TP Enzymo Et Structural PDF

From the SelectedWorks of Pr. Mamoudou H.
DICKO
January 2006
Travaux Pratiques de Biochimie Structurale et

d'Enzymologie
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UNIVERSITE DE OUAGADOUGOU
-------------------
Unit de Formation et de Recherche

en Sciences de la Vie et de la Terre
(U.F.R.S.V.T.)
-----------------
Centre de Recherche en Sciences Biologiques

Alimentaires et Nutritionnelles
(CRSBAN)
Anne 2006-2007
-----------------
Laboratoire de Biochimie
Emails: mdicko@univ-ouaga.bf
Mamoudou_dicko2004@yahoo.fr
Tel. +227 70272643
TRAVAUX PRATIQUES
BIOCHIMIE STRUCTURALE &
ENZYMOLOGIE
Licence de Biochimie
DUT- Contrle Qualit- IAA-2me Anne
Enseignant
Moniteurs
Pr. Mamoudou H. DICKO, MSc, DSc, PhD

Matre de Confrences en Biochimie et Biotechnologie
- Obam Luis Clment (Thse Biochimie)

- Karim Koudougou (Thse Biochimie)
- Bayili Romaric (DEA Biochimie)
- Abdoul-Latif Fatimatou (DEA Biochimie)
- Diabat Wilfrid (DESS-IAA)
Techniciens
Paul KAGANBEGA
Kabor Dieudonn
Traor Eugne
TP. Licence Biochimie, DUT-CQA-2me Anne, Pr. M. H. DICKO
2
AVANT PROPOS
Inutile de rappeler ici les exigences en matire de comportement au laboratoire, la conduite

tenir, les rgles dutilisation des appareils etc., car elles sont senses tre connues par un tudiant
de niveau Licence ou 2me Anne DUT-Contle de Qualit en Agroalimentaire.
Les objectifs globaux de ce TP sont de :

-
connatre les proprits chimiques et physiques des constituants de la matire vivante et les
mthodes de dosage;
tre capable d'utiliser les outils de base de la biochimie, de les manipuler correctement avec
exactitude et prcision et de prsenter des donnes sous forme de tableaux, de figures ou de
graphiques.
Le but de ce cours sera avant tout pratique. Il faut donner au futur biochimiste les moyens
thoriques de comprendre les techniques biochimiques utilises en laboratoire et dans l'industrie.
Le plus souvent, plusieurs techniques s'offrent au Biochimiste qui est amen faire un choix
selon les avantages et les inconvnients de chaque mthode et les proprits du matriel
tudier. Le gradu devra tre capable de justifier et de proposer ce choix en situant le problme
dans un contexte plus gnral. Il devra galement tre capable de comprendre et de proposer
l'intgration de plusieurs techniques en une stratgie.
Enfin, la Biochimie et l'instrumentation tant en perptuelle volution, le futur gradu devra tre
form pour apprendre apprendre.
Le plus souvent, le Biochimiste est amen faire un choix selon les avantages et les
inconvnients de plusieurs techniques et les proprits du matriel tudier. Enfin, l'tudiant
devra tre capable de faire un rapport concis sur le travail demand et les rsultats obtenus. Il
devra tre capable de discuter ses rsultats.
copyright , Droit dauteurs : aucune photocopie du document nest autorise sans laccord
crit des auteurs.
Pr. Mamoudou H. DICKO, PhD
SOMMAIRE
TP.
1.
DOSAGE
SPECTROPHOTOMETRIQUE
DE
LAMIDON
TOTAL,
LAMYLOSE ET LAMYLOPECTINE ................................................................. 4

TP. 2. DOSAGE SPECTROPHOTOMETRIQUE DES SUCRES TOTAUX ET DES
SUCRES REDUCTEURS......................................................................................... 7
TP. 3 COMPARAISON DES POUVOIRS ROTATOIRES DES MONO ET
POLYSACCHARIDES :
ETUDE
DE
LA
MUTAROTATION
DU
GLUCOSE ................................................................................................................ 9
TP. 3 COMPARAISON DES POUVOIRS ROTATOIRES DES MONO ET
POLYSACCHARIDES :
ETUDE
DE
LA
MUTAROTATION
DU
GLUCOSE .............................................................................................................. 10
TP. 4. ETUDE CINETIQUE DE LHYDROLYSE ENZYMATIQUE DE LAMIDON..... 13
TP. 5. COMPARAISON DU DOSAGE SPECTROPHOTOMETRIQUE DES
PROTEINES PAR LA METHODE DE BRADFORD/SEDMAK ET PAR LA
METHODE DE KJELDAHL................................................................................. 17
TP. 6. EXTRACTION ET CARACTERISATION DES LIPIDES ...................................... 21
TP. 7. ETUDE CINETIQUE DE LHYDROLYSE DES TRIGLYCERIDES PAR LA
LIPASE DE Pseudomonas Cepacia ........................................................................ 27
TP.
8.
FRACTIONNEMENT
DUN
HOMOGENAT
DE
PANCREAS
ET
CARACTERISATION DES FRACTIONS OBTENUES ..................................... 33

TP. 9. ETUDE CINETIQUE DE LA LIBERATION DES ACIDES GRAS PAR LA
LIPASE PANCREATIQUE A PARTIR DHUILE DARACHIDE .................... 31
TP 10. ELECTROPHORESE DES PROTEINES................................................................. 37
4
TP. 1. DOSAGE SPECTROPHOTOMETRIQUE DE LAMIDON TOTAL,
LAMYLOSE ET LAMYLOPECTINE
Principe
Lamidon (polysaccharides de rserve chez les vgtaux) est une macromolcule
constitue de deux polymres de D-glucose : Amylose et amylopectine (Figure 1). Lamylose est
constitu essentiellement dunits de D-glucoses unies entre elles par des liaisons de type
(14). Lamylopectine consiste essentiellement en units (14)-D-glucosidiques linaires
mais branche, par des liaisons de type (16)-D-glucosidiques tous les 24-30 units de
glucose. Lamylopectine contient plus de 106 rsidus de D-glucose , la rendant ainsi la
macromolcule biologique la plus volumineuse qui existe. La structure primaire de
lamylopectine est semblable celle du glycogne (polysaccharide de rserve chez les animaux)
mais le nombre de rsidus de D-glucose dans les ramifications est de lordre de 8 12 dans le
glycogne. En dautres termes le glycogne est plus ramifi que lamylopectine.
Liode (I2) interagit avec lamylose et lamylopectine pour donner une coloration
respectivement bleue et brune. Les spectres des complexes I2-amylose et I2-amylopectine sont
diffrents. De ce fait ces complexes ont des longueurs dondes maximales pour lamylose (max
= 630 nm) et lamylopectine (max = 548 nm) qui sont diffrentes. En plus lamylose absorbe
dans le proche visible tan disque lamylopectine ny absorbe pas (Figure 2). On peut donc
utiliser cette diffrence spectrale pour doser simultanment lamidon total, lamylose et
lamylopectine dans un matriel biologique. Dans cette manipulation on considrera que
labsorbance 580 nm est lie la fois lamylose et lamylopectine, par contre labsorbance
720 nm est lie essentiellement lamylose.
Matriels et ractifs
-
Bain marie
Spectrophotomtre UV-visible
Tubes essais
Centrifugeuse
Plaques chauffantes
Ractif de liode : 0.2 g de I2 dissous dans 100 ml de KI 2 % (w /v) dans 0.1 N HCl.
Amidon de pomme de terre
1 N KOH
1 N HCl
Mode opratoire
-
a. Courbe dtalonnage de lamidon standard
Disperser 0.5 g damidon dans 20 ml deau distille. Y ajouter 80 ml deau distille

bouillante. Agiter lgrement le mlange et continuer lbullition pendant 5 min sur une plaque
chauffante pour obtenir une solution damidon limpide. Refroidir le mlange et le complter un
volume de100 ml avec leau distille. Ceci constitue une solution stocke damidon 5 mg/ml. La
courbe dtalonnage est tablie selon le tableau ci-dessous :
5
Tableau 1. Etablissement de la courbe dtalonnage. N.B. Les mesures sont faites en triplet
Ractif /tube
T=0
(Blanc)
(5 0
T=1 T=2
T=3
T=4
T=5 T=6
T=7
T=8
T=9
T=10
Amidon
0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06
mg/ml) en ml
H2O (ml)
4.9
4.89 4.88 4.87 4.86 4.85 4.84
Ractif
I2/KI 0.1
0.1 0.1
0.1
0.1 0.1 0.1
(ml)
Calculer la conc
damidon
(mg/ml)
Dure
10 min avant les lectures des DOs
dincubation
DO1 (580 nm)
0.07
0.08
0.09
0.10
4.83
0.1
4.82
0.1
4.81
0.1
4.8
0.1
DO2 (720 nm)

Moy DO1
Moy DO2
- Tracer la courbe f([amidon]) = DO1, amidon total
Tracer la courbe f([amidon]) = DO, amylose sachant que la proportion damylose et
damylopectine dans lamidon de pomme de terre est respectivement de 20% et 80%.
-
b. Prparation de lchantillon analyser
Prendre 0.1 g de farine de matriel biologique bien broy ( = 0.5 mm) et y ajouter 5 ml
de 1 N KOH. Bien homogniser la solution la temprature ambiante et la neutraliser
ensuite avec 5 ml de 1 N HCl. Bien sassurer que la solution est neutre laide dun
papier pH. Mettre ensuite le mlange en bullition au bain-marie pendant 15 min.
Rajuster le volume du mlange 10 ml. Centrifuger le mlange et prendre le surnageant.
Filtrer au besoin le surnageant et lutiliser pour le dosage de lamidon.
-
C. Dosage de lamidon dans le matriel biologique. N.B. Les mesures sont faites en
triplet
Ractif /Echantillon
Echantillon
H2O
Ractif I2/KI
Dure dincubation
Moy DO (580 nm)
Moy DO (720 nm)
Blanc
Echantillon 1
0
0.05 ml
4.90 ml
4.85 ml
0.1 ml
0.1 ml
10 min avant les lectures des DOs
Echantillon 2
0.05 ml
4.85 ml
0.1 ml
A laide de ces mesures, calculer les proportions damidon total, damylose et damylopectine
dans les chantillons. Donner une conclusion.
A M Y LO S E
A M Y L O PE C T IN
Figure 1. A) structure linaire de lamylose ; B) Structure ramifie de lamylopectine
Figure 2
Rfrence. Jarvis, C. E. and Walker, J. R. L. (1993) Simultaneous, rapid, spectrophotometric

determination of total starch, amylose and amylopectin. J. Sci. Food Agric. 63 , 53-57
TP2. Dosage spectrophotomtrique des sucres totaux et des sucres rducteurs

