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Adopte: 28 juillet 2011 Figure 1 corrige: 2 octobre 2012

LIGNE DIRECTRICE DE LOCDE POUR LES ESSAIS DE PRODUITS CHIMIQUES

tude tendue de toxicit pour la reproduction sur une gnration

INTRODUCTION 1. La prsente Ligne directrice pour les essais (LD) sappuie sur un projet dtude tendue de toxicit pour la reproduction sur une gnration F1, ralise au cours des diffrents stades de la vie, propos par le comit technique ACSA (Agricultural Chemical Safety Assessment) du Health and Environmental Sciences Institute (HESI) de lILSI (Institut International Life Science Institute), tel que publi dans Cooper et al., 2006 (1). Plusieurs amliorations et clarifications ont t apportes la mthodologie de ltude afin de la rendre adaptable et de mettre en valeur limportance de sappuyer sur les connaissances existantes, tout en mettant profit les observations en cours dtude pour orienter et dvelopper lessai. Cette Ligne directrice fournit une description dtaille du mode opratoire de ltude tendue de toxicit pour la reproduction sur une gnration. Elle dcrit trois cohortes danimaux de gnration F1: Cohorte 1 : valuation des effets observs sur la reproduction/le dveloppement ; cette cohorte peut ensuite tre tendue des animaux de gnration F2. Cohorte 2 : valuation de limpact potentiel de lexposition aux produits chimiques sur le dveloppement du systme nerveux. Cohorte 3 : valuation de limpact potentiel de lexposition aux produits chimiques sur le dveloppement du systme immunitaire.

2 Il convient que les dcisions dtendre lvaluation une deuxime gnration et dexclure les cohortes servant dterminer la neurotoxicit pour le dveloppement et/ou limmunotoxicit pour le dveloppement soient prises sur la base des connaissances existantes concernant la substance dessai, ainsi que des impratifs fixs par diffrentes autorits rglementaires. La prsente LD vise dtailler la manire dont ltude peut tre mene et dont il convient dvaluer les diverses cohortes. 3. La procdure tayant la dcision de dclencher en cours dtude la production dune seconde gnration est dcrite dans le document dorientation 117 (39) lintention des autorits rglementaires recourant aux dclencheurs internes. REMARQUES PRLIMINAIRES ET OBJECTIFS 4. Ltude tendue de toxicit pour la reproduction sur une gnration vise principalement valuer les tapes de la vie non couvertes par les autres types dtudes de toxicit et examiner les effets 1
OCDE, (2012). L'OCDE autorise l'utilisation de ce contenu pour usage personnel, dans un but non commercial sans autorisation pralable, sous rserve de mention de la source. Toute utilisation but commercial doit faire l'objet d'une autorisation crite pralable de l'OCDE.

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potentiels dune exposition pr- et postnatale aux produits chimiques. Pour mesurer les effets sur la reproduction, on songera dabord utiliser, sils sont disponibles, les rsultats dtudes doses rptes (notamment tudes de dpistage de la toxicit pour la reproduction, comme la LD 422 (32)), ou dessais de dpistage court terme des perturbateurs endocriniens, (par exemple bio-essai utrotrophique - LD 440 (36) ; bio-essai de Hershberger - LD 441 (37)) pour mettre en vidence un impact sur les organes reproducteurs mles et femelles. Ces rsultats porteront par exemple sur la spermatogense (examen histopathologique des testicules) chez les mles et sur les cycles straux, la numration des follicules/maturation des ovocytes et lintgrit des ovaires (examen histopathologique) chez les femelles. Ltude tendue de toxicit pour la reproduction sur une gnration permet donc dexaminer les effets sur la reproduction partir dinteractions entre mles et femelles, entre femelles et conceptus, et entre femelles et descendants et sur la gnration F1 aprs la maturit sexuelle (voir document dorientation 151 en appui cette LD (40)). 5. Cette LD est labore en vue de permettre lvaluation des effets pr- et postnataux de produits chimiques sur le dveloppement, ainsi que lexamen exhaustif de la toxicit systmique chez les femelles gravides et allaitantes ainsi que chez la descendance (petits et adultes). Lexamen dtaill des principaux effets sur le dveloppement, comme la viabilit de la descendance, la sant des nouveau-ns, le niveau de dveloppement la naissance et le dveloppement physique et fonctionnel jusqu lge adulte, doit permettre de reprer les organes cibles spcifiques chez les descendants. En outre, ltude fournira et/ou confirmera des informations quant aux effets de la substance dessai sur lintgrit et le fonctionnement des appareils reproducteurs mles et femelles chez ladulte. On tiendra notamment compte des paramtres suivants, sans sy limiter : fonction gonadique, cycle stral, maturation des spermatozodes dans lpididyme, comportement daccouplement, conception, gestation, mise-bas et lactation. Par ailleurs, les rsultats de lvaluation de la neurotoxicit pour le dveloppement et de limmunotoxicit pour le dveloppement caractriseront les effets potentiels sur ces systmes. Les donnes dcoulant de ces essais devront permettre de dterminer les concentrations sans effet nocif observ (CSENO), les concentrations minimales avec effet nocif observ (CMENO) et/ou les doses de rfrence pour les divers effets valus, et/ou servir caractriser les effets reprs dans des tudes doses rptes antrieures et/ou orienter les essais ultrieurs. 6. Le protocole est reprsent schmatiquement la figure 1. La substance dessai est administre en continu plusieurs groupes de mles et femelles sexuellement matures, diffrentes doses chelonnes suivant une gradation. Cette gnration parentale (P) reoit la substance pendant un temps dfini avant laccouplement (priode fixe daprs les informations disponibles sur la substance dessai, mais ne pouvant pas tre infrieure deux semaines) puis pendant une priode daccouplement de deux semaines. Les mles P sont ensuite traits au moins jusquau sevrage de la gnration F1. Leur traitement dure au minimum 10 semaines, et peut tre prolong sil y a lieu de clarifier les effets sur la reproduction. Le traitement des femelles P se poursuit pendant la gestation et lallaitement jusquau sacrifice, aprs le sevrage de leurs portes (soit 8 10 semaines de traitement). La descendance F1 reoit encore la substance dessai du sevrage jusqu lge adulte. En cas dvaluation dune seconde gnration (voir document dorientation 117 (39)), la descendance F1 continue de recevoir le traitement jusquau sevrage des petits F2, ou jusqu la fin de ltude. 7. Tous les animaux subissent un examen clinique et pathologique destin mettre en vidence des signes de toxicit ; cet examen sattache particulirement lintgrit et au fonctionnement des appareils reproducteurs mles et femelles ainsi qu la sant, la croissance, le dveloppement et la fonction reproductrice de la descendance. Au moment du sevrage, les descendants slectionns sont affects divers sous-groupes (cohortes 1 3, voir paragraphes 33 et 34 et figure 1) afin de faire lobjet dvaluations supplmentaires, portant notamment sur la maturation sexuelle, lintgrit et le 2
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fonctionnement des organes reproducteurs, les effets neurologiques et comportementaux, et les fonctions immunitaires. 8. Lors de la ralisation de ltude, il est recommand de suivre les principes et considrations noncs dans le Document dorientation n 19 de lOCDE sur la reconnaissance, lvaluation et lutilisation des signes cliniques en tant queffets mesurs thiquement acceptables dans les exprimentations animales menes des fins d'valuation de la scurit (34). 9. Quand un nombre suffisant dtudes aura t conduit afin danalyser limpact de cette nouvelle mthode dessai, la LD sera examine et, si ncessaire, rvise la lumire de lexprience acquise. Figure 1 : Protocole de ltude tendue de toxicit pour la reproduction sur une gnration
Ncropsie des animaux P

Traitement Avant accouplement P P 2 semaines 2 semaines Accouplement 2 semaines 2 semaines F1 Gravidit Dveloppement inutero Aprs accouplement 6 semaines Lactaction Avant sevrage Aprs sevrage

Gnration parentale

Cohorte 1A 1B 2A 2B 3 Surplus

Dsignation Reprotoxicit Reprotoxicit Neurotoxicit Neurotoxicit Immunotoxicit Sujets de rechange

Animaux/cohorte 20 M + 20 F 20 M + 20 F 10 M + 10 F @ 10 M + 10 F @ 10 M + 10 F @

