TECHNIQUES EN IMMUNOLOGIE

Biologie-Biochimie L3 2016-2017
 L’immunoenzymologie
Technique puissante couramment utilisée en recherche et en
diagnostic
Basée sur la très grande spécificité des anticorps pour leurs
antigènes

 Test qualitatif Détection de protéines après électrophorèse : Western-blot

Détection de protéines sur une coupe histologique

 Test quantitatif Dosage d’antigènes ELISA (direct, compétitif…)

Dosage d’anticorps EMIT

Principe de la réaction Composé coloré

Spectrophotométrie
complexes
Ag-traceur + Ac Composé
Ac-Ag-traceur fluorescent
signal
Ag-Ac-traceur fluorimétrie
Ag + Ac-traceur
Emission de lumière
substrat luminescence
1. l’anticorps primaire

Anticorps primaire Anticorps primaire

Ag Ag

Ex: Méthode ELISA compétition Histologie : immunofluorescence directe

Espèces chez qui l’anticorps primaire peut-être obtenu :

souris, lapin, rat, chèvre…
Isotype IgG

2. l’anticorps secondaire
Immunoglobuline dirigée contre la
partie Fc de l’anticorps I et produit chez
Anticorps secondaire
une autre espèce que cet anticorps I

Ex : Ac I = IgG lapin
Ag Ac II = IgG de chèvre anti-IgG de lapin
 Ag Ag

Détection du complexe Ag-AcI-AcII Avantage du système :

Ac secondaire conjugué amplification du
signal

3. Les composés conjugués

Les enzymes
Enzyme d’oxydoréduction La peroxydase du raifort (« Horseradish peroxydase »,
HRP)
Enzymes hydrolytiques Phosphatase alcaline
b-galactosidase
Les radio-isotopes
Principalement l’iode-125 et le tritium (H3)

Les fluorophores
Principalement en microscopie (rhodamine, FITC)
 4. Le système (strept)avidine-biotine

Avidine: glycoprotéine du blanc d’œuf

(66 000 daltons)
4 sites de liaison pour la biotine
Streptavidine : protéine synthétisée par
Streptomyces avidinii (60 000 daltons)

Biotine : vitamine H

Système d’amplification des signaux

Affinité (strept)avidine-biotine est extrêmement élevée (10-15M) (supérieur à Ag-
Ac: 10-13M)
Enz Enz
B B
Av Av
B B B B
Enz
+ Substrat Signal

Ag Ag Ag Ag
 Les différentes méthodes

Détection Western blot,

immunohistochimie
Phase hétérogène
Antigène ELISA compétition
Dosage Immunométrique
(ELISA sandwich)

EMIT (Enzymes
Phase homogène Dosage Multiplied
Immunoassay Technique

Immunométrique
Anticorps Phase hétérogène Dosage de type ELISA
Phase hétérogène: l’étape de blocage (saturation)

Les supports physiques utilisés ont une affinité élevée pour les
protéines
Dépôt
d’antigène

Dépôt
d’anticorps

Les protéines adsorbées sur le

support n’occupent qu’une
Plaque ELISA
Membrane nitrocellulose
petite fraction de la surface

Nécessité d’occuper l’espace afin d’éviter des fixations non spécifiques

d’anticorps et/ou d’antigènes
Ac II
• Sérum Albumine
• Lait en poudre
Ag
• Collagène Ac I

Détergent doux
(tween20)
Protéines inertes
Détection d’antigène: Western-blot

 Détection de protéines

 Détermination du poids moléculaire

Etape 1: séparation des protéines

selon leur poids moléculaire

SDS-PAGE : Sodium Dodécylsulfate-

PolyAcrylamide Gel Electrophoresis
Etape 2: Transfert des protéines sur un support solide
(membrane de nitrocellulose)
Etape 3: Incubation avec
les anticorps et révélation
 Révélation par émission de lumière et
impression de films photographiques :
Electrochemiluminescence (ECL)

Révélation colorimétrique
de bandelettes
Dosage d’antigènes en phase hétérogène

1. Méthode ELISA compétition (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)

Compétition à l’Ag marqué Ag recherché de petite taille (hormones, médicaments)

Ac I fixé
E
E Ag marqué (quantité fixe)
E

Ag à doser (non marqué;

quantité variable)

Intensité signal
 Réalisation d’une courbe
d’étalonnage avec des solutions d’Ag de Courbe
d’étalonnage
concentrations connues

 Dosage avec le sérum du patient.

