Dépistage des mycotoxines

Bart Huybrechts
Centre d’Etudes et de Recherches vétérinaires et agrochimiques (CODA-CERVA)
Direction opérationnelle Sécurité chimique de la chaîne alimentaire,
Service Toxines et Substances naturelles
Laboratoire national de référence pour les Mycotoxines
Leuvensesteenweg 17, 3080 Tervuren, Belgique

Introduction

Les problèmes de sécurité alimentaire sont essentiellement associés à la présence potentielle de contaminants
issus des activités humaines, tels que les pesticides, par exemple. Une attention bien moindre est prêtée aux
contaminants d’origine naturelle. Les mycotoxines sont un bon exemple de contaminant ‘naturel’ : il s’agit des
substances toxiques produites par les moisissures. Début de l’année dernière, les mycotoxines ont fait parler
d’elles lorsque du maïs-fourrage importé d’Europe de l’Est et contaminé par l’aflatoxine, une des mycotoxines
les plus connues et les plus toxiques, est entré dans l’alimentation de bêtes laitières. Les moisissures des familles
Aspergillus, Fusarium et Penicillium sont les principaux producteurs de mycotoxines dans les denrées alimentaires.
Une première condition pour limiter autant que possible la présence de mycotoxines dans l’alimentation est de
prévenir le développement des moisissures à tout moment de la production et de la transformation. Le stoc-
kage de la récolte représente également un moment critique ; la température et le taux d’humidité doivent être
contrôlés en permanence. Les mycotoxines sont des composés très stables qui résistent à la plupart des procédés
de préparation et de transformation. Cela signifie que les mycotoxines peuvent encore être présentes alors même
que la moisissure qui les a produites ne peut plus être décelée. De plus, les mycotoxines peuvent pénétrer dans
la chaîne alimentaire par différentes voies. Outre la possibilité d’une contamination primaire, une contamination
secondaire peut également se produire, avec, par exemple, l’introduction d’aflatoxines dans la chaîne alimentaire
humaine par le biais du lait.

Tests rapides versus méthodes de confirmation

Étant donné qu’une contamination par ces toxines ne peut jamais être totalement exclue et qu’une décontami-
nation systématique ne constitue pas une option acceptable en raison de la dégradation olfactive inévitable du
produit, il est recommandé de surveiller la présence de ces toxines dans les denrées alimentaires. Il n’est pas si
évident de développer des méthodes d’analyse capables de détecter ces toxines de manière fiable et en routine,
dans des matrices diverses (des céréales à la viande, en passant par le miel), d’autant plus que la norme applicable
à plusieurs de ces toxines peut être relativement basse. Le fait qu’une méthode d’analyse nouvellement dévelop-
pée soit adaptée ou non à une utilisation commerciale en routine est déterminé par trois critères pratiques : (a) la
fiabilité, c.-à-d. l’exactitude et la précision (b) la rapidité et donc, dans une large mesure, le prix de l’analyse (c) la
possibilité de réaliser l’analyse “sur le terrain”.
Sur base de ces critères, les techniques d’analyse des mycotoxines peuvent être classées en deux catégories : (1)
les tests rapides de dépistage et (2) les méthodes de confirmation. Tandis que les méthodes de la catégorie 1 ont
principalement pour but de détecter les toxines le plus rapidement possible, de préférence déjà sur le terrain et
de manière plutôt qualitative, c.-à-d. en donnant une réponse “oui” ou “non”, les méthodes de la catégorie 2 sont
essentiellement utilisées pour confirmer un résultat positif obtenu avec un test rapide, et/ou pour fournir un
résultat quantitatif plus précis (“quelle est la quantité exacte présente ?”). Les deux catégories de méthodes ont
en commun qu’elles nécessitent une étape d’extraction, lors de laquelle la toxine est extraite de l’échantillon au
moyen d’un solvant (p.ex. alcool). Leur différence fondamentale est la manière dont se fait la détection.

