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Propriétés physiques des globules rouges en agrégation
François Yaya
Pour citer cette version :
François Yaya. Propriétés physiques des globules rouges en agrégation. Hématologie. Université Grenoble Alpes [2020..] ;
Universität des Saarlandes, 2021. Anglais. ffNNT : 2021GRALY001ff. fftel03281595ff
Identifiant HAL : tel03281595
https://theses.hal.science/tel03281595
Soumis le 8 juil. 2021
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ou à l'étranger, ou de centres de recherche publics ou privés. ou privés.
CELLESCI
Pour obtenir le grade de
DOCTEUR DE L'UNIVERSITE GRENOBLE ALPES
préparé dans le cadre d'une cotutelle entre la
Communauté Université Grenoble Alpes et
l'Université des Saarlandes
Spécialité : Physique Appliquée
Arrêté ministériel : le 6 janvier 2005 – 25 mai 2016
Présentée par
« François YAYA »
Thèse dirigée par « M. Thomas PODGORSKI » et « M. Christian
WAGNER »
préparé au sein du Laboratoire Interdisciplinaire de Physique,
Grenoble et de l'Experimentalphysik, Sarrebruck
dans les Écoles Doctorales de l'université Grenoble Alpes et de
Dekanat der Universität des Saarlandes
Propriétés physiques des
globules rouges en agrégation
Thèse soutenue publiquement le « 4 janvier 2021 »,
devant le jury composé de :
Mme Gladys MASSIERA
Professeur des universités, Montpellier, Présidente et
rapporteur M. Philippe CONNES Professeur des universités,
Lyon, Rapporteur M. Clément DE LOUBENS Chargé de
recherche HDR, Grenoble, Examinateur M. Jochen HUB
Professeur, Sarrebruck, Examinateur M. Rolf PELSTER
Professeur , Sarrebruck, Examinateur M. Herbert WOLF
Docteur en sciences, Sarrebruck, Examinateur
Diese Arbeit wurde von der DeutschFranzösischen Hochschule (DFH)
et CNES (Centre National d'Études Spatiales) finanziell gefördert.
Cette thèse a été subventionnée par l'Université francoallemande (UFA)
et le CNES (Centre National d'Etudes Spatiales)
Eidesstattliche Versicherung
Hiermit versichere ich an Eides statt, dass ich die vorliegende Arbeit
selbstständig und ohne Benutzung anderer als der angegebenen Hilfsmittel
angefertigt habe. Die aus anderen Quellen oder indirekt übernommenen
Daten und Konzepte sind unter Angabe der Quelle gekennzeichnet. Die
Arbeit wurde bisher weder im Innoch im Ausland in gleicher oder ähnlicher
Form in einem Verfahren zur Erlangung eines akademischen Grades
vorgelegt.
Sarrebruck, 21.09.2020
___________________
François YAYA
Abstrait
Propriétés physiques des globules rouges en agrégation
par François YAYA
Les globules rouges (RBC) sont des objets biologiques de la taille d'un micron et le principal
constituant corpusculaire du sang. Il s'écoule des grandes artères vers de très petits capillaires.
Utilisant une approche physique, ce travail vise à évaluer les propriétés qui régissent les flux
sanguins et en particulier les mécanismes de désagrégation et d'agrégation des globules rouges
au niveau d'une seule cellule. Les interactions des globules rouges sont ainsi étudiées
expérimentalement en mesurant les forces d'adhérence dans la gamme pN dans différentes
solutions modèles grâce à des pinces optiques. Bien que deux modèles d'agrégation aient été
proposés : le pontage et l'épuisement, les preuves expérimentales manquent encore pour décider quel mécanism
La recherche présentée ici apporte un nouvel éclairage sur l'agrégation des globules rouges et
montre que les deux modèles ne sont peutêtre pas exclusifs. Un diagramme de phase
tridimensionnel complet des doublets a été établi et confirmé expérimentalement en faisant varier
les forces d'adhésion et les volumes cellulaires réduits. Par ailleurs, l'effet de l'agrégation a été
étudié in vitro dans un réseau microcapillaire bifurquant et la distribution des agrégats et leur
stabilité dans une telle géométrie sont rapportées. Enfin, des expériences d'écoulement ont
permis de caractériser le champ d'écoulement autour des globules rouges à différentes vitesses.
Des structures fluides tourbillonnaires intéressantes ont également été observées grâce à des
nanoparticules traceurs.
vi
Les globules rouges (GR) sont des objets biologiques de la taille du micron et l'un
des principaux constituants du sang. Ils circulent des grandes artères aux très petits
capillaires. En utilisant une approche physique, ce travail vise à évaluer les propriétés
qui régissent les écoulements sanguins et en particulier les mécanismes de
désagrégation et d'agrégation des globules rouges au niveau cellulaire. Les interactions
des globules rouges sont ainsi étudiées expérimentalement en précisant les forces
d'adhésion qui sont seulement de quelques piconewtons et ce, dans dif férentes
solutions modèles grâce aux pinces optiques. Malgré les deux modèles d'agrégation
existants : le pontage et la déplétion, les preuves expérimentales font défaut. La
recherche présentée ici apporte un nouvel éclairage sur l'agrégation des GR et montre
que les deux modèles ne sont peutêtre pas mutuellement exclusifs.
Un diagramme de phase tridimensionnel complet des doublets a été établi et confirmé
par des expériences en faisant varier les forces adhésives et en utilisant les volumes
réduits des globules rouges. En outre, l'effet de l'agrégation a été examiné in vitro dans
un réseau microcapillaire en bifurcation et la distribution des agrégats dans un tel
modèle a été rapportée. Enfin, des expériences en écoulement ont permis de
caractériser le champ d'écoulement autour de chaque globule rouge à différentes
vitesses. Des structures de fluides en forme de vortex intéressantes ont également été
révélées grâce à des traceurs (nanoparticules).
Rote Blutkörperchen (Erythrozyten) sind biologische Objekte im Mikrometer bereich
und der korpuskuläre Hauptbestandteil des Blutes. Es fließt aus größeren Arterien in
sehr kleine Kapillaren. Unter Verwendung eines physikalischen Ansatzes zielt diese
Arbeit darauf ab, die Eigenschaften zu bewerten, die den Blutfluss und insbesondere
die Disaggregations und Aggregationsmechanismen der RBC auf Ein zelzellebene
regeln. Die Interaktionen der Erythrozyten werden daher experimentell untersucht,
indem Adhäsionskräfte im pNBereich in verschiedenen Modelllösun gen mit Hilfe einer
optischen Pinzette gemessen werden. Während mit Bridging und Depletion zwei Modelle
für die Aggregation vorgeschlagen wurden, fehlen noch experimentelle Beweise, um zu
entscheiden, welcher Mechanismus vorherrscht.
Die hier vorgestellte Forschung liefert neue Erkenntnisse über die Aggregation von
RBCs und zeigt, dass die beiden Modelle möglicherweise nicht exklusiv sind. Es wurde
ein vollständiges dreidimensionales Phasendiagramm von Dubletten erstellt und
experimentell durch Variation der Adhäsionskräfte und reduzierte Zellvolu mina
bestätigt. Außerdem wurde der Effekt der Aggregation in vitro in einem sich
gabelförmigen Mikrokapillarnetz untersucht, und es wird über die Verteilung der
Aggregate und ihre Stabilität in einer solchen Geometrie berichtet. Schließlich
vii
erlaubten Strömungsexperimente die Charakterisierung des Strömungsfeldes um
einzelne RBCs bei unterschiedlichen Geschwindigkeiten. Dank TracerNanopartikeln
konnten auch interessante wirbelartige Fluidstrukturen beobachtet werden.
ix
Remerciements
Tout d'abord, je tiens à remercier mes deux encadrants Prof Dr Christian Wagner et Dr
Thomas Podgorski pour leur soutien durant cette thèse en cotutelle et me laissant une totale
liberté pour faire des recherches sur des sujets qui m'intéressent. J'ai commencé à travailler
avec des pincettes optiques et des globules rouges pendant mon mémoire de maîtrise et
mon travail aurait été plus difficile sans l'aide précieuse du Dr Kisung Lee. La même
personne qui m'a présenté au professeur Alexander Priezzhev de l'Université d'État de
Moscou. Je n'oublierai jamais son soutien et son attitude positive envers notre recherche. Il
en va de même pour ses étudiants et collègues avec qui j'ai également aimé collaborer :
Alexey Semenov, Petr Ermolinsky, Evgeny Shirshin et Andrei Lu govtsov. En parlant de
collaborations, je voudrais remercier les groupes de recherche de Jülich : Dimitry Fedosov,
Masoud Hoore, Pavlik Lettinga, Olivera Korculanin et Mehrnaz Babaki mais aussi les
collègues de Bayreuth : Stephan Gekle, Achim Guckenberger et Johannes Roemer pour les
discussions fructueuses. Même si ce travail est nouveau mais prometteur pour moi, je
remercie également Laura Casanellas et Laura Casas Ferrer de Montpellier pour leur accueil
chaleureux et les échanges intéressants lors de mon séjour.
Merci beaucoup à Elke Huschens pour avoir simplifié les tâches administratives, m'a aidé à
améliorer mon allemand (ou saarländisch !) et aussi à Karin Kretsch qui a fait en sorte que
nos expériences puissent se dérouler sans rien manquer. Un grand merci à mes collègues
de laboratoire et maintenant à mes amis de laboratoire de Sarrebruck et de Grenoble pour
avoir fait de chaque jour une journée agréable : Asena Abaye, Ettore Bernardi, Zakaria
Boujja, Re vaz Chachanidze, Viviana Claveria, Alexis Darras, Bernd Eberle, Thomas
Fischer , Jorge Fiscina, Daniel Flormann, Luigi Giannelli, Rishab Handa, Sebastian Himbert,
Mehdi Inglebert, Thomas John, Lars Kaestner, Alexander Kihm, Oliver Köhn, Sylvain
Losserand, Julie MartinWortham, Javad Najafi, Mohamed Nouaman, Pankaj Pandey,
Stephan Quint, Steffen Recktenwald, Francesco Rosati, Christian Ruloff, Greta Simionato,
Emmanuel Terriac et Doriane Vesperini.
Enfin, merci à mes anciens amis de France : Emrullah, Maxime, à travers l'Europe : Alex,
Carla, Daniel, Joe, Marcus, Nico, Pete, Rafal, Rick, et bien sûr ma famille, mes parents et
ma sœur pour leur soutien malgré la distance et mon manque de temps libre pendant cette
thèse.
xii
Contenu
Remerciements ix
1. Introduction 1
1.1 Revue de la littérature . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
1.2 Composition sanguine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
1.3 Zoom sur le RBC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
1.4 Agrégation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . dix
1.4.1 Facteurs d'agrégation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
1.5 Descriptions des modèles . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
1.5.1 Pontage . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
Liaison non spécifique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
Liaison spécifique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
1.5.2 Couches d'appauvrissement . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
Interaction entre deux sphères dures . . . . . . . . . . . . . . 18
Profondeur de pénétration et interaction des GR . . . . . . . . . . . . 21
Appauvrissement induit par un polymère idéal . . . . . . . . . . . . . 23
Particules en forme de tige . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
1.6 Résumé . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
2 Matériel et méthodes 29
2.1 Manipulation du sang . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
2.1.1 De la piqûre au doigt au sang veineux . . . . . . . . . . . . . . . . 30
2.1.2 Préparation du sang . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
2.1.3 Solutions tampons . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
2.1.4 Traitement de l'effet de verre . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
2.1.5 Conservation du sang . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
2.2 Microfluidique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
2.2.1 Configuration microfluidique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
2.2.2 Préparation des puces microfluidiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
2.3 Brucelles optiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34
2.3.1 Historique et principe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34
xii
2.3.2 Holographie : le modulateur spatial de lumière . . . . . . . . . . . 36
2.3.3 Formalisme mathématique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38
2.3.4 Montage expérimental . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39
2.3.5 Étalonnage . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
Étalonnage Stokes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
Bruit thermique pour les mesures de rigidité . . . . . . . . . . . . 41
Étalonnage billescellules . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
2.3.6 Procédure de mesure . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
Agrégation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
Désagrégation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
2.3.7 Effet des pièges laser sur l'hémoglobine . . . . . . . . . . . . . . . 46
2.4 Analyse d'images . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48
2.5 Résumé . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48
3 Adsorption de macromolécules revisitée 3.1 49
. . . . . . . . .
Quantification au niveau d'une seule cellule de dextran sur RBC . . . 49
3.1.1 Évolution dans le temps de l'adsorption du dextrane sur RBC . . . . . . . . . . 52
3.1.2 Quantification du nombre de molécules adsorbées . . . . . 55
3.2 Mécanismes d'adsorption . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58
3.3 Résumé . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60
4 Étudier les 2 modèles d'agrégation : pontage et épuisement 63
4.1 Matériel et méthodes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63
4.2 Analyse assistée par ordinateur des données expérimentales . . . . . . . . . . . . 64
4.2.1 Segmentation et suivi des contours . . . . . . . . . . . . . . . . . 64
4.2.2 Force et énergie d'interaction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66
4.3 Forces de (dés)agrégation dans le dextrane . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68
4.4 Forces de (dés)agrégation dans le virus Fd . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69
4.5 Débat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71
4.6 Analyse de traces dans des solutions modèles : dextran et virus Fd . . . . . . . 72
4.7 Influence du temps d'interaction sur la désagrégation . . . . . . . . . . . . . 76
4.7.1 Influence du temps d'interaction sur la désagrégation avec le dextran . 76
4.8 Mécanismes possibles . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77
4.9 Résumé . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79
5 Effet de l'élasticité du réseau de spectrine sur les formes des doublets 83
. . . . . . . . . . . . . . . . . . .
érythrocytaires 5.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . 83
5.2 Modèle d'adhérence . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84
xiii
5.3 Méthodes expérimentales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86

5.4 Résultats sur les formes de doublets . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87
5.4.1 Influence de la forme sans contrainte . . . . . . . . . . . . . . . . . 96
5.4.2 Comparaison avec des expériences . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100
Formes de doublet . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100
Formation de rouleaux . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 101
5.5 Conclusion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103
6 Flux tourbillonnaires induits par les globules 105
rouges 6.1 Introduction .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 105
6.2 Méthodes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 106
6.2.1 Expériences . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 106
6.2.2 Simulation 3D . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 108
6.3 Résultats . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 110
6.3.1 Champ d'écoulement au voisinage d'un seul RBC . . . . . . . . . . . . 110
6.3.2 Champ d'écoulement au voisinage d'un cluster de deux hématies . . . . . . . 112
6.3.3 Voies d'échappement des particules autour des globules rouges . . . . . . . . . . . . . 115
6.4 Résumé . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 118
7 Agrégation sous flux 121
7.1 Stabilité des grappes de RBC aux bifurcations . . . . . . . . . . . . . . . . . 121
7.1.1 Conception de la puce . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 122
7.1.2 Répartition des rouleaux . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 123
Répartition des rouleaux en fonction de la vitesse d'agrégat . 125
. . 7..1.3
Répartition des rouleaux dans les branches filles . . . 126 . . É.vénements
. de
rupture . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 128
7.2 Agrégation en cisaillement . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 131
7.2.1 Matériel et méthodes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 132
Chambre à circulation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 133
Seringues de pompage . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 134
Microscope holographique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 135
7.2.2 Premiers résultats préliminaires . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 135
7.3 Résumé . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 140
8 Conclusion générale et perspectives 143
Bibliographie 149
xv
Liste des figures
1.1 Schéma d'un tube sanguin après centrifugation. 3 couches sont séparées par
la densité. De haut en bas : plasma, buffy coat (plaquettes, globules blancs)
et globules rouges . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
1.2 Croquis de la membrane érythrocytaire montrant de haut en bas : le glycocalyx
principalement constitué de glucides, la bicouche phospholipidique et la
membrane (actine, spectrine,...) . . . . . . . . . . . . . . dix
1.3 Microphotographie de rouleaux vus au microscope avec un x40
objectif . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
1.4 Image AFM sur un substrat de silice du virus Fd tirée de [57] . . . . . 13
1.5 Espace intercellulaire en fonction du poids moléculaire du dextran. Graphique
tiré de [15] . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
1.6 Croquis 3D illustrant la liaison non spécifique des protéines. Ici, les ponts noirs
se lieraient sur n'importe quel site disponible. Aucune interaction particulière
entre les ponts (protéines) n'est envisagée . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
1.7 Croquis 3D illustrant la liaison spécifique des cellules. Dans cet exemple, les
ponts cyan n'interagiraient qu'avec les ponts verts et les ponts bleus avec
les noirs. Chaque pont aurait son propre type de site où il peut se lier .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
1.8 Schéma de calcul des forces de déplétion entre deux grosses sphères de
diamètre D dans une solution constituée de plusieurs petites sphères de
diamètre d. Leur distance centre à centre est h et l représente la moitié de
la largeur de la région formée par les deux sphères qui se chevauchent en
rouge . . 19 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.9 Schéma de déplétion induite par un polymère idéal entre deux plaques. Le
rayon de giration Rg est représenté en rouge et h est la distance entre les
plaques . . 23 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.10 Représentation schématique de deux disques en interaction de rayon R,
séparés par h la hauteur et d étant la distance centre à centre. . 25
1.11 Schéma représentant deux plaques séparées d'une distance h en présence
d'un appauvrissant en forme de bâtonnets de longueur L et G étant leur centre de masse . 26
xvi
2.1 Représentation tridimensionnelle de : (a) un échynocyte (cellule crénelée) (b) .
un discocyte (forme normale d'un GR) et (c) un sphérocyte . . . . . . 32
2.2 Configuration pour des expériences microfluidiques. 1 : Caméra haute vitesse, 2 :
Contrôleur de pression, 3 : Microscope inversé, 4 : Joystick pour platine
piézoélectrique XY, 5 : Porteéchantillon, 6 : Interface logicielle, 7 : Éclairage
. . . . . . . . . . . . . 33
rouge, 8 : Puce microfluidique, 9 : Sortie d'échantillon. . . . . . . . . . . . .
2.3 Photographie d'une plaquette contenant le mélange PDMS et agent de
durcissement (à gauche) et la puce microfluidique finale après l'avoir collée sur
. . . . . . . . . . . . . 34
une lame de verre avec exposition au plasma (à droite) . . . . . . .
2.4 Schéma représentant un faisceau gaussien traversant un bourrelet et les
forces optiques associées. En raison de la géométrie du faisceau, plus
d'énergie est émise au centre, ce qui donne naissance à une force nette
. . . . . . 3. 6. . . . .
vers le centre dans la direction opposée à la source. . . . . . . . .
2.5 Hologrammes de phase générés pour les pièges optiques 2 (a) et 4 (b) et
leurs images microscopiques associées de billes piégées d'un diamètre de
5 µm respectivement (c) et (d) . . . . . . . . . . . . 38 . . . . . . . . . . . .
2.6 Schéma représentant un faisceau gaussien traversant la lentille d'un objectif
à grande ouverture numérique. Le piégeage est expliqué à l'aide de l'optique
des rayons et des coefficients de Fresnel (T : transmission, R : réflexion et P :
puissance initiale). Dans cette configuration, la force nette pointe vers la source
et le piégeage a lieu. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39
2.7 Schéma simplifié de la pince optique holographique. BE : extenseur de
faisceau, SLM : modulateur spatial de lumière, L1 et L2 : lentilles, DM :
miroir dichroïque, C : caméra, O : objectif à grande ouverture numérique
x60 et S : échantillon. I1 : éclairage principal, I2 : lampe au mercure, F : filtre
. 4. . . . . . . . . . . . . .
fluorescent et M : miroir . . 0 . . . . . . . . . . . .
2.8 Mesures de rigidité utilisant le bruit thermique et basées sur la posi
tion du centroïde du cordon . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
2.9 Étalonnage de la rigidité par la méthode du bruit thermique pour un . 43
piège en fonction de la puissance du laser . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.10 (a) Schéma expérimental et (b) de l'étalonnage de la force à l'aide d'une bille de 5 µm
. raphiques
et d'un RBC soulevé à 15 µm de la lamelle couvreobjet. . . 43 2.11 G . . . . . d.e .sortie
pour l'étalonnage de la cellule de billes avec une puissance laser de 38 mW.
Les lignes pointillées (cellule) et noires continues indiquent la position du
piège pendant la procédure de mesure. La courbe rouge montre la position
du bord de la cellule et la courbe bleue le centre du cordon au fil du temps.
Les flèches représentent les signaux de synchronisation . . . . . . 44
xvii
2.12 Timelapse montrant la procédure de mesure de la force pour l'agrégation
entre deux globules rouges sélectionnés. Les points rouges représentent
. 4. . . . . . . . . . . . . .
la position des pièges optiques . . 5 . . . . . . .
2.13 Timelapse montrant la procédure de mesure de la force pour la
désagrégation entre deux globules rouges sélectionnés. Les points
. . . . . . . . 46
rouges représentent la position des pièges optiques . . . . . . . . . . . . . .
2.14 Absorption de la lumière par A : carboxyhémoglobine, B : désoxyhémoglobine
(Hb) C : oxyhémoglobine (HbO2) et D : méthémoglobine pour différentes
longueurs d'onde obtenues par spectrophotométrie de [101] . . . . . . . . 47
2.15 GR unique piégé dans du plasma autologue avec le piège laser non
diffracté. Formes possibles pouvant être observées de puissance faible
(<300 mW) à élevée (jusqu'à 500 mW) : (a) biconcave, (b) forme en
. . .hémolysées .
"poire", (c) trilobe et (d) hématies . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.16 (a) Microphotographie 47
de deux globules rouges piégés et (b) sa segmentation associée à l'aide de la
méthode d'Otsu . . . . . . . . 48 . . . . . . .
3.1 (a) Puce microfluidique utilisée pour étudier l'adsorption de macromolécules
sur les globules rouges.(1) : zone d'observation située à environ 500 µm
de la "piscine" (S1), (2) canal de résistance pour diminuer la vitesse
d'écoulement et (3) entrée où la solution tampon est injectée. (b)
Esquisse représentant un seul RBC traîné d'une solution de
. ".S2" . . . . . . . . . .
macromolécule (dans le "pool" S1) vers une solution tampon . . . . . . 51
3.2 La dépendance de l'intensité maximale de fluorescence sur le temps d'incubation :
les points noirs et rouges correspondent respectivement à 0 et 135 minutes
de préincubation des globules rouges dans du PBS. Les microphotographies
dans les ensembles illustrent les changements d'intensité de fluorescence
détectés dans le canal avec du PBS. Ici, l'intensité de fluorescence a été
normalisée à la valeur obtenue au premier point. L'intensité de l'excitation est
restée la même et a été estimée approximativement à 5 mW au niveau de l'échantillon.
Les barres d'erreur correspondent à la moyenne sur trois microcanaux
. S. ignal
indépendants utilisés dans l'expérience. . . . . . . . . . . . 53 3.3 . . . fluorescent
. .
correspondant au blanchiment . . . . . . . . . . . . . 54
3.4 Signal fluorescent correspondant à la désorption réelle des macromolécules
de dextrane . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54
3.5 Dépendance de la concentration de dextrane sur la fluorescence enregistrée
signaler . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55
3.6 Croquis décrivant la méthode utilisée pour obtenir le volume de détection en
z à l'aide d'un cordon de 2 µm de diamètre . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56
xviii
3.7 Signal fluorescent enregistré à l'aide d'une bille de 2 µm de diamètre à différents
z 57 3.8 Adsorption de fibrinogène fluorescent à une concentration de 1 mg/ml (a) et
adsorption de FITCdextran 70 kDa à une concentration de 20 mg/ml (b) . . 59
. .au
3.9 GR déposés . f.ond
. . d. . . . . . . . . . . . . . . . .en
u canal microfluidique lavés . c. ontinu
. . . .par
. .d.u après
PBS
avoir été incubés dans une solution de fibrinogène à 2 mg/ml. Le signal s'est avéré
plus intense sur des points spécifiques qui peuvent être synonymes de liaison
spécifique du fibrinogène .
. . . . . . . . 60
4.1 Deux RBC sur le point d'être désagrégées. Les quatre points en rep jaune
renvoyer les points qui sont suivis pendant tout le processus de séparation 65
4.2 Nombre de pixels pour chaque colonne d'une image segmentée de deux globules
rouges agrégés. Les quatre pics donnent directement la position x du bord de
chaque R. BC . .
. . . 6.6 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.3 Désagrégation de deux globules rouges en présence de dextran. En violet
la position du piège généré par le SLM et en bleu la position du bord de
la cellule détectée par l'algorithme de suivi. La ligne rouge ∆x représente
la distance entre les deux. Le RBC supérieur est tiré avec des pas
constants et une puissance laser . . . 67 . . . . . . . . . . . .
4.4 Forme en cloche pour la désagrégation (bleu) et l'agrégation (rouge) d'une paire de
globules rouges avec une distance de chevauchement linéaire initiale de 4,5 microns.
La ligne théorique (noire) a été calculée à l'aide de l'équation. 1,34 (N>10) . . . . . . 68
4.5 La force de (dés)agrégation FD varie linéairement en fonction de la
concentration en virus Fd. Par rapport au dextrane (70 kDa), les forces
d'agrégation et de désagrégation sont du même ordre de grandeur que
celui attendu pour un déplétant pur. La droite théorique (noire) a été
. . 7.0 . . . . . . . . .
calculée à l'aide de l'Eq. 1,45 (N>10) . . . . . . . . . . . . .
4.6 Paire de deux cellules observées par microscopie à fluorescence à molécule
unique à une concentration de 4 mg/ml de virus Fd. La LED de fluorescence
(λ = 470 nm) et la lampe halogène sont allumées pour visualiser les bâtonnets
ainsi que les globules rouges non colorés (a)(f), l'intensité de la lampe
halogène a été éteinte tout au long de (g)(i ). Avec l'aimable autorisation
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
d'Olivera Korculanin . . . . . . . . . . . . . . 71
xix
4.7 Force de traction appliquée sur le RBC en fonction de la distance (centre à
centre) dc−c entre les deux RBC. Les forces de traction sont recueillies pour
c = 50 mg/ml dextran (70 kDa) avec une vitesse de v = 0,12 µm/s (a,c) et v =
0,47µm/s taux de traction (b,d), pour zéro ( a,b) et 30 secondes de temps
d'interaction (c,d), montrant les détails de la dynamique de désagrégation.
Chaque couleur correspond à une expérience de désagrégation différente.
74
Les lignes pleines sont des courbes théoriques calculées à l'aide de l'équation. 1.34 .
4.8 Les courbes de force pour le virus Fd à (a) c = 2 mg/ml et (b) c = 4 mg/ml
montrant les détails de la dynamique de désagrégation avec une vitesse de v
= 0,12µm/s. La ligne pleine dans chaque graphique est la prédiction théorique
. . . . 75
selon le modèle d'épuisement pour les barres idéales (voir équation 1.45). .
4.9 Les trois étapes d'un tracé de traction pour un ensemble de données de dextran à un
taux de traction de 0,12 µm/s, traçant la force de piégeage en fonction de dc−c (a)
. . e.t j.aune . . . .
et du temps (b). Les stades I, II et II sont respectivement en bleu, rouge . . 75 4.10
.
Probabilité de séparation entre deux hématies à une force choisie et en
présence de Dextran à une concentration fixe de 50 mg/ml avec une vitesse
de tirage de 0,12 µm/s, 0,24 µm/s et 0,47 µm/s. La distance de
chevauchement initiale a été fixée à. . . . . . . . . . . . . .
4,5 µm . . . . . . . . . 77
4.11 Schéma 3D représentant un modèle avec des ponts transversaux en migration.
Les ponts restent dans la zone de contact lorsqu'un RBC est éloigné de l'autre.
Dans ce scénario, la densité d'énergie d'interaction augmente à mesure que la
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
surface diminue . . . . . . . . . 78
4.12 Microphotographie de deux globules rouges au cours de la progression de la
. . . . . . . . 78
désagrégation dans du Dextran 50 mg/ml et appelée attache . . . . . .
4.13 Schéma 3D représentant un modèle avec ponts transversaux non mobiles.
Le nombre de ponts diminue à mesure que la surface entre 2 hématies
diminue lors de la désagrégation . . . . . . . . . . . . 79 . . . . . .
.
5.1 Le rapport de l'énergie d'adhérence effective ˜ à l'énergie par paire. Ce
rapport dépend faiblement de la configuration des deux globules rouges
collés. Des simulations sont effectuées pour le système jusqu'à ce qu'il
atteigne l'équilibre. Les données rapportées sont moyennées sur 250
points non corrélés dans les simulations des états d'équilibre. En
. . . . . . . . 85
moyenne, /˜ = 4,23 ± 0,03. (Simulations par Masoud Hoore) . . . . . .
xx
5.2 Configurations du doublet RBC en fonction de v1 = v2 = v et γ avec premier
point de contact aligné et décalé. (a) Courbes de contour pour la zone de
contact et l'énergie de flexion réduite pour les globules rouges alignés. (b)
Tracé de contour pour la différence entre l'énergie libre du doublet et les
globules rouges libres (énergie de déformation). Le changement d'énergie libre
est normalisé par l'énergie de flexion d'une vésicule avec un module de flexion
κc, 8πκc, et la barre de couleur a une échelle logarithmique. Les points noirs
(•) dans les courbes de niveau représentent les valeurs pour lesquelles des
simulations ont été effectuées. (Simulations par Masoud . . . . . . . . . . . 88
. H. oore) .
5.3 Configurations du doublet RBC en fonction de v1 = v2 = v et γ avec premier
point de contact aligné et décalé. (a) La configuration d'un doublet dépend
de la façon dont les globules rouges établissent leur premier contact. Les
globules rouges peuvent établir le premier contact alors qu'ils sont dans
des configurations alignées ou décalées. (b) La différence entre l'énergie
libre des doublets dans les cas alignés et décalés. Si
positif,
Ealig −c ela
Eo sf ignifie
f est
que le doublet de décalage a une énergie libre plus petite, de sorte que
c'est une configuration plus favorable. Les diagrammes de phase des cas
(c) aligné et (d) décalé sont différents dans la région, où Ealig − Eo
positif.
f f est
Différentes phases se distinguent par leurs vues en coupe.
Les points noirs (•) dans les diagrammes de phase représentent les
simulations réalisées. Notez que les limites de phase sont dessinées
. . . .Hoore) .
schématiquement pour guider l'œil. (Simulations par Masoud . . . . . . . . 89
5.4 Configurations du doublet RBC en fonction de v1 et v2 à une force d'adhérence
constante γ = 8. Les tracés de contour montrent la surface de contact et
l'énergie de flexion réduite du premier RBC en fonction de v1 et v2.
Les points noirs (•) représentent les valeurs pour lesquelles des simulations
. C
ont été effectuées. (Simulations par Masoud Hoore) . . 92 5.5 . onfigurations
. . . . . . . du
doublet RBC en fonction de v1 et v2 à une force d'adhérence constante γ = 8. Les vues
latérales et en coupe de certaines configurations sont présentées dans le diagramme
de phase, en omettant certaines formes pour plus de clarté. Les différentes phases
sont séparées par des couleurs différentes.
La phase SB se produit dans une région étroite entre les phases YinYang et
MF. La membrane est supposée sans contrainte dans sa forme biconcave
avec v = 0,64. Les limites de phase sont dessinées schématiquement pour
guider l'œil. (Simulations par Masoud Hoore) . . . . . . . . . . . 93
xxi
5.6 Configurations du doublet RBC en fonction du module de cisaillement
réduit du réseau de spectrine µ = GA/8πκc et de la force d'adhérence
réduite γ à un volume réduit constant v = 0,64. (a) Les tracés de contour
montrent la zone de contact et l'énergie de flexion réduite. Les points
noirs (•) représentent les valeurs pour lesquelles des simulations ont été effectuées. (b)
Dépendance de la surface de contact sur la force d'adhérence pour différentes
valeurs µ . Une discontinuité dans la zone de contact est observée lorsqu'un ou
les deux globules rouges perdent leur forme biconcave d'origine. (Simulations
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
par Ma soud Hoore) . . . . . . . . . 94
5.7 Configurations du doublet RBC en fonction du module de cisaillement réduit
du réseau de spectrine µ = GA/8πκc et de la force d'adhérence réduite γ à
un volume réduit constant v = 0,64. Diagramme de phase des doublets RBC
en fonction de γ et µ, où différentes phases sont séparées par différentes
couleurs. Les limites de phase sont dessinées schématiquement pour guider
l'œil. Les vues latérales et en coupe de certaines configurations sont
présentées, en omettant certaines formes pour plus de clarté. Les modules
de faible cisaillement se rapprochent des doublets de vésicules. La membrane
est supposée sans contrainte dans sa forme biconcave avec v = 0,64
(Simulations par M. a
. s.oud
. . H.oore) .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95
5.8 Effet de la forme sans contrainte des globules rouges sur les phases de doublet pour
v1 = v2 = 0,64. (a) Aire de contact en fonction de γ pour des formes biconcaves
et presque sphériques (avec une excentricité de 0,94) sans contrainte. ( b ) Les
formes des doublets RBC pour µ = 81, montrant des différences appréciables pour
les deux formes sans contrainte. Les frontières entre les différentes formes sont
. oore) . .
tracées schématiquement pour guider l'œil. (Simulations par Masoud H . . . . 9. 7
xxii
5.9 Effet de la contrainte de surface locale dans le modèle de membrane sur un Yin
Doublet Yang pour γ ≈ 85, µ = 80 et v1 = v2 = 0,64. ( a ) Distributions de
déformation de liaison à partir de simulations avec et sans contrainte de zone locale.
La déformation de la liaison est définie comme l/l0 − 1, où l est la longueur
d'une liaison déformée et l0 est sa longueur d'équilibre correspondante. (b)
Distributions des déformations locales de la zone triangulaire. La déformation
de surface est définie comme A/A0 − 1, où A est la surface d'un triangle déformé
dans le réseau de ressorts et A0 est sa surface imposée à la forme d'équilibre
biconcave. ( c ) Distribution des contraintes de zone locale sur les globules
rouges dans un doublet YinYang. Les membranes RBC présentent une
déformation en compression (ou déformations de surface négatives) au niveau
de la zone de contact et sont étirées principalement au niveau des surfaces
. d. es
libres caractérisées par . d. . . . . . . . . . . . . . . . . . (Simulations
éformations de surface positives. . . . . . . .par
. Masoud
Hoore) . . 99 5.10 Comparaison des formes expérimentales et simulées de doublets
d'hématies déterminées par la force d'adhérence, le module de flexion et le volume
réduit d'hématies. Pour les simulations, les vues de côté et en coupe sont présentées
pour chaque cas. Les phases (a) sigmoïdebiconcave, (b) mâlefemelle, (c) sigmoïde
concave (YinYang), (d) gaine, (e) plateconcave et (f) platebiconcave sont
représentées. (a) a été observé dans du dextran (70kDa) 20mg/ml, (b) dans du
dextran (40kDa) 10 mg/ml, (c) dans du plasma + fibrinogène à 6mg/ml, (d) et (e) les
deux dans une solution hypotonique de dextran (70kDa) à 20mg/ml et (500kDa) à
10mg/ml . . . . . . . . . . . . . 101
5.11 Diverses formes de rouleaux dans des expériences et des simulations avec
différents doublets de nucléation : (a) sigmoïde (b) mâlefemelle et (c)
concave plat. (a) a été observé dans du dextrane (70kDa) à 20 mg/ml, (b)
dans du dextrane 40 kDa à 10 mg/ml et (c) dans du dextrane (500kDa) à 10 mg/ml 102
6.1 Instantanés de globules rouges en (a) croissant et (b) en forme de pantoufle, ainsi
qu'une superposition de trajectoires expérimentales enregistrées de traceurs. (c) et
(d) représentent les lignes de courant et les formes des cellules à partir des
simulations numériques. La vitesse en (a) et (c) est vRBC = 2,83 mm/s et en (b) et
(d) vRBC = 6,50 mm/s. Les trajectoires et les lignes de courant des particules sont
représentées dans le cadre de comouvement des globules rouges. Le fluide s'écoule de gauche à droite.
Simulations par A. Guckenberger et J. Roemer . . . . . . . . . . . . . 108
xxiii
6.2 Mouvement des traceurs dans le cadre comobile d'un RBC en forme de croissant
s'écoulant avec une vitesse vRBC = 4,3 ± 0,1 mm/s. (a) Instantané du RBC avec
une superposition d'une trajectoire de traceur à partir de la séquence d'images. (b)
La vitesse vr,x dans le sens d'écoulement du traceur lorsqu'il s'approche et
s'éloigne de la cellule. La courbe d'ajustement est une fonction sigmoïde
empirique. La direction d'écoulement de la cellule est indiquée par une flèche
. . . 6..3
jaune et la trajectoire du mouvement est indiquée par des chiffres. . . . . (.a)
. . 111
Instantané d'un groupe de deux globules rouges en forme de croissant avec une
distance de dRBC = 5,2 µm avec une superposition de trajectoires de traceurs.
Le liquide entre les cellules semble être encapsulé dans un vortex et tourner
comme un tore avec l'axe de symétrie dans la direction x. (b) Simulation
numérique d'un cluster. Les lignes de courant indiquent comment les traceurs
sera transporté à partir du milieu le long d'une trajectoire hélicoïdale (voir
Fig. 6.6). Simulations par A. Guckenberger et J. Roemer. . . 113. . . . .
6.4 Période de cycles pour un mouvement de traceur toroïdal entre deux hématies en
fonction de la distance entre les cellules. Les données expérimentales sont
représentées respectivement par des symboles et des lignes pleines et les
résultats numériques par des symboles ouverts et des lignes pointillées.
L'ajustement représente un mouvement sur un tore étiré axial avec des ellipses
de révolution. Il est basé sur l'équation 6.1 avec π/vt comme paramètre
. e.st
d'ajustement et le petit axe . fixé
. . à. a. . . . . . . . . . . . .
= 3 µm. . . . . . . . . . . 115
6.5 Vue 3D montrant la provenance (flèche bleue) des traceurs et leurs
trajectoires pour une vitesse cellulaire de 2,2 mm/s. Simulations par A.
. 1. 16
Guck berger et J. Roemer . . . .6. . . . . . . . . . . . . .
.6 Trajectoires calculées n. umériquement
. . . . . . d'un
traceur s'échappant des tourbillons d'écoulement entre deux globules rouges avec
une vitesse de 2,2 mm/s où X0 est le centre entre les deux globules rouges.
(a) Mouvement temporel avantarrière le long de la direction du flux. (b)
Trajectoire toroïdale dans le plan xy, partant du milieu et allant vers l'extérieur.
Simulation par A.
