AAV1 Est Le Vecteur Viral Optimal Pour Les Expériences D'optogénétique Chez Les Pigeons (Columba Livia)

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https://doi.org/10.1038/s42003020015959 OUVERT
AAV1 est le vecteur viral optimal pour les expériences
d'optogénétique chez les pigeons (Columba livia)
Noemi Tour 1 , John Michael Tuff1 , Sevim Isparta 1,2, Olivia Andrea Masseck 3, Stefan Herlitze4,
Onur Güntürkün1 & Roland Pusch1
1234567890() :, ;
Bien que l'optogénétique ait révolutionné les neurosciences des rongeurs, elle est encore rarement utilisée dans
d'autres organismes modèles car l'efficacité du transfert de gènes viraux diffère entre les espèces et les études
complètes de transduction virale sont rares. Cependant, pour la recherche comparative, les oiseaux offrent des
organismes modèles précieux car ils ont d'excellentes capacités visuelles et cognitives. Par conséquent, l'étude
suivante établit l'optogénétique chez les pigeons sur des bases histologiques, physiologiques et
niveaux comportementaux. Nous montrons que AAV1 est le vecteur viral le plus efficace dans divers cerveau
régions et conduit à une expression étendue de ChR2 antérograde et rétrograde lorsqu'il est combiné avec le
promoteur CAG. En outre, la stimulation optique transitoire des cellules exprimant ChR2 dans l'entopallium
diminue la sensibilité au contraste des pigeons lors d'une tâche de discrimination en niveaux de gris. Cette
découverte démontre une preuve causale de l'implication de l'entopallium dans la perception du contraste ainsi
qu'une preuve de principe pour l'optogénétique chez les pigeons et fournit les bases de diverses autres
méthodes qui reposent sur le transfert de gènes viraux chez les oiseaux.
1Département de biopsychologie, Institut des neurosciences cognitives, Faculté de psychologie, Ruhr University Bochum, Universitätsstraße 150, 44801
Bochum, Allemagne. 2Département de génétique, Faculté de médecine vétérinaire, Université d'Ankara, Şht. Ömer Halisdemir Blv, 06110 Ankara, Turquie.
3 Université de Brême, Biologie synthétique, Leobener Straße 5, 28359 Brême, Allemagne. 4Département de zoologie générale et de neurobiologie, Ruhr University
Bochum, Universitätsstraße 150, 44801 Bochum, Allemagne. email : noemi.rook@rub.de
BIOLOGIE DES COMMUNICATIONS | (2021) 4:100 | https://doi.org/10.1038/s42003020015959 | www.nature.com/commsbio 1
ARTICLE BIOLOGIE DES COMMUNICATIONS | https://doi.org/10.1038/s42003020015959
de forme, de motif, de couleur, de mouvement et de luminance17,18,21. Nous
la recherche scientifique car différentes espèces aviaires offrent des avons utilisé une tâche de discrimination visuelle en niveaux de gris et avons
Les oiseaux sont des
opportunités orrganismes
de echerche um odèles
niques. Aplors
récieux
que ples
our neu comparative
corbeaux ont d'excellentes constaté que la stimulation optogénétique au sein de cette structure entraînait une
capacités cognitives comparables à celles des primates1–3, les diamants mandarins altération de la perception du contraste indiquée par une diminution de la précision
et autres oiseaux chanteurs sont largement étudiés comme modèles de langage4–7. de la discrimination. Avec cette étude, nous fournissons une preuve de principe
De plus, les pigeons ont des capacités visuelles exceptionnelles8, des pour l'optogénétique chez les pigeons ainsi que des informations supplémentaires
compétences de navigation9,10 et représentent des modèles animaux classiques sur la fonction de l'entopallium.
pour la recherche sur l'apprentissage et la mémoire11. Les oiseaux sont capables
de ces comportements bien que leur cerveau soit organisé radicalement différent
de celui des mammifères12. Alors que le néocortex des mammifères est organisé Résultats
en six couches, le pallium des oiseaux est structuré de façon nucléaire12. Analyse comparative de transduction des sérotypes de vecteurs
Il existe cependant des preuves cumulatives suggérant que, bien que les cerveaux viraux adénoassociés 1, 5 et 9 dans le prosencéphale aviaire. Dans
des oiseaux et des mammifères diffèrent au niveau macroscopique, les circuits un premier temps, nous avons voulu déterminer le vecteur viral adéno
locaux au sein de leurs systèmes sensoriels sont hautement comparables, indiquant associé (AAV) le plus efficace pour des expériences d'optogénétique
des principes conservés dans l'organisation des systèmes sensoriels13. La dans le système visuel des pigeons. Pour l'étude de transfection
découverte de ces propriétés invariantes peut aider à établir des relations circuit virale, nous avons comparé l'effi cacité d'un AAV de sérotype 2
fonction qui mettent en évidence les principes généraux du cerveau. Ainsi, la pseudotypé avec le sérotype 1 (ici appelé AAV1), pseudotypé avec
recherche comparative est indispensable pour comprendre comment les fonctions le sérotype 5 (ici appelé AAV5) et pseudotypé avec AAV9 (ici appelé
cérébrales émergent de la structure14. AAV9) . Tous les sérotypes ont été combinés avec le promoteur du
Malheureusement, la plupart de ce que nous savons sur la fonction du pallium gène de la synapsine 1 humaine (hSyn) ou le promoteur de la bêta
aviaire, en particulier pour le système sensoriel, provient de méthodes purement actine de poulet (CAG) et ont été injectés dans l'entopallium du
corrélatives15,16 ou d'études de lésions qui manquent de précision spatiale et cerveau du pigeon (Fig. 1a, b). Chaque construction a été injectée
temporelle17–21. Cependant, pour étudier la fonction des réseaux neuronaux, des dans au moins cinq hémisphères distincts de trois pigeons (pour plus
méthodes capables de contrôler précisément l'activité neuronale sont indispensables. d'informations, voir le tableau 1). Après 6 semaines de transfection,
Cet objectif ambitieux a d'abord été atteint avec l'optogénétique, permettant aux les pigeons ont été sacrifiés et des colorations immunohistochimiques
chercheurs d'activer ou de réduire au silence des réseaux spécifiques avec une contre ChR2 ont été réalisées dans toutes les tranches de cerveau
résolution temporelle et spatiale élevée grâce à l'intégration de canaux ioniques contenant l'entopallium. La contrecoloration a été effectuée pour
sensibles à la lumière artificielle dans la membrane cellulaire22,23. L'optogénétique permettre une comparaison égale entre les sérotypes, car les
a révolutionné la recherche sur les rongeurs24 et a été établie chez d'autres sérotypes avec le promoteur hSyn ont été marqués avec eYFP,
espèces telles que les primates25, les diamants mandarins7 et les furets26 au tandis que les sérotypes avec le promoteur CAG ont été marqués
cours des dernières années. Cependant, la mise en œuvre fonctionnelle de avec mCherry. De plus, la quantité d'expression du transgène peut
l'optogénétique chez d'autres espèces a été difficile27. être sousestimée lors de l'analyse de la fluorescence native, car le
signal augmente avec les contrecolorations (voir la Fig. 1
Alors que plusieurs études ont pu montrer les effets de la microstimulation supplémentaire et la section Méthode pour plus de détails). L'efficacité
électrique lors de la prise de décision ou de la perception chez les primates28–30, des six constructions a été évaluée sur la base du nombre de somates
les études utilisant la stimulation optogénétique ont parfois échoué à trouver des exprimant ChR2 (Fig. 1a) et de la zone transfectée de somates, de
effets comportementaux, malgré des changements physiologiques rapportés25,31– dendrites et d'axones exprimant ChR2 par rapport à la taille de l'entopallium (Fig.
33. Une explication qui a été fournie pour l'absence d'effets comportementaux est Nous avons constaté que la construction avait un effet significatif sur le nombre
une efficacité virale insuffisante entraînant de faibles quantités d'expression de de cellules exprimant ChR2 (ANOVA unidirectionnelle avec correction de Welch F
protéines25,27. Comme l'un des éléments clés de l'optogénétique est l'expression (4, 9, 511) = 14, 949, p <0, 001, Fig. 1c). Bien qu'il n'y ait pas eu de différence
de canaux ioniques sensibles à la lumière qui sont généralement transférés dans dans le nombre de cellules exprimant ChR2 entre les injections d'AAV1hSyn
le cerveau via des vecteurs viraux, l'efficacité de ces constructions doit être ChR2 et d'AAV1CAGChR2 (comparaisons par paires corrigées de Bonfer roni, p
soigneusement étudiée avant l'application de l'optogénétique in vivo. L'efficacité du = 1,00, Fig. 1c, e, h), les deux constructions étaient significativement plus efficace
vecteur viral peut varier considérablement entre les zones cérébrales et les que tous les autres sérotypes, y compris AAV5hSynChR2 (p ≤ 0,001, Fig. 1c, f),
espèces, ce qui souligne la nécessité d'études de transfection virale dans divers AAV5CAG ChR2 (AAV1hSynChR2 : p = 0,003, AAV1CAGChR2 : p = 0,025,
organismes modèles34–39. Surtout chez les oiseaux, la transfection virale s'est Fig. .1c, i) et AAV9CAGChR2 (p ≤ 0,001, Fig. 1c , j, pour les valeurs moyennes
avérée difficile40, peutêtre en raison des propriétés du système immunitaire41,42 . et SEM voir tableau 1). De plus, la construction a eu un effet significatif sur le
Bien que l'optogénétique ait déjà été utilisée dans certaines zones du système de pourcentage de zone d'expression de ChR2 dans l'entopallium (ANOVA
chant du pinson zèbre7,43,44, l'efficacité de différentes constructions virales n'a unidirectionnelle avec correction de Welch, F (4, 8, 515) = 12, 791, p = 0, 001, Fig.
pas été comparée dans ces zones cérébrales et dans d'autres zones du cerveau 1d). Il n'y avait pas de différence significative dans le pourcentage de la zone
telles que le système visuel. Dans cette étude, nous avons comparé l'efficacité de transduite entre les injections d'AAV1hSynChR2 et d'AAV1CAGChR2
six constructions virales dans leur capacité à transduire des neurones dans le (comparaisons par paires corrigées de Bonfer roni, p = 0, 402, Fig. 1d, e, h).
cerveau antérieur du pigeon et avons constaté que l'AAV1 est la construction virale
optimale pour les expériences optogénétiques chez les oiseaux. Comme il a été
compliqué d'induire des effets comportementaux avec l'optogénétique chez les Cependant, AAV1CAGChR2 a entraîné une zone significativement
primates en raison d'une expression protéique insuffisante, nous avons en outre plus grande exprimant ChR2 que tous les autres sérotypes, y compris
confirmé que la stimulation de la channelrhodopsine (ChR2) entraîne des effets AAV5 hSynChR2 (p < 0,001, Fig. 1d, f), AAV5CAGChR2 (p = 0,001,
physiologiques et comportementaux chez les pigeons. Dans notre étude, nous Fig. 1d , i) et AAV9CAGChR2 (p = 0,001, Fig. 1d, j, pour les valeurs
nous sommes concentrés sur le système visuel, car les oiseaux sont des animaux moyennes et SEM voir tableau 1). De plus, la zone d'expression de
très visuels et des études récentes ont indiqué que les propriétés caractéristiques ChR2 était significativement plus grande pour AAV1hSyn par rapport
des systèmes sensoriels, telles qu'une organisation colonnaire et laminaire, sont à AAV5hSyn (p = 0, 039, Fig. 1d – f). De plus, les efficacités de
conservées entre les oiseaux et les mammifères13. Nous avons ciblé l'entopallium, transduction des sérotypes suivaient un schéma similaire lorsque la
qui est la zone visuelle primaire la plus importante du télencéphale du pigeon et zone d'expression de ChR2 était comparée à la taille de l'entopallium
qui a été associée à la discrimination uniquement dans les tranches avec transduction (voir Fig. 2
supplémentaire). Le profil d'expression après les injections d'AAV9
différait de tous les autres sérotypes, comme pour AAV9hSynChR2, seuls deux C
2 BIOLOGIE DES COMMUNICATIONS | (2021) 4:100 | https://doi.org/10.1038/s42003020015959 | www.nature.com/commsbio
BIOLOGIE DES COMMUNICATIONS | https://doi.org/10.1038/s42003020015959 ARTICLE
AAV1 AAV1
AAV5
un Nombre de somates ChR2+
AAV5
AAV9
b Surface transfectée en % AAV9
E E
MS t MS t
somata LS t généraliste
Densité LS t généraliste
c ré
*** 35
*** ** *
25 000
*** * *** *** ** **
30
hSyn hSyn
20 000 CAG CAG
25
somates
Nombre
ChR2+
de
15 000 20
entopalliale
transduite
Surface
%
15
10 000
dix
5 000
5
30 µm
AAV1 AAV5 AAV9 AAV1 AAV5 AAV9
ef g AAV1hSyn AAV5hSyn AAV9hSyn
500 µm
ChR2 ChR2 ChR2
h AAV1CAG je AAV5CAG j AAV9CAG
ChR2 ChR2 ChR2
Fig. 1 Analyse de transduction comparative d'AAV1, AAV5 et AAV9 en combinaison avec les promoteurs hSyn et CAG. a Illustration schématique de la
zone d'injection et type d'analyse. Pour la première analyse, tous les somates ont été comptés qui affichaient l'expression de ChR2. b Représentation schématique de la zone d'injection
et le type d'analyse. Pour la deuxième analyse, la surface de ChR2 exprimant les somates, les dendrites et les axones a été mesurée et comparée à la surface totale de
l'entopallium. c Comparaison quantitative de toutes les constructions testées dans leur capacité à conduire l'expression du transgène dans les somates de l'entopallium. AAV1hSyn ChR2, ainsi
que AAV1CAGChR2, étaient significativement plus efficaces que toutes les autres constructions testées. d Pourcentage de ChR2 exprimant l'aire entopalliale pour
toutes les constructions testées. AAV1CAG était significativement plus efficace que toutes les autres constructions testées. Tous les AAV avec le promoteur hSyn sont représentés en gris et tous
Les AAV avec le promoteur CAG sont représentés en bleu. e–j Images qualitatives de l'expression de ChR2 suite à des injections de e AAV1hSynChR2 (n = 5), f AAV5
hSynChR2 (n = 5), g AAV9hSynChR2 (n = 5), h AAV1CAGChR2 (n = 6), i AAV5CAGChR2 (n = 5) et j AAV9CAG ChR2 (n = 5). Toutes les barres d'échelle
représentent 500 µm. Les barres d'erreur représentent l'erreur standard de la moyenne (SEM) et les points représentent les données brutes, ***p < 0,001, **p < 0,01, *p < 0,05.
Abréviations : vecteur viral adénoassocié AAV, promoteur du gène de la synapsine 1 humaine hSyn, promoteur de la bêtaactine de poulet CAG.
des cellules ont été trouvées dans l'un des cinq cas (Fig. 1g), tandis que AAV9
Tableau 1 Analyse comparative de transduction de AAV1, AAV5,
CAG ChR2 a conduit à une expression fiable de ChR2 dans les cinq cas mais aussi à
et AAV9 en combinaison avec le hSyn et le promoteur CAG.
neurotoxicité (Fig. 1j, sera discuté en détail plus tard).
Alors que AAV1CAGChR2 et AAV1hSynChR2 n'ont pas
Sérotype Nombre de ChR2 Entopallial transduit
exprimant des cellules superficie en % diffèrent dans leur efficacité à piloter l'expression de ChR2 dans le
AAV1CAG 12405 ± 2230 SEM, n = 6 15,89 ± 3,17 ETM, n = 6 entopallium, ils différaient par d'autres propriétés telles que l'antérograde
AAV1hSyn 15028 ± 3170 SEM, n = 5 9,73 ± 2,62 ETM, n = 5 et expression rétrograde de ChR2 dans les structures cibles et d'entrée
AAV5CAG 3782 ± 690 SEM, n = 5 2,79 ± 0,81 ETM, n = 5 de l'entopallium. Nous avons constaté que les injections d'AAV1CAGChR2
AAV5hSyn 406 ± 125 SEM, n = 5 0,18 ± 0,05 SEM, n = 5
AAV9CAG 574 ± 83 SEM, n = 5 1,67 ± 0,38 ETM, n = 5 dans l'entopallium (Fig. 2a) a entraîné une importante ChR2
expression dans les fibres se projetant sur des structures cibles telles que le
Pour tous les sérotypes, le nombre moyen de cellules exprimant ChR2 et le nombre moyen de cellules exprimant ChR2 mésopallium ventrolatéral (MVL, Fig. 2b, d) et nidopallium
la surface entopalliale en % a été évaluée pour au moins cinq injections dans des hémisphères séparés d'au moins
moins trois pigeons. intermédiaire (NI, Fig. 2b, d). Contrairement à cela, seulement peu de ChR2
AAV1
AAV1CAG AAV1hSyn
un b MVL c MVL
MVL
NI
E
MS t
généraliste
LS t
NI NI
ré antérograde
E
E
MVL
NI
E
MS t
généraliste
LS t
200 µm
ChR2 ChR2
ef g antérograde
MVL
E
NI
LSt LSt
E
E
MS t LSt généraliste
généraliste
généraliste
ChR2 ChR2
rétrograde
h je TrO j TrO
SC
nRT nRT
Dernier
UN
nRT
TrO ChR2 ChR2