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Tests rapides

La majorité des tests rapides se basent sur les anticorps (essais immunologiques) pour la détection et diffèrent
essentiellement entre eux suivant la manière dont est utilisé l’anticorps. Trois formats sont actuellement com-
mercialisés : (1) les tests ELISA (enzyme-linked immunosorbent-assays) (2) les tests à bandelette réactive et à flux
latéral et (3) les FPIA (immunoessais à polarisation de fluorescence). Ces derniers ne sont presque plus utilisés en
raison de leur complexité. Dans les tests ELISA, la toxine doit se lier à un certain nombre de sites de liaison d’un
anticorps dans la solution d’extraction, immobilisés dans une plaque multititre, ce qui entraîne une extinction du
signal ; en d’autres termes, moins le test émet de signal, plus la toxine est présente. Un inconvénient de ce test
est qu’il réclame une main-d’œuvre relativement élevée et qu’il est difficilement applicable sur le terrain. Les tests
à bandelette réactive et à flux latéral sont des tests immunochromatographiques où la présence de la toxine est
mesurée au moyen d’une bandelette jetable. Ces bandelettes contiennent un anticorps lié à une particule de
couleur ; lorsque l’agent d’extraction est ajouté, la toxine présente se lie à la particule de couleur, la bandelette de
papier se colore et démontre ainsi la présence de la toxine. Le grand avantage de ce test par rapport au test ELISA
est qu’il peut être appliqué sur le terrain, raison pour laquelle il a récemment fortement gagné en popularité. Ces
tests immunologiques ont cependant un point faible : les autres composants présents dans l’échantillon sont
susceptibles d’influencer la liaison de l’anticorps et d’ainsi donner lieu à un faux négatif ou à un faux positif.

Figure 1 : Test rapide de type ELISA avec plaque de titration de
96 puits. Chaque position exige plusieurs étapes de pipetage
pour parvenir à un résultat.
Figure 2 : Test bandelette. La solution
d’échantillon peut directement être appli-
quée sur cette bandelette. Une colora-
tion indique ensuite le résultat positif ou
négatif.

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Nouvelles tendances

L’évolution récente des méthodes de détection peut être perçue comme la réponse à deux demandes conflic-
tuelles : d’une part, la demande de méthodes toujours plus rapides et toujours plus simples, avec une meilleure
applicabilité “sur le terrain”, et d’autre part l’évolution vers des méthodes de référence davantage fiables et
capables de détecter le plus de toxines possible en une seule analyse. Indépendamment de ceci, on a également
une demande de méthodes d’extraction nécessitant des agents organiques d’extraction moins nocifs, sans pour
autant toucher à la qualité des analyses.

Tests rapides

Tests à flux multi-toxines (multiplex)

Grâce à leur manipulation beaucoup plus aisée, les tests rapides sous la forme de bandelettes ont rapidement
gagné des parts de marché, comparativement aux tests ELISA. Un inconvénient important qu’ils partageaient
avec les tests ELISA est qu’ils ne pouvaient détecter qu’une seule mycotoxine par analyse. Récemment, plusieurs
tests à flux capables de mesurer plusieurs toxines au cours d’une même analyse ont été mis à disposition sur le
marché. Leur inconvénient, cependant, est qu’ils sont pour l’instant encore moins sensibles que les tests à bande-
lette réactive mono-toxine.

Polymères à empreintes moléculaires (MIP) & Aptamères

Jusqu’il y a peu, les tests rapides étaient basés sur des anticorps d’origine biologique (p.ex. de lapins, de souris)
mais, récemment, des tests rapides à base d’éléments de liaison non biologiques ont été commercialisés. Les MIP
sont des polymères avec une mémoire moléculaire intégrée qui, à l’instar des anticorps, ont la capacité de lier spé-
cifiquement une toxine via un mécanisme “clé-serrure”. La stabilité, la réutilisabilité, la reproductibilité, les faibles
coûts de production et l’absence d’éventuelles questions éthiques autour de l’utilisation d’animaux de laboratoire
constituent des atouts commerciaux importants.
Des aptamères (éléments de liaison basés sur l’ADN) sont déjà utilisés à l’échelle du laboratoire comme alternative
aux anticorps mais leur avenir commercial est encore incertain.