Guckenberger et J. Roemer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 117
7.1 (a) Conception de la puce microfluidique pour l'étude du comportement
des agrégats aux bifurcations et (b) microimage de la région d'intérêt
observée à partir de la puce microfluidique. Les canaux de haut en bas
sont numérotés de 1 à 4. Les canaux 1 et 4 sont appelés
branches externes, 2 et 3 comme branches internes. . . . . . . . . . . . . 123
xxiv
7.2 Pourcentage d'agrégats (2 cellules et plus) passant par la bifurcation pour
plusieurs vitesses allant de vRBC = 0,4 à vRBC = 20 mm/s pour le dextran
(70 kDa) avec une concentration de (a) 20 mg/ml (b) 50 mg/ml et (c) du
fibrinogène à 2,5 mg/ml . . . . . . . . . . 125 . . . . . . . . . . . .
7.3 Distribution des rouleaux constitués de N >2 globules rouges normalisée, pour
chaque canal, par le nombre de cellules passant par le même canal pour
une vitesse d'écoulement donnée pour le dextran (70 kDa) avec une
. m. g/ml .
concentration de (a) 20 mg/ml (b ) 50 mg/ml et (c) fibrinogène à 2,5 . . . . 127
7.4 Microimages d'un granulat se brisant sous l'effet d'une contrainte de cisaillement lors de son déplacement
de (a) à (c) le long du microcapillaire . . . . . . . . . . . . . . . . . . 129
7.5 Microimages prises à 3 images consécutives de (a) à (c) d'un agrégat se
brisant au sommet de la bifurcation en raison du point de stagnation . . 129
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
7.6 Répartition des événements de rupture montrant à la fois les contributions de
cisaillement et de cisaillement d'extension pour une concentration de dextrane
. 130
(70 kDa) de (a) 20 mg/ml et (b) 50 mg/ml et (c) de fibrinogène à 2,5 mg/ml . .
7.7 Photo et croquis de la chambre à flux de cisaillement. Sur la photo, le cylindre noir à
gauche est le moteur, relié au disque rotatif supérieur par une courroie. Sur le
croquis (coupe transversale), le disque tournant est la pièce conique (épaisseur 20
mm). Cette pièce est guidée par un roulement à billes. Le disque inférieur est
composé de deux parties : une plaque de verre de 2 mm, renforcée par une plaque
de verre de 10 mm d'épaisseur (collée). La plaque de 10 mm a un trou autour du
point d'observation, pour limiter l'épaisseur du verre à 2 mm au point d'observation. . .
133 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
7.8 (a) un pousseseringue. Le corps de la seringue de 20 ml (1) est maintenu
par un support de maintien (2) et le fond est inséré dans le stator d'un
moteur pas à pas utilisé comme agitateur magnétique (3). Le piston de la
seringue est entraîné par un moteur pas à pas (4) grâce à une vis
d'entraînement (5) et (b) vue d'ensemble du pousseseringue avec p.attes
. . .de fixation. . . 134
7.9 (a) Schéma du DHM (L1, L2, L3, L4 : lentilles ; M1, M2, PM : miroirs ; BS1,
BS2 : séparateurs de faisceau ; S : Échantillon [puce microcanal]) et (b)
photo de l'holographique microscope sur paillasse hors rack (avec un
prototype de la chambre à flux de cisaillement) . . 135. . . . . . . . . . . .
7.10 Données brutes typiques obtenues pour le dextrane (70 kDa) à une concentration
−1
mg/ml et un taux de cisaillement de γ˙ = de 50 indiquant le nombre d'objets
10s en fonction de leur volume. Le premier pic représente le nombre de cellules
individuelles, le second : les doublets et ainsi de suite. . . . . . . . . . . . . . . 136
xxv
7.11 Fraction d'agrégats de RBC pour deux concentrations de Dextran : (a) 20 mg/
ml et (b) 50 mg/ml à de faibles taux de cisaillement. 1c (en bleu) : 1 cellule, 2c
(en rouge) : 2 cellules, 3c (en vert) : 3 cellules et 4c (en violet) : 4 cellules et plus 138
7.12 Indice d'agrégation calculé pour deux concentrations de dextrane : 20 mg/ml
. . 139
(rouge) et 50 mg/ml (bleu), pour toutes les valeurs de taux de cisaillement . .
7.13 Indice d'agrégation calculé en fonction du taux de cisaillement pour deux
concentrations de dextrane : 20 mg/ml (rouge) et 50 mg/ml (bleu) . . . 140
xxvii
Liste des tableaux
1.1 Propriétés géométriques des globules rouges humains . . . . . . . . . . . . . 9
1.2 Protéines responsables de l'agrégation dans le plasma humain, leur
concentration et leur effet sur l'agrégation (qu'il augmente ↑ ou diminue ↓) .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
xxix
Liste des abréviations
Microscopie à force atomique AFM
ATP adénine triphosphate
Albumine sérique bovine BSA
ADN acide désoxyribonucléique
Acide éthylènediaminetétraacétique EDTA
FB AppartementBiconcave
FC PlatConcave
Isothiocyanate de fluorescéine FITC
HEPES Acide 4(2hydroxyéthyl)1pipérazine éthane sulfonique
Albumine sérique humaine HSA
LJ LennardJones
Analyseur de cellules rotationnelles optique assisté par laser LORCA
Indice d'agrégation microscopique MAI
MF MâleFemelle
Nanoparticules de NP
Brucelles optiques OT
Solution saline tamponnée au phosphate PBS
PDMS polydiméthylsiloxane
PEG polyéthylène glycol
Globule(s) rouge(s) érythrocytaire(s)
SB SigmoïdeBiconcave
SC SigmoïdeConcave
Erreur standard SE
Microscopie électronique à balayage SEM
Modulateur spatial de lumière SLM
Microscopie électronique à transmission TEM
xxxi
Constantes physiques
Nombre d'Avogadro NA = 6,022 140 76 × 1023 mol−1 (exact)
Constante de Boltzmann kB = 1,380 648 52 × 10−23 m2 kg−1 s −2 K−1 (exact) h =
Constante de 6,626 070 04 × 10−34 m2 kg s−1 (exact)
Planck c = 2,997 924 58 × 108 m s−1 (exact)
Vitesse de la lumière
Chapitre 1
Introduction
Le sang a fasciné les humains à travers les âges. Dans la mythologie grecque, le sang
sortant de la veine gauche de la Méduse était toxique alors que celui qui coulait dans son
bras droit pouvait ressusciter les morts. Le but du sang mais aussi s'il est sain ou nocif a
toujours été remis en question. La saignée, c'estàdire se débarrasser du sang dans l'espoir
de guérir une maladie, en est un exemple. Celleci a été pratiquée depuis l'Antiquité jusqu'au
XIXe siècle et s'est révélée nocive dans la majorité des cas. Au XVIIe siècle, JeanBaptiste
Denis tenta de transfuser du sang de veau à Antoine du Mauroy, un malade maniaque. Même
s'il a survécu à la première transfusion, il est décédé après la seconde d'un accident
hémolytique.
En fait, ses globules rouges (RBC) ont subi une hémolyse. Cet accident a montré que le sang
est un fluide complexe qui peut présenter des problèmes de compatibilité. Au même siècle,
Malpighi et Swammerdam ont été les premiers à mentionner l'existence des globules rouges.
Cependant, la découverte de RBC est souvent attribuée au scientifique néerlandais Anthony
van Leeuwenhoek pour avoir donné une meilleure description de ces cellules. Cette
découverte a été rendue possible par sa capacité à fabriquer des microscopes à lentille
unique avec un grossissement d'au moins 250 fois.
Le XXe siècle a été majeur en termes de techniques médicales pour traiter le sang en raison
de sa meilleure compréhension. Le jeune Antoine du Mauroy aurait peutêtre survécu s'il était
né en 1900. C'est l'année où Karl Landsteiner découvrit les groupes sanguins. Il a été
récompensé par le prix Nobel de médecine pour cette découverte et sa date de naissance a
été choisie pour être le jour du "don de sang" dans le monde. Les deux guerres mondiales,
bien que meurtrières, ont apporté quelques améliorations pour la transfusion et la manipulation
du sang avec l'apparition des premiers anticoagulants comme le citrate ou le citratedextrose.
Malgré une meilleure description de ce qu'est le sang, la recherche manque encore pour
avoir une compréhension approfondie de ce fluide complexe. Cette thèse est consacrée à
l'étude du sang et plus particulièrement d'un type particulier de cellules : les érythrocytes (ou
GR) et leurs interactions entre elles. Travail expérimental utilisant principalement l'optique
2 Chapitre 1 Introduction
pincettes (OT) et plateformes microfluidiques ont été étayées par des simulations numériques.
Cette recherche doctorale est divisée en deux grandes parties. La première partie sera consacrée
à l'étude des globules rouges en stase. Nous insisterons sur l'agrégation des érythrocytes. Un
phénomène très présent dans la circulation sanguine mais encore mal compris malgré les modèles
et expérimentations existants. Le processus d'agrégation affecte un certain nombre de processus
physiologiques et est considéré comme l'un des facteurs les plus importants affectant le flux
sanguin [1, 2, 3]. D'un point de vue clinique, la compréhension de l'agrégation est cruciale car ce
phénomène est altéré dans de nombreuses maladies comme le paludisme [4, 5], le diabète [6, 7]
ou la drépanocytose [8, 9] pour n'en citer que quelquesunes. En effet, une agrégation accrue des
globules rouges (hyperagrégation) est souvent considérée comme un facteur de risque dans les
états pathologiques. Pour élucider cette partie, nous traiterons : de l'adsorption des macromolécules
sur les globules rouges, de la mesure des forces de (dés)agrégation et de la forme des doublets
globulaires.
La deuxième partie concerne les globules rouges en flux avec un accent sur les interactions des
cellules, qu'elles soient adhésives ou hydrodynamiques. Il traitera : du champ d'écoulement autour
des cellules et de la distribution des agrégats aux bifurcations. Mais d'abord, commençons par
une description détaillée de nos montages expérimentaux et par une vue approfondie des objets
biologiques que nous étudions.
Introduction
Le sang a toujours été fascinant pour l'homme. Dans la mythologie grecque, le sang qui sortait de
la veine gauche de la Méduse était toxique alors que celui qui coulait dans son bras droit pouvait
ressusciter les morts. La fonction du sang, mais aussi son caractère sain ou nocif, a toujours été
remis en question. La saignée, c'estàdire le fait de se débarrasser du sang dans l'espoir de guérir
une maladie, en est un exemple. Elle a été pratiquée depuis l'Antiquité jusqu'au XIXe siècle et
s'est révélée nocive dans la majorité des cas. Au XVIIe siècle, JeanBaptiste Denis a tenté de
transfuser du sang de veau à Antoine du Mauroy, un patient souffrant de démence.
Même s'il a survécu à la première transfusion, il est mort après la seconde d'un accident
hémolytique. En effet, ses globules rouges (GR) ont subi une hémolyse. Cet accident a montré
que le sang est un complexe fluide qui peut avoir des problèmes de compatibilité. Au cours du
même siècle, Malpighi et Swammerdam ont été les premiers à éprouver l'existence des globules
rouges. Cependant, la découverte des GR est souvent attribuée au scientifique néerlandais
Anthony van Leeuwenhoek, qui a donné une meilleure description de ces cellules. Cette
découverte a été rendue possible grâce à sa capacité à fabriquer des microscopes à lentille unique
avec un
Chapitre 1 Introduction 3
grossissement d'au moins 250 fois.
Le vingtième siècle a été majeur en termes de techniques médicales pour traiter le
sang en se basant sur une meilleure compréhension de celuici. Le jeune Antoine du
Mauroy aurait peutêtre survécu s'il était né en 1900. C'est l'année où Karl Land steiner
a découvert les groupes sanguins. Il a été récompensé par le prix Nobel de médecine
pour cette découverte et sa date de naissance a été choisie pour être le jour du "don
du sang" dans le monde. Les deux guerres mondiales, bien que meurtrières, ont
apporté quelques améliorations relatives aux transfusions et la manipulation du sang
avec l'apparition des premiers anticoagulants comme le citrate ou le citrate dextrose.
Bien que l'on dispose d'une meilleure description de ce qu'est le sang, la recherche
manque encore pour comprendre en profondeur ce fluide complexe. Cette thèse est
consacrée à l'étude d'un type particulier de cellules : les érythrocytes (ou globules
rouges) et leurs interactions entre elles. Des travaux expérimentaux utilisant
principalement des pinces optiques et des plateformes microfluidiques ont été complétés
par des simulations numériques. Ce travail de recherche est divisé en deux grandes
parties. La première partie est consacrée à l'étude des globules rouges en stase. Nous
mettrons l'accent sur l'agrégation des érythrocytes. Un phénomène très présent dans
la circulation sanguine mais encore mal compris malgré les modèles et les expériences.
Pour élucider cette partie, nous traitons de : l'adsorption de macromolécules sur les
globules rouges, la mesure des forces de (dés)agrégation et la forme des doublets des
globules rouges.
La deuxième partie concerne les GR en flux mettant l'accent sur les interactions des
cellules, qu'elles soient adhésives ou hydrodynamiques. Nous abordons également : le
champ d'écoulement autour des cellules et la distribution des agrégats aux bifurcations.
Mais tout d'abord, commençons par une description détaillée de nos installations
expérimentales et par une vue approfondie des objets biologiques que nous étudions.
Einleitung
Blut hat den Menschen schon immer fasziniert. In der griechischen Mythologie war das
Blut, das aus der linken Ader der Medusa austrat, giftig, während das Blut, das in ihrem
rechten Arm floss, Tote auferwecken konnte. Die Aufgabe des Blutes, aber auch seine
Gesundheit oder Schädlichkeit wurde immer in Frage gestellt. Das Ader lassen, dh die
Entnahme von Blut in der Hoffnung, eine Krankheit zu heilen, ist ein Beispiel dafür. Sie
wurde von der Antike bis ins 19. Jahrhundert praktiziert und hat sich in den meisten
Fällen als schädlich erwiesen. Im 17. Jahrhundert versuchte
JeanBaptiste Denis, dem an Demenz erkrankten Antoine du Mauroy Kalbsblut zu
transfundieren. Obwohl er die erste Transfusion überlebte, starb er nach der zweiten
an einem hämolytischen Unfall. Seine roten Blutkörperchen (Erythrozyten) wurden einer
Hämolyse unterzogen. Dieser Unfall zeigte, dass Blut eine komplexe Flüs sigkeit ist,
die Kompatibilitätsprobleme haben kann. Im gleichen Jahrhundert waren Malpighi und
Swammerdam die ersten, die die Existenz roter Blutkörperchen er wähnten. Die
Entdeckung der roten Blutkörperchen wird jedoch oft dem nieder ländischen
Naturforscher Anthony van Leeuwenhoek zugeschrieben, der diese Zellen besser
beschreiben konnte. Diese Entdeckung wurde durch seine Fähigkeit ermöglicht,
Einlinsenmikroskope mit mindestens 250facher Vergrößerung herzustellen.
Das zwanzigste Jahrhundert war aufgrund seines besseren Verständnisses für die
medizinischen Techniken im Umgang mit Blut von großer Bedeutung. Der junge Antoine
du Mauroy hätte vielleicht überlebt, wenn er 1900 geboren worden wäre.
Dies ist das Jahr, in dem Karl Landsteiner die Blutgruppen entdeckte. Für diese
Entdeckung wurde er mit dem Nobelpreis für Medizin ausgezeichnet, und sein
Geburtsdatum wurde zum Tag der "Blutspende" in der Welt gewählt. Die beiden
Weltkriege brachten, obwohl sie tödlich waren, mit dem Erscheinen der ersten An
tikoagulanzien wie Citrat oder CitratDextrose einige Verbesserungen für Transfu sionen
und den Umgang mit Blut. Trotz einer besseren Beschreibung dessen, was Blut ist,
mangelt es der Forschung immer noch an einem vertieften Verständnis dieser
komplexen Flüssigkeit. Diese Arbeit widmet sich der Untersuchung eines bestimmten
Zelltyps : der Erythrozyten (oder RB) und ihrer Interaktionen untere inander. Die
experimentellen Arbeiten, die hauptsächlich mit optischen Pinzetten und Mikrofluidik
Plattformen durchgeführt wurden, wurden durch numerische Sim ulationen untermauert.
Diese Doktorarbeit ist in zwei Hauptteile gegliedert. Der erste Teil ist dem Studium der
roten Blutkörperchen in Stase gewidmet. Wir wer den uns auf die Aggregation von
Erythrozyten konzentrieren. Ein Phänomen, das im Blutkreislauf sehr präsent ist, aber
trotz Modellen und Experimenten noch nicht vollständig verstanden wird. Um diesen Teil
zu erläutern, werden wir folgende Themen behandeln : Adsorption von Makromolekülen
an RBC, die Messung von (Dis)Aggregationskräften und die Form von RBCDubletten.
Im zweiten Teil geht es um RBC in Strömung, wobei der Schwerpunkt auf den Inter
aktionen der Zellen liegt, unabhängig davon, ob sie adhäsiv oder hydrodynamisch sind.
Wir beschäftigen uns mit : dem Strömungsfeld um Zellen und der Verteilung von
Aggregaten an Bifurkationen. Beginnen wir jedoch zunächst mit einer detail lierten
Beschreibung unserer Versuchsaufbauten und mit einer eingehenden Betra chtung der
biologischen Objekte, die wir untersuchen.
1.1. Revue de littérature 5
1.1 Revue de la littérature
L'agrégation des RBC depuis sa découverte par Leeuwenhoek, est toujours un sujet d'actualité. Une façon
« d'évaluer » l'agrégation consiste à utiliser la vitesse de sédimentation. Aujourd'hui encore, il s'agit d'un
outil de diagnostic pour les médecins. Il a été observé que le sang pathologique sédimente souvent plus
rapidement que le sang sain. Ceci est souvent attribué à la concentration plus élevée de fibrinogène due à
la réponse inflammatoire [10, 11] du corps à une maladie. Le fibrinogène est responsable de l'agrégation
des globules rouges mais ce n'est peutêtre pas le seul facteur et la compréhension des mécanismes
d'agrégation des globules rouges devient cruciale dans ce contexte.
Le système le plus simple pour étudier l'agrégation des globules rouges consiste en un amas de deux
cellules : les doublets. Le travail numérique a permis d'acquérir plus de connaissances en tenant compte
de paramètres physiques spécifiques tels que : l'aire de contact, le volume mais aussi l'élasticité de
cisaillement et la rigidité en flexion. Beaucoup a déjà été fait dans ce domaine mais il a été principalement
soutenu par une analyse en 2 dimensions [12]. Les modèles initiaux considéraient que la zone de contact
entre deux hématies était plane. En fait, c'est plus subtil et tout un diagramme de phase a été découvert en
2 dimensions. Nos travaux récents proposent un diagramme de phases complet dans un espace
tridimensionnel.
Un premier aperçu de l'agrégation a été fait à l'aide de techniques dédiées à la rhéologie du sang.
Cela a révélé le comportement collectif des globules rouges dans le flux sanguin (Rheoscan A, Myrenne
Aggregometer [1], ektacytometer [13], LORCA [14]. L'un des résultats les plus significatifs liés à l'agrégation
est, par exemple, ce qui est maintenant décrit comme le sang Ce phénomène est attribué à la dissociation
des rouleaux sous contrainte de cisaillement D'autres techniques sont également disponibles pour étudier
l'agrégation des plus simples comme l'analyse d'images microscopiques [15] aux plus élaborées comme la
diffusion du faisceau laser [16, 17, 18 ] ou la diffusion d'ultrasons [19, 20] sur des suspensions de
sang.Néanmoins, même si de telles techniques sont utiles pour étudier à la fois l'agrégation et la désagrégation
des globules rouges de manière contrôlée en faisant varier la contrainte de cisaillement, elles ne permettent
pas d'expliquer au niveau cellulaire les deux phénomènes et des techniques plus locales deviennent
nécessaires. Les méthodes monocellulaires (AFM [21, 22], aspiration par micropipette [23]) se concentrent
principalement sur la désagrégation des globules rouges. Par rapport à d'autres méthodes [24, 25, 26, 21],
l'OT permet une meilleur contrôle de la zone d'interaction dans diverses solutions modèles et donc, à la fois
pour le processus d'agrégation et de désagrégation.
L'un des moyens de favoriser l'agrégation entre les globules rouges est l'utilisation de polymères.
Les premiers travaux de Chien et al. [25, 27], ont soutenu l'hypothèse selon laquelle les globules rouges de
clusters plus grands en formant des ponts entre eux. Chien et al. privilégier un modèle basé sur l'adsorption
de macromolécules ou de protéines sur les membranes cellulaires adjacentes et la formation de ponts
croisés donnant naissance à la formation de rouleaux.
Il est donc important de prendre en compte l'adsorption pour vérifier cette hypothèse. Les preuves
expérimentales ont été considérées comme controversées et considérées comme des artefacts [28] et, par
conséquent, négligeant la formation possible de ponts. Des travaux plus récents de Neu et al. [29], repose
sur les forces de déplétion. La différence de concentration de macromolécules entre la couche
d'appauvrissement et le milieu environnant provoque une pression osmotique poussant les globules rouges
entre eux. Des travaux expérimentaux ont été menés dans le plasma et les polymères non ioniques [30].
Avec l'émergence de techniques physiques pour mesurer les forces, les questions sur les interactions
des globules rouges au niveau d'une seule cellule ont été mieux traitées. La micropipette comme les
techniques de piration ont donné un premier aperçu des interactions globules rouges mais elles ont été
réalisées sur des paires liposomes globules rouges [24] au lieu de globules rouges globules rouges. Des
expériences avec l'AFM ont révélé quantitativement la plage d'énergie d'interaction des globules rouges,
mais ont trouvé ses limites à des concentrations élevées de dextran. En passant, toutes les méthodes
unicellulaires sont mécaniques et ne permettent que la mesure de la désagrégation entre les cellules. Les
OT se sont révélés polyvalents pour mesurer les forces car ils pouvaient être combinés avec d'autres
méthodes existantes [31, 32, 33]. Plusieurs études ont rapporté sur l'évaluation des forces entre les GR.
L'OT a ouvert de nouvelles possibilités car elle permet de contrôler la dynamique d'agrégation mais aussi
de désagrégation des globules rouges [34, 35, 30]. Des différences entre les deux mécanismes en termes
de forces ont déjà été montrées mais il y a une absence de preuves expérimentales pour vérifier les
modèles et surtout, dans les solutions modèles. Le même manque se retrouve pour la durée d'interaction
entre les
cellules. Certains travaux ont déjà été effectués sur cette question, montrant que l'énergie d'interaction peut
devenir plus grande après des périodes d'interaction plus longues, mais qu'elle en était encore à un stade
précoce [30].
Les mesures de force sont perspicaces, mais la (dés) agrégation des globules rouges a lieu dans le
flux sanguin et l'influence des forces hydrodynamiques sur la forme et la stabilité des agrégats ne peut être
négligée. Pour répondre à cette problématique, le développement de plateformes microfluidiques a trouvé
un intérêt croissant pour la recherche sanguine. Des expériences dans les capillaires ont révélé que la
membrane des globules rouges pouvait se déformer en se déplaçant dans des canaux étroits et donner
naissance à plusieurs formes. Les premières simulations [36, 37, 38, 39, 40] en 2D modélisaient les
globules rouges en les considérant comme des vésicules. Le champ d'écoulement autour d'un seul RBC a
déjà été simulé et un diagramme de phase complet a été établi, montrant la présence d'une pléthore de
formes de RBC [38, 39]. Ces résultats ont été plus tard
1.2. Composition du sang 7
confirmé en 3D par Fedosov et al. [41]. Parmi toutes ces formes possibles, deux d'entre elles ont été
étudiées plus en profondeur à savoir le croissant et les chaussons. Des expériences et des simulations en
3D [42, 43] ont montré que ces formes sont les plus importantes dans les microcanaux pour, respectivement,
des vitesses cellulaires inférieures et supérieures. Cependant, malgré les travaux numériques, le champ
d'écoulement autour d'un seul RBC et en particulier, autour de ces deux formes proéminentes n'a jamais
été étudié depuis les travaux pionniers de Gae htgens et al. [44] bien qu'il soit de la plus haute importance
pour la compréhension des interactions cellulecellule dans le flux. Le champ d'écoulement autour des
doublets formés de manière hydrodynamique fait également défaut. En fait, les expériences reposant sur
les forces adhésives formant des amas dans les microcanaux sont plutôt nouvelles [45]. Même si les
contributions des forces adhésives et hydrodynamiques sont mieux connues in vitro pour les canaux droits,
il reste encore beaucoup à faire dans des géométries plus complexes imitant les capillaires sanguins, par
exemple avec des bifurcations. On ne sait toujours pas comment ces bifurcations influencent la rhéologie
du sang à une échelle microscopique et plus locale en déterminant la distribution réelle des tailles
d'agrégats.
1.2 Composition sanguine
Le sang représente environ 7 % de notre poids corporel. C'est un fluide non newtonien véhiculant les
nutriments nécessaires mais aussi l'oxygène dans tout le corps. Comme représenté sur la Fig. 1.1, il est
composé de :
• Plasma : C'est le milieu dans lequel les cellules et les protéines voyagent. Sa fraction volumique
dans le sang dépend d'un individu à l'autre mais est en moyenne de 55 %.
L'eau est l'élément le plus présent et constitue environ 92 % du volume.
Les 8 % restants sont principalement constitués de protéines. L'albumine est la protéine la plus
importante dans le plasma. Cependant, celui tenu pour responsable de l'agrégation est
principalement le fibrinogène. Il contient également divers électrolytes tels que le sodium et le
chlorure pour maintenir l'osmolalité à un niveau optimal. D'autres nutriments comme le glucose ou
les acides aminés peuvent également être trouvés.
• Globules rouges : Ce sont les cellules les plus abondantes dans le sang. Leur fraction volumique est
d'environ 45 % du sang et varie entre les hommes et les femmes et plus généralement entre les
individus. Il est en moyenne plus faible pour les femmes et est également influencé par de nombreux
facteurs (ex : vie en altitude, activité physique...). L'hématocrite est un paramètre précieux car il est
souvent déficitaire pour les cas pathologiques.
Le but des globules rouges est de transporter l'oxygène à travers les vaisseaux dans tout le corps.
Sa couleur est due à l'hémoglobine qu'il contient, car la longueur d'onde rouge est
le moins absorbé. Les molécules d'hémoglobine ont également un composant de fer qui aide à capter
l'oxygène grâce à son affinité chimique.
• Couche leucocytaire : Elle représente environ 1 % du volume total et contient environ 0,2 % de globules
blancs (leucocytes), qui font partie du système immunitaire et éliminent les cellules obsolètes. Des
plaquettes ou thrombocytes (entre 0,6 et 1 %) sont également présents et permettent la coagulation après
une blessure par exemple.
FIGURE 1.1 : Schéma d'un tube de sang après centrifugation. 3 couches sont séparées
par la densité. De haut en bas : plasma, buffy coat (plaquettes, globules blancs) et
globules rouges
1.3 Focus sur le RBC
La formation des globules rouges, également connue sous le nom d'érythropoïèse, a lieu dans la moelle osseuse
et dure environ 5 jours. Tout commence par les hémocytoblastes, une cellule souche hématopoïétique capable
de se différencier en différentes lignées de cellules sanguines. Ce sont des cellules autorégénérantes car elles
donnent naissance à d'autres cellules de même nature mais aussi à des progéniteurs myéloïdes. A partir de ces
cellules, les proérythroblastes se forment et passent par différents stades (basophiles, polychromatiques et
orthochromatiques ou normoblastes). A ce stade, le noyau est éjecté et donne naissance à un autre type de
cellules appelées réticulocytes. Ces cellules sont expulsées de la moelle osseuse et commencent à voyager dans
tout le corps. Après maturation, ces mêmes cellules deviennent des RBC (érythrocytes).
Après avoir circulé pendant environ 120 jours, les globules rouges sénescents sont détectés par les macrophages
1.3. Focus sur RBC 9
et subissent une érythrophagocytose, un processus au cours duquel les globules rouges sénescents
sont engloutis par les macrophages. Ils sont ensuite, pour la plupart, transportés vers la rate où ils
devront passer par des canaux très étroits. Cela provoque la rupture des globules rouges et l'hémolyse
a lieu. Au cours du processus, l'hémoglobine contenue dans les globules rouges est libérée et
récupérée. Ceci résume le parcours d'un RBC pendant 120 jours.
Un GR sain a une forme biconcave au repos [46] mais du fait de sa déformabilité il peut prendre
d'autres formes comme des chaussons ou des parachutes en écoulement [43, 42]. Les paramètres
géométriques élémentaires (tableau 1.1) peuvent être résumés comme suit :
Diamètre 7,62 ± 0,62µm [47]
Épaisseur minimale 0,81 ± 0,35µm [47]
Épaisseur maximale 2,58 ± 0,27µm [47]
TABLEAU 1.1 : Propriétés géométriques des globules rouges humains
La membrane RBC peut être divisée en trois parties :
• Glycocalyx : il s'agit de la membrane externe présente dans un globule rouge. C'est comparable à
un pinceau de glucides ou de saccharides.
• Bicouche phospholipidique : C'est une couche polaire et double de molécules lipidiques. La tête
est hydrophile tandis que la queue est hydrophobe. Il est également constitué de protéines trans
membranaires telles que la bande 3 représentée sur la figure 1.2. La bande 3 favorise les
échanges ioniques entre l'environnement externe et interne de la cellule mais régule également
les interactions protéineprotéine. D'autres comme les glycophorines transportent des molécules
de sucre.
• Squelette membranaire : On trouve des protéines comme l'actine ou des plus grosses comme la
spectrine qui est aussi la plus abondante dans cette couche. Ils aident à conserver la forme des
globules rouges et à former le cytosquelette.
dix Chapitre 1 Introduction
FIGURE 1.2 : Schéma de la membrane érythrocytaire présentant de haut en bas : le
glycocalyx principalement constitué de glucides, la bicouche phospholipidique et la
membrane (actine, spec trine,...)
1.4 Agrégation
L'agrégation des globules rouges fait référence à la formation d'amas cellulaires également appelés "rouleaux".
Le terme "rouleau" a été utilisé car les globules rouges forment des structures qui ressemblent à une pile de pièces de monnaie
(Fig. 1.3). Tout ce processus a été étudié par Fahraeus [11]. Il a compris que l'agrégation est directement liée
aux taux de sédimentation. Il a observé que la formation et la densité des rouleaux sont bien souvent plus aiguës
pour le sang pathologique et qu'en même temps la sédimentation est plus rapide. Dans les cas pathologiques, le
temps de sédimentation est plus court en raison de la formation de rouleaux tombant plus rapidement qu'un seul
RBC. Cette observation est toujours cruciale dans la médecine moderne car c'est un outil de diagnostic utilisé par
les médecins pour détecter d'éventuelles maladies. Bien qu'il s'agisse d'un marqueur plutôt non spécifique, il est
maintenant admis que l'inflammation, conduisant à des niveaux plus élevés de fibrinogène [48, 10], est
responsable de cette augmentation de l'agrégation.
1.4. Agrégation 11
FIGURE 1.3 : Microphotographie de rouleaux vus au microscope avec un
objectif x40
Des comparaisons concernant l'agrégation chez d'autres mammifères ont déjà été effectuées
et les résultats sont quelque peu surprenants. Il montre que le sang prélevé sur des chevaux en
bonne santé a une agrégation plus forte, alors que le sang de veau ou de mouton a une formation
de rouleaux très faible, voire nulle [49, 50]. Néanmoins, leur taille et leurs propriétés mécaniques
peuvent être différentes et jouent également un rôle dans l'agrégation. Le mécanisme sousjacent
de l'agrégation des globules rouges, que ce soit pour les animaux ou les humains, reste incertain.
Néanmoins, deux modèles sont privilégiés pour décrire la formation des rouleaux.
Ces deux modèles sont le pontage et l'épuisement. La première repose sur l'adsorption de
macromolécules à la surface des globules rouges provoquant leur agrégation lorsque les forces de
pontage l'emportent sur les forces électrostatiques. Cette dernière est basée sur l'exclusion des
macromolécules proches de la surface des globules rouges conduisant à un gradient de pression
osmotique et également à l'agrégation.
1.4.1 Facteurs d'agrégation
Le fibrinogène a souvent été présenté comme la principale protéine responsable de l'agrégation
des globules rouges. Néanmoins, d'autres protéines telles que les γ globulines présentent un
comportement similaire favorisant l'agrégation. L'albumine est également présentée comme un
inhibiteur dans la littérature mais en présence d'autres protéines elle peut aussi être un promoteur
d'agrégation. Ces exemples montrent que l'agrégation, même au niveau des protéines, est un processus complexe.
Différents facteurs d'agrégation peuvent être trouvés dans le plasma humain. Ce sont en fait des protéines
de nature diverse. Ils contribuent tous de manière différente à l'agrégation des globules rouges. Même si l'effet
de certains est discutable, le tableau 1.2 en énumère quelquesuns :
Antagoniste Poids moléculaire (kDa) Concentration (mg/mL) Effet
Fibrinogène 340 1.84.0 ↑
Albumine γ 66 3550 ↑↓
globulines 150 716 ↑
PCR 25 <0,006 ↑ (?)
TABLEAU 1.2 : Protéines responsables de l'agrégation dans le plasma humain, leur
concentration et leur effet sur l'agrégation (qu'il augmente ↑ ou qu'il diminue ↓)
Travailler avec du plasma ou du sérum autologue peut être réalisé relativement facilement, mais pour
comprendre la formation des rouleaux dans le cadre d'une approche physique, ce système doit être simplifié
car il implique trop de facteurs. Par conséquent, les solutions modèles telles que le dextrane dans un tampon
sont souvent préférées au plasma. Le dextran est un polymère colloïdal de la famille des glucanes. Il est utilisé
en médecine comme extenseur de volume [51] en remplacement du sang après de graves pertes. Même si on
le retrouve dans la plaque dentaire, sa production est désormais contrôlée via des bactéries et permet ainsi
une production de masse.
C'est un polymère particulièrement polyvalent du fait que la force d'agrégation peut être modifiée en faisant
varier la concentration et que le dextrane de plusieurs poids moléculaires peut être facilement produit. Nous
l'utilisons comme pont croisé et plus de détails sur cet aspect ont déjà été exposés dans 1.1. Cependant, le
dextran a été utilisé dans des expériences pour vérifier à la fois les modèles d' épuisement et de pontage .
Pour cette raison, les mécanismes d'agrégation intervenant en présence de dextran sont encore controversés.
Le virus Fd de type sauvage a été choisi comme déplétant à longue portée dans nos expériences pour
ses propriétés bien connues avec une solide expérience en physique colloïdale [52, 53, 54]. Le virus Fd a un
rapport d'aspect élevé en raison de sa structure filamenteuse et en forme de bâtonnet (voir Fig. 1.4). Sa forme
s'est avérée idéale pour augmenter la portée de l'interaction d'appauvrissement par rapport aux particules
sphériques par exemple et, par conséquent, est considérée comme un appauvrissant à longue portée en
raison de sa géométrie et de sa taille. Ce système est également bien défini et des simulations numériques
peuvent décrire les potentiels d'appauvrissement en utilisant une approximation de densité du premier ordre
jusqu'à une teneur en Fd de plusieurs concentrations de chevauchement. Des équations entre deux sphères
ou deux plaques ont déjà été dérivées et peuvent être appliquées à un tel système. Des expériences utilisant
la microscopie à réflexion interne totale (TIRM) [55, 56] ont confirmé avec précision le profil potentiel de tels
1.5. Descriptions des modèles 13
interaction d'épuisement.
FIGURE 1.4 : Image AFM sur un substrat de silice du virus Fd tirée de [57]
1.5 Descriptions des modèles
Au cours des dernières décennies, diverses techniques ont émergé pour tenter de faire une percée liée
à l'agrégation. Une façon idéaliste de résoudre ce problème serait d'examiner l'écart entre deux globules
rouges agrégés. C'est ce que Jan et Chien [15] ont fait en utilisant la microscopie électronique à balayage
(MEB). Ils ont montré la dépendance de la distance intercellulaire des rouleaux par rapport au poids
moléculaire du dextran (Fig. 1.5). Cela pourrait indiquer que les molécules de dextrane sont situées entre
les cellules et que l'espace interstitiel serait plus grand pour des poids moléculaires plus élevés.
FIGURE 1.5 : Écart intercellulaire en fonction du poids moléculaire du
dextran. Graphique tiré de [15]
Cependant, il n'y a pas eu d'observation claire de tels "ponts" et l'écart semble rester le
même à un poids moléculaire plus élevé de dextrane. Pour surmonter ce problème, certains
ont essayé de rechercher des indices ou des signatures à la place. Si un pontage se
produit, on peut s'attendre à voir une éventuelle adsorption de macromolécules sur les
cellules. Cela pourrait être un indice de ponts restant à la surface des globules rouges.
Malgré quelques artefacts [28], différentes méthodes ont montré que l'adsorption du
dextrane a lieu à la surface des globules rouges. C'est un résultat probant mais
malheureusement insuffisant pour le généraliser au plasma car la nature des protéines est
différente par rapport au dextran. L'examen de l'énergie d'interaction pour l'agrégation et la
désagrégation est également un moyen possible de discriminer le pontage de l'épuisement.
Une analogie serait de penser à deux lames de verre mises en contact par une goutte
d'eau, il n'existerait aucune différence en terme d'énergie d'interaction si on tire une lame
de verre de l'autre ou si on pousse l'une sur l'autre dans le sens de sa longueur, car
l'énergie d'interaction ne dépendrait que de la distance instantanée entre les surfaces. Des
expériences sur cellule unique avec des micropipettes ont montré des énergies d'interaction
distinctes pour l'agrégation et la désagrégation. La relation entre l'énergie d'interaction pour
deux cellules adhérentes en fonction de la concentration en dextrane est bien connue. Il a
une forme dite "en cloche" [58, 59, 60]. Pour de faibles concentrations de dextran, il y a peu
ou pas d'agrégation. L'augmentation de la concentration de macromolécules de dextrane augmente
l'énergie d'interaction entre les globules rouges jusqu'à ce qu'elle atteigne un pic et diminue ensuite, à mesure
que plus de dextrane est ajouté.
1.5.1 Pontage
S. Chien et al. [60, 15, 61, 62] ont soutenu le modèle d'agrégation par crossbridging.
Deux globules rouges adjacents interagiraient en formant des ponts entre les membranes.
Les globules rouges ont été placés dans des solutions de macromolécules avec différents poids macromoléculaires
et ont été imagés à l'aide de la microscopie électronique à transmission (TEM). Ceci a révélé que la distance
intercellulaire varie en fonction de la taille des macromolécules [15]. Ajoutant à cela, une autre caractéristique
de ce modèle est donc l'adsorption de ces macromolécules sur les globules rouges pour former des ponts entre
les deux membranes. Il a été montré par Chien et al. [62] que les polymères neutres tels que le dextrane peuvent
s'adsorber à la surface des globules rouges.
L'une des premières explications de la "forme en cloche" a été attribuée aux forces électrostatiques qui ont
été étudiées en mesurant la mobilité électrophorétique et le potentiel zêta à la surface des globules rouges [15].
