THÈSE

En vue de l'obtention du

DOCTORAT

Spécialité : Biochimie

Titre : Expression hétérologue et purification partielle d’un variant

de la protéine kinase calcium et calmoduline dépendante (CCaMK) de
Medicago truncatula

Présentée par

KASSOUAR Schéhérazede

Sous la direction de M. Baba Hamed Mohamed-Bey

JURY

Karam Nour-Eddine – Professeur, Université d’Oran - Président

Baba Hamed M.Bey -Maître de Conférences-A-, Univ d’Oran - Directeur de thèse
Bono Jean-Jacques -Directeur de recherches INRA, Toulouse -Co-Directeur de thèse
Aoues Abdelkader- Professeur, Université d’Oran - Examinateur
Merzouk Hafida- Professeur, Université de Tlemcen – Examinateur
Maarouf Abderrazak – Professeur, centre Universitaire de Nâama – Examinateur

Année Universitaire 2011/2012

1
 Merci à Dieu tout puissant de m’éclairer tout au long de ma vie, de
m’avoir aidé dans mes recherches et grâce à qui je présente aujourd’hui
ce travail.
Ce travail a été réalisé sous la direction des Dr. BABA HAMED M.B et
Jean-Jacques BONO. Je les remercie chaleureusement pour le travail
d’encadrement qu’ils ont fourni, pour leur soutien et leurs précieux
conseils.
Je ne remercierai jamais assez le Dr. Jean-Jacques BONO, tout
d’abord pour m’avoir accueilli au sein de son équipe, pour tous les
efforts qu’il a fourni pour que ce travail aboutisse sans oublier son
extrême gentillesse et son énorme patience.
Je souhaite également remercier le Professeur Gérard BECARS,
Directeur du laboratoire, je m’avoir accueilli au sein de l’UMR 5546
(INRA, Toulouse).
Je tiens à remercier vivement les Dr. Charles ROSENBERG et
Frédéric DEBELLE pour m’avoir consacré de leur temps et m’initier aux
techniques de transformation in planta sans oublier Olivier GODEFROY
pour sa précieuse construction.
Je souhaite remercier de tout cœur Mme Gisèle BORDERIES pour
son encadrement technique et ses précieux conseils.
Je remercie également Le Dr. Patrice pour m’avoir initié aux
techniques d’extractions et purification des noyaux.
Je souhaite particulièrement remercier Sandra pour m’avoir épaulé
tout au long de mes manipulations sans oublier toutes les personnes qui
ont contribué de près ou de loin à ce travail ne serait ce que par leurs
encouragements.
Je souhaite remercier Monsieur le Président ainsi que Madame et
Messieurs les membres du jury d’avoir accepter d’examiner ce travail.
Enfin, un grand merci à mon entourage hors du laboratoire, mes
parents qui n’ont cessé depuis ma première scolarité de m’aider, me
soutenir et m’encourager à des moments difficiles et à qui je souhaite à
travers cette thèse d’être comblés de satisfactions. Je souhaite enfin et
2
surtout remercier ma jeune sœur Sarah et ma fille Nouha qui m’ont
permis de penser à autre chose et qui me comblent de joies au
quotidien.

3
 Résumé

Chez la légumineuse modèle Medicago truncatula, l’établissement

des symbioses racinaires, fixatrice d’azote et mycorrhizienne, repose sur
l’existence d’une voie commune de signalisation faisant intervenir une
protéine kinase calcium et calmoduline dépendante appelée DMI3. En
effet, la nature du signal perçu par la plante, facteurs de nodulation ou
de mycorhization, entrainerait la formation de signaux calciques
différents, reconnus et traités de manière spécifique par DMI3, localisée
au niveau du noyau, de façon à diriger les mécanismes symbiotiques de
la plante vers l’établissement de la mycorhization ou la formation du
nodule. Pour jouer ce rôle, il faudrait que DMI3 soit capable de
phosphoryler des cibles différentes selon la nature du signal.
Le travail initié dans cette thèse s’est basé sur l’obtention d’une
forme tronquée constitutivement active de DMI3 en système
hétérologue chez Eschérichia coli puis à la purifier au moyen d’une
étiquette StrepTag préalablement introduite dans la construction. Cet
outil moléculaire nous permettrait de rechercher et d’identifier des cibles
potentielles ou des partenaires interagissant avec DMI3 au moyen
d’expériences de phosphorylations in vitro réalisées à partir d’extraits
nucléaires. Il serait alors possible de déterminer si parmi ceux-ci se
trouvent des protéines spécifiques de l’une ou l’autre des deux
symbioses.

Mots clés : Medicago truncatula, CCaMK, expression hétérologue

4
 TABLE DES MATIERES

INTRODUCTION ………………………………………………………………………………… P1
1. La symbiose endomycorhizienne à arbuscules……………………….P1
1.1. La mise en place de l’interaction symbiotique mycorhizienne ……. P2
1.2. Echange de nutriments………………………………………………………………….. P5
2. La symbiose fixatrice d’azote ……………………………………………………..P6
2. 1. La symbiose rhizobium/légumineuses…………………………………………..P9
2. 2. Mise en place de la symbiose rhizobium/légumineuses……………….P10
2. 3. Intérêt écologique…………………………………………………………………………. P12
3. Dialogue moléculaire entre les partenaires symbiotiques….P13
3. 1. Les bases moléculaires de l’interaction rhizobium/légumineuses ……P16
3. 1. 1. Les flavonoïdes
3. 1. 2. Les facteurs de nodulation, ou facteurs Nod ………………………….P19
3. 2. Les réponses biologiques aux facteurs Nod………………………………..P21
3. 2. 1. Les réponses calciques……………………………………………………………..P21
3. 2. 2. Modification morphologiques…………………………………………………….P22
4. La perception et transduction du signal Nod ……………………P27
4. 1. Perception des facteurs Nod, les LysM-RLK récepteurs putatifs…P30
4. 2. Transduction du signal vers le noyau, implication de la protéine DMI2 et
de la signalisation lipidique……………………………………………………………….. P33
4. 3. Transduction du signal au niveau du noyau, génération du calcium
spiking……………………………………………………………………………………………………..P35
4. 4. Transduction du signal au niveau du noyau, décodage du calcium
spiking……………………………………………………………………………………………………..P39
4. 5. Les facteurs de transcription impliqués dans la signalisation Nod..P40
5. Position particulière de DMI3 dans la voie commune de
signalisation Nod et mycorhizienne …………………………………P44
6. Présentation du sujet de thèse …………………………………… P52
RESULTATS ET DISCUSSION……………………………………………………………P54
1Production et purification d’une forme tronquée DMI3 1-311
Article…………………………………………………………………………P54

5
A.Obtention de la protéine tronquée DMI3-311 …………………………..P55
1. Production de la protéine recombinante DMI3-311
2. Purification de la protéine recombinante DMI3-311 par chromatographie
d’affinité FPLC………………………………………………………………………………………..P62
3. Activité catalytique de la protéine DMI3-311 …………………………..P63
B. Caractérisation des fractions nucléaires des cellules en suspension de M.
truncatula A17 et du mutant dmi3 …………………………………………………...P66
1. Obtention des noyaux
2. Caractérisation des extraits nucléaires de cellules A17 et du mutant dmi3
par l’Anticorps polyclonal 315 SF ……………………………………………………P69
CONCLUSION GENERALE ET PESPECTIVES ……………………………… P73
ANNEXE
MATERIEL ET METHODES …………………………………………………………..P77
1. Matériel biologique et méthodes
1. 1. Production de la protéine DMI3 dans E. coli ………P77
1. 2. Obtention des extraits bactériens ………………………………P80
1. 3. Culture de plantes Médicago truncatula …………………… P81
1. 4. Obtention de noyaux à partir de cellules A17 de Médicago
truncatula et du mutant dmi3…………………………………………P82

2. Méthodes analytiques
2. 1. Le Western blot ……………………………………………………………P83
2. 2. Purification de DMI3-311 par chromatographie d’affinité FPLC
Superflow …………………………………………………………………………………………….P83
2. 3. Spectrométrie de masse MALDI TOF………………………………P84
2. 4. Test d’activité radio enzymatique ………………………………. P85
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES………………………………………………P86

6
 LISTE DES TABLEAUX ET FIGURES
INTRODUCTION :

Tableau N°1 : Classification simplifiée du règne des champignons (« Fungi »)

…………………………………………………………………………………………………………………….. P3
Figure 1 : Processus d’infection des cellules racinaires par un champignon
mycorhizien ……………………………………………………………………………………………….. P4
Tableau 2 : Les organismes fixateurs d’azote ……………………………………… P7
Figure 2 : Mécanisme moléculaire de la réduction de l’azote atmosphérique en
ammoniac par la Nitrogénase …………………………………………………………………..P8
Tableau 3 : Classification des rhizobium …………………………………………………P14
Figure 3 : Processus d’infection de la racine et mise en place du nodule chez
M. truncatula …………………………………………………………………………………………..P15
Figure 4 : Etablissement des symbioses Endomycorhizienne et Rhizobienne
…………………………………………………………………………………………………………………….P17
Figure 5 : Exemples de structures chimiques de flavonoïdes ……………..P18
Figure 6 : Structure du facteur Nod produit par S. meliloti et fonction des
protéines Nod ………………………………………………………………………………………….P20
Figure7 :Réponses de la plante aux facteurs Nod
…………………………………………………………………………………………………………………..P23
Figure 8 : Flux de calcium en réponse aux facteurs Nod ……………P24
Figure 9 : Corrélation entre l’expression du gène ENOD11 et la zone racinaire
sensible aux facteurs Nod, chez M. truncatula exprimant pENOD11::GUS
………………………………………………………………………………………………………….P26
Figure 10 : Modèle de perception des facteurs Nod et transduction du signal
chez M.
truncatula………………………………………………………………………………………………….P29
Figure 11 : Structure de NFP et LYK3, récepteurs potentiels des facteurs
Nod…………………………………………………………………………………………………………..P31
Figure 12 : Structure/Fonction des protéines DMI1, DMI2, DMI3, NSP1/2 de
M. truncatula…………………………………………………………………………………………….P34
Figure 13 : Schéma du modèle proposé pour la voie de
perception/transduction du signal « facteurs Nod » au niveau du poil
absorbant………………………………………………………………………………………………….P37
Figure 14 : Localisation subcellulaire de la protéine DMI1………………….P38
7
Figure 15 : Structure de la protéine codée par le gène DMI3 : une protéine
kinase dépendante du calcium et de la calmoduline (CCaMK)……………….P41
Figure 16 : Schéma du processus d’activation d’une CCaMK……………….P42
Figure 17 : Localisation subcellulaire de la protéine DMI3 et co-localisation
avec le calcium spiking………………………………………………………………………………P43
Figure 18 : Les trois gènes DMI sont impliqués à la fois dans l’établissement
de la nodulation et de la mycorhization…………………………………………………..P46
Figure 19 : Modèle de perception des « facteurs Myc » et de la transduction
du signal « Myc »……………………………………………………………………………………..P48

RESULTATS ET DISCUSSION
Figure 1a (Article): Effets de la concentration de l’IPTG sur l’expression de
la protéine recombinante DMI3 311……………………………………………………….P58
Figure 1b (Article): Expression de la protéine recombinante DMI3 311 après
induction par de faibles doses d’IPTG…………………………………………………….P59
Figure 2 (Article): Expression de la protéine DMI3 311 dans du milieu LB
classique et dans un milieu spécial auto inducteur « Overnight ExpressTM
Instant TB Medium »……………………………………………………………………………… P60
Figure 20 : Expression de la protéine recombinante DMI3 311 dans les
cellules Tuner DE3……………………………………………………………………………………..P61
Figure 3 (Article) : Purification de la protéine DMI3-311 recombinante par
chromatographique StrepTactin™ Sepharose™ …………………………………….P64
Figure 21 : Activité catalytique de la protéine DMI3 311 recombinante : Test
d’autophosphorylation de la protéine………………………………………….P65
Figure 22 : L’anticorps polyclonal (315 SF) reconnaît la protéine DMI3
recombinante entière à 58 kDa et la protéine tronquée DMI3-311 à 42
kDa……………………………………………………………………………………………………………….P68
Figure 23 : Obtention de noyaux à partir de cellules en suspension de M.
truncatula A17 (lignée sauvage) et du mutant dmi3……………………………….P70
Figure 24 : Caractérisation des fractions nucléaires de cellules A17 et du
mutant dmi3 par l’Anticorps polyclonal 315 SF………………………………………P72

8
 Dans leur environnement biologique, les organismes vivants sont en
interaction permanente les uns avec les autres. Ces interactions
nommées symbiose impliquent différents types d’organismes et
différents degrés d’associations. Les endosymbioses par exemple
résultent de l'association à bénéfice réciproque de deux organismes, l'un
des deux partenaires résidant partiellement ou entièrement à l’intérieur
des cellules de l'autre partenaire. Ce type d’interactions nécessite la
mise en place de processus physiologiques et moléculaires spécifiques ;
chacun des deux partenaires doit être en mesure de percevoir l’autre et
de le reconnaitre en tant qu’organisme symbiotique ; de plus le
partenaire dont les cellules sont envahies doit être en mesure de
contrôler et de réguler cette infection.

Les endosymbiotes entre Eucaryotes et Procaryotes ont été à

l'origine de l'acquisition de nouvelles fonctions biologiques au cours de
l'évolution. Ainsi, la mitochondrie proviendrait de l'endosymbiose d'une
bactérie avec une cellule eucaryote anaérobie, et le chloroplaste de celle
d'une cyanobactérie photosynthétique avec une cellule végétale.

Chez les végétaux supérieurs, on distingue deux types

d'endosymbioses racinaires: les symbioses endomycorhiziennes à
arbuscules et les endosymbioses fixatrices d'azote associant
respectivement aux plantes des partenaires fongiques ou bactériens.
Dans tous les cas la plante fournit aux microorganismes symbiotiques
les composés carbonés issus de la photosynthèse et reçoit en contre
partie les éléments minéraux ou azotés indispensables à sa croissance.

1. La symbiose endomycorhizienne à arbuscules

Le terme mycorhize, « mukes » : champignon et « rhiza » : racine,

désigne l’interaction entre les racines d’une plante et un champignon du
sol. En fonction de la morphologie de l’interaction, il existe différents
9
types de mycoryizes caractérisés par une interaction superficielle
(ectomycorhyze) ou interne (endomycorhize). Ce processus s'est
conservé au cours de l'évolution et aujourd'hui, 80% des espèces
végétales vivent en interaction avec des champignons mycorhiziens
(Harrison, 2005; Parniske, 2005). Les ectomycorhizes se rencontrent
principalement chez les arbres et arbustes et impliquent une très grande
variété de champignons Basidiomycètes, Ascomycètes ou Zygomycètes.
Les endomycorhizes à arbuscules sont tous membres des Glomeromycota
(Tableau 1) et dépendent entièrement d'une association avec une
plante hôte (biotrophes obligatoires). Sans cette association, ils sont
présents sous forme de spores dans le sol et sont incapables de se
développer.