Fig. 2 Expression antérograde et rétrograde de ChR2 dans les structures cibles et d'entrée de l'entopallium. a Illustration schématique de la zone d'injection dans
entopallium. b Expression antérograde de ChR2 dans les fibres se projetant vers le NI/MVL suite à des injections d'AAV1CAGChR2. c Peu d'expression antérograde de ChR2
suite aux injections d'AAV1hSynChR2. d Illustration schématique du marquage antérograde dans les fibres se projetant vers le NI/MVL. e Illustration schématique de
marquage antérograde dans les fibres se projetant vers le striatum. f Expression antérograde de ChR2 dans les fibres se projetant vers le striatum suite à des injections d'AAV1
CAG ChR2. g Peu d'expression antérograde de ChR2 dans le striatum suite à des injections d'AAV1hSynChR2. h Illustration schématique de l'expression de ChR2 dans le noyau
rotundus, qui est la principale région d'entrée de l'entopallium. i Expression rétrograde étendue de ChR2 dans le noyau rotundus suite à des injections d'AAV1CAG ChR2 dans
l'entopallium. j Expression rétrograde rare de ChR2 dans le noyau rotundus suite à des injections d'AAV1hSynChR2. Toutes les barres d'échelle représentent 200
µm. Notez que les images f, g, i, j ont été tournées de 90° vers la gauche. Abréviations : Arco arcopallium, E entopallium, GP globus pallidus, LSt lateral striatum, MSt
striatum médial, MVL mésopallium ventrolatéral, NI nidopallium intermedium, nRT noyau rotundus, TrO tractus opticus.
l'expression a pu être détectée dans NI et MVL après des injections d'AAV1 pallidus (Fig. 3d, f), l'hyperpallium apical (Fig. 3g, h) et le striatum médial
hSynChR2 (Fig. 2c, Tableau supplémentaire 1, Fig. 3 et 4 supplémentaires). (Fig. 3g, i).
Un schéma d'expression similaire a pu être observé dans le striatum (Fig. Étant donné que le promoteur CAG peut conduire l'expression du
2e), qui est une autre structure cible de l'entopallium. Nous avons trouvé une transgène dans tous les types de cellules, la mesure dans laquelle les
expression étendue de ChR2 dans les fibres faisant saillie vers le striatum cellules exprimant ChR2 étaient également colocalisées avec un marqueur
après des injections d'AAV1CAG ChR2 dans l'entopallium (Fig. 2f), qui était neuronal a été étudiée. Par conséquent, nous avons effectué des colorations
plus faible pour les injections d'AAV1hSynChR2 (Fig. 2g, Tableau immunohistochimiques combinées contre ChR2 et NeuN pour visualiser les
supplémentaire 1, Fig. 5 et 6). La principale région d'entrée de l'entopallium neurones (Fig. 4a – d). Nous avons constaté que AAV1CAGChR2 entraînait
est le noyau rotundus diencéphalique (Fig. 2h). Les injections d'AAV1hSyn une expression significativement plus importante du transgène dans les
ChR2 et d'AAV1CAGChR2 dans l'entopallium ont entraîné l'expression de neurones que dans les cellules gliales (neurones : 92,19 % ± 1,99 SEM, n =
ChR2 dans les neurones du noyau rotundus après 6 semaines de temps 5 ; cellules gliales : 7,81 % ± 1,99 SEM, n = 5 ; Z = 2,023 , p = 0,043, Fig.
d'expression (tableau supplémentaire 1, figures supplémentaires 7 et 8). 4a–d). Cette quantification n'a pas pu être effectuée pour les injections
Cependant, l'expression rétrograde de ChR2 était plus étendue après les d'AAV9CAGChR2, car ce sérotype a entraîné une forte réduction de
injections d'AAV1CAGChR2 (Fig. 2i) qu'après les injections d'AAV1hSyn l'expression de NeuN dans la zone d'expression de ChR2 (AAV1CAG :
ChR2 (Fig. 2j), en particulier après des temps d'expression plus longs de 6 1871 cellules NeuN+ par mm2 ± 41 SEM, n = 6 ; AAV9 CAG : 1102 cellules
mois (Fig. 2i, j, Supplémentaire Tableau 1, figures supplémentaires 7 et 8). NeuN+ par mm2 ± 77 SEM, n = 4 ; Z = 2,558, p = 0,01, Fig. 4e–h), suggérant
une neurotoxicité de ce sérotype. Pour étudier plus avant la neurotoxicité
possible de ce sérotype, nous avons effectué des colorations combinées
L'efficacité d'AAV1CAGChR2 a en outre été étudiée avec des injections contre ChR2 et la protéine acide fibrillaire gliale (GFAP) pour AAV9CAG
uniques de 5 µl chacune dans d'autres régions du pallium aviaire afin ChR2 et AAV1CAGChR2, car GFAP est un marqueur de l'activation des
d'évaluer son utilité à l'échelle du cerveau pour des expériences astrocytes après un stress ou une blessure à le cerveau45,46. Nous avons
d'optogénétique chez les oiseaux. AAV1CAGChR2 était capable de piloter constaté que les injections d'AAV1CAGChR2 entraînaient une expression
l'expression de ChR2 dans l'hippocampe (Fig. 3a, b), le nidopallium étendue de ChR2 dans la zone d'injection, tandis que l'expression de GFAP
caudolaterale (Fig. 3a, c), l'entopallium (Fig. 3d, e), le globus était faible et se produisait principalement autour des vaisseaux sanguins (expression de C
un b c
APH
NCL
SC APH
SC
L2 NCL
UN
UN
200 µm
ChR2 ChR2
ré e F
HA MSt généraliste LSt
E
E
LFB
MS t
généraliste
LS t
ChR2 ChR2
g h je
HA HA
E MSt
MSt
ChR2 ChR2
Fig. 3 AAV1CAG est efficace pour piloter l'expression du transgène dans diverses régions du cerveau antérieur du pigeon. a Illustration schématique de l'hippocampe (HC)
et du nidopallium caudolaterale (NCL). b Expression de ChR2 dans HC. c Expression de ChR2 dans NCL. d Illustration schématique de l'entopallium (E) et du globus
pallidus (GP). e Expression de ChR2 dans E. f Expression de ChR2 dans GP. g Illustration schématique de l'hyperpallium apical (HA) et du striatum médial (MSt). h
Expression de ChR2 dans HA. i Expression de ChR2 dans MSt. Toutes les barres d'échelle représentent 200 µm. Abréviations : APH area parahippocampalis, E
entopallium, GP globus pallidus, HA hyperpallium apical, HC hippocampus, LFB lateral prosencéphale bundle, LSt lateral striatum, MSt medial striatum.
un 100
* b AAV1CAG c AAV1CAG ré AAV1CAG
AAV1CAG
80
Neurones
Glie
60
Cellules
ChR2+
en
%
40
20
50 µm
ChR2 NeuN Recouvrir
2
e 2200 AAV9CAG AAV9CAG h AAV9CAG
** AAV1CAG
F g
AAV9CAG
1800
1400
Neurones
par
mm
1000
600
200 50 µm
ChR2 NeuN Recouvrir
12 AAV1CAG ChR2 j AAV1CAG i k AAV1CAG je
AAV1CAG
je
GFAP
dix
8
Densité
en
%
2
200 µm
ChR2 GFAP Recouvrir
m 12 AAV9CAG ChR2 n AAV9CAG o AAV9CAG AAV9CAG