Maturation sexuelle Oui Oui Oui Non Oui Non

Age approximatif la ncropsie (semaines) 13 14 ou 20-25 le cas chant 11-12 3 8 3

Objectif de 20 portes par groupe

@ un par porte, reprsentatif si possible, de 20 portes au total

DESCRIPTION DE LA MTHODE / PRPARATIONS POUR LESSAI Animaux Choix des espces et des souches 10. Lespce utilise pour ltude de toxicit pour la reproduction est choisie avec soin en fonction de lensemble des donnes disponibles. Cependant, en raison de labondance des donnes existantes et de la comparabilit par rapport aux essais de toxicit gnrale, le choix se porte gnralement sur le rat et les critres et recommandations prsents dans la prsente LD se rapportent cette espce. Si on utilise une 3
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autre espce, il faut le justifier et adapter le protocole en consquence. Les souches prsentant un faible taux de fcondit ou une frquence leve d'anomalies du dveloppement sont viter. ge, poids corporel et critres dinclusion 11. On utilisera des animaux parents sains, nayant pas t soumis des expriences antrieures. Ltude porte la fois sur les mles et les femelles, lesquelles sont nullipares et non gravides. Les animaux P sont sexuellement matures, de poids similaire ( sexe identique) au dbut du traitement, dge similaire (environ 90 jours) au moment de laccouplement, et reprsentatifs de lespce et de la souche tudis. Ils sont acclimats pendant au moins 5 jours aprs leur arrive au laboratoire. Les animaux sont rpartis au hasard entre groupes de traitement et groupes tmoins, de manire ce que les poids moyens de chaque groupe soient comparables (cest--dire 20 % de la moyenne globale). Conditions dencagement et dalimentation 12. Lanimalerie est 22 C ( 3 C), avec une humidit relative situe entre 30 et 70 %, lidal tant quelle soit maintenue entre 50 et 60 %. Lclairage est artificiel, alternant 12 heures de lumire et 12 heures dobscurit. Un rgime alimentaire classique pour animaux de laboratoire, avec eau potable satit, conviendra. On contrlera attentivement la teneur en phytoestrognes de lalimentation, qui est susceptible, si elle est leve, de modifier certains effets sur la reproduction. Les rgimes alimentaires standard formulation libre, dans lesquels la teneur en substances strogniques a t rduite, sont recommands (2), (30). Le choix des aliments sera guid par la ncessit dassurer un mlange convenable de la substance dessai, lorsque celle-ci est administre dans les aliments. Il convient de vrifier la concentration, lhomognit et la stabilit de la substance dessai dans lalimentation. La nourriture et leau de boisson seront analyses rgulirement la recherche de contaminants. Des chantillons de chaque lot de nourriture utilis au cours de ltude sont conservs dans des conditions appropries (par exemple congels 20 C), jusqu la finalisation du rapport, dans lventualit o les rsultats exigeraient une analyse supplmentaire des ingrdients consomms. 13. Les animaux sont encags par petits groupes dindividus de mme sexe recevant la mme dose. On envisagera un encagement individuel pour viter dventuelles blessures (par exemple entre mles aprs la priode daccouplement). Il convient que laccouplement se droule dans des cages propices cette fin. Ds constatation de la copulation, les femelles prsumes gravides sont hberges sparment dans des cages destines la mise-bas ou la maternit, o leur sont fournis des matriaux de nidification appropris et dtermins. Les portes sont hberges avec leur mre jusquau sevrage. Les animaux F1 sont encags par petits groupes dindividus de mme sexe et recevant la mme dose, du sevrage au sacrifice. On peut encager les animaux individuellement si une ncessit scientifique le justifie. Le type de litire choisi contient le moins possible de phytoestrognes. Nombre et identification des animaux 14. Normalement, chaque groupe dessai ou groupe tmoin contient un nombre de couples suffisant pour produire au moins 20 femelles gravides par groupe de dose. On cherche obtenir suffisamment de gestations pour assurer une valuation significative de laction de la substance tudie sur la fertilit, la gravidit et le comportement maternel de la gnration P, ainsi que sur la croissance et le dveloppement de la descendance F1, depuis la conception jusqu la maturit. Si le nombre de femelles gravides souhait nest pas atteint, ltude nest pas ncessairement invalide et chaque chec sera analys au cas par cas la recherche dventuels liens de cause effet avec la substance dessai. 15. Chaque animal P se voit attribuer un numro didentification unique avant le dbut du traitement. Si les donnes historiques du laboratoire suggrent quune part importante des femelles est susceptible de 4
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ne pas prsenter des cycles straux rguliers (de 4 ou 5 jours), il est conseill dtudier les cycles straux avant dadministrer les doses. Une autre option consiste agrandir les groupes de faon garantir quau moins 20 femelles dans chaque groupe prsentent des cycles straux rguliers (4 ou 5 jours) au moment de commencer le traitement. Tous les descendants F1 sont identifis de manire unique lors du premier examen des nouveau-ns effectu le jour de leur naissance (jour post-natal : JPN 0) ou un jour aprs (JPN 1). Tout au long de ltude, on gardera la trace de la porte dorigine de tous les animaux de la gnration F1 puis de la gnration F2, si elle est produite. Substance dessai Informations disponibles sur la substance dessai 16. Il importe dexaminer les donnes existantes pour choisir la voie dadministration, le vhicule et lespce utilise, slectionner les doses et ventuellement adapter le programme de traitement. Ainsi, il convient que la planification dune tude tendue de toxicit pour la reproduction sur une gnration tienne compte de toutes les informations pertinentes disponibles concernant la substance dessai, savoir proprits physico-chimiques, toxicocintiques (y compris mtabolisme propre lespce) et toxicodynamiques, relations structure-activit (RSA), mcanismes mtaboliques in vitro, rsultats des tudes de toxicit antrieures et donnes utiles sur les analogues de structure. Certaines informations prliminaires sur labsorption, la distribution, le mtabolisme et llimination (ADME), ainsi que sur la bioaccumulation, peuvent tre dduites de la structure chimique, des donnes physico-chimiques, de la capacit de liaison aux protines plasmatiques ou des tudes toxicocintiques ; les rsultats des tudes de toxicit livrent des informations supplmentaires, notamment sur la CSENO, le mtabolisme ou linduction du mtabolisme. Prise en compte des donnes toxicocintiques 17. Mme si elles ne sont pas obligatoires, les donnes toxicocintiques tires dtudes antrieures prliminaires de dtermination des concentrations ou autres tudes sont extrmement utiles pour planifier ltude, slectionner les niveaux de dose et interprter les rsultats. Sont particulirement utiles les donnes qui : 1) vrifient lexposition la substance dessai (ou ses mtabolites importants) des ftus et des petits en cours de dveloppement, 2) livrent une estimation de la dosimtrie interne, et 3) valuent la saturation potentielle des mcanismes cintiques en fonction de la dose. Il convient aussi de prendre en compte, lorsquelles sont disponibles, dautres informations toxicocintiques comme le profil des mtabolites, la fonction concentration-temps, etc. On pourra aussi recueillir pendant ltude principale des donnes toxicocintiques supplmentaires, condition que cela ninterfre pas avec la dtermination et linterprtation des principaux effets tudis. En rgle gnrale, les donnes toxicocintiques suivantes seront utiles pour planifier ltude tendue de toxicit pour la reproduction sur une gnration : En fin de gestation (par exemple au 20e jour de gestation) sang de la mre et du ftus Au milieu de lallaitement (JPN 10) sang maternel, sang du petit et/ou lait Peu aprs le sevrage (par exemple, JPN 28) chantillons sanguins des petits sevrs.

