rouge de phnolDDDDDDD.->-2% 3au distilleDDDDDDDDqsp1l pIb *>& 8 :ilieu lysine8fer Co position en g1l 5eptone bactriologiqueDDDD...D.& 3xtrait de le$ureDDDDDDDDD" #lucoseDDDDDDDDDDD.D.1 ,. lysineDDDDDDDDDD.D..1Citrate de fer a oniacalDDD.D....->&

Thiosulfate de sodiu DDD.DD.D.->-% 5ourpre de bro othy ol DDD...D...->-2 #loseDDDDDDDD.DDDD.1& 3au distilleDDDDDDDDD..D1l pI b (>* ->2 8 :ilieu ure8indole Co position en g1l ,. tryptophaneDDDDDD...D->" OI25G%DD.DDDDDDDD->1 O2I5G%DD.DDDDDDDD->1 'aC,DDDDDDDDDDD.->& Elcool ! /-D.DDDDDDD.1 l Rouge de phnol ! 1KDDDD..->2& 3au distille..DDDDDDD1-- l 8 :ilieu dantibiogra e

Co position en g1l )nfusion de "--g de $iande de bRuf?dshydrat< IydrolysYt acide de casineDDDDDDDDD.1*>& E idon de pIb*>% aAs.DDDDDDDDDDDDDD1>& EgarDDDDD..DDDDDDDDDDDD...1-

No) : RANDRIANANDRASANA Pr no) : $#on# Titr" ." M )oir" : ETUDE CHIMIQUE ET TOXICOLO5IQUE DES EXTRAITS TOXIQUES DECORCES DE TI5E DE Uapaca thoarsii (EUPHORBIACEAE) RESUME Une activit toxique a t mise en vidence dans lextrait brut aqueux dcorces de ti!e de Uapaca thouarsii une "uphorbiace endmique de Mada!ascar0 Un procd simple comprenant une dialIse et un 1ractionnement par le n>utanol a permis do>tenir un extrait partiellement puri1iC a*ec un rendement en extrait toxique de lordre de =C(.J2 Les principes toxiques de !oXt amer sont des molcules thermostables pouvant comporter un ou plusieurs no5aux aromatiques dans leur structure0 De plus ils ont une a33init pour les solvants polaires tels que leau et lthanol > ils rpondent positivement aux tests de caractrisation des triterp4nes des leucoanthoc5anes des strols insaturs et 3aiblement au test des saponines0 %heG la souris lextrait puri3i dveloppe un s5ndrome complexe dont les mani3estations les plus marquantes sont essentiellement des diarrhes et une di33icult respiratoire0 /l provoque des con!estions vasculaires pouvant voluer en nappes hmorra!iques au niveau des poumons de lintestin du cerveau et du 3oie0 La DLFJ #IKh$ est situe entre DAE @I m!PM! et DAB FE m!PM! de souris0 Lextrait puri3i ainsi que lextrait brut provoquent la l5se des hmaties respectivement 1 la dose de @IF `!Pml et de @F E `!Pml0 Lextrait brut tout comme lextrait puri3i est !alement toxique sur des animaux 1 san! 3roid0 %heG les t=tards de !renouille la %LFJ #IKh$ est de DF `!Pml pour lextrait brut et de IF `!Pml pour lextrait0 %heG les alevins le33et inhibiteur semble rpondre 1 la loi du tout ou rien0 Aucune activit na par contre pu =tre observe cheG les larves de moustique en. dessous de la concentration de @ DAB m!Pml en extrait brut0 %heG les plantes lextrait brut 1 @ m!Pml inhibe la !ermination des quelques !raines de Monocot5ldones et de Dicot5ldones0 La croissance de lepicot5le et de lh5pocot5le de riG et de petit pois est inhibe par lextrait brut0 Une stimulation est par contre note 1 de 3aibles concentrations0 La croissance du bour!eon axillaire est stimule pour les plantules de petit pois 1 la dose de IB `!0 Finalement les principes toxiques a!issent sur quelques !ermes patho!4nes ,'AM Q et ,'AM 0 Les %M/ en milieu solide pour lextrait sont respectivement de @D @ m!Pml> IE I m!Pml > @D @ `!Pml pour Listeria ivanovii Schi!ella sonnei et "scherichia coli0 "lle est identique pour lextrait brut et !ale 1 B EB m!Pml pour les trois !ermes0 MOTS B CLES Uapaca thouarsii 3uphorbiace> toxique> +,&-> lsions tissulaires> ichtyotoxique> proprit anti8bactrienne> proprit h olytique.
.

En0#.r"%r! : Pro2"!!"%r $EANNODA Vi0tor Do0t"%r RAGOTOBRANOROMALALA D#ni"''": A:D: SUMMA'7oxic activit5 has been discovered in an aqueous ra^ extract o3 Uapaca thouarsii #"uphorbiaceae$ stem barM endemic to Mada!ascar0 A t^o step puri3ication includin! a dial5sis and n.butanol separation led to partiall5 puri3ied extract !ivin! an output about J @DT o3 toxic extract0 7oxic principles are bitter.tasted the5 have heat resistant propert5 and ma5 contain one or more aromatic core inside their structure0 7he5 present some a33init5 ^ith polar solvents liMe ^ater and ethanol0 Moreover the5 !ive a positive response to triterpens leucoanthoc5ans sterol tests and sli!htl5 to saponins0 +n mouse puri3ied extract produces s5ndromes essentiall5 characteriGed b5 diarrhoea and di33icult5 to breathe0 /t causes also lesions such as vascular con!estions o3 the main or!ans liMe lun!s bo^els brain and liver leadin! to an haemorrha!e0 7he LDFJ #IKh$ is situated bet^een DAE @I m!PM! and DAB FE m!PM! o3 mice0 +ther^ise puri3ied and ra^ extracts cause l5ses o3 red blood cell o3 sheep respectivel5 at dose o3 @IF `!Pml and @F E `!Pml0 Both extracts are also toxic on cold blood animals0 +n tadpoles the L%FJ #IKh$ are respectivel5 o3 DF m!Pml and IF m!Pml 3or ra^ extract and puri3ied one0 +n 5oun! 3ishes o3 carps the inhibitin! e33ect 3ollo^s the la^ o3 all or nothin!0 %onversel5 lethal e33ect has not been noticed on larva o3 mosquitoes 3or an5 concentration belo^ @ DAB m!Pml0 Gn plant> ger ination of so e seeds of inhibited by rac extract at a dose of 1 onocotyledons and dicotyledons are

g1 l. #rocth of epicotyls and hypocotyls of rice and buds is sti ulated by the purified

pea plants are also repressed for higher concentrations in rac extract chile locer concentrations produce their sti ulation. #rocth of ste extract at a dose of 2. Cg for young plant of pea. Finall5 both extracts are toxic on some patho!enous ,'AM and ,'AMQ strains o3 bacteria0 /n solid media the %M/ o3 puri3ied extract is evaluated at @D @ m!Pml > IE I m!Pml > @D @ m!Pml 3or Listeria ivanovii Schi!ella sonnei and "scherichia coli0 /dentical value equals at B EB m!Pml ^as 3ound 3or each !erm ^ith ra^ extract0 KEF- LOR3' Uapaca thouarsii> Toxic> euphorb> +,&-> histological lesions> )chtyotoxic> anti8 bacteria property> hae olytic property. A./i!or! : Pro2"!!or Vi0tor $EANNODA Do0tor D#ni"''": A:D: RAGOTOBRANOROMALALA
.