p
GFAP
dix
8
Densité
en
%
2
200 µm
ChR2 GFAP Recouvrir
Fig. 4 Tropisme cellulaire de AAV1CAG et AAV9CAG. a–d AAV1CAGChR2 conduit à l'expression de ChR2 dans beaucoup plus de neurones (barre rose) que glial
cellules (barre verte, n = 5 injections). b Expression de ChR2 après injections d'AAV1CAG. c Expression de NeuN dans le site d'injection correspondant. d Superposition de
Expression de ChR2 et NeuN. e–h AAV9CAG (barre verte, n = 4 injections) conduit à une réduction significative de NeuN au site d'injection par rapport à AAV1
CAG (barre rose, n = 5 injections). f Expression de ChR2 suite à des injections d'AAV9CAG. g NeuN dans le site d'injection correspondant. h Superposition de ChR2 et
Expression de NeuN indiquant que les injections d'AAV9CAG entraînent une expression réduite de NeuN au site d'injection. i–l AAV1CAG conduit à un ChR2 étendu
expression (barre rose), mais seulement à une faible expression de GFAP (barre verte, n = 3 injections). j Expression de ChR2 suite à des injections d'AAV1CAGChR2. k GFAP
l'expression se produit principalement autour des vaisseaux sanguins. l Superposition de l'expression ChR2 et GFAP. m Les injections d'AAV9CAG entraînent une faible expression de ChR2 (barre rose),
mais augmentation de l'expression de GFAP (barre verte, n = 3 injections) au site d'injection. n Expression de ChR2 suite à des injections d'AAV9CAGChR2. o GFAP
expression dans le site d'injection correspondant. p Superposition d'expression ChR2 et GFAP. Toutes les barres d'échelle sont spécifiées dans les images microscopiques.
Les barres d'erreur représentent l'erreur standard de la moyenne (SEM), les points représentent les données brutes. **p < 0,01, *p < 0,05.
n = 3 ; Expression GFAP : 1,5 % ± 0,5 SEM, n = 3 ; Figure 4i–l, deux pigeons dans quatre hémisphères. L'objectif de ces activités spécifiques
Fig. 9 supplémentaire). Contrairement à cela, les injections d'AAV9 expériences consistaient à présélectionner des cellules sensibles à la lumière et
CAG a conduit à une faible expression de ChR2, tandis que l'expression de GFAP a été évaluer leurs caractéristiques. Par conséquent, une lumière constamment répétée
fort et s'est produit sur tout le site d'injection (ChR2 une impulsion d'une durée de 1 s a été présentée pour évoquer des pics au cours de la
expression : 1,5 % ± 0,6 SEM, n = 3 ; Expression GFAP : 3,7 % ± 0,9 progression de l'électrode. Lorsqu'une cellule réactive était
SEM, n = 3 ; Fig. 4m–p, Fig. 9 supplémentaire). Cela soutient la rencontrés, nous avons utilisé une séquence d'impulsions de lumière bleue (465 nm) de
idée de neurotoxicité pour AAV9CAGChR2. différentes durées (1, 10, 100, 200 et 500 ms ; voir le tableau supplémentaire 2) pour
la stimulation optique et répéter cette séquence
(balayage, Fig. 5a(i)) trois fois. Au total, les réponses neuronales de
Physiologie des cellules exprimant ChR2 lors de la stimulation optique neuf cellules ont été enregistrées pendant la stimulation optique (Fig. 5, Fig. 10 à 17
étudié avec l'électrophysiologie in vivo et immédiate supplémentaires). Dans toutes les cellules présélectionnées qui ont été enregistrées,
expression génique précoce. La physiologie de ChR2 a été évaluée dans un nombre important de potentiels d'action ont pu être évoqués par
deux expériences. Dans la première expérience, des pigeons ont été anesthésiés, et stimulation optique et toutes les cellules ont montré une réponse significative
des enregistrements unitaires extracellulaires et une stimulation optique ont été lorsque la durée de la stimulation était d'au moins 10 ms (unilatéral
effectués simultanément dans l'entopallium de Test de somme des rangs de Wilcoxon, toutes les valeurs p < 0,05, pour plus de détails, voir
un(je) St nd rd b
1 balayage 2 balayage 3 balayages
200
mA
ns
essais
20
ns
100
µV
ns
10 s
un(ii) 1 milliseconde 10 millisecondes 100 millisecondes 200 millisecondes 500 millisecondes
200
mA
pointes
20
100
µV
5 s 20 ms
un(iii) stimulation optique [465 nm] c
rd
3 balayage
(40 60)
ns ns
nd
2 balayage
(20 40)
ns essais
20
ns
St
1
balayage
(1 20) ns ns
pointes
20 pointes
20
20 ms 50 ms
ré e
ns ns
ns ns
essais
5
essais
10
ns ns
pointes
20 pointes
20
100 ms 200 ms
Fig. 5 Réponses unicellulaires à la stimulation optique (Cellule 4). a(i) Protocole de stimulation (tracé supérieur) et les réponses cellulaires évoquées qui en résultent (tracé inférieur
trace). Le protocole de stimulation consistait en des impulsions lumineuses répétées de différentes durées (1, 10, 100, 200 et 500 ms) et était répété trois fois
(balayage 1–3, indiqué par le fond gris/blanc). Le taux de déclenchement de base de chaque neurone a été évalué avant/après le protocole de stimulation lumineuse.
a(ii) Un seul balayage (c'estàdire balayage 2) du protocole de stimulation optique. La stimulation optique de 10 ms est mise en évidence et analysée plus en détail dans (a(iii)). Trame
tracé (partie supérieure) et histogramme de temps péristimulus (PSTH ; partie inférieure) de la réponse cellulaire. Le tracé raster caractérise la réponse cellulaire alignée avec
le début de la stimulation optique (465 nm à 300 mA ; zone ombrée en bleu). Chaque ligne représente une stimulation optique. Chaque point dans cette ligne
représente un potentiel d'action évoqué. Pour chaque répétition de la stimulation, une nouvelle ligne est ajoutée au tracé. Le fond gris/blanc du tracé raster
indique les blocs de répétition (balayage 1–3). Pour évaluer la variabilité des réponses évoquées, les balayages ont été statistiquement comparés. Dans le cas de ce
cellule, aucune différence statistique n'a été trouvée (indiquée par l'abréviation ns à côté des tracés matriciels). Le PSTH représente la somme des réponses dans un
certaine fenêtre temporelle (bin). Dans le cas de la présentation du stimulus de 10 ms, la largeur du bac est de 2 ms. b Tracé raster (trace supérieure) et PSTH (trace inférieure) pour le 1 ms
durée du stimulus (largeur de case : 2 ms). c Tracé raster (trace supérieure) et PSTH (trace inférieure) pour la durée de stimulation de 100 ms (largeur de bac : 4 ms). d Trame
parcelle (trace supérieure) et PSTH (trace inférieure) pour la durée du stimulus de 200 ms (largeur de bac : 10 ms). e Tracé raster (tracé supérieur) et PSTH (tracé inférieur) pour
Durée du stimulus de 500 ms (largeur du bac : 10 ms).
Tableau supplémentaire 3). Pour évaluer la variabilité de l'évocation Les cellules enregistrées différaient dans leurs propriétés de réponse globales
réponses neuronales, nous avons comparé les pics évoqués lors de ces (Fig. 10 à 18 supplémentaires). Nous avons trouvé des cellules qui ont répondu
balayages à l'aide d'une analyse de variance non paramétrique pendant toute la période de stimulation optique avec une constante
(Test de KruskalWallis). Si nous trouvions des différences significatives entre quantité de pointes, bien que présentant un pic d'activation prononcé
les balayages, un test de comparaison multiple corrigé de Bonferroni a été au début de la stimulation lumineuse (Fig. 5, Fig. 15 supplémentaires
menée. Dans seulement deux des neuf cellules, des différences significatives et 17, Fig. 18 supplémentaire, cellules 4, 7 et 9). De plus, nous
entre les balayages dans certaines conditions ont été détectés (voir le tableau trouvé des cellules qui affaiblissaient leurs réponses au cours de
supplémentaire 3). Les différences ont été trouvées dans les essais de stimulation stimulation prolongée (Figs. 10–12 supplémentaires, Fig. 18 supplémentaires,
de plus longue durée (>100 ms). Pour les durées de stimulation cidessous cellules 1–3). Un autre modèle de réponse qui a été trouvé
100 ms, aucune différence significative n'a pu être détectée (la signification est a montré un pic net uniquement au début du stimulus
indiquée dans le tableau supplémentaire 3 et dans les tracés raster à cellule (Fig. 13, 14 et 16 supplémentaires, Fig. 18 cellules supplémentaires
unique). Dans l'ensemble, les réponses évoquées étaient robustes. 5, 6 et 8). Après les expériences électrophysiologiques
BIOLOGIE DES COMMUNICATIONS | (2021) 4:100 | https://doi.org/10.1038/s42003020015959 | www.nature.com/commsbio sept
un b 1000 c
2
millimètre
800
620 nm 465 nm **
600
400
Cellules
Fos+
0,25
par
C
200
50 µm
Recouvrir
Ento Wulst
ré e F
orange bleu
200 µm 200 µm 50 µm

