License SV – B2IP

Biochimie des Macromolécules Biologiques (BIM)

Spectrométrie de masse

Nathalie Demont-Caulet
Université de Paris 7 – Denis Didert
UMR ECOSYS- INRA Versailles
Nathalie.Demont-Caulet@inrae.fr
particule d épissage: complexe dynamique de particules ribonucléoprotéiques

Séparation sur gel

électrophorèse 2D
Cellules humaines Purification des
HeLa protéines de
Spliceosome

Identification des protéines

par spectrométrie de masse
et interrogation banques de
données de séquence
Apport de la spectrométrie à la
biologie structurale

Etude du protéome

Etude structurale des protéines

* Contrôle de la séquence, de la pureté,
* Détermination de la séquence C-terminale,
* Localisation de ponts disulfures
* Identification et localisation de modification
post-traductionnelles,
* Suivi du repliement,
* Suivi de l activité enzymatique,
* Interaction protéine/ligand,
* Interaction ADN/protéine,
* Cartographie d épitope.
 Spectromètre de masse (MS): Principe

Source d ions Détecteur

ESI / MALDI

Analyse du
Analyseur
signal
Trappe Ionique / Quadripôle
Temps de vol (TOF)
FT-ICR

S A D/PC

Ce qui est mesuré : rapport m/z (Thomson 1856-1940)

 Un spectromètre de masse mesure la masse
de molécules isolées

Pour cela, le spectromètre de masse doit assurer les

opérations suivantes:

1- Volatiliser
Séparer les molécules les unes des autres: on passe de l état de
matière condensée à un état gazeux.
2- Ioniser
Transformer les molécules en ions, car un spectromètre de
masse fonctionne grâce à des champs électriques
3- Mesurer les rapports m/z
La masse moléculaire est calculée à partir du rapport masse
(m)/nb de charges (z)
 Les Sources d Ionisation les plus utilisées

Ionisation à Impact électronique (IE)

Petites molécules volatiles DURES
Ionisation Chimique (IC) et thermostables

Ionisation par bombardement d ions ou d atomes rapides molécules < 6000 Da

(LSIMS ou FAB)
ASSEZ DOUCES

Ionisation par électronébullisation

(électrospray ES ou ESI) Biomolécules (1 300 kDa) et
complexes non-covalents,
Désorption/Ionisation Laser protéomique
assistée par Matrice (MALDI) DOUCES
 Un spectromètre de masse est donc constitué de deux
parties caractéristiques :

1- La source d’ion : pour volatiliser et ioniser

Ces opérations peuvent se faire simultanément ou successivement
selon le type de source d’ions. Leur mécanisme intime est souvent mal
connu.

2- L’analyseur: pour séparer/mesurer m/z

Il mesure les valeurs du rapport: masse / nb de charge (appelé m/z)
C’est une partie de l’appareil où règne un vide suffisant pour que les
ions puissent se déplacer sans être détruits ou déviés par des
molécules résiduelles (libre parcours moyen des ions)

Implique des champs électrostatiques très précis pour guider

et déplacer les ions dans l'appareil
 Approches MS et MS/MS (MS2)

Mode MS (mesure de masse) Mode MS : masse m3

cartographie peptidique
MALDI-TOF MS

Mode MS/MS (fragmentation) Mode MS/MS : séquence S3

séquence peptidique
nanoESI Q-TOF, QqQ, trappe ionique, FTICR
MALDI TOF/TOF
Couplage LC

Deux modes de recherche hiérarchisés:

cartographie peptidique/séquençage
 La spectrométrie de masse à plusieurs dimensions:
il y a plusieurs analyseurs qui se suivent

Les analyseurs peuvent être couplés et agir de façon séquentielle.

On parle alors de spectrométrie de masse à plusieurs dimensions.

Un premier analyseur sélectionne les ions avec un certain m/z

On « purifie » donc un ion présent dans un mélange d ion qui peut
être très complexe.

L ion « purifié » est alors fragmenté dans une chambre de collision.

Un deuxième analyseur mesure alors les m/z des fragments.

