Culture de cellules

animales
3e dition

Chez Lavoisier Tec & Doc :

Cycle cellulaire et cytomtrie en flux, par Didier Grunwald, Jean-Franois Mayol et Xavier Ronot
La cytomtrie en flux, par Xavier Ronot, Didier Grunwald, Jean-Franois Mayol et Jean Boutonnat
Communications et signalisations cellulaires, par Yves Combarnous
Lvolution biologique au XXIe sicle : Les faits, les thories, par Roger Dajoz
Biologie de lvolution et mdecine (Coll. Monographies), par Christian Frelin et Bernard Swynghedauw
Labo-Stat : Guide de validation des mthodes danalyse, par Max Feinberg

Chez Lavoisier Mdecine Sciences :

Biologie molculaire de la cellule, par B. Alberts, A. Johnson, J. Lewis, M. Raff, K. Roberts et P. Walter
Biologie molculaire de la cellule Livre dexercices, par J. Wilson et T. Hunt
Lessentiel de la biologie cellulaire, par B. Alberts, D. Bray, K. Hopkin, A. Johnson, J. Lewis, M. Raff, K. Roberts
et P. Walter
Immunologie, par L. Chatenoud et J.-F. Bach
Manuel de poche de biologie cellulaire, par H. Plattner et J. Hentschel
Biologie molculaire et mdecine, par J.-C. Kaplan et M. Delpech
Appareils et mthodes en biochimie et biologie molculaire, par B. Hainque, B. Baudin et P. Lefebvre
Biochimie et biologie molculaire, par P. Kamoun, A. Lavoinne et H. de Verneuil
Histologie, par J.-P. Dadoune

Georgia BARLOVATZ-MEIMON

Xavier RONOT

Culture de cellules
animales
3e dition

Prface de Monique Adolphe

Postface de Jacques Demongeot

editions.lavoisier.fr

Les auteurs dclarent ne pas avoir de conflit dintrt concernant le contenu de cet ouvrage.

Ouvrage ralis avec le concours de lInserm

(Institut national de la sant et de la recherche mdicale)

Couverture :
Photo 1 : Visualisation des filaments dactine dans un doigt de migration dun tissu MDCK. (Crdit : clich O. Cochet)
Photo 2 : Cellules provenant dun adnocarcinome mammaire, MDA-MB-231. Au cours dun test de migration aprs blessure in vitro, on
note la prsence de PAI-1 (en vert) dans de petits bourgeonnements membranaires. (Crdit : collection Michel Malo, laboratoire IBISC)
Photo 3 : Photographie de cellules cultives sur microporteur. Cellules rnales humaines sur Cytodex 3. (Crdit : clich CNRS-Laboratoire
Ractions et Gnie des Procds, Nancy)
Photo 4 : Cellules RT112 (ligne drive dune tumeur vsicale humaine). Marquage en fluorescence de la tubuline (vert) et de lADN (bleu).
(Crdit : collection Vronique Frachet, laboratoire CaCyS, EPHE)
Photo 5 : Culture de pneumocytes de type II isols de poumon de rat ftal qui se transforment en pneumocytes I en 48h sur plastique (en
vert la protine TI) (Crdit : clich Bernadette Chailley-Heu)
Photo 6 : Explant de cochle de souris. Sur cette portion, on visualise les cellules cilies (rouge, marquage myosine 7a), les neurones auditifs
et les fibres nerveuses (vert, marquage neurofilament 200). (Crdit : clich Florence Franois)

Direction ditoriale : Fabienne Roulleaux

dition : Brigitte Peyrot
Fabrication : Estelle Perez-Le Du
Composition et couverture : Patrick Leleux PAO, Caen
Impression et brochage : L.E.G.O. S.p.a., Lavis, Italie

2014, Lavoisier, Paris

ISBN : 978-2-7430-1989-1

LISTE DES COLLABORATEURS

ABERDAM Daniel, Directeur de Recherche Inserm, UMRS976, Hpital Saint-Louis, Paris.
ALFAIDY Nadia, Charge de Recherche Inserm, Laboratoire Biologie du Cancer et de lInfection, Unit Mixte INSERM-CEAUJF U1036, Institut de Recherches en Technologies et Sciences pour le Vivant, CEA-Grenoble, Universit Joseph
Fourier, Grenoble.
ANDRAU Karine, Matre de Confrences, Laboratoire des Rponses Molculaires et Cellulaires aux Xnobiotiques, Unit
Biologie Fonctionnelle et Adaptative, CNRS UMR 8251, Universit Paris-Diderot, Paris.
AUXENFANS Cline, Praticien Hospitalier, Laboratoire des Substituts Cutans, Banque de Tissus et Cellules, Hpital douard
Herriot, UMR5305, IBCP, Lyon.
BAEZA-SQUIBAN Armelle, Professeure des Universits, Laboratoire des Rponses Molculaires et Cellulaires aux Xnobiotiques,
Unit de Biologie Fonctionnelle et Adaptative, UMR CNRS 8251, Universit Paris-Diderot, Paris.
BARLOVATZ-MEIMON Georgia, Professeure mrite, Universit Paris-Est, Crteil et Laboratoire IBISC (Informatique, Biologie
Intgrative et Systmes Complexes), Universit dvry-Val dEssonne/Genopole, vry.
BARTHOLIN Laurent, Charg de Recherche Inserm, UMR Inserm 1052, CNRS 5286, Universit Lyon 1, Centre de Recherche en
Cancrologie de Lyon, Centre Lon Brard, Lyon.
BLANCHARD Fabrice, Ingnieur de Recherche, Laboratoire Ractions et Gnie des Procds, UMR CNRS 7274, ENSAIA,
Vanduvre-ls-Nancy.
BONGRAND Pierre, Professeur des Universits, Praticien Hospitalier, Laboratoire Adhsion Cellulaire et Inflammation, Inserm
UMR1067, CNRS UMR 7333, Universit Aix-Marseille, Marseille.
BOUBLIK Yvan, Ingnieur de Recherche CNRS, UMR 5237 CNRS, Centre de Recherches de Biochimie Macromolculaire
(CRBM), Montpellier.
BOURBON Jacques, Directeur de Recherche CNRS, Inserm U955, Institut Mondor de Recherche Biomdicale, Crteil.
BROCARD Jacques, Charg de Recherche Inserm, Institut de Neurosciences, Centre de Recherche Inserm U836, Grenoble.
BROUILLET Sophie, Assistante Hospitalo-Universitaire, Laboratoire dAide la Procration-CECOS, Centre Hospitalier
Universitaire de Grenoble, Universit Joseph Fourier, Grenoble.
CALVO Fabien, Professeur des Universits, Praticien Hopitaliler, Service de Pharmacologie, Centre dInvestigations
Cliniques, Inserm UMRS 940 Hpital Saint-Louis, Paris.
CAMBAR Jean, Professeur des Universits, Laboratoire de Biologie Cellulaire, FRE CNRS 3396 Pharmacochimie, UFR des
Sciences Pharmaceutiques, Universit Bordeaux-Segalen, Bordeaux.
CARTIER-MICHAUD Amandine, Post-doctorante, CRCM Marseille, Equipe Adhsion et Interactions Tumeur/Hte, Marseille.
CERUTTI Martine, Directrice de Recherche CNRS, UP33044, Baculovirus et Thrapie, Saint Christol-ls-Als.
CHARRIRE-BERTRAND Ccile, Matre de Confrences, Universit Paris-Est Crteil, et laboratoire IBISC (Informatique, Biologie
Intgrative et Systmes Complexes), vry.
CHEVALOT Isabelle, Professeure des Universits, Universit de Loraine, Laboratoire Ractions et Gnie des Procds, UMR
CNRS 7274, ENSAIA, Vanduvre-ls-Nancy.
COCHET-ESCARTIN Olivier, Docteur, Laboratoire Physicobiologie aux Msochelles, UMR 168, Institut Curie, Centre de
Recherche CNRS UPMC, Paris, France. Physics Department, University of California, San Diego, USA.
CORRE Guillaume, Chercheur/Post-doctorant, UMR Inserm U951 Immunologie Molculaire et Biothrapies Innovantes,
Gnthon, Universit dvry-Val dEssonnes, cole Pratique des Hautes tudes, vry.
COUSSERANS Franois, Ingnieur dtudes, UMR1333 INRA - DGIMI, Universit Montpellier 2, Montpellier.
CURTET-BENITSKI Sandrine, Assistante Ingnieure, Inserm U823, pigntique et Signalisation Cellulaire, Institut Albert
Bonniot, La Tronche.

DAMOUR Odile, Praticien Hospitalier, Laboratoire des Substituts Cutans, Banque de Tissus et Cellules, Hpital douard
Herriot ; UMR5305, IBCP, Lyon.
DE

GUERRA Arnaud, Responsable Ple Recherche et Union europenne, Direction Mdicale et Scientifique, Agence de la
Biomdecine, Saint-Denis La Plaine.