1. 1. La mise en place de l’interaction symbiotique mycorhizienne

L’infection de la plante hôte par le champignon mycorhizien peut

être inter ou intra cellulaire (Harrison, 2005). Le champignon, présent
sous forme de spore dans le sol, germe et développe un hyphe, à
croissance limitée. La croissance de l’hyphe ne reprend que lorsqu’un
contact s’établit entre les deux symbiotes; le champignon forme alors à
la surface de la racine une structure appelée appressorium. Grâce à cet
appressorium, le champignon pénètre les couches supérieures de la
racine et se propage à travers les cellules végétales (Figure 1)
(Paszkowski, 2006). Une fois l’épiderme traversé, les hyphes fongiques
se développent à l’intérieur de la racine. On différencie alors quatre
types d’hyphes intra-radiculaires : (1) les hyphes intracellulaires qui
forment généralement des boucles et traversent les cellules des
différentes couches du cortex ; (2) les hyphes intercellulaires qui
croissent entre les cellules et envahissent rapidement la racine ; (3) les
hyphes intra ou intercellulaires hypertrophiés qui forment des vésicules
riches en lipides et en cytoplasme ; et (4) les hyphes intracellulaires très
ramifiés, les arbuscules (Wilcox, 1996).
10
Tableau N°1 : Classification simplifiée du règne des champignons
(« Fungi »)

11
Figure 1. Processus d’infection des cellules racinaires par un
champignon mycorhizien
Le développement d’un champignon mycorhizien à arbuscules
débute par la germination d’une spore et le développement d’un
mycélium pré-symbiotique présentant des ramifications importantes en
présence de la plante hôte (1). Au contact de la racine, ce mycélium pré-
symbiotique forme une structure différenciée, l’appressorium, qui est le
site d’entrée du champignon dans la racine (2). A partir de ce point
d’entrée, le champignon développe un mycélium intra-radiculaire,
essentiellement intercellulaire (3), qui forme au sein des cellules
corticales des structures très ramifiées, les arbuscules (4). Les
arbuscules sont le site des échanges de nutriments entre les deux
symbiotes. En parallèle à l’invasion de la racine, le champignon
développe un mycélium extra-radiculaire, au niveau duquel les
nutriments sont prélevés dans le sol pour être fournis à la plante. C’est
également au niveau du mycélium extra-radiculaire que de nouvelles
spores sont formées (5).

12
Les arbuscules représentent l’organe essentiel de la symbiose, à
l’intérieur des cellules corticales, ils sont séparés du cytoplasme par une
extension de la membrane plasmique et un dépôt de matériel pariétal.
Cette nouvelle interface symbiotique, entre arbuscule et cellule corticale,
constitue le lieu d’échanges de phosphate et probablement aussi de
carbone.

Le champignon développe également un mycélium externe qui

s’étend sur plusieurs centimètres autour de la racine. Ces hyphes extra-
racinaires prospectent le sol environnant à la recherche de nutriments
minéraux et de nouvelles racines à coloniser; ils sont aussi, pour la
plupart des espèces, le site de sporulation.

1. 2. Echange de nutriments

Au cours de l’interaction, les deux partenaires échangent des

nutriments, le champignon fournit à la plante des composés minéraux
tels que le potassium, calcium, magnésium, cuivre, azote, eau,
phosphore et phosphate. Le champignon tire du sol les minéraux qu’il
fournit à la plante, ce mécanisme nécessite de transporter les minéraux
prélevés du mycélium extra-radiculaire au mycélium intra-radiculaire
d’où ils sont délivrés à la plante au niveau de l’arbuscule. En échange, la
plante fournit au champignon des composés carbonés issus de la
photosynthèse. Le mycélium extra-radiculaire est incapable de prélever
les composés carbonés nécessaires à partir de son milieu, et c’est donc
le mycélium intra-radiculaire qui absorbe depuis la plante la quasi-
totalité des composés carbonés nécessaires au champignon. Ainsi,
cohabitent dans le champignon un flux de minéraux du mycélium extra-
radiculaire vers la plante et un flux de carbone de la racine vers le
mycélium extra-radiculaire.

13
 2. La symbiose fixatrice d’azote

La symbiose fixatrice d’azote serait apparue il y a 65 millions

d’années. La capacité à fixer l’azote atmosphérique se retrouve
exclusivement chez certains procaryotes (bactéries et archées) dans des
genres phylogénétiquement très éloignés (bactéries photosynthétiques
sulfureuses, Firmibacteria, actinomycètes, cyanobactéries et toutes les
subdivisions des protéobactéries, archées méthanogènes). Elle concerne
des organismes hétérotrophes aérobies (Azotobacter…), anaérobies
facultatifs (Klebsiella…), anaérobies stricts (Clostridium…), des
organismes photosynthétiques anoxygéniques (Rhodobacter…) ou
oxygéniques (Anabaena…) et des chemolithotrophes (comme
Leptospirillum ferrooxidans). Ces organismes colonisent des habitats
différents sous forme libre (sols, eau, air…) ou en interaction avec des
organismes eucaryotes, par simple association (notamment dans la
rhizosphère) ou en symbiose (Tableau 2) (Dixon and Kahn, 2004 ;
Dixon and Wheeler, 1986).

La fixation de l’azote chez ces procaryotes, est réalisée par une

enzyme, la nitrogénase, leur permettant de réduire l’azote
atmosphérique en ammoniac suivant la réaction chimique :

N2 + 8 e– + 8 H+ + 16 Mg ATP → 2 NH3 + H2 + 16 Mg ADP + 16Pi

Cette enzyme est un complexe associant un homodimère donneur

d’électrons ATP-dépendant, la protéine-Fe et un hétéro tétramère
associant deux sous-unités α et β de la protéine-MoFe possédant le site
catalytique. Afin de fournir les électrons nécessaires à la réduction de
l’azote moléculaire, la nitrogénase fonctionne avec des cofacteurs
protéiques : la ferrédoxine chez les bactéries symbiotiques (cofacteur à
NAD ou NADP), ou la flavodoxine chez les bactéries libres (cofacteur à
FAD) (Peters and Szilagyi, 2006) (Figure 2).
14
Tableau 2 : Les organismes fixateurs d’azote

15
 2NH3 + H2

Protéine ox

N2

Protéine red 16ATP

16ADP + 16Pi

Figure 2. Mécanisme moléculaire de la réduction de l’azote

atmosphérique en ammoniac par la Nitrogénase

La nitrogénase est un complexe associant un homo-dimère donneur

d’électrons ATP-dépendant, la protéine-Fe et un hétéro-tétramère
associant deux sous-unités α et β de la protéine-MoFe possédant le site
catalytique.

16
ammoniac, l’azote atmosphérique est transféré chez le partenaire
eucaryote sous une forme qui varie en fonction du couple de partenaires
: ion ammonium, acides aminés… Chez la plante, l’azote est
généralement intégré aux acides aminés via le cycle Glutamine
Synthétase/Glutamine – Oxoglutarate Aminotransférase (GS-GOGAT).

Les principales symbioses fixatrices d’azote sont les symbioses

nodulaires. Il en existe deux types, la symbiose actinorhizienne qui
implique des bactéries filamenteuses du genre Frankia et la symbiose
rhizobium/légumineuses. Ces deux symbioses sont caractérisées par la
formation d’un nouvel organe au niveau des racines, le nodule, à
l’intérieur duquel les bactéries assurent la fixation de l’azote
atmosphérique (Kistner et al., 2002; Stracy et al., 2006).

2.1. La symbiose rhizobium/légumineuses

• Légumineuses et espèces modèles

Les légumineuses ou Leguminosae ou Fabaceae constituent une

superfamille de dicotylédones d’origine monophylétique divisée en 674
genres répartis dans 3 familles. La très grande diversité des
légumineuses fait que l’on retrouve ces plantes dans la plupart des
milieux. Les plantes de la famille des Caesalpinioideae et des
Mimosoideae ont colonisé principalement les régions tropicales et
subtropicales alors que les plantes de la famille des Papilionoideae sont
présentes dans les zones tempérées et également tropicales.
Les légumineuses forment l’un des groupes de plantes les plus
diversifiés, avec plus de 18000 espèces, on y recense des arbres et des
arbustes, parmi les Caesalpinioideae, Mimosoideae et certaines
Papilionoideae, et un très grand nombre d’herbacées parmi les
Papilionoideae. Cette dernière famille est de loin la plus abondante, avec
plus de 12000 espèces dans 429 genres. La majorité des légumineuses
17
 d’intérêt économique appartient aux Papilionoideae que l’on subdivise
généralement en deux groupes : les légumineuses dites « Phaséolides »
(Phaseolus, Vigna, Glycine, Cajanus…) principalement des zones
tropicales, et les légumineuses dites « Galégoïdes » (Trifolium,
Medicago, Pisum, Lens…) principalement des zones tempérées.

• Les bactéries du groupe rhizobium

Il a été recensé 44 espèces de bactéries capables d’établir une

symbiose avec les légumineuses (Tableau 3). Ces bactéries regroupées
sous le terme rhizobium, ont comme caractéristiques communes d’être
des Gram-négatives aérobies et, pour la plupart, mobiles grâce à la
présence d’un ou plusieurs flagelles. Bien qu’ils puissent vivre en
conditions non-symbiotiques dans les sols, les rhizobium fixent
généralement l’azote uniquement au cours de la symbiose, à l’exception
de Bradyrhizobium et Azorhizobium.

2. 2. Mise en place de la symbiose rhizobium/légumineuses

L’établissement de la symbiose Rhizobium/Légumineuse est un

processus complexe faisant intervenir différentes étapes au cours
desquelles les deux organismes vont se reconnaître pour aboutir à la
formation d’un nouvel organe (le nodule) et développer une nouvelle
fonction : la fixation symbiotique de l’azote atmosphérique.

La pénétration des bactéries dans les racines de la plante hôte peut

suivre deux procédés : l’invasion par l’épiderme via les poils absorbants,
ou l’invasion par le cortex externe via une pénétration intercellulaire au
niveau de fissures de l’épiderme ou « crack entry ».

18
 Le poil absorbant est le plus souvent le lieu d’entrée des bactéries
dans la racine des légumineuses. Après avoir subi une série de
déformations, le poil prend la forme d’une crosse de berger qui
emprisonne les bactéries. Une structure tubulaire appelée cordon
d’infection se forme au niveau de la crosse par dégradation locale de la
paroi cellulaire et invagination de la membrane plasmique. Le cordon
d’infection permet aux bactéries de progresser vers la base du poil et de
traverser plusieurs couches cellulaires jusqu’à atteindre le cortex
interne. Le cordon se ramifie au niveau du cortex interne où les cellules
en divisions ont formé un primordium nodulaire. Les Rhizobia ayant
cheminé dans le cordon d’infection sont relargués dans le cytoplasme
des cellules du primordium par endocytose. A l’intérieur de la cellule
végétale, les bactéries sont enfermées dans un symbiosome qui est le
lieu de la différenciation des bactéries en bactéroïdes et de la conversion
de l’azote en ammoniac (Figure 3) (Timmers et al., 1999). Cinq grands
types de bactéroïdes ont été identifiés sur des critères morphologiques,
et il semble que seul le type 4 fixe effectivement l’azote (Vasse, et al.,
1990). Les bactéroïdes de type 4 présentent un cytoplasme hétérogène
avec une alternance de zones riches en ribosomes et de zones riches en
matériel génétique.

L’activité de la nitrogénase est détectable au niveau de la zone III

du nodule. Afin d’optimiser la fixation de l’azote, la plante assure une
pression partielle en oxygène très basse dans le nodule pour empêcher
l’inactivation de la nitrogénase, mais suffisante au fonctionnement de la
chaine respiratoire des bactéries. Les mécanismes de limitation de
l’oxygène au sein du nodule reposent sur la présence de barrières
physiques freinant la diffusion de l’oxygène au sein des tissus et la
séquestration des molécules d’oxygène à l’intérieur des cellules infectées.
Ainsi l’enregistrement de la tension en oxygène dans le nodule montre
que la teneur en oxygène est limitée dans le nodule par une couche
cellulaire au niveau de l’endoderme. Cette couche appelée « boundary
19
layer » se compose de cellules à paroi épaisse et sans espace
intercellulaire, qui jouent un rôle de barrière physique à la diffusion de
l’oxygène vers l’intérieur du nodule. De plus, au sein des cellules
infectées on trouve en abondance des protéines de la famille des
hémoglobines, les leghémoglobines. Ces protéines proches des
myoglobines, mais spécifiques des légumineuses et de la symbiose,
présentent une très forte affinité pour l’oxygène avec un constante
d’association très rapide mais une vitesse de dissociation très basse,
permettant la séquestration de l’oxygène. La concentration en oxygène
dans les cellules infectées est ainsi tamponnée entre 7 et 11 nM,
permettant le fonctionnement de la nitrogénase.

La symbiose rhizobienne aboutit à la formation de nodules de type

« indéterminés » (Luzerne, Pois) surtout observés chez les légumineuses
tempérées, qui présentent une forme allongée ; ou « déterminés » (Lotier,
Haricot, Soja) chez les légumineuses tropicales, qui ont une forme
arrondie.

2.3. Intérêt écologique

Le processus de fixation de l’azote par les bactéries coûte cher en

énergie ; en s’associant avec les plantes, les bactéries bénéficient de
leur énergie chimique, produit de la photosynthèse. Le nodule racinaire
constitue pour elles une niche écologique et leur fait bénéficier d’une
protection vis-à-vis d’autres microorganismes environnants. En retour,
les Rhizobia leur fournissent de l’ammoniac nécessaire pour assurer leur
autotrophie azotée.

La symbiose Rhizobium-Légumineuse est très étudiée en raison de

son impact écologique et agronomique majeur. En effet, elle produit
chaque année plus d’ammoniac que l’ensemble de l’industrie mondiale
20
des engrais et concerne des espèces végétales constituant la source
majeure de protéines pour l’alimentation humaine et animale (Pois,
Luzerne, Lotier, Haricot, Soja etc.) En évitant le recours aux engrais
azotés elle permet ainsi de concilier production à haut rendement de
protéines végétales et agriculture durable.

3. Dialogue moléculaire entre les partenaires symbiotiques

Il existe un véritable dialogue moléculaire entre la bactérie et

le plante hôte via des signaux émis par chacun des deux partenaires.
Lors de l’établissement de la symbiose entre les rhizobium et les
légumineuses, la bactérie, qui vit à l’état libre dans le sol, est attirée par
la présence de la plante. En réponse à l’émission par les racines de la
plante de flavonoïdes, les rhizobium synthétisent des molécules
spécifiques de la symbiose qui permettent à ces bactéries de s’identifier
comme partenaires symbiotiques potentiels. Ces molécules appelées
facteurs de nodulation, ou Facteurs Nod, sont perçues par la plante qui,
en réponse, active les mécanismes nécessaires à la mise en place de la
symbiose (Figure 4).

Un schéma similaire est proposé pour la symbiose

endomycorhizienne, ainsi les composés de la famille des strigolactones,
le 5-déoxy-strigol, produit par les racines de la plante hôte stimule la
formation des arbuscules chez le champignon endomycorhizien
suggérant l’existence d’un dialogue moléculaire entre les deux
partenaires (Akiyama et al., 2005 ; Besserer et al., 2006). En retour, un
signal dénommé facteur Myc par analogie fonctionnelle avec le facteur
Nod, produit par le champignon initierait le processus symbiotique.

21
Tableau 3 : Classification des rhizobium

22
Poils
absorbants

Épiderme

Cortex

Endoderme
Tissus
Vasculaires

Figure 3. Processus d’infection de la racine et mise en place

du nodule chez M. truncatula

Les rhizobium (rh) attirés par la présence des racines de l’hôte,

adhèrent et se développent à la surface racinaire. La capture des
bactéries au sein du recourbement d’un poil absorbant permet la
formation d’un cordon d’infection (ci) qui véhicule les bactéries dans la
racine en traversant les cellules qui s’y sont préparées en mettant en
place un cordon de pré-infection (cpi). La production par les rhizobiums
de facteurs Nod, associée au déroulement du processus infectieux,
induit l’activation du programme d’organogénèse qui débute par la mise
en place d’un primordium nodulaire (pn) où sont relarguées les
bactéries. Ce processus aboutit à la formation d’une nodosité fixatrice
d’azote mature, qui présente quatre zones spécifiques : le méristème
(I), la zone d’infection (II), la zone de fixation (III) et la zone de
sénescence (IV). L’activité de la nitrogénase est détectable au niveau de
la zone III du nodule.