C est de la MS-MS (spectrométrie de masse en tandem)
Si on répète l opération, on fait de la MS-MS-MS ou MS3
Certain appareils permettent de faire de la MS10
La MS-MS est un puissant outil de détermination de structure
 Mode MS (mesure de masse)

1- Sources d ions
ESI / MALDI

2- Analyseurs
Trappe Ionique / Quadripôle
Temps de vol (TOF)
FT-ICR
(Fourier transform-ion cyclotron resonance MS)
 Structure d une source d ionisation Electrospray (ES)

è Une source d ionisation par ES est composée :

- d un capillaire dans lequel est injecté l échantillon à analyser en solution
- d un ensemble de lentilles électrostatiques permettant de transférer les ions de la
zone à pression atmosphérique vers la zone dans laquelle règne un vide poussé

è L ionisation ES est un processus qui a lieu :

- à température ambiante
- à pression atmosphérique (ambiante)
- sous l action d un champ électrique

è L ionisation ES génère des ions multichargés

cap. métal (75 µm) ++

+
++
+
+ +
+ TOF D
3 à 5 µl/min ++
+ + +

DV = 3000V

Electrospray: Zone de Zone de Analyse des produits

Formation de gouttelettes chargées désolvatation focalisation en fonction de leur rapport m/z
contenant la protéine des ions
 Principe de l Electrospray (ESI)

Echantillon en solution
pression atmosphérique

Désolvatation/ionisation
sous l effet de:
* Champs électrique intense Formation d ions
* Explosions Coulombiennes multichargés
* Flux d azote
 Exemple de spectre ESI d une
protéine : la calmoduline
Abondance relative

m/z
 Principe de la
Données déconvolution
«brutes»
m2
Deux pics successifs
m1 sont séparés par
une seule charge

MH+ = 16704.0
Données
«transformées»

(Théorique: 929.0
16706.39)

983.6
Distribution état de charge sur la calmoduline
15+
De 9 à 18 H+
14+
16+

13+

9+
12+

m/z
 Quadripôle

4 barreaux portés 2 à 2 à un
potentiel électrique de même
valeur et de signe opposé:

U + V cos(wt)
-U - V cos (wt)
Composante
Composante
continue
alternative

La trajectoire des ions

est décrite par les
équations de Mathieu.
Schéma d un spectromètre de masse de type trappe ionique

Source Trappe Dynode de

électrospray Multipôles ionique conversion
ESI
Skimmer

760 Torr 1.3 Torr 2.10-3 Torr 2.10-5 Torr

 Trappe ionique
Injection des ions

Calotte
d entrée

Electrode
970602
77001-1383

z0 annulaire
r0

Calotte de Trajectoire d un ion

Ejection des ions sortie « piégé » dans la trappe

Les ions sont piégés dans un champ multipolaire à 3 dimensions.

Ejection des ions de m/z croissant par augmentation de
l amplitude du champ de radiofréquence appliquée.
 Echantillon + Matrice Principe du MALDI
Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation

1 mm

acide a-Cyano-4-hydroxy
Cinnamique (goutte séchée)
Formation d ions monochargés (MH+)
Matrices
Les plus
courantes
Analyseur « temps de vol »
(TOF – Time of Flight)
Mode réflectron

Refocalisation des ions

de même m/z

Miroir électrostatique
Comparaison mode linéaire /réflectron
Substance P
1348.71
Mode linéaire
Résolution 600

1347.67 Mise en évidence

Mode réflectron Du profil isotopique ou
Résolution 3400 « massif moléculaire »
 Pic moléculaire et masse moléculaire : définition

La molécule a été ionisée grâce à la perte ou au gain d une charge électrique.

La masse moléculaire est déduite de la valeur m/z du pic moléculaire

dans le spectre. Celui-ci correspond à un ion qui contient TOUS les
atomes de la molécule étudiée, sans qu il y ait eu rupture d une
liaison.

La masse moléculaire correspond donc à la composition élémentaire

(formule brute) de l ion moléculaire.

