République Algérienne Populaire Et Démocratique

Ministère De L’enseignement Supérieur

Et De recherche Scientifique
Université Tahri Mohamed Bechar

Faculté: des Sciences de Vie et la Nature

Département : des Sciences de la nature et de la vie
Groupe:01 et 02
Spécialité: microbiologie appliqué

La séquençage
Présenté par: Recherche par :

Année universitaires: 2018/2019

 Plan de travail 
I
 Les techniques La méthode
La méthode
Introduction Historique de séquençage de Maxam Conclusion
Sanger
de l’ADN &Gilbert

 Introduction:
- La molécule d’ADN est constituée d’une chaine de 4
nucléotides guanine, cytosine, adénine et thymine, dont la
succession détermine la séquence des différents génes.le
séquençage est une méthode qui consiste a déterminé la
succession des ces nucléotides sur ADN. Ce procédé
permet de déterminer les différentes anomalies
responsables de maladies génétiques ou de réaliser des
études d’épidémiologie moléculaire en microbiologie ou
dans t’autre domaines. Deux principales méthodes ont été
initialement développées dans ce but : la méthode
chimique (Maxam et Gilbert en1977), et la méthode
enzymatique (Sanger 1981). D’autres techniques récentes
comme le séquençage par hybridation, le pyroséquençage
ont été utilisées et appliquées à l’analyse des génomes.
 Les techniques La méthode
La méthode
Introduction Historique de séquençage de Maxam Conclusion
Sanger
de l’ADN &Gilbert

 Historique:
Les premières techniques de séquençage ont été
développées en parallèle au milieu des années
1970. Les méthodes de Sanger (Grande-
Bretagne) et Gilbert (Etats-Unis) ont toutes deux
Walter GILBERT
été récompensées d'un prix Nobel de chimie (1932- )
en1980.
Le premier organisme a été séquencé en1977.
Il s'agissait du virus bactériophage X174, possédant
un ADN simple brin ne nécessitant donc pas
l'étape de dénaturation utilisé dans les méthodes
de Sanger et Maxam et Gilbert.
Frederick SANGER
(1918- )
Quelles sont les
méthodes de
séquençage de
l’ADN
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La méthode
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Sanger
de l’ADN &Gilbert

 Les techniques de séquençage de

l’ADN :
Chacune des deux méthodes de
séquençage des longues molécules d’ADN
(chimique et enzymatique) implique la
production d’un lot de molécules de tailles
différentes dotées d’extrémité commune,
ensuite séparait par électrophorèse sur
gel de polyacrylamide(PAGE) pour accéder
à la lecture de la séquence.
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Sanger
de l’ADN &Gilbert

 2. Préparation de la séquence cible

 Ces trois méthodes utilisent des bases communes : le brin d’ADN à
séquencer est extrait, amplifié, puis dénaturé (on sépare le double brin
d’ADN en deux), et on utilise la polymérase, une enzyme dont le rôle est
de dupliquer un élément.
 L'amplification, c'est à dire la réplication de la séquence, est réalisée à
partir d'un technique appelée PCR ou "Polymerase chain reaction"
(réaction de polymérisation en chaîne).
 Cela permet de dupliquer à plusieurs millions d'exemplaires un fragment
d'ADN grâce à l'ADN polymérase.
 Cette technique utilise des cycles de trois phases au cours des quelles
chaque double brin est dénaturé (cf. infra) et séparé de sa polymérase
(qui est maintenu par des protéines).
 Une variation spécifique de la température permet aux nombreuses
amorces présentes en suspension dans la solution de s'hybrider aux
simples brins sans que ceux-ci ne s'hybrident entre eux (ce qui rendrait
impossible l'accrochage de l'amorce).
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 Enfin, la polymérase assimile progressivement les