(D’après Timmers et al., 1999)

23
 3.1. Les bases moléculaires de l’interaction
rhizobium/légumineuses

3.1.1. Les flavonoïdes

La plante émet dans le sol des exsudats racinaires composés

d’acides organiques, d’acides aminés, de vitamine, de sucre et de
dérivés phénoliques C’est parmi ces derniers que l’on retrouve les
flavonoïdes, un premier type de molécules actives au cours de la
symbiose.
Les flavonoïdes sont des molécules organiques présentant deux
cycles aromatiques (dérivés du phénol) reliés par un hétérocycle pyrone ;
elles dérivent principalement du 2-phényl-1,4- benzopyrone (Figure 5;
(Steinkellner, et al., 2007). Elles sont issues du métabolisme secondaire
et ont pour précurseur commun la 4,2',4',6'-tétrahydroxychalcone. On
distingue plusieurs sous-classes de flavonoïdes en fonction de leur
structure, les flavanols, les flavanones, les flavonols, les flavones, les
anthocyanidines et les phényl-propanoïdes (Harborne and Williams, 2000
; Harborne and Williams, 2001).
Ces molécules sont produites dans toute la plante et ont des rôles
très variés allant de la pigmentation des pétales à la défense contre les
pathogènes ou les rayonnements ultra-violets. Au cours de la symbiose
rhizobium/légumineuse, les flavonoïdes ont un rôle mineur de chimio
attraction des bactéries (Caetano-Anollés, et al., 1988). Leur principale
fonction est la signalisation. Les flavonoïdes sont en effet capables
d’activer l’expression des gènes nod, nol et noe nécessaires à la
synthèse des facteurs Nod. Le mécanisme d’induction implique la
protéine bactérienne NodD, un régulateur transcriptionnel de la famille
Lys-R qui reconnaît une séquence d’ADN de 47pb, la « nod box », dans
les régions promotrices des gènes de nodulations.

24
 Figure 4. Etablissement des symbioses Endomycorhizienne
et Rhizobienne
Lors de la symbiose rhizobium-Légumineuse, un véritable dialogue
moléculaire s’établit entre les deux partenaires. Des exsudats racinaires
riches en flavonoïdes sont perçus par les rhizobium, qui à leur tour
synthétisent les facteurs Nod. Les facteurs Nod sont responsables de
l’infection, de la nodulation et de la spécificité d’hôte.

Lors de la symbiose endomycorhizienne à arbuscules, la plante produit

des signaux de la famille des strigolactones responsables chez les
champignons de l’ordre des Glomeromycota de la ramification des
hyphes nécessaire à l’infection de la racine par le champignon. En retour,
un signal dénommé facteur Myc par analogie fonctionnelle avec le
facteur Nod, produit par le champignon initierait le processus
symbiotique.

25
Figure 5 : Exemples de structures chimiques de flavonoïdes
D’après Steinkellner et al., 2007

26
 En réponse à la présence de flavonoïdes, la protéine NodD active
l’expression de ces gènes et la synthèse de facteurs Nod. Il s’agit donc
de la première étape du dialogue moléculaire entre les deux organismes
qui permet à la bactérie, présente dans le sol, de percevoir la plante, de
la reconnaître comme hôte potentiel et de se préparer à l’établissement
de la symbiose.

3.1.2. Les facteurs de nodulation, ou facteurs Nod : Structure,

Biosynthèse et Spécificité d’hôte

Les facteurs Nod, produits par les rhizobium en réponse à la

présence d’une plante hôte, sont des molécules diffusibles synthétisées
et sécrétées spécifiquement au cours de l’établissement de la symbiose.
Ils possèdent tous la même structure de base : ce sont des lipo-chito-
oligosaccharides constitués d’un squelette d’oligochitine de 3 à 4 résidus
de N-Acétyl-glucosamine, acylé à l’extrémité non réductrice par un acide
gras (Figure 6). La nature de l’acide gras (longueur et degré
d’insaturation) et des substituants chimiques présents sur le squelette
d’oligochitine sont caractéristiques d’une espèce bactérienne donnée et
déterminent la spécificité d’interaction entre la bactérie et la plante hôte
(Dénarié et al, 1996).
Les produits des gènes nodABC permettent de synthétiser la
structure de base des facteurs Nod. Ils sont communs à tous les
Rhizobia et une mutation dans un de ces gènes conduit à une abolition
complète de toutes réponses de la part de la plante. La protéine NodC
catalyse la synthèse du chito-oligomère et en contrôle la longueur.
L’unité de glucosamine à l’extrémité non réductrice est désacétylée par
NodB, et substituée par une chaîne d’acide gras par NodA. Chez
Sinorhizobium meliloti, les gènes nodFE contrôlent le degrès
d’insaturation de la chaîne lipidique, nodL l’addition d’un groupement
acétate à l’extrémité non réductrice de la chaîne oligosaccharidique, et
nodPQ et nodH celui d’un groupement sulfate à l’extrémité réductrice.
27
Figure 6 : Structure du facteur Nod produit par S. meliloti et
fonction des protéines Nod.
NoA, NodB et NodC sont communes à tous les rhizobia et sont à l’origine
de la structure de base des facteurs Nod. Les autres protéines Nod sont
responsables de l’addition des décorations du facteur Nod, impliquées
dans la spécificité d’interaction avec la plante hôte.

D’après Wais et al., 2002

28
Ces décorations sont spécifiques d’un facteur Nod produit par une
espèce et sont à l’origine de la spécificité d’hôte.

L’application sur les racines de légumineuses des facteurs Nod

purifiés à partir des rhizobia, conduit à une variété de réponses
cellulaires et moléculaires, identiques à celles provoquées par la bactérie
elle-même. Les facteurs purifiés ne sont néanmoins pas suffisant pour
établir toutes les réponses induites par la bactérie elle-même.

3.2. Les réponses biologiques aux facteurs Nod

Outre leur implication dans l’identification du micro-symbiote et la

spécificité d’hôte, les facteurs Nod sont responsables de la mise en place
de certains mécanismes qui, chez la plante hôte, vont préparer l’arrivée
des bactéries et l’établissement de la symbiose.

Les facteurs Nod purifiés appliqués sur les racines de la plante hôte
déclenchent deux types de réponses, les réponses primaires qui
apparaissent quelques secondes ou quelques minutes après l’ajout de
facteurs Nod, et des réponses plus tardives, qui apparaissent dans les
heures et les jours qui suivent (Downie and Walker, 1999).

3.2.1 Les réponses calciques

Dans les secondes qui suivent l’ajout de facteurs Nod on observe

une dépolarisation rapide et transitoire de la membrane plasmique du
poil absorbant ainsi qu’une alcalinisation du milieu (Felle, et al., 1996).
Ces phénomènes, qui se déclenchent pour une concentration en facteurs
Nod de l’ordre du nanomolaire, traduisent un influx de calcium à l’apex
du poil absorbant accompagné par un efflux d’ions chlore et potassium
(Felle, et al., 1996 ; Gehring, et al., 1997). Par ailleurs, des données
29
pharmacologiques nous indiquent que quelques minutes après la
perception des facteurs Nod, des protéines-G et une signalisation
lipidique sont probablement mises en jeux pour générer les oscillations
calciques (Figure 7) (Downie and Walker, 1999). Ces flux ioniques au
niveau de la membrane plasmique sont suivis, une dizaine de minutes
plus tard, par des oscillations périodiques de la concentration
intracellulaire de calcium. Ces oscillations, appelées « calcium spiking »,
sont localisées dans le noyau et dans le cytoplasme entourant le noyau.
Elles sont régulières et peuvent durer plusieurs heures (Ehrhardt, et al.,
1996) ; elles requièrent pour se former une concentration en facteur
Nod bien plus faible que pour l’influx rapide, de l’ordre du picomolaire.

Ainsi deux réponses calciques se mettent en place dans le poil en

réponse aux facteurs Nod, premièrement une entrée d’ions Ca2+ depuis
l’extérieur créant "une vague" de calcium qui diffuse de la membrane
vers l’intérieur de la cellule, puis dans un deuxième temps "des vagues"
successives d’ions calcium provenant de stocks intracellulaires et
diffusant du noyau vers le reste de la cellule (Figure 8) (Shaw and
Long, 2003).

3.2.2 Modification morphologiques

Quelques heures après l’ajout de facteurs Nod sur les racines, on

observe des réponses de la plante au niveau tissulaire. Les facteurs Nod
induisent un arrêt de la croissance apicale des poils absorbants, ce qui
conduit à un gonflement de l’apex. Il se forme alors un nouveau site de
croissance proche de l’extrémité du poil (Ruijter, et al., 1998) entrainant
un phénomène de branchement des poils absorbants (« root hair
branching »). Il semble que ces déformations soient accompagnées par
un réarrangement du cytosquelette du poil (Cárdenas, et al., 1998 ;
Miller, et al., 1999). Ce phénomène de branchement des poils est
observé lors de l’application de facteurs Nod purifiés. Au cours de
30
 Figure 7. Réponses de
la plante aux facteurs
Nod

(i) dans les secondes

qui suivent la perception
des facteurs Nod par la
plante on constate un
influx d’ions calcium
accompagné par un
efflux de chlore et de
potassium à l’origine de
la dépolarisation de la
membrane et de
l’alcalinisation du milieu

(ii) cet influx d’ion Ca2+

est à l’origine d’une
accumulation de calcium
dans le poil absorbant

(iii) les données

pharmacologiques nous
indiquent que quelques
minutes après la
perception des facteurs
Nod, des protéines-G et
une signalisation
lipidique sont
probablement mises en
jeu pour générer les
oscillations calciques
(iv) ces oscillations de la
concentration en
calcium, ou « calcium
spiking », sont localisées
principalement au niveau
du noyau et peuvent se
prolonger plusieurs
heures

(D’après Downie and Walker, 1999)

31
Figure 8. Flux de calcium en réponse aux facteurs Nod

Enregistrements réalisés à l’aide d’une sonde fluorescente sensible au

calcium « Calcium Green Dextran » et d’une sonde non-sensible au
calcium « Texas Red Dextran » permettant de mesurer les flux calciques
induits par les facteurs Nod dans les poils absorbant de M. truncatula. La
courbe supérieure représente le ratio sonde-sensible et sonde insensible
au calcium ; la courbe du bas représente la dérivée de la première.
A : racines non traitées aux facteurs Nod : la concentration
intracellulaire en calcium fluctue légèrement autour d’une valeur fixe ;
B : racines traitées par une concentration de 1nM de facteurs Nod (L
indique le moment du traitement) : environ 10mn après le traitement il
y a formation de pics de la concentration en calcium qui se suivent avec
régularité : « calcium spiking » ;
C : racines traitées par une concentration de 10nM de facteurs Nod :
quelques secondes après le traitement, une élévation rapide de la
concentration en calcium est observée suivie d’un plateau supérieur à
l’état basal avant traitement qui dure jusqu’à l’initiation du « calcium
spiking ».

32
l’infection par les rhizobium les facteurs Nod sont produits au niveau de
la microcolonie bactérienne et la réorientation de la croissance qui est
engendrée permet le recourbement du poil et l’enfermement des
bactéries dans la poche d’infection.

De même il a été observé quelques heures après, que les facteurs

Nod induisent l’expression de certains gènes de nodulines précoces.
Parmi ces gènes, le gène ENOD11 code pour une petite protéine riche en
proline présentant des similitudes avec des protéines pariétales.
L’expression tissulaire de ce gène par l’intermédiaire du gène rapporteur
de la β-glucuronidase (GUS) (via la construction chimère
pENOD11::GUS), a révélé une activité dans les tissus épidermiques
situés au niveau de la région d’émergence et de développement des
poils absorbants (zone II) (Figure 9).

33
 A

Figure 9. Corrélation entre l’expression du gène ENOD11 et la

zone racinaire sensible aux facteurs Nod, chez M. truncatula
exprimant pENOD11::GUS

A : Jeune racine latérale 18 heures après inoculation par S.meliloti, le

promoteur du gène ENOD11 est actif dans la région d’émergence et de
développement des poils absorbants. ENOD11 est exprimé de façon
constitutive à l’extrémité de la racine.
B : Racine latérale 3 jours après inoculation par S.meliloti.
Dans les tissus externes du nodule émergeant, ENOD11 s’exprime au
niveau des sites d’infection.
Dans les tissus internes, ENOD11 s’exprime au niveau du primordium
nodulaire envahi par les bactéries.
Les flèches indiquent le lieu d’une infection avortée.
(D’après Journet et al., 2001)

34
 (Journet, et al., 2001). Ces résultats ont permis de valider l’utilisation
de la construction pENOD11::GUS en tant que marqueur des réponses
de l’épiderme.

Les travaux d’analyse des oscillations calciques ont révélé que

l’expression du gène ENOD11 dans les cellules épidermiques de la zone
II ne pouvait pas être seulement régulée par les oscillations calciques
mais devait faire intervenir une composante supplémentaire. Il est
proposé que pour exprimer ENOD11 les cellules devaient avoir acquis un
stade de développement particulier (Miwa et al., 2006).

4. La perception et transduction du signal Nod

Pour déclencher ces réponses chez la plante hôte les facteurs Nod
doivent être perçus physiquement par les cellules de la racine par
l’intermédiaire de récepteurs. L’information doit être transmise aux
différents effecteurs qui mettront en place les réponses moléculaires et
cellulaires nécessaires à l’établissement de la symbiose.

La stratégie adoptée pour identifier le maximum d’intervenants

impliqués dans la perception/transduction du signal Nod fut, par une
approche génétique, de cribler des mutants de légumineuses affectées
dans leur capacité à noduler (Nod-). L’identification de six lignées
mutantes correspondant à six gènes différents et l’analyse phénotypique
de ces lignées a permis l’élaboration d’un schéma de voie de
transduction du signal Nod (Figure 10).

- L’un de ces mutants, nommé nfp pour « Nod Factor Perception », ne

présente plus aucune réponse aux facteurs Nod. Ce gène est donc
suspecté de jouer un rôle dans la perception des facteurs Nod et a ainsi
été placé au départ de la voie de perception/transduction du signal Nod
(Ben Amor, et al., 2003).
35
- En aval de NFP les plantes affectées dans les gènes DMI1 et DMI2
présentent un même blocage précoce dans la voie de signalisation.
Traitées aux facteurs Nod, ces lignées présentent un gonflement des
poils absorbants (« root hair swelling ») sans réorientation de la
croissance, les oscillations calciques nucléaires (calcium spiking) n’ont
pas pu être observées, alors que les flux ioniques rapides au niveau de
l’apex des poils sont légèrement affectés mais toujours présents.

- Un troisième gène DMI3 a également été identifié. Le mutant dmi3

correspondant présente un phénotype identique aux mutants dmi1 et
dmi2 à l’exception du « calcium spiking », qui est toujours détectable
chez ce mutant. Ainsi les deux gènes DMI1 et DMI2 semblent
nécessaires pour le déclenchement « du calcium spiking » et le gène
DMI3 se trouve juste en aval de cette étape. Il a ainsi été suggéré que
ce signal calcique faisait partie intégrante de la voie de signalisation,
DMI1 et DMI2 intervenant en amont pour sa mise en place, alors que
DMI3 participerait à sa perception et son décodage en aval (Catoira, et
al., 2000 ; Wais, et al., 2000).

