11/02/2015

6.2.6- Phosphate de pyridoxal

Structure:

drive de la vit B6

= vit B6
CHO

CH2OH

CH2-NH2

CH2OH

CH2OH

CH2OH

OH

OH

OH

CH3

CH3

CH3

pyridoxine
Rle:

pyridoxal

pyridoxamine

Transport de groupement amin: NH2

Pyridoxal = vit B6

HO

CH2-NH2

CHO

- NH2

CH3

CH3
OH

OH

OH

OH

HO

CH3

CH3

Phosphate de pyridoxamine

Phosphate de pyridoxal

Mcanisme des ractions de

Dcarboxylation et de Transamination
1re tape
-Enzyme

Enzyme
Acide
amin

PLP

Enzyme-PLP

Amino-acid-PLP

Raction de dcarboxylation

CO2
Quininod intermdiaire

Amino-acid-PLP
PLP

Amine

H2

H2 O

11/02/2015

Raction de transamination
Raction globale

Transaminase
PLP
Acide amin

ctoglutarate

Acide
ctonique

Glutamate

Transamination: tape 1
Iminoacide

Fonction
amine

Acide
ctonique
Pyridoxamine P
(PMP)

Transamination: tape 2

(PMP)

ctoglutarate

Enzyme-PLP

Glutamate

11/02/2015

6.2.7-Raction de carboxylation: Carboxylases Biotine

Centre actif

Biotine

Exemple: ActylCoA Carboxylase

HCO3ATP

CH3-CO
SCoA

Pi
ADP

HOOC-CH2-CO
SCoA

Biotine

(ActylCoA)

Chapitre 2:

(MalonylCoA)

La cintique enzymatique

Objectifs:
Reconnatre la cintique dune enzyme
Reconnatre les facteurs qui influencent la cintique dune enzyme
Dfinir la vitesse maximale (Vmax) et la constante de Michaelis (KM)
Reprsenter graphiquement la cintique dune enzyme en fonction
des diffrentes variables

1- LORDRE DUNE REACTION

S

A- raction dordre 0
[S]

V
V=

-d[S]

=k

dt

[S]

B- raction dordre 1
[S]

V=

-d[S]
dt

= k[S]

[S]

11/02/2015

Calcul de la vitesse dune raction

K1

V = V de disparition de S (dapparition de P):

K1
K2

V =

d [ S ] d[ P]
= K1 [ S ]
=
dt
dt

V de lalle = V de disparition de S (apparition de P):V =

d [ S ] d[P] = K [ S ]
=
1
dt
dt

d[P ] d [ S ]
= K 2 [P ]
V de retour = V dapparition de S (disparition de P): V =
=
dt
dt

quilibre

Keq =

K1[S] = K2[P]

K1 [ P ]
=
K 2 [S ]

K1
A+B

K2

V de lalle= V de disparition de A et B (apparition de P ): V = K1[A][B]

V de retour= V dapparition de A et B (disparition de P): V = K2[P]
quilibre K1[A][B] = K2[P]

Keq=

K1
[P ]
=
K 2 [ A ][B]

K1
A +B

C+ D

K2

V de lalle= V de disparition de A et B (apparition de C et D): V=K1[A][B]

V de retour= V dapparition de A et B (disparition de C et D): V=K2[C][D]
K1[A][B] = K2[C][D]

Keq=

K1 [C][D]
=
K 2 [ A ][B ]

2- CINETIQUE DES REACTIONS ENZYMATIQUES

Ce qui est fondamental dans les ractions enzymatiques, cest la
combinaison E-S.
Aprs formation du complexe, le substrat est transform en produit et
lenzyme retrouve sa structure initiale.

S +E

K1
K2

ES

K3
K4

P +E

La V de la raction enzymatique est influence par:

[S], [E], temprature, pH, effecteurs.

11/02/2015

2.1- V de la raction en fonction de [S]

Ltude de la cintique enzymatique a t ralise essentiellement par
Michaelis et Menten en 1913.

2.1.1 Courbe de Michaelis-Menten

[E] fixe et faible
V

V=Vmax [E] =[ES]

Saturation de lenzyme
Ordre 0

Vmax

Courbe de Michaelis-Menten

Ordre 1
S

S
S

S S S
S

[S]

S
S

Interprtation de la courbe de MM

- Aux faibles conc de substrat, la vitesse de la raction est

proportionnelle la concentration du substrat (raction dordre 1)

- Lorsque la conc de S augmente, la vitesse augmente mais ne saccrot

plus dans les mmes proportions (raction dordre mixte)

- Aux fortes conc de S la vitesse devient constante, indpendante de

cette concentration (raction dordre 0): lenzyme est sature par son
substrat. Ce phnomne est particulier la cintique enzymatique.