La souplesse sera de mise dans la dtermination des substances spcifiques analyser (par exemple le compos principal et/ou ses mtabolites) et du programme dchantillonnage. Par exemple, le nombre et le moment des prlvements dchantillons le jour prvu dpendront des voies dexposition et des connaissances existantes concernant les proprits toxicocintiques chez les animaux non gravides. Quand la substance dessai est administre dans la nourriture, il suffit de prlever les chantillons heure fixe les jours concerns, tandis que pour ladministration par gavage, des prlvements supplmentaires peuvent savrer ncessaires dans la mme journe pour obtenir une meilleure estimation de la gamme des doses 5
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internes. Il nest toutefois pas ncessaire de tracer lintgralit de la fonction concentration-temps, pour quelque jour de prlvement que ce soit. Si ncessaire, les prlvements sanguins destins aux analyses des ftus et des nouveau-ns peuvent tre regroups par sexe pour une mme porte. Voie dadministration 18. Il convient que le choix de la voie dadministration tienne compte de la voie ou des voies les plus appropries lexposition humaine. Bien que le protocole prvoie ladministration de la substance dessai dans la nourriture, il peut tre modifi au profit dune autre voie (eau de boisson, gavage, inhalation, voie cutane), en fonction des caractristiques du produit et des informations recherches. Choix du vhicule 19. Sil y a lieu, la substance dessai est dissoute ou mise en suspension dans un vhicule appropri. On recommande, si possible, de recourir en priorit une solution ou suspension aqueuse, ou dfaut une solution ou suspension huileuse (par exemple dans lhuile de mas). Si le vhicule nest pas aqueux, il convient que sa toxicit soit connue. Les vhicules susceptibles de prsenter une toxicit intrinsque sont proscrire (par exemple actone, DMSO). Il faut dterminer la stabilit de la substance dessai dans le vhicule. Il convient en outre de tenir compte des caractristiques suivantes lorsquun vhicule ou un autre adjuvant est utilis pour faciliter ladministration : effets sur labsorption, la rpartition, le mtabolisme ou la rtention de la substance dessai ; effets sur les proprits chimiques de la substance dessai susceptibles de modifier sa toxicit ; et effets sur la consommation de nourriture ou deau et sur ltat nutritionnel des animaux. Choix des doses 20. Normalement, ltude porte sur au moins trois niveaux de dose et un tmoin concomitant. Pour slectionner les niveaux de dose appropris, lexprimentateur tient compte de toutes les informations disponibles, y compris les donnes relatives au dosage des tudes antrieures, les rsultats toxicocintiques concernant les animaux gravides ou non gravides, limportance du transfert dans le lait, et les estimations de lexposition humaine. Si les donnes toxicocintiques disponibles indiquent une saturation des mcanismes toxicocintiques en fonction de la dose, on sefforcera dviter les doses leves induisant clairement une saturation, condition, bien entendu, que les expositions humaines attendues soient bien infrieures ce seuil de saturation. Le niveau de la dose maximale devra alors correspondre au point dinflexion vers un comportement toxicocintique non linaire, ou lui tre lgrement suprieur. 21. dfaut de donnes toxicocintiques pertinentes, les niveaux de dose sont dfinis en fonction des effets toxiques, dans la limite des proprits physiques/chimiques de la substance dessai. Si les niveaux de dose sont fixs daprs la toxicit, la dose maximale est celle qui induit une certaine toxicit systmique, sans provoquer de dcs ni de souffrances aigus des animaux. 22. On slectionnera une squence de doses dcroissantes afin de mettre en vidence une ventuelle relation dose-effet et de dterminer les CSENO ou les doses proches de la limite de dtection, ce qui permettra de dduire une dose de rfrence pour le(s) paramtre(s) dvaluation le(s) plus sensible(s). Pour viter des carts de dose importants entre CSENO et CMENO, le recours des multiples de deux ou quatre est gnralement optimal. Ladjonction dun quatrime groupe dessai est souvent prfrable lapplication dintervalles trs espacs (par exemple suprieur un facteur dix) entre les doses. 23. Les animaux du groupe tmoin sont manipuls de la mme manire que les animaux traits, lexception du fait quils ne reoivent pas la substance dessai. Ce groupe tmoin ne sera pas trait ou recevra un placebo, ou le vhicule si ladministration de la substance dessai en ncessite un. Si un 6
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vhicule est employ, les animaux du groupe tmoin devront recevoir le plus grand volume utilis de ce vhicule. Essai limite 24. Si des essais doses rptes conduits une dose dau moins 1 000 mg/kg de poids corporel/jour ne produisent aucun effet toxique observable, ou sil ny a pas de raison de penser que la substance est toxique compte tenu des donnes dont on dispose au sujet de composs prsentant une structure et/ou une action mtabolique analogues et des proprits mtaboliques in vivo/in vitro similaires, il nest pas indispensable de mener une tude complte sur plusieurs doses diffrentes. Dans cette ventualit, ltude tendue de toxicit pour la reproduction sur une gnration se limitera un groupe tmoin et une dose unique dau moins 1 000 mg/kg de poids corporel/jour. Cependant, si cette dose limite provoque des signes de toxicit pour la reproduction ou le dveloppement, dautres tudes conduites des doses infrieures simposent pour dfinir une CSENO. Ces remarques concernant lessai limite ne sont valables que si le niveau de lexposition humaine nimplique pas dvaluer des doses suprieures. PROTOCOLES Exposition de la descendance 25. On privilgiera ladministration dans la nourriture comme voie dexposition. Dans le cas des tudes par gavage, il faut noter que normalement, les petits ne recevront la substance dessai quindirectement par le lait maternel jusqu ce quon leur administre la dose directement, partir du sevrage. Lorsque la substance dessai est mlange la nourriture ou leau de boisson, les petits recevront aussi la substance dessai directement, ds quils commenceront salimenter tout seuls pendant la dernire semaine dallaitement. La mthodologie est modifie lorsque lexcrtion de la substance dessai dans le lait est faible ou que lexposition continue de la descendance nest pas avre. Dans ces cas, on envisagera de traiter directement les petits pendant lallaitement en fonction des donnes toxicocintiques disponibles, de la toxicit pour la descendance ou de lvolution des biomarqueurs (3), (4). Il convient dvaluer soigneusement les avantages et les inconvnients avant la mise en uvre dtudes dadministration directe aux petits allaits (5). Programme du traitement et administration des doses 26. Il se peut que lon dispose dinformations sur les cycles straux, de donnes histopathologiques sur les tractus reproducteurs mles et femelles et danalyses des spermatozodes testiculaires/pididymaires provenant dtudes de toxicit doses rptes antrieures dune dure adquate. Pour ce qui est de ltude tendue de toxicit pour la reproduction sur une gnration, la dure du traitement avant laccouplement doit donc permettre de dtecter les effets des modifications fonctionnelles susceptibles de perturber le comportement daccouplement et la fertilisation. Il convient que le traitement avant laccouplement dure suffisamment longtemps pour atteindre des conditions dexposition stables chez les mles et les femelles P. Gnralement, une priode de deux semaines conviendra pour les deux sexes. Chez les femelles, cette priode correspond 3 4 cycles straux complets et devrait suffire identifier dventuels effets nocifs sur la cyclicit. Chez les mles, elle correspond la dure ncessaire la migration des spermatozodes en maturation dans lpididyme, et devrait permettre de dtecter les effets post-testiculaires sur le sperme (au cours des derniers stades de la spermiation et de la maturation des spermatozodes pididymaires) au moment de laccouplement. Au moment du sacrifice, quand lexamen histopathologique des testicules et pididymes et lanalyse des caractristiques du sperme sont programms, les mles P et F1 auront donc t exposs la substance dessai pendant au moins un cycle entier de spermatogense (6) (7) (8) (9) et document dorientation 151 (40). 7
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27. Les scnarios dexposition des mles avant laccouplement peuvent tre adapts si des tudes antrieures ont clairement mis en vidence une toxicit testiculaire (anomalie de la spermatogense) ou des effets sur lintgrit et le fonctionnement des spermatozodes. De la mme manire, pour les femelles, lexistence deffets avrs de la substance dessai sur les cycles straux et par consquent sur la rceptivit sexuelle peut motiver une modification des scnarios dexposition avant laccouplement. Dans certains cas particuliers, on pourra attendre de dtecter des spermatozodes par frottis vaginal avant de commencer le traitement des femelles P (voir document dorientation 151 (40)). 28. Une fois que la dure de la priode dexposition avant laccouplement est dfinie, les animaux sont traits en continu avec la substance dessai, 7 jours sur 7 jusqu la ncropsie. Le mode dadministration sera le mme pour tous les animaux. Le traitement se poursuivra pendant les deux semaines de la priode daccouplement et, pour les femelles P, au cours de la gestation puis de lallaitement jusqu leur sacrifice aprs le sevrage. Les mles seront traits de la mme faon jusqu leur sacrifice, au moment du sevrage des animaux F1. En ce qui concerne la ncropsie, la priorit est donne aux femelles qui seront ncropsies le mme jour ou un jour similaire de lactation. La ncropsie des mles peut staler sur un plus grand nombre de jours, selon les quipements du laboratoire. moins davoir dbut pendant la priode de lactation, ladministration de la substance dessai directement aux mles et femelles F1 slectionns commence au moment du sevrage et se poursuit jusqu la date programme pour la ncropsie, en fonction de la cohorte. 