DEUGNIER Marie-Ange, Charge de Recherche Inserm, Institut Curie, Centre de Recherche, CNRS UMR144, Mcanismes
Molculaires du Dveloppement de la Glande Mammaire, Paris.
DI-CICCO Amandine, Assistante Ingnieure, Institut Curie, Centre de Recherche, CNRS UMR144, Mcanismes Molculaires
du Dveloppement de la Glande Mammaire, Paris.
DORANGE Germaine, Professeure des Universits, UFR Mdecine et Sciences de la Sant, Dpartement Gnie biologique, IUT
Brest, Universit de Bretagne Occidentale, Brest.
DOS SANTOS Morgan, Docteur, Laboratoire des Substituts Cutans, Banque de Tissus et Cellules, Hpital douard Herriot,
Lyon.
DROGUET Mickael, Matre de Confrences des Universits, UFR Mdecine et Sciences de la Sant, Dpartement Gnie biologique, IUT Brest, Universit de Bretagne Occidentale, Brest.
DUCAROUGE Benjamin, Post-doctorant, UMR 5286 quipe Apoptose Cancer et Dveloppement, Centre de Recherche en
Cancrologie de Lyon, Centre Lon Brard, Lyon.
DUGAIL Isabelle, Directrice de Recherche Inserm, UMRS U1166, quipe 6 Nutriomics, Inserm, Paris.
DUPONT Jolle, Directrice de Recherche INRA, UMR Physiologie de la Reproduction et des Comportements, Centre Val-deLoire, Tours.
DUPRESSOIR Thierry, Professeur des Universits, Directeur dtudes Laboratoire de Pathologie Compare des Invertbrs,
cole Pratique des Hautes tudes, UMR1333 INRA - DGIMI, Universit Montpellier 2, Montpellier.
EDOM-VOVARD Frdrique, Post-doctorant, Centre de Recherche en Myologie, UMRS974 UPMC, Inserm, FRE 3617 CNRSAIM, Groupe Hospitalier Piti-Salptrire, Paris.
FABRE Isabelle, Chef du ple Contrles biologiques des produits biologiques et des plantes, Direction des Contrles, Agence
Nationale de Scurit du Mdicament et des produits de sant (ANSM), Vendargues.
FEIGE Jean-Jacques, Directeur de Recherche Inserm, Laboratoire Biologie du Cancer et de lInfection, Unit Mixte INSERMCEA-UJF U1036, Institut de Recherches en Technologies et Sciences pour le Vivant, CEA-Grenoble, Universit Joseph
Fourier, Grenoble.
FILIPUTTI-GILQUIN Anne-Laure, Assistante Ingnieure, Responsable Culture Cellulaire, Socit CreaCell, La Tronche.
FRABOULET Sandrine, Matre de Confrences des Universits, UFR Chimie-Biologie, Universit Joseph Fourier, Grenoble.
FRANOIS Florence, Ingnieure dtudes, Institut des Neurosciences de Montpellier, Inserm U1051, Montpellier.
FRESHNEY Ian, PhD, honorary Senior Research Fellow, Center for Oncology and Applied Pharmacology, part of the Cancer
Research UK Beatson Laboratories, University of Glasgow, Royaume-Uni.
FROMENT Pascal, Charg de Recherche INRA, UMR Physiologie de la Reproduction et des Comportements, Centre Val-deLoire, Tours.
FROMIGU Olivia, Charge de Recherche Inserm, Inserm UMR 981, Universit Paris Sud, Institut Gustave Roussy, Villejuif.
GABILLARD Jean-Charles, Charg de Recherche INRA, UR1037, Laboratoire de Physiologie et Gnomique des Poissons, Rennes.
GABOYARD-NIAY Sophie, Chef de Projet R&D, Sensorion, Institut des Neurosciences de Montpellier, Montpellier.
GIRODON Franois, Professeur des Universits, Praticien Hospitalier, Service dHmatologie Biologique, Centre Hospitalier
Universitaire de Dijon et Universit de Bourgogne, Dijon.
GRUNWALD Didier, Ingnieur/Chercheur, iRTSV, CEA, Grenoble.
GUEDON Emmanuel, Charg de Recherche CNRS, Laboratoire Ractions et Gnie des Procds, UMR CNRS 7274, ENSAIA,
Vanduvre-ls-Nancy.
GUGUEN-GUILLOUZO Christiane, Directrice de Recherche mrite, Inserm U991 Foie, Mtabolisme et Cancer, Universit de
Rennes 1, Rennes.
GUYOT Mlanie, Docteur, IPMC, Universit de Nice-Sophia Antipolis, Nice.

VI

LISTE DES COLLABORATEURS

HABERT Ren, Professeur des Universits, UMR Inserm U967-CEA, Universit Paris-Diderot, Sorbonne Paris-Cit, Laboratoire
de Dveloppement des Gonades, Centre CEA, Fontenay-aux-Roses.
HOFFMANN-CUCUZ Pascale, Professeure des Universits, Praticien Hospitalier, Service de Mdecine de la Reproduction,
Centre Hospitalier Universitaire de Grenoble ; Laboratoire Biologie du Cancer et de lInfection, Unit Mixte InsermCEA-UJF U1036, Institut de Recherches en Technologies et Sciences pour le Vivant, CEA-Grenoble, Universit Joseph
Fourier, Grenoble.
JACQUIER-SARLIN Muriel, Matre de Confrences, Institut des Neurosciences, Inserm U836, Universit Joseph Fourier,
Grenoble.
KADRI Malika, Technicienne, Laboratoire Cancer Cycle cellulaire et Snescence (CaCyS), FRE AGIM 3405 UJF-CNRS-EPHE,
Universit Joseph Fourier, Grenoble.
KLEMAN Jean-Philippe, Chercheur, Institut de Biologie Structurale, UMR 5075 CNRS/CEA, Universit Joseph Fourier,
Grenoble.
LAZOU Batrice, Matre de Confrences, Laboratoire de Biologie Cellulaire, UFR des Sciences Pharmaceutiques, Universit
Bordeaux-Segalen, Inserm 1026 Bioingnierie Tissulaire, Bordeaux.
LAIN Michle, Matre de Confrences, Institut des Neurosciences, Inserm U836, Universit Joseph Fourier, Grenoble.
LARDEUX Bernard, Charg de Recherche CNRS, Institut des Maladies de lAppareil Digestif, Inserm U913, Centre Hospitalier
Universitaire Htel-Dieu, Nantes.
LEGENDRE Audrey, Ingnieure-Chercheur, Institut de Radioprotection et de Sret Nuclaire (IRSN), Laboratoire de
Toxicologie Exprimentale, Fontenay-aux-Roses.
LEGUEN Isabelle, Charge de Recherche INRA, UR1037, Laboratoire de Physiologie et Gnomique des Poissons, Rennes.
LEMAZURIER Emmanuel, Chef de Projets, Institut National de lEnvironnement et des Risques (INERIS), Verneuil-en-Halatte.
LIVERA Gabriel, Professeur des Universits, UMR Inserm U967-CEA, Universit Paris-Diderot, Sorbonne Paris-Cit,
Laboratoire de Dveloppement des Gonades, Centre CEA, Fontenay-aux-Roses.
LOYER Pascal, Charg de Recherche, Inserm UMR 991 Foie, Mtabolisme et Cancer, Hpital Pontchaillou, Rennes.
MAGUER-SATTA Vronique, Directrice de Recherche CNRS, Centre de Recherche en Cancrologie de Lyon, U1052-UMR5286,
Universit Lyon 1, Lyon.
MALO Michel, Matre de Confrences, Universit dvry-Val dEssonne, et laboratoire IBISC (Informatique, Biologie
Intgrative et Systmes Complexes), vry.
MARC Annie, Directrice de Recherche CNRS, Laboratoire Ractions et Gnie des Procds, UMR CNRS 7274, ENSAIA,
Vanduvre-ls-Nancy.
MARIE Pierre, Directeur de Recherche CNRS, Inserm UMR 1132 et Universit Paris-Diderot, Sorbonne Paris-Cit, Hpital
Lariboisire, Paris.
MARTEL-FRACHET Vronique, Matre de Confrences, cole Pratique des Hautes tudes, Laboratoire Cancer Cycle cellulaire
et Snescence (CaCyS), FRE AGIM 3405 UJF-CNRS-EPHE, Grenoble.
MAYNADI Marc, Professeur des Universits, Praticien Hospitalier, Service dHmatologie Biologique, Centre Hospitalier
Universitaire de Dijon et Universit de Bourgogne, Dijon.
MAYOL Jean-Franois, Chief Scientific Officier, TransCure bioServices SAS, Biopark, Archamps Technople.
MODROWSKI Dominique, Charge de Recherche Inserm, Inserm UMR 1132 et Universit Paris-Diderot, Sorbonne Paris-Cit,
Hpital Lariboisire, Paris.
MOULY Vincent, Directeur de Recherche CNRS, Centre de Recherche en Myologie, UMRS 974 UPMC, Inserm, FRE 3617
CNRS-AIM, Groupe Hospitalier Piti-Salptrire, Paris.
MOURAH Samia, Praticien Hospitalier, Service de Pharmacologie, Laboratoire de Pharmacologie-Gntique, Inserm UMRS
940, Hpital Saint-Louis, Paris.
NEGRONI Elisa, Post-doctorante, Centre de Recherche en Myologie, UMRS 974 UPMC, Inserm, FRE 3617 CNRS-AIM, Groupe
Hospitalier Piti-Salptrire, Paris.
NEUNLIST Michel, Directeur de Recherche Inserm, Institut des Maladies de lAppareil Digestif, Inserm U913, Centre Hospitalier
Universitaire Htel-Dieu, Nantes.

LISTE DES COLLABORATEURS

VII

OLMOS Eric, Matre de Confrences, Laboratoire Ractions et Gnie des Procds, UMR CNRS 7274, ENSAIA 7274, Vanduvrels-Nancy.
OUDAR Olivier, Professeur des Universits, Inserm U698, Unit 1148 LVTS, Universit Paris 13, Paris.
PAGS Gilles, Directeur de Recherche, Institut Cancer et Vieillissement de Nice (IRCAN) UMR CNRS 7284/U Inserm 1081,
Centre Antoine Lacassagne, Universit de Nice-Sophia Antipolis, Nice.
PAIN Bertrand, Directeur de Recherche, Inserm U846, USC 1361, INRA, Bron.
PALDI Andras, Professeur des Universits, UMR Inserm U951 Immunologie Molculaire et Biothrapies Innovantes,
Gnthon, Universit dvry-Val dEssonnes, cole Pratique des Hautes tudes, vry.
PELISSIER-ROTA Marjolaine, Doctorante, Inserm U836, Institut des Neurosciences, Grenoble.
PIERRES Anne, Directrice de Recherche, Laboratoire Adhsion Cellulaire et Inflammation, Inserm UMR1067, CNRS UMR
7333, Universit Aix-Marseille, Marseille.
POMMIER Roxane, Doctorante, UMR Inserm 1052, CNRS 5286, Universit Lyon 1, Centre de Recherche en Cancrologie de
Lyon, Centre Lon Brard, Lyon.
PRULIRE-ESCABASSE Virginie, Matre de Confrences des Universits, Praticien Hospitalier, Service dORL et de Chirurgie
Cervico-Faciale, Centre Hospitalier Intercommunal de Crteil ; Inserm U955, Institut Mondor de Recherche
Biomdicale, Crteil.
PUEL Jean-Luc, Professeur des Universits, Institut des Neurosciences de Montpellier, Inserm U1051, Montpellier.
QUIGNOT Nadia, Chercheur Chef de Projets scientifiques, LA-SER Analytica, Strategy & Decision Analytics, Paris.
ROBIN Marie-Anne, Directrice de Recherche, Inserm U991 Foie, Mtabolisme et Cancer, Universit de Rennes 1, Rennes.
ROCHAIS Francesca, Charge de Recherche Inserm, IBDM UMR 7288, Marseille.
ROCHET Nathalie, Charge de Recherche Inserm, FRE 3502 CNRS, Universit de Nice, Facult de Mdecine, Nice.
ROLLI-DERKINDEREN Malvyne, Charge de Recherche, Institut des Maladies de lAppareil Digestif, Inserm U913, Centre
Hospitalier Universitaire Htel-Dieu, Nantes.
RONOT Xavier, Directeur dtudes, cole Pratique des Hautes tudes, Laboratoire Cancer Cycle cellulaire et Snescence
(CaCyS), FRE AGIM 3405 UJF-CNRS-EPHE, Grenoble.
ROUILLER-FABRE Virginie, Professeure des Universits, UMR Inserm U967-CEA, Universit Paris-Diderot, Sorbonne ParisCit, Laboratoire de dveloppement des Gonades, Centre CEA, Fontenay-aux-Roses.
SALASC Fanny, Doctorante, Laboratoire de Pathologie Compare des Invertbrs, cole Pratique des Hautes tudes, UMR1333
INRA - DGIMI, Universit Montpellier 2, Montpellier.
SEN Sylvain, Professeur des Universits, CNRS, LIF, UMR7279, Universit dAix-Marseille, Marseille ; Institut Rhne-alpin
des systmes complexes, IXXI, Lyon.
SILBERZAN Pascal, Directeur de Recherche, Laboratoire Physico-chimie Curie, UMR 168, Institut Curie, Centre de Recherche
CNRS UPMC, Paris.
STOCKHOLM Daniel, Matre de Confrences, UMR Inserm U951 Immunologie Molculaire et Biothrapies Innovantes,
Gnthon, Universit dvry-Val dEssonnes, cole Pratique des Hautes tudes, vry.
SUPIRAMANIAN-THURAISAMY Ajitha, Post-doctorante, Laboratoire CRRET, Universit Paris-Est Crteil.
TALARMIN Hlne, Matre de Confrences des Universits, Laboratoire de Physiologie, IUT Gnie biologique, Facult de
Mdecine, Brest.
THEPOT Amlie, Chef de Projet R&D, Laboratoire des Substituts Cutans, Banque de Tissus et Cellules, Hpital douard
Herriot, Lyon.
VALCOURT Ulrich, Matre de Confrences, UMR Inserm 1052, CNRS 5286, Universit Lyon 1, Centre de Recherche en
Cancrologie de Lyon, Centre Lon Brard, Lyon.
VALLESE Denis, Doctorant, Centre de Recherche en Myologie, UMRS 974 UPMC, Inserm, FRE 3617 CNRS-AIM, Groupe
Hospitalier Piti-Salptrire, Paris.
VENAIL Frederic, Praticien Hospitalier Universitaire, Institut des Neurosciences de Montpellier, Inserm U1051 ; Service ORL,
Centre Hospitalier Universitaire Gui-de-Chauliac, Montpellier.