Ces trois gènes ont été nommés DMI pour « Does not Make Infections
», car, de façon surprenante, les trois mutants dmi sont également
affectés dans l’établissement de la symbiose mycorhizienne à
arbuscules. En effet, l’infection de ces mutants par un champignon
mycorhizien est bloquée au stade appressorium, étape cruciale dans la
reconnaissance entre la plante et le champignon. Il a ainsi été fait
l’hypothèse qu’il existe des signaux de reconnaissance fongiques
spécifiques de la symbiose mycorhizienne perçus par la plante par une
voie de signalisation recouvrant partiellement la voie de signalisation
des facteurs Nod. Par analogie avec ces derniers, ces facteurs fongiques

36
 Figure 10. Modèle de perception des facteurs Nod et transduction du
signal chez M. truncatula
Les facteurs Nod sont perçus par un récepteur ou un complexe protéique faisant
intervenir le produit du gène NFP. Cette perception engendre des flux ioniques
au niveau de l’apex du poil absorbant, ainsi qu’un gonflement du poil (« root
hair swelling »). De la perception des facteurs Nod via NFP découle la mise en
place du calcium spiking qui requiert également les produits des gènes DMI1 et
DMI2. En aval du calcium spiking, l’intervention de la protéine DMI3 permet la
réorientation de la croissance du poil (« root hair branching ») et la transmission
du signal pour la mise en place du nodule. Cette mise en place ainsi que
l’activation de l’expression des gènes de nodulines requièrent également les
gènes NSP1 et NSP2.

37
 hypothétiques ont été nommés facteurs de mycorhization ou facteurs
Myc. Ces composés ont été récemment identifiés à partir de Glomus
interadices et ils présentent une structure lipo-chitooligosaccharidique
similaire à celle des facteurs Nod (Maillet et al., 2011).

- Deux gènes supplémentaires ont été identifiés, nommés NSP1 et NSP2

pour « Nodulation Signalling Pathway » car ils sont impliqués
spécifiquement dans l’établissement de la symbiose rhizobienne. Les
mutants correspondants présentent un phénotype très proche de celui
de dmi3, mais ils sont capables de former des branchements de poil.

Ainsi, il semble que ces deux gènes interviennent en aval de DMI3 mais
en amont de l’induction de l’expression des gènes de nodulines et des
divisions corticales qui donnent naissance au primordium nodulaire
(Catoira, et al., 2000 ; Oldroyd and Long, 2003) (Figure 10).

4.1. Perception des facteurs Nod, les LysM-RLK récepteurs

putatifs
Le clonage positionnel du NFP a ainsi révélé que ce gène code pour une
protéine de 595 acides aminés présentant trois domaines, (1) un
domaine extracellulaire N-terminal qui se subdivise en trois domaines de
type LysM, (2) un domaine central transmembranaire composé d’une
hélice α et (3) un domaine serine-thréonine kinase C-terminal prédit
pour être intracellulaire. Les domaines LysM ont d’abord été identifiés
chez les bactéries, dans certaines enzymes intervenant dans la
dégradation de la paroi bactérienne. Chez ces protéines, les domaines
LysM sont impliqués dans la liaison au substrat, c’est-à-dire au
peptidoglycane, un polymère de N-acétylglucosamine et acide
Nacétylmuramique liés en β1-4. Ainsi ces données suggèrent fortement
que la protéine NFP puisse lier les oligomères de chitine qui constituent le
squelette des facteurs Nod, et donc jouer le rôle de récepteur aux
facteurs Nod.

38
Figure 11. Structure de NFP et LYK3, récepteurs potentiels des
facteurs Nod.
NFP et LYK3 sont des Ser/Thr kinases membranaires avec dans leur
partie extracellulaire trois motifs LysM (LysM-RLK). Les motifs LysM sont
impliqués dans la reconnaissance de composés comme la chitine (Kaku et
al., 2006; Miya et al., 2007; Wan et al., 2008) , suggérant que les LysM-
RLKs seraient capables de percevoir un dérivé d’oligochitine, comme les
facteurs Nod. NFP est dépourvue de boucle d’activation qui empêche le
domaine kinase d’être fonctionnel. Le domaine kinase de LYK3 par contre
est fonctionnel.

(D’après Arrighi et al., 2006)

39
Cependant il est à noter que le domaine kinase de NFP ne présente ni la
boucle P (« P loop ») ni la boucle d’activation (« activation loop ») qui,
chez les autres sérine-thréonine kinases, sont nécessaires à l’activité de
phosphorylation. Ainsi, il semble que NFP soit capable de percevoir les
facteurs Nod mais incapable de transduire seul le signal Nod. Il est donc
probable que NFP fasse partie d’un complexe récepteur dont certaines
protéines seraient plus à même de transduire le signal Nod à l’intérieur
de la cellule (Arrighi, et al., 2006) (Figure 11).

Parmi les candidats potentiels pour former un complexe de

perception des facteurs Nod, on suspecte d’autres LysM-RLK. C’est en
effet le cas chez le lotier ou le transfert de deux récepteurs potentiels aux
facteurs Nod, NFR1 et NFR5 est nécessaire pour transférer la spécificité
d’hôte (Madsen, et al., 2003 ; Radutoiu, et al., 2003).

Chez M. truncatula les LysM-RLK forment une famille multigénique

importante comprenant au moins 17 membres dont certains sont
exprimés spécifiquement dans les racines et les nodules, suggérant une
implication dans la symbiose. Parmi ceux-ci on trouve le gène LYK3.
L’inactivation de ce gène est responsable du phénotype observé chez le
mutant hcl (« root Hair CurLing ») (Catoira, et al., 2001 ; Limpens, et al.,
2003 ; Smit, et al., 2007).
Ce mutant présente une déformation du poil absorbant anormale, un
recourbement en crosse de berger incomplet. Les bactéries sont donc
enfermées de manière incorrecte dans la poche d’infection, et des
cordons d’infection moins nombreux et anormaux sont formés.

Ainsi ces deux protéines (NFP et LYK3) sont requises pour la

perception des facteurs Nod au cours de la mise en place de la symbiose
mais ne semblent pas être impliquées exactement dans les mêmes
étapes. Ainsi, NFP serait plus impliquée dans la signalisation Nod à
40
 distance, alors que LYK3 serait préférentiellement impliquée dans la
perception des facteurs Nod au niveau de la micro-colonie lors du
recourbement du poil absorbant, de la constitution et de la croissance
du cordon d’infection (Gough, 2003).

4.2. Transduction du signal vers le noyau, implication de la

protéine DMI2 et de la signalisation lipidique
En aval de la perception des facteurs Nod, les protéines DMI1 et
DMI2 sont requises pour la mise en place du signal calcique nucléaire
nécessaire à la transduction du signal Nod au niveau du noyau. Le
clonage du gène DMI2 a montré qu’il code pour une protéine
membranaire de 925 acides aminés présentant (1) un domaine
extracellulaire N-terminal avec trois régions riches en leucine de type LRR
(« Leucine Rich Repeat »), connues pour être impliquées dans les
interactions protéine/protéine, et un domaine de fonction inconnue, (2)
un domaine transmembranaire et (3) un domaine sérine-thréonine kinase
C-terminal prédit pour être intracellulaire (Endre, et al., 2002) (Figure
12). Le rôle potentiel de DMI2 dans la génération du signal calcique est
encore flou. Cependant l’implication de ce récepteur kinase dans la
transduction du signal Nod indique que le signal « calcium spiking » est
probablement généré par l’intermédiaire d’une cascade de
phosphorylation.

Des données pharmacologiques suggèrent également l’implication

de protéines G hétérotrimériques. Ces protéines G ont été très bien
caractérisées chez les animaux. Les protéines G, formées de trois sous
unités (α, β et γ) fixées à la face interne de la membrane plasmique
sont activées par un récepteur membranaire. En réponse à cette
activation elles agissent sur des effecteurs membranaires enzymatiques
tels que les phospholipases, ou des canaux ioniques, déclenchant une
cascade de phosphorylation via les MAP-kinases qui aboutit à la
régulation de l’expression de gènes cibles.
41
Figure 12. Structure/Fonction des protéines DMI1, DMI2, DMI3,
NSP1/2 de M. truncatula.
DMI1 (883 aa) pourrait être un canal potassique. DMI2/NORK (925 aa)
est un récepteur kinase à domaine extracellulaire capable d’interaction
protéine/protéine. DMI3/CCaMK (523 aa) serait capable de décoder des
signaux calciques en des processus de phosphorylation. NSP1/2 (554 aa
pour NSP1, 508 aa pour NSP2) sont des facteurs de transcription de type
GRAS.

(D’après Ané et al., 2004 ; Endre et al., 2002 ; Lévy et al., 2004 ; Smit et al.,
2005)

42
 Chez les plantes, les protéines G sont notamment impliquées dans
la transduction du signal lors de la perception de certaines
phytohormones telles que l’auxine et l’acide abscissique. Elles pourraient
également jouer un rôle au cours de la transduction du signal Nod. En
effet, le traitement des racines de M. truncatula par du mastoparan, un
agoniste des protéines G, permet l’induction de l’expression de ENOD11
et ENOD12 en l’absence de stimulation par les facteurs Nod. De plus, un
antagoniste des protéines G, la toxine pertussique, bloque l’induction de
l’expression de ces gènes par les facteurs Nod. Enfin, il a été montré
que le mastoparan induit l’expression d’ENOD11 en absence de facteurs
Nod chez les mutants dmi1 et dmi2 mais pas chez dmi3, suggérant
qu’une protéine G intervient en aval de DMI1/DMI2 et en amont de
DMI3 (Charron, et al., 2004 ; Kelly and Irving, 2003; Kelly-Skupek and
Irving, 2006) (Figure 13).

4.3. Transduction du signal au niveau du noyau, génération du

calcium spiking

Le gène DMI1 code pour une protéine de fonction inconnue

présentant un domaine riche en proline, un domaine de type « leucine
zipper » du coté N-terminal et un domaine central présentant 4
séquences transmembranaires.
La protéine DMI1 présente des homologies faibles mais significatives
avec des canaux potassiques multimériques d’archéobactéries (Ané, et
al., 2004). L’étude de la localisation subcellulaire de DMI1 a permis de
montrer sa présence au niveau de l’enveloppe nucléaire (Riely, et al.,
2007) (Figure 14). Le réticulum endoplasmique qui est en continuité
avec l’enveloppe nucléaire constitue une réserve intracellulaire en
calcium importante. Ceci suggère que DMI1 pourrait être impliqué
directement dans la génération du « calcium spiking » (Peiter, et al.,

43
2007). Chez le lotier deux gènes ont été identifiés comme étant
nécessaires à la fois pour la nodulation et la mycorhization.

Ces gènes NUP133 et NUP85 (Kanamori, et al., 2006 ; Saito, et al.,

2007) codent pour des protéines faisant partie du complexe du
nucléopore. De façon intéressante, les plantes mutées sur l’un ou l’autre
de ces gènes ne présentent plus, en réponse aux facteurs Nod, de
« calcium spiking », mais conservent le branchement de poil qui n’existe
plus chez dmi1 et dmi2. Ces deux protéines semblent donc impliquées
dans la génération du « calcium spiking » mais pas dans la réorientation
de la croissance du poil.

Dans le cas de la symbiose rhizobienne la génération du « calcium

spiking » au niveau du noyau en réponse aux facteurs Nod requiert un
canal ionique de l’enveloppe nucléaire et une intervention du nucléopore
(Figure 13).

44
Figure 13. Schéma du modèle proposé pour la voie de
perception/transduction du signal « facteurs Nod » au niveau du
poil absorbant
45
 1 2

Figure 14. Localisation subcellulaire de la protéine DMI1

Localisation subcellulaire de la protéine DMI1 dans les cellules

épidermiques (1) et les poils absorbants des racines de M. truncatula (2).
La fusion traductionnelle 35Sp::DMI1-GFP révèle l’adressage de DMI1 à
l’enveloppe nucléaire.

(D’après Riely et al., 2007)

46
4.4. Transduction du signal au niveau du noyau, décodage du
calcium spiking

La génération du signal calcique au niveau de noyau n’est que la

première étape de la transduction du signal vers le noyau. Une fois
généré, ce signal doit être perçu et décodé afin que l’information soit
transduite. Les données génétiques suggèrent l’implication de DMI3. Ce
gène code pour une protéine kinase dépendante du calcium et de la
calmoduline (Lévy, et al., 2004; Mitra, et al., 2004). Ce type de protéine
possède une structure unique présentant une double sensibilité au
calcium (Patil, et al., 1995). L’activité du domaine sérine-thréonine
kinase N-terminal de la protéine est en effet régulée d’une part par un
domaine central d’auto-inhibition qui peut lier la calmoduline, et d’autre
part par un domaine de type visinine C-terminal, présentant trois mains
EF capables de lier chacune un ion calcium (Figure 15). Ce type de
protéine, nommé CCaMK en anglais pour « Calcium and
CalModulin dependent protein Kinase », a été identifié pour la première
fois chez le lys. Les analyses biochimiques de cette protéine ont permis
de proposer un mode d’activation. Les ions calcium libérés au cours du
signal calcique se fixent sur les mains EF du domaine de type visinine,
ce qui induit une auto-phosphorylation de la protéine. Cette
autophosphorylation déclenche une modification de conformation qui
augmente l’affinité du domaine central pour la calmoduline. Cette
protéine, qui a elle-même fixé des ions calcium, vient alors se fixer à la
CCaMK au niveau du domaine central et lève ainsi l’inhibition que ce
domaine exerce sur la kinase, permettant ainsi la phosphorylation des
cibles et la transduction du signal calcique (Sathyanarayanan, et al.,
2000) (Figure 16).

Afin de confirmer les données de génétique qui suggèrent

l’implication de DMI3 dans le décodage du « calcium spiking », la
47
localisation subcellulaire de la protéine a été réalisée à l’aide d’une
protéine de fusion avec la GFP (« Green Fluorescent Protein »). DMI3 se
localise de façon très stricte dans le noyau des cellules racinaires où est
observé le « calcium spiking » (Figure 17) (Kalo, et al., 2005 ; Oldroyd
and Downie, 2006 ; Smit, et al., 2005).

Cependant les cibles phosphorylées par la kinase DMI3 en réponse

au calcium spiking induit par les facteurs Nod sont toujours inconnues.

4.5. Les facteurs de transcription impliqués dans la signalisation

Nod

La régulation de l’expression des gènes de nodulines par les

facteurs Nod nécessite l’intervention, au niveau du noyau, de facteurs
de transcription qui vont moduler l’expression de ces gènes cibles. Ces
facteurs sont activés en réponse à la présence de facteurs Nod par la
voie de perception/transduction faisant intervenir NFP et les trois gènes
DMI.

Ainsi les gènes NSP1 et NSP2 qui ont été placés dans la voie de
transduction en aval de DMI3 semblent de bons candidats. Le clonage
positionnel de ces gènes a révélé qu’ils codent pour des facteurs de
transcription de type GRAS (Kalo, et al., 2005 ; Smit, et al., 2005).

Les protéines de type GRAS forment une famille importante de

facteurs de transcription chez les plantes (33 membres chez A.
thaliana). Il est intéressant de noter que certaines protéines de type
GRAS sont impliquées dans le développement racinaire.

48
Figure 15. Structure de la protéine codée par le gène DMI3 : une
protéine kinase dépendante du calcium et de la calmoduline
(CCaMK)

La protéine DMI3 présente une double sensibilité au calcium de par son

domaine carboxy-terminal de type visinine présentant 3 mains-EF et de
par son domaine central auto-inhibiteur pouvant lier la calmoduline. Ces
deux domaines de sensibilité au calcium permettent le fonctionnement
du domaine N-terminal : une sérine/thréonine kinase précédée d’une
séquence d’adressage au noyau (NLS).

