Université SAAD DAHLEB :Blida-1

Faculté des sciences de la nature et de la vie

Département de biologie et physiologie cellulaire
(BPC)

Master 2 – Biochimie/Semestre III

Travaux pratiques récepteurs et effecteurs

Dr EDDAIKRA. A
 Introduction

La liaison de ligands extracellulaires à leurs récepteurs membranaires constitue la première étape de

la transduction de signaux biochimiques de l'extérieur vers l'intérieur des cellules vivantes et est donc
un élément essentiel dans la régulation de ces cellules.

Les récepteurs membranaires constituent donc une cible de choix pour :

 le diagnostic clinique des pathologies humaines
 L’étude structurale et moléculaire des protéines membranaires et leurs ligands intracellulaires
ou extracellulaires
 le criblage de nouvelles molécules capables de réguler les processus biologiques, en
particulier pour le criblage de nouveaux médicaments dans un but thérapeutique
 l’étude et prédiction de la fonction biologique des récepteurs et leurs ligands (docking)

Les récepteurs peuvent être localisés au niveau tissulaire ou cellulaire. La localisation cellulaire cible
les membranes ou le cytosol

Les méthodes utilisées peuvent être soit des tests de liaisons, autoradiographie, microscopie
électronique, cytométrie à flux, des techniques d'immunohistochimie ou d'immunofluorescence directe
ou amplifiée.

Nous allons voir au cours de séances comment peut-on isoler des cellules, des protéines.
Nous allons voir aussi comment mettre en évidence la présence de ligands comme le monoxyde d’azote
(NO) l’immunoglobuline (IgG), et les cytokines ou de leurs récepteurs couramment utilisé dans le
diagnostic clinique et leurs méthodes d’études. Les récepteurs membranaires peuvent aussi être étudiés
par génotypage.
 Techniques de séparation par densité
Séparation et tri cellulaire
Séance1

Les méthodes classiques de centrifugation simple ou en gradients de densité sont largement utilisées
pour séparer différentes populations cellulaires présentes notamment dans le sang comme les
hématies, les leucocytes et les plaquettes.

Comment isoler les PBMC (Peripheral blood mononuclear cells)?

Certaines populations cellulaires ont des densités suffisamment différentes pour permettre leur
séparation à l’aide de gradients de densité. On distingue essentiellement des gradients de densité
discontinue dont le plus classique est le Ficoll®. Ce dernier est un glucide ramifié artificiel dont la
densité à 20 °C est de

Principe : les lymphocytes sont obtenus à partir de sang total prélevé sur héparine, par séparation en
gradient de phicoll. Ils peuvent être, soit utilisés immédiatement, soit conservés en azote liquide dans
des palettes.

Mode opératoire
 Le sang veineux périphérique des sujets sains a été prélevé dans des tubes héparinés (0,5
mg/mL) puis acheminé immédiatement au laboratoire à +4◦C.
 Pour 5ml de sang de périphérique on rajoute du 5 ml de PBS pH 7,4 (V/V)
 Faire couler délicatement à vitesse lente et constante, 5ml de sang le long de la paroi du tube
conique contenant 5ml de ficoll Ficoll-Hypaque (d=1.077) (Séparation sur gradient de densité).
 Centrifugation à 2800 rpm pendant 15 minutes à +4°C.
 Récupération des anneaux des cellules mononuclées
 Lavage avec une solution d‟ammonium chloride potassium (ACK, pH 7.4),
 Lavage avec du PBS à +4°C.
 Le culot de cellule est suspendu dans un volume minimum du milieu de culture (RPMI 1640 à
10 % de sérum de veau foetal ou SVF).
 Un test de viabilité est réalisé par la méthode d’exclusion au bleu Trypan, avant de déterminer
la densité cellulaire finale (viabilité ≥ 98 %).
 Les PBMC obtenues ont été diluées à une concentration finale de 106 cellules/mL puis mises
en culture en présence d’un agent mitogène, la phytohémagglutinine (PHA), ou des hormones
stéroïdes (testostérone, estradiol, cortisol) ou autres.
 Les cultures ont été effectuées en duplicates sur des micro-plaques de 96 puits avec un volume
de 200 µL/puits.
 Après20 h de culture, les surnageants de culture, obtenus par centrifugation, ont été testés pour
la production de l’IL-12 et du NO.

Exercice :
Etablir un protocl complet du materiel utilisés (réactifs et apparéallage) et méthode d’étude pratique a
partir de l’article 1 et 2 (Belguendouze 2008 et Messaouden 2011)
Séparation sur graduant Ficoll R
 Dosage du monoxyde d’azote ( NO)
Séance2
(Par spectrophotométrie à 543 nm)

Questions pré labo

1. Quel est le rôle du NO chez l’humain ?
2. Quelle est la source du NO ?
3. Quelle est la relation du NO avec l’arginase ?
4. Quelle est la relation du NO avec les cytokines ?