nucléotides néoformés libres ajoutés également dans
la solution jusqu'à l'obtention de doubles brins
complets ; c’est l’élongation. Le cycle, d'une durée
maximum de quatre minutes, est répété en boucles
de nombreuses fois (entre 35 et 45 par PCR) et double
le nombre de brins à chaque fois (suite logique de
puissance 2).
 La dénaturation (ou déshybridation), c'est à dire la
séparation des deux brins composant la molécule
d'ADN, est obtenue par élévation de température ce
qui a pour effet de fragiliser les liaisons hydrogènes
reliant les bases azotées.
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 3. Méthode de Sanger :
 Principe
 Une amorce d'ADN est liée par hybridation au brin matrice et
des désoxynucléosides triphosphates (dNTPP) sont ajoutés de
manière séquentielle au brin d'amorce par l'ADN polymérase.
L’amorce est conçue pour les séquences connues à
l’extrémité 3 ’du brin matrice. Les séquences M13 sont
généralement attachées à l'extrémité 3 ’et l'amorce de ce
M13 est fabriquée. Le mélange réactionnel contient
également du didésoxynucléoside triphosphate (ddNTP) ainsi
que des dNTP habituels. Si, pendant la réplication, des ddNTP
sont incorporés à la place des dNTP habituels dans le brin
d'ADN en croissance, la réplication s'arrête à ce nucléotide
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 Les ddNTP sont analogues aux dNTP Les

ddNTP n'ont pas de groupe hydroxyle (-OH)
en c3 du sucre ribose, ils ne peuvent donc
pas créer de liaison phosphodiester avec le
nucléotide du nid et terminent ainsi la chaîne
nucléotidique. Les ddNTP respectifs des
dNTP terminent la chaîne sur leur site
respectif. Par exemple, ddATP se termine sur
un site. De même, ddCTP, ddGTP et ddTTP se
terminent respectivement aux sites C, G et T
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 Procédure 1. Préparation du modèle:

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 Des copies du brin de matrice à séquencer doivent être préparées avec de

courtes séquences connues à l'extrémité 3 ’du brin de matrice. Un ADN
primaire est essentiel pour initier la réplication de la matrice. La préparation
de l’amorce des séquences connues à la fin du test est toujours nécessaire.
À cette fin, un vecteur de clonage simple brin M13 est flanqué d’un brin de
matrice situé en 3ème extrémité qui sert de site de liaison pour l’amorce.
 2. Génération d'un ensemble imbriqué de fragments étiquetés:
Des copies de chaque modèle sont divisées en quatre lots et chaque lot
est utilisé pour une réaction de réplication différente. Des copies de
l'amorce standard et de l'ADN polymérase I sont utilisées dans les quatre
lots. Pour synthétiser des fragments qui se terminent en A, ddATP est
ajouté au mélange réactionnel du lot I avec dATP, dTTP, dCTP et dGTP,
une amorce standard et de l'ADN polymérase I. De même, pour générer,
tous les fragments se terminant en C, G et T, les ddNTP respectifs, à
savoir ddCTP, ddGTP et ddTTP, sont ajoutés respectivement à un
mélange réactionnel différent sur un lot différent, avec les dNTP habituels
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 Electrophorèse et lecture de gel: Le mélange

réactionnel de quatre lots est chargé dans
quatre puits différents sur gel de
Polyacrylamide et soumis à une
électrophorèse. L'autoradiogramme du gel
est lu pour déterminer l'ordre des bases du
brin complémentaire à celui du brin matrice.
La bande des fragments les plus courts se
trouve au bas de l'autoradiogramme de sorte
que les séquences du brin complémentaire
soient lues de bas en haut
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 4. Méthode de Maxam et Gilbert :

 Contrairement à la méthode précédente, celle-ci
n'utilise quant à elle aucune base modifiée mais
une réaction chimique permettant de couper le
brin suite à un type de base. Étant donnée le
nombre important de copies présentes dans le
tube, on obtient statistiquement chaque
possibilité. La méthode de l'électrophorèse suit
ensuite celle de Sanger. Moins facile à robotiser
que la méthode de Sanger, cette technique est
aujourd'hui très peu utilisée dans les milieux
industriels.
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de l’ADN &Gilbert