L existence d isotopes se traduit par la présence de plusieurs pics

moléculaires. On observe, non pas UN pic moléculaire, mais UN
GROUPE de pics moléculaires (un «massif moléculaire» ou «massif
isotopique»)
La présence d isotopes complique donc la définition et la mesure du
«pic moléculaire».
 Masse Monoisotopique / Masse moyenne

Masse monoisotopique : masse exacte de l espèce contenant

uniquement les isotopes les plus abondants (C12, H1, O16….):
masse du premier pic du profil isotopique

Masse moyenne (ou masse chimique) : masse calculée en

utilisant les masses atomiques moyennes des éléments
individuels: c est le barycentre (centroïde) des masses des pics
constituant le profil isotopique

mc = S mia i avec i de 1 à n (nombre d isotope)

mi masse exact de l isotope i,
ai abondance naturelle de l isotope i.
 Massifs isotopiques
* Isotopes = atomes d un même élément qui contiennent un nombre
identique de protons mais un nombre différent de neutrons
* Abondance isotopique = pourcentage des isotopes d’un élément dans la
nature
* Masse moyenne pondérée (MM) = Masse atomique apparaissant sur le
tableau périodique et qui tient compte des isotopes et de leur abondance

Exemple : nbre de nbre de

protons : nucléons :
nbre nbre de nbre masse abondance
atomique masse neutrons isotopique en %
Chlore-35 17 35 35-17 = 18 34,97 75,8%
Chlore-37 17 37 37-17 = 20 36,97 24,2%

Masse moyenne pondérée du chlore = (0,758 * 34,97 uma) + (0,242 * 36,97 uma)
= 35,454 uma
 Principaux isotopes en chimie organique

Elément isotope % Masse isotope % Masse isotope % Masse Masse

isotopique isotopique isotopique moyenne

C 12C 100 12.0000 13C 1.1 13.0033 12.011

H 1
H 100 1.0078 2
H 0.015 2.0140 1.0079

N 14
N 100 14.0031 15
N 0.37 15.0001 14.0067

O 16
O 100 15.9949 17
O 0.04 16.9991 18
O 0.20 17.9992 15.9994

S 32S 100 31.9721 33S 0.789 32.9715 34S 4.44 33.9679 32.066

F
19
F 100 18.9984

37
Cl 31.98 36.9659 35.453
Cl 35
Cl 100 34.9688
Allure du massif isotopique de molécules contenant un nombre croissant d’atomes de
carbone.

Si le nombre de C augmente, la probabilité de trouver plusieurs 13C dans une même

molécule augmente ® le nombre de satellites isotopiques augmente

Rapport Rapport Rapport Rapport

M / M+1 pour M / M+1 pour M / M+1 pour M / M+1 pour
C 50 H 102 C 100 H 202 C 500 H 1002 C 1000 H 2002
( MM = 703,3 ) ( MM = 1404,7 ) ( MM = 7015,4 ) ( MM = 14 028,8 )

100

90
80

70

abondance
abondance

abondance

abondance
60

50

40

30

20
10

0 0 0 0
702 703 704 705 706 707 1402 1405 1408 1411 7008 7015 7022 7029 14017 14028 14039

m/z m/z m/z m/z

Ø Molécule à 50 C : à côté du M+1, apparition de satellites M+2, M+3,… non

négligeables
ØMolécule à 1000 C : la valeur de masse moyenne (MM) s’éloigne de celle de M –
Distribution gaussienne des satellites - Le plus abondant a une masse proche de
la masse moyenne
Exemples de massifs isotopiques de peptides
 Paramètres d un analyseur

Résolution: plus petit écart

de masse DM pouvant être DM
mesuré à une masse M (M/DM)

Gamme de masse: rapport m/z

maximum pouvant être transmis
par l analyseur, de la source
au détecteur. m/z
M M+DM
Sensibilité: proportion des ions issus de la source
effectivement transmis par l analyseur au détecteur.
 Exemples de spectres MALDI-TOF