Méthodes rapides de spectroscopie

Les techniques spectroscopiques où, par exemple, un laser infrarouge est dirigé sur l’échantillon et où l’absorption
spécifique d’une certaine longueur d’onde de la lumière révèle la présence d’une toxine, possèdent un très grand
atout : elles permettent d’omettre l’étape d’extraction. Cela ouvre un nombre infini de nouvelles possibilités : par
exemple, des grains de maïs peuvent être soumis à un screening individuel tandis qu’ils passent sur un tapis rou-
lant et ainsi être éliminés individuellement, ce qui évite la destruction de tout un lot. Cependant, cette technique
est relativement sensible aux interférences, une conséquence inévitable de l’absence de toute forme de prépara-
tion de l’échantillon, et la technologie utilisée est relativement coûteuse. Par contre, une fois mises en œuvre, ces
analyses se déroulent de façon entièrement automatique.

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Biocapteurs

Un biocapteur est un appareil permettant de détecter des molécules, qui combine un composé biologique
comme élément sensible à une lecture physico-chimique. Un biocapteur se compose de 3 parties : un élément
biologique sensible, un convertisseur (transducteur) et un détecteur physico-chimique. Si la toxine est présente,
elle se lie à l’élément et provoque ainsi une altération physico-chimique dans le détecteur. Bien que cette tech-
nologie ait jusqu’à présent donné des résultats prometteurs à l’échelle du laboratoire, elle ne semble pour le
moment pas présenter d’avantages concluants par rapport aux technologies existantes et elle n’est pas disponible
sur le marché.

Bead-based assays

Dans les bead-based assays, des petites billes (beads) codées avec une couleur ou des billes magnétiques sont
ajoutées à une solution d’échantillon. Outre leur codage d’identification, ces billes sont également marquées au
moyen d’un anticorps dirigé contre une certaine toxine. Les altérations causées aux billes par le complexe anti-
corps-antigène peuvent alors être mesurées au moyen d’un laser, par exemple. Un des grands avantages de cette
technologie est qu’elle est particulièrement bien adaptée aux analyses multi-toxines. Des kits commerciaux sont
déjà attendus dans le courant de cette année.

Spectrométrie de masse à haute résolution

Dans le domaine des méthodes de référence, la spectrométrie de masse se profile indubitablement comme la
référence en matière de détection.

La spectrométrie de masse à haute résolution (HR-MS) met en œuvre une très haute résolution de masse. Afin
d’identifier un composé de manière univoque, le spectromètre de masse doit pouvoir déterminer la masse du
composé le plus précisément possible, c’est-à-dire posséder une haute précision de masse, et en même temps
pouvoir différencier cette masse le plus précisément possible des autres masses moléculaires, c’est-à-dire possé-
der une résolution la plus grande possible. Il faut ici bien garder à l’esprit qu’une résolution la plus haute possible
est particulièrement utile mais qu’il ne s’agit pas d’une condition indispensable, ni d’une condition suffisante, pour
obtenir une précision de masse satisfaisante.

Les spectromètres de masse à haute résolution actuellement disponibles sur le marché peuvent être classés en
quatre catégories, suivant leur principe d’action : (1) les spectromètres de masse à secteur magnétique (2) les
spectromètres de masse à temps de vol (Time-of-Flight, TOFMS) (3) les spectromètres de masse à résonance
cyclotronique ionique à transformée de Fourier (FT-ICR) (4) l’Orbitrap à transformée de Fourier.
Les deux premiers types de spectromètre de masse sont généralement comptés parmi les spectromètres de
masse à scanning continu (secteur magnétique) ou semi-continu (TOFMS) ; les deux derniers sont ce qu’on
appelle des trappes ioniques. Dans le spectromètre de masse à secteur magnétique, une molécule chargée élec-
triquement est tout d’abord activée jusqu’à une très haute vitesse, après quoi elle doit passer par un champ ma-
gnétique situé perpendiculairement à sa trajectoire ; les molécules les plus lourdes, en raison de leur plus grande
inertie de masse, seront déviées différemment des molécules plus légères. Jusque dans les années nonante, les
secteurs magnétiques étaient l’outil privilégié lorsqu’une haute résolution était requise dans un environnement
de routine. À l’heure actuelle, ils ont en grande partie disparu en raison d’une série d’inconvénients : le coût