Pour mieux comprendre quelles forces sont impliquées dans l'agrégation des globules rouges en présence de
dextran, Chien et Jan [15] l'ont résumé ainsi :
Fa = Fb − Fe − Fs − Fm (1.1)
Avec Fa la force d'agrégation nette, Fb la force de pontage, Fe la force électrostatique,
Fs la force de cisaillement mécanique et Fm la force de flexion de la membrane des globules rouges.
La charge effective de la surface des érythrocytes est négative principalement en raison de la présence de
glycoprotéines sialylées [63]. Passé un certain seuil (pic de la forme en cloche), la répulsion électrostatique
augmente à mesure que plus de dextrane est ajouté à la solution. Cela provoque une diminution progressive
des forces de pontage et affaiblit l'agrégation.
Alors que pour la déplétion, la forme en cloche est basée sur la pénétration des macromolécules dans le
glycocalyx [29].
La nature de la liaison et de la création/destruction de ces ponts reste floue mais deux idées principales ont
émergé. L'un est basé sur des ponts se formant et se répartissant de manière homogène à la surface des
globules rouges, l'autre promeut l'idée que certaines protéines se lient sur des sites spécifiques.
Liaison non spécifique
Dans leurs travaux récents, Bagchi et al [64] ont proposé un modèle basé sur la réticulation non
spécifique. Comme pour les réactions chimiques, ils ont utilisé des vitesses de réaction pour
décrire la formation de liaisons. La figure 1.6 est une représentation schématique du modèle. Ces
liaisons sont considérées comme réparties de manière homogène avec une densité nb Chaque
liaison a été représentée comme un ressort hookéen et la force par liaison fb est donc donnée par :
fb = kb (l − l0) (1.2)
l0 est la longueur initiale de la liaison et l sa longueur étirée. kb fait référence au ressort
constante d'une liaison. L'équation de réaction régissant ce système :
∂nb nb = 2[k+(n − ) ∂t 2
2 2 − k−n b (1.3)
]
k+ et k− sont respectivement les coefficients de vitesse de réaction directe et inverse. n la
densité des molécules réticulantes sur la membrane.
2
− kts(l−l0 )
k+ = k 0 +e 2kB T (1.4)
si |x| = l < lt
2
− (k b−kts)(l−l0 )
0 k− = k−e
2kB T (1.5)
où k 0 et k 0 sont les coefficients de vitesse à l'équilibre, kts est la constante du

+ −
ressort de transition, kb est la constante de Boltzmann, T est la température absolue et lt est la
distance seuil inférieure pour la formation de la liaison supposée être lt = 2l0
FIGURE 1.6 : Croquis 3D illustrant la liaison non spécifique des protéines. Ici, les
ponts noirs se lieraient sur n'importe quel site disponible.
Aucune interaction particulière entre les ponts (protéines) n'est envisagée
Liaison spécifique
Concernant le plasma humain, le fibrinogène est considéré dans la littérature [65] comme l'une des principales
protéines induisant l'agrégation des globules rouges. Il est soupçonné de se lier aux membranes des globules
rouges [66, 67] et ce processus pourrait être spécifique [68, 69]. La figure 1.7 illustre ce modèle.
Dans une plus large mesure, on peut supposer que les protéines du plasma peuvent interagir dans un même
manière.
FIGURE 1.7 : Croquis 3D illustrant la liaison spécifique des cellules. Dans cet
exemple, les ponts cyan n'interagiraient qu'avec les ponts verts et les ponts bleus
avec les noirs. Chaque pont aurait son propre type de site où il peut se lier
Sur la base de travaux antérieurs [70], Pereverzev et al. [71] ont proposé un modèle à deux voies
pour tenter de décrire la liaison des sélectines P et L aux ligands oligosaccharidiques. Dans leur
modèle, ils montrent que la liaison récepteurligand peut être régie par des liaisons "slip" et "catch".
Les liaisons "glissantes" sont soumises à des durées de vie plus courtes à mesure que la force de
traction augmente. De manière contreintuitive, les liaisons "catch" voient leur durée de vie augmentée
à mesure que la force de traction augmente jusqu'à ce qu'elle atteigne une force critique. Une façon
imaginative de voir les choses est de penser aux doigts chinois. C'est un jouet dans lequel on met son
doigt et se fait piéger si ce doigt sort trop vite du piège.
1.5.2 Couches d'appauvrissement
Le modèle d'épuisement est pris en charge par des mesures AFM sur des globules rouges uniques.
Cependant, il est sujet à des artefacts car la quantification de l'énergie [12] peut être influencée par la
viscosité de la solution. La viscosité évolue évidemment en fonction de la concentration en
macromolécules de dextrane. La "forme en cloche" peut également être reproduite qualitativement
mais le maximum d'énergie d'interaction ainsi que les minima sont souvent décalés d'une technique à
l'autre. Afin de trouver ce comportement en forme de cloche, le modèle de déplétion d'Asakura et
Oosawa [72] a été adapté par Meiselman et al. [29] introduisant la profondeur de pénétration. Il tient
compte du fait que les polymères peuvent plus ou moins pénétrer les brosses des membranes du GR.
Pourtant, l'AFM favorise la dissociation des globules rouges en « face à face », ce qui n'est pas
vraiment représentatif de ce qui se passe dans des conditions physiologiques, où toutes les orientations
relatives peuvent se produire.
Avec l'émergence des pinces optiques, de nouvelles mesures ont été réalisées pour élucider les
mécanismes sousjacents de l'agrégation des globules rouges [73, 30, 35]. Il permet aux globules
rouges de s'agréger d'une manière similaire à ce qui se passe dans les vaisseaux (augmentation de
la zone de contact entre deux cellules agrégées). C'est aussi une méthode non invasive pour mesurer
à la fois l'agrégation et la désagrégation dans laquelle plusieurs paramètres peuvent être contrôlés
(orientation relative, vitesse d'approche). Même si la théorie de l'épuisement est solidement ancrée
dans la communauté scientifique, les preuves expérimentales font défaut. Le fait qu'il y ait agrégation
de GR alors que leurs membranes sont chargées négativement et donc répulsives, le rend encore
plus intéressant. Cette section suivante donne une « étude de cas » avec des explications détaillées
pour chaque modèle.
Interaction entre deux sphères dures
Le modèle bien accepté et plus récent repose sur des couches d'appauvrissement. Il a été initialement
introduit par Asakura et al. [72]. Il trouve ses racines dans la physique statistique en tant que système
est un ensemble canonique et se compose d'un grand nombre d'objets. Pour comprendre les fondements
de la théorie de la déplétion [74], partons d'un cas idéal. Nous considérons un modèle simplifié, dans
lequel deux grandes sphères sont immergées dans une solution de sphères dures (Fig. 1.8).
FIGURE 1.8 : Schéma de calcul des forces de déplétion entre deux grosses
sphères de diamètre D dans une solution constituée de plusieurs petites sphères
de diamètre d. Leur distance centre à centre est h et l représente la moitié de la
largeur de la région formée par les deux sphères qui se chevauchent en rouge
Le volume interdit auquel on ne peut pas accéder est "grossièrement" le volume des petites sphères
environnantes de diamètre d ainsi que le volume des plus grosses sphères de diamètre D donné par VF :
3
π(D + d)
FV = (1.6)
6
Nous définissons h comme la distance entre les centres de deux grandes sphères. Pour des calculs plus
précis, ce volume doit être diminué du volume superposé VO ce qui conduit à un volume réduit VF :
2 2πl 3(D + ré) − l 2
VF = VF − VO = VF − (1.7)
3
ré + dl h
= 2 − (1.8)
2
l représente la moitié de la largeur de la région formée par les deux sphères superposées en rouge
(voir Fig. 1.8).
La fonction de partition Z pour notre ensemble canonique de petites sphères identiques est :
1
Z = e −β(T+νp) dΓ (1.9)
N!h 3N
1 où β = kBT ,
la N est le nombre total de petites sphères, h la constante de Planck et T la
température, νp l'énergie potentielle et Γ l'espace des phases ou ensemble de Gibbs. Après
réarrangement, résolution de l'intégrale et négligence de l'interaction entre petites et grandes sphères,
on aboutit à :
VN
Z = UNE
(1.10)
N!Λ3N
h avec Λ la longueur d'onde de De Broglie Λ = √ 2πmkBT et VA étant le volume
accessible
par le centre des petites sphères et m leur masse.
L'énergie libre de Helmholtz est définie par :
FH = −kBTlnZ (1.11)
VN
FH = −kBTln N! UNE
(1.12)
Λ3N
En utilisant l'approximation de Stirling qui est valable pour N >> 1, lnN! ≈ Nln N − N
on obtient l'énergie libre de Helmholtz FH :
NΛ3
)) − NkBTln( ) VA(h) (1.13)
FH = −NkBT(1 − ln( V V
A partir de là, deux configurations sont possibles :
Les grosses sphères sont suffisamment séparées pour laisser passer les petites sphères entre elles.
Les grandes sphères sont trop proches et les petites sphères ne peuvent pas se mettre entre elles.
Mathématiquement et dans le même ordre, VA peut être vu comme la différence entre
le volume total V et le volume interdit VF :
VA = V − VF, h ≥ d + D (1.14)

ou alors
π h
VA = V − VF + 2 h < d + D
(D + ré h) 6 ( j + j + ), 2 (1.15)
On peut alors linéariser et approximer :
VF π
(D + ré h) + 2 ( j + j + 2
Virginie
ln( ) ≈ − h ) (1.16)
V V 6V
Comme nous l'avons appris de la thermodynamique :
∂FH
Fdep = − (1.17)
∂h
J
On obtient finalement la force d'appauvrissement Fdep (seulement si les grosses sphères sont assez proches) :
N
Fdep = 4V kBTπ(D + ré − h)(D + ré + h) = −poS (1.18)
Néanmoins, ce modèle montre ses limites dans le cas des GR et demande à être mieux défini. C'est ce que Neu
et Meiselman ont fait, sur la base de la théorie de l'épuisement de Vincent et al. [75].
Profondeur de pénétration et interaction des RBC
Pour un modèle plus précis, les globules rouges ne peuvent pas être considérés comme des sphères dures. Les
globules rouges sont connus pour être des objets très flexibles et leur structure est plus complexe que les sphères.
Le glycocalyx de la cellule est constitué de polysaccharides et les macromolécules environnantes peuvent
pénétrer dans cette couche externe. Cependant, le système est considéré comme non absorbant. Tenant compte
de l'énergie libre élastique des globules rouges mais aussi des forces osmotiques exercées à sa surface par les
macromolécules environnantes, Vincent et al. [75] ont déterminé que l'épaisseur de la couche d'appauvrissement
était :
1 Π 1 ∆ = Π
− + 2 ( ) 2 + 4∆ 2 0 (1.19)
D 2 ré
avec ∆0 l'épaisseur d'appauvrissement pour des concentrations de polymère nulles. Dans le cas du dextrane, il
est pris égal à 1,4 Rg le rayon de giration. Π est la pression osmotique et D est un paramètre dépendant de la
concentration en polymère dans la masse et est donné par :
2kBT b 2Na )
c 3
D = ( 2 (1.20)
∆ 2 M2
0
M2 est le poids moléculaire des macromolécules dans la concentration en solvant et 2 l'essentiel
b
en polymère c. kB et Na respectivement les constantes de Boltzmann et d'Avogadro.
Malgré le manque d'informations sur la profondeur de pénétration, on peut s'attendre à ce que sa forme soit
la suivante :
avant
JC
c 2 p
p = δ(1 − e 2 ) (1.21)
pc 2
_
est la constante de pénétration.
Soit δ l'épaisseur du glycocalyx et d la distance cellule à cellule. L'énergie d'interaction, compte
tenu de la pénétration éventuelle du glycocalyx, est cette fois calculée comme suit :
ré wD = −2Π(∆ − + δ − p) 2 (1.22)
La surface d'un RBC est chargée négativement et, par conséquent, la répulsion électrostatique
doit être prise en compte dans le processus d'agrégation. L'énergie libre électrostatique wE est
la suivante :
On peut distinguer deux cas : d ≥ 2δ
wE = sinh(κδ)e κδ−κd (1.23)
d < 2δ
wE = (2κδ − κd) − e −κδsinh(κδ − κd) − sinh(κδ)e −κd (1.24)
Enfin, sur la base de la théorie de l'épuisement, nous pouvons résumer l'agrégation comme
l'addition à la fois de l'énergie électrostatique wE et de l'énergie d'interaction wD en tenant
compte de la pénétration possible du glycocalyx. On le note wtotal
wtotal = wD + wE (1.25)
Le fait que des macromolécules puissent pénétrer dans le glycocalyx joue un rôle majeur dans
l'explication du comportement dit « en cloche » de l'énergie d'interaction pour une concentration
donnée de macromolécules.
Appauvrissement induit par un polymère idéal
Pour obtenir une meilleure description de notre système, les deux membranes en interaction des globules
rouges peuvent être approchées comme deux plaques et le dextrane comme un polymère idéal avec un
rayon de giration Rg et Mw son poids moléculaire (Fig. 1.9). Du fait de sa géométrie complexe, cette
grandeur est utile pour appréhender la taille d'un polymère donné. Le rayon de giration est la distance
entre un axe de rotation donné et un point de même masse que le polymère doit être placé pour avoir le
même moment d'inertie que ce polymère. Pour le dextran et en utilisant les équations de Kuhn–Mark–
Houwink–Sakurada [76, 77] , il peut être exprimé comme suit :
FIGURE 1.9 : Schéma de déplétion induite par un polymère idéal entre deux
plaques. Le rayon de giration Rg est représenté en rouge et h est la distance
entre les plaques
Rg = 0,66M0,43
w (1.26)
et dans le cas du dextran :
PM = 70000g /mol
En utilisant la même méthodologie que pour le cas à deux sphères, on aboutit à un potentiel d'interaction :
4Rg
W(h) = −nbulkkBT( − h + hχ(h)) √ π χ(h) est le (1.27)
profil de densité de
segment du polymère près des plaques et h le dis
tance entre ces plaques.
8Rg
Pour 0 ≤ h ≤ : √ π
8 −π 2R 2
g
χ(h) = π2 e h 2 (1.28)
Pour h > : √8Rg
π
4Rg
χ(h) = 1 − h √ π (1.29)
Pour simplifier encore le système, il faut garder à l'esprit les travaux d'Eisenriegler [78] qui ont montré que
le potentiel d'interaction des polymères idéaux est le même que pour les sphères dures pénétrables de
diamètre σ. Cela conduit à un potentiel d'interaction qui peut s'écrire comme suit :
Pour h < σ :
W(h) = −nbulkkBT(σ − h) (1.30)
Pour h ≥ σ :
W(h) = 0 (1.31)
En introduisant d comme la distance "centre à centre" entre les cellules et en rapprochant les deux
globules rouges en interaction comme des disques (Fig. 1.10), la zone de contact peut être calculée comme
suit :
FIGURE 1.10 : Représentation schématique de deux disques en interaction de rayon R,
séparés par h la hauteur et d étant la distance centre à centre.
ré 1
S = 2R 2cos −1 ( − 4r 2 − ré 2) (1.32)
2R 2
Après dérivation, la surface infinitésimale est :
ré
− d 2 (1.33)
ddS = − 4r 2 En
branchant 1.33 sur 1.30 on obtient la force en fonction de la distance de recouvrement
d entre les deux globules rouges :
4Rg
F(d) = −nbulkkBT √ π 4R2 − d 2 (1.34)
Rg est le rayon de giration (voir Eq. 1.26), R = 3.7µm comme le rayon des deux disques (rayon moyen d'un
RBC), T la température ambiante et d est la distance entre les deux disques "centre à centre"
Particules en forme de tige
La forme de l'appauvrissement a un effet majeur sur les forces d'appauvrissement. Le fibrinogène est la protéine la
plus longue du plasma et ce modèle peut être intéressant pour comprendre son rôle dans l'agrégation des globules
rouges. Dans notre travail, nous utilisons des particules en forme de bâtonnets également connues sous le nom de
virus Fdwt en tant que déplétant pur. Soit L la longueur de la tige et D son diamètre. D'après les travaux de
Lekkerkerker et al. [79], nous approcherons les globules rouges non pas comme de grosses sphères mais comme
de grandes plaques, parallèles les unes aux autres. On considère que les tiges sont infiniment minces et donc L»D
(Fig. 1.11)
FIGURE 1.11 : Schéma représentant deux plaques séparées par une
distance h en présence d'un appauvrissant en bâtonnets de longueur L et G
étant leur centre de masse
Ici, nous avons utilisé la méthode de la force pour trouver l'énergie d'interaction en fonction de la
distance entre deux plaques.
Si une tige est en contact avec la paroi, la distance entre son centre de masse G et cette paroi
donnée est inférieure à L/2 et l'angle de contact est :
X
θx = acos( (1.35)
L/2)
x étant la distance horizontale au mur. En passant aux coordonnées sphériques, la densité
numérique à l'extérieur des plaques no est donc :
π/2
non = nvrac sinθdθ = nbulk (1.36)
0
nbulk étant la densité numérique en vrac et :
Na
nvrac = cb (1.37)
Mw
Et la pression osmotique, à une température T, à l'extérieur des plaques Po peut se résumer ainsi :
Po = nbulkkBT (1.38)
A l'intérieur des plaques, le nombre de configurations est en quelque sorte limité par la plaque opposée.
Par conséquent, la densité numérique à l'intérieur des plaques doit être divisée en deux cas et la pression
osmotique résultante à l'intérieur des plaques Pi est :
Pour h [0, L] :
π/2
Pi = nbulkkBT h sinθdθ = nbulkkBT (1.39)
L
θh/2
Pour h > L :
Pi = nbulkkBT (1.40)
Enfin, on obtient la force d'appauvrissement Fdep qui est attractive entre les plaques :
Fdep(h) = Pi − Po = −nkBT(1 − h ) (1.41)

L
Pour h > L :
Fdep = 0 (1.42)
Et son potentiel d'interaction associé après intégration de la force de déplétion :
1 2
(L − h)
W(h) = − nvrackBT 2 (1.43)
L
et à l'extérieur des plaques :
W(h) = 0 (1.44)
Maintenant, en branchant 1,33 à 1,43, la force résultante pour deux globules rouges en interaction avec un
distance centre à centre d est :
1
F(d) = − nbulkkBTL 4R2 − d 2 2 (1.45)
et dans notre cas : L = 880nm , R le rayon des disques, moyenné à R = 3,7 µm (rayon d'un
RBC) et nbulk la densité numérique en vrac (voir Eq. 1.37). Pour le virus Fd, Mw = 1,64 107g/mol
Plus tard, la théorie de la déplétion a suscité un intérêt croissant dans la communauté hémorhéologique
et l'interaction entre les globules rouges a été décrite en s'inspirant de cette théorie [80, 58]. Il promeut l'idée
de deux globules rouges interagissant entre eux en raison de la différence de pression osmotique causée par
les macromolécules environnantes.
1.6 Résumé
Dans ce chapitre d'introduction, le contexte et la motivation concernant la recherche sur le sang sont apportés.
Le sang a été décrit à partir de son principal constituant, le plasma, jusqu'à des composés plus détaillés tels
que les cellules qui le constituent. Nous nous sommes plongés dans la structure complexe d'un GR qui est le
principal objet biologique que nous avons étudié dans cette thèse. Par ailleurs, nous nous concentrons sur un
phénomène qui se déroule dans notre corps : l'agrégation. Les connaissances actuelles sont exposées grâce
à une revue de littérature approfondie. Les deux modèles plausibles, à savoir le pontage et l'épuisement, pour
décrire ce phénomène sont discutés ainsi que les questions qui doivent encore être élucidées. Une description
mathématique du modèle de pontage et des calculs partant de la base de l'épuisement jusqu'à des concepts
plus complets sont détaillés.
29
Chapitre 2
matériel et méthodes
Le travail du sang demande un soin particulier pour être étudié correctement. Les méthodes de
manipulation des cellules sanguines et en particulier des globules rouges sont ici détaillées depuis
leur prélèvement jusqu'à la préparation de l'échantillon. Des techniques expérimentales sont
également présentées dans ce chapitre. À partir de dispositifs microfluidiques, la fabrication de
puces pour l'étude des globules rouges en flux est décrite. Cette méthode peut être combinée avec
des pinces optiques, pour une manipulation non invasive des cellules mais aussi pour les mesures
des forces mises en jeu entre les globules rouges. Différentes méthodes d'étalonnage pour mesurer ces forces afin d
ensemble avec une présentation détaillée des deux configurations expérimentales sont ici exposés.
Matériel et méthodes
Le travail avec le sang nécessite un soin particulier pour être bien étudié. Les méthodes de
manipulation des cellules sanguines et en particulier des globules rouges sont ici détaillées depuis
leur prélèvement jusqu'à la préparation de l'échantillon.
Des techniques expérimentales sont également présentées dans ce chapitre. En mençant par les
dispositifs microfluidiques, la fabrication de puces pour l'étude des globules rouges en écoulement
est décrite. Cette méthode peut être combinée avec des pinces optiques, pour une manipulation non
invasive des cellules mais aussi pour la mesure des forces engagées entre les GR. Différentes
méthodes de calibrage pour mesurer ces forces ainsi qu'une présentation détaillée des deux exposés
expérimentaux sont ici exposés.
Materialien und Methoden
Die Arbeit mit Blut erfordert besondere Sorgfalt, um gut untersucht zu werden. Die Methoden zum
Umgang mit Blutzellen und insbesondere mit Erythrozyten werden
30 Chapitre 2. Matériel et méthodes
hier von der Entnahme bis zur Probenvorbereitung detailliert beschrieben. Auch experimentelle
Techniken werden in diesem Kapitel vorgestellt. Ausgehend von mikrofluidischen Geräten wird die
Herstellung von Chips für die Untersuchung von RB im Fluss dargestellt. Diese Methode kann mit
einer optischen Pinzette kom biniert werden, für eine nicht invasive Manipulation der Zellen, aber
auch für die Messung von Kräften, die zwischen den Erythrozyten wirken. Verschiedene Kalib
rierungsmethoden zur Messung dieser Kräfte zusammen mit einer ausführlichen Darstellung beider
Versuchsaufbauten werden hier vorgestellt.
2.1 Manipulation du sang
2.1.1 De la piqûre au doigt au sang veineux
Pour les petits volumes de sang, la méthode de la piqûre au doigt est la plus rapide pour obtenir du
sang frais d'un donneur. Nous pouvons collecter jusqu'à des centaines de microlitres. Il est très
adapté aux expériences de pincettes optiques puisque seule une petite quantité de globules rouges
« frais » est nécessaire à cet effet. Le bout du doigt est percé à l'aide d'un petit appareil (le même que
pour les patients diabétiques). Avant et après la procédure, les mains sont désinfectées avec une
solution d'alcool à 70%. Le sang prélevé peut ensuite être remis en suspension dans diverses solutions.
Lorsque des volumes plus importants sont nécessaires, le sang peut être prélevé par ponction
est insérée dans la veine et le sang estveineuse. Une aiguille ® reliée à un vacutainer MONOVETTE
recueillies en raison de la différence de pression entre le tube et la veine du volontaire.
Cette méthode est nécessaire pour collecter du plasma, du sérum ou d'autres cellules sanguines
moins présentes dans le sang telles que les globules blancs, par exemple. Plusieurs anticoagulants
sont disponibles et sont déjà enrobés sur les parois internes des tubes. Soit K3 − EDTA, Li − héparine
ou Na2H − citrate pour empêcher la coagulation. Très peu de littérature peut être trouvée sur l'effet
de l'anticoagulant sur les propriétés physiques des globules rouges. Néanmoins, les mesures
réalisées avec LORCA montrent qu'aucun effet significatif n'a pu être rapporté sur la déformabilité et
l'agrégation des globules rouges [14].
2.1.2 Préparation du sang
Après prélèvement, le sang est centrifugé à 1800 g pendant 10 min pour obtenir trois couches
distinctes. La première couche contenant le plasma avec toutes les protéines (albumine, fibrinogène,
γ globulines,...) est isolée et mise en aliquotes. La couche médiane n'a pas d'intérêt dans cette thèse
et est généralement écartée. Enfin, la couche inférieure avec les globules rouges est
2.1. Manipulation du sang 31
récupérés et remis en suspension dans une solution tampon. Les globules rouges sont lavés deux fois.
Cette procédure consiste à mélanger les globules rouges avec une solution tampon (PBS), à centrifuger
avec la même force G/temps comme indiqué cidessus et à éliminer le surnageant (PBS dans ce cas).
2.1.3 Solutions tampons
Les globules rouges sont souvent lavés ou remis en suspension dans des solutions tampons. La solution
la plus courante est probablement la solution saline tamponnée au phosphate (PBS), mais elle n'est peut
être pas la plus adaptée à long terme. En effet, ces solutions visent à préserver la forme et les propriétés
physiques des globules rouges en préservant leur intégrité. Une bonne solution tampon répond à 3
critères : pH, osmolalité et maintien des nutriments. Bien qu'il en ait deux, PBS, par exemple, n'a pas le
troisième. Le pH doit être maintenu similaire à la valeur du pH plasmatique = 7,4 car une solution tampon
acide peut conduire à moins de déformabilité [81]. Les solutions tampons comme HEPES sont connues
pour leur stabilité du pH. C'est l'une des raisons de sa large utilisation en culture cellulaire.
L'osmolalité doit être soigneusement contrôlée. Les globules rouges sains conservent leur forme
biconcave si l'osmolalité est comprise entre 290 et 310 mOsm. Ceci est particulièrement pertinent lorsque
vous travaillez avec du fibrinogène, par exemple. Certaines protéines sont généralement vendues avec
du sel pour éviter leur dégradation et afin de les conserver plus longtemps. Ceci est problématique dans
un sens car cela augmente l'osmolalité du tampon. Étant donné que la masse de sel dans le récipient
n'est généralement pas spécifiée avec précision, il faut ajuster l'osmolalité de la solution tampon. Trois
types de solutions pour les globules rouges peuvent être distingués :
• Isotonique : Cela correspond aux solutions dans lesquelles le volume des globules rouges n'est pas
modifié comme le plasma par exemple. En effet, aucun échange d'eau ne peut être observé à
travers la membrane de la cellule. La cellule conserve sa forme discocytaire. (Fig. 2.1 (b))
• Hypertonique : Il y a un échange d'eau de l'intérieur de la cellule vers l'extérieur. Ceci vise à
contrebalancer une concentration trop élevée de soluté à l'extérieur de la cellule. La forme
caractéristique d'un RBC dans une telle solution est un échynocyte (Fig. 2.1 (a))
• Hypotonique : Pour les solutions à trop faible concentration en soluté, l'apport d'eau par la cellule
devient plus important. On observe, dans ce cas, majoritairement des sphérocytes (Fig. 2.1 (c)).
Certaines cellules peuvent même « exploser » en libérant leur contenu.
Ce phénomène s'appelle la lyse.
FIGURE 2.1 : Représentation tridimensionnelle de : (a) un échynocyte (cellule crénelée)
(b) un discocyte (forme normale d'un globule rouge) et (c) un sphérocyte
Pour un stockage plus long, les globules rouges ont besoin de nutriments de maintien (généralement du
glucose). Les solutions tampons comme le tampon de Tyrode l'incluent généralement dans la préparation. Les
globules rouges ne transportent que de l'oxygène et ne l'utilisent pas pour produire leur énergie. L'adénine
triphosphate (ATP), le vecteur énergétique des globules rouges, est libéré par la glycolyse.
2.1.4 Traitement de l'effet de verre
L'« effet de verre » [82] se produit lorsque les globules rouges sont en contact avec une surface artificielle.
Les globules rouges discocytaires sains se transforment en échinocytes. Cette crénelure des globules rouges est
moins présente ou absente lorsque les globules rouges sont dans leur milieu natif. Pour l'éviter, nous préparons une
solution à 1% d'albumine sérique humaine (HSA) dans de l'eau distillée. Il est connu que la HSA inhibe l'agrégation
des globules rouges. La surface sur laquelle reposent les globules rouges peut être passivée en utilisant cette
solution comme revêtement. Après séchage, seule la HSA reste en surface.
2.1.5 Stockage du sang
Sauf indication contraire, toutes les expériences ont été réalisées avec du sang frais. Cependant, en raison de
réglementations de laboratoire ou de mesures de longue durée, il peut arriver que le sang doive être stocké et que
les propriétés des globules rouges soient altérées [83]. Par exemple, nous stockons parfois du plasma autologue car
il peut être utilisé pour remettre en suspension les globules rouges. Nous suivons la procédure conventionnelle
utilisée par les banques de sang et congelons le plasma en aliquotes de 2 ml sous 18 ° C pour une utilisation
ultérieure [84]. Concernant les GR, cela dépend vraiment des propriétés qui sont étudiées. Pour les mesures
microfluidiques, la déformabilité et la rigidité des globules rouges peuvent être intéressantes. Selon Uykulu et al. [85],
les globules rouges pouvaient être conservés jusqu'à 6 heures à température ambiante sans aucun changement
significatif mesurable par ékacytomètre. Un temps de stockage plus long a tendance à durcir les globules rouges.
Pour les mesures de pincettes optiques où la (dés)agrégation est mesurée, ce temps de stockage peut être prolongé
jusqu'à 12 heures si les globules rouges sont stockés à 4 °C.
2.2. Microfluidique 33
2.2 Microfluidique
2.2.1 Configuration microfluidique
Pour réaliser des expériences microfluidiques, un ELVEFLOW Il © dispositif microfluidique est utilisé.
applique une chute de pression précise et pousse un fluide à travers une puce microfluidique.
À l'aide d'un objectif à immersion d'huile x60 et d'une caméra à grande vitesse, des séquences d'images
peuvent être enregistrées (Fig. 2.2). Pour faciliter les expériences, l'éclairage, le dispositif microfluidique
ainsi que la caméra à grande vitesse peuvent être contrôlés par ordinateur.
FIGURE 2.2 : Configuration pour des expériences microfluidiques. 1 : Caméra
haute vitesse, 2 : Contrôleur de pression, 3 : Microscope inversé, 4 : Joystick
pour platine piézoélectrique XY, 5 : Porteéchantillon, 6 : Interface logicielle, 7 :
Éclairage rouge, 8 : Puce microfluidique, 9 : Sortie d'échantillon.
2.2.2 Préparation des puces microfluidiques
Une plaquette avec la conception de canal souhaitée est utilisée pour la production de puces
microfluidiques. Un élastomère, le PDMS (Polydiméthylsiloxane), est mélangé avec un durcisseur
RTV615 dans un rapport de 1:10. Le mélange fluide est versé dans la plaquette (Fig. 2.3). Pour éviter
la présence d'air à l'intérieur du mélange, la plaquette contenant le mélange est mise sous vide en
appliquant une pression négative. Après 30 min, le système est ramené à la pression atmosphérique et
mis à l'étuve à 75°C pendant au moins une heure. La puce PDMS durcie peut ensuite être coupée et
retirée de la plaquette. La dernière étape consiste à coller la puce PDMS sur un verre microscopique
faire glisser. La lame microscopique est nettoyée une fois à l'isopropanol puis à l'eau avant d'être
séchée à l'air comprimé. Enfin, la lame microscopique et la puce PDMS sont placées dans une
chambre à plasma pendant 30 s avant d'être collées ensemble.
Ces étapes peuvent être répétées autant de fois que l'on veut produire des puces. Le résultat final
après toutes ces étapes est montré sur la Fig. 2.3.
FIGURE 2.3 : Photographie d'une plaquette contenant le mélange de PDMS
et d'agent de durcissement (à gauche) et la puce microfluidique finale après
l'avoir collée sur une lame de verre avec exposition au plasma (à droite)
2.3 Pinces optiques
2.3.1 Historique et principe
Au XVe siècle, Léonard de Vinci a apporté l'idée d'une voile mobile utilisant l'énergie du soleil. Deux
siècles plus tard, Johannes Kepler fut le premier à parler d'une "pression radiative", en observant que
les comètes ont toujours la queue dirigée à l'opposé du soleil. Au cours de ses recherches aux Bell
Laboratories, en 1970, Arthur Ashkin publie son article [86, 87] dans lequel il rapporte être capable de
piéger des objets de taille micronique en utilisant la même pression de radiation. En 2018, il a été
récompensé par le prix Nobel pour ses travaux sur les pinces optiques. C'est une nouvelle méthode
qui a ouvert de nombreuses
2.3. Brucelles optiques 35
opportunités dans le domaine de la biophysique. Pour n'en citer que quelquesuns, il permettait la
manipulation de spermatozoïdes [88, 89], de flagelles bactériens [90] ou encore de virus [91].
Un piège optique peut être obtenu lorsqu'un faisceau est étroitement focalisé à l'aide d'un objectif à
grande ouverture numérique. Trois composantes physiques entrent en jeu : la réfraction, la pression de
rayonnement et le champ électrique. L'objet piégé doit être transparent car la lumière doit le traverser. En
effet, la lumière est porteuse de quantité de mouvement qui, selon la loi de la physique, doit être conservée.
Du fait du profil gaussien du faisceau laser (Fig. 2.4), le centre du faisceau a plus de puissance que sa
périphérie ce qui donne naissance à une force de gradient. Lorsque la lumière déplace hors du centre l'objet,
celuici acquiert de l'élan pour le contrebalancer. C'est la raison pour laquelle la réfraction maintient l'objet
au milieu du faisceau. Cependant, cela n'explique pas pourquoi la lumière peut piéger. Une partie de la
quantité de mouvement est absorbée par l'objet qui l'éloigne de la source lumineuse. La première idée était
d'utiliser la gravité pour contrer la force induite par la pression de rayonnement [92, 93] ou deux pièges à
faisceau [86]. Néanmoins, ces montages expérimentaux n'étaient pas très stables. L'idée d'Ashkin d'établir
un piège stable était d'ajouter une lentille forte juste avant l'objet, ce qui peut être facilement réalisé en
utilisant un objectif à grande ouverture numérique. En focalisant le faisceau directement sur l'objet, cela crée
également une force de gradient et pousse l'objet dans la direction opposée (plus près de la source). Les
forces sont représentées schématiquement sur la Fig. 2.4
FIGURE 2.4 : Schéma représentant un faisceau gaussien traversant un
bourrelet et les forces optiques associées. En raison de la géométrie du
faisceau, plus d'énergie est émise au centre, ce qui donne naissance à
une force nette vers le centre dans la direction opposée à celle du
la source.
2.3.2 Holographie : le modulateur spatial de lumière
L'un des principaux composants de nos pinces optiques est l'utilisation d'un modulateur spatial
de lumière (SLM). Différentes manières de générer et d'optimiser des pièges optiques existent
[94, 95]. Elle peut être réalisée via un miroir unique qui réfléchira le faisceau et en déplaçant le
miroir l'opérateur pourra contrôler la position de ce piège unique. Un moyen simple d'obtenir
une configuration à deux pièges consiste à utiliser un polariseur. Cela permet de scinder le
faisceau en deux mais cela permet aussi d'ajuster la force optique en laissant passer une
certaine polarisation. Néanmoins, nous avons choisi de construire nos pinces optiques à l'aide
d'un SLM. Il existe des SLM capables de moduler la phase ou l'amplitude d'un faisceau. Dans
notre cas, nous utilisons un laser monochromatique avec une longueur d'onde de λ = 1064 nm.
Son champ électrique E est régi par l'équation suivante :
−r 2 2 r
w0 −ikz−ik
E(r, z) = E0 e wz w2(z)e
2R(z) + iζ(z) (2.1)
avec r : la distance radiale à l'axe central de la poutre, z : la distance axiale λ , E0 l'amplitude
2πn
à partir de la taille du faisceau, k est le nombre d'onde et k = de la
champ électrique, w0 est le rayon de taille et w le rayon le long du faisceau auquel le
l'amplitude tombe
1
e
, R le rayon de courbure de la poutre et enfin ζ(z) le Gouy
en phase le long de l'axe z.
Nous avons un SLM qui module la phase du faisceau, c'est à dire qu'il va changer le terme
de phase dans l'exposant. Le SLM peut être vu comme une grille constituée de cristaux
liquides. Les propriétés optiques de chaque cristal peuvent être modifiées en appliquant une
tension. L'idée derrière les pincettes optiques holographiques est de créer un motif de phase
sur le SLM (Fig. 2.5 (a) et (b)) de sorte que, lorsque le faisceau laser frappe les pièges SLM, il
peut être généré dans le plan focal du haut numérique . objectif d'ouverture (également utilisé
à des fins d'imagerie comme on peut le voir sur la Fig. 2.5 (c) et (d)). En termes d'amplitudes
complexes, l'amplitude dans le plan focal est simplement la transformée de Fourier de
l'amplitude du faisceau. Cependant, en pratique, la distribution d'intensité dans le plan focal
n'est généralement pas celle attendue. Une solution simple consiste à régler la distribution
d'intensité dans le plan focal (avec la même phase), mais cela ne peut être fait sans modifier
la distribution d'intensité du faisceau. Un tel réglage peut être réalisé par un algorithme passant
par un processus itératif jusqu'à ce qu'il converge vers la tension et la phase souhaitées dans
le plan focal.
Pour ce faire, nous avons trouvé que l'algorithme de GerchbergSaxton [96] était le plus
fiable dans notre cas car il permet un bon compromis entre le temps de calcul de la phase et
la précision spatiale.
Notons que pour obtenir des mesures valides, les pièges générés doivent être
raisonnablement éloignés du faisceau laser non diffracté situé au milieu de la grille SLM.
FIGURE 2.5 : Hologrammes de phase générés pour les pièges optiques 2 (a)
et 4 (b) et leurs images microscopiques associées de billes piégées d'un
diamètre de 5 µm respectivement (c) et (d)
2.3.3 Formalisme mathématique
Selon la taille de l'objet, on peut distinguer deux régimes de piégeage optique. Pour les objets de taille
inférieure à la longueur d'onde du laser tels que D < λ, le système est en régime de Rayleigh. Pour D >
λ, on est dans le régime de Mie.
Puisque l'objet piégé doit être diélectrique, il peut être considéré comme un dipôle. L'élec
composante trique de la force de Lorentz est sous la forme de :
FL = qE (2.2)
Où q est la charge électrique du dipôle et E le champ électrique.
Dans le régime de Rayleigh, la particule piégée peut être approchée comme un point. La force induite
par le laser sur le dipôle est proportionnelle au gradient du champ électrique et donc à l'intensité du
laser. Cette force « gradient » Fg peut s'écrire :
2πr 3n1 m2 − 1
Fg = I (2.3)
c m2 + 2
r est le rayon de l'objet piégé, n1 est l'indice de réfraction du milieu, np est np l'indice de réfraction de
la p. articule
et m l'indice effectif tel que : m = I est l' intensité n1 du laser et c la vitesse de lumière.