La mesure des concentrations en nitrites (NO2-) et nitrates (NO3-) est fréquemment utilisée pour
explorer le métabolisme du monoxyde d'azote (NO) qui a à la fois des propriétés anti-oxydante et pro-
oxydantes, augmente en particulier dans les maladies inflammatoires (Joshi et al. 1999; Yilmaz et al.
2004) .
Le monoxyde d'azote (NO) est impliqué dans de nombreux processus physiologiques tels que
vasodilatation, régulation de la tension artérielle, neurotransmission et réactions inflammatoires et
immunitaires. Il joue également un rôle important au cours de processus pathologiques durant lesquels
sa concentration augmente (choc septique, inflammation...). Les molécules de NO sont libérées lors de
la conversion de L-arginine en citrulline par les nitroxydases synthétases (NOs, EC 1.14.13.39). Trois
isoformes de NOs ont été décrites : n NOs (NOs neuronales ou type 1), e NOs (NOs endothéliales ou
type 3) et i NOs (NOs inductible ou type 2). Les types 1 et 3 sont des isoformes constitutives, calcium
dépendantes et produisant de faibles quantités de NO à l'état basal (de l'ordre de la pmol). Le type 2 est
une isoforme inductible, calcium indépendante et pouvant produire d'importantes quantités de NO (de
l'ordre de la nmol)

But : Le but de ce TP est une initiation au dosage d’une molécule de signalisation « le NO » et à

l’interprétation et discussion des résultats à travers un exemple pratique

Principe
la mesure du monoxyde d’azote se fait par la réaction de Griess (Green et al. 1982). Cette dernière, permet
uniquement la mesure des nitrites (métabolite stable). Les nitrates devront donc être préalablement
réduits en nitrites(NO2) pour être quantifiés. La concentration ainsi mesurée représente la somme des
nitrites et des nitrates.

Il s'agit d'une réaction de diazotation en deux étapes : les nitrites forment un sel de diazonium avec
l'acide sulfanilique qui est ensuite couplé avec une amine (N-naphtyléthylène diamine) (NED) pour
donner un composé diazo de couleur rose vif dont l’absorbance est mesurée à 543 nm.
 Sel de

Methode
1- Le réactif de GRIESS se prépare une semaine avant son utilisation

Griess A : GA
0,1g de naphtylamine ou naphtyle éthylène diamine (NED) ou (50 mg)
+75ml H2Od ou 37,5 ml
+30ml d’acide acétique pur ou 15 ml

Griess B : GB
0,5g d’acide sulfanilique (sulfanilamide) ou (0,25 mg)
+75ml H2Od ou 37,5 ml
+30ml d’acide acétique pur ou 15 ml

NB : Pour dissoudre les composants A et B il faut dissoudre à 50°C pendant 1h

A la place de l’acide acétique on peut utiliser de l’acide phosphorique (5%)

2- MELANGER DANS L’ORDRE :

 50 μl Ech ou 25 μl
 25 μl Griess B (GB) ou 12,5 μl
 25 μl Griess A (GA) ou 12,5 μl
 400 μl H2OD ou 200 μl
 Passer le mélange au Vortex
 Centrifuger 5min à 2000 rpm (étape facultative)
 Incuber pendant 10 minutes à l’obscurité
 Lire la DO à 543 minutes, faire la lecture dans une cuve en quartz
 Contre un blanc : 25 μl GB+25 μl GA + 450 H2OD
 3-PREPARER LA COURBE ETALON : pour un volume total de 1 ml

NaNO2 1mM ( μl ) PBS Mélange Griess B Griess A H2OD (μl)

(μl) (NaNO2 + PBS) μl (μl) (μl)
0 500 50 25 25 400
0,5 499,5 50 25 25 400
1 499 50 25 25 400
2 498,5 50 25 25 400
4 498 50 25 25 400
8 497,5 50 25 25 400
16 497 50 25 25 400
32 496,5 50 25 25 400
64 496 50 25 25 400

 Préparer une solution mère de NaNO2 à 1mM

 A partir du mélange (NaNO2 + PBS) on prend 50 μl de chaque et mettre dans des
tubes opaques ou Eppendorfs opaques ou utiliser le papier aluminium puis ajouter
dans chaque tube 25 μl GB + 25 μl GA + 400 μl H2OD puis passer au vortex.
 Centrifuger à 2000rpm pendant 5 minutes (étape facultative)
 Puis incuber 10 minutes à l’obscurité, puis lire à 543 nm contre Le blanc :25 μl GB
+ 25 μl GA + 400 μl H2OD
 Tracer la droite qui doit passer par l’origine avec un R= 0,99

Courbe Etalon
1,4
y = 1,2866x - 0,0078
R² = 0,9953
1,2

0,8

0,6

0,4

0,2

0
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2

-0,2
 Concentration Absorbance
0 0
0,1 0,08
0,2 0,263
0,4 0,532
0,6 0,785
0,8 0,995
1

NB : Si vous utiliser Excel, chercher d'abord l'option fonction

Cliquer sur tendance
y=cc, x=absorbance, x nouveau=c'est le résultat en mM

Résultat
Complétez le tableau
Lecture de la DO Calcule de la CC en mM

Ech1

Ech2

Ech3

Exercice :
Le même dosage à été effectué chez deux groupes sujets : Malades et témoins
Les résultats de la lecture des DO sont représentés par le tableau suivant :

Malades Témoins
NO(mM) NO (mM)
1 0,505 0,212
2 0,700 0,379
3 0,380 0,159
4 0,490 0,332
5 0,089 0,131
6 0,377 0,243
7 0,294 0,267
8 0,096 0,099
9 0,198 0,121
10 0,196 0,286

Questions :
1- Représenter les résultats sous formes de moyenne ± Ecat-type
2- Interprétez et discutez les résultats
3- Donnez une conclusion