Principe
En milieu acide et chaux, les liaisons glycosidiques des carbohydrates sont hydrolyses. Les
oses simples ainsi librs subissent une dshydrations intramolculaires pour des drivs
furfuraux (furfural ou hydroxymethyl furfural). La fonction aldhyde des furfuraux se condense
ainsi en milieux acides avec lhydroxyl dun compos phnolique (Figure 1) pour donner des
actals ou hmi-actals de couleur rougetre qui absorbent dans le visible (450-500 nm). Cette
mthode permet ainsi de doser tous les glucides totaux dun matriel biologique.
Les sucres rducteurs sont doss par une mthode colorimtrique avec le ractif lAcide 3,5Dinitrosalycilique (DNS). Cest une raction doxydo-rduction non stchiomtrique permettant
de quantifier les sucres rducteurs. Dans cette raction, la fonction aldhyde du sucre libre
(rducteur) est transforme en fonction carboxylique par le DNS (oxydant). Labsorbance du
DNS oxyd est lue 546 nm.
Matriels et ractifs
-
Bain marie
Tubes essais
Centrifugeuse
Plaques chauffantes
Solution de phnol : 5% (p/v) dans leau
Acide sulfurique 75%
Ractif au DNS
Solution A= 2g de DNS dispers dans 40 ml deau distille
Solution B. 3.2 g de NaOH dissout dans 30 ml deau
Les deux solutions A et B sont mlanges et on y ajoute 60 g de tartrate double de
sodium et de potassium. Dissolution du mlange peut ncessiter un lger
chauffage su une plaque chauffante. Aprs dissolution, le volume est ajust 100
ml avec leau.
Solution standard de maltose 0.05 mg /ml pour les sucres totaux
Solution de maltose 0.5 mg/ml pour les sucres rducteurs
Mode opratoire
-
a. Etablissement des courbes dtalonnage
Tableau 1. Courbe dtalonnage pour les sucres totaux :

Ractif /tube
T=0
T=1
T=2
T=3
(Blanc)
Maltose
(0.05
0
0.1
0.2
0.3
mg/ml)
H2O (ml)
0.5
0.4
0.3
0.2
Phnol (5%) (ml)
0.5
0.50
00.5
0.5
H2SO4
2ml
2ml
2ml
2ml
Incubation bain
15 min
marie bouillant
Incubation
lobscurit
15 min
T=4
T=5
0.4
0.5
0.1
0.5
2ml
0
0.5
2ml
8
Ractif /tube
Calcul
maltose
Moy A492
-
T=0
(Blanc)
T=1
T=2
T=3
T=4
T=5
conc.
Tracer la courbe A492 = f([maltose]); et donner lquation de la droite.
Tableau 2. Courbe dtalonnage pour les sucres rducteurs

Ractif /tube
T=0
(Blanc)
(0.5 0
T=1
T=2
T=3
T=4
T=5
Maltose
mg/ml)
H2O (ml)
0.5
Ractif
DNS 1
(ml)
Incubation bain 8 min
marie bouillant
Calcul
conc.
maltose
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.4
1
0.3
1
0.2
1
0.1
1
0
1
Moy A546O
-
Tracer la courbe f([maltose]) = A546 ; et donner lquation de la droite.
b. Prparation et dosage des chantillons analyser
1 g de farine dchantillon est dispers dans 10 ml de DMSO 25% (v/v) dans leau. Le
mlange est incub au bain marie bouillant pendant 15 min. 0.1 ml de ce mlange est
dilu dans 9.9 ml deau.
- Dosages des sucres totaux. A 0.5 ml de ce dernier, on ajoute 0.5 ml de phnol (5%).
Aprs homognisation, on ajoute 2 ml de H2SO4 (75%). Ce mlange est ensuite trait
comme prcdemment dcrit pour le standard. Faire lessai en triplicate.
- Dosage des sucres rducteurs. 0.1 ml de lchantillon pralablement dispers dans le
DMSO sont mlangs avec 0.4 ml deau distille. La solution est ensuite mlange avec 1
ml du ractif au DNS puis incub au bain comme prcdemment dcrit pour le standard.
Faire lessai en triplicate.
Calculer la proportion des sucres totaux et des sucres rducteurs dans lchantillon
Discuter les rsultats.
H2SO4
+ 3 H2O
a)
Furfural
D-Ribose
H2SO4
+ 3 H2O
b)
D-Glucose
5-Hydroxymethyl Furfural
Figure 1. a) Exemple de raction de dshydratation dun pentose tel que le D-ribose pour donner le
furfural
b) exemple de raction de dshydratation dun hexose tel que le D-Glucose pour donner
le 5-Hydroxymethyl furfural
c) Raction de condensation entre le furfural et une compos phnolique tel que le
phnol, lorcinol, le resorcinol.
Actals
colors
c)
Rfrences.
Sucres totaux : Fox, J. D. and Robyt, J. F. (1991) Miniaturization of three carbohydrate
analyses using a microsample plate reader. Analytical Biochemistry., 195, 93-96.
Sucres rducteurs: Miller, G. L. (1958) Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination
of reducing sugar. Analytical Chemistry. 31, 426-428.
10
TP. 3 Comparaison des pouvoirs rotatoires des mono et polysaccharides :

Etude de la mutarotation du glucose
Principe
Les carbohydrates sont des composs optiquement actifs, c'est--dire quils dvient la
lumire polarise. Cette dviation est due lexistence de plusieurs carbones asymtriques dans
les sucres. En solution, les sucres subissent la mutarotation lie la variation lente de la
configuration strochimique de leurs carbones asymtriques. Cette mutarotation peut induire
une augmentation ou diminution de langle de dviation selon les pouvoirs rotatoires spcifiques
des diffrents anomres. Le pouvoir rotatoire spcifique dune substance optiquement active se
calcule selon la formule :
[ ] =
LxC
[] = pouvoir rotatoire spcifique du compos

= angle de rotation observ au polarimtre
L = longueur du tube de polarimtre (dm)
C = concentration du compos en g/ml
Ractifs et appareils
-
Polarimtre
Solutions de sucres : glucose, mannose, arabinose, fructose, saccharose, raffinose,
amidon, quilibres dans leau.
Poudre de glucose
Mode opratoire
Le polarimtre utilis dans ce TP est le Ceti polaris (Figure 1).
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
Oculaire
Bouton de magnification
Analyseur ou bouton de contrle et de
focalisation
Bouton de focalisation de loculaire
Fentre de lecture des valeurs des angles
Compartiment contenant le tube du
polarimtre de longueur variable
Filtre de verre
Lampe de sodium (=589 nm)
Bouton de mise en marche
Figure 1. Description du polarimtre
11
Utilisation du polarimtre
Aprs avoir allum la lampe de sodium, attendre 10 min de chauffage. Introduire le tube
contenant leau distille et lire le blanc. Ajuster le bouton de focalisation dobservation pour
obtenir une image claire.
Mettre dans le tube du polarimtre une substance optiquement active (par exemple une solution
de sucre). Noter la longueur du tube.
Tourner le bouton de contrle jusqu ce que la plaque indique presque zro de tous les deux
cts (gauche et droite). On observe un cercle jaune/orange divis par une bande noire comme
suit :
Valeur de mesure <
Tourner lanalyseur la main jusqu ce que les trois parties du cercle aient la mme couleur
jauntre :
Valeur de mesure =
Lorsquon dpasse la valeur exacte de langle , on observe limage ci-dessous :
Valeur de mesure >
La valeur positive de langle est lue droite et la valeur ngative gauche. La valeur de
langle de rotation est lue comme suit :
- Lire la valeur obtenue partir des grandes graduations.
- Pour obtenir une meilleure prcision on divise un degr de rotation part 20 parties (petites
graduations). Maintenant on lit la valeur dcimale au point o le trait intrieur concide
avec un trait du cercle extrieur comme indiqu dans limage ci-dessous :
Comparer les angles de dviation des solutions de diffrents sucres pralablement prpars et
laisss en quilibres : glucose, mannose, arabinose, fructose, saccharose, raffinose, mlezitose,
amidon, etc. Calculer les concentrations des sucres en utilisant les valeurs de leurs pouvoirs
rotatoires spcifiques donnes dans la littrature.
12
Etude de la mutarotation du glucose

Dissoudre frachement 25 g de glucose dans 100 ml deau distille et lintroduire immdiatement
dans un tube de polarimtre de longueur de 2 dm. Lire la valeur de langle t=0, et ensuite toutes
les 5 min jusqu ltat dquilibre (si le temps impartit le permet !). On obtient le tableau
suivant :
Temps
0 5
(min)
observ
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
75
90
1. Calculer les pourcentages d et de -glucose prsents aprs 15 et 30 min dincubation.