La force de diffusion est directement proportionnelle à l'intensité du laser et vaut :
5 128π r 6n1 m2 − 1

Fs = je (2.4)
3λ4c m2 + 2
Pour le régime de Mie, l'optique des rayons peut aider à comprendre comment se produit le piégeage
optique. Ashkin a démontré que dans ce cas la force de gradient Fg et la force de diffusion Fs sont :
n1P 2 sin(2θ − 2φ) + Rsin 2θ
Fg = Rsin 2θ − T (2.5)
c 1 + R2 + 2Rsin 2φ
n1P 2 cos(2θ − 2φ) + Rcos 2θ
Fs = 1 + Rcos 2θ − T (2.6)
c 1 + R2 + 2Rcos 2φ
avec P étant la puissance du rayon, R et T sont respectivement les coefficients de Fresnel en réflexion
et en transmission. θ désigne l'angle d'incidence et φ l'angle de réfraction d'un rayon donné (Fig. 2.6).
Chose intéressante, le coefficient de front correspond à la quantité de mouvement transférée par un
rayon en une seconde.
FIGURE 2.6 : Schéma représentant un faisceau gaussien traversant la lentille
d'un objectif à grande ouverture numérique. Le piégeage est expliqué à l'aide de
l'optique des rayons et des coefficients de Fresnel (T : transmission, R : réflexion
et P : puissance initiale). Dans cette configuration, la force nette pointe vers la
source et le piégeage a lieu.
2.3.4 Montage expérimental
Notre configuration expérimentale actuelle (Fig. 2.7) a été conçue par Achim Jung et Chris tian Ruloff.
Leur travail représente un point de départ pour l'entretien et la
développement ultérieur de pincettes optiques holographiques. Un laser à onde continue avec une
longueur d'onde de λ = 1064 nm a été soigneusement choisi pour empêcher l'absorption de la
lumière par les globules rouges. Le faisceau traverse un expanseur de faisceau constitué de deux
lentilles avant d'être collimaté sur le modulateur spatial de lumière (SLM). Notre SLM fonctionne en
mode phase
FIGURE 2.7 : Schéma simplifié des pincettes optiques holographiques. BE :
extenseur de faisceau, SLM : modulateur spatial de lumière, L1 et L2 :
lentilles, DM : miroir dichroïque, C : caméra, O : objectif à grande ouverture
numérique x60 et S : échantillon. I1 : éclairage principal, I2 : lampe au
mercure, F : filtre fluorescent et M : miroir
2.3.5 Étalonnage
Étalonnage Stokes
Plusieurs procédures d'étalonnage peuvent être utilisées. Le plus pratique et le plus répandu est
probablement le calibrage de Stoke. Elle est basée sur la loi de Stokes qui donne la force exercée
sur un petit objet traîné dans un milieu visqueux. La force peut être
décrit comme suit :
Ftr = 6πηrv (2.7)
où r est le rayon de l'objet sphérique entraîné, η la viscosité dynamique du milieu et v est la vitesse
d'entraînement de l'objet dans le milieu.
Cependant, nous manipulons des globules rouges qui sont connus pour être particulièrement
mous et non sphériques. Pour cette raison, nous adaptons la loi de Stokes en ajoutant deux
facteurs pour la géométrie de l'objet qui diffère d'une perle. Nous devons également tenir compte
de la proximité de la lamelle lors du déplacement de l'objet avec une platine piézo [97].
Ces facteurs peuvent s'écrire :
1
β = − 45 (2.8)
1 − ( un ) +
9 16 h 1 8( un
h
)3 256 ( un
h
)4 − ( un )
1 16 h
5
4 2
3 (α − 1)
K = (2.9)
2α 2−1 2
ln(α + (α − 1)) −α
√ α 2−1
où a : rayon de la sphère entraînée, h : distance de la lame microscopique et α est le rapport entre
le grand et le petit axe d'une ellipse.
La force de traînée corrigée devient alors :
Ftrap = 6Kβπηrv (2.10)
Bruit thermique pour les mesures de rigidité
Sur la base du théorème d'équipartition, on peut calculer la rigidité d'un piège optique.
Pour un système en équilibre thermique, ses énergies mises en jeu sont également réparties.
Cette méthode présente un avantage considérable puisqu'elle est indépendante de la taille ou de
la forme du cordon mais aussi qu'elle s'affranchit de toute mesure de viscosité.
Cependant, il est très sensible aux bruits ambiants. Un objet dans un piège optique peut être
approximé par un potentiel harmonique et contrebalancé par ses fluctuations thermiques.
1 2
KOT < x >= 2 1 kBT (2.11)
2
Ainsi, la raideur d'un piège optique est donnée par :
kBT
KOT = 2 < x (2.12)
>
Avec x la position du centre d'un cordon et T la température absolue. La figure 2.8 montre un
exemple de distribution de la position du centroïde du cordon dans le temps.
(A) Position du centroïde de la perle pour une (B) Répartition spatiale le long de l'axe X pour
puissance de 38 mW 38 mW
(C) Position du centroïde de la perle pour une (D) Répartition spatiale le long de l'axe X pour
puissance de 161 mW 161mW
FIGURE 2.8 : Mesures de rigidité utilisant le bruit thermique et basées sur
la position du centroïde du cordon
En utilisant l'équation, Eq. 2.12 on peut tracer la rigidité d'un seul piège dans la configuration
de mesure (2 pièges) en fonction de la puissance de sortie du laser (Fig. 2.9).
La relation entre les deux grandeurs suit une tendance linéaire. Même si des intensités laser plus
élevées peuvent être atteintes, elles ont été écartées car elles ne sont jamais utilisées dans nos
études sur les globules rouges. Il s'agit principalement d'éviter les effets d'échauffement ou
d'endommagement de la membrane du RBC (hémolyse, déformation en poire, ...), Une autre
raison, plus pratique, concerne la limite que notre SLM peut subir.
FIGURE 2.9 : Étalonnage de la rigidité par la méthode du bruit thermique pour
un piège généré en fonction de la puissance du laser
Étalonnage billescellules
L'étalonnage des pinces optiques à l'aide de billes a été assez largement étudié [98, 99, 100].
Néanmoins, en termes de forces appliquées sur les globules rouges, cela est sujet à discussion.
En fait, le piégeage des globules rouges diffère du piégeage d'un objet sphérique quasi parfait tel que
des perles. Dans le cas des globules rouges, c'est l'hémoglobine qui est piégée et donc, les forces
appliquées sur la cellule doivent être reconsidérées. Pour ce faire, nous avons attaché une perle de
verre de 5 µm de diamètre à une cellule pour plusieurs puissances de piégeage, comme illustré à la Fig. 2.10.
FIGURE 2.10 : (a) Schéma expérimental et (b) de l'étalonnage de la force à
l'aide d'une bille de 5 µm et d'un RBC soulevé à 15 µm de la lamelle couvre
objet.
Grâce aux méthodes exposées cidessus, la raideur et la force appliquée sur un bourrelet sont bien
déterminées. Nous avons approché la cellule comme un corps solide, ce qui est raisonnable pour de
faibles forces de piégeage. Nous avons observé que pour une longue durée de piégeage et des
puissances P plutôt élevées (P> 5 min et P> 150 mW), les globules rouges peuvent s'allonger.
FIGURE 2.11 : Graphiques de sortie pour l'étalonnage de la cellule de billes
avec une puissance laser de 38 mW. Les lignes pointillées (cellule) et noires
continues indiquent la position du piège pendant la procédure de mesure.
La courbe rouge montre la position du bord de la cellule et la courbe bleue
le centre du cordon au fil du temps. Les flèches représentent les signaux
de synchronisation
Avant les mesures, nous avons vérifié que la position des deux pièges (un pour le cordon, un
autre pour le bord de la cellule) générés par l'ordinateur ont une distance bien définie entre eux.
La caméra a commencé à enregistrer à 30 images par seconde et a été synchronisée avec la
première étape. Deux flèches sur la Fig. 2.11 montrent le signal de synchronisation. Le piège près
du bord de la cellule ne bouge pas.
Par conséquent, la ligne en pointillés montre toujours la même position. Le piège retenant la bille
se déplace relativement au piège retenant la cellule avec des pas spatialement et temporellement
réguliers. Les pas choisis étaient : dsteps = 50 nm et tsteps = 7 s. Nous avons trouvé celuici
raisonnable, car il nous permet d'avoir une résolution souspixel et il laisse suffisamment de temps
au système pour revenir à l'équilibre. La Fig. 2.11 montre un exemple de graphique de sortie.
A l'équilibre, on a l'équation suivante :
−kcell∆xcell = −kbille∆xbille (2.13)
où ∆xcell et ∆xbead sont la différence de position le long de l'axe X entre 2 images consécutives
de la position du bord et de la position du cordon, respectivement. kbead est la constante
d'élasticité du piège appliqué sur le bourrelet déterminée comme mentionné dans la section 2.3.5.
Enfin, kcell est la constante du ressort liée à la force appliquée sur le
RBC. Pour nos expériences et sur une plage de puissance (inférieure à 350 mW), nous avons trouvé
que la relation entre était :
∆xbille
kcell = kbille ∆xcell (2.14)
2.3.6 Procédure de mesure
Afin de mesurer les forces entre deux hématies et d'étudier les mécanismes d'interaction, nous avons
établi deux protocoles. Un pour l'agrégation et un autre pour la désagrégation.
Agrégation
Deux globules rouges sont sélectionnés à l'aide de 4 pièges optiques générés. Chaque cellule possède
un piège à son extrémité (2 pièges par cellule). La distance entre deux pièges "extrémaux" est de 6µm
et la distance séparant le haut des pièges du bas est de 8µm (a). Le RBC du bas reste statique tandis
que celui du haut est mis en contact (b). La distance de recouvrement entre les cellules est déterminée
par notre programme. Les deux pièges du milieu sont supprimés (c) une fois que les cellules ont trouvé
un équilibre. Ensuite, nous diminuons progressivement la puissance du laser, ce qui signifie que la
force appliquée sur la cellule diminue également (d). Un script est exécuté pour s'assurer que les pas
de tempsforce sont constants. Dans la plupart des mesures et sauf indication contraire, nous utilisons
des pas de 0,5 pN toutes les 5s. Cela permet au système de s'équilibrer. A un certain moment, les
globules rouges s'agrègent spontanément car la force pour les empêcher de s'agréger n'est pas assez
élevée (Fig. 2.12). C'est cette force que nous appelons force d'agrégation FA.
FIGURE 2.12 : Timelapse montrant la procédure de mesure de la force pour
l'agrégation entre deux globules rouges sélectionnés.
Les points rouges représentent la position des pièges optiques
Désagrégation
Pour mesurer la désagrégation, on part de la même configuration que pour les mesures d'agrégation.
Un piège est placé à chaque extrémité du RBC (a), les cellules sont
réunis (b) et les pièges du milieu sont retirés (c) jusqu'à ce que les cellules soient à l'équilibre.
Pour connaître la force de désagrégation FD, on fixe la puissance du laser et donc aussi la force. Nous
commençons alors à tirer avec une vitesse constante par étapes (d). Deux scénarios sont alors
possibles. Soit les cellules se séparent(e) soit elles ne le font pas. Dans la plupart des solutions
(dextrane, plasma, sérum, ...), une fois que les cellules se sont remises en place, elles ne peuvent plus
être séparées et de nouvelles cellules doivent être prélevées pour les mesures (Fig. 2.13). C'est la
raison pour laquelle, nous avons besoin de scanner plusieurs forces pour avoir une bonne estimation
de la force de désagrégation FD. Nous considérons arbitrairement FD comme étant la force à laquelle
plus de 70 % des paires peuvent être séparées (sauf indication contraire) pour ne pas avoir de
représentation "probabilistique" de la force.
FIGURE 2.13 : Timelapse montrant la procédure de mesure de la force pour
la désagrégation entre deux globules rouges sélectionnés.
Les points rouges représentent la position des pièges optiques
2.3.7 Effet des pièges laser sur l'hémoglobine
Il faut garder à l'esprit que les globules rouges sont des objets biologiques et donc plus sensibles à la
pression de radiation que les objets inertes. Lors de nos mesures, nous veillons toujours à optimiser le
temps des mesures pour ne pas endommager les globules rouges. De plus, notre laser est dans le
domaine infrarouge (λ = 1064 nm) et vise à limiter l'absorption de la lumière par l'hémoglobine enfermée
dans la membrane des globules rouges. Les courbes B et C (sur la Fig. 2.14) sont représentatives de
l'hémoglobine la plus importante présente dans les globules rouges humains. La carboxyhémoglobine
(A) et la méthémoglobine (D) peuvent être négligées car elles constituent moins de 2 % de l'hémoglobine
totale présente dans les globules rouges. Le premier peut atteindre des niveaux plus élevés (jusqu'à
9%) pour un fumeur car il est synthétisé lorsque le monoxyde de carbone est inhalé, le second provient
principalement de certains aliments ou médicaments.
FIGURE 2.14 : Absorption de la lumière par A : carboxyhémoglobine, B :
désoxyhémoglobine (Hb) C : oxyhémoglobine (HbO2) et D : méthémoglobine
pour différentes longueurs d'onde obtenues par spectrophotomètre de [101]
Néanmoins, nous avons réalisé des expériences avec le piège non diffracté qui est le plus
puissant que nous puissions obtenir pour voir la déformation des globules rouges sous haute
puissance et mieux prévenir l'éventuelle altération des globules rouges lors des mesures (Fig. 2.15).
FIGURE 2.15 : GR unique piégé dans du plasma autologue avec le piège
laser non diffracté. Formes possibles pouvant être observées de puissance
faible (<300 mW) à élevée (jusqu'à 500 mW) : (a) cavité bicon, (b) forme de
« poire », (c) trilobe et (d) globules rouges hémolysés
Toutes les mesures de (dés)agrégation nécessitent rarement des puissances laser supérieures
à 300 mW. Cependant, le temps de piégeage joue un rôle. Nous avons observé que pour les
mesures de vol du piège non diffracté (expériences d'adsorption), certains changements de forme
peuvent se produire pour des durées de piégeage de l'ordre de la minute. La plupart du temps, les
globules rouges prennent une forme dite en « poire », comme le montre la figure 2.15 (b). La forme
trilobée comme on le voit sur la Fig. 2.15 (c) est plus rare. Après une trop longue exposition au laser,
la cellule s'hémolyse et libère son hémoglobine (Fig. 2.15 (d)).
2.4 Analyse d'images
Dans cette thèse, divers algorithmes sont utilisés pour la soustraction de fond ou la détection d'objets.
Elle repose souvent sur la segmentation d'images, c'estàdire l'extraction de régions d'images
correspondant à des objets ou des zones d'intérêt. Ceci est particulièrement utile pour suivre les particules
mais aussi pour éviter les analyses manuelles qui peuvent être répétitives et chronophages. Il existe de
multiples méthodes de segmentation avancées telles que : le thresh olding [102, 103], le region growth
[104] ou encore le « Merge and split » [105, 106]. L'une des méthodes de base utilisées dans ce travail
est basée sur le seuil de l'image en utilisant la méthode d'Otsu [107]. La figure 2.16 montre un bon exemple
de la méthode d'Otsu. La plupart des images expérimentales sont des images dites en noir et blanc mais
en fait chaque pixel correspond à une valeur comprise entre 0 et 28 − 1 voire 216 − 1 pour les caméras
plus sensibles. Les zones sombres ont des valeurs faibles et les zones claires des valeurs élevées. La
segmentation basée sur la méthode d'Otsu regroupe les pixels dont la valeur est supérieure ou inférieure
à un seuil sélectionné.
FIGURE 2.16 : (a) Microphotographie de deux globules rouges piégés et (b) sa
segmentation associée à l'aide de la méthode d'Otsu
2.5 Résumé
Ce chapitre présente les méthodes physiques utilisées pour étudier les propriétés des globules rouges.
Des protocoles possibles pour prélever du sang avec une manipulation appropriée sont également décrits.
Deux techniques expérimentales sont exposées : les pinces optiques et la microfluidique. Le premier dédié
à l'étude de l'agrégation au niveau d'une seule cellule et le second à l'observation des propriétés des
globules rouges en flux. Après avoir illustré les deux configurations expérimentales, le protocole de mesure
(dés) agrégation des globules rouges par OT a été spécifié avec la procédure d'étalonnage des forces pN.
Enfin, la procédure de fabrication des puces microfluidiques mais aussi la manière dont les expériences
ont été réalisées sont exposées.
49
chapitre 3
L'adsorption des macromolécules
revisitée
Pour élucider si le pontage ou l'épuisement peut mieux expliquer l'agrégation des globules
rouges, il faut vérifier si l'adsorption se produit sur la membrane des globules rouges. Une étude
plus approfondie basée sur ces travaux, incluant ce chapitre, a été publiée [108]. Le modèle
d'appauvrissement suggère que la zone de contact entre deux globules rouges agrégés est
appauvrie en protéines. Considérant maintenant l'hypothèse de pontage, on peut s'attendre à
ce que des sites de liaison existent à la surface des globules rouges sur lesquels des protéines
peuvent être attachées. Même si l'adsorption de macromolécules sur les globules rouges a déjà
été observée grâce à différentes méthodes telles que : la microscopie électronique [109], le
radiomarquage [62, 110], le marquage fluorescent [111] ou la mesure du potentiel zêta [110], il
a été question aux artéfacts potentiels tels que le fluide emprisonné[28]. La méthode proposée
ici offre un moyen polyvalent de détecter l'adsorption de macromolécules (ici dextran) sur les
globules rouges en combinant des pinces optiques avec une plateforme microfluidique. Cela
peut se faire en incubant les globules rouges dans une solution de macromolécules et en
changeant rapidement de milieu grâce à un piège optique entraînant la cellule à contrecourant.
Une adsorption immédiate de 104 molécules par cellule a été quantifiée et lors de l'incubation
des globules rouges avec du dextran, une multiplication par dix progressive de l'adsorption a été constatée.
3.1 Quantification au niveau de la cellule unique de dextran sur RBC
La configuration expérimentale utilisée pour quantifier l'adsorption de dextrane sur un seul RBC
était similaire à celle utilisée dans un travail précédent [112]. La conception initiale de
l'expérience a été imaginée par Kisung Lee et Evgeny Shirshin. Mon travail expérimental est la
continuation des expériences de Nataliya Rovnyagina (de l'Université d'État Lomonossov de
Moscou) et a contribué à rendre la technique plus fiable. Une grande partie de ce chapitre a
déjà été publiée [108]. Il est basé sur le microscope inversé (TE 2000, Nikon, Japon), et la
disposition schématique de la configuration est la
50 Chapitre 3. L'adsorption des macromolécules revisitée
identique à celui décrit dans la section matériaux 2.3.4 de cette thèse. Des pièges optiques ont
été formés à l'aide d'un faisceau laser d'un laser Nd: YAG monomode (1064 nm, 1,5 W, Ventus
1064, Laser Quantum, RoyaumeUni) réfléchi par le modulateur de lumière spatiale à cristaux
liquides nématiques alignés parallèlement (PALSLM, PPM X8267 15, Hamamatsu Photonics,
Japon) et focalisé avec un objectif à immersion dans l'huile à grande ouverture numérique (NA
1.40, 60x, Nikon, Japon). Nous avons utilisé une puissance laser jusqu'à 40 mW au point focal.
A longueur d'onde et puissance données, l'échauffement de l'échantillon peut être considéré
comme négligeable [18]. Les positions des pièges ont été contrôlées indépendamment dans le
plan XYZ dans le plan focal de l'objectif à l'aide de PALSLM. Le contrôle visuel (en mode réflexion)
des objets piégés et la détection de l'intensité de fluorescence de l'échantillon ont été effectués
dans une configuration de transmission à l'aide de la caméra CMOS (ORCA Flash 4.0 V3,
Hamamatsu, Japon). Lors de la mesure du signal de fluorescence, le temps d'exposition a été fixé
à 33 ms et un regroupement 4 × 4 des images a été utilisé. L'excitation et l'enregistrement de la
fluorescence ont été effectués à l'aide d'une lampe à mercure (HB 10103AF, Nikon, Japon) et d'un
cube dichroïque FITC (filtre à isothiocyanate de fluorescéine, Nikon, Japon) avec une excitation
de 480/30 nm et des bandes d'émission de 535/45 nm, en conséquence. . Deux valeurs d'intensité
d'excitation ont été utilisées : I0 ≈ 5 mW, lorsqu'aucun filtre n'était utilisé, et I0/24, lorsque le filtre
ND était installé. Lors de la mesure du signal de fluorescence des molécules de dextrane
adsorbées sur les globules rouges, l'intensité d'excitation a été fixée à I0, sauf mention contraire.
Dans le cas des mesures d'étalonnage avec des billes de fluorescence, l'intensité d'excitation a
été fixée à 10/24. Un système de contrôle de débit microfluidique (MK1, ELVEFLOW©, France) a
été utilisé pour pomper les échantillons à travers
le dispositif microfluidique.
Le protocole de préparation des échantillons était le suivant : (1) une solution de dextrane
fluorescent (20 mg/ml, dextrane conjugué au FITC 70 kDa, Sigma, n° de catalogue 46945) a été
préparée dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS, pH 7,4, 290 mOsm,
INVITROGEN); (2) du sang a été prélevé par la méthode de piqûre au doigt (voir 2.1.1) et une
petite quantité a été ajoutée à la solution de dextran pour atteindre la concentration finale de
globules rouges 0,05 % ; (3) la suspension a été incubée à 22°C pendant un certain temps et
utilisée pour les mesures. Pour les expériences avec préincubation, les cellules ont été conservées
dans du PBS pendant 120 minutes, puis remises en suspension dans la solution de dextrane
fluorescente suivie d'une incubation supplémentaire pendant une durée donnée. La cuvette
expérimentale était constituée d'un microcanal S2 (Fig. 3.1 (a)) connecté à une chambre ou "piscine" S1 (Fig. 3.1 (b)).
La chambre était beaucoup plus grande (3x2x0,5cm) que le microcanal (100x40x30µm), qui était
relié à une micropompe et servait à maintenir deux solutions différentes. La puce à microcanaux
a été fabriquée à base de PDMS (polydiméthylsiloxane) et fixée sur le verre de couverture en
borosilicate. La plus grande chambre était également couverte
3.1. Quantification au niveau de la cellule unique du dextran sur RBC 51
avec un couvercle en verre pour éviter l'évaporation. Le rinçage doux d'une solution du microcanal vers la
chambre a permis de maintenir deux solutions différentes.
En raison de la différence significative des volumes, nous pourrions négliger les changements de
concentration de la solution dans la chambre.
FIGURE 3.1 : (a) Puce microfluidique utilisée pour étudier l'adsorption de
macromolécules sur les globules rouges.(1) : Zone d'observation située à environ
500 µm de la "piscine" (S1), (2) canal de résistance pour diminuer la vitesse
d'écoulement et (3) entrée où la solution tampon est injectée. (b) Esquisse
représentant un seul RBC traîné d'une solution de macromolécule (dans le "pool"
S1) vers une solution tampon "S2"
Le microcanal (S2) (Fig. 3.1 (a)) a été initialement rempli de solution PBS, après quoi 200 µL de
suspension de globules rouges dans une solution de dextrane fluorescent ont été placés dans la chambre
(S1). La diffusion a été empêchée en rinçant en continu S2 vers S1 à une vitesse d'écoulement vf lush =
20 µm/s. Des mesures de test
minutes
ont montré
et la vqf
u'à
fluorescente
la donnée
luxuriante
la diffusion n'a pas lieu pendant au moins 30
signal dans S2 reste presque au niveau du bruit. Afin de mesurer l'adsorption du dextran, nous
avons piégé un seul RBC avec la pince à épiler laser, et l'avons soulevé de 15 µm par rapport à la
surface, et l'avons rapidement transféré de la plus grande chambre dans le microcanal (voir Fig.
3.1 (b) ). Ensuite, le signal de fluorescence a été enregistré comme indiqué sur la figure 3.1 (b).
Pour s'assurer que la fluorescence observée des globules rouges est due à l'adsorption de
dex tran, mais pas au détachement du FITC de la macromolécule de dextran et à son adsorption
sur les globules rouges, nous avons effectué un test supplémentaire en utilisant une filtration de 3
kDa et une chromatographie d'exclusion de taille, et confirmé que il n'y a pas de désorption FITC
du dextrane, du moins sur l'échelle de temps d'une expérience typique. Du dextrane conjugué au
FITC de 70 kDa (Sigma, n° de catalogue 46945) a été utilisé dans les expériences d'adsorption.
Avant les mesures, nous avons vérifié l'absence de FITC libre dans la solution de dextran et
l'absence de désorption de FITC à partir de dextran avec le temps. Pour cela, un filtre centrifuge
de 3 kDa (Amicon Ultra, Sigma) a été utilisé. La solution de dextrane de 70 kDa marqué par
fluorescence (20 mg/ml dans du PBS) a été filtrée à travers une membrane de 3 kDa, et la
fluorescence de la solution après filtration a été mesurée. Il a été observé que seule la partie de la
solution, qui ne traversait pas la membrane, présentait une fluorescence, confirmant ainsi l'absence
de FITC libre ou désorbé dans le système.
Pour les mesures d'étalonnage, des billes de latex de polystyrène modifiées au carboxylate
rouge fluorescent de 2 µm (Sigma, catalogue n° L3030) ont été utilisées . Pour mesurer le profil z
du volume de détection de fluorescence, la bille a été déplacée pas à pas dans le plan vertical à
l'aide du PALSLM sans déplacer l'objectif, c'estàdire que les paramètres d'excitation et de
détection ont été maintenus constants. Le positionnement du piège au centre du faisceau
d'excitation a été effectué en utilisant les coordonnées du point d'intensité de fluorescence maximale
obtenue dans les expériences avec la solution de dextrane. L'erreur a été prise comme écarttype
calculé à partir de trois mesures indépendantes.
L'intensité de fluorescence a été calculée comme la moyenne sur les 25 % de points avec l'intensité
la plus élevée.
3.1.1 Évolution dans le temps de l'adsorption du dextrane sur RBC
La figure 3.2 montre l'évolution dans le temps de l'intensité de fluorescence intégrale normalisée
pour les cellules déplacées du pool (S1) vers le canal avec du PBS (S2). Comme les globules
rouges sont essentiellement non fluorescents sous la longueur d'onde d'excitation utilisée (550
nm), le signal de fluorescence détecté à partir de la zone cellulaire était indicatif de l'adsorption de dextrane.
Après avoir déplacé un RBC individuel de la solution avec du dextran fluorescent vers du PBS,
nous avons pu observer un signal de fluorescence significatif (voir Fig. 3.2, Fig. 3.3 et Fig. 3.4).
Comme dans le canal avec PBS, une désorption du dextrane et un photoblanchiment ont été observés,
qui se sont produits à l'échelle de la minute (voir Fig. 3.3 et Fig. 3.4) ; les valeurs d'intensité de fluorescence
de la Fig. 3.2 ont été prises comme valeurs initiales maximales.
L'intensité d'excitation de la Fig. 3.3 est 24 fois supérieure à celle de la Fig. 3.4, tandis que les temps de
décroissance correspondants sont de 25 et 100 s. Considérant le fait que le taux de photoblanchiment
kblanchiment est déterminé par l'intensité d'excitation I (dans le cas d'un seul fluorophore kblanchiment ≈
I), on peut conclure que la décroissance de l'intensité de fluorescence sur la Fig. 3.4 est principalement
due à la désorption du dextrane par le cellule. D'où le
−1 .
le taux de désorption a été estimé à 0,01 s
FIGURE 3.2 : La dépendance de l'intensité maximale de fluorescence sur le
temps d'incubation : les points noirs et rouges correspondent respectivement à 0
et 135 minutes de préincubation des globules rouges dans du PBS. Les
microphotographies en médaillons illustrent les changements d'intensité de
fluorescence détectés dans le canal avec du PBS. Ici, l'intensité de fluorescence
a été normalisée à la valeur obtenue au premier point. L'intensité de l'excitation
est restée la même et a été estimée approximativement à 5 mW au niveau de
l'échantillon. Les barres d'erreur correspondent à la moyenne sur trois microcanaux
indépendants utilisés dans l'expérience.
FIGURE 3.3 : Signal fluorescent correspondant au blanchiment
FIGURE 3.4 : Signal fluorescent correspondant à la destruction réelle des
macromolécules de dextrane
La cinétique d'adsorption du dextrane a été suivie en mesurant la dépendance du temps
d'incubation du signal de fluorescence. À cette fin, les globules rouges ont été séquentiellement
déplacés vers le canal avec du PBS, et les durées totales d'incubation des cellules correspondent
aux valeurs de l'axe X de la figure 3.2. En conséquence, nous avons observé que l'adsorption de
dextrane augmente progressivement en fonction du temps (Fig. 3.2). Pour étudier l'influence du
prétraitement des globules rouges, la cinétique d'adsorption a été mesurée après 2 et 4 heures de
préincubation des globules rouges dans du PBS. Après préincubation, les cellules ont été remises
en suspension dans la solution fluorescente de dextrane dans la puce microfluidique, et l'évolution
temporelle de l'intensité de fluorescence a été étudiée. Dans ce cas, après une préincubation de 2
heures, le signal initial était proche de celui en l'absence de préincubation, mais augmentait plus rapidement avec
temps. Une préincubation plus longue (4 heures) n'a pas non plus entraîné l'amélioration immédiate du
signal.
Pour l'étape suivante, nous avons visé une estimation quantitative du nombre de molécules ad
sorbées par cellule. Pour cela, la mesure du volume de détection de fluorescence a été réalisée avec des
microbilles.
3.1.2 Quantification du nombre de molécules adsorbées
Tout d'abord, pour obtenir la courbe d'étalonnage, le microcanal a été rempli avec la solution de dextrane
à différentes concentrations et le signal de fluorescence a été enregistré (Fig. 3.5). Pour obtenir la courbe
d'étalonnage, nous avons utilisé le protocole suivant : (1) Le canal vide a été rempli avec la solution de
dextrane fluorescent de concentration différente ; (2) Le signal de fluorescence de l'échantillon a été
mesuré et la valeur initiale (c'estàdire maximale) a été utilisée pour la courbe d'étalonnage. Le signal a
été moyenné sur la zone centrale de l'image avec l'intensité la plus élevée, et cette zone a été sélectionnée
de manière similaire pour toutes les concentrations ; (3) Pour des concentrations plus faibles, l'exposition
a été augmentée et le signal de fluorescence détecté a été divisé par l'amélioration de l'exposition (c'està
dire que les intensités ont été normalisées à l'exposition) ; (4) Après cela, la dépendance de l'intensité de
fluorescence sur la concentration de fluorophore a été tracée (voir Fig. 3.5).
FIGURE 3.5 : Dépendance de la concentration de dextrane sur le signal fluorescent
enregistré
Pour calculer correctement le nombre de molécules qui ont contribué au signal de fluorescence
global, la géométrie du volume de détection a été évaluée. À cette fin, la dépendance en z de
l'intensité de fluorescence (c'estàdire la profondeur de champ) a été déterminée à l'aide de billes
fluorescentes de 2 µm. La perle a été piégée et déplacée dans la direction Z de manière progressive
par rapport au plan focal de l'objectif. Les mesures ont été effectuées dans le microcanal rempli de
PBS. La position du piège a été modifiée en ajustant les paramètres du masque PALSLM tout en
gardant la position de l'objectif constante, ce qui a permis de déplacer le piège par rapport au
faisceau d'excitation sans modifier la géométrie de ce dernier dans l'échantillon (Fig. 3.6).
FIGURE 3.6 : Croquis décrivant la méthode utilisée pour obtenir le volume
de détection en z à l'aide d'un cordon de 2 µm de diamètre
Le signal fluorescent de la perle était suffisamment fort pour utiliser une excitation de faible
niveau et éviter le photoblanchiment dans les échelles de temps de la procédure d'étalonnage.
La dépendance obtenue de l'intensité de fluorescence sur le décalage z est illustrée à la Fig. 3.7.
FIGURE 3.7 : Signal fluorescent enregistré à l'aide d'une perle de 2 µm de
diamètre à différents z
Nous avons supposé que l'intensité d'excitation est constante le long de l'axe Z dans le volume de
détection et le profil Z obtenu est dû au profil de profondeur de champ du système optique du microscope.
Les dimensions latérales et la distribution du profil du faisceau ont été obtenues en traitant les images de
fluorescence de la solution de dextrane.
Ensuite, pour le volume de détection Vdet = 1, 2.105µm3 , qui correspond à 109 molécules de dextrane
à une concentration de 10−3mg/ml, l'intensité de fluorescence intégrale a été calculée comme une somme
sur les points correspondants de l'image obtenue pour la solution fluorescente de dextrane.
Lors de la mesure de l' IRBC de fluorescence à partir des globules rouges, le piège est toujours
maintenu au centre du faisceau d'excitation près du plan focal, c'estàdire que dans ce cas, l'intensité
d'excitation est réglée sur la valeur maximale. En cas de solution de dextrane, le signal est détecté à partir
de points avec une intensité d'excitation et une efficacité de détection différentes. Par conséquent, pour
comparer les signaux des globules rouges et de la solution, l'intensité intégrale mesurée pour la solution a
été normalisée aux distributions d'intensité XY et Z. Enfin, en comparant la valeur d'intensité normalisée
pour une solution de dextrane avec une concentration connue et des globules rouges, le nombre de
molécules adsorbées a été estimé. Cette procédure a donné 2.104 molécules de dextrane adsorbées par
un seul RBC dans le premier
moment, atteignant 105 molécules après incubation (Fig. 3.2).
Pour estimer la sensibilité de notre système de mesure, la courbe d'étalonnage (Fig. 3.5) a
été ajustée linéairement et son interception avec l'axe Y a été obtenue. Cette valeur correspondait
au signal d'environ 100 molécules, par conséquent, cette valeur a été prise comme une erreur
STD (σ) et la limite de détection a été estimée à 3σ (≈ 300 molécules).
Lors de l'évaluation du nombre de molécules adsorbées, on suppose qu'elles sont réparties
uniformément sur la surface des globules rouges. Par conséquent, la fluorescence serait diffusée/
absorbée par la cellule, ce qui affecterait l'intensité enregistrée. À savoir, les longueurs d'onde
d'excitation et d'émission pour FITC s'intègrent dans le spectre d'absorption de l'hémoglobine, et
on pourrait s'attendre à la dépendance du signal détecté sur la géométrie cellulaire. De plus, la
diffusion de la lumière entraînerait une différence des signaux de fluorescence de la solution de
dextrane pur et du dextrane adsorbé sur RBC, ce qui compliquerait la comparaison de la
concentration de fluorophore. Cela se traduirait par un signal systématiquement plus faible
détecté à partir du même nombre de molécules de dextrane libres en solution par rapport aux
molécules adsorbées. Dans le pire des cas (absorption totale des signaux d'excitation et
d'émission par la cellule conduisant à un "ombrage" des molécules du côté opposé de la cellule),
cette différence serait presque doublée.
3.2 Mécanismes d'adsorption
L'adsorption de macromolécules sur la membrane des globules rouges est un indicateur fort du
pontage des globules rouges. Néanmoins, pour se rapprocher des conditions physiologiques
nous avons voulu reproduire cette expérience en remplaçant le dextrane par du fibrinogène.
Étant donné que cette protéine est connue pour être l'un des principaux agents contribuant à
l'agrégation des globules rouges, nous avons décidé d'étudier si l'adsorption se produit ou non.
Pour des concentrations de 1 mg/ml et plus, on observe des différences dans les images
fluorescentes après analyse du signal (Fig. 3.8). Pour le fibrinogène, un signal plus fort sort de
la partie externe de la membrane, présentant la forme biconcave typique d'un GR. Dans le cas
du dex tran, le signal est réparti de manière homogène sur toute la cellule. Nous pouvons
supposer que le dextran a trouvé son chemin à travers la membrane. Néanmoins, aucune
explication triviale ne peut être trouvée tant la taille du dextran (70 kDa) est considérable par
rapport aux pompes à globules rouges ou même aux canaux ioniques. Nous avons également
écarté la possibilité pour le dextrane fluorescent de libérer son composant fluorescent car les
deux sont liés de manière covalente et il est extrêmement peu probable que cela se produise.
3.2. Mécanismes d'adsorption 59
FIGURE 3.8 : Adsorption de fibrinogène fluorescent à une concentration
de 1 mg/ml (a) et adsorption de FITCdextran 70 kDa à une concentration
de 20 mg/ml (b)
À l'aide d'une loupe (x4,5), nous avons examiné plus attentivement la surface d'un
globule rouge. Un RBC a été piégé avec le faisceau laser non diffracté de la même manière
que des expériences d'adsorption ont été réalisées. L'illumination du RBC sous fluorescence
a révélé la présence de plus de points avec un signal plus intense. Nous supposons que le
fibrinogène pourrait se fixer sur la membrane du RBC sur des points spécifiques contrairement
au dextran qui pourrait recouvrir la membrane de manière plus homogène de manière non
spécifique (Fig. 3.9).
FIGURE 3.9 : Dépôt de globules rouges au fond du canal microfluidique
lavé en continu par du PBS après avoir été incubé dans une solution de
fibrinogène à 2 mg/ml. Le signal s'est avéré plus intense sur des points
spécifiques qui peuvent être synonymes de liaison spécifique du
fibrinogène
3.3 Résumé
Notre montage expérimental nous a permis de changer rapidement le milieu environnant d'un
RBC. L'adsorption de macromolécules sur un seul GR a été démontrée et quantifiée. Cette
découverte est importante pour évaluer les mécanismes d'agrégation des globules rouges,
car pour les interactions induites par la couche d'appauvrissement et le pont, l'adsorption est
un facteur important qui doit être pris en compte. En général, l'approche développée basée
sur la combinaison de pinces optiques avec une plateforme microfluidique a des perspectives
pour différentes applications et permet de détecter l'adsorption avec un contraste élevé au
niveau d'une seule cellule. Contrairement à d'autres méthodes, il est possible de mesurer
l'adsorption de macromolécules exemptes d'artefacts potentiels tels que le liquide piégé entre les cellules.
Nos expériences réalisées en présence de fibrinogène fluorescent suggèrent qu'il existe
différents modes d'adsorption et ont déjà été abordées par Lominadze et al.
3.3. Résumé 61
[68]. Des expériences pour enquêter sur cette question ont été réalisées avec la microscopie
confocale mais n'étaient pas perspicaces. Nous supposons que le dextran peut pénétrer dans
la membrane après une incubation de quelques heures. Néanmoins, les voies possibles du
Dextran à travers la membrane restent inconnues. Cette approche pourrait également être
utilisée pour sélectionner des cellules spécifiques (par exemple par âge) et des conditions
avec un changement rapide du milieu de suspension sans centrifugation, étendant ainsi les
possibilités d'investigation des interactions intermoléculaires et de l'adsorption des macromolécules.