(D’après Lévy et al., 2004 ; Mitra et al., 2004)

49
Figure 16. Schéma du processus d’activation d’une CCaMK

La formation d’un signal calcique permet la fixation d’ions calcium sur les
mains-EF du domaine de type visinine (1). Cette fixation permet une
auto-phosporylation de la protéine qui entraine une augmentation de
l’affinité de la protéine pour la calmoduline (2). Celle-ci, liée au calcium,
se fixe alors sur le domaine central (3) permettant la levée de l’auto-
inhibition et l’activation du domaine kinase (4).

(D’après Sathyanarayanan et al., 2000)

50
 A

Figure 17. Localisation subcellulaire de la protéine DMI3 et

co-localisation avec le calcium spiking
A: localisation de la protéine DMI3 par fusion traductionnelle
DMI3p::GFP-DMI3 ; la protéine est strictement localisée dans le noyau
des cellules racinaires en absence comme en présence de facteurs Nod
(D’après Kalo et al., 2005 et Smit et al., 2005)
B: localisation du « calcium spiking » observé par mesure de la
concentration intracellulaire en calcium après injection d’Oregon Green-
Dextran ; les pics de concentration en calcium sont localisés au niveau du
noyau et diffusent faiblement dans le cytoplasme environnant
(D’après Oldroyd and Downie, 2006)

51
 D’autres protéines de la famille des facteurs de transcription de
type AP2/ERF ont été identifiées comme étant impliquées dans la mise
en place des réponses symbiotiques.

- L’une d’entre elles, ERN (« ERF Required for Nodulation »), a été
identifiée par génétique à partir du mutant bit1 (« branching infection
threads ») de M. truncatula présentant un phénotype d’infection anormal
et impliqué dans le développement du nodule (Middleton, et al., 2007).

- Deux autres protéines de la famille des AP2/ERF ont été identifiées,

ERN2 et ERN3, en recherchant des protéines capables de se lier au
promoteur ENOD11p (Andriankaja, et al., 2007). Cette même étude a
permis de montrer que ERN (ou ERN1), ERN2 et ERN3, se fixent sur le
fragment [-411 ; -358] du promoteur ENOD11p. Il semble que les
facteurs ERN1 et ERN2 aient un rôle d’activation de l’expression
d’ENOD11 (Figure 13).

5. Position particulière de DMI3 dans la voie commune de

signalisation Nod et mycorhizienne

Lors des cribles génétiques menés sur M. truncatula pour l’identification de

mutants de nodulation, trois gènes, DMI1, DMI2 et DMI3 ont été identifiés
comme étant également requis pour l’établissement de la symbiose
mycorhizienne. Le fait que des gènes de la voie de signalisation Nod soient
également nécessaires à l’établissement de la symbiose mycorhizienne
suggérait que la mise en place de cette dernière reposait sur la
reconnaissance par la plante de signaux spécifiques du partenaire fongique.
Par analogie avec ce qu’on savait de la symbiose rhizobienne, ces signaux,
ont été appelés « Facteurs de Mycorhization » ou « Facteurs Myc » (Figure
18).
52
Des travaux menés à Toulouse ont permis de démontrer l’activation
spécifique de l’expression du gène ENOD11 de M. truncatula par des spores
germées de Gigaspora rosea, G. gigantea, G. margarita, ou Glomus
intraradices séparées de la plante par une barrière physique empêchant tout
contact direct entre la plante et le champignon. Cette activation de
l’expression d’ENOD11 n’est pas dépendante des trois gènes DMI et ne
présente pas la même localisation tissulaire que lors de l’activation de
l’expression d’ENOD11 par les facteurs Nod (Kosuta, et al., 2003).

Par ailleurs, des travaux de transcriptomique ont montré que le profil

d’expression de 11 gènes de M. truncatula, dont certains pourraient être
impliqués dans la signalisation cellulaire, est modifié en présence de spores
germées de Glomus mosseae mais en absence de contact (séparation par
une barrière physique). Dans ce cas, la régulation à distance de l’expression
de ces gènes par le champignon dépend du gène DMI3 (Weidmann, et al.,
2004). Il a également été montré que la présence d’hyphes pré-
symbiotiques à proximité des racines de la plante mais sans contact, stimule
la formation de racines secondaires. A l’inverse de l’activation de
l’expression d’ENOD11, la stimulation de la formation de racines latérales
est dépendante de DMI1 et DMI2 mais pas de DMI3 (Olah, et al., 2005).

Enfin, des travaux de deux équipes italiennes ont montré une réponse
calcique des cellules de plante à des molécules émises par le champignon
mycorhizien. En utilisant des cultures de cellules de soja (Glycine max)
exprimant l’aequorine (une protéine émettrice de lumière en présence de
calcium) ils ont montré une élévation rapide et transitoire de la
concentration cytoplasmique en calcium en réponse à l’ajout d’un milieu de
culture dans lequel des spores de Gigaspora margarita avaient germé.
Cette réponse calcique semble élicitée par des molécules partiellement
lipophiles de moins de 3kDa (Navazio, et al., 2007).

53
Figure 18. Les trois gènes DMI sont impliqués à la fois dans
l’établissement de la nodulation et de la mycorhization

Le fait que des gènes de la voie de signalisation Nod soient également

nécessaires à l’établissement de la symbiose mycorhizienne suggérait que
la mise en place de cette dernière reposait sur la reconnaissance par la
plante de signaux spécifiques du partenaire fongique, potentiellement
diffusibles, et qui par analogie pourraient être nommés « Facteurs Myc ».

54
Il semble donc clair que des molécules diffusibles produites par des
champignons mycorhiziens peuvent avoir un effet à distance sur les
racines de plantes. Cependant ces réponses ne semblent pas toutes
dépendre des gènes symbiotiques identifiés à ce jour. Ainsi, si l’activation
des 11 gènes identifiés par Weidmann et collaborateurs est dépendante
de DMI3, l’activation de la formation de racines latérales dépend de DMI1
et DMI2 mais pas de DMI3, et l’expression d’ENOD11 est indépendante
des trois gènes DMI. L’identification récente et formelle des facteurs Myc,
produits par G. intraradices, a montré qu’ils étaient capables d’induire
des réponses biologiques, comme la formation de racines latérales et
l’induction de gènes. Ces réponses, dépendant des gènes DMI, confirment
l’existence de la voie de signalisation commune à l’établissement des
deux symbioses (Figure 19).
De plus, des travaux menés par l’équipe de Giles Oldroyd à Norwich
ont montré l’apparition d’un signal calcique intracellulaire dans les
cellules de poils absorbants lorsque les hyphes pré-symbiotiques sont à
proximité de la racine, mais sans contact. Ces oscillations calciques, bien
que très irrégulières semblent porter une signification biologique et
pourraient être considérées comme le pendant mycorhizien du « calcium
spiking » observé au cours de la symbiose rhizobienne. La formation de
ce signal calcique est dépendante de DMI1 et de DMI2 (Kosuta et al.,
2008). Toutefois la nature des signaux calciques générés en réponse à un
traitement des racines par les facteurs Myc n’a pas encore été établie.
Les molécules diffusibles produites par le champignon seraient
perçues par les racines de la plante par l’intermédiaire de récepteurs à
partir desquels un signal intracellulaire, nécessitant la présence de DMI2
et DMI1, conduirait à la formation d’un signal calcique intracellulaire
différent du « calcium spiking » induit par les facteurs Nod. Ce signal
calcique une fois décodé par DMI3 permettrait la mise en place des
réponses cellulaires (Figure 19).

55
Figure 19. Modèle de perception des « facteurs Myc » et de la
transduction du signal « Myc »

56
 La protéine DMI3 pourrait orienter les voies de signalisation
des deux endosymbioses racinaires

L’implication de la protéine DMI3 dans l’établissement des deux

symbioses racinaires la place comme le dernier élément commun à la
mycorhization et à la nodulation. En effet, la protéine DMI3 se situe à «
l’embranchement » entre les deux symbioses, percevant les signaux
calciques induits par les facteurs Nod (oscillations calciques régulières ou
« calcium spiking ») ou des signaux fongiques (oscillations calciques
irrégulières) et dirigeant la signalisation vers l’un ou l’autre des
mécanismes symbiotiques. Cette hypothèse d’un rôle d’aiguillage de la
protéine DMI3 entre la nodulation et la mycorhization suggère qu’elle soit
capable de distinguer le signal calcique induit par les facteurs Myc de
celui induit par les facteurs Nod.

Si DMI3 joue un rôle d’aiguillage vers la nodulation ou la mycorhization,

cette protéine kinase pourrait avoir des cibles différentes en fonction du
signal Nod ou Myc qu’elle perçoit. L’identification des cibles de la kinase
DMI3 est donc une question prioritaire pour comprendre la transduction
des signaux symbiotiques.

Messinese et collaborateurs (2007) ont caractérisé une protéine IPD3 («

Interacting Protein for DMI3 ») dont la partie C-terminale interagit avec
DMI3 dans un système de double hybride chez la levure. Cette protéine
de 513 acides aminés présente deux domaines d’interaction
protéine/protéine de type coiled-coil [244-297] et [419-513], ainsi que
deux sites potentiels de phosphorylation [208-226] et [331-443] et deux
séquences potentielles de localisation nucléaire. L’utilisation de la
protéine de fusion IPD3::GFP a permis de démontrer la localisation
nucléaire de la protéine IPD3 dans les racines de M. truncatula.

57
Afin de déterminer si IPD3 et DMI3 sont capables d’interagir in vivo,
Messinese et collaborateurs ont utilisé la technique de « split YFP » qui
consiste à fusionner la partie C terminale ou N terminale de la YFP à une
protéine d’intérêt et à réaliser les constructions réciproques pour le
partenaire potentiel. Ainsi, si la protéine d’intérêt interagit avec son
partenaire potentiel, le rapprochement des parties C et N terminale de la
YFP permet l’observation de la fluorescence. Grâce à cette technique, ils
ont pu déterminer que dans le noyau des cellules de feuilles de tabac (N.
benthamiana), IPD3 interagit avec DMI3.

Chez M. truncatula, l’étude de l’expression de IPD3 et de DMI3 montre

que ces gènes sont co-exprimés au niveau de l’épiderme et du cortex
racinaire dans les premières étapes de l’établissement de la symbiose
(Messinese, et al., 2007 ; Godfroy et al., 2008). L’interaction d’IPD3 et de
DMI3 dans le noyau des cellules de feuille de tabac, la présence de IPD3
et de DMI3 dans le noyau des cellules de racines de M. truncatula et la
colocalisation de l’expression spatio-temporelle des deux gènes
correspondants suggèrent très fortement que IPD3 interagit avec DMI3.

La présence de sites potentiels de phosphorylation sur la protéine IPD3

laisse penser que cette protéine pourrait être une des cibles de la kinase
DMI3. Il est intéressant de remarquer que dans les nodules matures,
IPD3 est exprimée au niveau de la zone de fixation de l’azote alors que
l’expression de DMI3 est restreinte à la zone d’infection. Ainsi, si IDP3 est
une cible de DMI3 dans la première étape de la mise en place de la
symbiose, il se peut qu’elle joue un rôle différent au niveau des cellules
infectées de la zone III du nodule mature.

L’équipe de Martin Parniske à Munich a isolé chez le lotier un mutant de

l’homologue d’IPD3, CYCLOPS, qui est affecté à la fois pour la nodulation
et la mycorhization (Yano et al., 2008) . La protéine IPD3 pourrait donc
être un nouvel effecteur appartenant à la voie de signalisation commune
58
aux symbioses rhizobienne et mycorhizienne. Si IPD3 est phosphorylée
par DMI3 après activation par le signal calcique, il se pourrait que cette
protéine intervienne en aval dans la voie de signalisation menant à la
nodulation ou à la mycorhization.

Par contre si IPD3 n’est pas phosphorylée par DMI3, elle pourrait être
une protéine affine de DMI3 qui pourrait réguler l’activité enzymatique de
DMI3, sa localisation au sein du noyau ou participer à la formation d’un
échafaudage moléculaire permettant les interactions avec d’autres
protéines.

Pour mieux comprendre la transduction du signal en aval de DMI3, il

serait donc intéressant d’identifier ses cibles ou ses partenaires, afin de
déterminer si parmi ceux-ci se trouvent des protéines spécifiques de l’une
ou l’autre des deux symbioses.

59
6. Présentation du sujet de thèse

Une étude des relations structure/fonction réalisée sur la CCaMK de

lys par Ramachandiran et collaborateurs (1997) ont montré qu’une forme
tronquée constituée des 322 premiers résidus de la protéine,
correspondant au domaine kinase seul, sans les domaines de régulation
ni de sensibilité au calcium, présente une activité identique en présence
ou en absence de calcium. Plus récemment, les travaux réalisés par
(Gleason et al., 2006) ont montré que des variants protéiques de DMI3,
DMI3 1-311 et DMI3 1-316, correspondant au domaine kinase, sans les
deux domaines de régulation par le calcium (domaine visinine et domaine
central de liaison à la calmoduline) présentent une activité enzymatique
constitutive. L’activité kinase de ces deux variants, mesurée au moyen de
tests de phosphorylation in vitro sur substrat artificiel, est indépendante
du calcium, et correspondant à environ 30 et 40% respectivement de
l’activité de la protéine entière en présence de calcium et de calmoduline.

Par ailleurs ces formes tronquées de CCaMK/DMI3, sont capables,

lorsqu’elles sont introduites chez un mutant dmi3 de M. truncatula, de
provoquer la formation de nodules en absence de bactéries ou de
facteurs Nod. Ces données démontrent que la forme tronquée de DMI3
interagit avec ses substrats pour déclencher en aval la signalisation
cellulaire conduisant à l’organogenèse nodulaire.

Mon travail au cours de cette thèse avait pour objectif d’exploiter le

potentiel d’une forme tronquée de DMI3 comme outil pour rechercher à
terme ses substrats ou ses protéines affines susceptibles d’intervenir en
aval des voies de signalisation conduisant à la nodulation ou à la
mycorhization. L’objectif de mon travail a été de produire, en condition
hétérologue, une forme tronquée de DMI3 permettant de réaliser des
expériences de phosphorylation in vitro sur des préparations de noyaux
de M. truncatula.
60
Nous avons dans un premier temps, établi un protocole de production de
la forme tronquée de DMI3 chez Escherichia coli. L’objectif du travail
étant d’utiliser la protéine tronquée DMI3 pour réaliser des expériences
de phosphorylation, nous nous sommes assurés de l’activité catalytique
de la protéine produite et partiellement purifiée au moyen d’une
expérience de phosphorylation avec de l’ATP radioactif.

Dans un deuxième temps nous nous sommes intéressés à l’isolement de

noyaux. Pour cela, nous avons retenu des suspensions cellulaires d’une
lignée sauvage de M. truncatula (A17) et du mutant dmi3 qui constituent
un matériel biologique plus facile à manipuler pour notre étude que les
racines.

La production d’une forme tronquée active et la préparation de noyaux

ayant été obtenus avec un rendement suffisant permettent d’envisager
maintenant la réalisation d‘expériences de phosphorylation in vitro.