2. Dterminer les constantes cintiques de la mutarotation k1 et k2 ainsi que la constante de
la mutarotation km. Donnes : [] glucose= +112.7, [] glucose = +18.7
3. A partir de cette tude pouvons-nous dterminer lanomre le plus stable ?
Valeurs des pouvoirs rotatoires spcifiques de quelque carbohydrates
Carbohydrate
D-ribose
L-arabinose
D-xylose
D-glucose
D-galactose
D-fructose
D-mannose
L-rhamonose
L-sorbose
Lactose
Maltose
Sucrose
Raffinose
Trehalose
Anomre
-23.1
+54.0
+92
+113.4
+144.0
-21.0*
+34.0
-7.7
+90.0
+168.0*
-
Mlange lquilibre
-23.7
+104.5
+19
+52.2
+80.5
-92.0
+14.6
+8.9
-4.4
+55.3
+16
+66.5
+105.2
+178.3
Anomre
+175.0
-20.*
+19
+52.0
-133.5
-17.0
+54.0*
+35
+118
-
*Valeurs calcules.
Rfrence :
Rendina G. (1971) Experimental in modern biochemistry. Ed. Saundres W. B. Company, New
York (USA). pp.133-161.
120
13
TP. 4 Etude cintique de lhydrolyse enzymatique de lamidon

Principe
Lamidon (polysaccharides de rserve chez les vgtaux) est une macromolcule
constitue de deux polymres de D-glucose : Amylose et amylopectine (Figure 1). Lamylose est
constitu essentiellement dunits de D-glucoses unies entre elles par des liaisons de type
(14). Lamylopectine consiste essentiellement en units (14)-D-glucosidiques linaires
mais branches, par des liaisons de type (16)-D-glucosidiques tous les 24-30 units de
glucose. Ces deux polymres peuvent tre hydrolyss par les amylases enzymes spcifiques des
liaisons (14)), les glucosidases, lamidon phosphorylases, la pullulanse, lamyloglucidase
etc.
Les amylases sont des hydrolases ; enzymes de la classe III dans la classification
internationale des enzymes (International Union of Pure and Applied Chemistry, IUPAC). Lamylase ou -(14)-D-glucane 4-glucanohydroase (EC. 3.2.1.1) est dorigine animale, vgtale
et microbienne. Elle est surtout abondante dans les grains de crales (bl, sorgho, mil, etc.) en
germination. La -amylase ou -(14) glucane maltohydroase (EC. 3.2.1.2) est surtout
rencontre dans les vgtaux et les microbes. Ces deux enzymes ont pour principal substrat
lamidon mais leur action est incomplte car elles ne peuvent pas hydrolyser les liaisons (16) prsentes dans lamylopectine.
Cette tude consiste extraire les amylases de la farine de sorgho germ (contenant la
fois des amylases et ), et ensuite tudier la cintique de lhydrolyse de cet amidon par ces
enzymes. Ltude cintique en fonction de la concentration en substrat nous permettra destimer
les paramtres cintiques (Km et Vm) des amylases du sorgho. En rappelle les amylases sont des
enzymes obissant la loi cintique de Michalis-Menten donne par lquation :
Vi =
Vm[ Eo]
Km + [ S ]
O Vi= vitesse initiale de la raction enzymatique ( t 0)

Vm, vitesses maximale de lenzyme
Km, constante de Michalis, correspondant la concentration en substrat laquelle
la vitesse atteint la moiti de la vitesse maximale
Le trac en double inverse de Lineweaver et Burk (trac en double inverse) nous permet
dobtenir lquation suivante :
1 Km 1
1
=
x
+
Vi Vm [ S ] Vm
Le trac 1/vi = f(1/[s]) donne une droite de pente Km/Vm et dordonne lorigine 1/Vm.
Liode (I2) interagit avec lamylose et lamylopectine pour donner une coloration respectivement
bleue et brune. Dans cette manipulation on considrera que labsorbance 580 nm est lie la
fois lamylose et lamylopectine. Lhydrolyse de lamidon par les amylases donne du
glucose, du maltose et des dextrines limites (rsidus doligosacchrides posssdant des
ramifications de type (16). Cela rsulte de ce fait de la dcoloration du milieu ractionnel,
e.g. une baisse de labsorbance 580 nm. En suivant (monitoring) la variation de labsorbance
580 nm, on peut effectivement dterminer les constantes cintiques apparentes globales des
amylases du sorgho.
Matriels et ractifs
Bain marie
14
-
Tubes essais
Centrifugeuse
Plaques chauffantes
Ractif de liode : 0.2 g de I2 dissous dans 100 ml de KI 2 % (w /v).
Amidon de pomme de terre
Solution tampon McIlvaine (50 mM phosphate/citrate pH 2 9).
Prparer une solution dacide citrique, 50 mM, pour un volume de 1 litre
Prparer une solution de Na2HPO4, 50 mM, pour un volume de 1 litre
Mode opratoire
a. Extraction des amylases du sorgho
Peser 1 g de farine de sorgho germe et les disperser dans 20 ml de tampon McIlvaine pH 6

contenant du CaCl2 2 mM.. Laisser sous agitation pendant 5 min. Centrifuger la solution et
prendre le surnageant comme extrait enzymatique. Cet extrait doit tre conserv au frais (4C).
-
b. Etude de la variation de vitesse initiale en fonction de la concentration en

substrat.
Disperser 0.1 g damidon dans 20 ml deau distille. Y ajouter 80 ml deau distille

bouillante. Agiter lgrement le mlange et continuer lbullition pendant 5 min sur une plaque
chauffante pour obtenir une solution damidon limpide. Refroidir le mlange et le complter un
volume de 100 ml avec leau distille. Ceci constitue une solution stocke damidon 1 mg/ml.
Tableau 1. Prparation
Ractif /tube
T=0
(Blanc)
(1 0
T=1
T=2
T=3
T=4
T=5
T=6
0.02
0.04
0.08
0.12
0.16
0.20
2.5
2.5
2.5
2.5
2.5
2.5
2.5
0.05
0.05
0.05
0.05
0.05
0.05
0.05
200 l
200 l
200 l
200 l
200 l
200 l
200 l
Amidon
mg/ml) en ml
Tampon Citrate
pH6 (ml)
Ractif
I2/KI
(ml)
Extrait
enzymatique
Prendre
les
DO580
nm
toutes les 10 s
t=0
idem
idem
idem
idem
idem
idem
t=10
t=20
t=30
t=-----t= 3 min
N.B. La solution enzymatique est additionne juste avant la lecture de la DO
Tracer la courbe f(A580) = f(t) pour chaque concentration en amidon, dterminer les
vitesses initiales pour chaque concentration en amidon.
Tracer la courbe Vi = f([amidon)]. Dduire si cette cintique est Michalienne ou non
Tracer la courbe 1/Vi = f(1/S) et calculer les paramtres cintiques Km et Vm.
Garder le mme blanc pour toutes mesures
15
-
c. Etude de lactivit enzymatique en fonction du pH
Ltude de lactivit enzymatique en fonction du pH se fera dans des tampons standard de type
McIlvaine (Journal of Biological Chemistry). Cette prparation se fera sur la base de lquation
dAnderson Hasselbalch :
pH = pK + log
[ Base]
[ Acide]
La prparation des solutions tampons se fera selon le tableau suivant :

Tableau 2. Prparation des tampons McIlvaine
Ractif
T1
T2
T3
T4
T5
T6
T7
T8
T9
50
mM 100
100 ml 100 ml 100 ml 100 ml 100 ml x
x
x
acide
ml
citrique
50
mM 0
x
x
x
x
x
100 ml 100 ml
100 ml
Na2HPO4
Volume x 2.3
3
4
5
5.5
6.5
7
8
9
pour obtenir
un dsir pH
Cette gamme de prparation nous permet dobtenir des solutions tampons de pH variant de 2.5
9. Conserver les solutions tampons au frais avant leur utilisation.
Tableau 3. Etude de lactivit en fonction du pH
Ractif /tube T=1
T=2 T=3 T=4
T=5 T=6
pH
pH3
pH4 pH5 pH5.5 pH6 pH6.5
Tampon
2.45
2.45 2.45 2.45
2.45 2.45
McIlvaine
(ml)
Amidon
(1 0
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
mg/ml) en ml
Ractif I2/KI 0.04

(ml)
Dure
dincubation
5DO580 nm
Extrait
enzymatique
0.04
200 l 200
l
0.04
0.04
0.04
0.04
T=7
pH7.0
2.45
T=8
pH8
2.45
T=8
pH9
2.45
0.2
0.2
0.2
0.04
0.04
0.04
200 l
200
l
200 l
Incubation 5 min
200
l
200 l 200
l
200 l
Prendre
les t=0
idem idem idem idem idem
idem
idem idem
DO580
nm t=10
toutes les 10 s t=20
3 min
Tracer la courbe f(A580) = f(t) pour chaque pH, et dterminer les vitesses initiales pour chaque
pH.
Tracer la courbe Vi = f(pH). Quel est le pH optimum des amylases du sorgho ? Tracer la
courbe dactivit relative (%) = f(pH), en considrant 100 % dactivit au pH optimum.
16
Reducing
end
Figure 1. Mode daction des principales enzymes impliques dans lhydrolyse de

lamidon.
Rfrences :
Dicko , M. H. et al. (1999) Purification and characterization of -amylase from C. pilosa.
Applied Microbiology and Biotechnology (Germany-USA). . 52, 802-805.
Dicko, M. H. et al. (2000) Extraction, partial purification and characterisation of -amylase from
G. klattianus. Bioresource Technology (England). 73, 183-185.
Dicko, M. H. et al. (2001) Polysacharide hydrolases from leaves of B. senegalensis. Applied
Biochemistry and Biotechnology (USA). 94, 225-241.
17
TP. 5. Comparaison du dosage spectrophotomtrique des protines par la