Mélange de protéines
Peptides issus d une digestion
(500-20 000Da)
par la trypsine de
l hémoglobine humaine
(500-3000Da)
 Approches MS et MS/MS (MS2)

Mode MS (mesure de masse) Mode MS : masse m3

• Identification de protéines à partir des
masses des peptides
cartographie peptidique
MALDI-TOF MS Mode MS/MS : séquence S3

Mode MS/MS (fragmentation)

• Identification par homologie de séquence
séquence peptidique
nanoESI Q-TOF, QqQ, trappe ionique, FTICR
MALDI TOF/TOF
Couplage LC

Deux modes de recherche hiérarchisés:

cartographie peptidique/séquençage
 Protéomique
Quelle(s) est (sont)
la (les) protéine(s)
dans ce spot?

1- Lavage
2- Digestion Analyse
par SM
3- Extraction (MALDI-TOF
LC-MS/MS)

1- Hsp70
2- Kératine...
3- Trypsine...

Traitement informatique des données

 Principe de l’électrophorèse 2-D

1. Première dimension:
isoélectrofocalisation (IEF)
séparation en fonction du pI

2. Seconde dimension:
PAGE SDS
séparation selon le poids
moléculaire apparent

L’ électrophorèse 2D permet de séparer plusieurs

centaines de protéines.
 Exemple du protéome de mitochondrie
Digestion trypsine
« in-gel »
MALDI-TOF

Liste de masse
804.287 1344.72 1623.72 2047.11
833.387 1389.71 1684.9 2145.08
2D-PAGE protéines de matrice 855.465
912.573
1411.86
1427.67
1698.9
1771.82
2194.05
2295.1
mitochondriale (500µg) 941.609 1444.81 1876.51 2385.26
961.487 1572.89 1919.08 2560.17
1215.66 1593.89 1938.93
 Principe de la cartographie peptidique ou l empreinte peptidique
(Peptide Mass FingerPrint)

K R R K R
H2N COOH
K
R
R
K
R
COOH
m1 m2 m3 m4 m5 m6

Analyse des peptides par MS (Maldi-Tof)

Liste des masses expérimentales des peptides de la protéine:

M1, m2, m3, m4, m5 et m6
RECHERCHE DANS LES BANQUES DE DONNEES

Données :
- masse des peptides
- enzyme utilisée
- tolérance de masse = +/- 0.1 Da
- modifications de la protéine : réduction/alkylation

Comparaison masses expérimentales / masses théoriques calculées à

partir des séquences connues (banques) digérées par l enzyme utilisée

Résultats:
- Identification de la ou des protéines
- Nombre de peptides identifiés pour chacune des protéines
- Mise en évidence de modifications post-traductionnelles
 Interrogation banque de données
Exemple ProFound
(http://65.219.84.5/service/prowl/profound/profound_E_adv.html)

Banque Enzyme
utilisée
Espèce

Gamme Traitement
masse chimique
et pI

liste de
masse

Résolution
HSP 60
 Impact des données fournies
1- Précision de la mesure et de la tolérance en masse

Exemple peptide VGAHAGEYGAEALER

MH+ = 1529.7348 (monoisotopique)

m/z Tolérance Peptides

de masse (Da) correspondants
1529 1 478
1529.7 0.1 164
1529.73 0.01 25
1529.734 0.001 4
1529.7348 0.0001 2

Recherche dans Swiss-Prot (protéines humaines et murines)

 Impact des données fournies

2- Importance du nombre de peptides

m/z Tolérance Protéines

de masse (Da) identifiées
1529.73 0.1 204
1529.73 0.1 7
1252.70
1529.73
1252.70 0.1 1
1833.88

Problèmes: * un spot 2D peut contenir plus d une protéine,

* présence de contaminant (kératine, trypsine...),
* modifications post-traductionnelles.
 APPROCHES MS ET MS/MS

Protéine
Séparation, digestion

Mélange de peptides
MS (MALDI)
MS1
Carte peptidique

Identification Indétermination
MS2
MS/MS (nanoESI)
Séquence de peptide(s)