Continuer
Notre dispositif expérimental nous a permis de changer rapidement le milieu environnant
d'un globule rouge. L'adsorption de macromolécules sur un seul globule rouge a été
démontrée et quantifiée. Cette technique est importante pour évaluer les mécanismes
d'agrégation entre globules rouges, car pour les interactions induites par la déplétion et le
pontage, l'adsorption est un facteur déterminant qui doit être pris en compte. Plus
généralement, la technique développée basée sur la combinaison de fils de pinces optiques
avec une plateforme microfluidique est prometteuse pour différentes applications et permet
de détecter l'adsorption avec un contraste élevé au niveau d'une seule cellule. Contrairement
aux autres méthodes, il est possible de mesurer l'adsorption de macromolécules exemptes
d'artefacts potentiels tels que celui du fluide piégé entre les cellules. Nos expériences réalisées
en présence de fib rinogène fluorescent provoquent qu'il existe différents modes d'adsorption
et ont déjà été évoquées par Lominadze et al. [68]. Les expériences visant à étudier cette
question ont été réalisées en microscopie confocale mais n'ont pas été très perspicaces.
Nous supposons que le dextran peut pénétrer dans la membrane après une incubation de
quelques heures. Néanmoins, les voies possibles de pénétration du dextran à travers la
membrane restent inconnues. Cette approche pourrait également être utilisée pour sélectionner
des cellules spécifiques (par exemple en fonction de l'âge) et des conditions avec changement
rapide du milieu de suspension sans centrifugation, ce qui étendrait les possibilités d'étude
des interactions intermoléculaires et de l' adsorption des macromolécules.
Zusammenfassung
Unser Versuchsaufbau ermöglichte es uns, das umgebende Medium eines RB schnell zu
verändern. Die Adsorption von Makromolekülen an eine einzelne RB wurde
gezeigt und quantifiziert. Diese Erkenntnis ist für die Beurteilung der Aggregations
Mechanismen der Erythrozyten von Bedeutung, da sowohl für die Depletionsschicht als
auch für die brückeninduzierten Interaktionen die Adsorption ein wichtiger Faktor ist, der
berücksichtigt werden muss. Im Allgemeinen ist der entwickelte Ansatz, der auf der
Kombination einer optischen Pinzette mit einer mikrofluidis chen Plattform basiert, für
verschiedene Anwendungen vielversprechend und er laubt es, die Adsorption mit einem
hohen Kontrast auf Einzelzellebene zu detek tieren. Im Gegensatz zu anderen Methoden
ist es möglich, die Adsorption von Makromolekülen zu messen, die frei von solchen
potentieln Artefakten sind, wie zB zwischen den Zellen eingeschlossene Flüssigkeit. Unsere
Experimente, die in Gegenwart von fluoreszierendem Fibrinogen durchgeführt wurden,
deuten darauf hin, dass es verschiedene Modi der Adsorption gibt, und wurden bereits von
Lomi nadze et al. [68] dans les génomes d'Angriff. Experimente zur Untersuchung dieser
Frage wurden mit konfokaler Mikroskopie durchgeführt, waren aber nicht aufschlussre ich.
Wir spekulieren, dass Dextran nach einer Inkubation von einigen Stunden in die Membran
eindringen könnte. Dennoch bleiben die möglichen Wege von Dextran durch die Membran
unbekannt. Dieser Ansatz könnte auch für die Auswahl spez ifischer Zellen (zB nach Alter)
und Bedingungen mit schnellem Wechsel des Sus pensionsmediums ohne Zentrifugation
verwendet werden, wodurch die Möglich keiten der Untersuchung intermolekularer
Interaktionen und der Adsorption von Makromolekülen erweitert würden.
63
Chapitre 4
Étudier les 2 modèles d'agrégation :
pontage et épuisement
L'agrégation des globules rouges est un processus d'adhésion et de séparation des cellules
se déroulant en continu dans la circulation sanguine in vivo [11, 1] et en présence de protéines.
Il existe deux modèles théoriques (pontage et déplétion) détaillés en 1.5 pour décrire ce
phénomène. Cependant, ces modèles sont souvent présentés comme étant mutuellement
exclusifs [29, 58, 113] et les mécanismes d'agrégation des globules rouges restent encore
flous. Des travaux expérimentaux [12, 22, 23] ont déjà été réalisés mais la plupart d'entre eux
se concentrent sur la désagrégation des RBC. Nos expériences sont conçues pour étudier la
désagrégation et l'agrégation des globules rouges au niveau d'une seule cellule. Des forces
de (dés)agrégation ont été mesurées, dans deux solutions modèles présentées comme étant
un déplétant pur (Fdvirus) et une molécule qui est également un crossbridger (Dextran). La
surface d'interaction cellulecellule a été profilée tout au long des processus de (dés)agrégation
avec un contrôle précis de leur temps d'interaction et de la force appliquée sur les globules
rouges. Nos expériences suggèrent que les mécanismes de désagrégation et d'agrégation
peuvent être de nature différente en raison de l'écart observé, principalement en termes de forces.
4.1 Matériel et méthodes
Les particules de virus Fd (type sauvage) sont des bactériophages filamenteux d'intérêt
puisqu'ils ont déjà été utilisés par [114] comme déplétant à longue distance (voir 1.4.1). La
préparation de ce virus a été portée par le groupe de Pavlik Lettinga et ses deux doctorants
Olivera Korculanin et Mehrnaz Babaki. Ils présentent l'avantage d'être très monodisperses. Ils
ont une forme de tige avec une longueur de L = 880 nm et un diamètre de d = 6,6 nm. Ils se
situent donc dans le domaine colloïdal. A titre de comparaison, nous avons utilisé une
deuxième solution modèle avec du dextrane (70 kDa) largement utilisé pour démontrer les
deux modèles (pontage et déplétion) et qui sert d'expandeur de plasma dans le domaine
médical. Notre choix vise à montrer que si le dextran
64 Chapitre 4. Étudier les 2 modèles d'agrégation : transition et déplétion
est un appauvrissant, ses propriétés devraient être comparables à celles du virus Fd.
Les globules rouges ont été prélevés du bout du doigt et lavés selon la procédure standard
détaillée en 2.1.1 et remis en suspension dans des solutions modèles. Toutes les mesures ont
été effectuées en moins d'une heure, sinon le milieu a été renouvelé (les hématies peuvent être
modifiées pour un temps d'incubation plus long). La température dans le laboratoire n'a pas
augmenté de plus de 2 °C pendant les mesures et aucun effet de chauffage dû à la présence du
faisceau laser n'a influencé nos mesures. Les porteéchantillons ont été entièrement remplis et
scellés pour éviter toute évaporation conduisant à une augmentation des forces mesurées. Les
pièges laser étaient éloignés du faisceau non diffracté et la puissance du laser était suffisamment
faible (des centaines de milliwatts) pour éviter d'endommager les cellules. La procédure de mesure
ellemême était très courte pour éviter en outre tout échauffement ou altération possible des
globules rouges.
4.2 Analyse assistée par ordinateur des données expérimentales
Pour mesurer les forces d'agrégation/désagrégation entre deux hématies, il est nécessaire de
maîtriser une grande variété de paramètres (aire de contact, temps d'interaction, forces, ...). Alors
que la plupart des techniques monocellulaires (AFM, micropipettes) consistent à mesurer l'énergie
d'interaction à un instant donné, les pincettes optiques permettent d'effectuer des mesures
"dynamiques" et donc d'évaluer l'énergie d'interaction dans le temps. Pour ce faire, toutes les
expériences réalisées, que ce soit pour l'agrégation ou la désagrégation, ont été enregistrées puis
analysées. Une analyse manuelle prendrait du temps et les résultats pourraient différer d'un
opérateur à l'autre. Par conséquent, un algorithme a été développé pour nous aider à analyser les
données expérimentales. Il permet de récupérer avec facilité trois paramètres qui seront mieux
détaillés dans ce chapitre :
• Bords latéraux des cellules
• Emplacement du piège
• Horodatages pour chaque image
4.2.1 Segmentation et suivi des contours
Après avoir ajusté l'optique pour avoir une bonne qualité d'image et un bon contraste, l'ensemble
du processus a été enregistré avec 30 images par seconde. Le temps a été défini avec une
précision à la milliseconde et un horodatage a été attribué à chaque image prise. Après
4.2. Analyse assistée par ordinateur de données expérimentales 65
passant dans le domaine fréquentiel de l'image avec une transformée de Fourier, un filtre passe
haut a été appliqué. Le but est de mieux définir les contours des deux cellules.
La membrane d'un RBC apparaît blanche sur un fond sombre (moyen) et donc, un filtre passehaut
est adapté puisqu'il y a une grande différence de contraste entre les deux.
Même si les bords semblent assez clairs, ce n'est peutêtre pas toujours le cas. En tirant sur les
cellules, les deux peuvent être légèrement floues, ce qui rend le suivi des bords plus difficile.
Ceci est principalement dû au fait que le piégeage mais aussi l'imagerie se fait à travers le même
objectif c'est à dire qu'il peut y avoir un décalage entre le plan focal de l'image et le "waist" du piège.
L'étape suivante consiste à suivre les bords. Les bords gauche et droit sont triviaux à obtenir car ils
correspondent aux points extrêmes gauche/droite de l'image (points 1 et 4 sur la Fig. 4.1). Cependant,
les bords intermédiaires (points 2 et 3 de la Fig. 4.1 ) doivent être pris en compte avec plus de
précautions.
FIGURE 4.1 : Deux RBC sur le point d'être désagrégées. Les quatre points
en jaune représentent les points qui sont suivis pendant tout le processus de
séparation
L'une des solutions consiste à additionner tous les pixels le long des colonnes pour obtenir le
profil d'intensité de l'image. Ce faisant, nous nous retrouvons avec 4.2. Celleci fait apparaître 4 pics
correspondant à chaque extrémité du GR (Fig. 4.2). Notre algorithme de suivi est fiable dans la
plupart des cas et tout au long des enregistrements, mais les bords des cellules deviennent flous
lorsqu'une cellule échappe au piège. Cependant, ce n'est pas un problème pour cette étude.
FIGURE 4.2 : Nombre de pixels pour chaque colonne d'une image
segmentée de deux globules rouges agrégés. Les quatre pics donnent
directement la position x du bord de chaque RBC
Pouvoir suivre ces 4 points spécifiques est crucial pour approfondir la dynamique de
(dés)agrégation des globules rouges. Par exemple, le suivi du bord des cellules donne accès au
diamètre de la cellule au fil du temps et révèle par exemple si l'allongement a lieu pendant toute la
procédure. La position du piège combinée aux bords de la cellule peut être directement corrélée à
la force effective appliquée au RBC
4.2.2 Force et énergie d'interaction
Lorsqu'il s'agit de mesurer des forces, il existe deux approches possibles. La première consiste à
mesurer la force mise en jeu entre une paire de cellules pendant un temps donné et à en déduire
la force de (dés)agrégation (Ftrap = FA et Ftrap = FD), directement à partir de la puissance du
laser, en suivant la calibration de Stokes détaillée dans rubrique 2.3.5.
La seconde consiste à mesurer dynamiquement la force appliquée sur le RBC au fil du temps.
Pour chaque piège deux forces entrent en jeu : la force optique du piège Ftrap retenant les cellules
et la force de la cellule Fcell due à l'agrégation spontanée agissant en sens inverse. Dans les deux
cas, pour mieux appréhender les forces mises en jeu et en raison de la nature biologique des
échantillons, 10 paires d'hématies ont été prélevées pour une concentration donnée. La force
optique agissant sur la cellule suit la loi de Hook avec kcell sa constante de rappel. (Plus de détails
pour déterminer kcell peuvent également être trouvés dans la section 2.3.5):
4.2. Analyse assistée par ordinateur de données expérimentales 67
Fcell(t) = kcell(xtrap (t) − xedge (t)) (4.1)
également écrit comme:
Fcell(t) = kcell∆x(t) (4.2)
pour la simplicité.
Le suivi des bords de la cellule et de la position du piège lors de la désagrégation de deux
Les globules rouges peuvent être vus sur la Fig. 4.3
FIGURE 4.3 : Désagrégation de deux globules rouges en présence de dextran.
En violet la position du piège généré par le SLM et en bleu la position du bord de
la cellule détectée par l'algorithme de suivi. La ligne rouge ∆x représente la
distance entre les deux. Le RBC supérieur est tiré avec des pas constants et une
puissance laser
4.3 Forces de (dés)agrégation dans le dextrane
Les mesures ont été réalisées comme présenté dans la section 2.3.6. Le chevauchement linéaire entre
les deux globules rouges a été fixé à 4, 5 µm et les forces d'interaction des globules rouges induites par
le dextrane résultantes à l'aide de l'étalonnage de Stokes (voir section 2.3.5) sont illustrées à la Fig. 4.4.
FIGURE 4.4 : Forme en cloche pour la désagrégation (bleu) et l'agrégation
(rouge) d'une paire de globules rouges avec une distance de chevauchement
linéaire initiale de 4,5 microns. La ligne théorique (noire) a été calculée à l'aide
de l'équation. 1,34 (N>10)
La force d'agrégation FA augmente jusqu'au pic à 50 mg/ml, atteignant 5 ± 1 pN et diminue ensuite
jusqu'à atteindre un point sans interaction autour de 100 mg/ml. On notera l'abondance de stomatocytes
à des concentrations plus élevées (> 80mg/ml).
Concernant la force de désagrégation FD dans le dextrane, un comportement différent a été observé
par rapport à l'agrégation. Tout d'abord, il faut reconnaître que l'obtention de la force de désagrégation
n'est pas une tâche facile. Il nécessite de scanner différentes forces (13,3 ± 1,3, 16,5 ± 1,6, 18,9 ± 1,9,
21,3 ± 2,1pN dans le cas du dextrane (70 kDa)). En fait, la force ne peut pas être augmentée par paliers
car si la force de traction n'est pas suffisante, les globules rouges vont s'agréger spontanément et
l'interaction est telle qu'il est impossible de les séparer. De plus, les globules rouges sont des objets
biologiques avec un certain niveau de variabilité et la force de désagrégation peut varier d'une paire à
l'autre. Néanmoins,
4.4. Forces de (dés)agrégation dans le virus Fd 69
la force de désagrégation FD est considérée comme la force suffisante pour séparer 70 % des
paires et la force d'interaction atteint un maximum à 50 mg/ml et à 70 mg/ml et diminue ensuite. Il
faut mettre l'accent sur la vallée à 50 mg/ml, où la force d'interaction diminue notablement, et qui
n'était pas vraiment observée avant d'utiliser d'autres techniques monocellulaires. Même si le pic
représentant le maximum d'agrégation semble correspondre à la courbe théorique, il doit être
redimensionné afin d'ajuster quantitativement les résultats expérimentaux. La courbe théorique a
été dérivée de l'Eq. 1.34 et ainsi, la répulsion électrostatique a été négligée. Il faut plutôt y voir une
comparaison qualitative puisque la répulsion électrostatique varie avec l'inverse de la distance
séparant les deux hématies.
À n'importe quelle concentration, le rapport FD/FA était grossièrement supérieur à 4. Une telle
différence implique que la désagrégation et l'agrégation des globules rouges peuvent impliquer des
mécanismes de nature différente. Le modèle d'épuisement ne fournit pas d'informations sur l'origine
de cette différence entre les deux forces FA et FD et peut donc être incomplet pour décrire
complètement l'agrégation des globules rouges.
La comparaison avec la théorie de l'épuisement donne en effet une différence significative.
Cependant, dans des travaux récents, l'ajustement du paramètre du glycocalyx (pénétration) a
conduit à des formes de cloche similaires (dépendance à la concentration) [115]. Néanmoins, nos
résultats avec des pincettes optiques montrent toujours une différence d'amplitude d'environ 4 fois
entre FA et FD. Un tel écart entre les forces n'a pas été démontré quantitativement jusqu'à présent
puisque la plupart des méthodes unicellulaires (AFM, MAT) se sont concentrées sur la désagrégation
des globules rouges. Les mesures OT révèlent plus de détails sur la nature des forces impliquées dans
mécanismes de (dés)agrégation.
4.4 Forces de (dés)agrégation dans le virus Fd
Les forces d'interaction des globules rouges induites par le virus Fd sont présentées à la figure 4.5.
Dans ce cas, les dépendances de FA et FD se suivaient et le rapport FD/FA était proche de l'unité.
Les forces FA et FD avaient une amélioration monotone et linéaire de 2 à 7 mg/ml. Il convient de
noter que, pour le virus Fd, il était très difficile de trouver une condition stationnaire pendant la
mesure. Une légère perturbation de FTrap était suffisante pour rompre l'équilibre dans les deux sens
d'agrégation ou de désagrégation des cellules. Cela montre que FA ≈ FD. Par conséquent, un seul
point de consigne pour FTrap a été utilisé, qui était supérieur de 1 pN à FA. Pour cette raison, les
valeurs FD pourraient être légèrement surestimées. La dépendance linéaire de la force par rapport
à la concentration avec les forces de (dés)agrégation
FD et FA étant dans le même ordre de grandeur sont typiques d'un épuisement pur et donc attendus.
FIGURE 4.5 : La force de (dés)agrégation FD varie linéairement en fonction
de la concentration en virus Fd. Par rapport au dextrane (70 kDa), les forces
d'agrégation et de désagrégation sont du même ordre de grandeur que prévu
pour un déplétant pur. La droite théorique (noire) a été calculée à l'aide de l'Eq.
1,45 (N>10)
Pour confirmer que le virus Fd se comporte comme un déplétant pur autour des globules rouges, une seule molécule
la microscopie à fluorescence a été mise en place. La figure 4.6 montre le comportement du virus Fd
marqué par fluorescence dans une solution tampon contenant du virus Fd non marqué (rapport 1 :
700 à une concentration totale de 4 mg/ml). Les virus Fd sont repoussés de la surface des globules
rouges et aucun d'entre eux n'a été trouvé dans la zone de contact, c'estàdire entre deux globules rouges.
On peut noter que la distance intercellulaire est importante. Cela est dû à la grande taille du déplétant
luimême (L = 880 nm).
À l'aide de pinces optiques, nous n'avons pas pu évaluer les forces de (dés) agrégation (FA et FD) à
une concentration plus élevée (Cb > 8 mg / ml) de virus Fd en raison de la viscosité du milieu qui était
trop élevée pour déplacer librement les cellules. C'est en principe possible, mais il faudrait un temps
considérable pour obtenir suffisamment de statistiques. Cependant, il est très probable que la
dépendance entre la force et la concentration reste la même.
4.5. Discussion 71
FIGURE 4.6 : Paire de deux cellules observées au moyen d'une microscopie
à fluorescence à molécule unique à une concentration de 4 mg/ml de virus
Fd. La LED de fluorescence (λ = 470 nm) et la lampe halogène sont allumées
pour visualiser les bâtonnets ainsi que les globules rouges non colorés (a)(f),
l'intensité de la lampe halogène a été éteinte tout au long de (g)(i) . Avec
l'aimable autorisation d'Olivera Korculanin
4.5 Débat
La dépendance en forme de cloche de l'agrégation des globules rouges à la concentration de dextran
a été rapportée plus tôt [97, 15, 16]. Cependant, les concentrations maximales variaient sur une
large plage (environ 20 à 40 mg/ml) selon la méthode de mesure utilisée.
Une spéculation pourrait être que l'une des raisons à cela serait les différences entre FA et FD, qui
n'étaient pas bien prises en compte auparavant.
La diffusion de la lumière (c'estàdire la mesure de l'intensité de la lumière diffusée sur l'échantillon)
[16] et l'indice d'agrégation microscopique (c'estàdire le comptage de la taille des agrégats) [15]
rapportent un pic d'interaction autour de 30 − 50 mg/ml, l'interaction disparaissant à > 80mg/ml. Nous
avons également constaté que les interactions des globules rouges sont extrêmement faibles à > 80
mg/ml et disparaissent complètement vers 100 mg/ml. Il faut également tenir compte du fait que pour
forte concentration de dextran, les macromolécules peuvent affecter la forme des globules rouges.
Cela pourrait justifier la présence de stomatocytes, comme déjà dit. Même si nous ne pouvons pas
émettre d'hypothèse concernant ce changement morphologique, on peut signaler qu'aucune agrégation
entre deux stomatocytes par OT n'a été observée. Néanmoins, certaines similitudes quantitatives dans
nos données ont pu être trouvées avec la littérature [12].
Si l'on compare les méthodes expérimentales, l'AFM est probablement la plus proche de l'OT car elle
permet de mesurer les forces au niveau d'une seule cellule. Outre et à l'instar de la technique
d'aspiration à la micropipette, il existe toujours un contact mécanique entre l'objet et l'appareil de
mesure. Rappelons également que dans nos mesures, la surface de contact est bien maîtrisée, alors
que pour l'AFM toute la surface supérieure du GR entre en jeu et l'orientation relative des cellules est
imposée par le système.
Par ailleurs, le mécanisme mis en jeu dans les mesures des forces de désagrégation FD est différent.
Avec l'AFM, une cellule est collée sur le substrat tandis que l'autre est soulevée de manière "face à
face". Avec l'OT, les globules rouges sont maintenus en suspension et l'un glisse sur l'autre sans aucun
contact mécanique externe. Malgré ces particularités, on pourrait s'attendre à ce que les deux méthodes
s'accordent sur le maximum de la dépendance en forme de cloche de l'énergie d'interaction par rapport
à la concentration, mais cela n'a pas toujours été le cas [21].
En termes de forces d'interaction pour le virus FD , il se comporte comme un déplétant pur pour une
gamme de concentration comprise entre 2 et 8 mg/ml. Il convient de mentionner que les globules
rouges ont toujours conservé leur forme biconcave en présence de Fd avec la gamme de concentration
que nous avons choisie (entre 2 et 8 mg/ml). Même si sa nature diffère du dextrane, il montre ce que
l'on peut attendre d'un système où se produit une déplétion pure. Les forces de (dés)agrégation (FA et
FD) suivent une tendance linéaire et il n'y a pas besoin d'un paramètre de "pénétration de gly cocalyx"
pour expliquer ce comportement comme dans [58]. En fait, si la surface de contact entre deux globules
rouges est purement appauvrie, les forces nécessaires pour (dés)agréger les globules rouges ne
devraient pas trop différer (étant donné que l'interaction entre les brosses à membrane des globules
rouges peut être négligée).
4.6 Analyse de traces dans des solutions modèles : dextran et Fd
virus
La plupart des expériences jusqu'à présent ne tenaient pas compte du temps de contact entre les
cellules et les forces entre les globules rouges étaient mesurées de manière "face à face" par rapport
au "glissement" comme c'est le cas pour l'OT. Même s'ils donnent un premier aperçu de la désagrégation
des globules rouges, ils peuvent dissimuler des caractéristiques importantes de ce mécanisme particulier.
Nos expériences sont dynamiques et visent à montrer des différences pour la désagrégation
4.6. Analyse de traces dans des solutions modèles : dextran et virus Fd 73
processus dans un épuisant pur et dans une solution de pontage croisé. Toutes les paires de
cellules ont été analysées à l'aide de l'algorithme de suivi. Pour le dextrane (70 kDa) et le virus Fd,
les données suivent la même tendance et peuvent être superposées presque parfaitement. Cela
indique que l'âge des globules rouges et leur éventuel changement de rigidité, de déformabilité et
d'autres paramètres physiques n'ont eu aucune influence sur les mesures.
En utilisant le même algorithme qu'en 4.2, des traces représentant la force appliquée sur la
cellule en fonction de la distance centre à centre dc−c ont été générées. Les données brutes
comprennent : la position du bord de la cellule, la position du piège et l'horodatage de chaque trame.
Par conséquent, dc−c pour un horodatage donné peut être récupéré facilement. Les forces générées
par le piège optique FOT ont été calculées à l'aide de l'étalonnage du bruit thermique (voir section
2.3.5) pour déterminer la constante de Hooke et l'équation associée.
FOT = −KOT∆x (4.3)
∆x est la distance entre un piège optique et le bord d'une cellule telle qu'elle est déjà affichée
sur la Fig. 4.3. La force effective appliquée sur chaque RBC peut également être calculée à l'aide
de l'étalonnage de la cellule de billes (section 2.3.5). Cela donnerait une représentation encore plus
précise de la force appliquée sur la cellule mais c'est toujours en cours. Pour le dextrane, les traces
de désagrégation (Fig. 4.7) ont été analysées avec et sans temps d'interaction pour observer son
influence possible sur une éventuelle formation de ponts. Comme on peut l'interpréter sur la Fig.
4.7, la vitesse de traction a son importance dans la compréhension du mécanisme de désagrégation
des globules rouges dans le dextran. Si une cellule est éloignée de l'autre trop rapidement ou
brusquement, le système a une réponse linéaire (Fig. 4.7 (b,d)) et peut ne pas être un bon exemple
pour prendre en compte toutes les contributions de force lors de la désagrégation. Une vitesse de
traction plus faible (Fig. 4.7 (a,c)) nous donne une réponse différente, légèrement plus complexe à
interpréter et indique que la vitesse de traction que nous avons sélectionnée est raisonnable pour
étudier la désagrégation des globules rouges.
FIGURE 4.7 : Force de traction appliquée sur le RBC en fonction de la distance
(centre à centre) dc−c entre les deux RBC. Les forces de traction sont recueillies
pour c = 50 mg/ml dextran (70 kDa) avec une vitesse de v = 0,12 µm/s (a,c) et v
= 0,47µm/s taux de traction (b,d), pour zéro ( a,b) et 30 secondes de temps
d'interaction (c,d), montrant les détails de la dynamique de désagrégation.
Chaque couleur correspond à une expérience de désagrégation différente. Les
lignes pleines sont des courbes théoriques calculées à l'aide de l'équation. 1.34
Pour les faibles vitesses de séparation (vs = 0,12 µm/s) dans le dextran, la force appliquée sur les
globules rouges ne diminue pas instantanément après le début de la traction, comme c'est le cas pour
le virus Fd (Fig. 4.8) .En fait, on peut supposer qu'il y a trois étapes basées sur nos graphiques. La Fig.
4.9 peut représenter cette description plus précisément.
4.6. Analyse de traces dans des solutions modèles : dextran et virus Fd 75
FIGURE 4.8 : Les courbes de force pour le virus Fd à (a) c = 2 mg/ml et (b) c =
4 mg/ml montrant les détails de la dynamique de désagrégation avec une
vitesse de v = 0,12 µm/s. La ligne pleine dans chaque graphique est la prédiction
théorique selon le modèle d'épuisement pour les barres idéales (voir équation
1.45).
FIGURE 4.9 : Les trois étapes d'une traction tracent un ensemble de données
de dextran à un taux de traction de 0,12 µm/s, traçant la force de piégeage en
fonction de dc−c (a) et du temps (b). Les stades I, II et II sont respectivement en
bleu, rouge et jaune
Pour une faible vitesse de séparation vs = 0,12µm/s, les traces de force du dextrane ne diminuent
pas immédiatement, comme c'est le cas pour le virus Fd, mais au contraire, les courbes présentent trois
étapes avec l'augmentation du temps, comme on peut le voir plus clairement dans la Fig. 4.9. Au
stade I, immédiatement après le début de la traction, la force appliquée sur la cellule augmente alors
que dc−c reste quasiment constant. Vers la fin de l'étape I (en bleu), le système cède : dc−c commence
à augmenter, tandis que la force appliquée diminue. C'est l'étape II (en rouge) où les cellules s'écoulent,
jusqu'à ce que dc−c ≈ 2R, donc lorsque les cellules passent au contact latéral.
Les courbes F dc−c pour l'interaction timepan tint = 0 et 30 secondes sont cependant différentes.
Pour tint = 0 s la courbe est plus raide que pour tint = 30 s. Au stade III (en jaune), lorsque les cellules
ne se sont pas séparées, la force recommence lentement à augmenter et les cellules se séparent ou
s'attachent (Fig. 4.12), où dc−c augmente légèrement, mais la force augmente de manière significative.
La plupart des cellules qui s'attachent finalement se réagrègent au fur et à mesure que le piège de
traction continue de se déplacer.
À une vitesse de séparation plus élevée vs = 0,47 µm/s (Fig. 4.7 (b,d)) et dans le cas du virus Fd
(Fig. 4.8 (a) et (b)), Fcell saute instantanément à peu près à une certaine force. Cette force est de 2
pN et 8 pN, respectivement pour une concentration de 2 mg/ml et 4mg/ml pour le Fdvirus et d'environ
14 pN pour le dextrane à 50mg/ml. Après ce saut soudain, Fcell diminue avec l'augmentation de dcc,
c'està dire que les cellules suivent le piège optique et le système commence à couler instantanément,
de sorte que l'étape I est sautée et l'étape II est instantanément entrée. Alternativement, les globules
rouges échappent au piège ce qui est plus souvent le cas pour tint = 30 s que pour tint = 0 s. La
transition de phase vers le stade III est ignorée pour presque toutes les cellules, et les cellules se
réagrègent immédiatement ou se séparent.
4.7 Influence du temps d'interaction sur la désagrégation
4.7.1 Influence du temps d'interaction sur la désagrégation avec le dextran
Le temps d'interaction entre les globules rouges en présence de dextran peut donner une indication
sur le mécanisme sousjacent de l'agrégation des globules rouges. En effet, une dépendance temporelle
peut être directement liée à la formation de ponts. On peut s'attendre à ce qu'une durée d'interaction
plus longue favorise la formation de ponts. Une absence de dépendance temporelle peut être synonyme
d'un scénario d'épuisement pur, dans lequel le temps ne devrait pas jouer un rôle majeur. La figure
4.10 montre l'effet du temps mais aussi de la vitesse de traction sur la probabilité de séparation des
globules rouges. Les données de la solution de virus Fd et des milieux physiologiques (sérum, plasma)
sont toujours en cours de traitement et pourraient révéler davantage d'informations sur l'effet du temps
sur la désagrégation des globules rouges.
4.8. Mécanismes possibles 77
FIGURE 4.10 : Probabilité de séparation entre deux GR à une force choisie et
en présence de Dextran à une concentration fixe de 50 mg/ml avec une vitesse
de traction de 0,12 µm/s, 0,24 µm/s et 0,47 µm/s. La distance de chevauchement
initiale a été fixée à 4,5 µm
Les traps ont été générés avec la configuration habituelle. Les forces ont été sélectionnées de
manière à être légèrement supérieures aux forces de séparation moyennes. L'effet possible de la
vitesse de traction a également été étudié. Les durées d'attente sont pour la plupart des expériences
teinte = 0 s (pas de temps d'attente) et teinte = 30 s. Il faut garder à l'esprit qu'il y a toujours un laps de
temps de 2 secondes lorsque les globules rouges sont réunis
en contact.
Pour une force de 22,9 pN, on constate qu'un temps d'attente plus long entraîne une probabilité de
désagrégation plus faible. Cela soutient l'idée que davantage de ponts peuvent se former après un
temps d'attente plus long. Pour une même vitesse de traction, prendre une force encore plus élevée
telle que 25,4 pN semble faciliter la dissociation des cellules après un temps d'attente de 30 s. Lorsque
la vitesse de traction est augmentée d'un facteur 2 et que la force reste constante (22,9 pN), cette
probabilité de séparation devient encore plus faible. C'est également valable si cette vitesse de traction
devient encore plus élevée avec 2µm/s. Cela peut s'expliquer par le fait que la traction est trop brutale
et qu'on ne laisse pas assez de temps au système pour se rééquilibrer.
4.8 Mécanismes possibles
L'un des scénarios possibles concerne les ponts transversaux mobiles. Les protéines présentes dans
le plasma peuvent former des ponts croisés entre le glycocalyx de deux globules rouges et ces
les ponts peuvent se déplacer à mesure que les globules rouges se désagrègent. La figure 4.11 illustre
cette idée. La figure 4.11 exprime de quelle manière la densité d'énergie d'interaction pourrait s'accumuler
lors de la désagrégation avec des pincettes optiques. Au fur et à mesure que la zone de contact entre les
deux globules rouges diminue, le nombre de ponts reste (quasi) constant, exigeant une force plus élevée
pour séparer les cellules.
FIGURE 4.11 : Schéma 3D représentant un modèle avec des ponts transversaux
en migration. Les ponts restent dans la zone de contact lorsqu'un RBC est éloigné
de l'autre. Dans ce scénario, la densité d'énergie d'interaction augmente à mesure
que la surface diminue
Un indice expérimental pourrait être la présence de « liens » pour une concentration élevée (Cb < 50
mg/ml) de dextran (70 kDa). Ce terme peut être légèrement imprécis puisqu'il fait référence à la formation
d'une liaison entre une cellule et un substrat en biologie cellulaire.
Néanmoins, une attache, dans ce contexte, fait référence à deux globules rouges qui sont liés par un
contact ponctuel entre eux (voir Fig. 4.12). La plupart du temps, ce point de contact est si fort que notre
OT ne pourrait pas le casser. Une explication plausible est que les protéines de pontage peuvent dériver
sur la membrane et, tandis qu'une cellule glisse sur l'autre pendant le processus de désagrégation.
FIGURE 4.12 : Microphotographie de deux globules rouges au cours de la
progression de la désagrégation dans du dextran 50 mg/ml et appelée attache
4.9. Résumé 79
La dépendance linéaire entre la force et la distance de recouvrement linéaire pourrait être synonyme de
migration des ponts transversaux (Fig. 4.13). Dans ce modèle, le nombre de ponts est supposé proportionnel à
la surface de contact entre cellules (en considérant une répartition homogène des ponts).
FIGURE 4.13 : Schéma 3D représentant un modèle avec des ponts transversaux non
mobiles. Le nombre de ponts diminue à mesure que la surface entre 2 globules rouges
diminue lors de la désagrégation
Qualitativement, les courbes en plasma, en sérum ou encore en dextran montrent une tendance similaire.
Pour un piège tirant un hématie avec une force constante, la désagrégation semble s'accélérer vers la fin du
processus lorsque la surface de contact entre les deux hématies diminue. Cela pourrait être dû au fait que
davantage de ponts se brisent à mesure que le piège continue de tirer. La densité d'énergie d'interaction dans
ce scénario diminuerait au fil du temps à mesure que la zone de contact entre les RBC diminue. Néanmoins,
c'est une vision plutôt simpliste et les deux mécanismes pourraient avoir lieu. On peut penser à une interaction
entre la migration des ponts transversaux et un taux de rupture de formation lors de la désagrégation.
4.9 Résumé
Dans ce chapitre, les forces de (dés)agrégation entre deux GR sont évaluées afin de mieux comprendre le
mécanisme de (dés)agrégation. Nous montrons que le dextran (70 kDa) peut ne pas être un bon candidat pour
sauvegarder le modèle d'épuisement. Comme pour le plasma, il est rapporté que la force de désagrégation FD
est plus de 4 fois supérieure à la force d'agrégation FA. Dans le cas d'un déplétant pur, les forces sont du même
ordre de grandeur FA ≈ FD et les données de désagrégation suivent une tendance similaire. Nos expériences
suggèrent que pour cette méthodologie de désagrégation donnée, le dextran ne se comporte pas comme un
déplétant uniquement car il suit une tendance différente par rapport au virus Fd, qui est un pur déplétant. Alors
que les courbes de dextran pourraient être divisées en 3 étapes pour décrire la force appliquée sur une cellule
pendant le processus de désagrégation, le virus Fd ne représente que deux phases et saute ainsi l'étape I de
production.
Des analyses plus poussées de la désagrégation dans le plasma autologue sont toujours en cours de traitement
et peut révéler le véritable rôle des protéines dans le plasma et quel modèle peut être appliqué pour
décrire l'agrégation des globules rouges dans des situations physiologiques. Nos mesures suggèrent
qu'un temps d'interaction plus long peut améliorer l'énergie d'interaction entre les globules rouges
en présence de dextran, car les ponts peuvent avoir plus de temps pour se former. Cette étude
suggère que les deux mécanismes d'interaction souvent présentés comme mutuellement exclusifs
peuvent tous deux contribuer au mécanisme d'agrégation des globules rouges.
Continuer
Dans ce chapitre, les forces de (dés)agrégation entre deux GR sont requises afin de mieux
comprendre le mécanisme de (dés)agrégation. Nous montrons que le dextran (70 kDa) n'est pas un
bon candidat pour soutenir le modèle de déplétion. Comme pour le plasma, il est rapporté que la
force de désagrégation FD est plus de 4 fois supérieure à la force d'agrégation FA. Dans le cas d'un
déplétant pur, les forces sont du même ordre de grandeur FA ≈ FD et les données de désagrégation
suivent une tendance similaire. Nos expériences éprouvées que pour cette méthode de désagrégation
donnée, le dextrane ne se comporte pas comme un déplétant car il suit une tendance différente de
celle du virus Fd, qui est un déplétif pur.
Alors que les courbes du dextrane pourraient être divisées en 3 étapes décrivant la force sur une
cellule appliquée pendant le processus de désagrégation, le virus Fd, lui, ne représente que deux
phases et donc, saute l'étape I d'élasticité. D'autres analyses de désagrégation dans le plasma
autologue sont encore en cours et pour révéleraient la vraie fonction des protéines contenues dans
le plasma et le modèle qui pourrait être appliqué pour décrire l'agrégation des globules rouges. Nos
mesures laissent penser qu'un temps d'interaction plus longtemps pourrait augmenter l'énergie
d'interaction entre les globules rouges en présence de dextrane, car les ponts pour raient avoir plus
de temps pour se former. Cette étude suggère que les deux mécanismes d'interaction souvent
présentés comme étant mutuellement exclusifs peuvent tous deux contribuer au mécanisme
d'agrégation des globules rouges.
Zusammenfassung
In diesem Kapitel werden die (Dis)Aggregationskräfte zwischen zwei RB unter sucht, um den
Mechanismus der (Dis)Aggregation besser zu verstehen. Wir zeigen, dass Dextran (70 kDa)
möglicherweise kein gutes Aggregationsmittel ist, um das Depletionsmodell zu untermauern. Ähnlich
wie bei Plasma wird berichtet, dass die Disaggregationskraft FD mehr als viermal so hoch ist wie die
Aggregationskraft
4.9. Résumé 81
FA. Im Falle eines reinen Depletants liegen die Kräfte in der gleichen Größenord
nung FA ≈ FD und die Disaggregationsdaten folgen einem ähnlichen Trend.
Unsere Experimente legen nahe, dass sich Dextran bei dieser gegebenen
Disaggregations methode nicht wie ein Depletant verhält, da es einem anderen
Trend folgt als das fd Virus, das ein reines Depletant ist. Während DextranKurven
in 3 Stufen aufgeteilt werden könnten, um die Kraft zu beschreiben, die während
des Disaggregation sprozesses auf eine Zelle ausgeübt wird, stellt das fdVirus
nur zwei Phasen dar und überspringt somit die Ertragsstufe I. Weitere Analysen
der Disaggregation in autor Plasma sind noch in Bearbeitung und könnten die
wahre Rolle der Pro teine im Plasma aufdecken und zeigen, welches Modell zur
Beschreibung der RB Aggregation angewendet werden kann. Unsere Messungen
lassen vermuten, dass eine längere Wechselwirkungszeit die
Wechselwirkungsenergie zwischen den Ery throzyten in Gegenwart von Dextran
erhöhen könnte, da Brücken möglicherweise mehr Zeit zur Bildung haben. Diese
Studie legt nahe, dass die beiden Wechsel wirkungsmechanismen, die oft als sich
gegenseitig ausschließend dargestellt wer den, beide zum Mechanismus der RBAggregation be
83
Chapitre 5
Effet de l'élasticité du réseau de spectrine
sur les formes des doublets RBC
La recherche présentée ici a été publiée [116] à la suite de notre collaboration avec Masoud
Hoore du Forschungszentrum Jülich. Plus de détails sur le modèle théorique utilisé dans ses
simulations peuvent être trouvés dans Hoore et al. [116].