 À quoi sert le séquençage ? 1. Test héréditaire :

 II. Lorsqu'une simple vérification des groupes sanguins et des
gènes récessifs ne suffit pas à déterminer la parenté, on utilise
alors indirectement le séquençage génétique. Chez chaque
individu, des séquences de nucléotides non codantes (aussi
appelées ADN répétitif ou encore « ADN poubelle ») se répètent un
certain nombre de fois, différent selon les individus. Ces séquences
répétées sont appelées minisatellites; leur taille, qui correspond au
nombre de répétitions varie généralement de 5 à 50. Etant donné
que l'on possède tous les chromosomes, excepté les sexuels, par
paire, on a deux tailles différentes de minisatellites, transmises par
chaque parent. La comparaison de ceux-ci avec les géniteurs
potentiels conduit à la découverte du père biologique. Afin
d'augmenter les probabilités du lien de parenté recherché, ces
mesures de minisatellites sont étendues à plusieurs chromosomes;
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 minisatellites sont étendues à plusieurs chromosomes; cela permet actuellement aux

laboratoires d'analyse d'assurer une fiabilité supérieure à 99%.
 2. Identification judiciaire : La médecine légale utilise les même minisatellites afin de constituer
une empreinte génétique spécifique à chaque individu Celle-ci est ensuite comparé aux preuves
biologiques de l'enquête comme par exemple du sang, du sperme, des cheveux ou de la salive.
 Cette méthode permet d'inculper ou de relaxer un suspect avec une quasi-certitude écartant tout
risque d'erreur judiciaire (sous réserve que les éléments cibles soient les bons bien entendu).
 3. Thérapie génique : Certaines maladies sont dues à la mutation d’un gène. Le séquençage
génétique permet de comparer l’ADN de deux personnes afin de détecter une mutation. Ainsi, on
peut savoir sur quel gène et donc à quel endroit du génome s’est produite la mutation. Les
techniques de thérapies géniques, encore à l’état de test, essaient de remplacer la séquence
mutée par une séquence saine. Cependant, il s’avère beaucoup plus difficile d’introduire la
séquence modifiée au bon endroit d’un génome humain que d’un génome de souris. Ces
nouvelles pistes de recherche, même si elles sont encore balbutiantes, ouvrent de nouveaux
horizons et autorisent les malades à espérer. En effet, il y a quelques années encore, des
maladies telles que la mucoviscidose, l'hémophilie, la myopathie de Duchenne et la
drépanocytose étaient incurables. Aujourd’hui, les chercheurs savent où chercher et les
perspectives de guérison grandissent chaque année. Cependant leur l’élaboration, les tests qu’ils
nécessitent prennent su temps et surtout de l’argent ; Il est donc nécessaire que des
manifestations contre le Téléthon perdurent pour sensibiliser et informer le grand public à propos
de l’importance de leurs dons.
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 Quels dangers représente le séquençage ?

 Actuellement, les réglementations au sujet du séquençage ne sont pas très claires.
 1. Génome humain : Au début des années 1990, la communauté internationale a décidé
d’organiser un projet public de séquençage dont le but était d’obtenir, en l’an 2000, la
totalité des séquences du génome humain en caractères. En raison de l’ampleur de ce
travail, 20 institutions ont convenu de partager la tâche.
 Chaque centre de séquençage s’était alors engagé à déposer les séquences dans des
bases de données publiques dès l’acquisition, pour éviter un accès payant à ces
informations.
 Dans le même temps, une société privée, Celera Genomics, s’était engagée à donner
accès à ses clients plus rapidement à une séquence plus complète que celle du
consortium. Cependant, la société n’a pas réussi à obtenir une ébauche suffisamment
complète pour pouvoir concurrencer le consortium.
 Sur ce point, le projet public de séquençage a atteint son objectif d’obtenir la séquence
complète au début du troisième millénaire (2003). La seule loi en vigueur a été énoncée
par l’UNESCO, en 1997 : « Le génome humain est un patrimoine de l'humanité.
 Un patrimoine de l'humanité ne peut pas être la propriété de quelqu'un. » 2. Carte
d’identité génétique : Il est, depuis 2003, formellement interdit de dresser la carte
d’identité génétique d’un
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 être humain : cela est considéré comme une forme de racisme et de