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d’investissement est très élevé, et ils ne peuvent scanner que masse par masse et non pas établir en une fois un
profil complet de l’échantillon. En outre, ils ne peuvent pas être combinés à la chromatographie en phase liquide
mais uniquement à la chromatographie en phase gazeuse. Les spectromètres de masse à temps de vol utilisent le
principe selon lequel, si on donne la même énergie à deux molécules, la masse la plus lourde va se déplacer plus
lentement au travers d’un tube sous vide qu’une molécule plus légère. Ces spectromètres de masse ont, depuis
les années nonante, plus ou moins repris le rôle des secteurs magnétiques en tant qu’outil à haute résolution
grâce à une série d’avantages : coût d’investissement relativement bas, vitesse de scanning très élevée, robustesse
(principe d’action très simple), possibilité d’être combinés à presque toutes les méthodes de préparation d’échan-
tillon et de séparation d’échantillon. Ils présentent néanmoins deux grands inconvénients : leur résolution est
très basse, selon les normes HR-MS, et leur sensibilité diminue fortement si l’utilisateur demande une plus grande
résolution. Bien que l’on ait travaillé à ce problème ces dernières années, par exemple avec la technologie du
réflectron, la technologie TOFMS est pour l’instant encore à la traîne par rapport au système de trappe à ions du
point de vue de la résolution de masse.

Les spectromètres de masse dits trappes à ions, tels que le spectromètre de masse ICR ou Orbitrap, offrent de
très hautes résolutions, jusqu’à 100 fois plus élevées que les autres types. Avec ces spectromètres de masse à
transformée de Fourier, les ions sont capturés dans une cage en métal (trappe), après quoi ils sont soumis à un
champ magnétique (ICR) ou à un champ électrique à courant continu (Orbitrap). La manière dont ils réagissent
à l’exposition à ce champ est dictée uniquement par leur masse. L’énergie éventuelle que les ions reçoivent par
exemple pendant l’introduction dans le détecteur n’a pas d’incidence sur le mesurage. D’où leur principale qualité
: une résolution extrêmement élevée. Étant donné qu’ils stockent des ions dans une trappe et, de cette manière,
les concentrent pour ainsi dire, ils présentent en général une excellente sensibilité qui, en plus, ne diminue pas
lorsqu’une plus grande résolution est demandée. Par contre, ils commencent à scanner plus lentement si une plus
grande résolution est demandée, un inconvénient que n’a pas le TOFMS, ce qui complique leur intégration avec
les dernières techniques chromatographiques ultra rapides. De plus, ils ne concentrent pas seulement les molé-
cules d’analyte souhaitées dans leur trappe mais toutes les molécules qui proviennent de l’échantillon. La trappe
peut ainsi se retrouver surchargée, ce qui entraîne une précision de masse erronée (effet de matrice). Cela peut
être évité en ne laissant par exemple que 1% des ions entrer dans la trappe, mais alors la sensibilité s’en retrouve
bien entendu diminuée. La règle suivante s’applique dès lors en spectrométrie de masse : une plus grande sen-
sibilité signifie soit une moindre résolution dans le cas des spectromètres de masse à scan continu (quadripôle,
secteur) ou semi-continu (TOFMS), soit des faibles vitesses de scan dans le cas des spectromètres de masse avec
trappe à ions.