Identification
 Approches MS et MS/MS (MS2)

Mode MS (mesure de masse) Mode MS : masse m3

• Identification de protéines à partir des
masses des peptides
cartographie peptidique
MALDI-TOF MS Mode MS/MS : séquence S3

Mode MS/MS (fragmentation)

• Identification par homologie de séquence
séquence peptidique
nanoESI Q-TOF, QqQ, trappe ionique, FTICR
MALDI TOF/TOF
Couplage LC

Deux modes de recherche hiérarchisés:

cartographie peptidique/séquençage
 Principe du séquençage de peptide par MS2

q2 : Cellule de collision
Règles de fragmentations des peptides

La fragmentation se fait au niveau

de la liaison peptidique

Majoritairement des ions y et b

Ions y : charge localisée en C-terminal

Ions b : charge localisée en N-terminal
 Règles de
fragmentation
des peptides
 Nomenclature de Schéma d un tétrapeptide
fragmentation et
informations de séquences

Rés. 2 Rés. 3

- 17 (NH3)

- 28 (C=O)

b1 R1 O +
y1 H+
R4
O
H2 N C C Rés. 2 Rés 3 H2 N C C
H H OH

Mrés. Nter + 1 Mrés. Cter + 19

Roepstorff et Fohlman (1981)
Acides aminés Masse Masse
Monoisotopique Moyenne

Glycine G 57.02147 57.052

Alanine A 71.03712 71.079
Sérine S 87.032.03 87.078
Proline P 97.05277 97.117
Valine V 99.06842 99.133
Thréonine T 101.04768 101.105
Cystéine C 103.00919 103.144
Isoleucine I 113.08407 113.160
Leucine L 113.08407 113.160
Aspargine N 114.04293 114.104
Aspartate D 115.02695 115.089
Glutamine Q 128.05858 128131
Lysine K 128.09497 128.174
Glutamate E 129.04260 129.116
Méthionine M 131.04049 131.198
Histidine H 137.05891 137.142
Phénylalanine F 147.06842 147.177
Arginine R 156.10112 156.188
Tyrosine Y 163.06333 163.17
Tryptophane W 186.07932 186.213
 APPROCHES MS ET MS/MS: Conclusion

Protéine
Séparation, digestion

Mélange de peptides
MS (MALDI)
MS1
Carte peptidique

Identification Indétermination
MS2
MS/MS (nanoESI)
Séquence de peptide(s)

Identification
Apport de la spectrométrie à la
biologie structurale
Etude structurale des protéines
* Contrôle de la séquence, de la pureté,
* Détermination de la séquence C-terminale,
* Localisation de ponts disulfures
* Identification et localisation de modification
post-traductionnelles,
* Suivi du repliement,
* Suivi de l activité enzymatique,
* Interaction protéine/ligand,
* Interaction ADN/protéine,
* Cartographie d épitope.

Etude du protéome
 Identification et localisation de
mutations ponctuelles
Hémoglobine humaine Hémoglobine humaine
native mutée

Après déconvolution: Après déconvolution:

Chaîne a = 15 126.3 Chaîne a = 15 126.3

Chaîne b = 15 867.5 Chaîne b = 15 864.5

DM = - 3 Da
 Analyse en MALDI-TOF de la l hémoglobine mutante
après digestion par la trypsine

K
Digestion MALDI-TOF
R
R
trypsine X
K
Carte peptidique
Hémoglobine Mélange peptides
(MPF)

* * Ions ne correspondant pas à

la masse d un peptide
d hémoglobine native

*
Analyse MS-MS du peptide à m/z = 921.55

Mutation
d un E en V

T P V E K
101.05 97.05 99.07 129.04 128.01

Mutation E6V (129.04//99.06) DM = - 30 Da

Analyse MS-MS du peptide a m/z = 1404.81

E6V DM =-30 Da
E121R DM= +27 Da

DM= - 3 Da

Correspond bien
à la différence de
masse observée en
protéine entière

Mutation E121R (129.04//156.10) DM = + 27 Da