29. Il importe de sassurer que les quantits de substances administres dans la nourriture ou leau de boisson ninterfrent pas avec la nutrition ou lquilibre hydrique. Lorsque la substance dessai est ajoute la nourriture, deux possibilits sont offertes : soit le maintien dune concentration constante dans les aliments (ppm), soit le maintien dun niveau de dose constant par rapport au poids corporel des animaux ; il y a lieu de prciser loption retenue. 30. Si la substance dessai est administre par gavage, le volume maximal de liquide administr en une seule fois ne dpasse pas 1 ml/l00 g de poids corporel (0.4 ml/100 g de poids pour lhuile, de mas par exemple). Sil ne sagit pas de substances irritantes ou corrosives dont les effets doivent en principe sintensifier aux concentrations suprieures, on rduira au minimum la variabilit du volume dessai en adaptant les concentrations de faon obtenir un volume constant toutes les doses. Le produit est administr chaque jour heure fixe. La dose reue par chaque animal est normalement calcule sur la base de la pese la plus rcente de lanimal, et est ajuste au moins une fois par semaine pour les mles adultes et les femelles adultes non gravides, et tous les deux jours pour les femelles gravides et les descendants F1 si elle est administre avant le sevrage et pendant les deux semaines qui suivent le sevrage. Si les donnes toxicocintiques indiquent un faible transfert de la substance dessai dans le placenta, il faudra ventuellement revoir la dose administre par gavage pendant la dernire semaine de gestation afin dviter de traiter la mre avec une dose excessivement toxique. Le jour de la mise-bas, les femelles ne sont pas traites par gavage ou toute autre voie dadministration impliquant la manipulation de lanimal ; il est en effet prfrable de ne pas les traiter ce jour-l plutt que de perturber le processus de la naissance. Accouplement 31. Chaque femelle P est place avec un seul mle non apparent choisi au hasard dans le mme groupe de dose (accouplement 1:1) jusqu ce que la copulation soit avre ou pendant deux semaines. Si le nombre de mles est insuffisant, en raison par exemple de dcs de mles avant la mise en couple, on pourra placer un ou plusieurs des mles stant dj accoupls avec une seconde femelle (1:1) afin que toutes les femelles aient un partenaire. Le jour 0 de la gestation est celui o laccouplement est avr (observation de sperme ou dun bouchon vaginal). Les animaux sont spars ds que possible une fois que la copulation a t confirme. Si les animaux ne se sont toujours pas accoupls au bout de deux semaines, 8
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ils sont spars sans autre tentative daccouplement. Les couples sont clairement identifis dans les rsultats. Taille des portes 32. Au quatrime jour aprs la naissance, on peut ajuster la taille de chaque porte en liminant des petits surnumraires choisis au hasard, afin de sapprocher autant que possible du nombre de cinq mles et cinq femelles par porte. Il ne convient pas de procder une limination slective des petits, par exemple base sur le poids corporel. Lorsque le nombre de petits mles et femelles est tel quil empche de disposer de cinq animaux de chaque sexe par porte, il est acceptable de procder des ajustements partiels (par exemple, six mles et quatre femelles). Slection des petits pour les tudes aprs le sevrage (voir figure 1) 33. Au moment du sevrage (vers le JPN 21), on slectionne des petits de toutes les portes disponibles, avec un maximum de 20 portes par groupe de dose et tmoin, afin de les soumettre des examens ultrieurs et de les lever jusqu la maturation sexuelle (sauf si des essais sont ncessaires avant). La slection des petits est alatoire, si ce nest quil convient dcarter les individus clairement chtifs (dont le poids corporel est infrieur de plus de deux carts-types au poids moyen des petits de la mme porte), dans la mesure o ils ne sont sans doute pas reprsentatifs du groupe de traitement. Au JPN 21, les petits F1 slectionns sont affects au hasard lune des trois cohortes danimaux suivantes : Cohorte 1 (1A et 1B) = essai de toxicit pour la reproduction/le dveloppement Cohorte 2 (2A et 2B) = essai de neurotoxicit pour le dveloppement Cohorte 3 = essai dimmunotoxicit pour le dveloppement Cohorte 1A : un mle et une femelle/porte/groupe (20/sexe/groupe) : slection prioritaire pour lvaluation primaire des effets sur lappareil reproducteur et de la toxicit gnrale. Cohorte 1B : un mle et une femelle/porte/groupe (20/sexe/groupe) : slection prioritaire pour lvaluation ultrieure de la capacit de reproduction lors de laccouplement danimaux F1 (voir document dorientation 117 (39)), et pour obtenir des informations histopathologiques supplmentaires dans le cas dagents prsums toxiques pour la reproduction ou le systme endocrinien, ou quand les rsultats de la cohorte 1A sont quivoques. Cohorte 2A : total de 20 petits par groupe (10 mles et 10 femelles par groupe ; un mle ou une femelle par porte) destins des tests neurocomportementaux suivis dun examen neurohistopathologique lge adulte. Cohorte 2B : total de 20 petits par groupe (10 mles et 10 femelles par groupe ; un mle ou une femelle par porte) destins un examen neurohistopathologique au moment du sevrage (JPN 21 ou JPN 22). Si les animaux ne sont pas assez nombreux, ils seront affects en priorit la cohorte 2A. Cohorte 3 : total de 20 petits par groupe (10 mles et 10 femelles par groupe, dont un individu par porte, si possible). Il pourra y avoir lieu dutiliser des petits supplmentaires issus du groupe tmoin, qui serviront de tmoins positifs pour lessai de rponse anticorps dpendante des lymphocytes T, au JPN 56 3. 34. Si lune des portes ne compte pas suffisamment de petits pour toutes les cohortes, ils sont affects en priorit la cohorte 1, qui peut ensuite servir produire une gnration F2. Il est possible daffecter davantage de petits lune des cohortes en cas de proccupations spcifiques, par exemple quand un produit chimique est prsum neurotoxique, immunotoxique ou reprotoxique. Ces petits pourront servir des examens mens des moments diffrents ou pour lvaluation deffets supplmentaires. Les 9
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petits non affects aux cohortes feront lobjet dun examen biochimique clinique (paragraphe 55) et dune ncropsie macroscopique (paragraphe 68). Second accouplement des animaux P 35. On dconseille gnralement de procder un second accouplement des animaux P, ce qui entranerait la perte dinformations importantes sur le nombre de points dimplantation (et donc de donnes post-implantation et prinatales, indicatrices dune ventuelle action tratogne) concernant la premire porte. Sil y a lieu de vrifier ou dlucider un effet chez les femelles exposes, il est prfrable dtendre ltude un accouplement de la gnration F1. Cependant, il est toujours possible de procder un second accouplement des mles P avec des femelles non traites afin de clarifier les rsultats quivoques ou pour mieux caractriser les effets sur la fertilit observs la suite du premier accouplement. OBSERVATIONS IN VIVO Observations cliniques 36. Les animaux P et F1 slectionns font lobjet dune observation clinique gnrale quotidienne. Si ladministration se fait par gavage, ces observations cliniques auront lieu avant et aprs le traitement ( la recherche dventuels signes de toxicit associs aux pics de concentration plasmatique). On note les changements de comportement pertinents, les signes de mise-bas prolonge ou difficile et tous les signes de toxicit. Deux fois par jour, ou une fois par jour pendant le week-end, on surveille les manifestations de toxicit svre, la morbidit et la mortalit sur lensemble des animaux. 37. En outre, tous les individus P et F1 (aprs le sevrage) font lobjet une fois par semaine dun examen plus dtaill, quil sera commode deffectuer loccasion dune pese de lanimal, ce qui limitera le stress li la manipulation. Les observations sont effectues avec soin et consignes conformment aux systmes de cotation dfinis par le laboratoire dessai. On sattache particulirement rduire au minimum les variations affectant les conditions de lessai. Les observations notes portent, sans que cette liste soit exhaustive, sur les modifications de la peau, de la fourrure, des yeux et des muqueuses, sur lapparition de scrtions et dexcrtions et sur les activits rflexes (par exemple larmes, rection des poils, diamtre de la pupille, rythme respiratoire inhabituel). Il convient galement de noter tout changement dans la dmarche ou la posture, les ractions la manipulation ainsi que lapparition de mouvements spasmodiques ou de contractures, de strotypes (par exemple toilettage excessif, circuits rptitifs) ou de comportements bizarres (par exemple automutilation, marche reculons). Poids corporel et consommation de nourriture et deau 38. Les animaux P sont pess le jour de la premire administration et ensuite au moins une fois par semaine. En outre, les femelles P sont peses pendant lallaitement, les mmes jours que la pese des petits de leurs portes (voir paragraphe 44). Tous les animaux F1 sont pess individuellement au moment du sevrage (JPN 21) et au moins chaque semaine par la suite. On relve aussi le poids corporel des animaux le jour o ils atteignent la pubert (sparation prputiale ou ouverture vaginale observables). Tous les animaux sont pess au moment du sacrifice. 39. Au cours de ltude, la consommation de nourriture et deau (si la substance dessai est administre dans leau de boisson) est consigne au moins une fois par semaine, le mme jour que la pese des animaux (sauf pendant la cohabitation). La consommation de nourriture de chaque cage danimaux F1 est note une fois par semaine, ds laffectation une cohorte particulire.