1.1.2- Dtermination de lquation de Michaelis-Menten

K1

S+ E

K2

S +E
ES

K3

K1
K2

ES

K3
K4

P +E

ES (rapide)

V= f([S]) ?

Conditions initiales
[E] = concentration totale de lenzyme
[ES] = concentration du complexe Enz-Sub
[E]L = concentration de lenzyme libre

P + E (lente)

[E] = [E]L+ [ES]

[E]L= [E] - [ES]

V= K3[ES]
Vitesse de formation de [ES] =
Vitesse de disparition de [ES] =

d[ES]
= K1[E]L[S] = K1([E]-[ES])[S]
dt
- d[ES]
= K2[ES] + K3[ES] = [ES] (K2+K3)
dt

Etat stationnaire: V de formation de [ES] = V de disparition de [ES]

K1([E]-[ES])[S] = [ES] (K2+ K3)

11/02/2015

K1([E]-[ES])[S] = [ES] (K2+ K3)

([E]-[ES])[S]
[ES]

(K2+K3)
= KM
K1

[E][S] - [ES][S] = [ES] KM

[E] [S]
[ES] =

[ES](KM+[S]) = [E][S]
Or, V = K3[ES]

KM+[S]
[E] [S]

= K3

V=Vmax

[E]=[ES]

KM+[S]

Vmax = K3 [E]

V=

Vmax [S]
KM+[S]

V=

Equation de M-M

Vmax [S]
KM+[S]

Cas particulier
Si V=

Vmax
2
Vmax = Vmax [S]
2
KM+[S]

2[S] = KM +[S]

KM = [S]

Vmax

Vmax
2

KM

[S]

1.1.3- Signification de Vmax et de KM

Vmax est atteinte lorsque toute lenzyme est sature par le substrat
KM est la valeur de S pour laquelle la vitesse de la raction est Vmax/2
KM est une grandeur exprimentale qui peut varier avec la structure du
S, le pH, la temprature. Chaque enzyme a un KM caractristique pour un S
KM indique laffinit de lenzyme pour le S

KM

affinit

11/02/2015

1.1.4- Reprsentation de Linweaver et Burk

KM +[S]

KM

[S]

1 =
=
+
V
Vmax [S]
Vmax [S]
Vmax [S]

V=

Vmax [S]
KM+[S]

1
KM
1 + 1
=
V
Vmax [S] Vmax
Y =
a
x + b

1
V

KM/Vmax

1/Vmax
1
[S]

-1/KM

Cette reprsentation offre lavantage de permettre la dtermination plus

prcise de KM et Vmax. De plus, tant une droite, elle ncessite moins de
points exprimentaux.

1.2- Influence de la concentration en enzyme

V
V

E3
E2
E1

[S]

[E]

La vitesse dune raction est

proportionnelle la quantit
denzyme

1.3- Influence de la temprature

to optimale
Mouvement
des molcules

20

30

Dnaturation
de la protine

40

50

60

Temprature
C

11/02/2015

1.4- Influence du pH

cholinestrase

pepsine

La plupart des
enzymes

Le pH agit sur:

10

12

pH

Conformation de la protine
Association E-S
Action catalytique de lenzyme

1.5- Effet des effecteurs

Rle des effecteurs:
Physiologique: Rgulation du mtabolisme cellulaire
Biochimique: Permettre de mieux comprendre le mode daction des
enzymes
comptitive
rversibles
inhibiteurs

irrversibles

non comptitive
incomptitive

activateurs
effecteurs allostriques

1.5.1- Inhibiteurs
1.5.1.1- Inhibition rversible
1.5.1.1.1- Inhibition comptitive
Exerce par un compos dont la structure ressemble celle du S
E + S
E + I
KI =

K1
K2

ES

E + P

EI (Inactif)

[E] [I]
[EI]

[EI] =

[E] [I]
KI

[E] = [E]L + [ES] + [EI]

Vmax [S]
V =
KM(1+[I]/KI) + [S]

KM= KM(1+[I]/KI)

KM

11/02/2015

Vmax [S]
V =
KM(1+[I]/KI) + [S]