61
RESULTATS ET DISCUSSION

Production et Purification d’une forme tronquée active de DMI3

A mon arrivée au laboratoire, une construction avait été obtenue par

Olivier Godfroy permettant d’exprimer une forme tronquée de DMI3, DMI3 1-
311, chez E. coli. Cette construction, comportait également deux étiquettes :
- la partie N-terminale a été fusionnée à une étiquette moléculaire
Strep●TagII®, correspondant à une séquence protéique de 8 acides aminés
présentant une très forte affinité pour la Strep●Tactin®, une protéine dérivée
de la streptavidine. Ainsi, ce système permet de purifier sur des colonnes de
Strep●Tactin® des complexes protéiques dont au moins une protéine possède
l’étiquette Strep●TagII®, sans les dégrader.
- le plasmide commercial utilisé pour la fusion traductionnelle
Strep●TagII®-DMI3 tronquée (le pET52b(+) de Novagen) a permis l’ajout
d’une étiquette de 10 résidus Histidine en C-terminal de la protéine de fusion,
ce qui constitue un second moyen pour purifier la protéine.
Par ailleurs, ce type de construction avait été également retenu pour
pouvoir être introduite chez M. truncatula via la transformation au moyen
d’Agrobacterium rhizogenes. Dans ce cas, l’objectif était d’activer de façon
constitutive la voie de signalisation, en absence de traitement par les facteurs
Nod, afin de rechercher, in planta, les protéines en interaction avec la kinase
au moyen d’une purification des complexes par affinité sur colonne de
Strep●Tactin®.

- ARTICLE

1. Production et purification d’une forme tronquée DMI3 1-311

62
 A - Obtention de la protéine tronquée DMI3-311

A -1- Production de la protéine recombinante DMI3-311

Nous avons tout d’abord essayé de déterminer les conditions optimales

de production de la protéine tronquée sous sa forme soluble. Pour cela,
nous avons introduit la construction pET52b(+) -DMI3 1-311 dans des
cellules E. coli BL21 (DE3) que nous avons cultivé dans différents milieux
de cultures, à différentes températures et en présence de différentes
concentrations d’IPTG utilisé comme inducteur.

La première étape de cette analyse nous a permis de déterminer que la

température optimale de production de la protéine DMI3 311
recombinante sous sa forme soluble est de 28°C comparé aux résultats
obtenus à 16°C ou à 37°C.

Dans une seconde étape, nous avons examiné l’effet de la concentration

de l’IPTG sur l’expression de la protéine. Pour cela, nous avons cultivé
des cellules E. coli BL21 (DE3) dans du milieu LB à 28°C en présence de
1mM ou 2mM d’IPTG pendant 30 ou 120 minutes. L’analyse par SDS
PAGE représentée par la Figure 1a (voir Article) nous montre que la
production totale de la protéine DMI3 311, sous sa forme soluble
(surnageant S) et insoluble (culot P), augmente par rapport au temps
d’induction (durée de la culture cellulaire) mais ne semble pas
dépendre de la concentration d’IPTG utilisée. Nous avons obtenu des
résultats similaires en utilisant des concentrations plus faibles d’IPTG
(0.25 et 0.5 mM) (voir la Figure 1b Article).

Cependant, nous avons constaté que la protéine est retrouvée, en

quantité importante, dans les corps d’inclusion représentés par la
fraction insoluble (P). Nous avons donc tenté de changer de milieu de
culture. En effet, à partir de cellules E. coli BL21 (DE3), nous avons
63
comparé la production de DMI3 311 dans du milieu LB classique en
présence de 0,1mM d’IPTG à 28°C pendant 90 minutes, avec celle
obtenue dans un milieu spécial auto inducteur (Overnight ExpressTM
Instant TB Medium) utilisé en général pour la production de petites
protéines tout en favorisant leur solubilité sans l’utilisation d’IPTG. La
Fig2 représente l’analyse des fractions solubles et insolubles
correspondantes, par SDS PAGE (a) et par western blot via l’utilisation
de l’anticorps Strep-Tactin (HRP) dirigé contre le tag streptavidine de la
protéine (b). Les résultats montrent que la protéine DMI3 311
recombinante sous forme soluble est exprimée en quantité équivalente
aussi bien dans le milieu auto inducteur Overnight ExpressTM Instant TB
Medium (ligne 7) que dans le milieu LB classique (ligne3).

Toujours dans le but d’obtenir une meilleure expression de la protéine

tronquée sous sa forme soluble, nous avons tenté de cultiver les cellules
BL21 (DE3) dans le milieu minimum M9. Ce milieu a la particularité
d’être composé uniquement de sels (MgSo4, CaCl2) d’une source de
carbone (par exemple le glucose) d’antibiotiques (ampicilline et
chloramphénicol) et d’hydrolysat de caséine. Après avoir induit les
cellules avec 0,5mM d’IPTG pendant 180 minutes, les fractions solubles
et insolubles, obtenues après lyse cellulaire, ont été analysées par SDS
PAGE et par western blot mais aucun résultat significatif n’a été obtenu.

Nous avons alors essayé d’utiliser d’autres souches bactériennes comme

les cellules DH5a, les Rosetta-gami et les Tuner DE3 (voir le chapitre
Mat&Met) ; Seules les Tuner DE3 ont donné des résultats similaires à
ceux obtenus avec les cellules BL21(DE3).

En effet, nous avons essayé de produire la protéine tronquée DMI3 311

sous sa forme soluble au niveau des cellules Tuner DE3 en utilisant les
mêmes paramètres de culture cellulaire que pour les cellules BL21 DE3.
Pour cela, nous avons tout d’abord transformé les cellules avec la
64
construction pET52b(+) -DMI3 1-311 puis nous les avons induites avec
0,1mM d’IPTG à 28°C pendant 30 minutes, 60 minutes, 120 minutes et
180 minutes. Après une lyse cellulaire par French presse, les fractions
solubles et insolubles sont séparées et analysées par SDS PAGE. Les
résultats représentés dans la Figure 20 nous montrent que la protéine
DMI3 311, sous sa forme soluble (S) et insoluble (P), possède le même
profile d’expression que dans les cellules BL21 DE3. Nous constatons
également que la protéine tronquée est retrouvée en quantité
importante au niveau des corps d’inclusions représentés par la fraction
insoluble (P).

65
 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
kDa S P S P S P S P S P

50

DMI3 311
37

Figure 1a (Article): Effets de la concentration de l’IPTG sur

l’expression de la protéine recombinante DMI3 311

Analyse par SDS PAGE des extraits protéiques obtenus, après lyse
par French presse, à partir de cellules E. coli BL21 (DE3) cultivées
dans du milieu LB à 28°C en présence de 1mM ou 2mM d’IPTG
pendant 30 ou 120 minutes. La fraction soluble est représentée
par(S) et la fraction insoluble par (P). Lignes 1 et 2 : cellules non
induites ; Lignes 3, 4, 5 et 6 : cellules cultivées pendant 30 minutes
en présence de 1 mM d’IPTG (lignes 3 et 4) ou 2mM d’IPTG (lignes 5
et 6). Lignes 7, 8, 9 et 10 : cellules cultivées pendant 120 minutes
en présence de 1 mM d’IPTG (lignes 7 et 8) ou 2mM d’IPTG (lignes 9
et 10).

66
 M 1 2 3 4 5 6 7 8
kDa S P S P S P S P

50

DMI3 311
37

Figure 1b (Article): Expression de la protéine recombinante

DMI3 311 après induction par de faibles doses d’IPTG

Analyse par SDS PAGE des extraits protéiques obtenus, après lyse
par French presse, à partir de cellules E. coli BL21 (DE3) cultivées
dans du milieu LB à 28°C en présence de 0,25Mm ; 0,50mM et
1mM d’IPTG pendant 120 minutes. Lignes 1 et 2 : cellules non
induites ; Lignes 3 et 4 : cellules induites par 0,25Mm d’IPTG.
Lignes 5 et 6 : cellules induites par 0,5Mm d’IPTG. Lignes 7 et 8 :
cellules induites par 1Mm d’IPTG. (S) correspond à la fraction
soluble et (P) à la fraction insoluble.

67
 a) b)

M 1 2 3 4 5 6 7 8 M 1 2 3 4 5 6 7 8
kDa S P S P S P S P kDa S P S P S P S P

50
37
50

DMI3 311
37

Figure 2 (Article): Expression de la protéine DMI3 311 dans du

milieu LB classique et dans un milieu spécial auto inducteur
« Overnight ExpressTM Instant TB Medium »

Analyse comparative des fractions solubles (S) et insolubles (P)

obtenues à partir de cellules BL21 (DE3) cultivées dans du milieu LB en
présence de 0,1mM d’IPTG à 28°C pendant 90 minutes et dans un milieu
spécial auto inducteur « Overnight ExpressTM Instant TB Medium ».
L’expression de la protéine DMI3 311 est analysée par SDS PAGE après
coloration du gel au bleu de coomassie (a) et par western blot via
l’anticorps Strep-Tactin (HRP) utilisé au 1/10 000 (b). Lignes 1 et 2 :
cellules non induites ; Lignes 3 et 4 : cellules cultivées dans du milieu
LB en présence de 0,1mM d’IPTG à 28°C pendant 90 minutes ; Cellules
cultivées dans 2,5ml (Lignes 5 et 6) et 5ml (Lignes 7 et 8) de milieu auto
inducteur « Overnight ExpressTM Instant TB Medium ».

68
 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
kDa S P S P S P S P S P

50
DMI3 311

37

Figure 20 : Expression de la protéine recombinante DMI3 311

dans les cellules Tuner DE3

Des cellules Tuner DE3 sont cultivées dans du milieu LB en présence de

0,1mM d’IPTG à 28°C pendant 30 min, 60 min, 120 min et 180 min.
Après lyse cellulaire par French presse, les fractions solubles et
insolubles sont séparées et analysées par SDS PAGE à 10%
d’acrylamide. Lignes 1 et 2 : cellules non induites ; Lignes 3 et 4 :
cellules induites pendant 30 min ; Lignes 5 et 6 : cellules induites
pendant 60 min ; Lignes 7 et 8 : cellules induites pendant 120 min ;
Lignes 9 et 10 : cellules induites pendant 180 min ; (S) représente la
fraction soluble et (P) la fraction insoluble.

69
 D’autres procédés ont été utilisés dans le but de solubiliser
davantage la protéine tronquée DMI3-311. En effet, nous avons tenté
différentes lyses cellulaires : la lyse par FRENCH Presse, technique
habituellement utilisée au laboratoire, la lyse par ultrasons (sonication) et
la perméabilisation cellulaire par le shaps (voir le chapitre Mat&Met). La
lyse par FRENCH Presse nous a permis d’obtenir les meilleurs résultats.
A l’issue de cette première partie des résultats, nous pouvons établir les
conditions optimales de production de la protéine tronquée DMI3 311
recombinante à savoir utiliser les cellules BL21 DE3 ou les cellules Tuner
DE3 comme souches de production, 28°C comme température
d’incubation, 0,1mM d’IPTG comme dose d’induction et 90 minutes
comme temps d’induction. L’expression de la protéine tronquée sous sa
forme soluble n’est pas très importante mais reste suffisante pour
procéder à la purification de la protéine.

A-2- Purification de la protéine recombinante DMI3-311 par

chromatographie d’affinité FPLC

Dans le but de purifier la protéine DMI3-311 tronquée à partir de la

fraction soluble, nous avons choisi d’utiliser la chromatographie d’affinité
FPLC (voir chapitre Mat&Met). La protéine DMI3-311 étant taguée en N
et C terminal de sa séquence, nous avons tout d’abord tenté de la
purifier par son motif His tag localisé en C terminal en utilisant des
colonnes IMAC permettant une élution des protéines par un tampon
imidazole à 500mM. Aucune interaction de la protéine avec la matrice
n’a été observée après élution, suggérant ainsi que la partie C terminale
de la protéine pourrait être repliée sur elle même ou prendre une
conformation telle que le tag His serait masqué et par conséquent non
reconnu par la matrice. A la suite de cette observation, nous avons alors
tenté de purifier la protéine tronquée par l’intermédiaire de son tag
StrepTagII localisé en N terminal en utilisant la chromatographie
d’affinité StrepTactin™ Sepharose™ (StrepTrap HP 5ml). Après une
70
étape de fixation des protéines sur la matrice et différents lavages, les
protéines sont éluées par 2.5mM de désthiobiotine. Une analyse de ces
fractions est effectuée par électrophorèse 1-D à 15% d’acrylamide suivie
d’une coloration au PageBlue™. La figure 3 (Article) nous permet de
visualiser une protéine au poids moléculaire attendu d’environ 39 à
42kDa correspondant probablement à la protéine DMI3-311 tronquée.
En effet, la bande correspondant à la protéine suspectée DMI3-311 a été
excisée à partir du gel, digérée par une solution de trypsine et les
peptides analysés par spectrométrie de masse MALDI TOF (voir chapitre
Mat&Met). L’identification de la protéine a été réalisée à partir d’une
banque de données (NCBI) utilisant le programme MS-FIT (Protein
Prospector, http://prospector.ucsf.edu) et a révélée une forte homologie
de séquence avec la protéine DMI3-311. Par ailleurs, ce résultat a été
confirmé par western blot en utilisant l’anticorps Strep-Tactin (HRP)
dirigé contre le tag streptavidine de la protéine.

A- 3- Activité catalytique de la protéine DMI3-311

Après l’étape de purification, il est essentiel de vérifier, in vitro,
l’activité catalytique de la protéine DMI3-311 recombinante par le test
d’autophosphorylation de la protéine. Il est important de savoir qu’à
l’extrémité N-terminal du domaine kinase de la protéine se trouve le
domaine de liaison à l’ATP et à son extrémité C-terminal se trouve le
résidu Thr267, site d’autophosphorylation de la protéine. La présence
d’autophosphorylation est vérifiée par un marquage radio enzymatique
33
de la protéine avec de l’ATP P. La figure 21 nous révèle la présence
de phosphorylations au poids moléculaire attendu d’environ 39 à 42kDa
confirmant ainsi que la protéine DMI3-311 recombinante est bien
active.

71
 M 1 2 3 4 5 6
kDa T NR L1 L2 FE1 FE2

50
DMI3-311
37

Figure 3 (Article) : Purification de la protéine DMI3-311

recombinante par chromatographique StrepTactin™
Sepharose™

La purification de la protéine DMI3-311 recombinante à été réalisée

par chromatographique StrepTactin™ Sepharose™ (StrepTrap HP
5ml). Un volume de 15 ml de la fraction soluble est dilué dans du
tampon de fixation (100mM Tris, 150mM NaCl, PH8) puis appliqué
sur la matrice. Après lavages, la protéine tronquée est éluée par
2.5mM de désthiobiotine puis analysée par électrophorèse 1.D à
15% d’acrylamide.
Ligne 1 : témoin représenté par une fraction insoluble de BL21 DE3-
311 induites par 0,1 mM d’IPTG à 28°C pendant 90minutes; ligne
2 : protéines non retenues par la matrice (NR) ; ligne 3 et 4:
fractions représentant plusieurs lavages après fixation des protéines
(L1, L2) ; lignes 5 et 6 : fractions de protéines éluées par 2,5mM de
désthiobiotine (FE1, FE2).

72
 50
DMI3 -311
37

Figure 21 : Activité catalytique de la protéine DMI3 311

recombinante : Test d’autophosphorylation de la protéine

Après purification, l’activité catalytique de la protéine DMI3-311

recombinante est vérifiée par un test d’autophosphorylation de la
protéine. Un volume de 40µl de la fraction purifiée de DMI3 311
recombinante est additionné d’un tampon réactionnel (Mg cl2 10mM,
33
ATP P 50µM, DTT 1mM et Mncl2 10Mm) le mélange est incubé à
25°C pendant 1heure. Après centrifugation, l’échantillon est déposé
sur un gel SDS PAGE à 15% d’acrylamide, le marquage de la
protéine tronquée phosphorylée est révélé sur film X-Ray
(AMERSHAM) après 4 à 5 jours d’exposition à -80°C.