VIII

LISTE DES COLLABORATEURS

VIGOUROUX Clotilde, Pharmacienne, Banque de Tissus et Cellules, Hpital douard Herriot, UMR5305, IBCP, Lyon.
VINCENT David, Post-doctorant, Beatson Institute for Cancer Research, Wnt signaling and Colorectal Cancer, Glasgow,
Royaume-Uni.
VITTET Daniel, Charg de Recherche Inserm, Laboratoire Biologie du Cancer et de lInfection, Unit Mixte Inserm-CEA-UJF
U1036, Institut de Recherches en Technologies et Sciences pour le Vivant, CEA-Grenoble, Universit Joseph Fourier,
Grenoble.

LISTE DES COLLABORATEURS

IX

Sommaire

Liste des collaborateurs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Prface M. ADOLPHE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

XXV

Avant-propos G. BARLOVATZ-MEIMON, X. RONOT . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . XXVII

Liste des abrviations . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . XXIX
Chapitre 1.

Origine de la culture de cellules

I. FRESHNEY . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

PARTIE I
BIOLOGIE ET ENVIRONNEMENT DES CELLULES EN CULTURE
Chapitre 2. Adhsion cellulaire A. PIERRES, P. BONGRAND . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Les interactions adhsives rgulent la quasi-totalit des fonctions cellulaires . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Le comportement des cellules adhrentes dpend trs significativement des proprits physiques du substrat . .
Ladhsion cellulaire repose essentiellement sur de trs nombreux rcepteurs membranaires spcialiss . . . . .

Mthodes dtude de ladhsion cellulaire : aspects gnraux. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Proprits mcaniques et/ou cintiques de ladhsion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
tude morphologique de ladhsion cellulaire . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Rgulation de ladhsion cellulaire . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Rgulation de la rpulsion strique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Rgulation de lexpression des rcepteurs dadhsion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Rgulation fonctionnelle des rcepteurs dadhsion : modifications conformationnelles. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Microagrgation (clustering) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Localisation des rcepteurs sur les extrmits des protrusions membranaires . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Modification de linteraction des rcepteurs dadhsion avec le cytosquelette dactine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Contrle du dtachement des cellules adhrentes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Modifications conformationnelles . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Rupture mcanique des liaisons . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Diminution de la rigidit membranaire . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Protolyse de molcules impliques dans ladhsion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Insertion dlments rpulsifs dans la zone dadhsion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Comment ladhsion un substrat peut-elle modifier le comportement cellulaire ? . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Signaux engendrs par loccupation des rcepteurs dadhsion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Regroupement de quelques molcules susceptibles dinteragir pour produire un signal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

13
13
13
14
15
17
17
20
24
24
24
24
24
25
25
25
25
26
26
26
26
26
26
27

XI

Gnration de forces et mcanotransduction linterface cellule-substrat. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Contrle de lorganisation du cytosquelette . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Importance de ltalement : effet de la forme sur le comportement cellulaire . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

27
28
28

Conclusion. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

29

Chapitre 3. Variabilit non gntique dans les cultures cellulaires G. CORRE, D. STOCKHOLM, A. PALDI . . .

33

Historique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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Cellule unique et population cellulaire. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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Fluctuations dorigine interne . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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Bruit molculaire : la loi des petits nombres . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Bruit structural : compartimentation subcellulaire et dynamique chromatinienne . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Stochasticit expression gnique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Fluctuations dorigine externe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Milieu nutritif et mtabolisme cellulaire. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Organisation spatiale des cellules in vitro . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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40
40

Variations lies aux manipulations exprimentales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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Matriser les fluctuations. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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Conclusion. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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Chapitre 4.

Aspects physiques des comportements collectifs pithliaux

O. COCHET-ESCARTIN,
P. SILBERZAN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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Structure et rgulation du tissu pithlial . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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Mouvements collectifs de tissus in vivo. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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tude de mouvements collectifs de tissus in vitro . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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Techniques exprimentales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Particularits du mouvement collectif. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Polarisation du mouvement collectif . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

tudes thoriques de la migration collective . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Modles continus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Modles discrets . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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55

Conclusion. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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Chapitre 5. Dfis de la culture de cellules animales en bioracteur A. MARC, E. GUEDON,

E. OLMOS, F. BLANCHARD, I. CHEVALOT . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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Principaux racteurs en mode agit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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Diffrents modes dalimentation du milieu de culture . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Systmes de culture placs en incubateur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Bioracteurs contrls . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Influence de lenvironnement cellulaire . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Du milieu avec srum jusquau milieu chimiquement dfini . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Mthodes de criblage de la formulation du milieu de culture. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
lments nutritifs solubles . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Gaz dissous. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Paramtres physicochimiques. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Culture des cellules sur microporteurs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Diffrents types de supports . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Principaux paramtres opratoires . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Expansion cellulaire en systme de culture agit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Analyses et rgulations en ligne sur le bioracteur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Mesure et rgulation de la temprature . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Mesure et rgulation de la concentration en oxygne dissous . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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Mesure et rgulation de la concentration en dioxyde de carbone dissous. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Mesure et rgulation du pH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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Nouveaux outils danalyse en ligne . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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Analyse des cellules . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Analyse des composs solubles. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Chapitre 6. Sphrodes

O. OUDAR. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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Dfinition, historique, intrts, avantages. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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Obtention, caractrisation des sphrodes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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Protocoles . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Formation des sphrodes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Transfert et culture cellulaire. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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75
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Conclusion. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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Chapitre 7.

Dynamique du microenvironnement cellulaire A. SUPIRAMANIAN, A. CARTIER-MICHAUD,

C. CHARRIRE-BERTRAND, M. MALO, G. BARLOVATZ-MEIMON . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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De la matrice extracellulaire au microenvironnement . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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Le microenvironnement volue avec le dialogue cellules/matrice . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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83
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Le matrisome humain . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
La matrice extracellulaire, une combinatoire aux rles pliotropiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Un acteur exemplaire du dialogue cellule/matrice, la fibronectine. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
La dynamique du microenvironnement constitue un systme complexe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Une dynamique particulire : le microenvironnement tumoral . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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Exploration de toutes ses facettes. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Les nouveaux venus du microenvironnement : exosomes, microvsicules et autres dbris cellulaires . . . . . .
Lexemple de PAI-1, frein ou promoteur de la migration cellulaire et acteur direct de la transition
msenchymo-amaebode (MAT). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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Conclusion. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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Annexes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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Chapitre 8. Bonnes pratiques de culture cellulaire

S. CURTET-BENITSKI, A.-L. FILIPUTTI-GILQUIN . . . . . . . . .

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Matires premires . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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Cellules . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Milieux, additifs et ractifs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Consommables . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Matriels . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Postes de scurit microbiologique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Incubateurs CO2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Centrifugeuses . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Autres quipements . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Main-duvre . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Formation du personnel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Hygine et scurit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Milieu : le laboratoire de culture cellulaire . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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Niveaux de scurit biologique et organisation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Dsinfection des locaux . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
vacuation des dchets . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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124
124

Mthodes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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Conclusion. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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Annexe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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SOMMAIRE

XIII

Chapitre 9. Cryoprservation des cellules

X. RONOT, M. KADRI, V. MARTEL-FRACHET . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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Aspects physicochimiques de la formation des cristaux . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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Effets biophysiques de la formation de glace . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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129
129
129
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Dshydratation cellulaire . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Stress mcanique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Cristallisation intracellulaire . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Choc thermique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Effets biologiques de la formation de glace . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Agents cryoprotecteurs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Conditions de conglation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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Matriel cellulaire . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Identification des cryotubes pour larchivage . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Dispositifs de conglation. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Cryoconservateurs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Conglation 80 C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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132
132
132
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Dconglation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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Hygine et scurit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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Conglation sans srum . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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Conservation de courte dure . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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Transport des cellules . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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Conclusion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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Annexe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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PARTIE II
TECHNIQUES ET MTHODES
Chapitre 10.

Viabilit, cytotoxicit, gnotoxicit

A. BAEZA-SQUIBAN, K. ANDRAU . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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Mthodes dtude de la viabilit cellulaire . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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140
140

Approches morphologiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Mthodes de quantification de la viabilit cellulaire . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Quantification des cellules mortes par la perte dintgrit de la membrane plasmique . . . . . . . . . . . . . . . .