mthode de Bradford/Sedmak et par la mthode de Kjeldahl.
Principe
Le dosage des protines en solution par la mthode de Bradford est bas sur linteraction
en milieu acide, entre les protines et le Coomassie Brillant Bleu G250 (CBBG-250) dont la
structure est la suivante :
Tan disque le CBBG-250 seul a une longueur donde maximale 450 nm ; on obtient en
prsence des protines un dplacement du spectre vers le rouge (effet bathochrome) avec une
longueur donde maximale 620 nm. Dune manire gnrale le CBBG-250 ragit plus
spcifiquement avec les acides amins basiques (K, R, H) mais il interagit avec les autres acides
amins. De ce fait plus la concentration en protine est leve, plus labsorbance 450 nm
baisse, et labsorbance 620 nm augmente. Ainsi, le ratio de labsorbance 620 sur labsorbance
450 est fonction de la concentration protique.
A620
= f ([ protine )]
A450
Le trac de cette courbe nous donne une droite de la forme y = ax (si on soustrait le blanc) ou
une droite de la forme y = ax + b (sans soustraction du blanc).
Le dosage des protines par la mthode de Kjeldahl est bas sur la minralisation totale
de la matire biologique en milieu acide, suivie de la distillation de lazote sous forme
dammoniac. En effet, le matriel biologique est minralis dans lacide sulfurique concentr
(H2SO4) chaud (500-600C) pendant 5-10 heures en prsence du catalyseur de la digestion
(mlange de K2SO4, CuSO4 et slnium ; ce dernier est de moins en moins utilis cause de sa
toxicit). Le dosage de lazote seffectue selon les tapes suivantes :
Matriel biologique
Hydrolyse : H2SO4
Neutralisation : NaOH
NH4
NH4++ autres minraux
Distillation : B(OH)3
NH3
NH3B(OH)3
A la fin de la minralisation lazote se trouve sous la forme minrale [(NH4+)2, SO42-]. Afin
de pouvoir distiller lazote par entranement la vapeur deau, il faut dabord neutraliser lacide
sulfurique et transformer lazote sous dammoniac gazeux (NH3). Au cours de la distillation
18
lazote de lammoniac (Base de Lwis possdant un doublet lectronique) est entraner la
vapeur deau et pig dans lacide borique : B(OH)3 qui est un acide de Lwis (possdant une
orbitale vacante). Lammoniac est pig dans lacide borique travers une liaison dative :
NH3 B(OH)3, est ensuite titr avec une solution faible (0.1N) dacide sulfurique. La
quantification de lazote total permet dextrapoler pour estimer la quantit de protines. On
admet dune manire gnrale que :
la masse des protines vgtales = masse dazote x 6.25
la masse des protines animales = masse dazote x 5.75
Matriels et ractifs
Tubes essais , Centrifugeuse
Bleu de Coomassie G250
Acide sulfurique concentr
NaOH 10 N
Phnophtaline (1% dans lthanol)
Tablet de catalyse de minralisation : K2SO4+CuSO4
Acide perchlorique (HClO4)
Srum Albumine bovin
Acide borique (1.6 g /litre deau distile)
Modes Opratoires
a. Prparation du bleu de Coomassie.
La solution de CBBG-250 (Sigma nr. B-1131) est prpare une concentration de 0.06%
(p/v) dans une solution dacide perchlorique 3 % (p/v). La solution est laisse sous
agitation pendant 24 h, puis filtre. La solution est ajuste pour donner une DO de 1.3-1.5
450 nm, laide dune solution dacide perchlorique 3 % (p/v). Le ractif, stock labri de
la lumire, pourrait tre conserv pendant plus de 10 ans.
b. Prparation de la courbe dtalonnage pour le dosage des protines
La protine standard utilise pour le dosage des protines est le bovin serum albumin (BSA)
une concentration de 50 g/ml dans leau distille).
Tableau 1. Prparation de ltalon
Tube
blanc
1
2
3
4
BSA (50 g/ml) en
0
0.1
0.2
0.4
0.6
ml
Eau distille
1
0.9
0.8
0.6
0.4
Ractif au Bleu de
1
1
1
1
1
Coomassie
A620
A450
Aprs avoir ajout le ractif, les DOs sont lues dans les 2-5 min qui suivent.
Tracer la courbe :
A620
= f ([ protine )]
A450
5
0.8
6
1
0.2
1
0
1
19
c. Extraction des protines de lchantillon et dosage
- Solution dextraction : 7.5 g de Sodium Dodcyl Sulfate (SDS) sont mlangs 225 l de
-mercapto-thanol, le tout complter 500 ml avec leau.
La solution dchantillon est obtenue par dissolution de 5 g du matriel biologique dans 12.5 ml
de la solution dextraction. Cette solution est ensuite centrifuge 5 000 rpm pendant 5 min.
Aprs centrifugation, le surnageant recueilli. Filtrer le surnageant avec un papier filtre ou
dfaut un papier lotus, juste pou retenir les particules solides et diluer le surnageant 10 fois. Le
dosage seffectue comme suit :
Tableau : dosage de lchantillon :
Tube
blanc
1
2
Echantillon (ml)
0
0.1
0.1
Solution dextraction contenant
0.01
0
0
le DNS
Eau
0.990
0.9
0.9
Ractif au Bleu de Coomassie
1
1
1
A620
A450
- Calculer la concentration protique de lchantillon en vous basant sur
dtalonnage dj tablie.
- Pourquoi mettons dans le blanc le SDS dans les mmes proportions
chantillon ?
3
0.1
0
0.9
1
la courbe
que votre
d. Dosage des protines par la mthode de Kjeldahl
Dans un matras de Kjeldahl, sont introduits 0.2 g de farine, un tablet de catalyseur (1 g) et 10 ml

dacide sulfurique concentr. Le tout est minralis pendant 5-10 heures jusquobtention dune
solution limpide (verdtre). Le minralist est dilu avec 50 ml deau distille. A ce mlange, on
ajoute quelques gouttes de phnophtaline et de la soude 10 N, jusqu lobtention dune
coloration rose. Aprs cela, le matras est plac dans lappareil Kjeldahl pour la distillation. Le
distillat est recueilli dans 50 ml dacide borique contenant quelques gouttes dhlianthine et de
vert de bromocrsol. On effectue la distillation jusqu lobtention dun volume de distillat de
250-300 ml. Le distillat contenant lammoniac est titr en prsence de phnophtaline par lacide
sulfurique 0.1 N. La teneur en protine pour un matriel biologique vgtal est donne par
lquation :
(V 1 Vo) xNx14(0.001)
x6.25 x100
PE
Vo = Volume de H2SO4, ayant servi pour titrer le blanc
V1 : volume de H2SO4 utilis pour le titrage de lchantillon
N= normalit de lacide sulfurique
PE= masse de prise dessai de lchantillon
6.25= coefficient de conversion
14 = poids molculaire de lazote
Calculer la proportion de protine dans votre chantillon et comparer les rsultats avec la
mthode dextraction en phase liquide suivie du dosage spectrophotomtrique.
Commenter les rsultats. Selon vous quelle est la meilleure mthode ?
% protines =
Rfrences.
20
Bradford, M. (1976) A rapid and sensitive method for the quantization of microgram quantities
of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry (USA). 72,
248-254.
Sedmak, J. J. and Grossbeg, S. E (1977) A rapid, sensitive, and versatile assay for protein using
coomassie brilant blue G250. Analytical Biochemistry (USA). 79, 553-560.
Zor, T., and Selinger, Z. (1996) Linearization of the Bradford protein assay increases its
sensitivity: theoretical and experimental studies. Analytical Biochemistry. 236, 302-308.
Dicko et al. (2002) Zymography of monophenolase and diphenoloase activities of polyphenol
oxidase. Analytical Biochemistry (USA). 360, 336-339.
21
TP. 6. Extraction et caractrisation des lipides

I. Gnralits
Les lipides sont des substances naturelles, constituants des structures cellulaires tels que
les phospholipides, les glycolipides membranaires, lments de revtement (cires, cutines, etc. ),
les substances de rserve , sources d'nergie cellulaire. On les appelle couramment huiles,
graisses, beurres. La distinction entre graisses et huiles est purement arbitraire car base sur l'tat
physique temprature ambiante :
- huiles pour les liquides
- graisses pour les solides et les ptes.
Les huiles sont souvent liquides 15C, les beurres fondent 25C, les graisses fondent aux
tempratures comprises entre 35C et 40C et les suifs ou graisses animales fondent des
tempratures suprieures 40C.
On distingue habituellement :
-les lipides simples (acides gras, glycrides, crides)
- les lipides complexes (phospholipides, glycolipides).
La graisse: Substance lipidique onctueuse, fondant entre 25C et 50C,dorigine animale ou
vgtale. On parle de :
- suif (graisse des ruminants)
- Lard (graisse des porcines: porc, sanglier, rhinocros)
-saindoux (graisse fondue des porcins)
Elle est faite du tissu adipeux trs dvelopp chez certains animaux (porcins, ovins et
autres ruminants), oiseaux (dindes, oies, canards, autruches, etc.), carnassiers (lions, tigre,
panthre, lopards, etc,), homme (paume des mains, plante des pieds ), mammifres aquatiques
(baleines, phoques), poissons (morues., hlicoptres), reptiles (boas, pythons, etc.)
C'est la rserve lipidique mobilisable par l'intermdiaire du sang. C'est la source d'nergie
efficace, servant d'isolant dans les tissus sous-cutans et autour de certains organes.
La graisse est constitue d'esters d'acides gras et de glycrol. Les acides gras sont souvent saturs
(tri-starines surtout).
Le beurre de lait de mammifres reprsente 3 10% des matires grasses du lait. Sa
composition varie selon son origine (ruminant, rongeur, flin, quids, zbus, ovins caprins,
bovins etc.), Il est fait de 82 84% de triacyl-glycrols dont 1/3 d'oline, 4% de butyrine qui se
transforme en acide butyrique d' odeur dsagrable. Les teneurs en huile des laits de vache et de
la femme sont respectivement 3.7-5% et 3.7-10%. Les laits de brebis et chvres renferment
respectivement 6.7% et 4.1%.
La margarine reprsentant 83% de lipides est faite de mlange de triacyl glycrols.