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Cycles straux

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40. Les ventuelles informations prliminaires concernant les effets de la substance dessai sur le cycle stral, fournies par de prcdentes tudes de toxicit doses rptes, pourront tre mises profit pour laborer un protocole dtude tendue de toxicit pour la reproduction sur une gnration propre au produit chimique concern. Normalement, lvaluation de la cyclicit strale (par cytologie vaginale) commence au dbut de la priode de traitement et se poursuit jusqu ce que laccouplement soit avr ou jusqu la fin de la priode daccouplement de deux semaines. Si lon a vrifi la normalit des cycles straux des femelles avant dadministrer la substance dessai, il est utile de poursuivre les frottis quand le traitement dmarre, mais si lon craint des effets non spcifiques au dmarrage du traitement (par exemple une baisse marque de la consommation de nourriture), on pourra laisser les animaux sadapter au traitement pendant deux semaines maximum avant la priode dobservation des frottis (de deux semaines) qui prcde la priode daccouplement. Si lon prolonge ainsi la priode de traitement des femelles (ce qui porte 4 semaines le traitement avant accouplement), on pourra envisager dacheter les animaux plus jeunes et de rallonger aussi la priode de traitement des mles avant la mise en couple. Pour obtenir des cellules vaginales ou cervicales, on prendra soin dviter dagresser la muqueuse ce qui risquerait dinduire une pseudo-gestation (10) (11). 41. Les frottis vaginaux sont examins chaque jour pour lensemble des femelles F1 de la cohorte 1A, partir de louverture du vagin jusqu lobservation des premires cellules kratinises, afin de dterminer lintervalle de temps entre ces deux vnements. Il convient galement de suivre les cycles straux de toutes les femelles F1 de la cohorte 1A pendant deux semaines, partir du 75me jour postnatal environ. En outre, si laccouplement de la gnration F1 simpose, la cytologie vaginale des femelles de la cohorte 1B se poursuivra depuis la mise en couple jusqu ce que la copulation ait eu lieu. Accouplement et gravidit 42. Outre les paramtres standard (par exemple, poids corporel, consommation de nourriture, observations cliniques dont contrle de la mortalit/morbidit), on relve les dates de mise en couple, dinsmination et de mise-bas, et on calcule lintervalle prcotal (entre la mise en couple et linsmination) et la dure de la gestation (entre linsmination et la mise-bas). Il convient dexaminer minutieusement les femelles P au moment prvu pour la mise-bas afin de reprer dventuels symptmes de dystocie. Toute anomalie du comportement de nidification ou dallaitement devra tre releve. 43. Le jour de la parturition correspond au jour 0 de lallaitement pour la mre, et au jour postnatal 0 (JPN 0) pour la descendance. Il est aussi possible de compter les jours partir de la copulation pour viter les erreurs sur les donnes relatives au dveloppement postnatal dues aux diffrences de dure de gestation ; il convient toutefois de noter galement les jours partir de la mise-bas. Ce changement de rfrence est particulirement important lorsque la substance dessai influence la dure de la gestation. Caractristiques de la descendance 44. On examine chaque porte ds que possible aprs la mise-bas (JPN 0 ou 1) afin dtablir le nombre et le sexe des petits, la mortinatalit, le nombre de naissances vivantes et la prsence danomalies macroscopiques (anomalies externes visibles, y compris : fentes palatines ; hmorragies sous-cutanes ; anomalies de la couleur ou de la texture de la peau ; prsence du cordon ombilical ; absence de lait dans lestomac ; prsence de scrtions sches). De plus, le premier examen clinique des nouveau-ns est loccasion deffectuer une valuation qualitative de la temprature corporelle, du degr dactivit et de la raction la manipulation. Chez les petits morts JPN 0 ou plus tard, on recherche dventuelles anomalies et la cause du dcs. Les petits en vie sont compts et pess individuellement JPN 0 ou JPN 1, puis rgulirement, par exemple au moins aux JPN 4, 7, 14 et 21. Les examens cliniques, qui dpendent de 11
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lge des animaux, sont rpts chaque pese des descendants, voire plus souvent si des cas spcifiques ont t rvls au moment de la naissance. Les symptmes surveiller sont notamment les suivants (liste non exhaustive) : anomalies externes, modifications de ltat de la peau, de la fourrure, des yeux, des muqueuses, apparition de scrtions et dexcrtions et de ractions neurovgtatives. Il convient galement de noter tout changement dans la dmarche ou la posture, les ractions la manipulation ainsi que lapparition de mouvements spasmodiques ou de contractures, de strotypies ou de comportements bizarres. 45. On mesure la distance anognitale (DAG) de chaque petit au moins une fois entre les JPN 0 et 4. Le poids corporel des petits est relev le jour de la mesure de la DAG, qui est rapporte la taille du petit, de prfrence la racine cubique du poids corporel (12). On recherche la prsence de ttons/aroles chez les petits mles aux JPN 12 ou 13. 46. On commence surveiller quotidiennement les signes de sparation balano-prputiale ou douverture vaginale sur tous les animaux F1 avant le jour prvu dapparition de ces signes, afin de dtecter une ventuelle maturation sexuelle prcoce. Toute anomalie persistante des organes gnitaux, telle que filaments vaginaux, hypospadias ou pnis bifide est note. La maturit sexuelle des animaux F1 est compare au dveloppement physique en dterminant lge et le poids corporel au moment de la sparation balano-prputiale ou de louverture vaginale chez le mle/la femelle, respectivement (13). valuation du potentiel de neurotoxicit pour le dveloppement (cohortes 2A et 2B) 47. Lvaluation de la neurotoxicit sappuie sur les individus des cohortes 2A et 2B, qui comptent chacune dix mles et dix femelles issus de chaque groupe de traitement (1 mle ou 1 femelle par porte ; chaque porte reprsente par au moins un petit ; slection au hasard). Les animaux de la cohorte 2A seront soumis une batterie dobservations fonctionnelles, une valuation du rflexe de sursaut auditif, de lactivit motrice (voir paragraphes 48-50) et une valuation neuropathologique (voir paragraphes 74-75). On sattachera particulirement rduire au minimum les variations affectant lensemble des conditions de lessai et sassurer quelles ne sont pas systmatiquement lies au traitement. Parmi les variables susceptibles de jouer sur le comportement figurent le niveau sonore (par exemple bruits intermittents), la temprature, lhumidit, lclairage, les odeurs, lheure du jour et les distractions lies lenvironnement extrieur. Il convient dinterprter les rsultats des essais de neurotoxicit en fonction des ordres de grandeur de rfrence appropris provenant des groupes tmoins historiques. Lvaluation neuropathologique des animaux de la cohorte 2B aura lieu aux JPN 21 ou 22 (voir paragraphes 74-75). 48. On testera le rflexe de sursaut auditif des animaux de la cohorte 2A au JPN 24 ( 1 jour). Lvaluation des groupes traits et tmoins est rpartie de manire quilibre au cours de la journe. Chaque session comporte 50 essais. Pour ces tests de sursaut auditif, on calculera lamplitude de la rponse moyenne pour chaque bloc de 10 essais (5 blocs de 10 essais), dont les conditions sont optimises pour permettre une accoutumance intra-session. Ces protocoles sont conformes la LD 426 de lOCDE (35). 49. un moment appropri entre les JPN 63 et 75, les animaux de la cohorte 2A sont soumis la batterie dobservations fonctionnelles ainsi qu un test automatis de motricit. Ces procdures sont conformes aux LD 424 (33) et 426 (35) de lOCDE. La batterie dobservations fonctionnelles comprend une description complte de lapparence, du comportement et de lintgrit fonctionnelle du sujet. Ces valuations sont bases sur des observations effectues dans la cage dhbergement puis dans un espace dobservation normalis (plan ouvert) o lanimal peut se dplacer librement, et sur des tests de manipulation. On procdera aux essais par ordre dinteractivit croissante. Une liste de mesures est prsente lappendice A. Tous les animaux sont examins soigneusement par des observateurs forms cet effet et ignorant le traitement reu par lanimal, suivant des protocoles normaliss destins limiter la variabilit lie lobservateur. Dans la mesure du possible, il est recommand de confier au mme 12
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observateur lvaluation de tous les animaux dun test donn. dfaut, il convient de dmontrer la fiabilit inter-observateurs. Pour chaque paramtre de la batterie de tests comportementaux, il faudra se rfrer des chelles et des critres de cotation dont les modes opratoires sont dfinis explicitement. Si possible, des mesures quantitatives objectives sont effectues pour les observations impliquant une cotation subjective. Concernant lactivit motrice, chaque animal est test individuellement. La sance dessai dure assez longtemps pour permettre de dmontrer laccoutumance intra-session des tmoins. Lactivit motrice est contrle laide dun appareil denregistrement automatique capable de dtecter aussi bien des augmentations que des diminutions dactivit (cest--dire que lactivit de base mesure par le dispositif ne doit pas tre trop faible, ce qui empcherait la dtection des diminutions dactivit, ni trop forte, ce qui empcherait la dtection daugmentations). Tous les appareils sont tests selon des protocoles standard afin de garantir, dans la mesure du possible, la reproductibilit entre appareils et entre dates de mesure. Il convient dquilibrer au mieux les groupes de traitement affects chaque appareil. Les groupes dvaluation de lessai sont rpartis sur la journe pour tenir compte des rythmes dactivit circadiens. 50. Sil existe des informations indiquant que dautres essais fonctionnels simposent (par exemple sensoriels, sociaux, cognitifs), ces essais seront inclus dans le protocole de ltude sans compromettre lintgrit des autres valuations prvues. Si ces autres essais portent sur les mmes animaux que ceux soumis au test du sursaut auditif, la batterie dobservations fonctionnelles et au test de motricit, il convient de les programmer des moments diffrents pour limiter le risque de perturbation. Des protocoles supplmentaires peuvent se rvler particulirement utiles lorsque lobservation empirique, les effets anticips ou divers aspects lis au mcanisme ou au mode daction suggrent un type spcifique de neurotoxicit. valuation du potentiel dimmunotoxicit pour le dveloppement (cohorte 3) 51. Au JPN 56 ( 3 jours), 10 mles et 10 femelles de la cohorte 3 issus de chaque groupe de traitement (1 mle ou 1 femelle par porte ; chaque porte reprsente par au moins un petit ; slection au hasard) seront soumis un essai de rponse anticorps dpendant des lymphocytes T, la recherche danticorps IgM produits au cours de la rponse primaire un antigne dpendant des lymphocytes T, par exemple les globules rouges de mouton (GRM) ou lhmocyanine de patelle (KLH) ; ces essais seront conformes aux protocoles actuels dtude de limmunotoxicit (14) (15). La rponse peut tre value par comptage des cellules formatrices de plaques (CFP) spcifiques dans la rate ou par titrage srique des anticorps IgM spcifiques aux GRM ou la KLH par ELISA, au moment du pic de rponse. En gnral, les rponses atteignent un pic quatre jours (pour le comptage des CFP) ou cinq jours (par ELISA) aprs limmunisation par voie intraveineuse. Si la rponse primaire des anticorps est value par comptage des CFP, il est permis de rpartir les animaux en sous-groupes valus des jours diffrents, aux conditions suivantes : lintervalle entre limmunisation et le sacrifice dun sous-groupe est dfini de manire ce que les CFP soient compts au moment du pic de la rponse ; les sous-groupes contiennent le mme nombre de descendants mles et femelles issus de tous les groupes de dose, y compris les tmoins ; et les sous-groupes sont examins peu prs au mme ge postnatal. On continuera dadministrer la substance dessai jusquau jour qui prcde le prlvement de la rate des animaux pour lvaluation de la rponse des CFP ou du srum pour lessai ELISA. valuation ultrieure du potentiel de reprotoxicit (cohorte 1B) 52. On peut continuer dadministrer le traitement aux animaux de la cohorte 1B au-del du JPN 90, et les lever pour produire une gnration F2 si ncessaire. Les mles et les femelles dun mme groupe de dose cohabitent (en vitant daccoupler les membres dune mme fratrie) pour une dure allant jusqu deux semaines, partir du JPN 90 ou aprs, mais pas au-del du JPN 120. Les protocoles sont les mmes que pour les animaux P. Cependant, sur la base du poids de la preuve, il peut savrer suffisant de sacrifier les portes au JPN 4 au lieu de les valuer jusquau sevrage ou au-del. 13
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OBSERVATIONS FINALES Biochimie clinique/hmatologie