[I]
KM
1 + 1
(1+
)
[S]
Vmax
KI
Vmax

V
1/ V

Sans I
[I]

Vmax

[I]

Vmax/2
1/Vmax

-1/KM -1/KM -1/KM

[S]

KM KM KM

KM

1/[S]

affinit

Quand [S] augmente , leffet de linhibiteur disparat:

Linhibition comptitive est leve par un excs de substrat
Vmax nest pas modifie

Exemples:
La succinate dshydrognase
COOH

COOH

Succinate dshydrognase
CH2

CH

CH2

CH

FADH2

FAD

COOH

COOH

succinate

Fumarate
COOH

COOH

CH2

Inhibiteurs comptitifs de la
succinate dshydrognase

CH2

CO
COOH

COOH

malonate

oxaloactate

Inhibition par le produit de la raction

Glucose 6 phosphatase
Glucose 6P

+ H2O

glucose + H3PO4

Les amines quaternaires

sont des inhibiteurs comptitifs de la cholinestrase

CH3
CH3

N+

CH2

CH2

CO

CH3

actylcholinestrase
Choline + ac. actique

CH3

actylcholine
R1
R2

N+

R4

Amines quaternaires

R3

11/02/2015

Antimtaboliques
En sintroduisant dans lorganisme, ils donnent naissance des
composs anormaux et ralentissent certains mtabolismes.
fluorouracile
2-amino adnine

Action anti-cancreuse

La sulfamide

NH2

NH2

bactrie
N-ptridine +Ac. para
amino-benzoque + Glu

E
COOH

SO2-NH2

Ac. para aminobenzoque

Ac. folique

sulfamide
Action antibactrienne

X des bactries

1.5.1.1.2- Inhibition non comptitive

E + S
E + I
ES + I

ES
EI
ESI

+ P

inactifs

i
Cu2+, Ag2+

[E]= [E]L+ [ES] + [EI] + [ESI]

Vmax
V=

Vmax
[S]
1+ [I]/KI

KM + [S]

V
Vmax
Vmax a
Vmax b

KM
Vmax

(1+[I]/KI)

1
1
+
(1+[I]/KI)
[S]
Vmax
[i]

1/V
sans i

1/Vmax
1/Vmax
1/Vmax

[S]

1/[S]
-1/KM

Ce type dinhibition nest pas lev par un excs de substrat

KM est inchang, laffinit de E pour S nest donc pas affecte
Vmax est diminue par linhibiteur
Le type le plus courant de cette inhibition se produit avec des ractifs
capables de se combiner rversiblement avec les groupement SH des
radicaux Cys indispensables lactivit enzymatique comme les mtaux
lourds (Cu2+, Ag2+, Hg2+..)
Certaines enzymes par contre, ont besoin de certains ions comme Mg2+,
cet ion peut tre chlat par EDTA (thylne diamine ttra actique).

10

11/02/2015

1.5.1.1.3- Inhibition incomptitive

E

ES
+
I

E + S

l'inhibiteur ne se lie que sur ES

S

+P

Vmax
[S]
1+[I]/KI
V=
KM
+ [S]
1+[I]/KI

ESI
[E]= [E]L+ [ES] + [ESI]

1
1
1 = KM
(1+[I]/KI)
+
V
Vmax [S] Vmax

Vmax

sans I

Vmax

1/V

1/V max
1/Vmax

[S]

1/[S]

-1/KM -1/KM

Cet inhibiteur dplace leq, abaisse KM. Une partie de ES reste bloque
sous forme ESI, donc Vmax est diminue

Tableau rcapitulatif des inhibitions rversibles

KM

Vmax

Pente

Comptitive
Non comptitive
Incomptitive

1.5.1.2- Inhibition irrversible:

inactivation totale de lenzyme

1er exemple:
E-S-CH2-CONH2 + HI

E-SH + ICH2CONH2
E Cys liodoactamide

Complexe inactif

raction irrversible
2me

exemple: Diisopropyl fluorophosphate (DFP) : arme biologique

E - CH2
F
CH3

E-CH2OH +
E Ser

CH
CH3

DFP

CH

CH3

CH3

CH3

CH3

O
CH

CH

CH3

+ HF

CH3
O

raction irrversible
Complexe inactif

Ex. enzyme srine: actylcholinestrase

3me exemple: Acide cyanhydrique (HCN): Poison respiratoire
Forme un complexe stable avec le fer des cytochromes (enzymes
respiratoires cellulaires) et provoque leur inhibition