Les doublets érythrocytaires et les agrégats plus complexes (jusqu'à 7 cellules) sont ici étudiés
en 3 dimensions. Des simulations avaient déjà été réalisées [12] dans un espace à 2 dimensions
dans lequel l'élasticité de cisaillement n'existe pas et par conséquent, on peut se demander si
l'ensemble du diagramme de phase a été exploré ou non dans ces simulations 2D précédentes.
En utilisant des membranes triangulées à haute résolution en 3 dimensions, l'espace des phases
des formes de doublets et de rouleaux RBC avec un accent sur l'élasticité de cisaillement est
établi et complété qualitativement par des expériences.
5.1 Présentation
Connaître le mécanisme inhérent à l'agrégation des globules rouges est d'un intérêt majeur mais
ne doit pas nous empêcher d'étudier les aspects structurels des agrégats de globules rouges. A
l'origine de la formation du rouleau, deux globules rouges forment un doublet qui est le point de
nucléation des agrégats plus gros. Les doublets sont également la structure la plus simple résultant
de l'équilibre entre les forces d'agrégation et les propriétés mécaniques des globules rouges et, à
ce titre, constituent un système pertinent pour modéliser et comprendre la stabilité mécanique des
agrégats. Ils sont également probablement le type d'agrégats le plus courant à des taux de
cisaillement plus élevés et nous pouvons soupçonner que leur morphologie, qui régit la surface
totale de contact entre les cellules agrégées, est intimement liée à leur stabilité dans des situations
dynamiques. Pour simplifier, les premières études considéraient que la zone de contact entre les
globules rouges était plate [27, 25, 117]. Grâce aux progrès des performances de calcul, des
simulations numériques ont montré que deux vésicules de rigidité en flexion donnée et de rigidité identique
84 Chapitre 5. Effet de l'élasticité du réseau de spectrine sur les formes des doublets RBC
volume ont une surface de contact plutôt sigmoïdale lorsque l'énergie d'interaction est suffisamment
élevée. De plus, le rôle du réseau de spectrine dans RBC et son élasticité de cisaillement ont été
omis et nous avons trouvé intéressant de l'implémenter dans notre modèle en même temps que la
rigidité en flexion. Les résultats numériques sont comparés à nos microimages expérimentales sous
microscopie à fond clair.
5.2 Modèle d'adhérence
Le modèle membranaire n'est pas décrit ici car il n'affecte pas la compréhension de cette recherche
et repose sur des considérations classiques de mécanique membranaire (voir [116] pour plus de
détails). Pour représenter l'agrégation entre deux globules rouges, des interactions attractives entre
deux membranes sont introduites similaires à d'autres modèles [118, 119, 12, 120] de membranes en
interaction. Notez que de telles interactions ne peuvent pas être directement associées à un
mécanisme sousjacent pour l'agrégation des globules rouges (par exemple l'épuisement ou le
pontage). Ce modèle constitue donc une représentation efficace de l'agrégation entre globules rouges,
qui se caractérise par la force de l'interaction attractive et la surface de contact telle qu'elle peut être
observée dans le plasma ou dans des solutions modèles (par exemple dans dex tran). L'interaction
attractive entre sommets adjacents de membranes en contact est modélisée par le potentiel de
LennardJones (LJ).
σ
12
UL J(r) = 4[(σ )
r
− ( r ) 6 ] (5.1)
où et σ sont l'énergie et la longueur caractéristique de l'interaction LJ. Le potentiel LJ est coupé à
rcut = 2,5σ. L'interaction de contact de deux globules rouges peut être représentée par l'énergie libre
d'adhésion [118, 119]
Eadh = −ΓAc (5.2)
où Γ est la force d'adhérence et Ac est la surface de contact. À condition que l'adhésion soit
modélisée par une interaction par paires, comme le potentiel LJ dans l'Eq. 5.1, entre les sommets de
la membrane, la force d'adhésion Γ peut être liée à l'énergie potentielle .
Si Nc sommets d'un RBC interagissent avec les sommets d'un autre RBC, l'énergie
d'adhésion totale est −Nc˜, où ̃ est l'énergie d'adhésion effective d'un sommet RBC avec les autres
sommets RBC. ̃ peut être calculé approximativement par
en considérant les sommets les plus proches d'un sommet d'une autre membrane.
Dans un état d'énergie minimale, un sommet se trouve au sommet de trois sommets dans une
configuration tétraédrique avec une distance égale σ à chacun d'eux. L'énergie d'adhésion de ce
sommet avec les autres plus proches voisins est d'environ −5,37. En conséquence, le
5.2. Modèle d'adhérence 85
l'énergie adhésive totale, lorsque Nc sommets participent à l'adhésion de chaque membrane, est
égale à environ 5,4Nc. Cependant, cette situation de symétrie élevée ne se produit bien sûr pas
pour tous les sommets, ce qui entraîne une énergie d'adhésion un peu plus faible. Comme les
sommets d'une membrane sont répartis de manière homogène sur la membrane, Nc/Ac = N/A, où
N et A sont le nombre total de sommets et la surface totale de la membrane RBC. Ainsi, la force
d'adhésion est directement proportionnelle à la densité de vertex N/A, c'estàdire Γ = Nc˜/Ac = N˜/
A. Ceci implique que la force d'adhésion est proportionnelle au paramètre LJ via ̃. L'énergie
d'adhésion réduite, γ, est définie comme le rapport de l'énergie d'adhésion totale possible (c'està
dire lorsque Ac = A) à l'énergie de flexion d'une sphère :
ΓA N˜
γ = = (5.3)
8πκc 8πκc
Le rapport ̃/ en fonction de γ et du volume réduit v (v1 = v2 = v) est présenté sur la Fig. 5.1,
qui montre comment l'énergie d'adhésion effective ̃ est liée à l'énergie LJ par paire.
˜
FIGURE 5.1 : Le rapport de l'énergie d'adhésion effective à au
l'énergie par paire . Ce rapport dépend faiblement de la configuration des
deux globules rouges collés. Des simulations sont effectuées pour le
système jusqu'à ce qu'il atteigne l'équilibre. Les données rapportées sont
moyennées sur 250 points non corrélés dans les simulations des états
d'équilibre. En moyenne, /˜ = 4,23 ± 0,03. (Simulations de Masoud Hoore)
Pour des valeurs différentes, la distance d'équilibre entre les deux membranes peut
changement, conduisant à une relation différente entre et ̃. C'est la raison principale d'une augmentation
de ̃/ avec une diminution de γ. Une très faible dépendance de ̃/ au volume réduit v peut être due à la
courbure locale de contact. De plus, pour v suffisamment grand, les membranes en configuration
doublet sont sous tension, ce qui peut contribuer à la dépendance du rapport ̃/ visàvis de v. Enfin,
l'amplitude des fluctuations thermiques d'une membrane RBC est connue pour être spatialement non
uniforme le long de la surface [121, 122], et de dépendre de la forme de la membrane, de la courbure
locale et de la tension [123].
Les fluctuations thermiques de la membrane sont incluses dans le modèle et introduiraient effectivement
une répulsion à courte portée entre deux membranes.
5.3 Méthodes expérimentales
Le sang a été prélevé par piqûre au doigt de donneurs sains (voir section 2.1.1). Les globules rouges
ont été lavés deux fois avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS, 290 mOsm) en suivant
la procédure standard [124]. Ensuite, les globules rouges ont été remis en suspension dans plusieurs
solutions pour obtenir plusieurs configurations de doublet. Afin d'avoir différentes énergies d'adhésion,
nous avons préparé des solutions de dextrane avec différents poids moléculaires :
• 40 kDa à une concentration de 10 mg/ml avec une énergie d'adhésion proche de 1
µJ/m2 ;
µJ/m2 ;
µJ/m2 .
Le fibrinogène a été ajouté à une concentration de 6 mg/ml au plasma autologue car il n'induit pas
d'agrégation spontanée par luimême. Une solution hypotonique de NaCl à 0,6 % a également été
préparée pour augmenter le volume des globules rouges. Pour induire l'agrégation, du dextrane 70 kDa
a été ajouté avec une concentration de 20 mg/ml dans cette solution. Le taux d'hématocrite a été
maintenu à 0,5 % dans chaque échantillon. Une si faible concentration de globules rouges nous permet
de manipuler librement les cellules avec des pincettes optiques holographiques. Ensuite, les cellules
ont été maintenues en épinglant deux extrémités opposées avec quatre pièges optiques. Les globules
rouges ont été réunis pour former des doublets et les pièges ont été libérés, afin qu'ils puissent
s'agréger spontanément. Comme le dextran est connu pour induire une agrégation spontanée [21],
nous avons observé la formation de rouleaux au cours du temps. Enfin, les globules rouges ont été
laissés à sédimenter pendant 30 minutes et des microphotographies ont été prises à l'aide d'un objectif 60 fois.
Les morphologies de ces agrégats ont été caractérisées de manière similaire à celles des simulations.
5.4. Résultats sur les formes de doublets 87
5.4 Résultats sur les formes de doublets
La force d'adhérence théorique Γ est liée aux concentrations de dextrane et de fibrinogène dans
les expériences [125, 21]. Les formes de doublet des globules rouges sont régies par la force
d'adhérence (Γ, ou de manière équivalente), les volumes réduits v1 et v2 et les paramètres
élastiques tels que la rigidité à la flexion κc et l'élasticité au cisaillement G. La force d'adhérence
des membranes des globules rouges est d'environ 1 µJ/m2. dans le plasma et environ 10µJ/m2
dans les solutions de dextrane [24], correspondant à γ = 4 dans le plasma et γ = 40 dans le
dextrane. Le volume de RBC est également sujet à changement dans différentes solutions, et
peut également varier d'une cellule à l'autre dans un échantillon donné. La figure 5.2 montre les
conformations de doublet, la surface de contact et l'énergie de flexion pour divers v1 = v2 = v et
γ. L'aire de contact Ac est normalisée par l'aire RBC A. L'énergie de flexion Eb calculée
directement à partir des simulations et normalisée par l'énergie de flexion 8πκc d'une sphère,
b = (5.4)
Mib 8πκc
où b désigne l'énergie de flexion réduite.
FIGURE 5.2 : Configurations du doublet RBC en fonction de v1 = v2 = v et γ
avec premier point de contact aligné et décalé. (une)
Courbes de contour pour la zone de contact et l'énergie de flexion réduite
pour les globules rouges alignés. (b) Graphique de contour pour la différence
entre l'énergie libre du doublet et les globules rouges libres (énergie de
déformation). Le changement d'énergie libre est normalisé par l'énergie de
flexion d'une vésicule avec un module de flexion κc, 8πκc, et la barre de
couleur a une échelle logarithmique. Les points noirs (•) dans les tracés de
contour représentent les valeurs pour lesquelles des simulations ont été
effectuées. (Simulations de Masoud Hoore)
Nous avons observé que la forme des doublets dépend fortement du premier point de contact
entre les deux globules rouges. La zone de contact est plus sensible à l'adhérence réduite
la résistance et l'énergie de flexion sont plus sensibles au volume réduit, voir Fig. 5.2 (a). Dans
l'ensemble, à mesure que les volumes réduits diminuent et que la force d'adhérence augmente, la
surface de contact et l'énergie de flexion de la membrane augmentent. Les configurations à la fois
pour les doublets initialement alignés et pour les doublets décalés (Fig. 5.3 (a)) sont représentées
sur les Fig. 5.3 (c) et (d).
FIGURE 5.3 : Configurations du doublet RBC en fonction de v1 = v2 = v et γ avec
premier point de contact aligné et décalé. (a) La configuration d'un doublet dépend
de la façon dont les globules rouges établissent leur premier contact. Les globules
rouges peuvent établir le premier contact alors qu'ils sont dans des configurations
alignées ou décalées. (b) La différence entre l'énergie libre des doublets dans les cas
alignés et décalés.
Si Ealig − Eo f f est positif, cela signifie que le doublet de décalage a une énergie libre
plus petite, de sorte que c'est une configuration plus favorable.
Les diagrammes de phase des cas (c) aligné et (d) décalé sont différents dans la
région, où Ealig − Eo f f est positif. Différentes phases
en csoupe.
e distinguent
Les points
par
nloirs
eurs
(•)
vues
dans
les diagrammes de phase représentent les simulations effectuées. Notez que les
limites de phase sont dessinées schématiquement pour guider l'œil. (Simulations de
Masoud Hoore)
Les phases des doublets de globules rouges pour les configurations initialement alignées et décalées
correspondent à des forces d'adhérence élevées ou à des volumes réduits élevés. Cependant, un décalage
des phases doublet est observé pour les faibles forces d'adhérence et les faibles volumes réduits, voir Fig. 5.3
(b), (c) et (d). Ceci indique l'existence de plusieurs minima locaux dans
le paysage de l'énergie libre, ce qui rend le premier point de contact important pour RBC doublets. De multiples
minima locaux dans l'énergie libre devraient également exister pour les vésicules fluides, même si cela n'a pas été
démontré jusqu'à présent. Par rapport aux vésicules, les globules rouges possèdent également un réseau de
spectrine élastique, qui peut avoir une précontrainte locale anisotrope. Cette propriété supplémentaire contribue
probablement à un paysage énergétique complexe pour les doublets RBC avec plusieurs états métastables ou
minima locaux. Différentes phases peuvent être distinguées, comme illustré sur les Figs.5.3 (c) et (d). Toutes les
formes observées sont classées par leur surface de contact et leurs surfaces libres non collées, comme suit :
• FlatBiconcave (FB) zone rose : Cette phase avec une aire de contact plane et des concavités restantes
aux surfaces libres est obtenue pour v1 = v2 ≈ 0,3 − 0,4 et γ ≤ 8 lorsque les globules rouges s'alignent sans
décalage. Les figures 5.3 (c) et (d) montrent que la phase FB se rétrécit à une très petite région si les
globules rouges sont initialement en contact avec un décalage. Ainsi, la phase FB est moins susceptible
d'être vue dans des conditions physiologiques, où le contact décalé est beaucoup plus probable que le
contact aligné.
Contactez.
• FlatConcave (FC) zone blanche : si les deux globules rouges sont gonflés, la phase MF devient instable et
les deux globules rouges se réconcilient en faisant une surface de contact plate et en gardant leurs surfaces
libres proches de la sphérique. Cette phase apparaît à grands volumes réduits.
• SigmoïdeConcave (SC) ou mieux connue sous le nom de "YinYang" zone rouge clair : les globules rouges
forment une zone de contact sigmoïde, qui est différente de la forme sigmoïde (concave) native d'une
membrane de globules rouges. Cette condition se produit à des forces d'adhérence élevées, car l'énergie
libre de flexion des globules rouges augmente considérablement, mais est compensée par la diminution de
l'énergie d'adhérence. Étant donné que la vue en coupe transversale de la forme sigmoïdeconcave
ressemble au symbole YinYang, nous l'appelons également phase YinYang.
• MâleFemelle (MF) zone bleue : Les deux globules rouges prennent la forme d'une coupelle et s'enfichent
l'un dans l'autre comme les bornes mâle et femelle d'une prise. La phase MF fournit la surface de contact la
plus élevée au détriment de l'énergie de flexion, de sorte que l'énergie totale est minimisée.
• SigmoïdeBiconcave (SB) zone verte : Cette phase est située entre les phases Yin Yang et MF. Les
globules rouges sont attachés les uns aux autres de manière à ce que la partie concave d'un globule rouge
remplisse la partie convexe de l'autre. En d'autres termes, la surface de contact est sigmoïde, tandis que la
surface libre reste biconcave.
Bien que la phase FB soit la configuration de doublet stable pour les doublets alignés,
l'énergie de flexion à cet état n'est pas à un minimum global. Cela peut être vu à partir de la
différence d'énergie libre entre les configurations alignée et décalée de la Fig. 5.3 (b). Dans
des conditions physiologiques (v ≈ 0,64), la phase MF peut être observée lorsque les globules
rouges établissent le premier contact dans une configuration alignée, ce qui est peu susceptible
d'être observé expérimentalement. La figure 5.5 illustre différentes formes de doublet de deux
globules rouges avec des volumes réduits différents pour une énergie d'adhésion réduite fixe
γ = 8. Une autre phase, la phase gaine, apparaît ici.
Phase de gaine : si le volume réduit d'un globule rouge est grand et de l'autre est petit, le
premier gonflera en une forme elliptique et le second se pliera en forme de coupe. Par
conséquent, la meilleure configuration pour leur adhérence se produit lorsque la coupelle
interne de ce dernier RBC correspond à la courbure gonflée de l'ancien RBC. Cette configuration
correspond à la condition d'énergie libre minimale pour presque toutes les forces d'adhérence.
Étant donné que la plupart des globules rouges ont un volume réduit dans la plage de 0,4
à 0,8, une telle phase ne se produit pas dans des conditions physiologiques. Dans le cas de
volumes réduits inégaux (voir Fig. 5.4 et Fig. 5.5), l'aire de contact est à peu près proportionnelle
−1
à l'inverse de la moyenne des volumes réduits (Ac/A (v1 + v2) à) e0t
varie
La fdlexion
,7. 'environ
0
réduite
l'énergie b,1 du premier RBC diminue avec l'augmentation
variation du dve
olume
v1, mrais
éduit
est
v2
peu
du ssensible
econd RàBC
une
Afin d'étudier l'effet de l'élasticité de cisaillement du réseau de spectrine sur les phases
doublets, la membrane le module de cisaillement G est varié. Un module de cisaillement élevé
G est pertinent pour les globules rouges malades, comme dans le cas du paludisme.
FIGURE 5.4 : Configurations du doublet RBC en fonction de v1 et v2
à une force d'adhérence constante γ = 8. Les tracés de contour
montrent la surface de contact et l'énergie de flexion réduite du
premier RBC en fonction de v1 et v2. Les points noirs (•) représentent
les valeurs pour lesquelles des simulations ont été effectuées.
(Simulations de Masoud Hoore)
FIGURE 5.5 : Configurations du doublet RBC en fonction de v1 et v2 à une force
d'adhérence constante γ = 8. Les vues latérales et en coupe de certaines
configurations sont présentées dans le diagramme de phase, en omettant certaines
formes pour plus de clarté. Les différentes phases sont séparées par des couleurs
différentes. La phase SB se produit dans une région étroite entre les phases Yin
Yang et MF. La membrane est supposée sans contrainte dans sa forme biconcave
avec v = 0,64.
Les limites de phase sont dessinées schématiquement pour guider l'œil.
La figure 5.6 (a) montre le diagramme de phase avec la surface de contact et l'énergie de flexion réduite
en fonction du module de cisaillement et de la force d'adhérence pour un volume réduit constant de globules
rouges sains v ≈ 0,64. La Fig. 5.7 montre le diagramme de phase de plusieurs doublets de globules rouges en
fonction de γ et µ. Le module de cisaillement des globules rouges sains est compris entre 2 et 12µN/m [126,
127, 128, 120, 129, 130], ce qui correspond au module de cisaillement réduit µ = GA/8πκc de 35215, à
condition que le la rigidité en flexion est de 70kBT.
FIGURE 5.6 : Configurations du doublet RBC en fonction du module de
cisaillement réduit du réseau de spectrine µ = GA/8πκc et de la force
d'adhérence réduite γ à un volume réduit constant v = 0,64. (une)
Les tracés de contour montrent la zone de contact et l'énergie de flexion
réduite. Les points noirs (•) représentent les valeurs pour lesquelles des
simulations ont été effectuées. (b) Dépendance de la zone de contact sur
la force d'adhérence pour différentes valeurs µ . Une discontinuité dans la
zone de contact est observée lorsque l'un ou les deux globules rouges
perdent leur forme biconcave d'origine. (Simulations de Masoud Hoore)
FIGURE 5.7 : Configurations du doublet RBC en fonction du module de cisaillement
réduit du réseau spec trin µ = GA/8πκc et de la force d'adhérence réduite γ à un
volume réduit constant v = 0,64. Diagramme de phase des doublets RBC en fonction
de γ et µ, où différentes phases sont séparées par différentes couleurs. Les limites
de phase sont dessinées schématiquement pour guider l'œil. Les vues latérales et en
coupe de certaines configurations sont présentées, en omettant certaines formes
pour plus de clarté. Les modules de faible cisaillement se rapprochent des doublets
de vésicules. La membrane est supposée sans contrainte dans sa forme biconcave
avec v = 0,64 (Simulations par Masoud Hoore)
Les phases obtenues pour des modules de cisaillement très faibles concordent bien avec l'étude numérique
de minimisation de l'énergie pour les vésicules [118], où la surface de contact est plate pour les faibles forces
d'adhérence et se déforme lorsque la force d'adhérence augmente. La phase FB apparaît dans une gamme
plus large de forces d'adhésion lorsque le module de cisaillement est bien inférieur à celui d'un RBC sain. De
plus, la phase FC, qui n'a jamais été détectée pour des volumes réduits de RBC normaux de v ≈ 0,64, apparaît
à des modules de cisaillement très faibles. En revanche, aux modules de cisaillement des globules rouges
sains, les phases MF et SB se retrouvent à de faibles forces d'adhésion. Si le module de cisaillement est très
élevé, les globules rouges ne
n'ont pas tendance à former une zone de contact à partir de leur centre.
Les phases du doublet sont déterminées par l'équilibre des énergies de déformation et de l'énergie
d'adhésion. L'élasticité de cisaillement de la membrane attribuée au réseau de spectrine a un effet
important sur les phases de doublet, comme le montrent les Fig. 5.6 (a, b) et Fig. 5.7. Pour les doublets de
vésicules, l'effet de l'élasticité de cisaillement est absent car les vésicules sont constituées d'une membrane
fluide. En conséquence, la région inférieure du diagramme de phase (µ → 0) de la Fig. 5.6 (a, b) et de la
Fig. 5.7 correspond aux travaux précédents sur les doublets avec les trois phases FC, FB et Sigmoïde
Concave (YinYang ) [118, 119, 12, 120], caractérisée par la surface de contact uniquement. Une nette
différence entre nos résultats et ceux des études précédentes sur les vésicules est que la phase FB
n'apparaît que si l'élasticité de cisaillement du réseau de spectrine RBC est suffisamment petite, comme le
montre la Fig. 5.7.
Par conséquent, une telle phase ne peut pas être observée pour les doublets RBC, car ils ont une
élasticité de cisaillement significative.
La figure 5.6 (b) montre qu'en augmentant la force d'adhésion, l'aire de contact présente deux sauts
discontinus pour un µ fixe. Le premier saut de Ac à très faible γ ≤ 1 se produit lorsque l'interaction
d'adhésion surmonte les fluctuations thermiques de la membrane et la diffusion cellulaire. La deuxième
discontinuité dans Ac manifeste une transition lorsqu'un ou les deux globules rouges perdent leur forme
biconcave d'origine en formant soudainement une zone de contact plus grande dans un doublet. Par
exemple, cela se produit lorsque les formes FB, SB et MF sont atteintes pour la première fois pour 1 < γ <
10, de sorte qu'une plus grande surface de contact se forme rapidement.
Fait intéressant, les transitions ultérieures avec l'augmentation de γ (par exemple vers la phase YinYang)
sont continues, puisque la zone de contact est continuellement gagnée avec une augmentation de la force
d'adhérence. Ainsi, le flambage d'une fossette de membrane et la formation rapide d'une plus grande
surface de contact peuvent être considérés comme des signatures de transition discontinue. Une
augmentation de l'élasticité de cisaillement retarde généralement cette transition discontinue en termes de
γ et réduit la surface de contact, comme on peut le voir sur la Fig. 5.6 (b). Ces résultats sont qualitativement
cohérents avec une discontinuité d' Ac trouvée pour les doublets de vésicules [118]. Plus généralement,
ces différences de surface de contact doivent être prises en compte, expérimentalement, pour bien évaluer
les énergies d'interaction.
5.4.1 Influence de la forme sans contrainte
Étant donné que l'élasticité de cisaillement des membranes a un effet significatif sur les configurations de
doublet, la forme sans contrainte des RBC pourrait également jouer un rôle important dans la détermination
de la forme de la membrane des RBC et de leurs phases de doublet. Que la spectrine
réseau d'un RBC est sans contrainte dans la forme biconcave ou sphérique ou quelque chose entre les deux
est encore en débat [46, 131, 132, 133]. Jusqu'à présent dans ce travail, les globules rouges étaient sans
contrainte à leur forme biconcave.
Afin d'étudier l'effet de l'état sans contrainte des globules rouges sur les phases de doublet, la forme biconcave
sans contrainte est comparée à un cas où le réseau est sans contrainte à une forme de sphère dégonflée avec
une excentricité de 0,94. Le changement de configuration des doublets est appréciable, comme le montre la
figure 5.8 (b).
FIGURE 5.8 : Effet de la forme sans contrainte des globules rouges sur les phases
de doublet pour v1 = v2 = 0,64. ( a ) Aire de contact en fonction de γ pour la grotte
bicon et les formes presque sphériques (avec une excentricité de 0, 94) sans
contrainte. ( b ) Les formes des doublets RBC pour µ = 81, montrant des différences
appréciables pour les deux formes sans contrainte. Les frontières entre les différentes
formes sont dessinées schématiquement pour guider l'œil.
La différence la plus importante entre les deux cas est le changement de la phase SB en phase MF à de
faibles forces d'adhérence. Si la forme sans contrainte des globules rouges est proche d'une sphère, le
passage à la phase YinYang se produit à des forces d'adhérence légèrement inférieures par rapport à la
forme biconcave sans contrainte, comme le montre la Fig. 5.8 (b). En pratique, ce petit changement ne peut
pas être détecté expérimentalement, non seulement à cause du manque de précision de l'imagerie, mais aussi
à cause de la variance naturelle
dans les propriétés mécaniques des membranes RBC et leurs volumes réduits [134].
Comme discuté cidessus, la transition de la forme biconcave d'origine des deux globules rouges à une
forme de doublet avec une grande surface de contact (par exemple, les formes FB, SB, MF) est
discontinue dans Ac pour la forme biconcave sans contrainte, voir Fig. 5.6 (b) et Fig. 5.8 (a). La figure
5.8 (a) montre également que cette transition est discontinue dans Ac pour la forme sans contrainte de
0,94.
De fortes modifications de la forme des globules rouges (par exemple pour un doublet YinYang)
conduisent probablement à des déformations locales appréciables dans le plan des membranes
cellulaires. Au niveau de la zone de contact, il est intuitif de s'attendre à ce que les membranes RBC
soient comprimées en raison des interactions adhésives, tandis que les surfaces libres sont
vraisemblablement soumises à une expansion de surface. Ces modes de déformation sont principalement
contrôlés par le module de compression de surface d'une membrane. Le module de compression de
surface dans notre modèle est égal à 2G + k1 + ka, où G est le module de cisaillement et les autres
termes correspondent aux contraintes locales et globales de conservation de surface. Ici, k1 ≈ G, tandis
que ka G tel que la contrainte de surface locale conduit à une amélioration assez légère du module de compression de surfa
Par conséquent, sous des déformations suffisamment fortes, la zone locale d'une membrane devrait
subir une déformation appréciable.
Afin d'élucider les déformations locales, les changements de surface locale et le rôle de la contrainte
de surface locale, nous présentons sur la Fig. 5.9 une comparaison des déformations locales de la
membrane pour un doublet YinYang (γ ≈ 85 et µ = 80) à l'aide d'un RBC modèle avec et sans la
contrainte de zone locale. La Fig. 5.9 (c) confirme que les membranes sont comprimées au niveau de la
zone de contact et dilatées au niveau des surfaces libres. Ceci est également observé dans les
distributions bimodales des contraintes de liaison et de la zone locale dans les Figs. 5.9 (ab).
FIGURE 5.9 : Effet de la contrainte de surface locale dans le modèle de membrane
sur un doublet YinYang pour γ ≈ 85, µ = 80, et v1 = v2 = 0,64. ( a ) Distributions de
déformation de liaison à partir de simulations avec et sans contrainte de zone locale.
La déformation de la liaison est définie comme l/l0 − 1, où l est la longueur d'une liaison
déformée et l0 est sa longueur d'équilibre correspondante. ( b ) Distributions des
déformations locales de la zone triangulaire. La déformation de surface est définie
comme A/A0 − 1, où A est la surface d'un triangle déformé dans le réseau de ressorts
et A0 est sa surface imposée à la forme d'équilibre biconcave. (c)
Distribution des contraintes locales sur les globules rouges au sein d'un doublet Yin
Yang. Les membranes RBC présentent une déformation en compression (ou
déformations de surface négatives) au niveau de la zone de contact et sont étirées
principalement au niveau des surfaces libres caractérisées par des déformations de surface positives.
Ici, la bimodalité dans la zone locale provient des différences entre les parties adhérentes et libres de la
membrane. La bimodalité des longueurs de liaison est liée au coefficient de Poisson positif de notre modèle de
réseau élastique, ce qui implique que l'étirement dans une direction s'accompagne d'une compression dans la
direction orthogonale.
Les déformations locales restent approximativement dans la plage de [0,3,0,3] et leurs valeurs absolues sont
légèrement inférieures pour le cas avec la contrainte de surface locale par rapport à celui sans cette contrainte.
Cependant, dans les deux cas, des doublets YinYang sont observés et leurs formes sont visuellement
indiscernables. Ainsi, pour les salariés
force de la contrainte de zone locale, elle joue tout au plus un rôle secondaire dans la détermination
des formes de doublets pour la gamme de forces d'adhérence étudiée ici.
5.4.2 Comparaison avec des expériences
Formes de doublet
Les images expérimentales des différentes phases sont comparées aux résultats de simulation de
la Fig. 5.10. La phase FB n'est pas observée dans les expériences et n'est pas prédite par les
simulations pour les volumes réduits physiologiques de globules rouges. Tant dans les simulations
que dans les expériences, les doublets MF se forment lorsque la force d'adhérence est intermédiaire
et que le volume réduit est faible. La phase YinYang apparaît lorsque la force d'adhésion est
élevée. La phase SB est considérée comme un état de transition entre ces deux phases.
La phase FB n'a pas été observée dans les expériences. La phase FC se produit lorsque les deux
globules rouges sont gonflés et la phase gaine se produit lorsqu'il existe une différence significative
dans les volumes réduits des deux globules rouges. Pour voir la phase FC dans les expériences,
l'osmolalité de la solution doit augmenter d'environ deux fois. Pour augmenter le volume réduit de
globules rouges dans les expériences, ils ont été immergés dans une solution hypotonique de NaCl.
À de faibles taux de cisaillement, les globules rouges s'agrègent en piles appelées rouleaux.
FIGURE 5.10 : Comparaison des formes expérimentales et simulées de doublets de
RBC déterminées par la force d'adhérence, le module de flexion et le volume réduit
de RBC. Pour les simulations, les vues de côté et en coupe sont présentées pour
chaque cas. Les phases (a) sigmoïdebiconcave, (b) mâlefemelle, (c) sigmoïde
concave (YinYang), (d) gaine, (e) plateconcave et (f) platebiconcave sont
représentées. (a) a été observé dans le dextran (70kDa) 20mg/ml, (b) dans le
Dextran (40kDa) 10 mg/ml, (c) dans le plasma + fibrinogène à 6mg/ml, (d) et (e) à
la fois dans une solution hypotonique de dextran (70kDa) à 20mg/ml et (500kDa) à
10mg/ml
Formation de rouleaux
Les rouleaux augmentent considérablement la viscosité du sang à de faibles taux de cisaillement [135, 136,
137]. La nucléation des rouleaux commence à partir de doublets RBC. Alors que certaines structures de
doublet permettent la formation de gros rouleaux, d'autres empêchent la formation de gros rouleaux. Parmi
toutes les phases doublets, les phases MF et SB laissent les globules rouges former de gros rouleaux à
structure droite (linéaire). Cependant, la phase YinYang empêche l'apparition de longues structures droites.
Ainsi, la taille des rouleaux dans une solution de globules rouges dépend de leur force d'adhérence qui est
déterminée par la concentration de différents facteurs adhésifs dans la solution (ex. dextrane, fibrinogène). La
figure 5.11 montre plusieurs résultats expérimentaux et simulés de différentes structures de rouleaux.
Les formes des rouleaux à haut pouvoir adhésif sont très différentes selon les volumes réduits de globules
rouges et le nombre de globules rouges dans le rouleau. En con
trast, les phases MF et SB devraient permettre d'augmenter sans limite la taille des structures en rouleaux
rectilignes. Notez qu'à des forces d'adhérence suffisamment élevées, plus complexes
Des structures d'agrégats de RBC, autres que des rouleaux droits, peuvent apparaître [138].
FIGURE 5.11 : Différentes formes de rouleaux dans des expériences et des
simulations avec différents doublets de nucléation : (a) sigmoïde (b) mâle
femelle et (c) platconcave. (a) a été observé dans du dextran (70kDa) à 20 mg/
ml, (b) dans du dextran 40 kDa à 10 mg/ml et (c) dans du dextran (500kDa) à 10
mg/ml
La limite de la nucléation en rouleau peut s'expliquer par l'énergie libre de l'ensemble du système.
La formation de doublets modifie l'énergie libre du système de 2Ede f − ΓAc. Ede f est l'énergie de
déformation dprincipe,
'un RBC,
il perincipalement
st toujours positif
due pàuisque
la rigidité
tout
eén
cart
flexion
par erapport
t à l'élasticité
à la forme
en cbisaillement.
iconcave d'équilibre
En
d'un globule rouge doit avoir une énergie plus élevée. Par conséquent, l'énergie d'adhésion ΓAc doit être
supérieure à 2Ede f L'ajout d'un globule rouge supplémentaire au doublet pour former un agrégat triplet
pour
de globules rouges augmente l'énergie libre totale de ∆E+ que
f −la
= Ede ΓfAc
ormation
+ E de doublets soit favorable.
0
0 où E est l'addition de f , de f
est l'énergie de déformation
l'énergie de déformation de l'agrégat d'origine, Ede f du RBC
nouvellement ajouté à l'agrégat d'origine et −ΓAc est l'énergie d'adhérence qui lui est due. En supposant
que les autres globules rouges de l'agrégat ne se déforment pas substantiellement, on obtient E ≈ 0 ;
0éformation
sinon, l'énergie de dune
dans la ceponfiguration
t
d'adhérence
énergie élevée prour
lus éarrangée.
de tous
les les
Cgette
lobules
globules configuration
rouges
rouges déjà ddans
e
réarrangée
f dl'agrégat,
oit être parise
p duisqu'ils
éfinitivement
en compte
s'éloignent de leur configuration d'équilibre. Pour les phases SB et MF, l'ajout d'un RBC à l'agrégat ajoute
un ∆E+ négatif constant à l'énergie libre de sorte que la croissance du rouleau est énergétiquement
favorable. ∆E+ est presque constant puisque la zone de contact et la courbure du RBC nouvellement
ajouté sont similaires aux autres RBC dans l'agrégat. Au contraire, ∆E+ croît lorsqu'un nouveau RBC est
ajouté à un doublet YinYang, car la zone de contact car le nouveau RBC est inférieur à la surface de
contact d'un doublet, et le nouveau RBC se déforme beaucoup plus pour s'adapter à la forme concave de
5.5. conclusion 103
un rouleau. En conséquence, ∆E+ devient positif à un moment donné, empêchant davantage de
globules rouges d'adhérer à l'agrégat. Ce point limite se produit pour des tailles de cluster plus grandes
lorsque la force d'adhérence Γ augmente.
5.5 Conclusion
Le travail présenté ici visait à compléter les simulations 3D réalisées par M.
Hoore (FZJülich). Un diagramme de phase complet a été établi pour les doublets tridimensionnels en
faisant varier des paramètres tels que : le volume réduit, la rigidité en flexion et l'élasticité en
cisaillement. Les résultats de la simulation démontrent diverses phases de doublet qui pourraient être
trouvées expérimentalement en faisant varier l'osmolalité et la concentration de l'agent d'agrégation.
Les phases du doublet des globules rouges sont principalement définies par l'interaction de l'énergie
de flexion et de l'énergie d'adhérence, et sont étroitement liées au volume réduit des globules rouges.
Cependant, l'élasticité de cisaillement des membranes RBC, due au réseau de spectrine sous leurs
bicouches lipidiques, est un acteur clé et affecte leurs phases de doublet.
Ce travail montre que la nucléation en rouleau dépend de la façon dont les globules rouges forment
d'abord des doublets. Les expériences et les simulations rapportent que le doublet mâlefemelle et
sigmoïde biconcave sont les plus favorables à la nucléation en rouleaux plus gros.
Ces résultats suggèrent que des variations des propriétés mécaniques des globules rouges (dues par
exemple à des pathologies spécifiques) peuvent significativement altérer leur capacité à s'agréger en
grandes structures ou au moins modifier la morphologie de ces structures et la rhéologie sanguine
associée.
Continuer
Le travail présenté ici vise à compléter les simulations 3D réalisées par M. Hoore (FZJülich). Un
diagramme de phase complet a été établi pour des doublets tridi mensionnels en faisant varier des
paramètres tels que : volume réduit, rigidité à la flexion et élasticité au cisaillement. Les résultats de la
simulation ont montré dif
férentes phases de doublets qui ont pu être trouvées expérimentalement en faisant varier l'osmolalité
et la concentration de l'agent d'agrégation. Les phases de doublets sont principalement définies par
l'interaction de l'énergie de flexion et de l'énergie gie d'adhésion, et sont liées au volume réduit des
globules rouges.
Cependant, l'élasticité de cisaillement des membranes des GR, due au réseau de spectrines sous
leurs bicouches lipidiques, est un acteur clé et affecte leurs phases en doublet. Ce travail montre que
la nucléation des rouleaux dépend de la façon dont les GRs forment initialement les doublets. Les
expériences et les simulations
indiquer que les doublets "mâlefemelle" et le doublet "sigmoïdebiconcave" sont les plus
favorables à la nucléation pour former de plus grands rouleaux. Ces ré sultats reconnus
que les variations des propriétés mécaniques des globules rouges (dues par exemple à
des pathologies spécifiques) peuvent modifier de manière significative leur capacité à
s'agréger en plus grandes structures ou du moins, changer de la morphologie de ces
structures et la rhéologie sanguine associée.