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53. On surveillera les effets systmiques chez les animaux P. Des chantillons sanguins sont prlevs jeun sur un site dfini chez dix mles et femelles P par groupe de dose, slectionns au hasard au moment du sacrifice. Ces chantillons sont conservs dans des conditions appropries et font lobjet dun examen hmatologique partiel ou complet, dun examen biochimique clinique, dun dosage de T4 et TSH, ou dautres examens suggrs par la connaissance du profil deffets de la substance dessai (voir document dorientation 151 (40)). Il convient dvaluer les paramtres hmatologiques suivants : hmatocrite, concentration dhmoglobine, numration des rythrocytes, numration totale et diffrentielle des leucocytes, numration des plaquettes et mesure du temps et du potentiel de coagulation du sang. Dans le plasma ou le srum, on mesure les lments suivants : glucose, cholestrol total, ure, cratinine, protines totales, albumine et au moins deux enzymes indicatrices deffets sur les cellules hpatiques (telles que lalanine aminotransfrase, laspartate aminotransfrase, la phosphatase alcaline, la gamma glutamyl transpeptidase et la sorbitol dshydrognase). Dans certains cas, le dosage denzymes supplmentaires et des acides biliaires peut livrer des informations utiles. En outre, il est possible de conserver des prlvements sanguins de tous les animaux en vue dune ventuelle analyse ultrieure destine clarifier les effets quivoques ou gnrer des donnes dexposition interne. Sil nest pas prvu de procder un second accouplement, les chantillons sont prlevs dans le cadre du sacrifice programm ou juste avant. Lorsque les animaux sont maintenus en vie, les prlvements ont lieu quelques jours avant le second accouplement. Par ailleurs, moins que des tudes doses rptes antrieures indiquent que la substance dessai ninflue pas sur ce paramtre, il convient de procder une analyse durine avant le sacrifice, en valuant les critres suivants : apparence, volume, osmolalit ou densit, pH, protines, glucose, sang et globules rouges, dbris cellulaires. Des prlvements durine peuvent galement tre effectus afin de suivre lexcrtion de la substance dessai et/ou de son ou ses mtabolites. 54. On surveillera aussi les effets systmiques chez les animaux F1. Des chantillons sanguins sont prlevs jeun sur un site dfini chez dix mles et femelles de la cohorte 1A par groupe de dose, slectionns au hasard au moment du sacrifice. Ces chantillons sont conservs dans des conditions appropries et font lobjet dun examen biochimique clinique standard, et notamment dune mesure de la concentration srique des hormones thyrodiennes (T4 et TSH), dun examen hmatologique (numration totale et diffrentielle des leucocytes plus rythrocytes) et dune analyse durine. 55. Les petits surnumraires au JPN 4 font lobjet dune ncropsie macroscopique et on peut mesurer la concentration srique de lhormone thyrodienne T4 cette occasion. Si ncessaire, les chantillons sanguins des nouveau-ns (JPN 4) peuvent tre regroups par porte aux fins danalyses biochimiques et du dosage dhormones thyrodiennes. Des chantillons sanguins sont galement prlevs sur les sujets tout justes sevrs soumis une ncropsie macroscopique au JPN 22 (petits F1 non slectionns pour les cohortes), afin de doser la T4 et la TSH. Caractristiques du sperme 56. On dtermine les caractristiques du sperme pour tous les mles de la gnration P, sauf sil existe des donnes montrant que ces caractristiques ne sont pas modifies au cours dune tude sur 90 jours. Les caractristiques du sperme ne sont values que chez les mles de la cohorte 1A. 57. Au moment du sacrifice, on note le poids des testicules et des pididymes de tous les mles P et F1 (cohorte 1A). On conserve au moins un testicule et un pididyme pour lexamen histopathologique. 14
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Lpididyme non conserv sert la numration des spermatozodes stocks dans la queue de lpididyme (16) (17). Les spermatozodes de la queue de lpididyme (ou du canal dfrent) sont par ailleurs rcuprs dune manire qui perturbe le moins possible lvaluation de leur motilit et de leur morphologie (18). 58. La motilit des spermatozodes est value immdiatement aprs le sacrifice ou enregistre en vido en vue dune analyse ultrieure. Le pourcentage de spermatozodes progressivement motiles peut tre dtermin subjectivement ou objectivement grce une analyse du mouvement assiste par ordinateur (19) (20) (21) (22) (23) (24). On conduira lvaluation de la morphologie des spermatozodes partir dchantillons de sperme prlevs dans lpididyme (ou le canal dfrent) sous forme de prparations fixes ou en milieu humide (25). Au moins 200 spermatozodes par chantillon sont classs comme normaux (aussi bien la tte que la pice intermdiaire et le flagelle paraissent normaux) ou anormaux. Les anomalies morphologiques des spermatozodes comprennent, par exemple, la fusion, des ttes isoles et des ttes et/ou des queues dformes (26). Des ttes dformes ou larges peuvent indiquer des anomalies de la spermiation. 59. Si les chantillons de sperme sont congels, les frottis fixs et les images de la motilit des spermatozodes enregistres au moment de la ncropsie (27), les analyses ultrieures peuvent ne porter que sur les mles ayant reu des doses leves et sur les mles tmoins. Toutefois, si lon observe des effets lis au traitement, il faudra aussi valuer les groupes traits aux doses plus faibles. Ncropsie macroscopique 60. Juste aprs le sacrifice ou le dcs en cours dtude, tous les animaux P et F1 subissent une ncropsie macroscopique destine mettre en vidence dventuelles anomalies structurelles ou altrations pathologiques. Il faut prter une attention particulire aux organes de lappareil reproducteur. Il convient de consigner les petits moribonds qui ont t euthanasis et les petits morts, et, sils ne sont pas macrs, de les examiner pour dtecter dventuelles anomalies et/ou tablir la cause de leur mort, et de les conserver. 61. Un frottis vaginal des femelles P et F1 adultes sera examin le jour de la ncropsie pour dterminer le stade du cycle stral et permettre dtablir des corrlations avec lhistopathologie des organes reproducteurs. On examinera les utrus de toutes les femelles P (et F1, le cas chant) sans compromettre lvaluation histopathologique, pour voir sils prsentent des points dimplantation et les dnombrer. Pese des organes et conservation des tissus animaux adultes P et F1 62. Aprs le sacrifice, le poids corporel et le poids des organes numrs ci-dessous de tous les animaux P et F1 adultes des cohortes concernes (voir ci-aprs) sont dtermins ds que possible aprs dissection pour viter toute dessiccation. Il convient de prserver ensuite ces organes dans des conditions appropries. Sauf mention contraire, les organes qui vont par paires peuvent tre pess individuellement ou ensemble, conformment aux habitudes du laboratoire.

Utrus (dont oviductes et col), ovaires Testicules, pididymes (totalit et queue pour les chantillons servant la numration des spermatozodes)

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Prostate (ensemble des parties dorsolatrale et ventrale). Il convient dextraire trs soigneusement les tissus adhrents de lensemble de la prostate pour viter de percer les vsicules sminales remplies de liquide. Si le traitement a eu un effet sur le poids total de la prostate, on dissquera minutieusement les lobes dorsolatral et ventral aprs les avoir fixs et pess sparment. Vsicules sminales avec glandes coagulantes et leurs liquides (considrs comme une unit et pess ensemble) Cerveau, foie, reins, cur, rate, thymus, hypophyse, glande thyrode (aprs fixation), glandes surrnales et organes ou tissus cibles connus.

63. Outre les organes mentionns ci-dessus, on conservera, dans des conditions appropries, des chantillons de nerf priphrique, muscle, colonne vertbrale, il avec nerf optique, conduit gastrointestinal, vessie, poumon, trache (portant encore les glandes thyrode et parathyrodes), moelle osseuse, canal dfrent (mles), glandes mammaires (mles et femelles) et vagin. 64. Tous les organes des animaux de la cohorte 1A sont pess et conservs en vue de lexamen histopathologique. 65. Pour rechercher les effets immunotoxiques pr- et postnataux, 10 mles et 10 femelles de la cohorte 1A issus de chaque groupe de traitement (1 mle ou 1 femelle par porte ; chaque porte reprsente par au moins un petit ; slection au hasard) seront soumis aux examens suivants au moment du sacrifice : pese des ganglions lymphatiques associs ou non la voie dexposition (en plus de la pese des glandes surrnales, du thymus et de la rate, dj effectue pour tous les animaux de la cohorte 1A) ; analyse des sous-populations lymphocytaires splniques (lymphocytes T CD4+ et CD8+, lymphocytes B, et cellules tueuses naturelles NK) effectue sur la moiti de la rate, lautre moiti tant conserve en vue de lexamen histopathologique.

Lanalyse des sous-populations lymphocytaires splniques chez les animaux non immuniss (cohorte 1A) dterminera si lexposition contribue une modification de lquilibre immunologique concernant la distribution des lymphocytes thymiques auxiliaires (CD4+) ou cytotoxiques (CD8+) ou des cellules tueuses naturelles (NK) (rponses rapides aux cellules noplastiques et aux pathognes). 66. Il convient de peser les organes suivants des animaux de la cohorte 1B et de traiter leurs tissus jusqu leur transformation en blocs : - Vagin (non pes) - Utrus (dont col) - Ovaires - Testicules (au moins un) - pididymes - Vsicules sminales et glandes coagulantes - Prostate - Hypophyse - Organes cibles connus

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Lexamen histopathologique de la cohorte 1B ne sera conduit que si les rsultats de la cohorte 1A sont quivoques ou si la substance administre est prsume toxique pour la reproduction ou le systme endocrinien. 67. Cohortes 2A et 2B : essai de neurotoxicit pour le dveloppement (JPN 21 ou 22 et descendants adultes). Les animaux de la cohorte 2A sont sacrifis aprs lessai comportemental ; leur cerveau est ensuite pes et soumis un examen neurohistopathologique complet des fins dvaluation de la neurotoxicit. Les animaux de la cohorte 2B sont sacrifis au JPN 21 ou 22 ; leur cerveau est ensuite pes et soumis un examen microscopique pour valuer la neurotoxicit. La fixation par perfusion est indispensable pour les animaux de la cohorte 2A et facultative pour ceux de la cohorte 2B, conformment la LD 426 de lOCDE (35). Pese des organes et conservation des tissus animaux F1 juste sevrs 68. Les petits non slectionns pour les cohortes, y compris les individus chtifs, sont sacrifis aprs le sevrage, au JPN 22, sauf si les rsultats indiquent que dautres recherches in vivo simposent. Les petits euthanasis sont soumis une ncropsie macroscopique comprenant lvaluation des organes reproducteurs, conformment aux paragraphes 62 et 63. Le cerveau, la rate et le thymus sont pess et conservs dans des conditions appropries pour un nombre maximum de 10 petits par sexe et par groupe, issus dautant de portes que possible. De plus, on pourra conserver les tissus mammaires de ces petits mles et femelles en vue danalyses microscopiques supplmentaires 1 (voir document dorientation 151 (40)). On conservera galement les anomalies macroscopiques et les tissus cibles en vue dun ventuel examen histologique. Histopathologie animaux P 69. Un examen histopathologique complet des organes numrs aux paragraphes 62 et 63 est pratiqu sur lensemble des animaux P tmoins ou ayant reu une dose leve. Il convient aussi dexaminer les organes qui prsentent des modifications imputables la substance dessai chez tous les animaux traits avec des doses infrieures en vue de dfinir une CSENO. En outre, un examen histopathologique des organes reproducteurs et de toutes les lsions macroscopiques sera pratiqu sur tous les individus chez lesquels on souponne une diminution de la fertilit, par exemple ceux qui ne se sont pas accoupls, nont pas conu, nont pas engendr ou nont pas donn naissance des descendants sains, ou dont le cycle stral ou le nombre, la motilit ou la morphologie des spermatozodes ont t affects.