Mthodes utilisant lexclusion de colorants vitaux. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Mthodes utilisant la libration denzymes intracellulaires. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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143
143

Dtection couple des cellules mortes et des cellules vivantes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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Cytotoxicit : tude spcifique des diffrentes voies de mort cellulaire. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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144
144
149
149

Classification des diffrents types de mort cellulaire. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Dtection et mesure spcifique de lapoptose. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Dtection et mesure spcifique de la ncrose rgule. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Dtection et mesure spcifique de lautophagie. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Mthodes dtude de la prolifration cellulaire . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Dnombrement des cellules . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Quantification des acides nucliques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Incorporation dun prcurseur de lADN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Mesure de limpdance lectrique cellulaire . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
tude du cycle cellulaire . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

149
149
149
150
150
150

Mthodes dtude de la gnotoxicit : le test des comtes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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Conclusion. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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XIV

SOMMAIRE

Chapitre 11. Apport de la cytomtrie en flux la culture cellulaire J.-F. MAYOL. . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Principe de la cytomtrie en flux . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Rseau fluidique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Systme optique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Interface informatique. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Diffrents types de marquages . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Anticorps. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Sondes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Transfection . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Compensations de fluorescence . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Interprtation des rsultats . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Rgions et conditionnement des graphes. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Pourcentages . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Valeurs absolues . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Intensits de fluorescence . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Applications . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Caractrisation phnotypique de sous-populations prsentes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Mesure dune intensit de fluorescence . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
tude de la viabilit, de la mort cellulaire . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Cycle cellulaire et prolifration . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Fonctions cellulaires . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Cellules souches . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Biologie vgtale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Microbiologie, virologie. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Tri cellulaire . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Nouveaux dveloppements . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Chapitre 12. Imagerie cellulaire J.-P. KLEMAN, D. GRUNWALD . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Prservation du vivant . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Conditions de culture et maintien de lhomostasie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Maintien de la temprature . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Milieux de culture spcifiques, maintien du pH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Stress radiatifs, stress oxydatifs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Microscopes pour lobservation des cellules vivantes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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Principes gnraux de la microscopie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Microscopie optique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Microscopie de fluorescence . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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170
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Dpasser les limites techniques de la rsolution optique. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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Chapitre 13. Transfert de gnes dans les cellules en culture P. LOYER . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Dfinitions et historique du transfert de gnes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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Transfert horizontal de gnes : le modle bactrien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Captation dADN par les cellules deucaryotes en culture . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Transfection dADN par des molcules polyanioniques : lipofection et polyfection . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Transfection par procds physiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Transfert de gnes par infection virale : la transduction. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Plasmides et gnomes viraux modifis pour le transfert de gnes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Transfection, transduction, oligonuclotides antisens et ARN interfrence . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Applications du transfert dacides nucliques dans les cellules en culture . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

tudes de la fonction des gnes et des protines . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
tablissement de lignes cellulaires recombinantes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Thrapie gnique ex vivo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Choix mthodologique du transfert de gnes : quels outils pour quelles applications ? . . . . . . . . . . . . . . . .

tudes de squences rgulatrices de la transcription et de la maturation des ARN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

SOMMAIRE

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190
191
191
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193
195
195
196
202
205
205
206

XV

Localisation subcellulaire de protines et identification de leurs partenaires. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Impact de la surexpression accrue et de lextinction de gnes sur les cellules en culture . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
tablissement de lignes cellulaires recombinantes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Chapitre 14. Mthodes informatiques en biologie

206
207
208

G. BARLOVATZ-MEIMON, S. SEN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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Vision globale de la bio-informatique actuelle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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218
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221
223
224

Bio-informatique des squences. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Bio-informatique des structures . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Bio-informatique des rseaux . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Traitement de linformation. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Une application traditionnelle : la phylognie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Rseaux et modlisation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Modlisation thorique : le cas des rseaux dautomates. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Modlisation applique. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

225
226
230

Conclusion. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

232

Annexes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

235

PARTIE III
PHARMACOTOXICOLOGIE IN VITRO
Chapitre 15.

Voies de signalisation majeures impliques dans la survie et la prolifration

cellulaire M. GUYOT, G. PAGS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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Gnralits sur le fonctionnement du couple ligands/rcepteurs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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Diffrents modes de transmission du signal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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Rcepteurs membranaires majeurs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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Rcepteurs activit tyrosine kinase . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Rcepteurs coupls aux protines G . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Rcepteurs des cytokines coupls la kinase JAK . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Rcepteurs du Transforming Growth Factor (TGF) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Voies de signalisation principales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Voie de lAMP cyclique (AMPc) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Voie de la phospholipase C (PLC). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Voie de la phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Voies des Mitogen Activated Protein Kinases (MAPK) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Modifications pathologiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Convergence, divergence et interfrence entre les diffrentes voies de signalisation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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Conclusion. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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Chapitre 16.

De la cible la molcule

S. MOURAH, F. CALVO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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Angiogense tumorale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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Mcanisme de langiogense tumorale. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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Switch angiognique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Processus de langiogense tumorale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Les facteurs VEGF et leurs rcepteurs (VEGFR) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

VEGF (VEGF-A) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Rcepteurs des VEGF . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Activits biologiques du systme VEGF/VEGFR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Les anti-angiogniques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Objectifs de la thrapie anti-VEGF . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Bevacizumab (Avastin) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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PARTIE IV
SYSTMES INTGRS ET CULTURES SPCIALISES
Chapitre 17. Cellules souches . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Cellules souches et cellules souches embryonnaires B. PAIN. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Totipotence et clonage . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Pluripotence et cellules souches embryonnaires . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Conclusion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

La niche des cellules souches : enjeux conceptuels et technologiques pour ltude des mcanismes
normaux et tumoraux V. MAGUER-SATTA, N. ROCHET . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Concepts et problmatiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Exemple de modlisation de la niche osseuse en culture 3D au sein dun biomatriau . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Conclusion gnrale et perspectives . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Chapitre 18.

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Ingnierie de la corne : vers des modles de plus en plus complexes

C. VIGOUROUX, O. DAMOUR, D. ABERDAM, C. AUXENFANS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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Modles 3D . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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pithlium pluristratifi sans stroma . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

pithlium avec stroma (hmi-corne) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Corne reconstruite complte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Sources potentielles de cellules capables de se diffrencier en cellules pithliales de corne humaine . . .

Cellules souches embryonnaires humaines (hESC) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPS) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

La peau reconstruite : un outil dtude de pharmacotoxicologie et de cration

dun modle in vitro M. DOS SANTOS, A. THEPOT, O. DAMOUR, C. AUXENFANS . . . . . . . . . . . . . . . . . .
De la peau humaine aux quivalents cutans : motivations ayant suscit leur dveloppement . . . . . . . .
Modles simples dvelopps pour les tests dinnocuit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Modles tridimensionnels et tests defficacit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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Chapitre 19.

Peaux reconstruites dans les matrices dorigine humaine ou animale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Peaux reconstruites dans une matrice biologique dorigine biosynthtique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Cration de modle in vitro : exemple du vieillissement . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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Modifications chimiques du support. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Modifications biologiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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Conclusion. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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Chapitre 20. Culture de cellules nerveuses J. BROCARD, S. FRABOULET . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Cultures primaires de cellules nerveuses . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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Phylognie des cellules nerveuses . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Neurones du systme nerveux central. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Neurones granulaires du cervelet : un modle de migration. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Autres cellules nerveuses en culture . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Lignes cellulaires. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Diffrenciation de cellules souches . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Cas des cellules humaines . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Modifications de cultures matures . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Substrats et supports . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Transfection/infection. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Protocoles . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Considrations gnrales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Culture de ganglions spinaux de poulet . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Culture de neurones hippocampiques ou corticaux . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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XVII

Culture de neurones granulaires de cervelet . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Co-cultures partir de neurosphres . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Transfection au phosphate de calcium . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Chapitre 21.

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Muscle squelettique : structure, origine et techniques de culture cellulaire

F. EDOM-VOVARD, D. VALLESE, E. NEGRONI, V. MOULY . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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Structure et origine du muscle squelettique. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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Structure du muscle squelettique adulte : les fibres musculaires. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Origine du muscle squelettique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Cellules satellites. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Technique de culture cellulaire . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Complexit de lorgane . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Pourquoi utiliser les cultures de cellules ? . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Cultures primaires . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Lignes et immortalisation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Fibres isoles . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Culture en trois dimensions (3D) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Chapitre 22. Cellules cardiaques

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F. ROCHAIS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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Structure et fonction du cur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Dveloppement du cur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Cellule cardiaque . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Cultures de cellules cardiaques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Quelques rappels historiques. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Isolement et culture primaire de cellules cardiaques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Lignes cellulaires tablies . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Cardiomyocytes issus de cellules souches pluripotentes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Cultures de modles complexes. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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Culture dexplants. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Ingnierie tissulaire . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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344
344

Conclusion. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

344

Chapitre 23.

Culture de cellules endothliales : applications ltude de langiogense

D. VITTET, S. BROUILLET, P. HOFFMANN, N. ALFAIDY, J.-J. FEIGE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

347

Fonctions et proprits physiologiques de lendothlium vasculaire . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

347

Angiogense . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

348

Caractrisation des cellules endothliales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

348
348
349

Morphologie. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Marqueurs cellulaires . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Protocoles de prparations de cultures cellulaires endothliales (mthodes disolement) . . . . . . . . . . . . . .

Cellules macrovasculaires. Exemple des cellules endothliales humaines de la veine ombilicale (HUVEC). . . . .
Cellules microvasculaires. Exemple des cellules endothliales humaines placentaires (HPEC). . . . . . . . . . . . . . . .
Prparations commerciales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Intrt des cultures de cellules endothliales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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353

Modles 2D (bidimensionnels) dangiogense . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Modles 3D (tridimensionnels) dangiogense . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

353
353
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Perspectives futures des cultures de cellules endothliales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

357

Chapitre 24. Culture de cellules ostoblastiques

P. MARIE, D. MODROWSKI, O. FROMIGU . . . . . . . . . . . . . . .

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Origine et diffrenciation des ostoblastes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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Obtention de cellules ostoblastiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

361
361

Cellules provenant du stroma mdullaire. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

XVIII

SOMMAIRE

Cellules drives de los . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Autres sources de cellules de type ostoblastique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Ostocytes. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Lignes cellulaires. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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362
362
362

Utilisation des cellules ostoblastiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

363
363
364

tudes phnotypiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
tudes phnotypiques ex vivo. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Applications thrapeutiques des cellules ostoblastiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Analyse transcriptomique et protomique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Thrapie cellulaire et gnique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

366
366
366

Conclusions et perspectives. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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Chapitre 25. Systme hmatopotique

M. MAYNADI, F. GIRODON . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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Hmatopose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

372
372
372
374
375

Localisation de lhmatopose. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Cellules de lhmatopose. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Microenvironnement ou stroma mdullaire . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Facteurs rgulateurs de lhmatopose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Cultures de cellules hmatopotiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Cultures et rythropose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Techniques de cultures . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Les diffrents types de cellules cultivables . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Exemples dapplication des cultures cellulaires . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Chapitre 26.