Zusammenfassung
Die hier vorgestellten Arbeiten zielten darauf ab, die von M. Hoore (FZJülich) durchgeführten
3DSimulationen zu ergänzen. Es wurde ein vollständiges Phasendi agramm für 3
dimensionale Dubletten erstellt, indem Parameter wie: reduziertes Volumen, Biegesteifigkeit
und Scherelastizität variiert wurden. Die Simulationsergeb nisse zeigen verschiedene
Dublettenphasen, die experimentell durch Variation der Osmolalität und der Konzentration
des aggregierenden Agens gefunden werden konnten. Die RBDublettenphasen werden
hauptsächlich durch das Zusammen spiel von Biege und Adhäsionsenergie definiert und
stehen in enger Beziehung zum reduzierten Volumen der RB. Die Scherelastizität der RB
Membranen aufgrund des Spektrinnetzwerks unter ihren Lipiddoppelschichten ist jedoch ein
Schlüsselfak tor und beeinflusst ihre Dublettenphasen. Diese Arbeit zeigt, dass die Rouleau
Keimbildung davon abhängt, wie die Erythrozyten zuerst Dubletten bilden. Sowohl aus
Experimenten als auch aus Simulationen geht hervor, dass das männlichweibliche und das
sigmoidbikonkave Dublett am günstigsten für die Nukleation zu größeren Rouleaux ist. Diese
Ergebnisse deuten darauf hin, dass Variationen in den mech anischen Eigenschaften der
Erythrozyten (zB aufgrund spezifischer Pathologien) ihre Fähigkeit, zu großen Strukturen zu
aggregieren, signifikant vermindern kön nen oder zumindest die Morphologie dieser Strukturen
undene damit verundenänder verbunden.
105
Chapitre 6
Flux tourbillonnaires induits par les globules
rouges
Alors que les parties précédentes de cette thèse sont consacrées à l'étude de l'agrégation des
globules rouges en stase, ce chapitre est consacré à l'observation des globules rouges en flux.
Cette étude a déjà été déposée [139] et vise à caractériser l'écoulement autour d'un seul GR mais
aussi autour de deux GR voisins. Nous nous sommes concentrés sur deux formes proéminentes :
les chaussons et les croissants. Le champ d'écoulement autour d'un groupe hydrodynamique de
deux formes en croissant a également été étudié. Des simulations informatiques ont indiqué la
présence de structures de type vortex entre les globules rouges voisins [36, 140] mais les
expériences sur cet événement particulier étaient incomplètes et très rares [44]. Ici, nous présentons
une observation expérimentale directe de (i) l'écoulement autour des globules rouges isolés et (ii)
le flux tourbillonnaire entre les globules rouges groupés dans un microcanal rectangulaire complété
par des simulations 3D réalisées par A.Guckenberger, J. Roemer et S.Gekle ( de l'université de
Bayreuth). Nous constatons que la fréquence de rotation des tourbillons est en bonne approximation
inversement proportionnelle à la distance entre les cellules.
6.1 Présentation
Outre sa pertinence physiologique, le flux sanguin dans les microcapillaires est un excellent
exemple d'un problème d'interaction fluidestructure biologique entre les globules rouges élastiques
d'une part et le flux hydrodynamique du plasma d'autre part [141, 142, 143]. Au cours des dernières
années, une certaine attention a été accordée à la dynamique des globules rouges dans des
canaux cylindriques ou rectangulaires connus pour être la configuration la plus courante dans les
modèles d'écoulements microfluidiques. En fonction de paramètres externes tels que la vitesse
d'écoulement, la taille du canal et la viscosité du plasma, deux formes principales ont émergé de
ces expériences expérimentales [144, 44, 145, 146, 42, 43] ainsi que numériques [147, 148, 149,
150, 41 , 151, 152, 43, 153, 154] ouvrages. Le premier, appelé chausson, est une forme allongée, non asymétrique
106 Chapitre 6. Flux tourbillonnaires induits par les globules rouges
dans lequel le RBC a tendance à s'écouler à une position stable légèrement éloignée du centre du
canal. Le second, presque axisymétrique dans les capillaires cylindriques et à deux plans de symétrie
dans les canaux rectangulaires, est appelé « parachute » dans les tubes cylindriques ou « croissant
» dans les sections rectangulaires et s'écoule au centre du canal.
De plus, certains travaux ont observé des amas de deux globules rouges ou plus formés et maintenus
ensemble par des interactions hydrodynamiques [155, 156, 157, 158, 125, 45, 159, 140].
Bien qu'il y ait un bon accord entre les simulations numériques et les expériences concernant la
forme réelle des globules rouges, moins d'attention a été accordée à la résolution expérimentale du
champ d'écoulement du plasma environnant. Alors qu'en l'absence d'hématies, il s'agirait d'un simple
profil de Poiseuille parabolique, la présence d'hématies perturbe fortement l'écoulement. [160]
Comprendre le modèle de flux réel est cependant essentiel, par exemple, pour la distribution
d'agents nanométriques d'administration de médicaments ou de substances dissoutes dans le flux
sanguin microcapillaire [161, 162, 163, 140, 164, 165, 166, 167] ainsi que pour comprendre le nature
des interactions entre les cellules. Bien qu'il existe de nombreuses publications sur le champ
d'écoulement dans les microcanaux autour d'objets rigides ou peu déformables tels que des
microsphères ou des gouttelettes [168, 169, 170, 171], les données expérimentales sont rares pour
les écoulements complexes résultant du croissant décrit cidessus. et les mouvements de pantoufle
des globules rouges. Dans les grappes de globules rouges, des simulations informatiques ont indiqué
la présence de structures de type vortex entre les globules rouges voisins [155, 156, 158, 140].
Ici, nous présentons une observation expérimentale directe de (i) l'écoulement autour des globules
rouges isolés et (ii) le flux tourbillonnaire entre les globules rouges groupés dans un microcanal
rectangulaire en utilisant le suivi des particules. Nous constatons que la fréquence de rotation des
tourbillons est inversement proportionnelle à la distance RBC. Nos mesures de suivi des particules
sont en bon accord avec les simulations d'intégrales aux limites correspondantes.
6.2 Méthodes
6.2.1 Expériences
Pour imiter les capillaires sanguins, nous utilisons des canaux rectilignes rectangulaires de 12 µm
de largeur, 10 µm de profondeur et environ 40 mm de longueur sous forme de puces microfluidiques.
La caméra est positionnée de telle sorte que le côté long (12 µm) soit visualisé sur les images. Les
canaux sont en polydiméthylsiloxane (PDMS) [172]. Pour éviter que les GR n'adhèrent aux parois,
les canaux sont rincés avec une solution tampon contenant de la BSA à 1 %. L'écoulement de la
suspension est observé au microscope avec un objectif à immersion dans l'huile (Nikon CFI Plan
Fluor 60x, NA = 1,25). Le champ d'observation est à 1 cm derrière la pression
6.2. Méthodes 107
entrée. Nous utilisons une caméra haute vitesse (HiSpec Fastec 2G) pour enregistrer des séquences d'images à des
cadences de 9000 ips. Nous étudions le flux à des vitesses cellulaires dans la plage de paramètres physiologiquement
pertinents et audelà de 1 mm/s à 10 mm/s. Les différentes vitesses de débit et de cellule sont obtenues avec un
contrôleur de pression (ELVEFLOW OB1+) à des pertes de charge allant de 100 mbar à 1000 mbar, respectivement
[43].
Pour visualiser le champ d'écoulement autour du RBC en mouvement, nous ajoutons des nanoparticules avec
revêtement de surface de polyéthylène glycol (PEG) et 250 nm de diamètre (Micromod) dans une solution aqueuse
contenant 0,1 % de Bovine Serum Albumine (BSA). Le sang est prélevé sur des donneurs sains après avoir donné un
consentement éclairé conformément aux exigences éthiques de l'Université de la Sarre, Sarrebruck, Allemagne
(Ärztekam mer des Saarlandes, numéro d'agrément 24/12). Nous utilisons une suspension de globules rouges lavés
dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à 0,5 % d'hématocrite avec des nanoparticules comme
traceurs.
Les échantillons sont régulièrement mélangés pour éviter la sédimentation des globules rouges.
La forme et la vitesse des cellules individuelles dépendent de la chute de pression appliquée et reste stationnaire
dans le temps d'observation dans nos expériences. Nous observons deux principales formes de cellules stables dans
nos géométries de canaux rectangulaires, des croissants à des vitesses d'écoulement plutôt faibles et des pantoufles
à des vitesses d'écoulement plus élevées, voir Fig. 6.1. Nous déterminons la vitesse des globules rouges à partir de la
séquence d'images enregistrées sur une distance de
©
100 µm. Les trajectoires des traceurs sont déterminées avec un programme MATLAB fait maison dans le cadre co
mobile du RBC individuel. Les figures 6.1 (a) et 6.1 (b) montrent des exemples de trajectoires sous forme d'images
superposées d'instantanés d'un RBC qui coule pour deux vitesses différentes. Le mouvement des traceurs entre deux
globules rouges est étudié dans un
manière similaire. Au cours de la période d'observation, la distance dRBC entre deux globules rouges consécutifs ne
change jamais de plus de 10 % dans nos expériences, c'estàdire que les deux cellules ont des vitesses comparables.
FIGURE 6.1 : Instantanés de globules rouges en forme (a) de croissant et (b) de
pantoufle, ainsi qu'une superposition de trajectoires expérimentales enregistrées
de traceurs. (c) et (d) représentent les lignes de courant et les formes de cellules à
partir des simulations numériques. La vitesse en (a) et (c) est vRBC = 2,83 mm/s et
en (b) et (d) vRBC = 6,50 mm/s.
Les trajectoires et les lignes de courant des particules sont représentées dans le
cadre de comouvement des globules rouges. Le fluide s'écoule de gauche à droite.
Simulations par A. Guckenberger et J. Roemer
6.2.2 Simulation 3D
Des simulations ont été réalisées par le groupe de Stephan Gekle et ses deux doctorants Achim
Guckenberger et Johannes Roemer à l'aide de simulations intégrales de frontière (BI) 3D pour résoudre les
équations de Stokes pour le fluide à l'intérieur et à l'extérieur du globule rouge [173, 174, 43]. Ceci est
justifié par le petit nombre de Reynolds d'environ 0,1.
6.2. Méthodes 109
Un avantage spécifique des simulations BI est que le champ d'écoulement instantané complet à tout
moment peut être calculé en ne connaissant que l'écoulement de fond parabolique et les forces sur la
paroi du cylindre et la membrane RBC [173, 174]. Une intégration temporelle n'est pas nécessaire
pour calculer le champ de flux. Dans notre modèle, les forces de membrane sont calculées selon les
modèles de Skalak et Helfrich pour le cisaillement, la surface et l'élasticité de flexion, respectivement
[175, 176, 142]. La condition aux limites de non glissement ainsi que la continuité des contraintes sont
imposées au niveau de la membrane. Des conditions aux limites périodiques le long du canal sont
utilisées avec une longueur de fenêtre de calcul de 42 µm. Cette longueur est suffisante pour retrouver
un écoulement de Poiseuille quasiment non perturbé loin de la cellule.
Pour le calcul du champ de vitesse, un instantané de la simulation est sélectionné et la forme du
RBC à ce moment est figée. Ensuite, le champ de vitesse est calculé sur une grille régulière dans le
plan central et transformé dans le cadre de référence du RBC mobile en utilisant sa vitesse de centre
de masse. Comme le patin présente une oscillation périodique à travers une série de formes
légèrement variables, une forme arbitraire parmi cellesci est sélectionnée pour calculer les lignes de
courant suivant la procédure décrite cidessus.
Dans une situation idéale, la symétrie miroir du système autour du plan central interdirait l'existence
de courants hors plan. En raison d'erreurs d'arrondi et de discrétisation, de petits courants parasites
hors du plan peuvent néanmoins apparaître, que nous fixons ici à zéro.
Les simulations sont réalisées dans la même géométrie de canal que les expériences.
Les figures 6.1 (c) et 6.1 (d) montrent les formes RBC 3D convergées et les lignes de courant
correspondantes dans le plan médian du canal pour un croissant et un pantoufle, respectivement.
Pour calculer les lignes de flux entre deux cellules dans un cluster, nous sélectionnons une forme de
croissant convergé à partir de la simulation avec un seul RBC à la vitesse correspondante.
Cette forme est ensuite copiée et les deux cellules sont placées dans le canal. Après un court laps de
temps de typiquement 70 ms, les lignes de courant sont calculées à partir d'une ligne verticale entre
les deux cellules. La procédure cidessus a dû être choisie car, dans les expériences, de nombreuses
distances différentes entre deux cellules pour une vitesse d'écoulement donnée peuvent être
observées, ce qui signifie que les clusters ne sont pas encore à leur distance convergée.
Le cadre de référence est la vitesse du centre de masse du RBC gauche.
Les lignes de courant ne contiennent que des informations directionnelles mais pas de vitesses
absolues qui sont nécessaires pour calculer la période de rotation des particules piégées dans les
tourbillons d'écoulement. Pour obtenir ces informations, nous plaçons des particules traceuses virtuelles
(toujours à partir d'une ligne de germes) et intégrons leur trajectoire dans le temps compte tenu du
champ d'écoulement extrait des simulations BIM (qui est supposé stationnaire). Cette procédure nous permet
pour obtenir non seulement les trajectoires des particules, mais aussi des informations temporelles
telles que les périodes de rotation. De plus, la Fig. 6.5 montre des trajectoires de particules intégrées
rétrospectivement dans le temps afin de démontrer la possibilité que des particules s'échappent des
tourbillons centraux dans des situations non parfaitement symétriques.
6.3 Résultats
6.3.1 Champ d'écoulement au voisinage d'un seul RBC
La figure 6.1 montre les résultats expérimentaux et numériques de nos mesures de champ d'écoulement
autour des deux formes de cellules caractéristiques. Loin de la cellule, le profil de vitesse dans le canal
rectangulaire est presque parabolique [177]. La vitesse des globules rouges est approximativement la
vitesse moyenne de l'écoulement liquide libre dans le canal car le flux volumique est conservé. La vitesse
de la cellule définit pour le cadre comobile et est toujours inférieure à la vitesse du fluide au milieu du
canal loin de la cellule. Aux faibles vitesses d'écoulement, la forme cellulaire observée est en forme de
croissant symétrique Fig. 6.1 (a) et 6.1 (c) [43] et les traceurs au milieu du canal devant la cellule
s'éloignent de la cellule, tandis que derrière vers la cellule, ils se dirigent vers elle, comme illustré à la
Fig. 6.2 (a).
6.3. Résultats 111
FIGURE 6.2 : Mouvement des traceurs dans le référentiel comobile d'un RBC
en forme de croissant s'écoulant avec une vitesse vRBC = 4,3 ± 0,1 mm/s. (une)
Instantané du RBC avec une superposition d'une trajectoire de traceur à partir
de la séquence d'images. (b) La vitesse vr,x dans le sens d'écoulement du
traceur lorsqu'il s'approche et s'éloigne de la cellule. La courbe d'ajustement est
une fonction sigmoïde empirique. La direction d'écoulement de la cellule est
indiquée par une flèche jaune et la trajectoire du mouvement est indiquée par
des chiffres.
Dans le référentiel comobile, la vitesse d'écoulement est nulle à la surface de la cellule et il y a un
point de stagnation sur la surface de la cellule sur la ligne médiane. Plus près des murs, cela coule
le sens est inversé. La combinaison de ces mouvements conduit à une demiellipse fortement
élongée pour la trajectoire d'un seul traceur. De la vélocimétrie expérimentale de suivi de particules
(PTV) des traceurs, nous pouvons également déduire la vitesse relative dans le repère comobile vr .
La composante dans le sens d'écoulement vr,x est représentée en fonction du temps Fig. 6.2 (b). La
vitesse peut être équipée d'une fonction sigmoïdale heuristique.
De toute évidence, les traceurs ralentissent à l'approche de la cellule et accélèrent le mouvement
fluide plus rapide au milieu du canal lorsqu'ils s'éloignent à nouveau de la cellule.
Nous devons mentionner qu'avec notre configuration microscopique dans l'expérience, nous
imaginons toute la hauteur de l'échantillon et, par conséquent, la position observée des traceurs est
toujours leur projection dans le plan xy. Par conséquent, nous observons également des trajectoires
qui s'approchent et s'éloignent de la cellule dans le plan y = 0 (Fig. 6.1 (a)). C'est notamment le cas
lorsque le mouvement du traceur est dans le plan orthogonal par rapport au plan de projection.
À des vitesses d'écoulement plus élevées, les cellules atteignent une forme de pantoufle [43].
Dans cette configuration asymétrique, un écoulement tourbillonnaire peut être observé derrière la
cellule (voir Fig. 6.1 (b)) même si l'écoulement reste laminaire. La forme en pantoufle et l'existence
des tourbillons sont confirmées par nos simulations numériques (Fig. 6.1 (d)). Cependant, un
écoulement vortex entièrement fermé dans le plan médian du canal, comme prédit à partir des
simulations numériques, n'a pas pu être observé dans la situation expérimentale où de petites
irrégularités suffisent à déplacer les particules traceuses hors de la zone vortex dans le canal. Dans
les deux cas, pour les croissants ainsi que pour les pantoufles, la présence de globules rouges réduit
les variations spatiales des vitesses de fluide sur la largeur du canal à un écoulement presque
comme un bouchon et donc la propagation des traceurs suspendus dans le sens de l'écoulement sur
le canal est également réduite. Cela devient encore plus prononcé pour les grappes de deux globules
rouges, comme nous le verrons dans ce qui suit.
6.3.2 Champ d'écoulement au voisinage d'un groupe de deux globules rouges
À de faibles niveaux d'hématocrite, la distance moyenne entre les globules rouges consécutifs dans
le canal est généralement très grande par rapport à la taille des cellules et à la largeur du canal.
Cependant, si deux cellules se rapprochent l'une de l'autre, elles peuvent former un amas stable en
raison de leur interaction hydrodynamique [156, 157, 158, 125, 45, 140]. Une quantité importante de
liquide entre les cellules semble être "encapsulée" et ne se mélange plus avec le liquide à l'extérieur
du cluster. Semblables aux trajectoires de traceurs de cellules individuelles, nous observons des
boucles en épingle à cheveux et des tourbillons pour les traceurs se déplaçant dans le plan
d'observation et des lignes droites pour les traceurs se déplaçant orthogonalement à celuici (Fig. 6.3
(a)), en conséquence de notre projection optique. Nos simulations numériques confirment que les
lignes de courant correspondent au vortex toroïdal, tout comme les anneaux de fumée, avec l'axe de symétrie le long de
6.3. Résultats 113
la direction x du canal, voir Fig. 6.3 (b). Dans le cadre de comouvement, les bordures du canal se
déplacent avec la vitesse du cluster RBC dans la direction x. Ce mouvement relatif de bordure
entraîne la rotation du liquide entre les cellules, similaire au cas d'un écoulement de cavité entraîné
par couvercle [178]. En conséquence, le liquide dans la partie interne du canal se déplace dans la
direction +x avec une vitesse légèrement supérieure à la vitesse des cellules dans le cadre du
laboratoire.
FIGURE 6.3: (a) Instantané d'un groupe de deux globules rouges en forme
de croissant avec une distance de dRBC = 5,2 µm avec une superposition de
trajectoires de traceurs. Le liquide entre les cellules semble être encapsulé
dans un vortex et tourner comme un tore avec l'axe de symétrie dans la
direction x. (b) Simulation numérique d'un cluster.
Les lignes de courant indiquent comment les traceurs seront transportés du
milieu le long d'une trajectoire hélicoïdale (voir Fig. 6.6). Simulations par A.
Guckenberger et J. Roemer.
À l'état d'équilibre, la distance dRBC entre deux globules rouges dans un cluster est constante
et dépend de la vitesse d'écoulement. Cependant, dans les expériences, de nombreuses distorsions
peuvent perturber les positions de distance d'équilibre et différentes distances peuvent être
observées pour la même condition d'écoulement. Pour imiter cette situation dans les simulations,
nous plaçons deux cellules avec la forme approximative à la distance souhaitée dans le canal et
déterminons le champ d'écoulement après un court laps de temps de généralement 70 ms. Ici, nous
analysons uniquement le champ d'écoulement des grappes de deux cellules en forme de croissant.
Pour caractériser plus quantitativement le mouvement du tore des traceurs on considère la période T pour un cycle.
Cela signifie que le vortex forme un tore déformé en 3D et que l'écoulement devient
plus rapide à mesure que l'on s'éloigne de l'axe central de révolution. La figure 6.4 montre la période
T en fonction de la distance entre les deux cellules, dRBC. La période augmente presque linéairement
avec la distance, tant pour les résultats simulés que pour les résultats expérimentaux. Autrement dit,
en première approximation, les traceurs se déplacent le long de la
circonférence C des ellipses. En supposant une vitesse de traceur constante vt le long d'une circonférence
d'ellipse particulière, la période T(dRBC) est donnée par le rapport de C et vt . Dans des ellipses concentriques
et avec des tailles décroissantes, la vitesse vt décroît également. L'extension de la plus grande ellipse est
donnée par un demipetit axe a presque constant de l'ordre du quart de la largeur du canal et un grand axe
dRBC de la distance intérieure entre deux cellules. En utilisant un développement en série tronquée pour la
circonférence C de la plus grande ellipse, la période estimée T(dRBC) est donnée par :
C π dRBC 2
T(dRBC) = = a + 2 θ 1 + 4 . (6.1)
Vermont Vermont
avec θ = (a − dRBC/2)/(a + dRBC/2)
Cette relation est confirmée à la fois par des expériences et des simulations. En fait, les deux montrent
que les vitesses du traceur vt dans le cadre comoving se trouvent être inférieures à la vitesse d'une cellule
vRBC dans le cadre du laboratoire. Cependant, il existe des différences quantitatives que nous attribuons au
fait que les cellules à différentes distances ne sont pas en
leur situation d'équilibre. Nous utilisons cette dépendance pour extraire la vitesse du fluide et du traceur vt à la
surface du vortex toroïdal, vt. Nous montrons sur la Fig. 6.4 les périodes extraites en fonction de la distance
entre deux globules rouges circulant à des vitesses différentes.
Comme attendu, un décalage peut être observé du fait que le demipetit axe a est considéré comme constant.
Nous avons constaté dans les simulations que des tourbillons appropriés se formaient rarement pour dRBC >
40 µm. Dans ce cas, un traceur s'échappe du vortex avant d'avoir fait un tour complet. Pour des distances
inférieures à 5 µm, aucun vortex n'a pu être observé dans les expériences. Ceci est en accord avec les
simulations [156] qui définissent la limite "d'existence de vortex" comme étant 1.4R0 avec R0 étant le rayon
effectif d'un RBC.
6.3. Résultats 115
É qu ati on
Terrain 8. 6m
I n tercept t
0, 25 Pente 0 ,0 0 245
vitesse cellulaire (mm/
s) 8. 6 4. 7 2. 2 8.
6±0. 1 4. 7±0. 1 N um .
0, 20 2. 2±0. 3
Exp.
0, 1 5
période
cycle
( s )
de
0, 1 0
0, 05
0, 00
0 5 dix 1 5 20 25 30
distance entre RBC dRBC (µ m)
FIGURE 6.4 : Période de cycles pour un mouvement de traceur toroïdal entre
deux hématies en fonction de la distance entre les cellules. Les données
expérimentales sont représentées respectivement par des symboles et des
lignes pleines et les résultats numériques par des symboles vides et des lignes pointillées.
L'ajustement représente un mouvement sur un tore étiré axial avec des ellipses
de révolution. Il est basé sur l'équation 6.1 avec π/vt comme paramètre
d'ajustement et le petit axe est fixé à a = 3µm.
6.3.3 Voies d'échappement des particules autour des globules rouges
Compte tenu des structures de type vortex entre deux globules rouges groupés, on peut s'attendre à
ce que ces vortex soient capables de capturer de petites particules et de les piéger entre les cellules,
comme dans les observations antérieures pour les microparticules [140]. Dans la figure 6.5 , nous
illustrons ces événements, c'estàdire les voies par lesquelles les particules peuvent entrer dans les
tourbillons à partir du flux principal.
FIGURE 6.5 : Vue 3D montrant la provenance (flèche bleue) des traceurs et
leurs trajectoires pour une vitesse cellulaire de 2,2 mm/s.
Simulations par A. Guckenberger et J. Roemer
Pour cela, une ligne de particules traceurs a été ensemencée dans la région centrale entre les
deux globules rouges et leurs trajectoires intégrées rétrospectivement dans le temps. Ainsi, les
lignes colorées illustrent l'entrée des particules traceurs dans les tourbillons.
Comme on peut le voir dans les lignes de courant (Fig. 6.3), les tourbillons entre deux globules
rouges en circulation ne sont généralement pas complètement fermés. On peut donc s'attendre à
ce que les particules de traceur puissent, en fonction de leur position de départ, également pouvoir
s'échapper de ces tourbillons pour retourner dans le flux principal. En effet, nous observons de
telles trajectoires comme illustré sur la Fig. 6.6. Notez que, en particulier pour les expériences, la
période T n'est pas affectée par la vue projective. Pour une distance fixe entre les cellules dRBC,
nous constatons que la période T reste constante, indépendamment de l'amplitude dans la direction
x. Ce résultat est étayé par des simulations numériques (voir Fig. 6.6). Ici, une particule effectue
d'abord un mouvement en spirale entre les deux globules rouges, mais finit par s'échapper de la
région située entre les deux globules rouges. En raison du court temps d'observation, nous n'avons
malheureusement pas pu observer de telles trajectoires directement dans l'expérience.
6.3. Résultats 117
FIGURE 6.6 : Trajectoires calculées numériquement d'un traceur
s'échappant des tourbillons d'écoulement entre deux globules rouges
avec une vitesse de 2,2 mm/s où X0 est le centre entre les deux globules
rouges. (a) Mouvement temporel avantarrière le long de la direction du flux. (b)
Trajectoire toroïdale dans le plan xy, partant du milieu et allant vers
l'extérieur. Simulations par A. Guckenberger et J. Roemer
6.4 Résumé
À l'aide d'expériences PTV, nous avons mesuré le champ d'écoulement autour des globules rouges
circulant dans de petits microcanaux. Pour les globules rouges isolés, nous avons trouvé une
différence significative dans le champ d'écoulement selon que le globule rouge est à l'état croissant
ou à l'état pantoufle. À l'arrière d'une pantoufle, on observe une petite mais caractéristique structure
en forme de vortex. Si deux cellules s'écoulent à proximité l'une de l'autre en forme de croissant,
une autre structure de type vortex apparaît entre les cellules comme prédit par des simulations
numériques antérieures [155, 156, 158, 140]. Nous avons montré que la période de rotation dans
ces vortex suit une loi quasilinéaire en fonction de la distance entre les globules rouges. Nos
résultats expérimentaux sont en bon accord avec les simulations numériques intégrales aux
frontières. Les simulations, en outre, pourraient illustrer qualitativement le piégeage et l'échappement
des particules traceurs des structures vortex entre les cellules.
Continuer
Grâce à des expériences de PTV (Particle tracking velocimetry), nous avons mesuré le champ
d'écoulement autour des globules rouges circulant dans de petits micro canaux. Pour les globules
rouges isolés, nous avons trouvé une différence significative dans le champ d'écoulement selon que
le globule rouge est à l'état de croissant ou de pantoufle. À l'arrière d'un chausson, on observe une
petite structure caractéristique ressemblant à un vortex. Si deux cellules s'écoulent à proximité de
l'une de l'autre en forme de croissant, une autre structure vortex apparaît entre les cellules, comme
le prédisaient des simulations numériques antérieures [155, 156, 158, 140]. Nous avons montré que
la période de rotation dans ces tourbillons suit une loi quasilinéaire en fonction de la distance entre
les globules rouges. Nos résultats expérimentaux sont en bon accord avec les simulations
numériques intégrales. Les simulations, en outre, ont pu illustrer qualitativement le piégeage et
l'échappement des particules traceuses en dehors des structures en forme de vortex.
Zusammenfassung
Mit PTV (Particle Tracking Velocimetry) Experimenten haben wir das Strömungs feld um rote
Blutkörperchen gemessen, die in kleinen Mikrokanälen fließen. Bei
6.4. Résumé 119
isolierten Erythrozyten fanden wir einen signifikanten Unterschied im Strömungs feld, je
nachdem, ob sich die roten Blutkörperchen im Croissant oder im Slipperzu stand
befinden. Auf der Rückseite eines Slippers ist eine kleine, aber charakteristis che,
wirbelartige Struktur zu beobachten. Wenn zwei Zellen in unmittelbarer Nähe zueinander
in der Croissantform flyssen, erscheint eine weitere wirbelartige Struk tur zwischen den
Zellen, wie durch frühere numerische Simulationen vorhergesagt [155, 156, 158, 140]. Wir
zeigten, dass die Rotationsperiode in diesen Wirbeln einem quasilinearen Gesetz als
Funktion des Abstands zwischen den roten Blutkörperchen folgt. Unsere experimentellen
Ergebnisse sind in guter Übereinstimmung mit nu merischen BoundaryIntegral
Simulationen. Die Simulationen konnten darüber hin aus das Einfangen und Entweichen
von Tracerpartikeln aus den Wirbelstrukturen zwischen den Zellen qualitativ illustrieren.
121
Chapitre 7
Agrégation sous flux
Le développement de la plateforme microfluidique a permis de mieux comprendre les
propriétés du sang dans les capillaires. Cependant, la plupart des travaux reposent sur des
interactions hydrodynamiques pures et les forces adhésives sont souvent écartées pour
simplifier les modèles et, par conséquent, l'agrégation des globules rouges a été négligée.
Claveria et al. [45] ont déjà réalisé des travaux expérimentaux et numériques pour étudier
l'effet des agrégats dans les capillaires. Néanmoins, l'effet d'agrégation et la présence de
bifurcation sont souvent étudiés séparément. Dans ce chapitre, nous proposons une
conception microfluidique qui imitent les bifurcations asymétriques dans le réseau
microvasculaire. La distribution des cellules individuelles/rouleaux dans une bifurcation
asymétrique a été étudiée pour différents débits et un seuil de transition a été trouvé pour
différentes concentrations de dextran et de fibrinogène à une concentration physiologiquement
pertinente. La nature de la rupture des rouleaux après une microbifurcation a également été
caractérisée pour plusieurs débits. De faibles forces d'adhérence et des vitesses d'écoulement
élevées peuvent être couplées et conduire à davantage de ruptures de rouleaux dans les capillaires.
7.1 Stabilité des grappes de RBC aux bifurcations
La distribution des globules rouges dans les microcapillaires mais aussi leur partition
hétérogène après bifurcations a été largement étudiée [179, 180, 181, 182, 183] et est
maintenant mieux comprise. Dans des situations physiologiques, le sang circule à travers des
réseaux complexes de capillaires reliés par des bifurcations. On peut se demander quel rôle
jouent ces bifurcations sur les statistiques de tailles des agrégats dans la microcirculation,
ainsi que sur la distribution de l'hématocrite dans les réseaux. Une caractéristique générale
des écoulements de suspensions dans les bifurcations capillaires est que lorsque les
bifurcations sont asymétriques, (par exemple débits différents dans les branches filles), une
concentration plus élevée de particules (cellules) se retrouve dans la branche fille où le débit
est le plus élevé, un phénomène généralement appelé effet ZweifachFung [184]. A l'échelle
d'un réseau microvasculaire, cela conduit à de fortes hétérogénéités de la distribution de l'hématocrite, comm
122 Chapitre 7. Agrégation sous flux
notes dans l'ouvrage pionnier de Poiseuille[185]. Plusieurs paramètres entrent en jeu pour
expliquer un tel écart. Pries et al. [179] ont rapporté que la distribution en amont des cellules a
un rôle concernant la distribution dans les branches filles. De plus, le diamètre de ces branches
(vaisseaux mère et filles) peut favoriser ou non le passage des globules rouges et ainsi, affecter
la cloisonnement. Par exemple, pour une ramification composée de deux capillaires filles de
tailles différentes, les cellules ont tendance à choisir les vaisseaux les plus petits. Barbier et al.
[186] ont montré que la rigidité des globules rouges est également importante dans la partition.
Les particules circulaires rigides conduisent à l'obstruction des branches alors que les particules
molles subissent une migration et s'aplatissent au sommet des bifurcations. Ces obstructions
peuvent être trouvées dans des cas pathologiques tels que la drépanocytose car les globules
rouges drépanocytaires sont plus rigides [187, 188]. Une autre observation intéressante concerne
l'asymétrie des branches. L'effet sur le partitionnement est à peine perceptible. Étant donné que
pour les petits capillaires et en raison des faibles nombres de Reynolds (Re«1), les effets d'inertie
peuvent être négligés et, par conséquent, le flux sanguin est régi par les équations de Stokes.
De plus, Chien et al. [189] ont déjà mentionné que même si les cellules ont tendance à suivre
des lignes de courant, cela est moins vérifiable pour les capillaires. Cela contribue également à
l'hétérogénéité de la distribution des globules rouges dans le système microvasculaire.
7.1.1 Conception de la puce
L'objectif était de concevoir une puce microfluidique qui mimerait les capillaires sanguins et en
particulier les bifurcations. La principale différence, par rapport aux capillaires sanguins, est que
nos canaux ont un aspect rectangulaire. Tenant compte de cela, une conception qui vise à suivre
la loi de Murray :
où R est le rayon du vaisseau mère et r1,2,...,nles rayons des vaisseaux filles.
3 3 3 3 + r + r + ... + r = r
R3 1 2 3 n (7.1)
Cette loi est particulièrement valable pour les réseaux microvasculaires [190]. Cependant,
ceci doit être considéré comme une première approximation puisque cette loi s'applique aux
canaux cylindriques. Toutes les branches devaient être ramenées vers la branche mère centrale.
La branche de départ ou branche mère mesure 10 µm de hauteur et 512 µm de largeur.
Les branches filles ont la même hauteur mais leur largeur est divisée par deux après chaque
bifurcation atteignant environ 8µm à l'extrémité (Fig. 7.1). Ceci conduit à une section constante
avant et après chaque bifurcation, donc à une vitesse moyenne constante le long du réseau. Le
taux de cisaillement (essentiellement gouverné par l'épaisseur des canaux) est également quasi
constant sauf au dernier niveau des bifurcations où
7.1. Stabilité des grappes de RBC aux bifurcations 123
les parois latérales (et pas seulement les parois supérieure et inférieure) entraînent un cisaillement
supplémentaire. La principale contrainte hydrodynamique supplémentaire due aux bifurcations est donc
la contrainte d'extension due au décollement des fluides de part et d'autre du point de stagnation. Les
agrégats passant par les bifurcations ont été observés à l'aide d'un objectif 20 fois et enregistrés avec
une fréquence d'images allant jusqu'à 200 Hz. Les rouleaux ont été caractérisés manuellement.
FIGURE 7.1 : (a) Conception de la puce microfluidique pour l'étude du
comportement des agrégats aux bifurcations et (b) microimage de la région
d'intérêt observée à partir de la puce microfluidique. Les canaux de haut en bas
sont numérotés de 1 à 4. Les canaux 1 et 4 sont appelés branches externes, 2 et
3 comme branches internes.
7.1.2 Répartition des rouleaux
La formation des rouleaux de globules rouges a été induite à l'aide de dextrane à deux concentrations
différentes : 20 et 50 mg/ml et de fibrinogène à une concentration physiologique de 2,5 mg/ml.
Le sang de donneurs sains a été prélevé à la banque de sang française et lavé deux fois selon la
procédure standard (voir 2.1.2). Des globules rouges après avoir été lavés ont été ajoutés à ces solutions
avec un hématocrite de 1,5 %. Bien qu'il soit inférieur aux niveaux physiologiques, il permet de suivre les
agrégats dans tout le système et d'étudier l'effet des contraintes hydrodynamiques dues à la bifurcation
sur la stabilité et la dissociation des agrégats isolés. En outre, il a été rapporté que l'hématocrite est plus
faible dans les capillaires [191] par rapport aux veines ou aux artères. Les capillaires ont une taille et une
forme variables
et ainsi, l'hématocrite peut également varier beaucoup. L'objectif était d'ajuster les forces d'adhérence
entre les globules rouges pour évaluer leur contribution au maintien des agrégats lorsqu'ils traversent
les bifurcations. Dans cette étude, nous nous concentrons principalement sur les canaux représentés
sur la Fig. 7.1 dans le rectangle rouge. Néanmoins, ce qui est observé à cet endroit est lié aux
embranchements précédents.
Répartition des rouleaux en fonction de la vitesse globale
FIGURE 7.2 : Pourcentage d'agrégats (2 cellules et plus) passant par la
bifurcation pour plusieurs vitesses allant de vRBC = 0,4 à vRBC = 20 mm/
s pour le dextran (70 kDa) avec une concentration de (a) 20 mg/ml (b ) 50
mg/ml et (c) fibrinogène à 2,5 mg/ml
La distribution des tailles de rouleaux a été étudiée pour plusieurs débits allant de vRBC = 0,4
mm/s à vRBC = 3,7 mm/s dans le cas du dextran et jusqu'à vRBC = 18,2 ± 0,8 mm/s pour le
fibrinogène. Un certain seuil a été trouvé pour lequel la
la population de rouleaux diminue considérablement. Pour 20 mg/ml, on voit sur la Fig. 7.2 une
population d'environ 12 % de rouleaux qui est le maximum. Ceci est favorisé par des débits assez
faibles entraînant de faibles forces d'interaction, qu'elles soient dues à des contraintes d'extension
ou de cisaillement. A vRBC = 0,9 ± 0,1 mm/s, cette population est divisée par deux et stagne à
environ 4 % pour des vitesses d'écoulement plus élevées.
A 50 mg/ml, la population d'agrégats est en moyenne plus importante du fait de forces adhésives
plus élevées. La plupart des agrégats survivent jusqu'à vRBC = 1,8 ± 0,1 mm/s. Nous avons
observé environ 20 % de rouleaux à ces pertes de charge. A vRBC = 2,9 ± 0,2 mm/s, on voit la
population de rouleaux diminuer d'un facteur 2. Il faut mentionner que les agrégats de 3 globules
rouges et plus représentent environ 10 % des agrégats totaux pour le dex tran à 50 mg/ml et sont
quasi absent dans le cas du dextrane à 20 mg/ml (non représenté sur le graphique).
Pour le fibrinogène avec une concentration de 2,5 mg/ml, nous avons choisi des vitesses
d'écoulement plus élevées car le seuil de transition apparaît à des vitesses d'écoulement plus
élevées. Cela est dû à l'extrême stabilité des granulats et aux fortes forces d'adhérence mises en
jeu. Environ 10 % des agrégats peuvent être trouvés à des vitesses sous vRBC = 8,4 ± 0,6 mm/s
et une diminution significative d'un facteur 2 est observée après cette vitesse particulière vRBC.
Répartition des rouleaux dans les branches filles
Ensuite, nous avons approfondi ces agrégats. La Fig. 7.3 montre la distribution des rouleaux (de
plus de 2 globules rouges) dans chaque canal (Fig. 7.1). Les doublets ont été rejetés car ils
représentent une fraction importante du nombre total d'agrégats et peuvent entraver la contribution
des forces d'adhérence pour les rouleaux plus grands dans une solution donnée.