Détermination de la concentration
d’Ag contenu dans le sérum à l’aide de 1 10 100 1000
la courbe étalon
[Ag] non marqué ng/ml
Compétition à l’Ac marqué

Eliminés par lavage

Ag à doser
(quantité variable)
Ag fixé
E

E
E

+ E
E

E
E
E

Ac marqué
(quantité fixe)

A l’équilibre de la réaction Ag-Ac, l’anticorps s’est réparti entre l’Ag à

doser et l’Ag fixé
Plus l’Ag à doser est abondant, moins l’Ac marqué peut accéder à la
phase solide
2. Dosage immunométrique de type sandwich
Ag circulant dans le sérum et divalent (ex: Ag bactériens, viraux, parasitaires)
Méthode ELISA sandwich (100 fois plus sensible que ELISA compétition)

Signal augmente en fonction de la

Ag divalent concentration d’Ag
+ recherché

Intensité signal
+ E
1 10 100 1000

[Ag] pg/ml

E + Substrat
Signal
Dosage d’antigènes en phase homogène

Technique EMIT = Enzyme Multiplied Immunoassay Technique

Méthode de recherche d’antigènes de petite taille (drogues, médicaments…) dans
les échantillons biologiques (sang, urine…) – méthode compétitive et automatisable
(couramment utilisée dans les laboratoires de toxicologie)

Ag recherché +
Substrat de l’enz

Enz
Ac

Ag recherché présent Ag recherché absent

Signal

Dégradation du substrat Site catalytique inaccessible

Signal  [Ag]  Signal inchangé
Dosage d’anticorps en phase hétérogène
1. Dosage ELISA à l’antiglobuline marquée (ELISA indirect)
Sérodiagnostics bactériens, viraux, parasitaires – recherche d’anticorps dans le
sérum de patients suite à une infection ou une vaccination

Ag fixé Ac sérique recherché

+
Ac secondaire marqué

Intensité signal
E

E
+ Substrat
1 10 100 1000

Signal [Ac]
2. Recherche des IgM spécifiques d’un Ag donné

Immunocapture des IgM totales

IgM non spécifique

Ag E

+ Substrat
Ag
E Signal
IgM spécifique
Sériodiagnostic du VIH
Protéine d’enveloppe gp120 et 14 21
gp41 (précurseur gp160)
Gène env

Protéine de nucléocapside p24 Cinétique de détection des

Gène gag marqueurs de l’infection VIH

Protéine de Transcriptase inverse

p32, p55, p65
Gène pol
Le sérodiagnostic de l’infection à VIH

Test ELISA (en première intention)

Western-blot (en confirmation d’une séropositivité VIH)

Test ELISA sandwich Test ELISA de 4ème génération

(ELISA de 3ème génération) VIDAS® HIV DUO ULTRA (Biomérieux)

Ag p24
Ag VIH Ac anti-
Ac anti-VIH recherché
p24 fixé E

E
Enz + substrat
Ac anti-p24
Ag VIH marqué marqué

Enz E

Ag VIH Ac anti-VIH
E
Signal  [Ac anti VIH] 
(IgG et IgM) Ag VIH marqué
Western-blot
Mise en évidence des Ac anti-VIH du patient
1. Séparation des protéines virales par SDS-PAGE
2. Transfert sur bandelette de nitrocellulose
3. Incubation avec le sérum du patient
4. Révélation avec un anticorps anti-IgG humain marqué

La présence de bandes révèle l’existence d’anticorps dirigés

contre des Ag du VIH dans le sérum du patient

Positif si reconnaissance de gp160,

gp120 et au moins une protéine pol
(p32, p65 ou p55) ou une protéine
gag (p24 ou p18)
 Bandelette positive
 Bandelette négative