377
377
377
378
378

Hpatocytes et foie : modles de rfrence et nouvelles approches stratgiques

M.-A. ROBIN, C. GUGUEN-GUILLOUZO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

382

Cultures primaires dhpatocytes issus de parenchyme hpatique adulte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

383
383
384
385

Ncessit de dstructurer le tissu par digestion enzymatique : principe et bilan fonctionnel . . . . . . . . . . . . . . . . .

Cultures primaires en monocouche (2D) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Modulation fonctionnelle par les facteurs environnementaux . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Obtention et diffrenciation dhpatocytes partir de cellules souches . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Cellules souches dorigine tissulaire adulte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Cellules souches embryonnaires (ESC) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Lignes cellulaires immortalises et/ou transformes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Lignes dhpatomes issues de tumeurs. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Ligne humaine HepaRG . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Lignes dhpatocytes immortalises . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Innovations technologiques. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Dveloppement de microsystmes ou puces cellules . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Cultures tridimensionnelles (3D) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Structuration de bioracteurs avec fluidique associe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Applications des modles hpatiques in vitro . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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390
390
393
393
394
397
397
397
398
398

tude des fonctions hpatiques et de leur rgulation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

tude du mtabolisme et de la toxicit des xnobiotiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Applications thrapeutiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

398
398
399
402

. DUCAROUGE, M. PELISSIER-ROTA, M. ROLLI-DERKINDEREN, B. LARDEUX,

M. LAIN, M. NEUNLIST, M. JACQUIER-SARLIN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

409

Gnralits sur le systme digestif . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

409

Principales populations cellulaires de lpithlium digestif . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Cellules souches et organodes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Cellules prolifratives des cryptes (cellules non transformes). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Cellules pithliales intestinales immortalises . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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414
416
418

SOMMAIRE

XIX

Chapitre 27. Systme intestinal

Cellules diffrencies drives des villosits intestinales (cellules non transformes) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Lignes dadnocarcinomes : modles de la diffrenciation pithliale. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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420

Rgulation des fonctions de la barrire pithliale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Par le msenchyme et la matrice extracellulaire. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Par le systme nerveux entrique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

426
426
433

Conclusion. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

440

Chapitre 28. Cultures de cellules rnales

B. LAZOU, J. CAMBAR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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Rappels . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

448
448
451

Structure et fonctions du rein . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Cibles des principaux xnobiotiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Techniques des cultures cellulaires rnales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Modles rnaux in vitro complexes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Diffrents types de cultures de cellules . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Cultures de cellules glomrulaires . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Cultures de cellules vasculaires corticales rnales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Cultures de cellules tubulaires. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

454
454
456
456
461
462

Cultures et complexification des modles . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

467

Conclusion. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

469

Chapitre 29. Culture de cellules pithliales respiratoires

V. PRULIRE-ESCABASSE, J. BOURBON . . . . . . . . .

476

Organisation et fonctions des pithliums du tractus respiratoire chez les mammifres . . . . . . . . . . . . . . .

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476
479
485

Description morphologique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Fonctions de lpithlium mucociliaire des voies de conduction. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Fonctions de lpithlium alvolaire . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Modles de culture primaire des cellules pithliales des voies ariennes de conduction . . . . . . . . . . . . . .
Culture dexplants. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Culture de cellules dissocies . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
pithlium respiratoire humain reconstitu en xnogreffe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Modles de culture primaire des cellules pithliales alvolaires. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Isolement et purification. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Maintien des pneumocytes en culture primaire : milieux et supports de culture . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Lignes cellulaires pithliales respiratoires . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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487
487
489
489
489
490

Lignes exprimant un phnotype cellulaire des voies de conduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Lignes exprimant un phnotype cellulaire alvolaire . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

493
494
495

Drivation in vitro de cellules pithliales respiratoires partir de cellules souches . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

496

Applications des cultures de cellules pithliales respiratoires . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

497

Chapitre 30.

Culture cellulaire de testicule et dovaire pour ltude de la fonction

de reproduction P. FROMENT, N. QUIGNOT, A. LEGENDRE, V. ROUILLER-FABRE, G. LIVERA,
J. DUPONT, R. HABERT, E. LEMAZURIER . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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Fonction de reproduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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Fonction testiculaire . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Fonction ovarienne . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Dveloppement des gonades . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Cultures cellulaires testiculaires . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Modles dtudes fondamentales in vitro . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Protocoles de culture de cellules testiculaires . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Cultures cellulaires ovariennes. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Modles cellulaires . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Protocoles de culture de cellules ovariennes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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SOMMAIRE

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Chapitre 31.

Culture primaire de cellules pancratiques exocrines de souris.

Un outil indispensable pour la comprhension de ltiologie de la carcinogense
pancratique U. VALCOURT, R. M. POMMIER, D. F. VINCENT, L. BARTHOLIN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Biologie du pancras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Culture des cellules acineuses disperses ou dacini disperss . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Isolement et culture dacini disperss . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Considrations gnrales et prcautions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Protocole . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Analyse du phnotype des cellules pancratiques primaires . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Extraction des protines . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Extraction des acides ribonucliques messagers . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Analyse du phnotype des cellules. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Protocoles complmentaires disolement et de culture des cellules acineuses pancratiques . . . . . . . . . .

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Concentration en acides amins. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Importance du pH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Mthode de Sphyris et al. (2005) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Mthode de Bluer et al. (2011) : culture organotypique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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Conclusion. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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Chapitre 32.

Culture de cellules de loreille interne de mammifre : de la physiopathologie

la thrapie F. FRANOIS, S. GABOYARD-NIAY, J.-L. PUEL, F. VENAIL . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Cultures de cellules de cochle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Culture organotypique dexplant de cochle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Culture organotypique de tranche de cochle. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Applications des cultures organotypiques de cochle. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Cultures primaires de vestibule . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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Les diffrentes techniques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Applications . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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Conclusion. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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Chapitre 33.

Caractristiques molculaires et proprits fonctionnelles des cellules pithliales

mammaires A. DI-CICCO, M.-A. DEUGNIER . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Dveloppement de la glande mammaire . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Caractristiques molculaires des cellules pithliales mammaires . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Organisation et marqueurs spcifiques de lpithlium mammaire . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Fractionnement des cellules pithliales mammaires et analyse par cytomtrie en flux. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Interactions paracrines . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Proprits fonctionnelles des cellules pithliales mammaires . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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Potentiel rgnratif et clonognique des cellules basales/myopithliales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Activit clonognique des cellules luminales. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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Conclusion. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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Chapitre 34. Systme adipocytaire I. DUGAIL . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Fonction des adipocytes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Modles adipocytaires en culture . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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Pr-adipocytes de la fraction stroma-vasculaire du tissu adipeux . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Lignes adipocytaires. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Conditions de culture . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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Milieux de culture. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Exigences en srum . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Repiquages . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Induction de la diffrenciation, contrles de qualit. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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Transfert de gnes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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Intrt des cultures dadipocytes. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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PARTIE V
AUTRES MODLES
Chapitre 35.

Cultures primaires de cellules cardiaques de bivalves marins G. DORANGE, M. DROGUET,

H. TALARMIN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Espces cibles. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Choix du cur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Anatomie et structure du cur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Anatomie. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Structure . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Physiologie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Cultures primaires de cellules cardiaques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Prlvement du cur. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Isolement des cellules cardiaques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Conditions de culture . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
volution des cultures . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Croissance cellulaire . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Capacit fonctionnelle des cellules cardiaques en culture. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Essais de subculture . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Cryoprservation des cellules isoles . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Quelques exemples dapplication des cultures en toxicologie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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Effet de lacide okadaque sur les cellules cardiaques de palourde . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Effet du tributyltain sur des cardiomyocytes dhutre . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Effet du cadmium sur les cardiomyocytes dhutre . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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Conclusion. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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Chapitre 36.

Cultures primaires de branchies et de muscles de truite arc-en-ciel

I. LEGUEN,
J.-C. GABILLARD . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Conditions de culture cellulaire pour poissons tlostens . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Culture primaire de branchies de truite . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Isolement des cellules branchiales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Culture sur support solide . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Culture sur support permable . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Culture primaire de cellules satellites de truite. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Mthode dextraction des cellules satellites de truite . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Caractrisation des cellules satellites en culture. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Enjeux fondamentaux et biotechnologiques de la culture des cellules

darthropodes F. COUSSERANS, Y. BOUBLIK, F. SALASC, M. CERUTTI, T. DUPRESSOIR . . . . . . . . . . . . . . . .
Pourquoi cultiver des cellules darthropodes ? . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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Chapitre 37.

Gnomique structurale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Gnomique fonctionnelle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Modles animaux . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

La culture de cellules darthropodes existe depuis le dbut du 20e sicle. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Culture de cellules darthropodes et agents infectieux . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Monte en puissance des cultures de cellules darthropodes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Spcificits techniques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

XXII

SOMMAIRE

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Production de protines htrologues et/ou recombinantes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Les diffrents systmes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Humanisation des systmes de production de protines recombinantes en cellules dinsecte . . . . . .

Glycosylation dans les cellules dinsecte. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Humanisation de la voie de biosynthse des N-glycanes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Perspectives . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Production de particules virales. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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Vaccins . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Vecteurs. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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Conclusion. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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PARTIE VI
LGISLATION
Chapitre 38. Aspects thiques et rglementaires de lutilisation des cellules, tissus et produits du
corps humain : applications aux tudes in vitro I. FABRE, A. DE GUERRA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Lgislation : historique des lois relatives la biothique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Les premires lois de biothique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Sanctions en cas dinfractions en matire dthique mdicale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Organes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Prlvements fins scientifiques sur personnes dcdes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Tissus, cellules, produits du corps humain et drivs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Dispositions communes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Prlvement et collecte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Autorisation des tablissements effectuant les prlvements . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Prparation, conservation et utilisation des tissus, des cellules et de leurs drivs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Recherche sur lembryon et les cellules souches embryonnaires . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Autres modles cellulaires prospectifs issus dlments du corps humain : un cadre lgislatif
moins contraignant . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Cellules souches adultes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Cellules souches pluripotentes induites . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Textes relatifs limportation et lexportation dorganes, de tissus et de cellules du corps humain. . .

