Extraction d’ADN génomique bactérien

L 'extraction de l'ADN est une technique permettant d'isoler l'ADN de cellules ou de tissus. L'ADN
ainsi extrait peut ensuite être utilisé pour des recherches de biologie moléculaire, telles que le
séquençage, la PCR ou le clonage. Il existe différents protocoles pour extraire l'ADN, qui suivent
approximativement les mêmes étapes :

 Lyse des cellules

 Elimination des protéines
 Concentration de l'ADN par précipitation à l'alcool

1- On commence en général par une lyse des cellules ou des tissus, consistant éventuellement
en un broyage, suivi d'une extraction par des détergents, SDS cétyltriméthylammonium
bromure (CTAB)qui vont disperser les bicouches lipidiques des membranes et dénaturer les
protéines, et en particulier celles qui sont associées à l'ADN dans la chromatine. La solution
obtenue est en général très visqueuse, car l'ADN ainsi libéré forme de très longs filaments qui
s'opposent aux écoulements hydrodynamiques.

L'étape suivante est la déprotéinisation de la solution qui se fait par une extraction au moyen de
solvants organiques, en général du phénol additionné de plus ou moins de chloroforme. Les
protéines dénaturées forment un précipité à l'interface phénol-eau, tandis que l'ADN reste en
solution dans la phase aqueuse qui est récupérée par décantation ou par centrifugation.

L'ADN est ensuite précipité par addition d'éthanol ou d'isopropanol dans la phase aqueuse,
collecté par centrifugation et dissout dans du tampon.

Contrôle de pureté et dosage d'ADN

– Réaliser une dilution au 1/10ème de la solution d'ADN directement dans une cuve en quartz
(diluant: SSC).
– Déterminer les absorbances à 260 nm, 270 et 280 nm.
– Déterminer le rapport A260 / A280.
– Conclure quant à la pureté de l'ADN obtenu.
– Calculer la quantité totale et la concentration d'ADN obtenues sachant que 1 unité d'absorbance
à 260 nm correspond à une concentration d'ADN de 50μg/mL d’ADN double brin.
Les protéines absorbant à 280 nm, le ratio A260/A280 est utilisé pour estimer la pureté de
l’acide nucléique. L’ADN pur devrait avoir un ratio d’environ 1,8, tandis que l’ARN pur devrait
avoir une valeur d’environ 2,0. L’absorption à 230 nm reflète la contamination de l’échantillon
par des substances telles que les hydrates de carbone, les peptides, les phénols ou les composés
aromatiques. Dans le cas d’échantillons purs, le ratio A260/A230 devrait être d’environ 2,2.
Une méthode alternative, en l’occurrence la méthode de la plaque d’agarose au bromure
d’éthidium, est utile lorsqu’on ne dispose que de faibles quantités d’acide nucléique. La quantité
d’acide nucléique peut être estimée par comparaison à une gamme de concentrations en utilisant
l’intensité de la fluorescence émise par le bromure d’éthidium lorsque celui-ci est irradié par la
lumière UV.
 Extraction d’ADN plasmidique

La préparation d'ADN plasmidique à partir de bactéries est l'une des techniques les plus
courantes de la biologie moléculaire, Le principe de l'extraction est connu sous le nom de lyse
alcaline. Cette méthode permet de préparer sélectivement l'ADN du plasmide contenu dans les
bactéries, tout en éliminant l'ADN du chromosome bactérien. Le principe de cette méthode
consiste à effectuer la lyse des cellules au moyen d'un détergent (dodécyl sulfate de sodium) en
présence de soude, à pH 13. À ce pH très alcalin, l'ADN est dénaturé, c’est-à-dire que les deux
brins de la double-hélice sont séparés. On neutralise ensuite rapidement la solution, ce qui
provoque la renaturation brutale (réappariement des brins du duplex d'ADN). L'ADN
chromosomique, très long (~10⁶ paires de base), ne parvient pas à se réapparier complètement
et forme des enchevêtrements insolubles. L'ADN plasmidique, court (~10³ paires de base),
parvient à se réassocier complètement et reste en solution. On sépare alors les espèces par
centrifugation. Les protéines précipitées, sont également éliminées avec le détergent et l'ADN
chromosomique. L'ADN plasmidique, resté en solution, est alors concentré par précipitation à
l'alcool.

1. Préparez les solutions suivantes avec les compositions suivantes avant d'isoler l'ADN
plasmidique de bactéries.
o Solution I (tampon de lyse I): Tris 50 mM pH 8,0 avec HCl, EDTA 10 mM.
Pour 1 l, dissoudre 6,06 g de base Tris, 3,72 g d'EDTA.2H2O dans 800 ml
d'eau milli Q, ajustez le pH à 8,0 avec HCl, compléter le volume à 1 l avec de
l'eau milli-Q, autoclaver et conserver à 4 ° C.
o Solution II (tampon de lyse II): NaOH 200 mM, 1% de SDS. Pour 1 litre,
dissoudre 8,0 g de NaOH dans 950 ml d'eau milli-Q et 50 ml d'une solution de
SDS à 20%. La solution II doit être fraîchement préparée juste avant
l’utilisation.
o Solution III (tampon de lyse III): KOAc 3,0 M, pH 5,5. Pour 1 litre, dissolvez
294,5 g d’acétate de potassium dans 500 ml d’eau milli-Q, ajustez le pH à 5,5
avec de l’acide acétique glacial (~ 110 ml) et monter le volume final à 1 litre
avec addition d'eau milli-Q, autoclaver et conserver à 4 ° C.
2. Inoculer une seule colonie bactérienne dans 5 ml de milieu de bouillon LB et incuber le
tube à 37 ° C pendant 24 h avec une agitation par rotation à 180 tr / min.
3. Recueillir le culot de cellules bactériennes provenant de la culture développée par
centrifugation à 12000 tr / min pendant 5 min à température ambiante.
4. Jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules avec 150 µl de tampon TE
5. Ajouter 150 µl de Solution II à la suspension. Bien mélanger par inversion douce répétée.
Évitez de vortexer.
6. Ajoutez 150µl de solution III glacée. Ne pas vortexer.
7. Recherchez l'apparition d'un précipité blanc.
8. Centrifuger à 12 000 tr / min pendant 15 min.
9. Transférer le surnageant dans un nouveau tube.
10. Ajouter 2,5 volumes (1ml) d'isopropanol ou d’éthanol froid pour précipiter l'ADN
plasmidique. Bien mélanger par inversion répétée sans vortex.
11. Centrifuger à 12 000 tr / min pendant 10 min.
12. Jeter le surnageant pour recueillir le culot.
13. Rincer le culot avec de l'éthanol à 70% glacé, centrifuger pendant 5min jeter le
surnageant puis sécher à l'air pendant environ 10 minutes pour évaporer l'éthanol.
14. Ajouter 50 µl de tampon TE pour dissoudre le culot.
15. Conservez le tube à -20 ° C jusqu'à utilisation ultérieure.