73
L’ensemble de ces résultats nous a permis d’obtenir une protéine
tronquée DMI3-311 recombinante sous forme soluble et fonctionnelle.
Cet outil moléculaire nous permettra de réaliser des phosphorylations in
vitro, tout d’abord dans des extraits de noyaux de cellules en suspensions
de M. truncatula A17 (lignée sauvage) et du mutant dmi3 (car les cellules
en suspension sont faciles à cultiver) puis dans des extraits racinaires,
dans le but d’identifier des substrats ou des partenaires moléculaires de
DMI3 impliqués dans le processus de nodulation ou de mycorhization.

B – Obtention des fractions nucléaires des cellules en

suspension de M. truncatula A17 et du mutant dmi3

B - 1 - Obtention des noyaux

L’obtention de noyaux à partir de tissus ou d’organes végétaux reste une
manipulation délicate. Différents protocoles existent dans la littérature et
font appel souvent à une étape intermédiaire par un stade protoplaste.
Toutefois l’obtention de protoplastes présente plusieurs inconvénients.
L’utilisation d’enzymes dégradant la paroi se traduit par la présence de
composés éliciteurs, associés aux cocktails enzymatiques ou libérés lors
de la lyse enzymatique, qui initient des réactions de défense. Les
protoplastes et les noyaux qui en sont issus après lyse par choc
osmotique ou mécanique constituent donc un matériel ayant subi un
stress. Nous avons donc opté pour une préparation de noyaux
directement à partir du matériel biologique par action mécanique au
moyen d’un broyage dans l’azote liquide et libération à l’aide d’un tampon
d’extraction préservant l’intégrité des noyaux. L’étape suivante consiste à
isoler les noyaux au moyen d’une centrifugation différentielle. Une
difficulté supplémentaire réside dans le fait que les noyaux et la paroi
végétale présentent une densité similaire. Il faut alors avoir recours à
une séparation sur gradient de densité suffisamment résolutif pour
arriver à obtenir une préparation de noyaux suffisamment purs. Nous
nous sommes ainsi inspirés du protocole établi au laboratoire pour les
74
suspensions cellulaires de tabac BY-2 (Da Silva et al, publication en
cours) et nous l’avons appliqué aux suspensions cellulaires de M.
truncatula.
L’obtention des extraits nucléaires de cellules en suspension de la lignée
sauvage A17 et du mutant dmi3 de M. truncatula a été réalisée à partir
de noyaux purifiés par centrifugation sur gradient discontinu d’iodixanol
(voir chapitre Mat&Met). Brièvement, une centrifugation du lysat
cellulaire à 3000xg pendant 30 minutes à 4°C sur un gradient discontinu
d’iodixanol permet d’obtenir 4 interfaces distinctes (0-10%, 10-25%, 25-
30% et 30-36%) où s’accumulent les éléments figurés de la cellule. Les
résultats obtenus à partir des observations de l’interface 30-36%, en
microscopie optique en lumière visible et en microscopie en fluorescence
(λ=630 nm), nous permettent de visualiser des noyaux exempts de
contaminations et que l’on voit fluorescents en bleu après une coloration
à l’iodure de propidium, (figure 22).

75
a A17 (10X) b A17 (10X)

c mutant dmi3 (20X) d mutant dmi3 (20X)

Figure 22 : Obtention de noyaux à partir de cellules en

suspension de M. truncatula A17 (lignée sauvage) et du mutant
dmi3. Une centrifugation des lysats cellulaires des cellules A17 et du
mutant dmi3 pendant 30 minutes à 4°C sur gradient discontinu
d’iodixanol permet d’obtenir 4 interfaces distinctes dont l’interface 30-
36% figurant ci dessus dans laquelle les noyaux purs attendus
fluorescent en bleu en microscopie U.V (λ=630 nm) après une coloration
à l’iodure de propidium ; a et b : noyaux de cellules A17 visualisés en
microscopie optique en lumière visible et en microscopie optique U.V
respectivement ; c et d : noyaux du mutant dmi3 visualisés en
microscopie optique en lumière visible et en microscopie optique U.V
respectivement. (10X, 20X = grossissement 10 fois et 20 fois).
76
 B – 2 - Caractérisation des extraits nucléaires de cellules
A17 et du mutant dmi3 à l’aide d’un anticorps polyclonal
dirigé contre DMI3

A mon arrivée au laboratoire un anticorps polyclonal avait été

généré par immunisation d’un lapin à l’aide de la protéine entière DMI3,
produite dans les corps d’inclusion chez E. coli. J’ai dans un premier
temps déterminé l’aptitude de cet anticorps à détecter DMI3 et DMI3 1-
311 produites chez E. coli. Les résultats présentés sur la figure 23
montrent que l’anticorps, utilisé au 1/1000ème immunodétecte à la fois la
protéine entière (signal à 58 KDa) et la protéine tronquée (signal à 42
KDa). Il semblerait cependant que la protéine tronquée soit moins bien
détectée.

Dans un deuxième temps, j’ai voulu déterminer s’il était possible

de détecter la protéine DMI3 dans les extraits nucléaires préparés à
partir des suspensions cellulaires.
Notre hypothèse est que l’anticorps polyclonal détectera la protéine
DMI3 dans la lignée sauvage et qu’il ne donnera aucun signal chez le
mutant. Les noyaux purifiés ont été repris par un tampon 5mM Bis-Tris ;
0,4M Saccharose ; 10mM NaCl et 5mM MgCl2 puis par le tampon de
charge en présence de 5% de 2- βmercaptoéthanol. Les différents
échantillons, représentant les extraits nucléaires, ont été ensuite soumis
à une électrophorèse 1-D à 10% d’acrylamide et une analyse par
immunodetection avec l’anticorps polyclonal.
Les résultats reportés figure 24 montrent que dans la lignée sauvage
A17 l’anticorps ne détecte pas de polypeptide au poids moléculaire
attendu (58kDa). Il semblerait que DMI3 soit trop peu abondante pour
être détectée à l’aide de cet anticorps. En revanche, chez le mutant
dmi3, l’anticorps détecte un polypeptide de poids moléculaire proche de
36 kDa. Ce signal serait- il non spécifique ou correpondrait il à un
polypeptide spécifiquement immunoréactif ?
77
 1 2 3 4 M

NI I NI I kDa

DMI3 (58kDa)
55

DMI3-311 (42kDa)
36

Figure 23 : L’anticorps polyclonal (315 SF) reconnaît la

protéine DMI3 recombinante entière à 58 kDa et la protéine
tronquée DMI3-311 à 42 kDa

Analyse par électrophorèse à 1-D à 12,5% d’acrylamide montrant

l’immunodétection de la protéine DMI3 recombinante entière à
58kDa ainsi que la protéine DMI3-311 recombinante à 42 kDa.
Ligne 1 et 2 : DMI3-311 recombinante à 42 kDa, culture non
induite (NI) et induite (I) par 0,1mM d’IPTG respectivement ;
Ligne 3 et 4 : DMI3 recombinante à 58 kDa, culture non induite et
induite par 0,1mM d’IPTG respectivement.

78
 Pour répondre à ces questions, nous avons réalisé un western blot
des mêmes échantillons en présence d’un sérum pré-immun. Notre
hypothèse serait que si la protéine visualisée à 34 kDa est une protéine
réagissant de manière non spécifique avec les IGGs, elle réagira alors en
présence d’un sérum pré-immun ; par contre, s’il n’y a aucune
interaction il se pourrait alors que cette protéine se révèle être un
polypeptide immunoréactif plus abondant chez le mutant. Les résultats
de l’analyse par western blot en présence d’un sérum pré-immun n’ont
révélé aucune protéine de poids moléculaire 34 kDa. Il semblerait donc
que l’anticorps puisse détecter un polypeptide plus abondant dans la
lignée cellulaire mutante. Il pourrait ainsi correspondre à une protéine
comportant un domaine kinase ou des EF-hands ayant des épitopes
communs à DMI3. Il serait ainsi interessant d’identifier cette protéine
afin de déterminer sa nature et sa relation directe ou indirecte avec
l’absence de CCaMK chez le mutant.

79
 1 2 3 4
dmi3 A17 I NI

72
55

36

Figure 24 : Caractérisation des fractions nucléaires de

cellules A17 et du mutant dmi3 par l’Anticorps polyclonal
315 SF

Analyse par western blot des extraits nucléaires obtenus à partir

de noyaux purifiés (1x106 noyaux/échantillon) des lignées
cellulaires du mutant dmi3 (ligne 1) et sauvage (ligne 2) à l’aide de
l’anticorps polyclonal utilisé au 1/1000ème.

80
CONCLUSION GENERALE ET PESPECTIVES

L’implication de la protéine DMI3 dans l’établissement des deux

symbioses racinaires et sa place de dernier effecteur connu commun
suggérait qu’elle pouvait jouer un rôle d’aiguillage entre les voies de
signalisation Nod et Myc. Pour jouer ce rôle, il faudrait que DMI3 soit
capable de phosphoryler des cibles différentes selon la nature du signal.
Ceci suppose qu’une information sur la nature bactérienne ou fongique de
ce signal puisse être perçue en amont, au niveau de DMI3 ou en aval.

Messinese et collaborateurs (2007) ont caractérisé une protéine IPD3 («

Interacting Protein for DMI3 ») capable d’interagir avec DMI3 dans le
noyau des cellules de feuilles de tabac. La présence de sites potentiels de
phosphorylation sur la protéine IPD3 ainsi que la co-expression spatio-
temporelle de IPD3 (Messinese, et al., 2007) et de DMI3 (Goderoy et al.,
2008) dans le noyau des cellules de M. truncatula, laisse penser que cette
protéine pourrait être une des cibles de la kinase DMI3. La protéine IPD3
pourrait donc être un nouvel effecteur appartenant à la voie de
signalisation commune aux symbioses rhizobienne et mycorhizienne.
Afin de mieux comprendre la transduction du signal en aval de DMI3,
l’identification de ses cibles ou ses partenaires, afin de déterminer si
parmi ceux-ci se trouvent des protéines spécifiques de l’une ou l’autre
des deux symbioses, reste un intérêt majeur.
La stratégie initiée dans ce travail de thèse se base sur l’obtention d’une
forme tronquée constitutivement active de DMI3 afin de pouvoir purifier
des protéines partenaires de DMI3 à partir d’extraits protéiques de
racines de M. truncatula.

Nous avons donc entrepris de produire une protéine tronquée DMI3-311

théoriquement active de façon constitutive grâce à une construction
tronquée DMI3 1-311. Après avoir établi les conditions optimales de
production, nos résultats montrent l’expression de la protéine tronquée
81
DMI3-311 recombinante sous sa forme soluble dans les cellules
bactériennes BL21(DE3) et Tuner(DE3).
Nous avons ensuite purifié la protéine tronquée sous sa forme soluble
(déjà marquée par une étiquette moléculaire StrepTagII en N-terminal)
par chromatographie d’affinité StrepTactin™ Sepharose™. En effet, nos
résultats analysés et confirmés par spectrométrie de masse MALDI TOF
nous ont permis d’identifier une protéine au poids moléculaire attendu.
Nous avons enfin vérifié, in vitro, l’activité catalytique de la protéine
DMI3-311 recombinante par le test d’autophosphorylation de la protéine.
Sachant qu’à l’extrémité N-terminal du domaine kinase de la protéine se
trouve le domaine de liaison à l’ATP et qu’à son extrémité C-terminal se
trouve le résidu Thr267, site d’autophosphorylation de la protéine, nos
résultats révèlent la présence de phosphorylations au poids moléculaire
attendu d’environ 39 à 42kDa confirmant ainsi que la protéine DMI3-311
recombinante est bien active.

Nous avons donc obtenu une protéine tronquée DMI3-311 recombinante

active. Cet outil moléculaire, très important, accompagné de l’anticorps
polyclonal (315 SF) reconnaissant la protéine sous ses deux formes
(sauvage et mutant) va nous permettre de rechercher et d’identifier des
protéines cibles phosphorylées ou des protéines partenaires de DMI3.
Les résultats préliminaires obtenus sur des cellules en suspension de
M.truncatula sont encourageants mais restent néanmoins à confirmer.

Par ailleurs, et dans le but de tester, in planta, l’activité de la protéine

tronquée DMI3-311, il serait intéressant d’effectuer des tests de
complémentation du mutant dmi3 avec la construction DMI3 1-311 sous
contrôle de son propre promoteur (pDMI3- DMI3 1-311) par la technique
de transformation par Agrobactérium rhizogenes. L’efficacité de la
transformation, en absence de toute stimulation symbiotique (facteurs
Nod ou symbiote bactérien), se traduit d’une part par l’expression du
gène de noduline précoce ENOD11 conférant ainsi aux tissus de
82
l’épiderme racinaire une coloration bleu et par la formation de structures
présentant l’anatomie d’une nodosité.

Il est intéressant de noter qu’il a été identifié un mutant ponctuel de la

CCaMK chez le lotier, snf1-1, qui forme des nodules spontanés. La
mutation affecte le site d’autophosphorylation de la CCaMK qui participe à
l’autorégulation de la protéine. Ce mutant ponctuel de CCaMK présente
une activité constitutive analogue à celle des formes tronquées chez M.
truncatula, mais est également capable de restaurer le processus
infectieux chez le mutant défectif (Tirichine, et al., 2006).

Il a été également montré chez le lotier, un mutant de la CCaMK,

CCaMKT265D (dans lequel la Thr265 a été remplacée par Asp) qui forme
des nodules spontanés et qui restaure le processus infectieux rhizobien et
mycorrhizien (Hayashi et al., 2010).

Il est donc clair que des formes constitutivement actives de DMI3 sont
capables, in vivo, d’interagir avec certaines des cibles impliquées dans la
mise en place de la symbiose rhizobienne.
L’approche biochimique que nous avons envisagée pour l’identification
des effecteurs symbiotiques en aval de DMI3 semble donc valable.
Cependant, cette approche risque de ne pas nous permettre d’identifier
les protéines partenaires de DMI3 impliquées dans le processus
d’infection de la racine par les rhizobium. D’autre part, en ce qui
concerne la symbiose mycorhizienne, nous ne savons pas si la voie de
signalisation est activée par ces formes tronquées de DMI3. Pour
déterminer si c’est le cas, il nous faudrait disposer d’un gène marqueur
de la symbiose mycorhizienne à l’image d’ENOD11 pour la symbiose
rhizobienne. Les travaux de transcriptomique réalisés chez M. truncatula
et le riz ont révélé un certain nombre de gènes exprimés ou activés au
cours de la symbiose mycorhizienne (Brechenmacher, et al., 2004 ;
Frenzel, et al., 2005 ; Güimil, et al., 2005 ; Hohnjec, et al., 2005 ;
83
Küster, et al., 2004 ; Liu, et al., 2003 ; Manthey, et al., 2004 ;
Massoumou, et al., 2007 ; Sanchez, et al., 2005 ; Weidmann, et al.,
2004 ; Wulf, et al., 2003). Parmi ceux-ci, certains, exprimés très
précocement et activés à distance par le champignon mycorhizien de
façon DMI3 dépendante (Weidmann, et al., 2004) pourraient être utilisés
comme marqueurs de l’activation de la voie de signalisation
mycorhizienne et ainsi valider l’utilisation de la forme tronquée de DMI3
pour rechercher ses cibles dans le contexte de la symbiose
mycorhizienne.

84
MATERIEL ET METHODES

1. Matériel biologique et méthodes

1. 1. Production de la protéine DMI3 dans E. coli :

• Construction du gène DMI3 dans le plasmide pET52b(+)

Lors du clonage du gène DMI3, plusieurs clones d’ADNc ont été

produits et utilisés dans le but de construire une forme tronquée et
taguée (Strep tag et His tag) dans le plasmide pET52b (+) sous contrôle
du promoteur T7 (Godfroy et al. en préparation). Cette forme tronquée,
correspondant seulement au domaine kinase de la protéine DMI3, code
pour une protéine de 311 acides aminés et de poids moléculaire
d’environ 40 kDa.