Pour les organes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Pour les tissus, cellules . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Brevetabilit des lments du corps humain et de ses drivs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Directive europenne relative la protection juridique des inventions biotechnologiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Encadrement juridique communautaire et international dans les diffrents domaines

de la biothique. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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Droit communautaire . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Droit international . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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Conclusion. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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Postface Considrations thiques sur lusage futur des cultures cellulaires

J. DEMONGEOT . . . . . . . . .

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Index . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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SOMMAIRE

XXIII

Apport de la cytomtrie
en flux la culture
cellulaire

11

J.-F. MAYOL

Principe de la cytomtrie en flux

Systme optique

La cytomtrie en flux (CMF) est une technique permettant la mesure (-mtrie) des proprits optiques de cellules (cyto-) transportes par un liquide vecteur (flux). La
CMF permet deffectuer une analyse multiparamtrique de
cellules individualises, en suspension, grce au passage de
ces cellules devant un laser rvlant leurs proprits de diffusion et de rfraction lumineuse ainsi que dmission de
fluorescence. Lobjectif de cette technique est de caractriser une ou plusieurs sous-populations cellulaires et den
dterminer la proportionnalit par rapport une population parente ou le nombre absolu.
La cytomtrie en flux repose sur diffrents lments :
un systme fluidique, un systme optique, et une interface
informatique, bien sr, sans oublier les cellules qui doivent
tre en suspension monodisperse et qui auront fait lobjet
dun marquage.

Le systme optique dun appareil de cytomtrie est

compos de deux parties, charges respectivement de
lexcitation des cellules et de la collecte des signaux lumineux. Les lasers sont utiliss dans la trs grande majorit
des appareils de cytomtrie. Ils offrent plusieurs avantages
pour leur utilisation comme source dexcitation : (i) leur
longueur donde dmission est trs troite (une seule
valeur de longueur donde), (ii) leur puissance permet une
trs bonne excitation des fluorochromes (de 10 100 mW),
et (iii) la cohrence du faisceau lumineux permet de perdre
trs peu dnergie lumineuse lors du trajet qui conduit les
photons de la sortie du tube laser au point dintersection
avec la veine liquide et les cellules. Les appareils de cytomtrie sont gnralement quips dun trois lasers, mais
certains appareils peuvent comporter jusqu sept lasers
afin daugmenter encore la quantit de fluorochromes analysables simultanment. Le laser va intercepter les cellules
dans une cellule en quartz dont lindice de rfraction est
proche de celui du liquide contenant lchantillon afin de
limiter la dispersion du signal lumineux.
Linterception de la veine liquide contenant les cellules analyser par le laser est lorigine de lmission
de photons de fluorescence ou de diffusion. Ces photons
peuvent avoir des longueurs donde trs diverses en fonction des fluorochromes par lesquels ils sont mis. La deuxime partie de loptique de lappareil de cytomtrie en flux
a pour fonction de collecter ces photons et de les sparer
selon leur longueur donde. Ce constituant du cytomtre
est le banc optique (figure 11-2). Il est form de diffrents
composants (cits par ordre dinteraction avec le signal
lumineux) :
une lentille de collection recueillant une partie
de la lumire mise au point dinterception avec le laser.
Dans certains cas, cette lentille de collection va amener les

Systme fluidique
Afin que les cellules soient analyses individuellement, la suspension monodisperse chaotique doit tre
transforme en un dfilement ordonn de cellules. Cette
tape se produit grce au phnomne dhydrofocalisation
grce auquel la suspension cellulaire est enrobe par un
liquide de gaine circulant une vitesse suprieure et qui
va tirer la suspension cellulaire jusqu ce que les cellules
salignent les unes derrire les autres (figure 11-1). Les
rgulations des vitesses du liquide de gaine et du liquide
chantillon se font grce au contrle des pressions dair
appliques sur ces liquides. Lutilisateur a la possibilit de
faire varier la pression sur le liquide chantillon, ce qui permet de moduler le dbit danalyse de lchantillon en largissant ou en rtrcissant la veine liquide de lchantillon
au sein du liquide de gaine.

153

Figure 11-1 Phnomne

dhydrofocalisation permettant
lalignement des cellules les unes derrire
les autres et influence de la pression
applique sur le liquide chantillon sur la
qualit de lhydrofocalisation.

Figure 11-2 Reprsentation dun banc optique et des

diffrents lments qui le composent.

154

PARTIE II TECHNIQUES ET MTHODES

photons dans un rseau de fibres optiques conduisant le

signal lumineux vers le banc optique proprement dit. Dans
dautres cas, la lentille de collection est accole au banc
optique et la transmission du signal lumineux est directe ;
des miroirs dichroques segmentant le signal
lumineux en fonction de la longueur donde des photons
qui le composent. Cette segmentation a pour but de sparer les photons selon le fluorochrome qui les a mis. Ces
miroirs dichroques peuvent avoir plusieurs proprits :
soit ils laissent passer les photons dont la longueur donde
est infrieure une valeur donne, ils sont alors dits shortpass ou passe-bas (par exemple, 488SP), le reste des photons est alors rflchi dans une autre direction, soit ce sont
les photons de longueur donde plus leve qui passent,
le miroir dichroque est alors qualifi de long-pass ou
passe-haut (par exemple, 530LP) ;
des filtres passe-bande placs devant les photomultiplicateurs effectuant une ultime slection de la longueur donde des photons qui seront par la suite quantifis.
Ces filtres transmettent seulement une certaine largeur de
bande passante de longueurs donde ; les autres photons
sont alors absorbs par ce filtre. Par exemple, un filtre
BP515/30 laisse passer tous les photons dont la longueur
donde est comprise entre 500 et 530 nm ;
les photomultiplicateurs (PMT) permettant de
transformer les photons en lectrons, cest--dire transforment un signal lumineux en signal lectrique quantifiable.
Les PMT sont constitus dune dizaine de dynodes traverses par un courant de haut voltage. Linteraction des

lectrons avec cette succession de dynodes permet une

amplification du signal lectrique. Lorsque lutilisateur
rgle la sensibilit de dtection de lappareil, il joue sur les
voltages appliqus aux PMT. Le signal lectrique en sortie
de PMT est proportionnel la quantit de photons qui y
sont entrs. Ce signal lectrique est alors transmis vers linterface informatique de lappareil qui traite le signal.

Interface informatique
Lobjectif de ce paragraphe nest pas de rentrer dans
les dtails du traitement lectronique du signal. Toutefois,
il est important dvoquer le fait que les appareils de cytomtrie, tout comme les appareils photos, sont devenus
numriques depuis une dizaine dannes. Cette numrisation prcoce offre un grand nombre davantages. Le signal
brut, en sortie de PMT, est directement enregistr par le
systme informatique, les tapes de traitement de signal
comme le choix de lchelle (linaire ou logarithmique) ou
les compensations de fluorescence peuvent tre retouchs
en post-acquisition, alors que ce nest pas le cas pour les
appareils de gnration plus ancienne.

Diffrents types de marquages

La CMF permet de mettre en vidence des sous-populations cellulaires sur la base de marquages permettant
de discriminer plusieurs sous-types cellulaires entre eux.
Ces marquages rvlent un phnotype particulier qui peut
tre lexpression de certains antignes extracellulaires,
intracytoplasmiques, le contenu en ADN, la capacit de
dgrader ou dliminer certains colorants, lexpression de
protines fluorescentes, ou encore le degr de polarisation
mitochondriale.

Anticorps
Lutilisation danticorps coupls des fluorochromes
pour la dtection dantignes membranaires reprsente la
trs grande majorit des applications de la CMF. Un large
choix de ractifs est propos pour raliser des marquages
multicouleurs (tableau 11-I), et il est maintenant courant
de raliser des exprimentations avec six ractifs fluorescents simultanment. Cependant, il a t montr quil est

Tableau 11-I Principaux fluorochromes pouvant tre coupls des anticorps utiliss en cytomtrie en flux
Laser UV (350 nm)
Longueurs donde dmission
425-450 nm

Fluorochromes
Alexa-Fluor 350

Laser Violet (405 nm)

Longueurs donde dmission
420-460 nm

Fluorochromes
Pacific BlueTM, Alexa Fluor 405, Cascade Blue, eFluor 450, VioBlue, Brillant
Violet 421TM

500-550 nm

Alexa Fluor 430, AmCyan, VioGreenTM, Pacific OrangeTM, Qdot 655, Brillant Violet 510TM, Krome OrangeTM

> 560 nm

Brillant Violet 570TM, Brillant Violet 605TM, Brillant Violet 650TM, Brillant Violet
711TM, Brillant Violet 785TM

Laser Bleu (488 nm)

Longueurs donde dmission
510-545 nm

Fluorochromes
FITC, Alexa Fluor 488

560-590 nm

PE

600-650 nm

PE-Texas Red, PE-Alexa Fluor 610, Qdot 605

670-720 nm

PerCP, PE-Cy5, PerCP-Cy5.5, PE-Cy5.5, PE-Alexa Fluor 647, PerCP-eFluor 710,

PE-Dyomics 647, SpectralRedTM

> 750 nm

PE-Cy7, PE-Vio770TM

Laser Rouge (633-635 nm)

Longueurs donde dmission
640-680 nm

Fluorochromes
APC, Alexa Fluor 647, eFluor 660, Dyomics 647, DyLights 647, Cy5

> 730 nm

APC-Cy7, BDTM APC-H7, APC-eFluor 780, APC-Vio770TM, APC-AlexaFluor 750,

APC-Cy5.5

CHAPITRE 11

APPORT DE LA CYTOMTRIE EN FLUX LA CULTURE CELLULAIRE

155

possible de raliser des marquages avec 17 fluorochromes

diffrents (Perfetto et al., 2004).
Le marquage de cellules avec des anticorps doit tre
fait dans des conditions o la concentration danticorps est
en large excs par rapport la quantit dantigne dtecter. Les quantits de ractif prconises par les fournisseurs
assurent lutilisateur de se trouver dans ces conditions de
marquage. Toutefois, une concentration trop importante
danticorps peut tre lorigine dune augmentation du
bruit de fond. Il est recommand de raliser des titrages
danticorps afin de dterminer quelle est la concentration
de ractif qui permet davoir le meilleur rapport signal/
bruit dans des conditions de marquage prdfinies (type
cellulaire, concentration cellulaire, temprature et dure
dincubation). Cette tape peut trs souvent aussi tre la
source dconomies importantes pour le laboratoire car
elle permet de diminuer la quantit de ractif utilise par
marquage.
Les fluorochromes associs aux anticorps peuvent
avoir des poids molculaires trs variables, comme lisothiocyanate de fluorescine (FITC) qui est une petite molcule (332,31 g/mol) ou lallophycocyanine (APC) qui est
beaucoup plus imposante (104 000 g/mol). titre de comparaison, un anticorps (IgG) a un poids molculaire denviron 150 000 g/mol, ce qui signifie que le couplage de cet
anticorps avec lun ou lautre des deux fluorochromes cits
ci-dessus naura pas la mme incidence sur ses proprits
de diffusion. Ainsi, il est gnralement admis quil convient
dutiliser des anticorps coupls des fluorochromes de
petite taille pour raliser des marquages intracytoplasmiques afin que les anticorps puissent facilement se lier
leur cible dans un environnement o rgne un fort encombrement strique. Toutefois, les diffrences de rendements
quantiques des fluorochromes sont aussi prendre en
compte dans ce genre de situation.