discrimination. Cependant, un Fichier Automatisé des Empreintes Génétiques
national de lutte contre la criminalité se et progressivement en place dans
certains pays tels que les Etats-Unis, le Royaume Uni, l'Autriche, l'Allemagne et
les Pays Bas. L’ADN répertorié correspond aux minisatellites non codant
permettant l’identification judiciaire. En France, ce système regroupe
exclusivement les délinquant sexuels potentiellement récidivistes. 3. Et demain ?
On pourrait par exemple envisager que l’empreinte génétique soit implantée
directement dans nos papiers d’identité. Cependant le fichage systématique des
individus pose des problèmes sous-jacents inévitables. Qu’est-ce qui
empêcherait un terroriste de fabriquer des armes génétiquement ciblées pour un
individus ou un groupe de personnes ? De plus, pourquoi ne pas imaginer un
monde à l’image du film Bienvenue à Gattaca dans lequel le sort de chacun est
décidé avant même sa naissance ? Les dérives criminelles de la génétique sont
aussi nombreuses et diversifiées que leurs perspectives bénéfiques...La science
et le savoir en eux-mêmes ne sont ni bons ni mauvais ; tout dépend de ce que
l’homme en fait. Depuis la nuit des temps la recherche progresse et l’on ne peu
pas la stopper, c’est dans la nature humaine. Il est cependant nécessaire de
l’encadrer !
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 Conclusion:
-La méthode chimique de séquençage de
l’ADN a été largement remplacée par la
méthode de Sanger.
- La séquence d’ADN contient l’information
nécessaire aux êtres vivants pour survivre et
se reproduire. Déterminer cette séquence
est donc utile aussi bien pour les recherches
visant à savoir comment vivent les
organismes que pour des sujets appliqués.
 Index des mots-clé
 Amorce (ou oligonucléotide): Série de quelques dizaines de nucléotides complémentaires
au début du brin à séquencer. Support sur lequel se fixe la polymérase. Apyrase : enzyme
utilisée dans la technique de pyroséquençage. Dégrade les nucléotides non assimilée par
la polymérase. Dénaturation ou déshybridation : séparation des deux brins de la double
hélice d’ADN. dNTP: nucléotide (ou nucléobase) "classique". Sigle signifiant
désoxyNucléotide TriPhosphate. Correspondant aux quatre bases Adénine (dATP), Thymine
(dTTP), Cytosine (dCTP) et Guanine (dGTP). ddNTP: type de nucléotide modifié, ne
permettant pas la poursuite de l'assimilation par la polymérase à cause du manque d'un
groupement hydroxyde HO nécessaire aux liaisons phosphodiesters. Utilisé dans la
méthode de Sanger. Electrophorèse : technique utilisant la propriété es ions à se déplacer
selon un champ électrique. Elle est utilisée pour connaître et classer par longueur les
séquences d’Adn dans certaines techniques de séquençage génétique. Luciférase :
enzyme utilisé dans la méthode de pyroséquençage. Transforme l’ATP en lumière.
Minisatellites : séquence de nucléotides non codantes répétées un nombre spécifique de
fois chez chaque individus et utilisé pour les empreintes génétiques. (ADN) polymérase:
complexe enzymatique permettant, à partir d'une amorce, d'assimiler les nucléobases
(néoformés libres) afin de répliquer un brin d'ADN fils ; sorte de "tricoteuse" ou
"assembleuse de fermeture éclair". PPi : phosphate inorganique. Rejeté lors de
l’assimilation d’un nucléotide par l’Adn polymérase. Sulfurylase : enzyme utilisé dans la
méthode de pyroséquençage. Transforme le PPi dégagé en en ATP.