11

11/02/2015

1.5.2- Activateurs
1.5.2.1- Activation par protection de lenzyme
Des composs qui protgent les enzymes contre les oxydations
dans les enzymes Cys se comportent comme des activateurs
E-SH + SH-G
E Cys

E-S ------ SG + H2

Glutathion

1.5.2.2- Activation par les ions

Concerne les enzymes qui ncessitent des ions pour leur activit
Mg2+ est un activateur des kinases

Exemple:

1.5.2.3- Activation par action sur les subunits enzymatiques

Protine kinase
protine +

Protine-P +

ATP

ADP

Les protines kinases sont actives par lAMPc

Site actif Site de fixation de lactivateur

E inactive

AMPc

AMPc

Subunit
catalytique active

3- ENZYMES ET EFFECTEURS ALLOSTERIQUES

3.1- Cintique des E allostriques

3.1.1- V en fonction de [S]

Interprtation de la courbe des E allostriques
V

E michaelienne

- Les petites quantits de substrat

sont transformes lentement
- La vitesse augmente partir dun seuil

E allostrique
- Effet coopratif

[S]
Contrairement aux enzymes michaeliennes, les enzymes allostriques
nexercent leur action qu des concentrations en substrat leves

12

11/02/2015

ont une structure quaternaire, formes dun nombre pair de sous units.

S
i

1er

La fixation de S au
site entrane un changement
A
de conformation des autres sites, ce qui modifie
laffinit pour le S. On dit quil y a un effet coopratif.

En plus du site actif o se fixe le substrat, lenzyme possde un ou

plusieurs sites allostriques o peuvent se fixer des effecteurs
allostriques (activateurs ou inhibiteurs).
Ces effecteurs nont aucune analogie structurale avec le substrat.

2.2- Action des effecteurs allostriques

Ce sont des substances qui agissent comme activateurs ou inhibiteurs en
modifiant la conformation des sites de liaison au substrat, ce qui change
laffinit pour le substrat
Activateurs allostriques
Augmentent laffinit de lenzyme pour le substrat, lui permettant
dagir de faible concentration en substrat
inhibiteurs allostriques

Activateur

Comme les inhibiteurs non comptitifs

diminuent laffinit de lenzyme pour le
substrat
Inhibiteur

Vmax
2

KM(a)KM KM(I)

2.3- Model des E allostriques

S
S

[S]

Model de Monod Wyman et

Changeux (MWC)
1- possdent 2 sites: site actif et
des sites rgulateurs (activateur
et inhibiteur)

i
A

2- formes de plusieurs sous

units identiques (= protomres)
3- existent sous 2 tats en
quilibre: tat catalytique R et
tat inhib T

A ou S

i
Relch
Tendu
(actif)
(inactif)
transition allostrique

Allostrie
Autre forme

4- effet coopratif: du la prsence de plusieurs sous units (protomres)

la fixation dune molcule de S sur un protomre
dplace lquilibre vers la forme active

13

11/02/2015

2.4- Importance des enzymes allostriques

Ont un rle de rgulation trs important dans la cellule:
Permettent ladaptation du mtabolisme au besoin de la cellule
En gnral lenzyme allostrique catalyse la 1re raction, limitante
dune voie mtabolique
Son activit peut tre contrle par des activateurs ou inhibiteurs
appartenant cette voie mtabolique

E1

E2

E3

X
X= inhibiteur
allostrique

E allostrique
Inhibition feed back
ou retroinhibition

Les effecteurs allostriques ont une action spcifique sur les

enzymes allostrique, en se fixant sur leur sites allostriques

MECANISME DE LA REACTION ENZYMATIQUE

1- Chymotrypsine:
hydrolyse les peptides au niveau de la Tyr et de Phe
R-CO-NH-R + H2O

RCOOH

+ NH2-R

Le site actif :
His 57,

Asp 102

et Ser 195

1re tape: acylation

peptide
H

O
C

R'

R'

O(His 57)

CH2

O
N

(Asp102)
(His 57)

(Ser 195)

Enzyme

O- H

(Asp102)

CH2
(Ser 195)

Enzyme

acylchymotrypsine

14

11/02/2015

2me tape: dsacylation

O
C

H
N

H
O-

(Asp102)

CH2

(His 57)

(Asp102)

OH

O
-

CH2

(His 57)

(Ser 195)

(Ser 195)

Enzyme

Enzyme

acylchymotrypsine

2- Actylcholinestrase
enzyme

Site anionique His

NH Site estrasique

CH2

CH3

actylcholine

N+

CH3

CH2

CH2

OH CH2

CH3

Ser

CH3

un dplacement dlectron va
fragiliser la liaison ester et
provoquer sa rupture

HO

Tyr

H2O

CH3
CH3

N+

CH2

CH2

OH

CH3

HO

C
CH3

Ac. actique

choline

3- Transaminases
Permettent le transfert rversible du groupement
amine dun AA un acide ctonique.