LES GRAISSES DE LA VIANDE
Le taux des lipides est variable selon les espces.

-x < 5%. : poulet, cheval
5< x<100% : veau, lapin
-10 < x < 20% : mouton, buf
-20 < x< 30% porc, oie
22
Tableau. Composition en huile de quelques olagineux
Graine ou noix
Pomme cajou
Pomme cannelle
Thevetia (noix)
Coco (noix)
Huile de palmiste
Jatropha curcas
Karit
Orange (grain)
Pastque
Ricin
Gombo
Oseille
Teneur en lipides (%) Graine ou noix

43-50
Blighia
23
Mangue
57-60.6
Corossolier
50-60
Rnier
49
Pulpe palme
30-52
Baobad (grain)
40-50
Calcdrat
30
Ssame
20-40
Citron
45-55
Courge
17-20
Gmelina
17-20
Melon
Teneur en lipides
54
3.5-12.5
25
37
44
10-30
45-60
45-60
30-60
20-50
11
20-50
Classification des lipides

Les lipides se distinguent des autres composants de la matire vivante, tels les sucres
et les acides amins, par une insolubilit totale ou partielle dans leau. Cette proprit physicochimique particulire fait que lon parle de milieu htrogne quand on dcrit la prsence de
lipides dans un milieu aqueux. Par opposition aux composs hydrophiles et solubles dans leau,
les lipides sont des composs de nature hydrophobe, solubles dans les solvants organiques
tels lther, le chloroforme ou le benzne.
Small [Small, 1968] a propos une classification des lipides selon leur comportement en
prsence deau (voir Figure 1) base sur leurs proprits physicochimiques en phase aqueuse
et aux interfaces air / eau ou huile / eau :
- Les lipides non polaires, totalement insolubles dans leau et qui ne forment pas de films
monomolculaires. On trouve dans cette catgorie les hydrocarbures ramifis ou insaturs ainsi
que les composs terpniques (comme par exemple le carotne, le limonne, le graniol ou
encore le squalne).
- Les lipides polaires partiellement ou totalement solubles qui se subdivisent en trois classes :
Classe I : les triacylglycrols, diacylglycrols et le cholestrol qui ne prsentent pas le
phnomne de gonflement en prsence deau. Ils forment des films monomolculaires stables.
Ces lipides peuvent former une mulsion en milieu aqueux. Le processus dmulsification
augmente considrablement la surface de contact lipide-eau. In vivo, cette mulsification est
stabilise grce par exemple la prsence de phospholipides alimentaires.
Classe II : les phospholipides, monoacylglycrols et acides gras ioniss qui gonflent dans un
systme aqueux. Les phospholipides peuvent dans certaines conditions former les liposomes. Il
sagit de bicouches lipidiques closes, sphriques et concentriques, spares les unes des
autres par des couches deau (Figure 1). Ces structures sont galement appeles vsicules et
sont visibles au microscope lectronique [Bangham, 1964].
23
Classe III : les sels biliaires et lysophospholipides (phospholipides avec une seule chane acyl)
qui se prsentent dans leau sous forme de micelles ou de monomres. Lorsque la
concentration en lipides polaires de classe III excde la concentration micellaire critique (CMC),
ces lipides sorganisent de manire minimiser le contact entre leurs parties apolaires et le
milieu aqueux : ils forment alors des micelles (Figure 1). Les parties polaires sorientent la
priphrie, du ct de la phase aqueuse, et les parties hydrophobes sagrgent vers lintrieur.
Les micelles sont en quilibre dynamique, cest--dire quil existe des changes rapides des
molcules amphiphiles dune micelle lautre ainsi quavec les monomres prsents dans le
milieu aqueux.
Totalement insolubles dans l'eau

Ne forment pas de films monomolculaires
Lipides
non
polaires
Hydrocarbures paraffiniques et aromatiques,
carotne, cholestane, etc...
Lipides
polaires
Classe I
Classe II
Classe III
Forment des films

monomolculaires stables:
Triglycrides
Diglycrides
Cholestrol
Forment des films

monomolculaires stables:
Phospholipides
Monoglycrides
Acides gras ioniss
Forment des films

monomolculaires
instables:
Sels biliaires
Lysophospholipides
Ne prsentent pas le
phnomne de gonflement
Prsentent le phnomne de
gonflement
Prsent sous forme de

micelles et de monomres
Figure 1. Reprsentation schmatique du comportement des lipides en prsence deau et

linterface air/eau. Classification selon Small [Small, 1968 #6].
II. Principe de lextraction des lipides
Les lipides sont solubles chaud ou froid dans les solvants organiques tels que lther
de ptrole, lther-dithylique, lhexane, lactone, lthanol, le chloroforme, le mthanol, etc. En
pratique lhexane et lther de ptrole chaud sont les plus couramment utiliss. On utilise pour
cela un solvant reflux dans extracteur de type SOXHLET. Les vapeurs chaudes du solvant
traversent la mouture dans une cartouche, se condensent plus haut dans un rfrigrant et
retombent dans la cartouche contenant la mouture. Il y a alors macration et extraction des huiles
de la mouture.
Lorsque le solvant remplit la cartouche, il y a siphonnage et le solvant retombe dans le ballon
d'bullition. Le cycle continu jusqu' l' extraction complte de la matire grasse. Le solvant
contenu dans le ballon est alors satur des huiles extraites. Il suffit alors d'vaporer le solvant
24
laide dun appareil ROVAPOR pour recueillir les huiles et rcupr le solvant qui pourrait tre
rutilis plusieurs fois.
Matriels
- Extracteur Soxhlet (chauffe ballon et cartouche)
-Balance de prcision
-Broyeur de type waring blendor
- Dessiccateur
- Hexane (500 ml)
- Ssame ou Arachide
III. Protocole dextraction des lipides
La capacit de lhexane solubiliser est donc utilise pour les extraire au solvant
organique. La dtermination des matires grasses est faite dans cette manipe selon la mthode
d'extraction par le SOXHLET en utilisant l'hexane ou lther de ptrole comme solvant. Broyer
dans un waring blendor les graines de ssame jusqu' l'obtention d'une mouture trs fine et trs
homogne (= 0.3-0.5 mm). Peser avec prcision 50 g de la mouture en notant le poids exact
dans la cartouche qui suffira pour l'extraction. Placer alors la cartouche dans le Soxhlet en l'ayant
recouvert avec du coton ou avec un linge propre et sec. Peser le ballon qui servira recouvrir le
solvant et y introduire 500 ml hexane. Raliser alors le montage de l'apparei1 en suivant le
schma dcrit. Alimenter le rfrigrant avec le cryostat thermostat 0-4C. Avant de
commencer la manipulation, faites vrifier le montage par l'assistant. Brancher alors la prise du
chauffe -ballon et rgler la temprature 60C ( viter les surchauffes). Effectuer 4-6
siphonages. Dbrancher le chauffe-ballon. Arrter le cryostat. Dmonter lappareil (en prsence
de l'assistant). Chasser alors par distillation la majeure partie du solvant l'aide de l'vaporateur
rotatif (ROTAVAPOR) pour viter l'bullition de l'huile qui la longue pourrait modifier les
indices d'acidit. Le ballon contenant les lipides est plac l'tuve pendant 30 min 103C, puis
au dessiccateur pendant 30 min. Une srie de peses sont ralises, toujours aprs avoir sch le
ballon l'tuve puis au dessiccateur jusqu' l'obtention d'un poids constant. Le poids des lipides
est obtenu par la diffrence entre le poids final et le poids initial du ballon.
(P1-P0)
Teneur en matires grasses(%)=
X100
Prise d'essai
P0: poids du ballon vide

P1: poids du ballon contenant les lipides
IV. Dtermination des indices des huiles
IV. 1. Indice de saponification
Lindice de saponification dun corps gras est le poids de KOH exprim en milligramme
pour neutraliser les acides gras provenant de lhydrolyse de 1g de ce corps gras. A un poids
dtermin de ce corps graons on ajoute un volume connu et en excs de solution de titre de
potasse. Il y a saponification et les acides gras librs se combinent avec la potasse pour donner
un savon. En dosant la quantit de potasse non co,bine, on dduit celle qui a t absorbe par la
matire grasse.
25
Matriel : burette, elenmeyers
Ractifs : KOH 1N, Huile extraite lors de ce TP, huile darachide, phnolphtaline 1 % dans
lthanol, HCl 1 N.
Protocole
A :tmoin y a ajout 10 ml de KOH 1N
B : 1.5 g dhuile extraite + 10 ml KOH
C : 1.5 g dhuile extraite + 10 ml KOH
Mlanger les suspensions et les chauffer jusqu lbullition. A la fin de la saponification, ajouter
quelques gouttes de pp et doser avec HCl 1 N lexcs de potasse.
Indice de saponification
(Is)
=
56, 1 * t* (V0-Ve)
Prise d'essai (g)
Vo, volume vers pour le tmoin, Ve, volume vers pour lchantillon
IV. 2. Indice diode
Le principe est bas sur la fixation diode (I2) sur les doubles liaisons thylniques (>C=C<)
dun corps gras insatur. Lindice diode est dfini comme le poids diode exprim en gramme
qui est fix par 100 g du corps gras considr.
H
R C = C R + I2
R C -C R
Ractifs
Ractifs de WIJS : 5 g I2 dans 100 ml thanol, + 5 g de HgCl2dans 100 ml thanol ; on mlange
les deux solutions et les laisser reposer pdt 12 hrs
Chloroforme, ther ethylique ou CCl4, solution de Ki 25 %, solution de thiosulfate de sodium (