ChR2 ChR2 ChR2
g orange h bleu je
200 µm 200 µm 50 µm

CFos CFos CFos
Fig. 6 Expression génique précoce immédiate après stimulation des cellules exprimant ChR2 avec de la lumière bleue (465 nm). un dessin schématique illustrant la procédure
expérimentale. Chez trois animaux, deux sites d'un hémisphère ont été stimulés avec de la lumière orange (620 nm), tandis que deux sites de l'autre hémisphère ont été stimulés
avec de la lumière bleue (465 nm). b Quantification de l'expression de cFos suite à une stimulation par la lumière orange et bleue dans l'entopallium stimulé et une zone de
contrôle non stimulée dans le wulst visuel. Une expression significativement plus importante de cFos a été observée dans l'hémisphère stimulé par la lumière bleue (n = 6 sites,
bleu) par rapport à l'hémisphère stimulé par l'orange (n = 5 sites, orange). Cependant, dans le wulst visuel non stimulé, l'activation de cFos était comparable. c Superposition de
l'expression de ChR2 avec l'expression de cFos (fluorescence) indiquant que la stimulation par la lumière bleue a entraîné une activité cellulaire dans les cellules exprimant ChR2.
d Expression de ChR2 dans l'hémisphère stimulé par l'orange. e, f Expression de ChR2 dans l'hémisphère stimulé par la lumière bleue. g Peu d'expression de cFos s'est produite
dans l'hémisphère stimulé par l'orange. h, i Une expression extensive de cFos s'est produite dans l'hémisphère stimulé par la lumière bleue. Les barres d'échelle sont spécifiées
dans les images. Les barres d'erreur représentent l'erreur standard de la moyenne (SEM), les points représentent les données brutes. **p < 0,01.
Une fois terminé, une histologie a été réalisée pour vérifier l'expression de ont été effectuées. L'activation cellulaire a été évaluée sur deux sites de
ChR2 dans l'entopallium (Fig. 19 supplémentaire). stimulation dans chaque hémisphère de trois pigeons dans l'entopallium
Nous avons décidé d'utiliser un protocole de stimulation optique pulsée de stimulé et dans une zone de contrôle dans le wulst visuel non stimulé pour
40 Hz dans nos expériences comportementales, car certaines cellules s'assurer que les deux hémisphères présentent des niveaux comparables
présentaient exclusivement un pic d'apparition brutal et des impulsions d'une d'expression de cFos en général. La stimulation par la lumière bleue a entraîné
durée de 10 ms évoquaient de manière fiable des pics dans toutes les cellules une expression accrue de cFos sous la canule dans l'entopallium (Fig. 6b, c,
enregistrées (durée d'impulsion : 15 ms ; intervalle entre les impulsions : 10 f, i) par rapport à la stimulation par la lumière orange (stimulation par la lumière
ms). La validité physiologique du protocole appliqué a ensuite été vérifiée dans bleue : 515 cellules ± 59 SEM, n = 6 ; stimulation par la lumière orange : 12
une expérience supplémentaire. Ici, nous avons étudié la fonctionnalité de cellules ± 3 SEM, n = 5 ; Z = 2,739, p = 0,004, Fig. 6b, g, h), bien que les deux
ChR2 avec une expression génique immédiate et précoce chez des pigeons éveillés (Fig. 6). aient montré une expression ChR2 fiable (Fig. 6d – f). Dans la
hémisphères
Après une phase de privation sensorielle d'une heure, les pigeons ont été zone de contrôle du wulst visuel, il n'y avait pas de différence entre la
stimulés pendant une période de 30 min avec des intervalles alternés de 5 min stimulation par la lumière orange et bleue, indiquant que les intensités de
de stimulation à 40 Hz et de 5 min sans stimulation avec une lumière orange coloration étaient similaires entre les deux hémisphères (stimulation par la
dans un hémisphère et une lumière bleue dans l'autre hémisphère (Fig. 6a) . lumière bleue : 464 cellules ± 107 SEM, n = 6 ; stimulation par la lumière
Après cela, les pigeons ont été privés de sens pendant 60 minutes orange : 585 cellules ± 133 SEM, n = 5, Z = −0,548, p = 0,662, Fig. 6b).
supplémentaires pour permettre une expression adéquate de cFos, puis
perfusés par voie transcardiaque avec du PFA.
La privation sensorielle avant et après l'expérience a été réalisée pour réduire
l'expression de cFos non liée à la stimulation. L'activation transitoire des cellules exprimant ChR2 dans l'ento pallium réduit
Par la suite, des colorations contre le gène précoce immédiat cFos la sensibilité au contraste indiquée par une altération
465 nm 465 nm
un b
100
ChR2 + Pas de stimulation
ChR2 + stimulation 40Hz
tdTomate + No Stim
90 tdTomate + 40Hz Stim
Stimulus Classe 1 (SC1)
80
performances
correctes
de
%
70
Stimuli Classe 5 (SC5) *
60 **
Initialisation
50
Initialisation Présentation de la stimulation Décision
Stimulation dans 50 % des essais SC 1 SC 2 SC 3 SC 4 SC 5
Aucune stimulation dans 50 % des essais Classe de stimuli (SC)
c ré
100 100 Aucune stimulation
Aucune stimulation
tdTomate + Stimulation 40 Hz
Stimulation ChR2 + 40 Hz
***
90 90
**
80
* 80
performances
correctes
de
% performances
correctes
de
%
70 70
60 60
50 50
SC 1 CS 2 SC 3 SC 4 SC 5 SC 1 CS 2 SC 3 SC 4 SC 5
Classe de stimuli (SC) Classe de stimuli (SC)
e F
2500 2500 Aucune stimulation
Aucune stimulation
Stimulation ChR2 + 40Hz tdTomate + Stimulation 40 Hz
2000 2000
réaction
Temps
en
de
ms réaction
Temps
en
de
ms
1500 1500
1000 1000
500 500
SC 1 CS 2 SC 3 SC 4 SC 5 SC 1 CS 2 SC 3 SC 4 SC 5
Classe de stimuli (SC) Classe de stimuli (SC)
performance dans une tâche de discrimination visuelle en niveaux de gris. Pour tous A chaque essai d'une session, les pigeons étaient confrontés à deux
expériences comportementales, AAV1CAG a été utilisé pour délivrer l'ion images en niveaux de gris dont la luminance variait. Le niveau de gris
canaliser ChR2 ou la protéine fluorescente tdTomato dans les neurones les paires d'images pourraient appartenir à cinq classes de stimulus différentes (SC),
de l'entopallium. Pour étudier l'effet comportemental de la stimulation optogénétique, en fonction de leur différence de luminance. SC1 consistait en
un groupe expérimental exprimant ChR2 et images en niveaux de gris avec la différence de luminance la plus faible (moyenne
un groupe témoin exprimant tdTomato a été stimulé bilatéralement différence de luminance 5,81 cd/m2, Fig. 20 supplémentaire). Ainsi,
dans l'entopallium pendant toute la phase de présentation du stimulus ces stimuli étaient similaires les uns aux autres et donc difficiles à
ou jusqu'à ce que le pigeon réponde. La stimulation a eu lieu dans 50 % des discriminer. En revanche, les paires d'images en niveaux de gris du
les essais d'une tâche de discrimination visuelle à choix forcé. La SC5 a montré la différence de luminance la plus élevée (luminance moyenne
les 50 % restants des essais étaient dépourvus de stimulation optique différence 30,39 cd/m2, Fig. 20 supplémentaire). Par conséquent,
(Fig. 7a). ces stimuli étaient plus faciles à discriminer (voir plus de détails dans le
Fig. 7 L'activation transitoire à 40 Hz des cellules exprimant ChR2 dans l'entopalium aviaire réduit la sensibilité au contraste. a Illustration schématique de la
Procédure expérimentale. Les pigeons ont été conditionnés pour discriminer les niveaux de gris des différentes classes de stimulus (SC). SC1 se composait d'images en niveaux de gris qui
étaient difficiles à discriminer et SC5 consistait en des images en niveaux de gris faciles à discriminer. Les pigeons ont été stimulés bilatéralement dans la moitié des essais
dans une session donnée et la stimulation a eu lieu pendant toute la phase de présentation du stimulus ou jusqu'à ce que l'animal réponde. b Discrimination visuelle
performances du groupe témoin (n = 6) et du groupe expérimental (n = 6) affichées dans un graphique. Les données du groupe expérimental peuvent être vues plus en détail dans le panneau (c)
et les données du groupe de contrôle peuvent être vues plus en détail dans le panneau (d). Le groupe témoin et expérimental avaient des performances comparables et une baisse significative de
la performance n'a pu être observée que pour la stimulation optogénétique dans le groupe expérimental en SC3 et SC5. c Performance de discrimination visuelle du
groupe expérimental exprimant ChR2 dans l'entopallium. La stimulation optogénétique a réduit la sensibilité au contraste comme indiqué par une réduction significative de
précision de discrimination pour les stimuli dans SC3, SC4 et SC5, mais performances de discrimination intactes dans SC2 et SC1. d Performance de discrimination visuelle
du groupe témoin exprimant tdTomato dans l'entopallium. La stimulation optogénétique n'a eu aucun effet sur la sensibilité au contraste en tant que performance de discrimination
était comparable entre les essais stimulés et non stimulés dans toutes les classes de stimulus. e, f Temps de réaction pour les essais stimulés et non stimulés du
groupe expérimental (n = 6) et groupe témoin (n = 6). Il n'y avait pas de différence dans les temps de réaction entre les différentes classes de stimuli ou entre stimuli et
essais non stimulés pour les deux groupes. c–f Les performances moyennes de toutes les sessions sont tracées pour tous les pigeons dans les couleurs individuelles. Stimulé et non stimulé
performances au sein de chaque pigeon ont été connectés avec des lignes. Les barres d'erreur représentent l'erreur standard de la moyenne (SEM), ***p < 0,001, **p < 0,01, *p <
0,05.
Tableau 2 Effets de la stimulation optogénétique sur la discrimination visuelle en niveaux de gris.
SC1 SC2 SC3 SC4 SC5
Tous les 57,86 ± 0,77 63,15 ± 0,73 69,57 ± 0,81 73,88 ± 1,45 79,97 ± 1,22

groupes Exp. groupe
Stimulation 40 Hz Pas 57,97 ± 1,19 61,32 ± 1,38 65,50 ± 1,19 69,66 ± 2,05 73,50 ± 2,46
de stimulation p Valeur 56,03 ± 1,49 63,35 ± 1,66 69,69 ± 1,13 76,08 ± 2,66 82,23 ± 1,69
Groupe contrôle 0,205 0,334 0,028* 0,006** <0,001***
Stimulation 40 Hz Pas 58,23 ± 1,57 64,04 ± 1,71 71,19 ± 1,20 76,06 ± 2,61 81,57 ± 1,35