Sondes
Certaines molcules chimiques peuvent avoir une
grande affinit pour certains composants de la cellule
et peuvent tre utilises comme colorant fluorescent
pour mettre en vidence certaines cibles (tableau 11-II).
Contrairement un marquage avec des anticorps, un marquage avec une sonde ne doit gnralement pas tre ralis
avec un large excs de ractif. En effet, ce marquage doit
tre ralis dans des conditions stchiomtriques, cest-dire des conditions o le nombre de molcules fluorescentes est proportionnel la quantit de molcules cibles.
Les conditions stchiomtriques de marquage dpendent
de la concentration de sonde, du pH, de la force ionique
ou du niveau daccessibilit des molcules cibles. Dans certains cas, comme pour le marquage des acides nucliques,
une trop forte concentration de sonde peut tre lorigine
dune perte de stchiomtrie. Une trop forte concentration
de ractif peut tre aussi lorigine dune augmentation
du marquage non spcifique, comme cela peut tre le cas

156

PARTIE II TECHNIQUES ET MTHODES

Tableau 11-II Liste non exhaustive des sondes utilisables par cytomtrie en flux en fonction de leur cible
Cibles

Sondes fluorescentes

ADN

Iodure de propidium
Hoechst
DAPI
7 amino-actinomycineD
TO-PRO 3

ARN

Acridine Orange
Pyronine Y

Mitochondries

DiOC6(3)
Rhodamine 123
JC-1
Mitotrackers
Nonyl Acridine Orange

Indicateurs dions

SNARF (pH)
Indo-1 (Ca2+)
Fluo-4 (Ca2+)

Traceurs

CFSE
PKH 26, PKH 67
CellVue

dans des protocoles de marquage potentiel-dpendant des

mitochondries : pour des concentrations relativement leves de sondes, un marquage de la membrane plasmatique
apparat en plus du marquage des membranes mitochondriales. Enfin, il faut aussi considrer leffet de ces sondes
sur la viabilit et la fonctionnalit cellulaire si le marquage
doit se faire sur des cellules vivantes. Bien souvent, des
sondes sont dcrites comme tant vitales , voire supravitales . Ces termes indiquent seulement quelles influent
peu sur la viabilit des cellules durant un temps dincubation court ; toutefois, long terme, elles entranent bien
souvent des effets dltres sur la viabilit ou sur la fonctionnalit cellulaire. Par exemple, le marquage de cellules
avec du Hoechst 33342, ciblant les acides nucliques, va
entraner un blocage transitoire des cellules dans le cycle
cellulaire et modifier leur profil de diffrenciation (Steuer et
al., 1990 ; Tobey et al., 1990 ; Adamski et al., 2007).

Transfection
Le dernier type de fluorescence quil est courant danalyser par cytomtrie en flux est celui de cellules transfectes
par une protine fluorescente. Les protines fluorescentes
de type Green Fluorescent Protein (GFP) sont issues dune
protine de mduse et ont t drives de telle faon que
les nouvelles protines mutes mettent des longueurs
dondes varies. Dautres protines fluorescentes ont aussi

t isoles partir de corail. Ainsi, il est possible de trouver

des vecteurs de transfection pour des yellow fluorescent
protein, red fluorescent protein, cyan fluorescen protein,
blue florescent protein et bien dautres Ces transfections
peuvent avoir diffrents objectifs : la simple identification
dun type cellulaire au sein dune population htrogne,
ltude de lexpression de gnes, lvaluation dinteractions
intermolculaires, ltude du cycle cellulaire La cytomtrie en flux permet danalyser lexpression simultane de
multiples protines fluorescentes. Toutefois, les rglages de
lappareil de cytomtrie sont parfois dlicats, notamment
le rglage des compensations (Telford et al., 2012).

une organisation hirarchique o les rgions sont

tablies en cascade. Il y a alors des populations de parents,
de grands-parents, darrire-grands-parents ;
une organisation boolenne o les rgions se
trouvent sur un mme niveau hirarchique, mais elles sont
combines grce des oprateurs logiques and , or ,
not , and not ou or not ;
avec une approche globale o tous les phnotypes
possibles sont analyss.
Aucune de ces stratgies nest meilleure quune autre.
Chacune sapplique dans des situations o linterprtation
des donnes ncessite une logique de combinaison de
rgions particulires.

Compensations de fluorescence
Les spectres de fluorescence des fluorochromes gnralement utiliss sont relativement larges et asymtriques.
Ainsi, une partie de la fluorescence mise par une molcule donne peut tre dtecte par dautres photomultiplicateurs que celui ddi la quantification du signal de ce
fluorochrome. Ce phnomne gnre un signal de fluorescence non souhait qui peut perturber linterprtation des
rsultats. Il est alors ncessaire de soustraire ce signal, cest
le rle du rglage des compensations. Ce prsent chapitre
na pas pour objet de rentrer dans les dtails de ce type de
rglages. Toutefois, il est important de savoir quils doivent
tre raliss dune manire parfaitement rigoureuse pour
garantir des rsultats de qualit (Roederer, 2001 ; Bayer et
al., 2007).

Interprtation des rsultats

Rgions et conditionnement des graphes
Pour chacune des fluorescences analyses, la cellule se voit attribuer une valeur sur une chelle arbitraire.
Ainsi, il est possible de catgoriser des sous-populations
cellulaires en fonction de leurs intensits de fluorescence.
La reprsentation des rsultats peut se faire sur des histogrammes monoparamtriques (figure 11-3A) figurant
la rpartition dun nombre dvnements en fonction du
canal de fluorescence, ou sur des histogrammes biparamtriques o les populations cellulaires sont visualises sous
la forme de nuages de points (figure 11-3B).
Il est possible de dlimiter des rgions autour des
diffrentes populations cellulaires identifies afin den
connatre la reprsentativit, mais aussi de crer de nouveau graphes conditionns sur une population choisie.
Ainsi, la population cellulaire pralablement slectionne
devient la population parente pour la dtermination des
pourcentages des sous-populations prsentes dans ce nouveau graphe.
Diffrentes stratgies existent pour organiser les
rgions :

CHAPITRE 11

Pourcentages
Ds la cration de la cytomtrie en flux, les rsultats
ont t donns sous la forme de pourcentages indiquant
la reprsentativit dune sous-population par rapport
une solution parente. Il est important de bien prendre en
compte que, pour la rigueur des rsultats, ces deux entits
doivent tre parfaitement dfinies. Gnralement, lutilisateur sapplique tracer avec prcision la rgion permettant de dfinir sa population dintrt, mais le pourcentage
donn ne sera juste que si la population parente a bien t
dfinie, elle aussi. Ainsi, il est ncessaire de bien liminer de
cette population parente tous les vnements pouvant tre
lorigine dartefacts ou ntant pas des cellules : les doublets, les dbris, les cellules mortes (Kuonen et al., 2010).
La mesure de pourcentages est assujettie une incertitude qui dpend directement du nombre de cellules analyses. Cette incertitude peut tre calcule grce la loi de
Poisson o elle est reprsente par un coefficient de variation. Il est communment accept quen biologie, ce coefficient de variation doive tre infrieur 5 %, ainsi le nombre
minimal de cellules dintrt analyser est de 400. Cette
incertitude peut paratre encore leve ; et si lexprimentateur souhaite avoir un coefficient de variation de 1 %, il
lui faudra alors analyser 10 000 cellules dintrt. Dans ces
deux exemples, le nombre dvnements total enregistrer
nest pas celui indiqu. Il faut relativiser ce nombre par rapport au pourcentage reprsent par la population dintrt.
Dans ces deux cas, si la population dintrt reprsente 4 %
du total, il faudra analyser un total de 10 000 cellules pour
avoir un coefficient de variation de 5 % et 250 000 cellules
pour un coefficient de variation de 1 %.

Valeurs absolues
Il est parfois intressant dexprimer les rsultats
en valeur absolue (en nombre de cellules par unit de
volume) plutt quen pourcentage. Diffrentes stratgies
permettent darriver ce type de rsultat selon lappareil
la disposition de lexprimentateur. En effet, certains appareils ont la possibilit de mesurer prcisment le volume

APPORT DE LA CYTOMTRIE EN FLUX LA CULTURE CELLULAIRE

157

Figure 11-3 Diffrentes

reprsentations possibles des donnes
de cytomtrie : (A) histogramme
monoparamtrique, (B) histogrammes
biparamtriques selon diffrents
types (pseudo-color, zebra, contour et
density).

dchantillon aspir et ainsi de pouvoir rendre des rsultats

en valeur absolue. Pour les appareils ntant pas quips de
ce module, il est possible de mlanger volume volume des
billes fluorescentes de concentration connue (billes pour
compte absolu), puis, soit par un produit en croix soit grce
un module intgr, il est possible dobtenir des rsultats
en concentration cellulaire.

Intensits de fluorescence
Pour certaines applications, les variations dintensit de fluorescence peuvent prsenter un intrt tout

158

PARTIE II TECHNIQUES ET MTHODES

particulier, pour suivre le niveau dexpression dun antigne, pour observer de fines variations de polarisation
mitochondriale, de pH intracytoplasmique, de concentration ionique
Les appareils de cytomtrie en flux permettent de
mesurer diffrents paramtres relatifs lintensit de
fluorescence. Toutefois, ces valeurs sont donnes avec une
unit arbitraire car lintensit de fluorescence mesure
dpend de nombreux paramtres dont la configuration du
banc optique, le pH ou le voltage appliqu sur le photomultiplicateur. Ainsi, il est possible de mesurer la moyenne
arithmtique, le mode, la moyenne gomtrique, et la

mdiane. Ces deux dernires valeurs sont prfrentiellement utilises pour dterminer une MFI (Mean or Median
Fluorescence Intensity) car elles sont moins sensibles aux
valeurs extrmes.
Afin de savoir si une diffrence existe entre deux
valeurs dintensit de fluorescence mesure, le calcul dun
RFI (Relative Fluorescence Intensity) peut tre ralis. Il est
calcul grce au rapport :
MFI de lchantillon/MFI du tmoin
Il est considr que, si ce RFI est suprieur 1,5, une
diffrence existe, bien que cela ne repose sur aucune loi
statistique. Des tests statistiques existent pour mettre en
vidence une diffrence significative entre deux intensits
de fluorescence. Ce sont les tests de Kolmogorov-Smirnov
et du Chi(T) quil est possible de raliser grce certains
logiciels spcialiss dans linterprtation des donnes de
cytomtrie (Cox et al., 1988 ; Roederer et Hardy, 2001).
Toutefois, il peut tre bon de rappeler quune diffrence
significative entre deux chantillons ne traduit pas forcment un effet biologique.
Afin de dterminer la quantit dantignes exprime
par des cellules, il est possible de raliser des calibrations
laide de billes spcifiques cette application. Diffrentes
stratgies existent partir de billes recouvertes ou imprgnes de quantits connues de fluorochromes (Gratama et
al., 1998 ; Lavabre-Bertrand, 2006). Ces billes permettent
dtablir une courbe talon faisant la relation entre lintensit de fluorescence et la concentration antignique. Des
logiciels permettent alors de transformer automatiquement lunit arbitraire de fluorescence en concentration
antignique.

suivre les tapes de diffrenciation de cellules cultives,

que ce soit partir de cultures primaires (De Smedt et al.,
2011) ou partir de cellules immortalises (Liu et al., 2004).
Le champ dapplication de la caractrisation de diffrentes
sous-populations prsentes nest, bien entendu, pas limit
ltude de la diffrenciation, et de trs nombreuses autres
tudes sont possibles.