N2S2O3) 0.1 N, empois damidon 1 %.
Protocole
Lindice diode est dtermine comme suit : on ajoute un volume connu diode un poids
dtermin de matire grasse et on dose lexs diode par un dosage en retour laide dune
solution sature de thiosulfats de sodium. On en dduit par diffrence la quantit diode fixe sur
les lipides.
A. erlen tmoin : 2.5 ml de chloroforme (ou ether ou ClCl4) + 40 ml de ractif de Wijs agiter
B. 0.5 ml dhuile extraite durant le TP, 2.5 ml chloroforme, + 40 ml ractifs de Wijs, agite
C. 0.5 ml dhuile darachide, 2.5 ml chloroforme, + 40 ml ractifs de Wijs, agiter
Boucher les erlens et les mettre lobscurit pendant 1h30 min en agitant momentanment.
26
Ajouter 6 ml de solution diodure de potassium dans les erlens et agiter. Titrer par le thiosulfate
0.1 N liode prsent dans les erlens jusqu jaune claire. Ajouter quelques gouttes dempois
damidon comme agent color et titrer jusquau virage lincolore.
IV. 2. Indice dacide
Lindice dacide est le nombre de milligrammes de KOH ncessaire pour neutraliser

lacidit d1 gramme de corps gras ; cest la neutralisation des acides gras libres sans hydrolyser
les liaisons esters des glycrides.
Protocole :
Peser dans un erlen 5 g dhuile extraite lors du TP, dans lautre 5 g dhuile darachide. Ajouter
dans chaque erlen 10 ml dthanol et quelques gouttes de . Bien agiter et titrer la solution par
le KOH 0.1 N.
Question :
1. Calculer la teneur en huile de la matire vgtale que vous avez utilis.
2. Donner lquation de dtermination de lindice diode
3. Comparer les indices de saponification, dacidit et diode des corps gras.
27
TP. 7. Etude cintique de lhydrolyse des triglycrides par la lipase de

Pseudomonas Cepacia
Introduction
Les lipases ou triacylglycrol hydrolases [EC 3-1-1-3] font partie de la classe des
hydrolases desters carboxyliques. Elles hydrolysent les fonctions ester des triacylglycrols
longues chanes hydrocarbones, insolubles dans leau pour librer des acides gras (Figure 2).
Les lipases sont galement des catalyseurs trs utiliss dans de nombreux procds
biotechnologiques bass sur les ractions de synthse desters, dalcoolyse, dacidolyse et de
trans- et inter-estrifications.
Les lipases ont des origines varies : on les trouve dans le monde animal (organes
digestifs, tissu adipeux, systme vasculaire et lymphatique, lysosomes) aussi bien que dans le
monde vgtal (graines olagineuses) et microbien (bactries et champignons).
Figure 1. La lipase peut hydrolyser les liaisons carboxyl-ester dun triacylglycrol. On

reprsente lalcool secondaire vers la gauche et le glycrol est dit sn-glycrol (i.e. numrotation
strospcifique du glycrol). On numrote ensuite les carbones de haut en bas. Cette
reprsentation est applique pour dterminer les formes stroisomres des
(phospho)glycrides.
Spcificit des lipases

La spcificit daction des lipases par rapport aux triacylglycrols fait appel trois
notions diffrentes [Jensen, 1990 #1970]:
La typoslectivit ou spcificit par rapport un type dacide gras donn.
La rgioslectivit ou spcificit de position qui reprsente le pouvoir dhydrolyser

prfrentiellement les esters primaires (en position externe sn-1 ou sn-3) ou secondaires (en
position interne sn-2) des triacylglycrols (voir Figure 2).
Lnantioslectivit
cest--dire
la
capacit
dhydrolyser
prfrentiellement
un
nantiomre par rapport lautre dans le cas dune molcule chirale (par exemple des
triacylglycrols comportant trois acides gras diffrents). Dans le cas de molcules prochirales
(triacylglycerols comportant trois acides gras identiques), la stroslectivit reprsente la
28
capacit de discriminer un groupement strohtrotopique mais homomorphique par rapport
lautre (positions sn-1 versus sn-3).
Ainsi la lipase pancratique et la lipase de Rhizopus arrhizus sont rgioslectives pour
les fonctions esters primaires des triacylglycrols, alors que la lipase de Candida rugosa nest
pas rgioslective [Verger, 1976]. La lipase de Geotrichum candidum est typoslective
puisquelle hydrolyse des liaisons ester avec un acide gras contenant une insaturation cis-9 et
cela, quelle que soit leur position sur le glycrol [Charton, 1992 #5364]. Lhydrolyse de
groupements esters en position sn-2 est catalyse par trs peu denzymes et seule la lipase de
Candida antarctica a montr une prfrence nette pour cette position [Rogalska, 1993].
Principe de du dosage de lactivit lipolytique

Lactivit lipolytique est mesure quantitativement selon la mthode dcrite par [Kordel,
1991]. Cette activit est dose avec diffrents esters de p-nitrophnyle, hydrolyss en prsence
dune lipase en p-nitrophnol et lacide correspondant. La libration du p-nitrophnol se traduit
par lapparition dune coloration jaune dtecte 410 nm. Des mesures en cintique ont t
menes 40C dans un spectrophotomtre aux cuves thermostates (Shimadzu UV-1205). La
solution ractionnelle contient un volume dune solution A et 9 volumes dune solution B ; la
solution A correspondant au substrat 1 mM dans liso-propanol et la solution B tant une
solution de Tris-HCl 100 mM, pH 8, contenant 0,25% (w/v) de polyvinyle alcool (PVA). Ce
dernier compos permet la mise en mulsion du substrat et le maintien de la stabilit de cette
mulsion. La vitesse de raction est calcule partir de la pente de l'absorbance en fonction du
temps en utilisant un coefficient d'extinction molaire de 12 750 M-1 cm-1 pour le p-nitrophnol.
Cette valeur est dtermine partir de l'absorbance de solutions standard de p-nitrophnol
ralises dans la solution ractionnelle. Une unit enzymatique est la quantit d'enzyme
capable de librer une mole de p-nitrophnol par minute dans les conditions dcrites cidessus. Pour chaque chantillon, l'activit donne correspond la moyenne de trois mesures
d'activit.
410 nm
O
O
lipase
R
N+
Tris-HCl pH 8
R
N
2H
O-
O-
O-
ester de p-nitrophnyle
p-nitrophnolate
Mode opratoire:
Prparer les solutions suivantes:
Solution A. Tampon Tris-HCl pH 8, 50 mM contenant 0.44% (w/v) de Triton X-100, 0.073% de
gomme arabique (w/v)
Solution B. Dissoudre Paranitrophenyl palmitate (PNPC16) 5 mM dans de lisopropanol;
Solution A+B. Il faut journalire prparer la solution C du substrat en mlangeant 9 mL de la A
avec 1 mL de la solution B. Toutes les olutions sont conserves au frais (4C).
29
Solution E. Cest la sulution enzymatique: Dissoudre la lipase Amano de Pseudomonas
Cepacia dans 50 mM de tampon Tris-HCL pH 8, pour obtenir une concentration finale de 10
g/mL. Adjuster la concentration de lenzyme pour avoir une activit raisonnable.
Essai enzymatique :
Dans une cuve de spectro mettre 1 mL du substrat (solution A+B). Dmarrer la raction en y
ajoutant 0.1 mL de lenzyme et suivre lhydrolyse enzymatique en monitorant la libration du
paranitro-phnolate 410 nm 15 s dintervalle jusqu 5 min. Le blank est obtenu en
remplaant la solution enzymatique par de leau distille ou le tampon Tris-HCl. Tracer la
courbe A410 = f(temps). Dterminer les vitesses initiales en calculant les pentes des courbes.
Etude de la vitesse de la raction en fonction de la concentration enzyme.

Ractif /tube
Solution A+B
Tampon
Tris_HCL pH8
Extrait
enzymatique
Prendre
les
DO410
nm
toutes les 15 s
T=1
1 mL
90 L
T=2
1 mL
80 L
T=3
1 mL
70 L
T=4
1 mL
60 L
T=5
1 mL
50 L
T=6
1 mL
40 L
T=7
1 mL
20 L
T=8
1 mL
0 L
10 L
20 L
30 L
40 L
50 L
60 L
80 L
100 L
=0
idem
idem
idem
idem
idem
t=10
t=20
t=30
t=--t=
5
min
Tracer la courbe f(A410) = f(t) pour chaque concentration en enzyme, dterminer les
vitesses initiales pour chaque concentration en enzyme. Prparer un blanc pour chaque
concentration en substrat tout en remplaant lextrait enzymatique par le tampon
Tris_HCL.
Tracer la courbe Vi = f([enzyme)]. Dduire si lactivit est proportionnelle la
concentration en enzyme. Cette prparation enzymatique est-elle pure ou non ?
Etude de la variation de la vitesse initiale en fonction de la concentration en substrat.