de stimulation Valeur 59,20 ± 0,84 63,88 ± 0,84 71,91 ± 1,96 73,72 ± 1,41 82,55 ± 1,37
p 0,513 0,937 0,665 0,228 0,270
Performance moyenne en % et SEM pour les cinq classes de stimulus pour les groupes expérimentaux et témoins. Les deux groupes étaient composés de six animaux chacun qui ont été testés à plusieurs reprises au cours de cinq sessions. ***p < 0,001,
**p < 0,01, *p < 0,05.
partie méthode). Les pigeons étaient conditionnés à picorer Cependant, la stimulation optique des animaux dans l'expérimentation
image plus sombre de la comparaison donnée et testée en sessions groupe exprimant une sensibilité réduite au contraste ChR2 indiquée par
composé de 600 essais jusqu'à cinq séances répondant aux critères comportementaux précision de la discrimination significativement altérée (pas de stimulation : 69,48 %
critères ont été réunis. Toutes les sessions auxquelles les pigeons ont participé ± 1,23 SEM, stimulation : 65,59 % ± 1,39 SEM, p = 0,002 ; Bonferroni
dans au moins 50 % des essais et leurs performances ont atteint 75 % dans comparaisons par paires corrigées).
un SC ont été analysés. Une ANOVA à mesures répétées avec La stimulation optique a altéré différemment le comportement
facteurs intrasujet stimulation 40 Hz (essais stimulés et non stimulés), session performance dans les différents CS (interaction entre les facteurs
(sessions comportementales 1–5) et SC 1–5 2=
Stimulation 40 Hz, SC et groupe F(4,40) = 5,184, p = 0,002, ηp
et le groupe de facteurs intersujets (groupe expérimental et 0,341, Fig. 7b–d, Fig. 21 supplémentaire). Dans l'expérimentation
groupe témoin) a été calculée. groupe, la stimulation à 40 Hz a altéré la précision de la discrimination dans
Pour la discrimination en niveaux de gris, les animaux appartenant à la SC5 (p < 0,001, Fig. 7c), SC4 (p = 0,006, Fig. 7c) et SC3 (p =
expérimental (n = 6) et le groupe témoin (n = 6) ont montré une 0,028, figure 7c). Cependant, la stimulation n'a eu aucun effet sur la
performances comportementales globales similaires (pas d'effet principal du précision de discrimination dans SC2 (p = 0,334, Fig. 7c) et SC1
2= (Fig. 7c, p = 0,205, Bonferroni a corrigé les comparaisons par paires ;
groupe de facteurs intersujets F(1,10) = 2,475, p = 0,147, ηp
0,198). En outre, la performance de choix des cinq comportements voir le tableau 2 pour les valeurs moyennes et SEM). L'effet de stimulation était
sessions de chaque groupe était comparable et non confondue avec robuste et s'est produit dans au moins un SC à chaque session de test
effets d'apprentissage (pas d'effet principal de la session F(4,40) = 0,802, p = (Fig. 21 supplémentaire). Contrairement au groupe expérimental,
2 = 0,074), ou des effets à long terme de la stimulation (pas il n'y avait aucun effet de la stimulation optique dans aucun SC dans le
0,531 , ηp
interaction entre la stimulation et la séance F(4,40) = 0,626, p = groupe témoin (toutes les valeurs p> 0,227 ; Fig. 7d, Fig. 21 supplémentaire,
2 voir le tableau 2 pour les valeurs moyennes et SEM). De plus, Bonferroni
0,647 , ηp = 0,059). Cependant, la performance de discrimination pour
les cinq SC différents différaient significativement pour tous les groupes testés des comparaisons par paires corrigées ont révélé que la performance de
2 = 0,948) et le groupe expérimental et le groupe témoin différaient significativement pour
(effet principal de SC F(4,40) = 181,015, p < 0,001, ηp
augmenté progressivement de SC1 à SC5 (tous Bonferroni corrigés essais stimulés dans SC3 (p = 0,007, Fig. 7b) et SC5 (p = 0,017,
comparaisons p < 0,007, pour les valeurs moyennes et SEM voir tableau 2). figure 7b). Pour SC4, il y avait une tendance vers la signification (p = 0,082,
Fait important, la stimulation optique a entraîné des effets différents pour figure 7b).
chaque groupe testé (interaction du groupe de facteurs intersujets Dans l'étape suivante, nous avons déterminé si la baisse de
et le facteur de stimulation intrasujet à 40 Hz, F(1,10) = 8,703, la performance dans le groupe expérimental était associée à une
p = 0,015, ηp
2 = 0,465). Nous n'avons trouvé aucun impact des stimuli optiques augmentation des temps de réaction qui pourraient avoir reflété l'attention
tion sur les performances comportementales des animaux déficits. Par conséquent, nous avons mesuré les temps de réaction dans tous les SC et
groupe témoin exprimant la protéine fluorescente tdTomato (pas calculé une ANOVA à mesures répétées avec les mêmes facteurs que
stimulation : 70,25 % ± 1,23 SEM, stimulation : 70,22 % ± 1,37 SEM, p = 0,970 ; décrit cidessus.
Bonferroni a corrigé les comparaisons par paires) indiquant que le bleu Nous avons constaté qu'il n'y avait pas d'effet principal de la séance (F(3,30)
la lumière ellemême n'a eu aucun impact sur les performances de discrimination visuelle. 2 = 0,069), stimulation 40 Hz (F(1,10) =
= 0,738, p = 0,538, ηp
dix BIOLOGIE DES COMMUNICATIONS | (2021) 4:100 | https://doi.org/10.1038/s42003020015959 | www.nature.com/commsbio
2 réponses chez les rongeurs ainsi que chez les primates45,46. Ces études ont conclu
2,292, p = 0,161, ηp = 0,186) et SC (F(4,40) = 1,439, p = 0,239, = 0,126) sur les
2 temps d e
r éaction.
D e
plus, il n'y avait pas que l'AAV9 est capable de transduire les cellules présentatrices d'antigène (APC) et
ηp interaction entre la stimulation à 40 Hz et SC (F(4,40) = 0,702, p = 0,066, Fig. 7e, peut déclencher une réponse immunitaire à médiation cellulaire en fonction de
2 Fig. 22 supplémentaire) indiquant = 0,595, ηp que les temps de
réaction étaient cf,
omparables entre les essais stimulés et non stimulés comme ainsi l'immunogénicité ainsi que du niveau d'expression du transgène45. Notre découverte
qu'entre tous les SC des groupes expérimental et témoin (Fig. 7e, f). De plus, les selon laquelle la réponse inflammatoire ne se produisait que lorsque l'AAV9 était
groupes ne différaient pas significativement dans leurs temps de réaction globaux utilisé en combinaison avec le promoteur CAG, mais pas lorsqu'il était utilisé avec le
(pas d'effet principal du groupe F(1,10) = 2,067, p = 0,181, ηp = 0,171, pas promoteur hSyn, étaye cette idée. C'est le cas car le promoteur CAG entraîne une
d'interaction de stimulation, SC et groupe F(4,40) = 2,139, p = 0,094, ηp Fig. 22 forte expression du transgène dans divers types de cellules, alors que le promoteur
2 hSyn s'est avéré être spécifique aux neurones25,34,4951, ce qui rend peu probable
supplémentaire). Un protocole d'impulsion différent été
avec
testé
une ssur
timulation
cinq pigeons
à 20 eHt
z
aa
2 0,176,
également pu altérer les performances comportementales pour les stimuli d= ans SC5 que l'expression du transgène se produise dans l'APC.
(voir Fig. 23 supplémentaire). À la fin des tests expérimentaux, tant pour le groupe
expérimental que pour le groupe témoin, les coordonnées des pointes de la canule Ainsi, il est toujours possible que l'AAV9 combiné à d'autres promoteurs fournisse
ont été évaluées et cellesci étaient principalement situées dans l'entopallium médial un outil optogénétique utile. En effet, plusieurs études menées sur des pinsons
à antérieur (voir Fig. 24 supplémentaire). zèbres utilisent scAAV9 en combinaison avec la neurexine ou le promoteur CMV
dans des zones du système de chant des pinsons zèbres7,44. Cependant, nos
résultats ne peuvent pas être facilement comparés à ces études, car elles utilisaient
des AAV autocomplémentaires (scAAV) construits sur mesure, qui différaient non
seulement par les promoteurs intégrés, mais également par d'autres aspects, car les
scAAV ne nécessitent pas de synthèse de second brin mais sont immédiatement
Discussion prêts pour la réplication et la transcription.
Dans la présente étude, nous avons étudié l'efficacité de trois AAV (AAV1, AAV5 et
AAV9) en combinaison avec deux systèmes de promoteurs différents (hSyn et CAG) Pour nos besoins, AAV1CAG était la construction la plus efficace et a donc été
dans leur capacité à piloter l'expression de ChR2 dans les neurones de l'entopallium, testée dans d'autres zones du cerveau du pigeon pour étudier son utilité à l'échelle
la première entrée visuelle. structure du cerveau antérieur des oiseaux. Cette du cerveau pour des expériences optogénétiques.
comparaison a été effectuée pour déterminer la construction virale optimale pour les Nous avons constaté que l'AAV1CAG était efficace pour piloter l'expression du
expériences optogénétiques dans le système visuel des oiseaux. Nous avons transgène dans les cellules du wulst visuel, de l'entopallium, du globus pallidus, de
constaté que l'AAV1 était le vecteur viral le plus efficace quel que soit le système de l'hippocampe, du striatum et du nidopallium caudolaterale. Il est important de noter
promoteur, car ce vecteur a transduit le plus grand nombre de cellules et a montré la que l'expression de ChR2 après des injections d'AAV1 combinées au promoteur CAG
densité de transfection la plus élevée par rapport aux autres constructions d'AAV. non spécifique s'est produite principalement dans les neurones indiquant que l'AAV1
Lorsque l'AAV1 était utilisé en association a un tropisme naturel pour ce type de cellule. Le fait que l'AAV1 transfecte
principalement les neurones a déjà été rapporté dans d'autres études38 soutenant
avec le promoteur CAG, nous avons observé un marquage antérograde et rétrograde l'idée que ce sérotype est un outil utile pour les expériences d'optogénétique.
étendu qui était plus faible lorsque AAV1 était combiné avec le promoteur hSyn. Étant
donné que plusieurs études ont rapporté des difficultés à produire des effets Chez les oiseaux, AAV1 n'a pas été utilisé dans le système visuel jusqu'à présent.
comportementaux avec la stimulation optogénétique chez les primates, nous avons Cependant, AAV1 a récemment été utilisé chez des diamants mandarins dans le
en outre voulu confirmer que la stimulation de ChR2 pouvait produire des effets système du chant pour étudier comment la stimulation optogénétique des terminaisons
physiologiques ainsi que comportementaux chez les pigeons. L'effet physiologique axonales de la zone tegmentale ventrale (VTA) peut guider les changements appris
de ChR2 a été vérifié avec une stimulation optique combinée et des enregistrements dans le chant43. Cette étude a rapporté un marquage antérograde dans la zone X
électrophysiologiques ainsi qu'avec une expression génique immédiateprécoce. suite à des injections d'AAV1CAG dans le VTA43. Ceci est conforme à notre
L'effet comportemental a été étudié dans une tâche de discrimination visuelle en découverte selon laquelle les injections d'AAV1CAG entraînent une expression
niveaux de gris. Nous avons pu montrer que le contraste sensi antérograde étendue de ChR2 dans des structures cibles bien décrites de l'entopallium
telles que le NI, le MVL et le striatum52. De plus, notre étude a observé une
la tivité a diminué lorsque l'activité neurale a été temporairement augmentée dans expression rétrograde étendue de ChR2 dans les structures d'entrée de l'entopallium
l'entopallium. Cette découverte fournit une preuve causale de l'implication de telles que le noyau rotundus53. La projection du noyau rotundus diencéphalique dans
l'entopallium dans la perception des contrastes ainsi qu'une preuve de principe pour l'entopalium télencéphalique est bien connue et idéale pour tester les propriétés
l'optogénétique chez les pigeons. rétrogrades d'un vecteur viral car ces deux structures sont situées dans des parties
La découverte selon laquelle AAV1 était la construction la plus efficace pour la différentes du cerveau54. Ainsi, il est impossible que les cellules marquées
transduction des cellules dans l'entopallium des pigeons est conforme à plusieurs rétrogradement qui ont été observées dans le noyau rotundus soient le résultat d'une
études montrant que cette construction est également très efficace chez les fuite d'injection de l'entopallium. La découverte que l'AAV1 en combinaison avec le
primates36, les chats39, les souris38 et les rats34,37. Néanmoins, chez les promoteur CAG conduit à l'expression rétrograde de ChR2 est conforme aux études
primates25,36 et les rongeurs34, l' AAV5 semble être encore plus efficace, ce qui de transduction réalisées chez la souris et le rat qui ont rapporté des propriétés
indique des différences de transfection virale entre les espèces, car l'AAV5 n'a similaires pour ce vecteur viral55,56. Les propriétés rétrogrades de l'AAV1 chez les
transduit que peu de cellules chez les pigeons et s'est avéré totalement inefficace oiseaux n'ont, à notre connaissance, jusqu'à présent pas été rapportées. Cependant,
chez les chats39. Alors que l'AAV9 est largement utilisé chez les rongeurs, notamment dans le système de chant des diamants mandarins, l'AAV9 a été utilisé pour transduire
en raison de sa capacité à traverser la barrière hématoencéphalique4749, et a les cellules de manière rétrograde44. Nos résultats indiquent que l'AAV1 en
également été utilisé chez les pinsons zébrés7,44, notre étude indique que l'AAV9 combinaison avec le promoteur CAG fournit une alternative utile pour ceux qui
combiné au promoteur hSyn était totalement inefficace pour conduire le transgène dépendent des produits disponibles dans le commerce. L'identification des propriétés
expression dans les cellules de l'entopallium chez les pigeons. En revanche, AAV9 antérogrades et rétrogrades des AAV chez les oiseaux est cruciale car c'est un moyen
combiné au promoteur CAG a conduit à une expression modérée du transgène dans d'acquérir une spécificité, qui peut être utilisée pour des analyses de circuit détaillées.
l'entopallium, mais également à une réduction sévère de NeuN et à l'activation des
cellules astrocytaires indiquant une neurotoxicité de ce sérotype. L'interprétation
selon laquelle la perte de cellules s'est produite à la suite d'une réponse inflammatoire
est corroborée par d'autres études de transfection montrant que l'AAV9 codant pour
des protéines nonsoi peut entraîner une réponse immunitaire à médiation cellulaire.
Nous avons constaté que la stimulation optique par la lumière bleue à 20 Hz et à
40 Hz des neurones exprimant ChR2 dans l'entopallium
a entraîné une discrimination visuelle en niveaux de gris altérée, tandis que La découverte que cette zone régit la perception de la luminosité fur
les mêmes manipulations chez les oiseaux témoins exprimant tdTomato thermore suggère une similitude fonctionnelle de l'entopallium avec le V165
n'ont entraîné aucun effet comportemental. Cela indique que la stimulation des mammifères .
par la lumière bleue ellemême n'a eu aucun effet sur la précision de la Avec notre découverte, nous avons en outre fourni, à notre connaissance,
discrimination visuelle et que le déficit de discrimination dans le groupe la première preuve de principe de la fonctionnalité de l'optogénétique chez
expérimental peut être attribué à la modification de la physiologie des les pigeons. Puisque la mise en œuvre fonctionnelle de l'optogénétique
cellules dans l'entopallium. De plus, ces résultats suggèrent que l'entopallium chez d'autres espèces, en particulier au niveau comportemental, a été
est impliqué dans la perception du contraste/la discrimination visuelle de la difficile24,27, la mise en place de cette méthode dans une nouvelle espèce
luminance, ce qui est bien en accord avec les études de lésions qui ont été est intéressante en soi. Alors que les tentatives de conduite du comportement
réalisées dans l'entopallium et d'autres zones de la voie collothalamique chez les primates avec stimulation optique du cortex moteur ont échoué25,
aviaire17,19,20,57 . Par exemple, il a été démontré que les lésions de la production de mouvements oculaires saccadés avec stimulation de V1 a
l'entopallium réduisent la capacité à classer les stimuli en clairs et sombres19 réussi66. Sur cette base, il a été suggéré que, en particulier pour la
ou à faire la distinction entre des images de motifs et de luminance stimulation optogénétique non spécifique des types de cellules inhibitrices
variables20. Cependant, dans la plupart des cas, les lésions n'étaient pas et excitatrices, les manipulations dans les zones sensorielles sont plus
confinées à l'entopallium, ce qui compliquait l'attribution des déficits efficaces dans le comportement de conduite que les manipulations dans les
perceptuels et comportementaux observés à la fonctionnalité de l'entopallium structures motrices66. C'est le cas car la stimulation non spécifique n'est
seul. pas en mesure de produire des plans d'action précis qui sont nécessaires
En utilisant l'optogénétique, une affirmation plus forte du rôle de l'ento pour piloter le comportement moteur58, tandis que la stimulation non
pallium dans la perception des contrastes peut maintenant être faite, car spécifique des zones visuelles peut produire des perceptions artificielles qui
nous avons sélectivement augmenté les taux de décharge des cellules attirent l'attention, modifiant ainsi le comportement66. L'idée de percepts
entopalliales. Cette procédure s'est avérée être une approche appropriée artificiels et de leurs effets attentionnels pourrait également s'appliquer à
pour perturber les comportements qui reposent sur un codage de population notre découverte selon laquelle la stimulation de la zone visuelle primaire
hétérogène et variant dans le temps7,58,59. Le traitement visuel dépend dans le cerveau du pigeon altère la perception du contraste dans une tâche
de ces mécanismes de codage adaptatif, car les neurones du système de discrimination en niveaux de gris. Cependant, comme les temps de
sensoriel varient dynamiquement leurs réponses en fonction de l'entrée60. réaction dans cette tâche ne différaient pas entre les essais stimulés et non
Dans les tâches de discrimination visuelle, où un stimulus doit être stimulés, il est peu probable que nos résultats soient simplement le résultat
sélectionné par rapport à l'autre, les cellules des zones visuelles supérieures d'une attention évitée, mais plutôt d'un codage de contraste déficient dans l'entopallium.
codent pour cette discrimination en augmentant et en diminuant Cependant, le fait que la stimulation non spécifique ne soit pas en
sélectivement leurs taux de déclenchement pour les stimuli sélectionnés et non mesure
sélectionnés, respectivement.