Le coenzyme des transaminases est le phosphate de

pyridoxal
O H

C H

C HO
C H
O
P

15

11/02/2015

Site actif dune transaminase

OH CH3

OH CH3

HOOC

HOOC
N

CH NH2C HO
R

CH

H2O

CH2
O
P

CH2
O
P

Base de schiff
COOH

OH CH3

+ H2O

HOOC
C

C
O

OH CH3

NH2

CH2
O
P

CH2
O
P

Ac. ctonique

Phosphate de pyridoxamine

DOSAGE DES ENZYMES

La quantit denzyme peut tre mesure par son activit enzymatique
E
A + B
C
Pour dterminer lactivit enzymatique, il faut connatre:
1- la stchiomtrie de la raction
2- les besoins de lenzyme en cofacteurs
3- KM
4- le pH optimum de lenzyme
5- la gamme de temprature olenzyme est stable
6- une mthode analytique permettant la dtermination de la
concentration du substrat qui disparat ou du produit obtenu
1- Unit de lactivit enzymatique
Unit internationale (UI) = la quantit denzyme qui produit la transformation
dune micromole ( mole) de S par min 25oC
Le katal (kat) = la quantit denzyme transformant une mole de substrat
par sec
Activit spcifique = le nombre dUI par mg de la protine enzymatique

DO = [C] l

NAD+
(forme oxyde)

DO

NADH
(forme rduite)

260

AH2

+ NAD+

350

Longueur donde
(nm)

A + NADH + H+

16

11/02/2015

2- Intrt de dosage des enzymes

Le fonctionnement normal de lorganisme est le rsultat de laction
harmonieuse de tous les systmes enzymatiques
Dosage des enzymes dans les liquides biologiques et les tissus
rvle des variations pathologiques:
Phosphatase acide dans le srum
Transaminases dans le srum

Cancer de la prostate
Cytolyse hpatique (hpatite)

La prsence de certaines enzymes dans le srum est le signe dune

ncrose tissulaire
Mais dans certains cas la mme activit enzymatique peut tre due
des enzymes diffrentes selon leur origine tissulaire.
Cest le cas des isoenzymes
Llectrophorse des isoenzymes permet de localiser lorigine de la
ncrose

3- Les isoenzymes
Ce sont des enzymes qui ont la mme proprit catalytique mais qui
diffrent par leur proprits physicochimique. Les isoenzymes peuvent
diffrer dun tissu un autre.
LDH
Ac. pyruvique
Ex.: Lactate dshydrognase (LDH): Ac. lactique
LDH: 4 sous units de 2 types, H et M
Sparation par lectrophorse des 5 isoenzymes de la LDH

+
1
dpts Cur

Forme H (Cur)

5
Muscle
et foie

Forme M (muscle et foie)

Sous-units

Fractions

Rpartition tissulaire

H4

LDH1

20-30%

Cur, reins, hmaties,

cerveau

H3 M1

LDH2

25-35%

Cur, reins, hmaties,

cerveau

H2 M2

LDH3

20-30%

Plaquettes, tissus
lymphodes, noplasiques

H1 M3

LDH4

5-13%

Foie, muscles, tissus

noplasiques

M4

LDH5

2-11%

Foie, muscles, tissus

noplasiques, peau

17

11/02/2015

4- Les enzymopathies hrditaires:

Il sagit des dficits enzymatiques hrditaires
Dans certains cas le diagnostic peut se faire par ltude de
lactivit enzymatique sur leucocytes (qui est diminue)
Cest le cas des maladies de surcharge lysosomale
Pour dautres maladies on mesure le substrat qui est
accumul
Exs:

maladie

Albinisme:

Enzyme altre
Tyrosine hydroxylase

phnylctonurie: Phnylalanine hydroxylase

homocystinurie: Cystathionine syntshtae

18