Ractif /tube
Solution A
Solution B
Extrait
enzymatique
Prendre
les
DO410
nm
toutes les 15 s
T=1
990 L
10 L
100 L
T=2
980 L
20 L
100 L
=0
idem
t=10
t=20
t=30
t=--t=
5
min
T=3
970 L
30 L
100 L
T=4
960 L
40 L
100 L
T=5
950 L
50 L
100 L
T=6
940 L
60 L
100 L
idem
idem
idem
idem
T=7
920 L
80 L
100 L
T=8
900 L
100 L
100 L
30
Tracer la courbe f(A410) = f(t) pour chaque concentration en substrat, dterminer les
vitesses initiales pour chaque concentration en substrat.
Tracer la courbe Vi = f([PNP16)]. Dduire si cette cintique est Michalienne ou non
Tracer la courbe 1/Vi = f(1/S) et calculer les paramtres cintiques Km et Vm.
Prpare un blan pour chaque concentration en substrat tout en remplaant lextrait
enzymatique par le tampon Tris_HCL. Dterminer la constante catalytique (Kcat) de
lenzyme sachant que son PM est de 32 kDa tout en tenant compte de la concentration
protique de la solution enzymatique.
31
TP. 8. Etude cintique de la libration des acides gras par la lipase

pancratique partir dhuile darachide
Introduction
L'extrait pancratique contient plusieurs enzymes digestives, parmi lesquelles on note la

prsence de la lipase. La lipase est synthtise au niveau du pancras et dverse avec le suc
pancratique dans le duodnum o elle participe l'hydrolyse des glycrides alimentaires.
La lipase catalyse l'hydrolyse des esters du glycrol et d'acides gras chane longue. La lipase
est une exoenzyme attaquant les liaisons esters situes en position externe des triglycrides sans
toucher la position interne (ce sont les 2- mono glycrides qui sont absorbs par la paroi
intestinale et transforms en chylomicrons lymphatiques). Le substrat de la lipase n'est pas une
seule molcule, mais plutt un agrgat de molcules de lipides. Tandis que pour les enzymes
agissant sur des substrats en solution aqueuse, la vitesse enzymatique dpend de la concentration
du substrat, la vitesse de la lipase est lie directement la concentration de molcules de substrat
dans l'interface. La lipase pancratique est une glycoprotine poids molculaire de 45000 50000, contenant deux isoenzymes presque identiques. Dans la prsente manipe, vous tudierez
l'action de la lipase de porc ou de buf sur une mulsion huileuse. Les acides gras librs sont
ensuite doss par titrimtrie avec une base.
* Matriel
Etuve 40C, Bain marie bouillant, pH mtre, Eprouvette gradue de 50 ml, pipette de 10 ml par
binme, 1 erlen de 250 ml, 2 tubes essai, 1 petit bcher, 1biurette, 1 pipette de 10 ml, Agitateur
magntique, l erlen de 100 ml Entonnoir, Papier filtre
* Ractif
Poudre l'actone de pancras de porc ou de buf : prendre 50g de pancras d'un porc ou d'un
buf frachement tu dcouper en petits morceaux. Homogniser les morceaux dans un mixer
ou dans un broyeur en utilisant de l'actone froid (-20C) dont le volume reprsente le double du
poids du pancras ; ex: pour 5g de pancras 10 ml d'actone ). Filtrer la suspension l'aide d'un
papier filtre et laver le dpt retenu sur le filtre, avec successivement les solvants frais suivants:
-100 ml d'actone
-50 ml d'actone + 50 ml d'ther thylique
-100 ml d'ther thylique.
Scher le dpt du lavage avec du papier filtre, puis laisser scher l'air libre. Cette poudre
l'actone peut tre stocke basse temprature pendant longtemps (des mois) sans perte
d'activit lipasique.
CaCL25 mM
CaCL2 0,07 M (1,1 g /1 00 ml ) NaCL 3 M ( 34,8 g/200 ml)
Na-taurocholate 0,027 M ( 2,9 g/ 200 ml) Na-doxycholate Huile d'arachide, Na OH 10 mM
HCL 10 mM
Phnolphtaline 1% dans l'alcool.
* Manipulation
Peser en collaboration avec un autre binme, 1,5 g de poudre l'actone de pancras dans
un petit bcher. Y ajouter 40 ml de CaCL2 5 mM. Agiter pendant 15 min 4C, l'aide d'un
agitateur magntique et filtrer ensuite la solution. Doser les protines de cette solution avec la
mthode de Bradford/Sedmak comme dcrit au TP 6. Le filtrat alors obtenu est susceptible de
contenir la lipase pancratiqne, l'amylase pancratique le trypsinogne et la trypsine. Pour
l'obtention d'une mulsion huileuse, peser dans un erlen 2,5 g de Na-desoxycholate, y ajouter 50
ml d'eau permute. Aprs la dissolution du desoxycholate, ajouter: 5 ml d 'huile d'arachide, 10
ml NaCl 3 M, 5 ml CaCL2 0,075 M , 10 ml Na-taurocholate 0,027 M
32
Bien agiter et vrifier que le pH soit entre 7,5 et 8,0. Si ce n'est pas le cas, ajouter de l'HCL
10mM pour l'amener dans ce trajet. Placer l'erlen dans une tuve pralablement amene 38 C.
Laisser votre solution enzymatique incuber pendant 5 min 38 C avant de commencer la
raction. Pendant ce temps, numrotez 7 tubes essai.
A t = 0 ajouter 10 ml de la solution enzymatique dans l'erlen contenant l'mulsion huileuse. Bien
agiter, et prlever t = 5 min 10 ml de l'mulsion dans le tube essai n 1. Porter le tube au bainmarie immdiatement pendant 5 minutes. Refroidissez-le ensuite sous le robinet, transvaser le
contenu dans petit bcher, ajouter 1- 2 gouttes de phnolphtaline et titrer jusqu' au virage rouge
avec la soude 10 mM.
A t = 10 minutes prendre le deuxime chantillon, t = 25 mn le troisime et, ainsi de suite de
dix dix jusqu' 60 minutes. Le tmoin est t=0 est la solution huileuse + 10 ml CaCL2 5 mM.
* Questions
1. Calculer la quantit d'acides gras librs dans chaque tube en millimoles. Construire la courbe
reprsentative de la quantit d'acide libr en fonction du temps.
2. En dduire la vitesse de production d'acide, exprim en millimoles par minute par ml de
solution enzymatique
3. Calculer lactivit spcifique ( mol dacide gras librs/min/mg de protine) de lenzyme en
tenant
compte
de
la
concentration
protique
de
lextrait
actonique.
33
TP. 9. Fractionnement dun homognat de pancras et caractrisation des

fractions obtenues
Introduction et principe
Une cellule contient plusieurs structures complexes, comme le noyau, les mitochondries,
les appareils de Golgi, les peroxysomes, lysosomes, ribosomes, etc. etc... Tous ces organites sont
constitus de lipides, de protines et des polysaccharides; les acides nucliques ne sont
rencontrs que dans quelques organites seulement (noyau, ribosomes, mitochondries) . Il existe
plusieurs mthodes de fractionnement du matriel cellulaire. En suivant des procds diffrents,
on peut isoler soit des noyaux, soit des mitochondries, soit un autre organite. Un tel
fractionnement permet par exemple la localisation d'une certaine activit enzymatique ou la
dtermination de la composition de l'organite isol.
En appliquant des mthodes et techniques diffrentes, on peut purifier des enzymes, des lipides,
des saccharides ou des fragments d'acide nucliques, dans le but d'tudier leurs proprits in
vitro. De telles investigations ont beaucoup contribu la comprhension du fonctionnement des
cellules et des organismes vivants. Dans ce TP on utilisera la technique de fractionnement assez
gnrale pour sparer les constituants cellulaires, savoir la mthode de Schneider. Le tissu est
homognis par la destruction des cellules qui librent leur contenu. Lhomognat est ensuite
trait par l'acide trichloroactique, qui permet de sparer deux fractions, une soluble et l'autre
insoluble. La fraction TCA soluble contient des petites molcules contenues dans le cytoplasme,
comme les mono- et oligosaccharides, les acides amins, les peptides etc . La fraction TCAinsoluble contient essentiellement les protines, les acides nucliques, et les lipides. Les lipides
sont ensuite limins par une extraction l'alcool. On spare les acides nucliques des protines
par un traitement chaud avec le TCA, qui les solubilise en les dnaturant. Le culot rest
insoluble, est considr comme renfermant les protines totales de l'homognat .
Matriel
Balance, Broyeur , Une paire de ciseaux, Chronomtre, Centrifugeuse, Glacire, Bain marie
bouillant, Spectrophotomtre, tuve 70- 80C, Agitateur vortex par binme, 3 petits bchers, 1
erlen de 50 ou 100 ml, Entonnoir, Pice de tissu propre, Baguette de verre, Pipettes pasteur de 5
ml, Eprouvettes gradues de 50 ml et 25 ml, tubes de centrifugation , 13 tubes essai .
Ractifs
Pancras de porc ou de boeuf , Glace , Acide trichloroactique ( TCA) 5 % , Acide

trichloroactique (TCA) 10 %, Ethanol 96 % ou alcool 96 % / ther thylique I : I ( v/v) Na OH
IN, Ractif de Sedmak, Ractif la dyphnylamine (A prparer juste avant utilisation, ne se
conserve pas ) : Diphnylamilne 250 mg + Acide actique 25 mg + H2SO4 concentr 0,7 ml
(ajout aprs la dissolution complte des cristaux)
Srum albumine bovin, 25 g/ml pour utilisation comme protine standard.
34
Schmas du fractionnement
10 g de pancras + 90 ml H2O
Homognat de volume X
10 ml + 10 ml TCA 10% froid