de produire des plans d'action précis qui sont nécessaires pour
La différence de taux de déclenchement de ces cellules représente piloter le comportement moteur58 indique également l'importance des
l'information discriminative, qui est plus importante pour les discriminations approches spécifiques au type de cellule ou à la projection lors de l'étude
simples que compliquées61. Étant donné que la manipulation optogénétique de comportements qui reposent sur des mécanismes étroitement régulés.
au sein de l'entopallium n'était pas spécifique au type de cellule, l'information Afin d'étudier la fonction de l'organisation colonnaire et laminaire du cerveau
discriminative de ces cellules a probablement été perturbée en augmentant des oiseaux qui a été proposée par plusieurs études13,67,68, des approches
les taux de déclenchement de toutes les cellules, réduisant ainsi leurs spécifiques à la projection sont nécessaires. Avec l'optogénétique spécifique
contrastes. Ce contraste réduit dans les représentations neuronales pourrait à la projection, le rôle de circuits visuels spécifiques entre les couches peut
avoir conduit à une altération de la précision de la discrimination. Ainsi, pour être étudié pour établir des relations circuitfonction qui mettent en lumière
l'optogénétique non spécifique de type cellulaire lors de la discrimination les principes généraux de l'organisation cérébrale. Avec notre découverte
visuelle, les outils optogénétiques excitateurs pourraient offrir des avantages que l'AAV1 en combinaison avec le promoteur CAG est capable de conduire
par rapport aux outils optogénétiques inhibiteurs, car l'excitation crée un l'expression de ChR2 de manière antérograde et rétrograde, nous avons
nouveau signal qui peut perturber la dynamique de la population plus fourni un outil utile pour les études futures qui peuvent utiliser ce sérotype
intensément que l'inhibition, ce qui pourrait entraîner des effets de pour déterminer si le principe conservé d'une organisation colonnaire et
plancher62. Bien que les outils optogénétiques excitateurs offrent les laminaire chez les oiseaux les zones sensorielles se traduisent également
avantages mentionnés cidessus et puissent produire des effets comparables par des fonctions similaires. Avec l'étude de comparaison virale, nous avons
aux lésions temporales63, il convient de noter que ces outils peuvent avoir en outre fourni les bases de diverses autres méthodes reposant sur le
des effets d'entraînement sur les zones de circuit connectées de l'entopallium transfert de gènes viraux, telles que DREADDS24, les ablations
telles que la NFL, le NI et le MVL64. Ainsi, pour étayer davantage le rôle de génétiques69, l'imagerie calcique69 ou les études d'inactivation/désactivation
la perception du contraste par rapport à l'entopallium, des expériences génétique locale5, qui peuvent désormais être appliquée dans le cerveau
similaires utilisant des outils inhibiteurs ou la pharmacologie pourraient être du pigeon et peut grandement améliorer la recherche comparative. Dans
réalisées. De plus, de futures études optogénétiques pourraient étudier l'ensemble, nous avons créé les bases d'une compréhension mécaniste du
l'effet de la stimulation optogénétique sur d'autres fonctions entopalliales pallium aviaire et démontré les principes conservés des systèmes visuels
telles que le mouvement, le motif et la discrimination des couleurs. Dans aviaires et mammifères encourageant l'utilisation d'organismes modèles
ces tâches, la ségrégation fonctionnelle a été décrite comme des lésions aviaires pour la recherche comparative et sur la vision à l'avenir.
dans l'entopallium antérieur affectant le motif, la couleur et la discrimination
des formes, tandis que les lésions de l'entopallium postérieur altèrent le
traitement du mouvement18,21. Sur la base de ces résultats et des modèles Méthodes
de projection topographique comparables dans les voies tectofuges des Sujets expérimentaux. Pour cette étude, N = 35 pigeons voyageurs adultes (Columba
oiseaux et des mammifères, il a été proposé que l'entopallium postérieur livia) de sexe indéterminé ont été obtenus auprès d'éleveurs locaux. Les pigeons
avaient entre 1 et 4 ans. Ils ont été mis en cage individuellement et soumis à un cycle
sensible au mouvement est comparable à la zone MT, tandis que
lumièreobscurité de 12 h. Pendant la période d'entraînement et de test, les oiseaux ont
l'entopallium antérieur sensible à la couleur/forme/motif est comparable à été maintenus à environ 85 % de leur poids d'alimentation libre. Toutes les expériences
V2, V3 , et IT chez mam mals21. Comme les neurones sensibles à la ont été réalisées conformément aux principes concernant les soins et l'utilisation des
luminosité du noyau rotundus se projettent principalement vers l'entopallium animaux adoptés par la loi allemande sur le bienêtre animal pour la prévention de la
cruauté envers les animaux, comme suggéré par la directive du Conseil des
antérieur, le traitement de la luminosité a également été lié à cette
Communautés européennes du 24 novembre 1986 (86/609/CEE) et ont été approuvés
subdivision21. Bien que ne montrant pas de ségrégation fonctionnelle, notre par le comité d'éthique animale du Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz
étude confirme que l'entopallium antérieur est impliqué dans la perception NRW, Allemagne. Tous les efforts ont été faits pour minimiser le nombre d'animaux
de la luminosité car notre manipulation neuronale s'est principalement concentrée utilisés
sur ect
minimiser
ette région.leurs souffrances.
Injections de vecteurs viraux/implantations de canules. L'anesthésie a été initiée avec un mélange 7:3 de complexe (Vector LaboratoriesVectastain Elite ABC kit ; 1:100 dans du PBST). Après un rinçage
kétamine (Ketavet 100 mg/ml, Zoetis GmbH, Berlin Allemagne) et de xylazine (20 mg/ml Rompun, Bayer supplémentaire (3 × 10 min), les tranches ont été incubées dans une solution DAB. La solution comprenait
Vital GmbH, Leverkusen Allemagne). 5 ml d'eau distillée, 100 ul de solution mère de DAB, 84 ul d'une solution de nickel et 84 ul de solution
Les pigeons ont reçu des injections intramusculaires de 0,075 ml pour chaque 100 g de poids corporel. mère tampon (Vector Laboratories, DAB Substrate Kit SK4100). Toutes les tranches ont été incubées
Cela se traduit par 52,5 mg de kétamine par kg de poids corporel et 4,5 mg de xylazine par kg de poids dans des plaques à 12 puits, chaque puits contenant 1 ml de cette solution de travail. Après avoir ajouté 6
corporel. Ensuite, l'anesthésie a été maintenue avec un flux constant d'isoflurane (Forane 100 %, Abbott ul de H2O2 dans chaque puits, la réaction a commencé et a été arrêtée après 2 min en transférant les
GmbH & Co. KG, Wiesbaden, Allemagne). Avant l'intervention chirurgicale, les plumes sur le dessus de la tranches dans des plaques à 12 puits contenant du PBS. Par la suite, les tranches ont été rincées (2 × 5
tête couvrant la zone cible ont été coupées. Dès que les pigeons n'ont plus montré de réflexes douloureux, min dans du PBS) puis montées sur des lames recouvertes de gélatine. Enfin, les tranches ont été
ils ont été placés dans un appareil de stéréotaxie. Au début, la peau recouvrant la tête était incisée pour déshydratées dans l'alcool et recouvertes de depex (Fluka, Munich, Allemagne)70.
exposer l'os crânien. Ensuite, des craniotomies ont été réalisées pour découvrir le tissu cérébral. Des
craniotomies ont été réalisées à différents endroits selon la structure cible (entopallium : A + 9,5, L ± 5,5, Pour les colorations fluorescentes, les tranches ont d'abord été rincées (3 × 10 min dans du PBS)
DV −4,5 ; hippocampe : A + 6,0, L ± 1,0, DV −1 ; wulst : A + 11, L ± 1,0, DV 1,5 ; globus pallidus : A + 9,0, puis incubées dans du NHS à 10% (Vector LaboratoriesVectastain Elite ABC kit) pour bloquer les sites
L ± 4,5, DV 6 ; NCL : A + 5,5, L ± 7,0, DV 2,5 ; striatum médian : A + 11,0, L ± 1,5, DV 6,054). de liaison non spécifiques. Après blocage et rinçage (3 × 10 min), les tranches pour les colorations ChR2
simples ont été incubées avec un anticorps monoclonal de souris antiChR2 (1: 1000 dans PBST,
PROGEN Biotechnik GmbH, Heidelberg, Allemagne).
Après le retrait de la duremère, des injections ont été faites aux endroits spécifiques. Pour les colorations combinées ChR2 et NeuN, les tranches ont été incubées dans un mélange d'un
Pour l'étude de transfection virale 5 µl de chaque vecteur viral (AAV1.hSyn.hChR2(H134R)eYFP, anticorps monoclonal de souris antiChR2 (1:1000 dans PBST, PROGEN Biotechnik GmbH, Heidelberg,
AAV1.CAG.hChR2(H134R)mCherry.WPRE.SV40, AAV5.hSyn. hChR2(H134R)eYFP, Allemagne) et d'un anticorps polyclonal de lapin antiNeuN (1:500 dans PBST, EMD Millipore, Darmstadt,
AAV5 .CAG.hChR2(H134R)mCherry.WPRE.SV40, AAV9.hSyn.hChR2(H134R)eYFP, Allemagne). Pour les colorations combinées ChR2 et c Fos, les tranches ont été incubées dans un mélange
AAV9.CAG.hChR2(H134R)mCherry.WPRE.SV40 (tous les vecteurs ont été obtenus auprès d'Addgene, d'un anticorps monoclonal de souris antiChR2 (1:1000 dans PBST, PROGEN Biotechnik GmbH,
Watertown, USA , tous les titres étaient ≥1 × 1013 vg/ml)) ont été injectés sous pression dans au moins Heidelberg, Allemagne) et d'un anticFos polyclonal de lapin (1: 500 en PBST, Santa Cruz Biotechnology,
cinq hémisphères séparés de trois pigeons. Par conséquent, 5 µl ont été pipetés sur du parafilm et aspirés Texas, ÉtatsUnis). Pour les colorations ChR2 et GFAP combinées, les tranches ont été incubées dans un
dans une pipette en verre avec une pointe de 25 µm. Le volume total a été réparti sur une plage de 500 mélange d'un anticorps monoclonal de souris antiChR2 (1:1000 dans PBST, PROGEN Biotechnik GmbH,
µm dorsal/ventral. Pour les expériences comportementales et électrophysiologiques, 10 µl d'AAV1. Heidelberg, Allemagne) et d'un antiGFAP monoclonal de rat (1:500 dans PBST , Invitrogen, Darmstadt,
Allemagne). Tous les anticorps primaires ont été incubés pendant une nuit à 4°C. Le lendemain, après
CAG.hChR2(H134R)mCherry.WPRE.SV40 (Addgene, Watertown, USA, tous titres ≥ 1 × 1013 vg/ rinçage (3 × 10 min), les tranches pour les colorations ChR2 simples ont été incubées avec un anticorps
ml) a été injecté bilatéralement dans l'entopallium (5 µl à A + 9,5, L ± 5,5, DV −4,5 et 5 µl à A + 10,5, L ± de chèvre antisouris AlexaFluor594 (1: 500 dans PBST, Invitrogen, Darmstadt, Allemagne). Les tranches
6,0, DV 4,5). Les pigeons témoins ont reçu des injections d'AAV1CAGtdTomato (Addgene, Watertown, pour les colorations combinées ChR2/NeuN et ChR2/cFos ont été incubées dans un mélange d'un
USA) à la place. anticorps de chèvre antisouris AlexaFluor594 (1:500 dans PBST, Invitrogen, Darmstadt, Allemagne) et
Les pigeons utilisés dans les expériences comportementales ont en outre été implantés bilatéralement d'un anticorps de chèvre antilapin AlexaFluor488 (1 :200 dans PBST, Invitrogen, Darmstadt, Allemagne).
avec une double canule à fibre optique (DFC_200/2450.53_12mm_GS0.7_FLT, Doric Lenses Inc, Les tranches pour les colorations ChR2 et GFAP combinées ont été incubées dans un mélange d'un
Québec, Canada). Ainsi, des vis en acier inoxydable (Small Parts, Logansport, USA) ont été fixées au anticorps de chèvre antisouris AlexaFluor594 (1:500 dans PBST, Invitrogen, Darmstadt, Allemagne) et
crâne pour servir d'ancrages au ciment dentaire. Après cela, les canules ont été insérées verticalement d'un anticorps de chèvre antirat AlexaFluor488 (1:200 dans PBST, Invitrogen, Darmstadt, Allemagne).
dans l'entopallium (A + 9,5, L ± 5,5, DV 4,5). Enfin, la canule a été attachée à la tête avec du ciment Tous les anticorps secondaires ont été incubés pendant 1 h à température ambiante. Après un rinçage
dentaire. Une fois l'opération terminée, les pigeons ont reçu des analgésiques pendant trois jours supplémentaire (3 × 10 min), les tranches ont été montées sur des lames de verre (Superfrost® Plus,
consécutifs (0,5 ml 10 mg/ml de Rimaldyl, Pfizer GmbH, Münster, Allemagne). La période de récupération Thermo Scientific) dans du PBS, et incorporées avec du DAPI FluoromountG® (SouthernBiotech,
a duré 14 jours, au cours desquels les pigeons ont eu accès à de la nourriture et de l'eau à volonté. Birmingham, USA), avec une exposition minimale à la lumière pour préserver autant de fluorescence que
possible. La spécificité des anticorps primaires a été soit évaluée avec des transferts Western, sur la base
Après la période de récupération, les pigeons ont continué à s'entraîner pour s'habituer aux patch chords. de la littérature publiée précédemment, soit étudiée avec des colorations immunohistochimiques dans des
échantillons de contrôle négatifs. Toutes les colorations ont été réalisées deux fois avec des séries
cérébrales séparées pour confirmer qualitativement la reproductibilité des colorations.
Perfusion. Les animaux de l'étude de transfection virale ont été perfusés 6 semaines après les injections
pour s'assurer que l'expression de ChR2 était déjà stable (voir Fig. 25 supplémentaire), tandis que les
pigeons du paradigme comportemental ont été perfusés une fois tous les tests expérimentaux terminés.
Nous avons constaté que l'expression de ChR2 était stable jusqu'à 12 mois (voir Fig. 26 supplémentaire).
Après avoir profondément anesthésié les pigeons avec de l'équithésine (0,45 ml par 100 g de poids
Analyse microscopique. Pour l'analyse quantitative de l'expression de ChR2, toutes les tranches contenant
corporel), la perfusion transcardiaque a été initiée avec du chlorure de sodium (NaCl) à 0,9 % et suivie
des cellules exprimant ChR2 ont été imagées bilatéralement avec un grossissement de 200 × à l'aide d'un
d'une solution froide (4 °C) de paraformaldéhyde (PFA) à 4 % dans 0,12 Tampon phosphate M (PB; pH
ZEISS AXIO Imager.M1 avec une caméra (AxioCam MRm ZEISS 60N C 2/3 ”0,63 ×). Toutes les sections
7,4). Une fois que le sang a été échangé avec succès avec du PFA, le cerveau a été retiré du crâne et
contenant l'entopallium entre A + 8,0 et A + 11,25 d'une série de cerveaux (toutes les dix tranches) ont
stocké dans une solution postfixée (4 % de PFA avec 30 % de saccharose) à 4 °C pendant les 2 heures
été analysées. Pour la quantification des somata, chaque soma exprimant ChR2 dans l'entopallium entier
suivantes. Après cela, tous les cerveaux ont été stockés dans une solution de saccharose à 30 % dans
a été mis en évidence dans ZEN 2.3 lite et ensuite automatiquement compté par le programme. Pour tous
une solution saline tamponnée au phosphate (PBS ; pH 7,4) pendant au moins 24 h pour éliminer l'eau
les vecteurs viraux, cette analyse a été effectuée dans un dixième des sections de cerveau et le nombre
pour la cryoprotection.
de tous les soma exprimant ChR2 a été additionné pour une analyse statistique plus approfondie.
Avant le tranchage, les cerveaux ont été inclus dans 15 % de gélatine/30 % de saccharose et stockés
dans du postfix pendant 24 h. Enfin, les cerveaux ont été coupés dans un plan coronal de 40 µm
d'épaisseur à l'aide d'un microtome à congélation (Leica, Wetzlar, Allemagne).
De plus, la densité de la zone tachée a été déterminée avec ZEN 2.3 pro
Assistant outil d'analyse d'image. Pour cela, l'entopallium entier a été sélectionné comme cadre
Immunohistochimie. Toutes les colorations ont été réalisées avec des sections flottantes et chaque d'analyse et les paramètres de segmentation ont été ajustés (lissage : aucun, netteté : aucun, surface
dixième tranche a été utilisée pour l'immunohistochimie. La contrecoloration a été effectuée pour permettre minimale 1 pixel, seuil : seuil d'Otsu, séparé : aucun).
une comparaison égale entre les sérotypes, car les sérotypes avec le promoteur hSyn ont été marqués Suite à cela, la taille de toutes les particules colorées dans le cadre d'analyse a été automatiquement
avec eYFP, tandis que les sérotypes avec le promoteur CAG ont été marqués avec mCherry. De plus, la mesurée en µm2. Dans les mêmes coupes, la taille de l'entopallium a été mesurée en µm2 en délimitant
quantité d'expression du transgène peut être sousestimée lors de l'analyse de la fluorescence native, car les bordures. La même analyse a été effectuée sur des images avec un grossissement de 100 × pour
le signal augmente avec les contrecolorations (voir Fig. 1 supplémentaire). déterminer la densité d'expression de ChR2 et de GFAP dans le site d'injection pour tous les cas utilisés
dans l'expérience de tropisme. Pour la quantification des signaux NeuN dans l'analyse de la perte de
Pour la réaction de la 3,3 diaminobenzidine (DAB), les tranches ont d'abord été rincées (3 × 10 neurones, les seuils supérieur et inférieur ont également été ajustés avec la méthode d'Otsu. Cependant,
min dans du PBS) puis incubées dans du peroxyde d'hydrogène à 0,3% (H2O2) dans de l'eau distillée les paramètres de segmentation ont été ajustés et définis sur (lisser : aucun, aiguiser : délimiter, seuil : 0,
pendant 30 min pour bloquer les peroxydases endogènes. Après cela, les tranches ont été rincées (3 × 10 taille : 6, surface minimale : 96 pixels, séparé : morphologie, nombre : 20).
min) puis transférées dans du sérum de cheval normal à 10 % (NHS ; kit Vector LaboratoriesVectastain
Elite ABC) dans du PBS avec 0,3 % de TritonX100 (PBST) pendant 30 min pour bloquer sites de liaison De même, le signal cFos a été quantifié dans l'entopallium et le wulst, la seule différence étant que la
non spécifiques. Pour l'analyse comparative de la transduction virale et pour l'évaluation du transport surface minimale a été ajustée à 24 pixels. Pour la quantification du transport antérograde et rétrograde,
antérograde et rétrograde, les tranches ont été incubées avec un anticorps monoclonal de souris anti la zone cible a été délimitée et les valeurs d'intensité ont été déterminées. Pour le transport antérograde,
ChR2 (1: 1000 dans PBST, PROGEN Biotechnik GmbH, Heidelberg, Allemagne) à 4 ° C pendant la nuit. les cas ont été classés en + peu, ++ modérés et +++ étendus (+ le signal était <6 % plus sombre que le
Pour l'expérience de gène précoce immédiate, les tranches ont été incubées avec un anticorps polyclonal fond, les signaux ++ étaient de 6 à 12 % plus sombres que le fond, le signal +++ était > 12 % plus sombre