Histopathologie animaux F1 Animaux de la cohorte 1 70. Un examen histopathologique complet des organes numrs aux paragraphes 62 et 63 est pratiqu sur lensemble des animaux adultes de la cohorte 1A tmoins ou ayant reu une dose leve. Chaque porte est reprsente par au moins un petit de chaque sexe. Il convient aussi dexaminer les organes et les tissus qui prsentent des modifications imputables au traitement, ainsi que toutes les lsions macroscopiques, chez tous les animaux traits aux doses infrieures en vue de dterminer une CSENO. Lvaluation des effets pr- et postnataux sur les ganglions lymphatiques requiert un examen
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Les recherches ont dmontr que la glande mammaire, en particulier dans ses premiers stades de dveloppement, constitue un critre dvaluation valide de laction oestrognique. On recommande donc dinclure dans la prsente LD, aprs validation, des paramtres dvaluation fonds sur les glandes mammaires des petits des deux sexes.

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histopathologique des ganglions lymphatiques et de la moelle osseuse pratiqu sur 10 mles et 10 femelles de la cohorte 1A, en plus de lexamen histopathologique du thymus, de la rate et des glandes surrnales dj effectu sur tous les animaux 1A. 71. Les tissus reproducteurs et endocriniens de lensemble des individus de la cohorte 1B sont traits pour tre transforms en blocs. Comme mentionn au paragraphe 66, les organes reproducteurs et endocriniens des animaux de la cohorte 1B subissent un examen histopathologique en cas de suspicion de toxicit pour la reproduction ou le systme endocrinien. Il convient aussi de soumettre la cohorte 1B un examen histologique si les rsultats de la cohorte 1A sont quivoques. 72. Les ovaires des femelles adultes doivent contenir des follicules primordiaux et des follicules en croissance, ainsi que les grands corps jaunes ; lexamen histopathologique des femelles F1 vise donc quantifier les follicules primordiaux, les petits follicules en croissance et les grands corps jaunes ; il convient que le nombre danimaux, le choix de la section ovarienne et la taille des chantillons de section soient statistiquement appropris la mthode dvaluation employe. Il est possible de procder dabord la numration folliculaire des animaux tmoins et traits la dose leve ; si lexamen de ces derniers rvle un effet nocif, on tendra lvaluation aux individus ayant reu les doses infrieures. Lexamen inclut la numration des follicules primordiaux, lesquels peuvent tre combins de petits follicules en croissance, des fins de comparaison entre les ovaires des femelles traites et tmoins (voir document dorientation 151 (40)). Lvaluation des grands corps jaunes seffectue paralllement lessai de cyclicit strale de sorte que ltape du cycle puisse tre prise en compte. On vrifiera le dveloppement spcifique correct des oviductes, de lutrus et du vagin. 73. Un examen histopathologique dtaill des testicules sera pratiqu sur les mles F1 afin de mettre en vidence des effets lis au traitement sur la diffrenciation et le dveloppement des testicules, et sur la spermatogense (38). Quand cest possible, des coupes du rete testis seront examines. On vrifiera le dveloppement spcifique normal de la tte, du corps et de la queue de lpididyme ainsi que du canal dfrent, et on valuera les paramtres requis pour les mles P. Animaux de la cohorte 2 74. Un examen neurohistopathologique est pratiqu sur tous les animaux de la cohorte 2A tmoins et traits dose leve, par sexe, juste aprs le test neurocomportemental (aprs le JPN 75, mais pas au-del du JPN 90). Lexamen histopathologique du cerveau est effectu sur tous les animaux de la cohorte 2B tmoins et traits dose leve, par sexe, au JPN 21 ou 22. Il convient aussi dexaminer les organes ou tissus qui prsentent des modifications imputables la substance dessai chez les animaux traits avec des doses infrieures en vue de dterminer une CSENO. Pour les animaux des cohortes 2A et 2B, plusieurs coupes du cerveau sont ralises afin dexaminer les bulbes olfactifs, le cortex crbral, lhippocampe, les ganglions de la base, le thalamus, lhypothalamus, le msencphale (tectum, tegmentum et pdoncules crbraux), le tronc crbral et le cervelet. Seule la cohorte 2A subira par ailleurs un examen des yeux (rtine et nerf optique) et dchantillons de nerf priphrique, muscle et colonne vertbrale. Tous les protocoles neurohistologiques sont conformes la LD 426 de lOCDE (35). 75. Des parties reprsentatives du cerveau (coupes homologues soigneusement slectionnes grce des repres microscopiques fiables) seront soumises un examen morphomtrique (quantitatif), qui pourra inclure des mesures linaires et/ou surfaciques de rgions spcifiques du cerveau. On ralisera au moins trois coupes conscutives pour chaque repre morphologique (niveau) en vue de slectionner ensuite la coupe la plus homologue et reprsentative de la rgion spcifique du cerveau analyser. Les neuropathologistes devront juger si les coupes prpares pour les mesures sont homologues aux autres chantillons du lot et si elles peuvent donc tre examines, dans la mesure o les mesures linaires, en particulier, sont susceptibles de changer sur une distance relativement faible (28). Les coupes juges non 18
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homologues sont exclues. Lobjectif est de prlever des chantillons sur tous les animaux rservs cet effet (10/sexe/niveau de dose), mais un nombre infrieur demeure acceptable. Toutefois, des chantillons prlevs sur moins de 6 animaux/sexe/niveau de dose ne seront en principe pas considrs comme suffisants pour rpondre aux objectifs de la prsente LD. La strologie peut permettre didentifier des effets lis au traitement sur des paramtres tels que le volume ou le nombre de cellules de rgions neuroanatomiques spcifiques. Tous les aspects de la prparation des chantillons de tissus, depuis la fixation de tissus jusqu la dissection des chantillons de tissus, au traitement des tissus et la coloration des lames, devront se conformer un modle exprimental quilibr tel que chaque lot contienne des chantillons reprsentatifs de chaque groupe de dose. En cas de recours aux analyses morphomtriques ou strologiques, les tissus crbraux sont inclus dans un milieu appropri, simultanment pour toutes les doses, afin dviter les artefacts de rtrcissement associs un stockage prolong dans le fixateur. RAPPORT Rsultats 76. Les rsultats sont rapports individuellement et rsums sous forme de tableaux. Sil y a lieu, on prsentera les informations suivantes pour chaque groupe dessai et chaque gnration : nombre danimaux prsents au dbut de lessai, nombre danimaux dcds durant lessai ou euthanasis, moment du dcs ou de leuthanasie, nombre danimaux fertiles, nombre de femelles gravides, nombre de femelles donnant naissance une porte, et nombre danimaux manifestant des signes de toxicit. Le rapport contient aussi une description de la toxicit, y compris le moment dapparition des effets toxiques, leur dure et leur svrit. 77. On valuera les rsultats numriques laide dune mthode statistique approprie et accepte. Les mthodes statistiques font partie intgrante de la mthodologie de lessai et sont choisies comme telles ; elles traitent de faon pertinente les donnes non normales (par exemple les rsultats des numrations), les donnes tronques (par exemple en raison dun temps dobservation limit), la nonindpendance (par exemple les effets sur les portes et les mesures rptes) et les variances ingales. Les modles linaires gnraliss mixtes et les modles dose-effet couvrent un large ventail doutils danalyse qui peuvent convenir au traitement des rsultats dans le cadre de cette LD. Le rapport fournit suffisamment dinformations sur la mthode danalyse et le logiciel employs pour quun rviseur ou un statisticien indpendant puissent valuer/r-valuer lanalyse.

valuation des rsultats 78. Les rsultats sont valus en fonction des effets observs, notamment la ncropsie et lors des examens microscopiques. Lvaluation porte notamment sur la relation ou labsence de relation entre la dose et la prsence, la frquence et la gravit des anomalies, notamment des lsions macroscopiques. Elle porte aussi sur les organes cibles, la fertilit, les anomalies cliniques, la capacit reproductrice et les portes, les modifications du poids corporel, la mortalit et autres effets toxiques et affectant le dveloppement. Les modifications spcifiques chaque sexe font lobjet dune attention particulire. Les proprits physico-chimiques de la substance dessai et, le cas chant, les donnes toxicocintiques, y compris le transfert dans le placenta et lexcrtion dans le lait, sont prises en considration lors de lvaluation des rsultats. Rapport dessai