La principale différence entre l’ICR et l’Orbitrap est le champ auquel sont soumis les ions. Dans le cas de l’ICR, il
s’agit d’un champ magnétique extrêmement puissant. Ce qui génère les résolutions les plus élevées actuellement
disponibles dans les spectromètres de masse commercialisés. Les aimants coûtent cependant très cher (un ICR
typique coûte plus de 2.000.000 euros) et sont très fragiles. De plus, l’ICR est trop lent pour pouvoir être combiné
aux nouvelles techniques chromatographiques rapides. Il est donc en grande partie inapproprié pour les analyses
de routine.

L’Orbitrap est le dernier des rejetons dans les spectromètres de masse à haute résolution, il soumet les ions à un
champ électrique à courant continu plutôt qu’à un champ magnétique. Étant donné qu’un champ électrique
à courant continu est “plus pur” qu’un champ magnétique, il possède une résolution plus élevée que l’ICR, du
moins en théorie ; il y a pour le moment encore des limites techniques à la production de la trappe proprement
dite, qui entravent cette résolution. La vitesse de scan relativement lente typique des spectromètres de masse à
transformée de Fourier, une opération mathématique où le signal de ces détecteurs, lié au temps, est transposé
en une lecture de masse, entre ici également en jeu. On peut augmenter leur vitesse de scan, sans pour autant
réduire la résolution, en diminuant la taille physique de la trappe mais cela les rend alors plus sensibles aux effets
de surcharge dans la trappe, avec pour conséquence une inexactitude de la masse (et des résultats faux positifs
ou faux négatifs). En tout cas, la génération actuelle peut être combinée aux techniques chromatographiques de

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séparation. On s’attend à ce que d’ici quelques années, les Orbitraps dépassent les ICR du point de vue de la réso-
lution, et ce pour seulement une fraction du coût des ICR. Ajoutez à cela une sensibilité actuellement meilleure
que les TOFMS et presque aussi bonne que les spectromètres de masse quadripôle, et il n’est donc pas étonnant
que beaucoup considèrent cette technologie comme l’avenir de la HR-MS.

La spectrométrie de masse à haute résolution ouvre une perspective très intéressante : le screening dit générique
ou non ciblé, où le détecteur scanne en continu un large champ de masses moléculaires pendant l’analyse de
l’échantillon. De cette manière, une sorte de profil complet de contamination de l’échantillon peut être établi,
incluant non seulement les mycotoxines mais aussi les toxines végétales par exemple, les pesticides, les fongi-
cides, etc. Une analyse rétroactive fait ici également partie des possibilités, par exemple si un client demande une
analyse supplémentaire (suite à une nouvelle réglementation, par exemple), ces informations peuvent facilement
être récupérées au moyen d’un logiciel pour les échantillons déjà analysés. En outre, cette technologie permet
aussi d’examiner, en plus des toxines, les métabolites de celles-ci. Bien souvent, les toxines comme les toxines
de moisissures sont modifiées par la plante en un produit moins nocif pour elle, mais lorsque celle-ci se retrouve
dans le système digestif de l’homme, les toxines sont susceptibles de retrouver leur forme initiale (supposée
plus toxique). Ces métabolites ne sont toutefois pas détectés par les techniques d’analyse classiques (toxines
“masquées”). La spectrométrie HR-MS permet d’en effectuer un screening en routine. Les limites de détection
de cette approche restent cependant relativement élevées, il faut donc examiner application par application si
cette approche fonctionne ou non. Une limite supplémentaire est le développement encore à la traîne du logiciel
adapté ; le screening manuel de centaines de composants dans chaque échantillon n’est pas applicable dans un
environnement de routine.

Figure 3 : Spectromètre de masse orbitrap de Thermo
Fisher Scientific
Figure 4 : Spectre de masse avec résolution 100000 (au-
dessus) et 10000 (en-dessous). On voit clairement que
la plus forte résolution de masse donne lieu à des pics
plus étroits. Cela signifie que le spectromètre de masse
peut déterminer la masse exacte avec plus de précision
avec un plus faible risque de résultats faux positifs ou
faux négatifs.

Bart.Huybrechts@coda-cerva.be