de lapin anticFos (1: 500 dans PBST, Santa Cruz Biotechnology, Texas, ÉtatsUnis) à 4 ° C pendant la que le fond). Pour le transport rétrograde, les cas ont été classés en + peu, ++ modérés et +++ étendus (+
nuit. Le lendemain, toutes les tranches ont été rincées dans du PBS (3 × 10 min) puis incubées à le signal était <2 % plus sombre que le fond, les signaux ++ étaient de 2 à 4 % plus sombres que le fond,
température ambiante avec l'anticorps secondaire biotinylé correspondant (anticorps antisouris 1:500 le signal +++ était > 4 % plus sombre que le fond). Toutes les quantifications ont été effectuées en aveugle,
dans du PBST, anticorps antilapin 1:200 dans du PBST; Vector LaboratoiresKit Vectastain Elite ABC) l'expérimentateur n'étant pas au courant du sérotype étudié.
pendant 1 h. Par la suite, les tranches ont été rincées (3 × 10 min dans du PBS) puis transférées dans un
avidinebiotineperoxydase
Électrophysiologie. Pour les enregistrements extracellulaires, des électrodes isolées en fil de stimulés avec de la lumière bleue (465 nm, Plexon) dans un ordre randomisé pendant la phase
tungstène avec une impédance d'environ 4 MΩ ont été utilisées (produit n ° 26053; FHC, Bowdoin de présentation du stimulus dans la moitié des essais (Fig. 7a). Ainsi, la stimulation a été arrêtée à
ham, ME, USA). À l'extrémité de chaque électrode d'enregistrement, une fibre optique pour la la fin de la présentation du stimulus (soit après 8 s, soit lorsque les pigeons ont répondu aux images
stimulation lumineuse (Doric Lenses Inc, Québec, Canada) a été collée. Les électrodes ont été en niveaux de gris). De plus, dans chaque session, un nombre égal de stimuli appartenant à chaque
montées sur un micromanipulateur (Narishige, MO8, Tokyo, Japon) et avancées dans le tissu SC a été affiché dans un ordre aléatoire.
cérébral. Au cours de l'avancement de l'électrode, une impulsion lumineuse constamment répétée Les pigeons ont été assignés au groupe expérimental (exprimant ChR2) et au groupe témoin
d'une durée de 1 s a été présentée pour évoquer des pointes. Lorsqu'une cellule réactive était (exprimant tdTomato) dans un ordre aléatoire. Les performances comportementales des pigeons
rencontrée, un protocole de stimulation fixe était appliqué. Le protocole consistait en des impulsions expérimentaux et témoins ont été enregistrées dans MATLAB et n'ont donc pas fait l'objet
lumineuses répétées de durée variable (1, 10, 100, 200 et 500 ms) et a été répété trois fois d'observations. De plus, l'expérimentateur qui a formé et testé les pigeons n'était pas au courant de
(balayages, Fig. 5a (i) et tableau supplémentaire 2). L'activité neuronale résultante a été amplifiée l'attribution du groupe.
(10 000 ×) et filtrée passebande (300 Hz à 3 kHz) à l'aide d'un amplificateur différentiel pour les
potentiels extracellulaires (DAM 80, World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA). De plus, un
filtre coupebande actif a été utilisé pour éliminer le bruit de ligne (HumBug, Quest Scientific, North
Manipulations optogénétiques. Des protocoles de stimulation lumineuse 20 Hz (durée d'impulsion :
Vancouver, Canada). Les réponses unicellulaires ont été numérisées à une fréquence de 83 kHz à
15 ms ; intervalle interimpulsions : 35 ms) et 40 Hz (durée d'impulsion : 15 ms ; intervalle inter
l'aide d'un convertisseur analogiquenumérique (Cambridge Electronic Design, Micro 1401 mkII).
impulsions : 10 ms) ont été réalisés avec le logiciel Radiant (Plexon, TX , ETATSUNIS). Pour les
Les pointes ont été triées hors ligne et analysées à l'aide du logiciel Spike 2 (Cambridge Electronic expériences comportementales, l'entopallium a été éclairé par de la lumière bleue (LED bleue, 465
nm, Plexon). Pour l'expérience cFos, l'entopallium a été éclairé avec une lumière bleue (LED bleue,
Design, V.8) et Matlab (The Mathworks, Natick, MA, USA). Pour la stimulation optique, nous avons
utilisé des modules LED (modules Plexon Compact, 465 nm, Plexon, TX, USA) pilotés par une unité 465 nm, Plexon) dans un hémisphère et une lumière orange (LED orange, 620 nm, Plexon) dans
de contrôle (PlexBright 4 Channel Optogenetic Controller, Plexon, TX, USA) à l'aide du logiciel l'autre hémisphère pendant une période de 30 min avec alternance intervalles de 5 min stimulation
Radiant (Plexon, TX, USA) . L'évolution temporelle de la stimulation lumineuse a été numérisée de 40 Hz et 5 min sans stimulation. La LED était montée sur un joint tournant placé à un emplacement
manière synchrone à une fréquence de 41 kHz pour l'analyse précise des réponses cellulaires fixe audessus de la chambre de comportement. Des cordes de patch optiques légères
(BFP(2)_200/220/LMWJ 0.53_1.5m_LCGS0.7, Doric Lenses Inc., Québec, Canada) ont été utilisées
évoquées (Cambridge Electronic Design, Micro 1401 mkII). Pour comparer le nombre de pointes
pour connecter les canules à double fibre optique à la source lumineuse. La puissance lumineuse a
évoquées par la stimulation optique avec l'activité de base de chaque cellule, un test unilatéral de
somme des rangs de Wilcoxon a été effectué dans toutes les conditions testées. Pour évaluer la été contrôlée avec le contrôleur PlexBright4 canaux (Plexon, TX, USA). Avant que les canules ne
soient utilisées pour des expériences comportementales ou électrophysiologiques, le flux lumineux à
variabilité des réponses neuronales évoquées, nous avons comparé les pics évoqués lors de
balayages uniques à l'aide d'une analyse de variance non paramétrique (test de KruskalWallis). Si l'extrémité de la canule a été vérifié à l'aide d'un wattmètre. Avant chaque expérience, le rendement
nous trouvions des différences significatives entre les balayages, des tests de comparaisons multiples lumineux de la corde de patch a également été vérifié (plage de canule d'intensité lumineuse : 3,5 à
corrigés de Bonferroni étaient effectués. 4,5 mW, plage d'intensité lumineuse à la corde de patch : 4,5 à 6 mW, Thorlabs, Newton, ÉtatsUnis).
Boîtes Skinner. Tous les entraînements et tests ont été effectués dans deux chambres opérantes
(32 cm (l) × 34 cm (d) × 32 cm (h)). Les chambres opérantes étaient équipées de caméras à des fins
Statistiques et reproductibilité. Pour l'étude de transfection virale, la taille de l'échantillon a été
de surveillance, de deux lumières blanches de chaque côté du plafond et d'un écran tactile sur le
déterminée sur la base d'études de transfection virale précédemment publiées qui ont été publiées
panneau avant. De plus, une mangeoire a été positionnée sur le panneau avant directement sous
chez d'autres espèces telles que les rats34, les souris38, les primates36 et les chats39. Pour tous
l'écran tactile où les oiseaux ont reçu des grains mélangés comme récompense alimentaire pour les
les vecteurs viraux, un minimum de cinq injections a été effectué dans des hémisphères séparés
réponses correctes. Une lumière audessus du
la mangeoire indiquait quand la nourriture était disponible et servait de second renforçateur. Tout d'au moins trois pigeons. La quantité totale de cellules exprimant ChR2 a été déterminée pour
chaque injection dans une série de cerveaux (un dixième de toutes les sections de cerveau) puis
les paradigmes comportementaux pour cette expérience ont été programmés dans MATLAB à l'aide
multipliée par dix pour estimer la quantité réelle de cellules exprimant ChR2. Pour l'analyse de la
de la Biopsychology Toolbox71.
zone transduite, la zone totale d'expression de ChR2 dans l'ento pallium a été déterminée dans la
même série cérébrale. De plus, la taille de l'entopallium a été mesurée dans toutes les sections d'une
Stimuli. L'ensemble de stimulus qui a été utilisé dans cette étude consistait en un stimulus série. La surface transduite a ensuite été mise en relation avec la taille de l'entopallium entier et avec
d'initialisation orange et des paires de niveaux de gris avec des différences de luminance variables la taille de l'entopallium dans les coupes avec expression de ChR2. Tous les sérotypes ont été inclus
qui ont été divisées en cinq SC différents (différence de luminance moyenne SC1 5,81 cd/m2 ; dans cette analyse à l'exception de AAV9hSynChR2, car ce sérotype n'a pas entraîné d'expression
différence de luminance moyenne SC2 12,56 cd/m2 ; SC3 moyenne différence de luminance 17,96 fiable de ChR2. Nous avons utilisé le test de ShapiroWilk pour tester la distribution normale des
cd/m2 ; différence de luminance moyenne SC4 23,91 cd/m2 ; différence de luminance moyenne SC5 données et le test de Levene pour tester l'homogénéité de la variance. Une ANOVA à une voie avec
30,39 cd/m2, voir Fig. 20 supplémentaire). Une paire de stimulus d'un SC était toujours affichée au correction de Welch a été calculée pour étudier l'effet du sérotype sur le nombre de cellules exprimant
centre de l'écran tactile de l'ordinateur. L'image avec la luminance la plus faible de la paire de niveaux ChR2 et sur la zone d'expression ChR2.
de gris a été attribuée à la position gauche ou droite du moniteur dans un ordre aléatoire. Un exemple
de paire de stimuli SC1 et un exemple de paire de stimuli SC5 sont représentés sur la figure 7a. Les tests post hoc ont été corrigés par Bonferroni. Pour les expériences de superposition NeuN,
Tous les stimuli mesuraient 3,5 cm × 3,5 cm et les paires de niveaux de gris étaient affichées à 5 cm ChR2 exprimant soma colocalisé avec NeuN, ainsi que les cellules ChR2 sans colocalisation, ont
à gauche et à droite du centre du été comptés en une série par injection. Le pourcentage de cellules avec et sans colocalisation a été
filtrer. déterminé et comparé avec un test de rang signé de Wilcoxon. Pour l'expérience de perte de
neurones, le signal NeuN a été quantifié au site d'injection des injections AAV9CAG et AAV1CAG
d'une série cérébrale par injection. Le nombre moyen de neurones des deux sérotypes a été comparé
Tâche de discrimination visuelle en niveaux de gris. La première phase de formation était une avec un test U de MannWhitney. Pour l'expérience cFos, les signaux cFos ont été quantifiés à
procédure de mise en forme automatique, où les oiseaux ont appris à picorer les stimuli de tous les deux sites dans deux zones cérébrales dans les hémisphères stimulés par la lumière bleue et orange
SC ainsi que le stimulus d'initialisation orange. Après que les pigeons aient appris à picorer tous les chez trois animaux. Un site stimulé dans un hémisphère stimulé orange n'a pas pu être reconstruit,
sti muli, ils ont été entraînés à une tâche de discrimination visuelle en niveaux de gris. Au cours de ce qui a conduit à n = 6 pour la stimulation par la lumière bleue et n = 5 pour la stimulation par la
cette phase, des paires de stimulus avec une différence de luminance élevée (SC5) ont été lumière orange. Les signaux moyens de cFos pour les hémisphères stimulés bleu et orange dans
présentées et le pigeon a dû apprendre à picorer le stimulus avec la luminance la plus faible. Une l'entopallium et dans le wulst ont été comparés à un test MannWhitney U.
fois que la performance de discrimination a atteint 75%, les pigeons ont été entraînés dans le
paradigme final qui contenait les stimuli des cinq SC. Une fois que les pigeons ont montré une
performance stable (au moins 50% d'initialisations et 75% de performance de discrimination correcte Pour l'analyse comportementale, six pigeons témoins et six pigeons expérimentaux
dans un SC), ils ont subi une intervention chirurgicale. Après 14 jours et une récupération complète, ont été testés en cinq séances. La taille de l'échantillon a été déterminée sur des études de
les pigeons ont été entraînés à nouveau dans le paradigme final pour s'habituer aux accords de lésions d'entopallium publiées précédemment qui ont étudié la discrimination visuelle chez les
patch. Les tests comportementaux ont commencé lorsque 6 semaines se sont écoulées depuis la oiseaux17–21. Pour l'analyse des données comportementales, cinq sessions qui correspondaient
chirurgie et que les performances comportementales sont revenues aux critères. Les 6 semaines au critère d'au moins 50 % de participation à l'essai et 75 % de réponses correctes dans au moins
entre la chirurgie et les tests comportementaux ont permis une expression stable du transgène. un SC ont été prises en compte. Les temps de réaction moyens et les performances moyennes dans
Chaque session de test contenait 600 essais au total. Un essai individuel a commencé par les essais stimulés et non stimulés pour tous les SC ont été extraits à l'aide de MATLAB. Nous avons
l'illumination d'un stimulus d'initialisation orange au centre du panneau avant ainsi qu'une tonalité utilisé le test de ShapiroWilk pour tester la distribution normale des données et le test de Levene
indiquant le début de l'essai (Fig. 7a). Après avoir picoré le stimulus orange, une paire en niveaux de pour tester l'homogénéité de la variance. Une ANOVA à mesures répétées avec la session de
gris de l'un des cinq SC a été affichée sur l'écran tactile pendant 8 s ou jusqu'à ce qu'une réponse facteurs intrasujets, la stimulation et le SC et le groupe de facteurs intersujets a été calculée pour
de picorage soit détectée (Fig. 7a). Les pigeons ont été conditionnés à picorer la plus sombre des étudier les effets sur les temps de réaction (en quatre sessions) et les performances (en cinq
deux images en niveaux de gris. Lorsqu'ils répondaient correctement, les pigeons recevaient une sessions). La reproductibilité des résultats comportementaux a été vérifiée en comparant les
récompense alimentaire pendant 2 s. En cas de réponse incorrecte, les pigeons étaient punis en performances de toutes les sessions testées. Les tests post hoc ont été corrigés par Bonferroni.
éteignant les lumières de la maison pendant 2 s. À la fin de chaque essai, un intervalle interessais Alpha a été fixé à 0,05 pour toutes les analyses. Toutes les analyses statistiques ont été réalisées
de 2 s a été utilisé avant le début de l'essai suivant avec la présentation du stimulus d'initialisation avec le logiciel IBM SPSS Statistics (v. 20).
orange et une tonalité. Les pigeons étaient
Résumé du rapport. De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des 24. Galvan, A., Caiola, MJ & Albaugh, DL Progrès dans les méthodes optogénétiques et
rapports de recherche sur la nature lié à cet article. chimiogénétiques pour étudier les circuits cérébraux chez les primates non humains. J
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Disponibilité des données Les
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données qui appuient les conclusions de cette étude sont incluses dans l'article et ses informations supplémentaires
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ou disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande.
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Les données sources des principales figures du texte sont disponibles dans les données supplémentaires 1.
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codes ont été écrits dans Matlab à l'aide de Biopsychology Toolbox (disponible sur http://
biopsytoolbox.sourceforge.net/ ). Les codes personnalisés seront disponibles sur demande. 28. Clark, KL, Armstrong, KM & Moore, T. Sonder les circuits neuronaux et fonctionner avec la
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mandarin. J. Comp. Neurol. 468, 452–465 (2004). 316803389 — SFB 1280, projets A01 (OG et RP) et A07 (SH), ainsi que numéro de projet 122679504
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(Columba livia). J. Comp. Neurol. 140, 35–51 (1970). leur aide dans les études pilotes sur la transfection virale.
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Transduction neuronale rétrograde efficace utilisant AAV1 autocomplémentaire.
ont conçu et analysé les expériences. NR a effectué des injections virales, des implantations de canules
Mol. Là. 16, 296–301 (2008).
et des perfusions. NR, JMT et SI ont réalisé l'histologie et l'analyse microscopique. NR et RP ont effectué
56. Château, MJ, Gershenson, ZT, Giles, AR, Holzbaur, ELF & Wolfe, JH
les enregistrements électrophysiologiques. NR, JMT et SI ont effectué une formation et des tests
Les sérotypes de virus adénoassociés 1, 8 et 9 partagent des mécanismes conservés
comportementaux. NR et JMT ont programmé le paradigme comportemental et les codes d'analyse. OM
pour le transport axonal antérograde et rétrograde. Hum. Gène Ther. 25, 705–720 (2014).
et SH ont fourni des conseils et un soutien technique initial ainsi que du matériel. OG et RP ont acquis
57. Hodos, W. Déficits de discrimination des couleurs après lésions du noyau rotundus chez les
le financement. NR a rédigé le brouillon original de l'article. RP a édité le papier. Tous les auteurs ont
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examiné l'article.
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60. Gutnisky, DA & Dragoi, V. Codage adaptatif des informations visuelles dans les neurones
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Libre accès Cet article est sous licence Creative Commons Attribution 4.0 International, qui
Projections intralencéphaliques de la crête ventriculaire dorsale visuelle aviaire :
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quel support ou format, à condition que vous accordiez le crédit approprié à l'auteur ou aux auteurs originaux et
Neurol. https://doi.org/10.1002/cne.24757 (2019).
à la source, fournissez un lien vers la licence Creative Commons et indiquez si des modifications ont été
68. Wang, Y., BrzozowskaPrechtl, A. & Karten, HJ Laminaire et colonnaire
apportées. Les images ou tout autre matériel tiers dans cet article sont inclus dans la licence Creative Commons
cortex auditif dans le cerveau aviaire. Proc. Natl Acad. Sci. ÉtatsUnis 107, 12676–12681
de l'article, sauf indication contraire dans une ligne de crédit au matériel. Si le matériel n'est pas inclus dans la
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70. Rook, N., Letzner, S., Packheiser, J., Güntürkün, O. & Beste, C. Empreintes génétiques d'auteur. Pour voir une copie de cette licence, visitez http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ .
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source Matlabtoolbox pour le contrôle des expériences comportementales. J. Neurosci.
© Le(s) auteur(s) 2021
Méthodes 175, 104–107 (2008).