Mesure dune intensit de fluorescence

travers la mesure dune intensit moyenne de
fluorescence, il est aussi possible dobtenir diffrents rsultats partir de cellules cultives in vitro. Cela permet, par
exemple, aprs marquage intracellulaire, de dterminer le
niveau de synthse dune cytokine (Shooshtari et al., 2010).
Cette logique peut, bien sr, tre applique dautres
molcules synthtises par les cellules condition quelles
soient fluorescentes ou quelles puissent tre mises en
vidence grce un marqueur fluorescent. Dans certains
cas, il est ncessaire de bloquer la scrtion ou lexocytose
qui peuvent fausser linterprtation, afin que le niveau de
fluorescence mesure soit bien proportionnel au niveau de
synthse.
La mesure dune intensit de fluorescence permet
aussi de dterminer le niveau de diffrenciation de certains
types cellulaires. Les cellules souches hmatopotiques
CD34+ isoles partir de moelle osseuse peuvent tre
cultives in vitro. Le suivi de lintensit dexpression de cet
antigne grce un marquage immunofluorescent permet
de suivre le processus de diffrenciation qui se traduit par
une diminution de lexpression du CD34 (Wu et al., 2001).
Cela permet, par exemple, dvaluer leffet de facteurs de
croissance sur ce processus de diffrenciation.

Applications
Dans ce chapitre, nous aborderons uniquement les
applications de la cytomtrie en flux qui sont les plus utilises dans le domaine de la culture cellulaire, cest--dire
hors des phnotypages dchantillons de type hmatologique ou immunologique qui reprsentent le pan le plus
large des applications de la cytomtrie.

Caractrisation phnotypique
de sous-populations prsentes
Cette application est la plus classique des applications de cytomtrie. Elle est base sur lanalyse phnotypique des cellules. Lorsque des cellules cultives in vitro
ont des caractristiques htrognes, la cytomtrie en flux
permet de mettre en vidence cette htrognit en rvlant la prsence de diffrentes sous-populations sur la base
de lexpression dantignes membranaires ou intracellulaires. Il est alors possible de connatre le pourcentage ou la
concentration cellulaire de chacune des sous-populations
identifies. Ce type dapplication permet, par exemple, de

CHAPITRE 11

tude de la viabilit, de la mort cellulaire

Diffrents types de mort cellulaire sont dcrits
(Galluzzi et al., 2012). Toutefois, dans le domaine de la
cytomtrie en flux, seuls trois types de mort cellulaire sont
classiquement caractriss : la ncrose, lapoptose et la
snescence. Brivement, la ncrose est le rsultat dune
toxicit directe dun agent chimique ou physique qui se
traduit par une augmentation du volume cellulaire, une
altration des organites cellulaires et une rupture de la
membrane conduisant la lyse des cellules. Lapoptose est
un mode de mort o la cellule intervient dans sa propre
destruction, caractrise par une rduction du volume cellulaire, une condensation de la chromatine, une fragmentation nuclaire, le maintien de lintgrit membranaire
jusquaux tapes finales du processus de mort qui conduit
la formation des corps apoptotiques. La snescence
non rplicative est caractrise par larrt irrversible de
lactivit de prolifration, mais un grand nombre de fonctions cellulaires sont maintenues (adhrence, scrtion,
activit mtabolique). Ce nest quaprs une priode de

APPORT DE LA CYTOMTRIE EN FLUX LA CULTURE CELLULAIRE

159

quelques semaines quelques mois que la cellule entame

les tapes finales de sa mort.
La caractrisation et la quantification des cellules
viables dans une culture sont trs largement utilises lors
de tests de toxicit, de cytotoxicit, lors de lvaluation de la
bonne sant des cellules aprs expansion ou lors du test de
nouvelles conditions de culture. Au-del de ces quelques
applications, il est recommand de raliser un marquage
permettant didentifier les cellules viables ds lors que des
analyses sont ralises sur des cellules fraches car les cellules mortes ou moribondes peuvent fixer non spcifiquement des anticorps coupls des fluorochromes et tre la
source de faux positifs. Les marquages de viabilit sont trs
gnralement bass sur la mise en vidence de la perte de

lintgrit membranaire des cellules mortes. Le principe

repose sur lutilisation dune molcule fluorescente ayant
une cible intracellulaire (tableau 11-III) ; la membrane
des cellules viables tant intgre et la membrane des cellules mortes tant altre, un diffrentiel de marquage
entre ces deux populations peut tre observ.
La cytomtrie en flux permet aussi la caractrisation
des cellules apoptotiques ; de nombreuses techniques
existent pour mettre ces cellules en vidence (Vermes et al.,
2000 ; Wlodkowic et al., 2010). Ces techniques sappuient
sur des modifications phnotypiques ou fonctionnelles
apparaissant lors du processus de mort (tableau 11-IV).
Ltude des phnomnes dapoptose doit bien prendre
en considration laspect dynamique de la mort cellulaire.

Tableau 11-III Principales molcules fluorescentes utilises pour les tests de viabilit par cytomtrie en flux
Sonde

Excitation

mission

DAPI

UV

461

Hoechst 33 258

UV

461

Iodure de propidium

UV, Bleu

617

Spectre dmission trs large qui limite son emploi dans

des protocoles multicouleurs

Homodimre-1 dthidium

UV, Bleu

617

Idem Iodure de propidium

7-aminoactinomycineD

Bleu

647

Spectre dcal dans le rouge par rapport liodure de propidium, compatible avec lemploi de la phycorithrine

Calcine AM

Bleu

517

Calcine Blue AM

UV

435

Reste squestr par les cellules vivantes qui deviennent

fluorescentes, les cellules mortes sont non-marques

Calcine Violet AM

Violet

452

Sytox Blue

Violet

470

Sytox Red

Rouge

658

Sytox Green

Bleu

523

YO-PRO 1

Bleu

509

PO-PRO 1

Violet

465

TO-PRO 3

Rouge

661

LIVE/DEAD Fixable
Dead Cell Stain Kits

UV

450

Violet

451 ou 526

Bleu

520 ou 615

Rouge

665 ou 775

Violet

450 ou 506

Rouge

660 ou 780

Violet

450

Fixable Viability Dye eFluor

BD Horizon Fixable Viability

Stain 450

160

PARTIE II TECHNIQUES ET MTHODES

Remarques

Lchantillon peut tre fix aprs marquage avec ce ractif

Lchantillon peut tre fix aprs marquage avec ce ractif

Lchantillon peut tre fix aprs marquage avec ce ractif

Tableau 11-IV Principales techniques utilises pour caractriser les cellules apoptotiques par cytomtrie en flux
vnement cellulaire

Techniques

Remarques

Activation des caspases

Inhibiteurs de caspases coupls des fluorochromes

Existe sous la forme de diffrents kits, spcifiques dune seule caspase, ou permettant
de mettre en vidence lactivation dun ensemble de caspases

Dpolarisation mitochondriale

Marquage des mitochondries avec des molcules fluorescentes lipophiles cationiques

permettant de mettre en vidence des variations du niveau de polarisation mitochondriale

Diffrents marqueurs sont disponibles : le

DiOC6(3), le JC-1, le MitoTracker Red, la
rhodamine 123, le TMRM

Externalisation de la
phosphatidylsrine

Marquage avec lannexine V

Lannexine V peut tre couple diffrents

fluorochromes. Sa liaison avec la phosphatylsrine ne peut se faire quen prsence
de Ca2+. Le dcollement de cellules adhrentes peut tre lorigine de lapparition de
faux-positifs

Fragmentation de lADN

Dtection du pic sub-G1,

technique TUNEL

Se pratique sur des cellules fixes, permet le

stockage des cellules avant leur analyse

Chacune de ces techniques sappuie sur un processus cellulaire qui napparat pas au mme temps que les autres.
Cest pourquoi, il nest pas recommand de prsenter des
rsultats en pourcentage de cellules apoptotiques , mais
en pourcentage de cellules positives pour lannexine V
par exemple, car les rsultats obtenus avec chacune de ces
techniques ne sont pas comparables entre eux (Galluzzi et
al., 2009).
La dtection de cellules snescentes par cytomtrie
en flux repose sur la mise en vidence de lexpression de
la SA--galactosidase, une enzyme exprime spcifiquement par les cellules en snescence non rplicative grce
un substrat fluorogne de cette molcule (Zhao et al.,
2010 ; Cho et Hwang, 2011 ; Bordoni et al., 2012). Le niveau
dexpression de cette enzyme peut devenir dtectable seulement quelques jours aprs le stress lorigine de linduction de la snescence.
Quel que soit le mode de mort cellulaire tudi, il est
important de rappeler que ces processus sont dynamiques
et que, bien souvent, la caractrisation des phnomnes
impliqus est plus fiable lors dune tude en cintique.

une discrimination prcise de ces diffrents pics afin de

connatre avec prcision la rpartition des cellules dans les
phases du cycle (Ronot et al., 2010). Cette discrimination
est dautant plus aise que les pics sont fins, cest--dire
que le coefficient de variation est le plus petit possible. Les
facteurs influenant ce paramtre sont le dbit cellulaire, la

Cycle cellulaire et prolifration

Grce lanalyse du contenu en ADN des cellules, il
est possible de connatre leur rpartition dans les diffrentes phases du cycle cellulaire (2n chromosomes : phases
G0/G1, 4n chromosomes : G2/M, compris entre 2n et 4n :
phase S). Classiquement, le cycle cellulaire est reprsent
sur un histogramme monoparamtrique o il est possible didentifier les pics correspondant ces diffrentes
phases (figure 11-4). La difficult principale est de raliser

CHAPITRE 11

Figure 11-4 Reprsentation en histogramme

monoparamtrique du contenu en ADN dune population
cellulaire pour ltude du cycle cellulaire et ses diffrentes
phases : G0/G1, S et G2/M.

APPORT DE LA CYTOMTRIE EN FLUX LA CULTURE CELLULAIRE

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