• Extraction de plasmides pET52b(+) -DMI3 1-311 à partir

de cellules bactériennes DH5α

Les plasmides pET52b(+) -DMI3 1-311 sont extraient à partir de

cellules bactériennes DH5α par un kit Minipreps d’ADN (Wizard plus SV
minipreps ADN PROMEGA) comme suit : après avoir repris les culots
bactériens dans la solution de resuspension cellulaire, les cellules sont
incubées pendant 5 minutes dans du tampon de lyse. Les endonucléases
sont ensuite inactivées par une solution de protéases alcalines. Après
neutralisation, le lysat bactérien est centrifugé et le surnageant est alors
transféré sur une colonne spin. Après plusieurs lavages, les plasmides
sont enfin élués par une eau dépourvue d’ADNase (ADNase free).

85
 • La transformation cellulaire dans E. coli

La construction pET52b(+) -DMI3 1-311 a été introduite, par

transformation cellulaire, dans différentes souches d’E.coli compétentes
comme BL21-DE3, TunerTM-DE3 et Rosetta-gamiTM.
En effet, 50µl de cellules BL21 (DE3), 20 µl de cellules Tuner (DE3)
ou de Rosetta-gamiTM sont rajoutés, séparément, à 1 ou 2µl d’une
solution d’ADN plasmidique (pET52b(+)-DMI3-311). Le mélange est
placé dans de la glace pendant 30 minutes puis incubé 30 secondes dans
un bain marie à 42°C. Après avoir rajouté 450 µl de milieu SOC stérile,
les cellules sont incubées sous agitation à 37°C pendant 1 heure 30
minutes. Les transformants sont enfin sélectionnés après incubation
toute une nuit à 37°C sur milieu LB agar contenant de l’Ampicilline (voir
le protocole NOVAGEN TB009 Revue F 0104).

• Les différentes souches bactériennes utilisées

Dans le but de produire un maximum de protéine DMI3 recombinante

sous forme soluble, nous avons sélectionné différentes souches de
cellules bactériennes parmi elles les BL21-DE3, les Tuner-DE3 et
les Rosetta-gami:

Les BL21-DE3: ces cellules hôtes que l’on appelle les Gold
Standard, sont les plus utilisées dans le système expression. Déficientes
en protéases Ion et OmpT, elles ont l’avantage de conférer une certaine
stabilité aux protéines étiquetées.

Les TunerTM: Ce sont des cellules dans lesquelles l’expression

protéique est contrôlée. Ce sont des mutants possédant une délétion lac
perméase. Lors de l’induction cellulaire, ces cellules permettent une
entrée uniforme de l’IPTG au niveau de toutes les cellules impliquant

86
ainsi une induction homogène (concentration dépendante) favorisant la
solubilité et l’activité des protéines étiquetées.

Les Rosetta-gamiTM: Ces cellules hôtes possèdent une mutation au

niveau des gènes de la thiorédoxine réductase (trxB) et de la glutathion
réductase (gor) résultant par une formation de ponts disulfures avec une
expression de protéines eucaryotes possédant des codons rarement
utilisés chez E.coli (AGG, AGA, AUA, CUA, CCC et GGA).

• Les conditions de culture bactérienne

Différentes conditions de culture cellulaire ont été testées dans le

but d’obtenir la protéine tronquée DMI3 sous sa forme soluble. Pour cela,
nous avons utilisé différents milieux de cultures (le milieu LB, le milieu
TM
Over night Express Instant TB, le milieu minimum M9 etc.),
différentes températures (16°C, 28°C et 37°C) et inducteur comme
l’isopropyl.pD-thiogalctopyranoside (l’IPTG). Nous avons donc
sélectionné les meilleurs paramètres :

- Culture sur milieu LB : à partir d’une préculture, les cellules sont

cultivées dans du milieu LB sous agitation à 37°C jusqu’à atteindre une
densité optique (D.O600nm) de 0.6 et sont immédiatement induites avec
0.1mM d’IPTG, pendant 1 heure 30 minutes pour les BL21 et 3 heures
30 minutes pour les Tuner DE3, à 28°C sous agitation. Après
centrifugation, les culots bactériens sont conservés à -20C°.

TM
- Culture sur milieu « Over night Express Instant TB
Medium » : Après transformation cellulaire, une colonie est introduite
dans 2.5 ml de milieu TB (Catalogue NOVAGEN) et incubée sous

87
agitation toute une nuit (environ 14 heures) à 37°C. Les cellules sont
ensuite centrifugées et les culots bactériens sont conservés à -20C°.

1 - 2 - Obtention des extraits bactériens

Les culots bactériens sont repris dans 500µl de tampon de lyse

(100mM Tris PH 8.0, 150mM Na Cl, 1Mm EDTA, 1mM AEBSF (inhibiteur
de protéases), 1mM DTT, 0.6 µg/ml de désoxyribonucléase I bovine
(DNase, SIGMA)) puis les cellules sont lysées par différents procédés
utilisés séparément dans le but d’obtenir le meilleur rendement quant à
la séparation des protéines solubles et insolubles. Nous avons testé la
lyse par sonication, par FRENCH Press et par l’utilisation du détergent
non ionique shaps.

- La lyse par sonication :

Les culots bactériens sont repris dans 500µl de tampon de lyse (50
mM Tris PH 8.0, 50mM Na Cl, 1Mm EDTA, 1mM AEBSF, 5mM DTT,
0,2mg/ml lysozyme, 0,5%, triton X-100, 0.6 µg/ml DNase) puis soumis
à une sonication (2 à 3 cycles par minute avec un pulse toutes les 0,5
secondes à une puissance de 80%). Les cellules sont ensuite
centrifugées à 15 000 rpm (27 200 xg) pendant 30 minutes à 2°C. La
fraction protéique soluble (contenue dans le surnageant) et insoluble
(culot) ainsi obtenues sont enfin conservées à -20°C.

88
 - La lyse par FRENCH Press :

Les culots bactériens sont repris dans 500µl de tampon de lyse

juste avant de subir la lyse par FRENCH Press. Celle-ci est effectuée à
une pression de 20,000 psi (voir le manuel Thermo Fisher
scientifique, révisé en 2009). Les fractions protéiques solubles et
insolubles sont ensuite séparées par une ultracentrifugation à 100.000xg
pendant 20 minutes à 4°C puis conservées à -20°C.

- La lyse par du shaps :

Les culots bactériens sont repris dans 500µl de tampon de lyse (50
mM Tris PH 8.0, 50mM Na Cl, 1Mm EDTA, 0,2mg/ml lysozyme, 5mM
βMercapto-Ethanol, 0,5% Shaps, 1mM AEBSF, 0.6 µg/ml DNase) puis
soumis à une sonication (2 à 3 cycles par minute avec un pulse toutes
les 0,5 secondes à une puissance de 80%). Les cellules sont ensuite
centrifugées à 15 000 rpm (27 200 xg) pendant 30 minutes à 2°C. Les
fractions soluble et insoluble sont conservées à -20°C.

1 – 3 - Culture de cellules Médicago truncatula

Les suspensions cellulaires de Medicago truncatula ont été

générées à partir de cals obtenus à partir de racines de la plante
sauvage (A17) ou du mutant dmi3. Elles sont cultivées en milieu
Murashige et Skoog modifié (Gressent et al., 1999) à 21°C, en lumière
continue (13 W.m-2) et sous agitation (125 rpm). La culture cellulaire
est repiquée tous les 14 jours en ajoutant 30 ml de suspension dans 300
ml de milieu frais. Les cultures sont récoltées en phase stationnaire de
croissance, à 2 semaines, par filtration sous vide sur une toile nylon de
37 µm de vide de maille. Les cellules sont rincées sous vide par un
89
grand volume de KCl à 20 mM, congelées dans l’azote liquide et
conservées à -80°C jusqu’à leur utilisation.

1 - 4 - Obtention de noyaux à partir de cellules A17 de

Médicago truncatula et du mutant dmi3

10g de cellules A17 de Médicago truncatula et du mutant dmi3,

sous forme lyophilisées et congelées (-80°C), sont broyés dans un
mortier en présence d’azote liquide jusqu’à l’obtention d’une poudre fine.
Après avoir rajouté 100ml de tampon NB1 2,5 x (41,6 mM Tris-Mes pH
7,5 ; 0,83 mM Hexylène glycol ; 83,3 mM βglycerophosphate ; 16,6 mM
NaF ; 1,6 mM Orthovanadate ; 1,6 mM DTT ; 1,6 mM AEBSF ; 8,3 mM
EDTA ; 8,3 mM EGTA), le mélange est filtré délicatement sur une
membrane de nylon. La présence de noyaux dans le filtrat est vérifiée
par microscopie à fluorescence (20µl de filtrat +1µl de Dapi à 2µg/ml
déposés sur une cellule Fuchs-Rosenthal).
Après centrifugation (500xg, 10 minutes à 4°C sans freins), les
culots de noyaux sont repris dans 9ml de tampon NB1 1x puis 3ml de
cette suspension sont ensuite déposés sur un gradient discontinu de
Iodixanol préparé dans le tampon NB1 1x (gradients de 10% ; 25% ;
30% ; 36%, à raison de 2ml par gradient dans des tubes Kimbel). Une
centrifugation à 3000xg pendant 30 minutes à 4°C permet d’isoler les
noyaux situés à l’interface 30-36% exempts de contaminations et
visibles en microscopie optique.
Pour des expériences de western blot, les noyaux isolés sont lavés
et repris dans un tampon additionné d’inhibiteurs de protéases (0,4 M
saccharose ; 5 mM Bis-Tris-HCL pH 5,3 ; 10 mM NaCl ; 5mM MgCl2 ; 0,1
mM PMSF et 2µM Leupeptine) (Toucheux, année…). Ils sont enfin prêts
pour une électrophorèse sur gel d’acrylamide en présence de 5% de 2β-
mercaptoethanol.

90
2 - Méthodes analytiques

2 – 1 – Le Western blot

Les fractions protéiques sont analysées par électrophorèse à 1-D

sur gel d’acrylamide SDS PAGE à 10% en conditions dénaturantes. Le
transfert des protéines à partir du gel d’électrophorèse sur une
membrane de nitrocellulose est effectué pendant 45 min. sous tension
constante de 20 V dans un tampon de transfert (Tris 48 mM ; glycine 39
mM ; méthanol 20 %) à l’aide d’un appareil de transfert semi-sec (Semi-
Dry Tansfer Cell, Bio-Rad). Après vérification de l’efficacité du transfert
par une coloration au rouge ponceau, la membrane est bloquée 1 heure
en présence de PBS/Tween 0,1 %, lait écrémé (5 %). La protéine DMI3-
311 recombinante est ensuite détectée par chimiluminescence grâce à
un anticorps reconnaissant la séquence étiquetée StrepTavidine des
protéines. Cet anticorps est le Strep-Tactin horse radish conjugué à la
peroxydase (HRP) et dilué au 1:10.000 (Voir le protocole IBA
Biotechnologie, Décembre 2006).

2– 2 - Purification de DMI3-311 par chromatographie

d’affinité FPLC Superflow

Dans le but de purifier la fraction soluble de la protéine DMI3-311,

obtenue après lyse par FRENCH Press, nous avons choisi la
chromatographie d’affinité basée sur la reconnaissance séparément des
séquences étiquetées streptavidine et His 10x situées respectivement
aux extrémités N-terminale et C-terminal de la protéine.

Pour la reconnaissance de la séquence C-terminale (tag His 10x)

de la protéine nous avons utilisé une colonne d’affinité IMAC et un
tampon d’élution contenant de l’imidazole à 500 mM.
91
 Concernant la reconnaissance de la séquence N-terminale de la
protéine (StrepTagII), nous avons choisi la chromatographie d’affinité
StrepTactin™ Sepharose™ (StrepTrap HP 5ml). Brièvement, la fraction
soluble de la protéine DMI3-311 est diluée dans du tampon de fixation
(100mM Tris, 150mM Na Cl, PH8) puis appliquée sur la colonne, deux
passages successifs sont suffisant pour fixer les protéines spécifiques.
Après lavages, la protéine DMI3-311 recombinante est éluée par
2.5mM de désthiobiotine (QIAGEN Strep-tagged Protein Purification
Handbook, 2007).
Enfin, la protéine éluée est analysée par électrophorèse 1-D à 15%
d’acrylamide puis identifier par western blot grâce à l’anticorps Strep-
Tactin (HRP).
Sa séquence sera analysée en parallèle, par spectrométrie de
masse MALDI- TOF (Chevalier et al, 2004 ; Borderies et al, 2003).

2 – 3 - Spectrométrie de masse MALDI TOF (Matrix Assisted

Laser Desorption Ionization-Time Of Flight)

Après avoir purifié la protéine DMI3-311 par chromatographie

d’affinité FPLC, nous avons analysé sa séquence par Spectrométrie de
masse MALDI TOF à partir du gel d’électrophorèse à 15% d’acrylamide.
En effet, la bande correspondant à la protéine DMI3-311 est excisée du
gel, hydrolysée par de la trypsine à 50ng/µl et ses peptides analysés
par spectrométrie de masse MALDI TOF (Voyager-DE STR, PerSeptive
Biosystems, Framingham, MA, USA) (Borderies et al, 2003).

La technique MALDI utilise en général un faisceau laser pulsé pour

désorber et ioniser un mélange de matrice/échantillon peptidique co-
cristallisé sur une surface métallique. L’énergie transmise par le laser
provoque l’expansion de la matrice en phase gazeuse en entraînant les
molécules de l’échantillon. Les peptides ionisés sont fragmentés du fait
92
de ruptures aléatoires de liaison au sein de l’ion puis accélérés par une
différence de potentiel. Le rapport masse/charge mesuré est directement
proportionnel au temps mis par l’ion pour aller de la source au détecteur
(analyseur temps de vol). L’ensemble de ces ions constitue le spectre de
masse dont la lecture permet l’identification de la protéine par
cartographie peptidique.

L’identification de la protéine recherchée est analysée grâce à une

banque de données de séquences de protéines non redondantes (NCBI)
ou à une banque de données locale
(http:/sequence.toulouse.inra.fr/Mtruncatula.html).

2– 4 - Test d’activité radio enzymatique

L’activité catalytique de la protéine DMI3-311 recombinante est

vérifiée par un test d’autophosphorylation de la protéine. En effet, à un
volume de 40µl de fraction purifiée est additionné un tampon réactionnel
33
(Mg cl2 10mM, ATP P 50µM, DTT 1mM et Mncl2 10Mm), le mélange est
ensuite incubé à 25°C pendant 1 heure. Après centrifugation, les
protéines marquées sont séparées par électrophorèse sur un gel SDS
PAGE à 10%. Le marquage des protéines phosphorylées est révélé sur
film X-Ray (AMERSHAM) après 4 à 5 jours d’exposition à -80°C.

93
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 Abstract

In legumes, the establishment of symbioses with arbuscular

mycorrhizal fungi and nitrogen-fixing bacteria share a common
signalling pathway. One of the shared components is a calcium and
calmodulin dependant protein kinase predicted to perceive and
transduce the calcium signals generated upon perception of the
symbiotic signals. The removal of the autoinhibitory domain that
negatively regulates the kinase activity in Medicago truncatula, results
in a constitutively-active form, inducing symbiotic responses in the
absence of bacterial signals. Here, the heterologous production and
partial purification of DMI3 variant as a tool for identifying substrates
potentially involved in nodulation or mycorrhization was described.

Key words: Medicago truncatula, CCaMK, heterologous protein

expression

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