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AAV1 AAV5 AAV9 AAV1 AAV5 AAV9

ef g AAV1hSyn AAV5hSyn AAV9hSyn

h AAV1CAG je AAV5CAG j AAV9CAG

ChR2 ChR2 ChR2

TrO ChR2 ChR2

HA MSt généraliste LSt

m 12 AAV9CAG ChR2 n AAV9CAG o AAV9CAG AAV9CAG

un(ii) 1 milliseconde 10 millisecondes 100 millisecondes 200 millisecondes 500 millisecondes

200 µm 200 µm 50 µm

200 µm 200 µm 50 µm

Initialisation Présentation de la stimulation Décision

Stimulation dans 50 % des essais SC 1 SC 2 SC 3 SC 4 SC 5

SC1 SC2 SC3 SC4 SC5

Tous les 57,86 ± 0,77 63,15 ± 0,73 69,57 ± 0,81 73,88 ± 1,45 79,97 ± 1,22

Stimulation 40 Hz Pas 58,23 ± 1,57 64,04 ± 1,71 71,19 ± 1,20 76,06 ± 2,61 81,57 ± 1,35

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AAV1 AAV5 AAV9 AAV1 AAV5 AAV9

ef g AAV1­hSyn AAV5­hSyn AAV9­hSyn

h AAV1­CAG je AAV5­CAG j AAV9­CAG

ChR2 ChR2 ChR2

TrO ChR2 ChR2

HA MSt généraliste LSt

m 12 AAV9­CAG ChR2 n AAV9­CAG o AAV9­CAG AAV9­CAG

un(ii) 1 milliseconde 10 millisecondes 100 millisecondes 200 millisecondes 500 millisecondes

200 µm 200 µm 50 µm

200 µm 200 µm 50 µm

Initialisation Présentation de la stimulation Décision

Stimulation dans 50 % des essais SC 1 SC 2 SC 3 SC 4 SC 5

SC1 SC2 SC3 SC4 SC5

Tous les 57,86 ± 0,77 63,15 ± 0,73 69,57 ± 0,81 73,88 ± 1,45 79,97 ± 1,22

Stimulation 40 Hz Pas 58,23 ± 1,57 64,04 ± 1,71 71,19 ± 1,20 76,06 ± 2,61 81,57 ± 1,35

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