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79. Le rapport dessai comporte les informations numres ci-aprs, obtenues dans la prsente tude partir des animaux P, F1 et F2 (le cas chant) : Substance dessai : Toutes les informations pertinentes disponibles concernant la substance dessai et ses proprits toxicocintiques et toxicodynamiques ; Donnes didentification ; Puret. Vhicule (sil y a lieu) : Justification du choix du vhicule sil ne sagit pas deau. Animaux dessai : Espces/souches utilises ; Nombre, ge et sexe ; Source, conditions dencagement, rgime alimentaire, matriaux de nidification, etc. ; Poids de chaque animal au dbut de lessai ; Rsultats des frottis vaginaux des femelles P avant le dbut du traitement (si ces examens ont t pratiqus ce moment-l) ; Donnes sur laccouplement de la gnration P, prcisant les partenaires mles et femelles du couple, et le succs de laccouplement ; Porte dorigine des adultes de la gnration F1. Conditions dessai : Justification de la slection des doses appliques ; Dtails concernant la prparation de la substance dessai ou son incorporation aux aliments, ainsi que la concentration obtenue ; Stabilit et homognit de la prparation dans le vhicule ou le milieu dadministration (par exemple la nourriture, leau de boisson), dans le sang et/ou le lait, dans les conditions dutilisation et de stockage entre les utilisations ; Dtails sur ladministration de la substance dessai ; Conversion de la concentration de la substance dessai (ppm) dans la nourriture ou leau de boisson en dose administre (mg/kg de poids corporel/jour), sil y a lieu ; Dtails concernant la qualit des aliments et de leau (y compris la composition de la nourriture, si possible) ; Description dtaille des protocoles de randomisation utiliss pour slectionner les petits limins de la porte, et pour affecter les petits aux groupes dessai ; Conditions environnementales ; Liste du personnel impliqu dans ltude, mentionnant leur formation professionnelle. Rsultats (rcapitulatif et donnes individuelles par sexe et par dose) : Consommation de nourriture, consommation deau (si disponible), efficacit alimentaire (gain de poids corporel par gramme de nourriture consomm, sauf lors de la cohabitation et de lallaitement), et consommation de la substance dessai (en cas dadministration dans la nourriture/leau de boisson) pour les animaux P et F1 ; Donnes relatives labsorption (si disponibles) ; Poids corporel des animaux P ; Poids corporel des animaux F1 slectionns juste aprs le sevrage ; Temps de survie pendant ltude ou indication de la survie des animaux la fin de lexprience ; 20
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Nature, svrit et dure des signes cliniques (quils soient rversibles ou non) ; Rsultats des analyses hmatologique, durine et de chimie clinique, y compris dosage des TSH et T4 ; Analyse phnotypique des cellules splniques (lymphocytes T, B, cellules NK) ; Cellularit de la moelle osseuse ; Donnes sur les effets toxiques ; Nombre de femelles P et F1 prsentant une dure de cycle ou un cycle stral normal ou anormal ; Moment de la copulation (intervalle prcotal, soit nombre de jours entre laccouplement et la copulation) ; Effets toxiques ou autres sur la reproduction, y compris nombre et pourcentage danimaux qui ont copul, sont gravides, ont mis bas et allait, de mles dclenchant une gravidit, de femelles prsentant des signes de dystocie ou de mise-bas prolonge ou difficile ; Dure de la gestation et, lorsque cest possible, de la parturition ; Nombre dimplantations, taille de la porte et pourcentage de petits mles ; Nombre et pourcentage de pertes post-implantation, de naissances vivantes et de mort-ns ; Poids des portes et poids des petits (mles, femelles et poids global), nombre dindividus chtifs, sil est tabli ; Nombre de petits affects danomalies macroscopiques ; Effets toxiques ou autres sur la descendance, la croissance postnatale, la viabilit, etc. ; Repres physiques relevs sur les petits et autres donnes sur le dveloppement postnatal ; Informations relatives la maturit sexuelle des animaux F1 ; Observations fonctionnelles ralises selon les besoins sur les petits et les adultes ; Poids corporel au moment du sacrifice, et poids absolu et relatif des organes des adultes P et F1 ; Rsultats de la ncropsie ; Description dtaille de toutes les observations histopathologiques ; Nombre total de spermatozodes dans la queue de lpididyme, pourcentage de spermatozodes progressivement motiles, pourcentage de spermatozodes de morphologie normale, et pourcentage de spermatozodes correspondant chaque anomalie identifie pour les mles P et F1 ; Nombre et stades de maturation des follicules contenus dans les ovaires des femelles P et F1, le cas chant ; Numration des grands corps jaunes dans les ovaires des femelles F1 ; Traitement statistique des rsultats, le cas chant.

Paramtres de la cohorte 2 : Description dtaille des protocoles utiliss pour standardiser les observations et les protocoles, et dfinitions du mode opratoire de notation des observations ; Liste de tous les protocoles dessai utiliss, et justification de leur choix ; Prcisions sur les protocoles comportementaux/fonctionnels, neuropathologiques et morphomtriques utiliss, y compris informations et dtails concernant les appareils automatiss ; Protocoles dtalonnage et de vrification de lquivalence des appareils et de la rpartition quilibre des groupes de traitement dans les protocoles dessai ; Brve justification explicitant les ventuelles dcisions impliquant une apprciation professionnelle ; Description dtaille de toutes les observations comportementales/fonctionnelles, neuropathologiques et morphomtriques par sexe et par groupe de dose, y compris augmentations et diminutions par rapport aux tmoins ; Poids du cerveau ; 21
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Tout diagnostic, ralis sur la base de signes et de lsions neurologiques, y compris maladies ou affections dorigine naturelle ; Images dobservations reprsentatives ; Images faible grossissement permettant dvaluer lhomologie des coupes utilises pour la morphomtrie ; Traitement statistique des rsultats, notamment modles statistiques employs pour analyser les donnes, et rsultats, quils soient significatifs ou non ; Lien entre chaque effet toxique et la conclusion propose sur le potentiel neurotoxique du produit chimique de lessai, par sexe et par groupe de dose ; Rpercussions de toutes les informations toxicocintiques sur les conclusions ; Donnes dmontrant la fiabilit et la sensibilit de la mthode de lessai (cest--dire, rsultats des tmoins positifs et historiques) ; Relations ventuelles entre les effets neuropathologiques et fonctionnels ; CSENO ou dose de rfrence pour les mres et les petits, par sexe et groupe de dose ; Discussion sur linterprtation gnrale des donnes sur la base des rsultats, dont une conclusion indiquant si la substance chimique est responsable ou non dune neurotoxicit pour le dveloppement, et prcisant la CSENO.

Paramtres de la cohorte 3 : Concentration srique des anticorps IgM (sensibilisation avec GRM ou KLH), ou nombre de CFP dans la rate en rponse aux IgM (sensibilisation avec GRM) ; Confirmation de la performance de lessai de rponse anticorps dpendante des lymphocytes T dans le cadre du processus doptimisation par le laboratoire qui conduit lessai pour la premire fois, puis priodiquement (par exemple tous les ans) par lensemble des laboratoires ; Discussion sur linterprtation gnrale des donnes sur la base des rsultats, dont une conclusion indiquant si la substance chimique est responsable ou non dune immunotoxicit pour le dveloppement, et prcisant la CSENO. Discussion des rsultats Conclusions, y compris CSENO concernant les parents et les descendants. Toutes les informations ne rsultant pas de ltude mais utiles pour interprter les rsultats (par exemple, similitude des effets avec ceux dautres neurotoxiques connus), sont galement fournies. I NT E R PR T A T I ON DE S R SUL T A T S 80. Ltude tendue de toxicit pour la reproduction sur une gnration fournit des informations sur les effets de lexposition rpte une substance durant toutes les phases du cycle de reproduction, si besoin est. Elle livre notamment des informations sur lappareil reproducteur et sur divers paramtres dvaluation des effets sur le dveloppement, la croissance, la survie et les fonctions des descendants jusquau JPN 90. 81. Linterprtation des rsultats de cette tude tient compte de toutes les informations disponibles sur la substance, notamment ses proprits physico-chimiques, toxicocintiques et toxicodynamiques, les donnes pertinentes disponibles sur les analogues de structure et les rsultats des tudes de toxicit antrieures sur le mme produit (par exemple toxicit aigu, toxicit aprs application rpte, tudes mcanistiques et tudes visant reprer dventuelles diffrences qualitatives et quantitatives des proprits mtaboliques in vivo/in vitro dune espce une autre). Il convient, si possible, dinterprter les rsultats de la ncropsie macroscopique et de la pese des organes la lumire des observations effectues 22
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dans dautres tudes doses rptes. On pourra ventuellement expliquer le ralentissement de la croissance des descendants par une influence de la substance dessai sur la composition du lait (29). Cohorte 2 (neurotoxicit pour le dveloppement) 82. Les rsultats des valuations neurocomportementales et neuropathologiques sont interprts la lumire de tous les effets observs, selon une dmarche fonde sur le poids de la preuve et le jugement dexperts. Il convient dinclure dans la discussion les types deffets comportementaux ou morphologiques ventuellement observs, ainsi que les preuves dune relation dose-effet. Cette caractrisation devra englober lvaluation de la neurotoxicit pour le dveloppement, provenant notamment dtudes pidmiologiques sur lhomme ou de rapports dtudes de cas et dtudes animales exprimentales (par exemple donnes toxicocintiques, informations sur la relation structure-activit, donnes issues dautres tudes de toxicit). Lvaluation des rsultats comprendra une discussion analysant la signification biologique et la signification statistique. Elle inclura, le cas chant, la relation entre les altrations neuropathologiques et comportementales observes. Pour orienter linterprtation des rsultats relatifs la neurotoxicit pour le dveloppement, voir la LD 426 de lOCDE (35) et le document (31). Cohorte 3 (immunotoxicit pour le dveloppement) 83. La suppression ou la stimulation de la fonction immune value par lessai de rponse anticorps dpendant des lymphocytes T est interprte la lumire de lensemble des observations effectues. La signification des rsultats de cet essai pourrait tre appuye par dautres effets sur divers indicateurs associs aux facteurs immunologiques (comme la cellularit de la moelle osseuse, le poids et lhistopathologie des tissus lymphodes, la distribution des sous-populations lymphocytaires). Les effets mis en vidence par lessai de rponse anticorps dpendant des lymphocytes T sont susceptibles dtre moins significatifs quand dautres toxicits se manifestent des concentrations dexposition infrieures. 84. Pour linterprtation des rsultats des tudes de la toxicit pour la reproduction et de la neurotoxicit, il est recommand de consulter le document dorientation 43 de lOCDE (26).

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Appendice A Mesures et observations incluses dans la batterie dobservations fonctionnelles (cohorte 2)

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Cage dhbergement & plan Manipulation ouvert Posture Mouvements spasmodiques contractures involontaires Fermeture palpbrale Pilorection Salivation Larmoiement Vocalisations Cabrage Dmarche anormale veil Strotypie Comportement bizarre Taches Respiration anormale Facilit saisir et Facilit manipuler Tonicit musculaire Rponse lapproche Rponse au toucher Rponse auditive Rponse au pincement de la queue Rflexe de redressement talement du pied pos sur le sol Force de prhension des pattes antrieures Force de prhension des pattes postrieures

Physiologie

Temprature Poids corporel Rflexe pupillaire Taille de la pupille

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