Le nombre de rouleaux (N > 2 GR) a été normalisé dans un canal donné par le nombre total de
cellules passant par ce même canal.
FIGURE 7.3 : Répartition des rouleaux constitués de N >2 globules rouges
normalisés, pour chaque canal, par le nombre de cellules passant par le
même canal pour une vitesse d'écoulement donnée pour le dextran (70
kDa) avec une concentration de (a) 20 mg/ml (b) 50 mg/ml et (c)
fibrinogène à 2,5 mg/ml
Le premier constat est que les rouleaux représentent environ 10 % de l'objet circulant dans
chaque canal. L'asymétrie de la bifurcation est responsable de la répartition des agrégats de
globules rouges dans les branches. Cela a un effet particulièrement plus fort sur les
concentration de dextrane comme le montre la Fig. 7.3 (b). En effet, les globules rouges ont un
cheminement privilégié du fait de l'asymétrie angulaire des canaux et favorisent les branches internes.
Pour le fibrinogène, le nombre d'agrégats passant par la bifurcation est similaire à une faible
concentration de dextrane (20 mg/ml) avec une moyenne de 10 % d'agrégats. Un seuil clair peut
également être observé, ici, entre vRBC = 8,4 ± 0,6 et vRBC = 11,0 ± 0,8 mm/s. Ici, le nombre
d'agrégats chute d'environ 5 %. Moins d'agrégats survivent à ce niveau de la bifurcation. La même
tendance peut être constatée, en tenant compte des grappes de 3 globules rouges et plus, pour chaque
canal. De même qu'à une concentration plus élevée en dextrane (50 mg/ml) et du fait de l'asymétrie de
la bifurcation, la voie interne (canaux 2 et 3) est favorisée et un pourcentage un peu plus important
d'agrégats transite par ces canaux.
Il apparaît que les rouleaux se réorientent dans le sens de l'écoulement. Ils s'alignent le long des
lignes de courant à travers les branches microfluidiques. Pour cette raison, l'orientation ne joue pas un
rôle majeur dans les événements de rupture. Cependant, la position d'un rouleau dans le canal est un
paramètre important à prendre en considération. En fait, les rouleaux qui se trouvent au milieu du canal
auront plus de chances de se casser après avoir atteint le sommet. Néanmoins, l'effet de l'orientation
du rouleau n'est pas dans le cadre de notre étude. Pour les vaisseaux mères dont la largeur est proche
de la taille des globules rouges, les risques de rupture due à l'apex sont encore plus élevés car les
effets de margination sont moins prononcés.
On peut convenir que d'autres facteurs peuvent jouer un rôle sur la (dés)agrégation des globules rouges
en flux tels que : la présence de l'épithélium, la présence d'objets plus rigides (généralement marginés)
comme les leucocytes ou encore les plaquettes.
7.1.3 Événements de rupture
Les forces de cisaillement et d'extension ont été prises en compte. Les agrégats peuvent casser pour
plusieurs raisons. On s'attend à ce que les bifurcations jouent un rôle majeur dans la rupture des
rouleaux en écoulement puisqu'elles représentent un obstacle pour le passage des agrégats RBC.
Cependant, les rouleaux se cassent également en raison de la contrainte de cisaillement, en particulier
dans les petits canaux où le confinement est plus prononcé. Pour cette raison, on distingue deux
causes d'événements de rupture :
• Rupture par cisaillement : Rupture des rouleaux due aux interactions hydrodynamiques et
contrainte de cisaillement induite par les canaux étroits. Ces interactions peuvent se situer entre les
cellules ou entre les rouleaux et la paroi (Fig. 7.4).
FIGURE 7.4 : Microimages d'un agrégat se brisant sous l'effet d'une contrainte de
cisaillement lors de son déplacement de (a) à (c) le long du microcapillaire
• Rupture extensionnelle : Rouleaux qui rompent à cause de l'apex de la bifurcation. Cela peut être soit
parce que la taille du rouleau est trop grande et qu'il doit se rompre pour franchir la bifurcation, soit
parce que le rouleau est orienté au milieu de la mère
canal et frappe l'apex orienté perpendiculairement à la direction de l'écoulement (Fig. 7.5).
FIGURE 7.5 : Microimages prises à 3 images consécutives de (a) à (c) d'un
agrégat se brisant au sommet de la bifurcation en raison du point de stagnation
FIGURE 7.6 : Répartition des événements de rupture montrant à la fois les
contributions de cisaillement et de cisaillement extensionnel pour une
concentration de dextrane (70 kDa) de (a) 20 mg/ml et (b) 50 mg/ml et (c) fib
rinogène à 2,5 mg/ ml
Nous avons observé que pour des énergies adhésives élevées dans le dextrane (50 mg/ml), la
distribution en taille est comprise entre 2 et 7 globules rouges comme déjà indiqué par Claveria et al.
[45], alors que pour des concentrations plus faibles de dextrane (20 mg/ml), on observe surtout des
cellules simples et des doublets. Sauf mention contraire, on considère comme rouleaux, les agrégats dont la taille
7.2. Agrégation en flux de cisaillement 131
de 2 cellules ou plus. Le pourcentage de granulats pour une vitesse d'écoulement donnée est
normalisé par la population totale de granulats circulant dans les canaux. Par rapport au nombre total
de globules rouges (y compris les cellules individuelles), ces événements représentent une faible
fraction (moins de 10 %). Pour les faibles vitesses, les forces d'adhérence dominent. Des énergies
d'interaction plus élevées conduisent à des agrégats plus gros aux dernières bifurcations, car les
rouleaux sont moins susceptibles de se briser en raison des interactions hydrodynamiques. Ainsi, la
capacité de survie des agrégats est supérieure pour 50 mg/ml. Néanmoins, pour cette concentration
de dextrane, où l'agrégation est connue pour être la plus élevée, les rouleaux, trop gros pour la branche
fille, vont se casser à l'apex pour passer par la bifurcation.
Pour des vitesses intermédiaires, c'estàdire entre vRBC = 0,9 ± 0,1 et 2,3 ± 0,1 mm/s, nous observons
une fraction plus élevée de rouleaux qui se cassent à mesure que les forces hydrodynamiques
deviennent plus importantes et que la vitesse à laquelle les rouleaux entrent en collision avec l'apex
est également plus importante. Il existe un seuil à ces vitesses d'écoulement où la probabilité de casser
un agrégat est élevée. Nous avons également étudié les vitesses d'écoulement audessus de ces
seuils, telles que vRBC = 2,9 ± 0,2 mm/s, par exemple. Nous observons des événements de rupture
beaucoup plus faibles car la vitesse et les interactions hydrodynamiques des rouleaux sont beaucoup
plus élevées. De plus, la plupart des rouleaux ont tendance à se rompre dans les bifurcations
antécédentes et donc, moins de rouleaux sont présents dans la bifurcation d'observation.
La principale différence par rapport au dextran en termes d'événements de rupture est que ces
événements sont plus rares. Cela montre que l'agrégation induite par le fibrinogène conduit à des
agrégats plus stables et très probablement, les interactions adhésives sont plus fortes. C'est pourquoi,
ces événements de rupture sont principalement régis par des interactions adhésives plutôt que par des
interactions hydrodynamiques. Pour les agrégats à faible vitesse (vRBC = 0,4 mm/s), ces événements
de rupture sont de l'ordre de 6 %. À ce stade, les interactions hydrodynamiques sont négligeables. À
des vitesses globales inférieures vRBC, la contrainte de cisaillement dans les capillaires n'est pas
suffisante pour induire la dissociation des rouleaux. La principale raison de la présence de ces
événements de rupture est due à la taille des rouleaux qui doivent se briser pour traverser la bifurcation.
L'autre raison est due à l'orientation des rouleaux dont la trajectoire croise le sommet de la bifurcation.
7.2 Agrégation en cisaillement
Le sang est un fluide complexe connu pour être non newtownien. En fait, la viscosité du sang est
principalement déterminée par le RBC et sa capacité à s'agréger. À des taux de cisaillement plus
élevés, la viscosité du sang diminue en raison de la rupture des rouleaux provoquant ce que l'on
appelle : le cisaillement du sang [192, 193, 194] et des modèles ont déjà été proposés [195,
196] pour relier le niveau d'agrégation à la viscosité effective. La formation ou l'agrégation de
rouleaux joue également un rôle majeur dans la sédimentation sanguine. L'agrégation des
globules rouges entraîne des vitesses de sédimentation plus rapides comme c'est souvent le cas
dans les pathologies dues à l'inflammation (concentration plus élevée de fibrinogène). La vitesse
de sédimentation résulte d'un équilibre entre poids et traînée visqueuse. Pour une densité donnée,
le poids est proportionnel au volume de l'objet et la traînée visqueuse est proportionnelle à son diamètre.
Les globules rouges, en formant des rouleaux grâce aux protéines (fibrinogène, gamma
globulines, protéines C réactives, ...) [197] contenues dans le plasma, augmentent le rapport
volume/diamètre et donc sédimentent plus rapidement. On peut affirmer qu'il y a un jeu entre
l'agrégation, les propriétés visqueuses du sang et la gravité. C'est un fait bien connu que lors des
mesures macroscopiques de la viscosité du sang avec des rhéomètres, il faut faire attention aux
éventuels artefacts dus à la sédimentation des globules rouges dans l'appareil de mesure pendant
la période de mesure.
Grâce aux vols paraboliques, il est possible de (presque) s'affranchir de la gravité et des
expériences réalisées en microgravité permettent d'observer et de mesurer des granulats en
régime permanent à faible taux de cisaillement.
7.2.1 Matériel et méthodes
Dans l'expérience, une suspension diluée de globules rouges avec une concentration contrôlée
de dextran (pour favoriser l'agrégation) est introduite dans une chambre à flux de cisaillement
constituée de deux disques de verre parallèles séparés par un espace d'environ 200 µm, juste
avant ou au début de la phase de microgravité. L'échantillon est ensuite cisaillé à faible taux de
−1
), ce q1ui
cisaillement (généralement favorise
10 en meême
s cellules temps les cd
t désagrégation ollisions/contacts
es agrégats due eantre
ux contraintes de
cisaillement. Un équilibre s'établit alors entre l'agrégation et la désagrégation qui conditionne la
taille de l'agrégat. Les images sont enregistrées par microscopie holographique numérique pour
caractériser la taille et forme de distribution des agrégats.
Les résultats présentés ici ont été obtenus lors de la 55e campagne de vols paraboliques du
CNES (VP139) à bord de l'Airbus 310 ZEROG de Novespace (Mérignac, France, septembre
octobre 2018) et ont été réalisés en collaboration avec T. Podgorski, G.
Coupier, P.Ballet du LIPhy. La chambre à circulation (Fig. 7.7) et le pousseseringue (Fig. 7.8) ont
été conçus par P. Ballet.
Chambre à circulation
FIGURE 7.7 : Photo et croquis de la chambre à flux de cisaillement. Sur la photo, le cylindre
noir à gauche est le moteur, relié au disque rotatif supérieur par une courroie. Sur le croquis
(coupe transversale), le disque tournant est la pièce conique (épaisseur 20 mm). Cette pièce
est guidée par un roulement à billes. Le disque inférieur est composé de deux parties : une
plaque de verre de 2 mm, renforcée par une plaque de verre de 10 mm d'épaisseur (collée). La
plaque de 10 mm a un trou autour du point d'observation, pour limiter l'épaisseur du verre à 2
mm au point d'observation.
Seringues de pompage
FIGURE 7.8 : (a) un pousseseringue. Le corps de la seringue de 20 ml (1) est
maintenu par un support de maintien (2) et le fond est inséré dans le stator d'un
moteur pas à pas utilisé comme agitateur magnétique (3). Le piston de la
seringue est entraîné par un moteur pas à pas (4) grâce à une vis d'entraînement
(5) et (b) vue d'ensemble du pousseseringue avec pattes de fixation.
C. Minetti de la MRC Bruxelles (ULB) a fourni l'instrument optique et le traitement d'image. L'expérience
consiste à injecter une suspension de cellules sanguines dans une chambre à flux de cisaillement où
elle est cisaillée à vitesse constante et des images des globules rouges et des agrégats en circulation
sont enregistrées avec un microscope holographique numérique. La partie centrale du dispositif
expérimental est une chambre à flux de cisaillement (deux disques de verre dont l'un est rotatif), montée
sur un microscope holographique numérique. Cet instrument permet, après traitement des informations
holographiques enregistrées, d'obtenir des informations sur la position et la forme 3D des objets dans
la suspension cisaillée dans l'enceinte au cours de l'expérience. (Fig. 7.7)
L'observation est faite avec un microscope holographique numérique (DHM) équipé d'une caméra
numérique CCD reliée à un PC (Fig. 7.9). Le volume d'observation est d'environ 400x400x200 µm. Le
DHM est un interféromètre à faisceau laser (classe 3B, longueur d'onde 635 nm), élargi par une lentille
(la section du faisceau élargi est de plusieurs mm2), diffusé par un verre dépoli et séparé par une lame
séparatrice. Il traverse la chambre de circulation et interfère avec un faisceau de référence pour produire
un hologramme sur le capteur CCD de la caméra. Plus de détails sur cette configuration expérimentale
ont déjà été publiés [198, 199, 200].
Microscope holographique
FIGURE 7.9 : (a) Schéma du DHM (L1, L2, L3, L4 : lentilles ; M1, M2, PM :
miroirs ; BS1, BS2 : séparateurs de faisceau ; S : Échantillon [puce microcanal])
et (b) photo du microscope holographique sur une paillasse hors du rack (avec
un prototype de la chambre à flux de cisaillement)
Les suspensions de globules rouges ont été préparées selon la méthode classique (voir section 2.1.2)
en lavant le sang de donneurs sains (de l'EFS RhôneAlpes) dans une solution de PBS puis en les
remettant en suspension dans une solution de PBS + Dextran (70 kDa) avec une fraction volumique
comprise entre 0,5 et 1 %. Les concentrations de dextrane étaient de 20 et 50 mg/ml.
7.2.2 Premiers résultats préliminaires
Le traitement des données holographiques permet, après segmentation, de retrouver pour chaque
objet détecté l'intégrale du déphasage entre l'objet et le fond. Connaissant les indices de réfraction du
liquide de suspension (solution de dextrane) et de la solution d'hémoglobine à l'intérieur des globules
rouges à une concentration physiologique moyenne, l'intégrale de phase peut être convertie en volume
physique de l'objet. Un histogramme typique de la distribution de volume obtenu sur 50 images
consécutives à la fin d'une parabole lorsque l'état d'équilibre est atteint est illustré à la Fig. 7.10
FIGURE 7.10 : Données brutes typiques obtenues pour le dextrane (70kDa)
à une concentration de 50 mg/ml et un taux de cisaillement de −1
γ˙ =montrant
10s
le nombre d'objets en fonction de leur volume. Le premier pic représente le
nombre de cellules individuelles, le second : les doublets et
bientôt.
Ces histogrammes, qui correspondent à des populations de l'ordre de 104 objets, présentent
des pics distincts correspondant à des volumes de globules rouges simples non agrégés ( 80100
µm3 ), 2 cellules, 3 cellules etc... La distribution des cellules simples et des rouleaux a été
−1
récupérés pour des taux de cisaillement faibles allant de γ˙ = 0 à γ˙ = . Les agrégats ont
35s ont donc été comptés comme des doublets, des triplets et des agrégats égaux ou supérieurs
à 4 cellules, permettant pour chaque ensemble de paramètres (concentration de dextrane, taux
de cisaillement) de calculer la fraction de chaque type d'objets. D'après les mesures en forme de
cloche et de force OT (voir Fig. 4.4), une concentration de dextrane (70 kDa) à 20 mg/ml induirait
des forces d'adhésion plutôt faibles entre les cellules et 50 mg/ml favoriserait une agrégation plus
élevée des GR. . La tendance générale pour toute concentration est que la fraction de cellules
individuelles a tendance à augmenter à des taux de cisaillement plus élevés et, par conséquent,
la fraction d'agrégats diminue, comme on peut le voir sur la Fig. 7.11. Bien que nous soyons ici à
un faible hématocrite, les résultats sont cohérents avec le cisaillement du sang [137, 192] associé
à la désagrégation lorsque le taux de cisaillement est augmenté. Il convient de noter que même
−1
au taux de cisaillement le plus élevé étudié
ici
), (l30
a fraction
s de granulats est encore significative.
−1 ,
Pour une concentration de 20 mg/ml et jusqu'à γ˙ < 10s la fraction de RBC unique
reste stable à f1 = 0,7. Les doublets constituent le deuxième agrégat le plus abondant avec f2 =
0,2 et les plus gros agrégats représentent environ fi>2 = 0,1.
À 50 mg/ml, la fraction de globules rouges représente environ la moitié de la chambre de circulation
à γ˙ = 5s −1 et augmente linéairement en fonction du taux de cisaillement et jusqu'à γ˙ < 10s −1 .
À des taux de cisaillement plus élevés
−1 , un plateau est atteint et les globules rouges simples constituent
γ˙ > 15s environ f1 = 0,8 de la chambre d'écoulement. Il convient de noter que les doublets représentent
toujours la fraction la plus élevée de rouleaux à tout taux de cisaillement et pour toute concentration de
dextran et que les agrégats plus gros (3 ou plus) qui représentent une fraction assez élevée à de faibles
−1 à ces faibles hématocrites.
taux de cisaillement, disparaissent rapidement audessus de γ˙ = 10s
FIGURE 7.11 : Fraction d'agrégats de RBC pour deux concentrations de
Dextran : (a) 20 mg/ml et (b) 50 mg/ml à de faibles taux de cisaillement.
1c (en bleu) : 1 cellule, 2c (en rouge) : 2 cellules, 3c (en vert) : 3 cellules
et 4c (en violet) : 4 cellules et plus
Pour mieux appréhender la signification de la fraction totale de rouleaux présente dans la chambre
de circulation, l'indice d'agrégation I est calculé comme suit :
je = n2 f2 + n3 f3 + n4
(7.2)
f4 n1 f1 + n2 f2 + n3 f3 + n4 f4
où fi est la fraction de cellules individuelles ou rouleaux avec i cellules et ni le nombre de i cellules.
La Fig. 7.12 montre, en bon accord avec nos mesures OT (voir Fig. 4.4), que l'index d'agrégation I est
plus faible pour une concentration de 20 mg/ml que pour 50 mg/ml.
FIGURE 7.12 : Indice d'agrégation calculé pour deux concentrations de
dextrane : 20 mg/ml (rouge) et 50 mg/ml (bleu), pour toutes les valeurs de taux
de cisaillement
L'indice d'agrégation I a également été rapporté pour plusieurs taux de cisaillement (Fig. 7.13).
Lorsque le taux de cisaillement augmente, le nombre de rouleaux qui cassent augmente et l'indice
−1 −1 . Après
d'agrégation I diminue presque linéairement entre γ˙ = 0s et γ˙ = 15s
γ˙ = 15s −1 , I = 0,3 en diffusion expérimentale et reste quasiment constant pour une concentration
en dextrane de 20 mg/ml. Pour 50 mg/ml, I passe de I = 0,5 à I ≈ 0,4 à γ˙ = 30s
−1
FIGURE 7.13 : Indice d'agrégation calculé en fonction du taux de cisaillement
pour deux concentrations de dextrane : 20 mg/ml (rouge) et 50 mg/ml (bleu)
7.3 Résumé
Dans ce chapitre, des expériences ont été consacrées à l'étude des rouleaux induits par le
fibrinogène et le dextran dans des microcapillaires bifurquants et dans une chambre à circulation.
Il a été montré qu'il existe un seuil pour les deux agents d'agrégation où les forces d'adhérence
deviennent trop faibles, ce qui conduit à davantage d'agrégats de plus petite taille (principalement
des doublets). Dans le réseau microcapillaire, les cassures ont une contribution mécanique
principalement due à la taille ou à l'orientation des agrégats. Des événements de rupture dus aux
interactions hydrodynamiques sont présents pour des vitesses plus faibles (contrainte de
cisaillement plus faible) et pour des interactions adhésives plus faibles puisque les rouleaux ont
une vitesse plus faible, ils sont moins susceptibles de se rompre au sommet, mais ces événements
restent assez rares. Dans ce travail, une bifurcation très précise avec une taille proche de celle
des globules rouges, situation courante dans les réseaux capillaires, a été observée et a donné un
aperçu précoce des agrégats atteignant une microbifurcation. Cependant, il pourrait être pertinent
de suivre les agrégats du naviremère aux navires plus petits pour surveiller les événements de rupture, mais aussi l'im
7.3. Résumé 141
de l'orientation des agrégats dans ces événements. Des expériences réalisées en conditions de
microgravité ont fourni un premier ensemble de résultats quantitatifs sur la distribution en taille
des agrégats en écoulement cisaillé simple, qui devraient être utiles pour des modèles de
rhéologie sanguine prenant en compte la dynamique agrégationdésagrégation. Cette piste
devrait être poursuivie à l'avenir pour explorer un éventail plus large de paramètres.
Continuer
Dans ce chapitre, des expériences ont été consacrées à l'étude des rouleaux induits par le
fibrinogène et le dextran dans des microcapillaires bifurquants et dans une chambre
d'écoulement. Il a été montré qu'il existe un seuil pour les deux agents d'agrégation où les forces
d'adhésion deviennent trop faibles, ce qui entraîne un plus grand nombre d'agrégats de taille
plus petite (principalement des doublets).
Dans le réseau de microcapillaires, les événements de rupture ont une contribution mécanique
principalement due à la taille ou à l'orientation des agrégats. Les ruptures dues à des interactions
hydrodynamiques sont contenues pour des vitesses plus faibles (contrainte de cisaillement plus
faible) et pour des interactions adhésives plus faibles, car les rouleaux ont une vitesse plus faible
et sont moins susceptibles de se rompre à l'apex mais ces événements restent assez rares.
Dans cette étude, une bifurcation très précise avec une taille proche de celle des globules
rouges, ce qui est une situation courante dans les réseaux capillaires, a été révélée et a donné
un premier aperçu des agrégats atteignant une microbifurcation. Cependant, il pourrait être
pertinent de suivre les agrégats depuis les branches "mère" jusqu'aux branches plus petites pour
surveiller les événements de rupture, mais aussi l'importance de l'orientation des agrégats dans
ces événements. Les expériences réalisées dans des conditions de microgravité ont fourni une
première série de résultats quantitatifs sur la distribution de taille des agrégats dans un flux de
cisaillement simple, ce qui devait être utile pour les modèles de rhéologie sanguine prenant en
compte la dynamique d' agrégation et désagrégation. Cette piste pour rait être poursuivie à
l'avenir pour explorer un plus large éventail de paramètres.
Zusammenfassung
In diesem Kapitel wurden Experimente zur Untersuchung von Fibrinogen und Dextraninduzierten
Rouleaux in gegabelten Mikrokapillaren und in einer Strömungs kammer durchgeführt. Es konnte
gezeigt werden, dass es für beide Agrégations mittel einen Schwellenwert gibt, bei dem die
Adhäsionskräfte zu gering werden,
was zu mehr kleineren Aggregaten (hauptsächlich Dubletten) führt. Im Mikrokap illarnetz
haben Ausfallereignisse einen mechanischen Beitrag, der hauptsächlich auf die Größe
oder Ausrichtung der Aggregate zurückzuführen ist. Brüche auf grund hydrodynamischer
Interaktionen treten bei niedrigeren Geschwindigkeiten (geringere Schherbeanspruchung)
und bei geringeren Adhäsionsinteraktionen auf, da die Rouleaux geringere
Geschwindigkeiten haben und weniger wahrscheinlich am Apex brechen aber diese
Ereignisse bleiben ziemlich selten. In dieser Unter suchung wurde eine sehr präzise
Bifurkation mit einer Größe nahe der der roten Blutkörperchen beobachtet, wie sie in
Kapillarnetzwerken häufig vorkommt, und gab einen ersten Eindruck davon, wie die
Aggregate eine Mikrobifurkation erre ichen. Es könnte jedoch sein pertinent, Aggregate
von "Mutter"Kanälen bis zu kleineren Kanälen zu verfolgen, um Bruchereignisse zu
überwachen, aber auch die Bedeu tung der Ausrichtung der Aggregate bei diesen
Ereignissen. Experimente, die unter Mikrogravitationsbedingungen durchgeführt wurden,
haben einen ersten Satz quan titativer Ergebnisse zur Größenverteilung von Aggregaten in
einer einzigen Sch erströmung geliefert, die für blutrheologische Modelle unter
Berücksichtigung der Aggregations und Disaggregationsdynamik sein dürftentlich. Dieser
Weg kön nte in Zukunft verfolgt werden, um ein breiteres Spektrum von Parametern zu er
forschen.
143
Chapitre 8
Conclusion générale et perspectives
Les recherches menées et présentées dans cette thèse sont interdisciplinaires et associent
l'hématologie à différents domaines de la physique. Basé sur la mesure de grandeurs physiques pour
évaluer les propriétés physiques inhérentes aux globules rouges, il vise à fournir une meilleure
compréhension de l'interaction des globules rouges. Le principal phénomène étudié ici est l'agrégation
des globules rouges vue sous le champ de deux techniques différentes : la pince optique et la
microfluidique.
Des expériences au niveau d'une seule cellule ont révélé que l'adsorption de macromolécules sur la
surface des globules rouges se produit tout en modifiant rapidement le milieu environnant. La technique
présentée dans cette thèse permet la quantification des macromolécules adsorbées et pourrait également
être utilisée pour quantifier l'adsorption des protéines plasmatiques.
De plus, nous avons étudié la (dés)agrégation de plusieurs paires de globules rouges dans divers
milieux. Le dextran était et est toujours utilisé pour élucider les mécanismes d'agrégation. Notre travail
visait à comparer le dextrane à un déplétant pur (virus Fd) et à montrer s'il pouvait être utilisé pour
vérifier le modèle de déplétion. Nos résultats suggèrent que le dextrane ne peut pas être considéré
comme un déplétant pur. Nous avons également constaté un écart en termes de forces mesurées. La
force d'agrégation en présence de dextrane est inférieure à la force de désagrégation. Au contraire, les
forces de désagrégation et d'agrégation mesurées en présence d'un déplétant pur (virus Fd) sont du
même ordre de grandeur.
Grâce à des simulations en 3 dimensions réalisées au Forschungszentrum Jülich, un diagramme de
phase complet des doublets de globules rouges a été établi en prenant en compte l'influence du réseau
de spectrine. Des expériences pourraient reproduire une variété de ces formes de doublets. Il a été
prouvé que deux formes de doublet, le mâlefemelle et le sigmoïde biconcave, facilitent la nucléation
en agrégats plus gros.
Une autre série d'expériences a été réalisée sous écoulement. Le champ d'écoulement autour des
globules rouges simples a été étudié. Des grappes de globules rouges formées de manière
hydrodynamique ont été étudiées et ont révélé des applications possibles pour l'administration de
médicaments. Les tourbillons ont été observés et caractérisés à l'aide de simulations 3D réalisées par
le groupe de S. Gekle. Nous avons montré que la période de rotation dans ces tourbillons suit une trajectoire quasilinéa
144 Chapitre 8. Conclusion générale et perspectives
loi en fonction de la distance entre les globules rouges.
La formation de rouleaux dans la microcirculation est principalement due aux forces
hydrodynamiques mais aussi et surtout aux forces adhésives. Par ailleurs, la contribution des
forces hydrodynamiques et adhésives (induites par le Dextran) sur la désagrégation des agrégats
sous écoulement a été explorée invitro, dans un réseau ramifié de bifurcations et dans une
chambre à écoulement. Il a révélé une vitesse et un taux de cisaillement existants pour lesquels
les forces adhésives disparaissent dans les capillaires à la fois dans le dextrane et le fibrinogène.
Les rouleaux formés en présence de fibrinogène se sont révélés plus stables et on peut s'attendre
à ce qu'ils aient des énergies d'interaction plus fortes.
D'autres expériences pour mieux comprendre et démêler le mécanisme d'agrégation sont toujours
prévues. L'une d'elles consiste à utiliser des ponts spécifiques (ADN linkers). La (dés)agrégation
des globules rouges a pu être étudiée et comparée au dextran et au virus Fd (déplétant pur).
L'objectif est de voir dans quelle mesure il pourrait être assimilé au plasma ultérieurement. Des
expériences similaires dans le plasma autologue ont déjà été réalisées de la même manière que
pour le dextrane et le Fdvirus. L'analyse de leurs traces est toujours en cours et une comparaison
directe avec les deux autres protagonistes (Fd et lieurs de l'ADN) pourrait éclairer les mécanismes
sousjacents de l'agrégation des globules rouges.
En un mot, de nombreux aspects des propriétés physiques des globules rouges et de leur
influence sur l'agrégation ont été abordés dans cette thèse. Notre travail a montré que l'agrégation
peut être plus complexe qu'il n'y paraît et les techniques détaillées dans ce travail sont de bons
outils pour aborder les questions ouvertes restantes.
Conclusion générale et perspectives
Les recherches appliquées et présentées dans cette thèse sont interdisciplinaires et com binent
l'hématologie avec différents domaines de la physique. Basée sur la mesure de quantités
physiques pour évaluer les propriétés physiques inhérentes aux GR, elle vise à fournir une
meilleure compréhension de l'interaction des GR. Le principal phénomène étudié ici est l'agrégation
des GR vue par l'intermédiaire de deux techniques : les pinces optiques et la microfluidique.
Des expériences au niveau d'une seule cellule ont révélé que l'adsorption de macromolécules
sur la surface du GR se produit et ce, tout en modifiant rapidement le mi lieu environnant. La
technique présentée dans cette thèse permet la quantification des macromolécules adsorbées et
pourrait également être utilisée pour quantifier l'adsorption des protéines plasmatiques.
De plus, nous avons étudié la (dés)agrégation de multiples paires de globules rouges
Chapitre 8. Conclusion générale et perspectives 145
dans différents milieux. Le dextran était et est toujours utilisé pour élucider les mécanismes
d'agrégation. Notre travail a visé à comparer le dextran avec un déplétant pur (virus Fd) et
à montrer s'il pouvait être utilisé pour vérifier le modèle de dé plétion. Nos résultats révèlent
que le dextran ne peut pas être considéré comme un déplétant pur. Nous avons également
constaté un écart en termes de forces mesurées. La force d'agrégation en présence de
dextrane est inférieure à la force de désagrégation. Au contraire, les forces de
désagrégation et d'agrégation mesurées en présence d'un déplétant pur (virus Fd) sont
du même ordre de grandeur.
Grâce à des simulations tridimensionnelles réalisées au Forschungszentrum Jülich, un
diagramme de phase complet des doublets de GR a été établi en tenant compte de
l'influence du réseau de spectrine. Des expériences ont permis de reproduire une variété
de formes de ces doublets. Il a été prouvé que deux formes de doublets, le mâlefemelle
et le sigmoïdebiconcave, ont traduit la nucléation en agrégats plus grands.
Une autre série d'expériences a été réalisée sous flux. Le champ d'écoulement au tour
de chaque GR a été étudié. Des groupes de globules rouges formés de manière
hydrodynamique ont été étudiés et ont révélé des applications possibles pour
l'administration de médicaments. Des vortex ont été observés et caractérisés à l'aide de
simulations 3D réalisées par l'université de Bayreuth. Nous avons montré que la période
de rotation dans ces tourbillons suit une loi quasilinéaire en fonction de la distance entre
les globules rouges.
La formation de rouleaux dans la microcirculation est principalement due aux forces
hydrodynamiques mais aussi, et surtout, aux forces d'adhésion. De plus, la contribution
des forces hydrodynamiques et adhésives (induites par le Dextran) sur la désagrégation
des agrégats sous flux a été explorée invitro, dans un réseau ramifié de bifurcations et
dans une chambre d'écoulement. Elle a révélé une vitesse
et un taux de cisaillement existant pour lesquels les forces adhésives disparaîtront dans
les capillaires à la fois dans le dextrane et le fibrinogène. Les rouleaux formés en présence
de fibrinogène se sont révélés plus stables et peuvent s'attendre à des énergies
d'interaction plus fortes.
D'autres expériences visant à mieux comprendre et à démêler le mécanisme d'agrégation
sont encore réalisées. L'une d'entre elles consiste à utiliser des ponts spécifiques (DNA
linkers). La (dés)agrégation des GR pourrait être étudiée et comparée avec le dextran et
le virus Fd (déplétant pur). L'objectif est de voir dans quelle mesure il pourrait être assimilé
au plasma par la suite. Des expériences similaires ont déjà été réalisées dans le plasma
autologue de la même manière que pour le dex tran et le virus Fd. L'analyse de leurs
courbes est encore en cours et une comparaison
directe avec les deux autres protagonistes (Fd et les lieurs d'ADN) pourrait faire la lumière
sur les mécanismes sousjacents de l'agrégation des globules rouges. En résumé, de
nombreux aspects des propriétés physiques des globules rouges et leur influence sur
l'agrégation ont été retenus dans cette thèse. Notre travail à montré que l'agrégation peut
être plus complexe qu'il n'y paraît et les techniques détaillées dans ce travail sont de
bons outils pour résoudre les questions encore ouvertes.
Allgemeine Zusammenfassung und Perspektiven
Die in dieser Arbeit durchgeführte und vorgestellte Forschung ist interdisziplinär und
verbindet die Hämatologie mit verschiedenen Bereichen der Physik. Basierend auf der
Messung physikalischer Größen zur Beurteilung der physikalischen Eigen schaften des
RB soll ein besseres Verständnis der RBInteraktion erreicht werden.
Das Hauptphänomen, das hier untersucht wird, ist die Aggregation von Erythrozyten im
Rahmen von zwei verschiedenen Techniken : optische Pinzetten und Mikroflu idik.
Experimente auf Einzelzellebene ergaben, dass die Adsorption von Makromolekülen an
der RBOberfläche unter raschem Wechsel des umgebenden Mediums erfolgt.
Die in dieser Arbeit vorgestellte Technik erlaubt die Quantifizierung der adsor bierten
Makromoleküle und könnte auch zur Quantifizierung der Adsorption von Plasmaproteinen
verwendet werden.
Darüber hinaus untersuchten wir die (Dis)Agrégation von mehreren RBPaaren in
verschiedenen Medien. Dextran wurde und wird immer noch zur Aufklärung der
Aggregationsmechanismen verwendet. Unsere Arbeit zielte darauf ab, Dextran mit einem
reinen Depletant (fdVirus) zu vergleichen und zu zeigen, ob es zur Veri fizierung des
Depletionsmodells verwendet werden kann. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass Dextran
nicht als reines Depletant betrachtet werden kann. Wir fanden auch eine Diskrepanz in
Bezug auf die gemessenen Kräfte. Die Aggregationskraft in Gegenwart von Dextran ist
niedriger als die Disaggregationskraft. Im Gegen teil, die gemessenen Disaggregations
und Aggregationskräfte in Gegenwart eines reinen Depletants (fdVirus) liegen in der
gleichen Größenordnung.
Dank dreidimensionaler Simulationen, die am Forschungszentrum Jülich durchge führt
wurden, konnte unter Berücksichtigung des Einflusses des Spektrinnetzwerks ein
vollständiges Phasendiagramm der RBDubletten erstellt werden. Experimente konnten
eine Vielzahl dieser Dublettenformen reproduzieren. Zwei Dublettenfor men, die männlich
weibliche und die sigmoidbikonkave, erleichtern nachweislich die Nukleation zu größeren
Aggregaten.
Chapitre 8. Conclusion générale et perspectives 147
Eine weitere Reihe von Experimenten wurde unter Fluss durchgeführt. Das Strö
mungsfeld um einzelne Erythrozyten wurde untersucht. Hydrodynamisch gebildete
Cluster von Erythrozyten wurden untersucht und mögliche Anwendungen für die
Medikamentenverabreichung aufgezeigt. Es wurden Wirbel beobachtet und charak
terisiert, die durch 3DSimulationen der Universität Bayreuth unterstützt wurden.
Wir zeigten, dass die Rotationsperiode in diesen Wirbeln einem quasilinearen Gesetz
als Funktion des Abstands zwischen den roten Blutkörperchen folgt.
Die Bildung von Rouleaux in der Mikrozirkulation ist hauptsächlich auf hydrody
namische Kräfte, aber vor allem auch auf Adhäsionskräfte zurückzuführen. Darüber
hinaus wurde der Beitrag von hydrodynamischen Kräften und Adhäsionskräften
(induziert durch Dextran) auf die Disaggregation von Aggregaten unter Strömung in
vitro, in einem verzweigten Netz von Verzweigungen und in einer Strömungskam mer
untersucht. Dabei wurde eine vorhandene Geschwindigkeit und Scherrate fest gestellt,
bei der die Adhäsionskräfte in den Kapillaren sowohl in Dextran als auch in Fibrinogen
verschwinden. In Gegenwart von Fibrinogen gebildete Rouleaux haben sich als stabiler
erwiesen und es ist zu erwarten, dass sie stärkere Interaktionsen ergien aufweisen.
Weitere Experimente zum besseren Verständnis und zur Aufklärung des Aggrega
tionsmechanismus sind noch geplant. Eines davon besteht in der Verwendung spez
ifischer Brückenbilder (DNALinker). Die (Dis)Aggregation von RB könnte un tersucht
und mit Dextran und fdVirus (reines Depletant) verglichen werden. Ziel ist es,
herauszufinden, inwieweit es später in Plasma assimiliert werden könnte. Ähnliche
Experimente mit autologem Plasma wurden bereits auf die gleiche Weise wie für
Dextran und fdVirus durchgeführt. Die Analyze die Daten ist noch im Gange, und ein
direkter Vergleich mit den beiden anderen Protagonisten (Fd und DNALinker) könnte
Aufschluss über die zugrunde liegenden Mechanismen der RBAggregation geben.
Zusammengefasst wurden in dieser Arbeit viele Aspekte der physikalischen
Eigenschaften von RB und deren Einfluss auf die Aggregation diskutiert. Unsere Arbeit
zeigte, dass die Aggregation komplexer sein kann, als es den Anschein hat, und die in
dieser Arbeit beschriebenen Techniken sind gute Werkzeuge, um die noch offenen
Fragen anzugehen.
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5.3 Méthodes expérimentales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86

où k 0 et k 0 sont les coefficients de vitesse à l'équilibre, kts est la constante du

VA = V − VF, h ≥ d + D (1.14)

p = δ(1 − e 2 ) (1.21)

wE = sinh(κδ)e κδ−κd (1.23)

wE = (2κδ − κd) − e −κδsinh(κδ − κd) − sinh(κδ)e −κd (1.24)

Fdep(h) = Pi − Po = −nkBT(1 − h ) (1.41)

5 128π r 6n1 m2 − 1

0, 25 Pente 0 ,0 0 245

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