(repeter)
Surnageant S1
contenant des petits
peptides et des sucres
Culot N1
Culot 1+ 16 ml alcool
96 (repeter)
Surnageant S2
contenant des lipides
Culot N2
Culot 2 + 10 ml TCA
5%, incuber 15 min
90C
Surnageant S3 contenant
des acides nucliques
Culot N3
contenant les
protines
Dissolution
dans du
NaOH 1 N
Protines en solution doser par le

ractif au Bleu de Coomassie G250
35
Manipulation
Fractionnement du pancras.
Mettre pralablement refroidir dans le rfrigrateur ou dans de la glace, 500 ml d'eau distille
ou permute, le TAC 5%, le TAC, 10%, erlens de 50 ou 100 ml et un entonnoir.
1. Homognisation
L 'homognisation du pancras du porc ou du buf sera ralise avec un broyeur de cuisine.
Peser en collaboration avec un autre binme dans un petit bcher, 10 g de pancras congel et
dcouper le tissu en petits morceaux dans le rcipient du broyeur en y ajoutant 90 ml d'eau
distille froide. Broyer le pancras sans le surchauffer le mlange. Complter ainsi 4 broyages
d'une minute. Filtrer 1homognat laide d'une pice de tissu propre en utilisant un entonnoir et
un erlen frais. Mesurer le volume obtenu aprs filtration. Garder l'homognat au froid.
2 .Prcipitation au TCA froid
Aprs agitation l'aide d'une baguette de verre, prlever 10 ml d'homognat avec une
pipette coulement rapide et les mettre dans un tube de centrifugation refroidi dans de la glace.
Ajouter, sous agitation 10 ml de TCA 10%; Laisser 10 min dans la glace en agitant de temps en
temps. Equilibrer votre tube contre celui d'un autre binme en y ajoutant quelques gouttes de
TCA 5%. Centrifuger les mlanges pendant 10 min 8000 rpm. Dcanter trs doucement les
surnageants dans un tube essai portant votre nom et ce qu'il contient et le conserver dans de la
glace. Si le culot n'est pas bien form, il faut enlever le surnageant par la pipette pasteur, en ayant
soin de ne pas perturber le culot. A l'aide d'une baguette de verre, remettre le culot en suspension
dans 8 ml de TCA 10% froid et effectuer une deuxime centrifugation pendant 8 min 8000 rpm
Ajouter les nouveaux surnageants aux prcdents. Cette fraction TCA soluble froid contient les
composantes cellulaires hydrosolubles tels que les amino-acides, petits peptides, oses simples et
oligosacchalides. Vous pourrez le vrifier par des tests caractristiques.
3. Extraction des lipides
Ajouter dans un tube contenant le culot 16 ml d'alcool 96% ou d'un mlange d'alcool
96%/ther thylique 1/1 (v/v). Remettre le culot en suspension et maintenir 10 minutes
temprature ambiante en agitant frquemment. Centrifuger 5 min 8000 tours / minute
Dcanter le surnageant qui a une coloration jaune dans un petit bcher pralablement tar.
Remettre le culot en suspension dans 16 ml dalcool ou alcool ther thylique, puis centrifuger
pendant 5 min 8000 rpm. Runir les surnageants. Aprs vaporation de l'alcool (ou alcool/ther
thylique) par chauffage dans l'tuve 70 C, vous vrifiez la prsence d'un rsidu lipidique au
fond du bcher. En admettant que tous les composs lipidiques sont extraits par cette technique,
donner la quantit de lipides par gramme de pancras.
4. Solubilisation des acides nucligues par TCA chaud
Reprendre le culot (protines + acide nucliques) par 6 ml de TCA 5% et le remettre en
suspension l'aide d'un agitateur. Verser le liquide dans un tube essai et rincer le tube de
centrifugation 2 fois avec 1 ml de TCA 5%. Portez cette suspension dans un bain-marie
thermostat 90C pendant 15 min en agitant frquemment. Refroidir sous courant d'eau froide,
transvasez dans le tube de centrifugation, et, ayant rinc le tube essai avec 1 ml de TCA 5%,
centrifuger pendant 8 min 8000 rpm. N'oubliez pas d'quilibrer les tubes de centrifugation !
36
Dcanter soigneusement le surnageant dans une prouvette de 20 ml et conservez-le. Remettre le
culot en suspension dans 10 ml de TAC 5% et centrifuger nouveau. Ajouter le surnageant
celui dans l'prouvette et noter le volume obtenu. Cette solution contient les acides nucliques.
5. Solubilisation et dosage des protines

Les culots, essentiellement protiques, sont remis en suspension dans 2 ml NaOH 1 N. Ajouter
18 ml deau. Agiter assez longtemps pour obtenir une bonne solubilisation, puis verser dans un
tube essai et le placer dans de la glace. Cette solution est dite contenir les protines totales .
Centrifuger la solution pour recueillir le surnageant et doser les protines par la mthode de
Bradford comme prcdemment fait au TP 6 en utilisant le srum albumine bovin comme
standard. Mlanger en duplicate 1 ml de la solution protique avec 1 ml du ractifs de Sekmak
(Bleu de Coomassie G250) et lire les DO 450 et 650 nm.
6. Mise en vidence des acides nucliques
Verser 10 ml de la solution contenant les acides nucliques dans un petit bcher et y ajouter l5
ml d'alcool froid. Ensuite enrouler les fils de l' ADN sur une baguette de verre, les transvaser
dans un tube essai contenant l ml d'eau, et y ajouter 4 ml de ractif la diphnylamine. Placer
le tube au bain-marie bouillant pendant 10 min et observer la coloration.
Question
1. Calculer la quantit de lipides par gramme de pancras.
2. Dterminer la concentration initiale de la solution inconnue de protine en l'exprimant en
mg/ml. Donner le poids des protines (%) dans le pancras.
3. Admettons que vous avez fait un dosage de l'ADN isol du pancras et vous avez trouv une
concentration de 0,05 mg/ml, Calculer la quantit d'ADN par gramme de pancras.
37
TP 10. Electrophorse des protines
I. Introduction
L'lectrophorse est une technique biochimique de sparation fonde sur le fait que des molcules portant
des charges lectriques migrent des vitesses diffrentes lorsqu'elles sont places dans un champ lectrique. Lide
dutiliser cette caractristique pour sparer des molcules remonte la fin du dix-neuvime sicle grce aux travaux
du biochimiste sudois Arne Tiselius (1902-1971), prix Nobel de chimie en 1948. Il a russit le premier sparer
par cette technique les protines contenues dans des liquides biologiques complexes comme le srum sanguin et le
lait. Aujourdhui, llectrophorse est devenue une technique de routine dans les laboratoires o on lutilise pour
sparer notamment les protines et les acides nucliques. Llectrophorse des protines peut tre ralise sur des
supports varis, notamment sur gel de polyacrylamide ou sur gel dagarose selon les informations recherches.
Principe de llectrophorse
Selon le principe de llectrostatique lorsquun ion de quantit de charge q est plac dans un champs lectrique E ,
une force F sexerce sur cet ion avec une intensit donne par lquation :
Flectrique = qE
Lion peut tre assimil une sphre de rayon r en mouvement dans un fluide de viscosit . De ce fait une force de
friction Ffriction soppose la force lectrique F. Par dfinition
Ffriction= 6rv
O v = vitesse de migration de lion, r = rayon de lion, = viscosit du milieu.
A lquilibre lion migre avec une vitesse constante de sorte que Flectrique = Ffriction
do
v=
qE
6 r
La mobilit lectrophortique est donne par lquation :
v
q
=
E
6 r
Cette quation nous montre que la mobilit lectrophortique est principalement fonction de la charge et de la taille
de lion. Cela est valable pour toutes les techniques dlectrophorse.
Les principales variantes de llectrophorse des protines sont les suivantes :
SDS-PAGE
L'une des variantes les plus rpandue de l'lctrophorse est la SDS-PAGE, utilise pour sparer les protines en
fonction de leur poids molculaire. Les protines sont dnatures par du S-dodecyl sulfate, molcule trs fortement
charge ngativement. Les charges ngatives du SDS noient compltement les charges propres de la protines qui
n'interviennent alors plus. La charge de l'ensemble molcule dnature/SDS (et donc sa vitesse de migration) dpend
alors uniquement de la longueur de la chane protique. S'il n'y avait pas le gel, toutes les protines ainsi traites
migreraient la mme vitesse. Mais la prsence du gel ralentit les grosses protines, elles se rpartiront le long du
trajet de migration en fonction de leur poids molculaire. C'est cette technique qui est mise en uvre dans les
automates d'analyse mdicale.
Sparation par le pH ou Electrophorse dIsolectrofocalisation (IEF)
Cette variante consiste imposer un pH prcis au gel de migration. Les molcules dont le pKa est gal au pH,
neutres, ne migreront pas, les molcules avec un pKa infrieur, charg ngativement migreront vers l'anode, les
autres vers la cathode. Une telle technique prsente l'inconvnient d'obliger de dposer l'chantillon au milieu du
gel, ce qui pose divers problme. Toutefois, un perfectionnement consiste utiliser un gel dont le pH varie d'une
extrmit l'autre. La molcule migrera alors le long du gel jusqu' ce que le pH local soit gal son pKa. Elle
deviendra alors neutre et arrtera de migrer. Les protines se rpartiront alors le long du gel en fonction de leur pKa.
Il est ici possible d'utiliser un gel vertical comme dcrit dans le principe. Lune des applications de cette technique
est son utilisation pour la technique de ZYMOGRAPHY qui consiste la dtection in-gel des enzymes. La
technique de zymography repose sur la raction spcifique in-gel de lenzyme avec son substrat. Lemplacement de
lenzyme sur le gel est dtect grce la rvlation des spots colors du produit.
38
Electrophorse bidimensionnelle
Le gel est un milieu solide qui peut tre manipul. Il est alors possible d'appliquer dessus successivement plusieurs
techniques d'lectrophorse pour obtenir des lectrophorses bidimensionnelles. L'chantillon est dpos dans un
seul puit et une premire variante est applique. Puis la migration acheve on bascule le gel d'un quart de tour et on
effectue une migration perpendiculaire la premire en utilisant une deuxime technique. Les molcules, spares
selon deux critres, se rpartissent donc dans un systme a deux coordonnes ce qui permet une meilleure rsolution
: si beaucoup de molcules ont un poids molculaire ou un pKa proche, les molcules ayant les deux paramtres en
commun sont rares. Avec cette variante, il est possible de travailler sur des extraits cellulaires complets.
II. Electrophorse sur gel de polyacrylamide en prsence du sodium dodcyl sulfate (SDS-PAGE)
Ce type d'lectrophorse peut tre ralis en utilisant des systmes tampons dissociant ou non dissociant, continus
ou non continus. L'agent dissociant le plus utilis est le dtergent anionique; Sodium Dodecyl Sulfate (SDS). Le
SDS de formule CH3-(CH2)11-S03-Na+, est le dtergent le plus utilis en lectrophorse. Il a trois fonctions: 1)
dissocier les protines agrges peu solubles ou hydrophobes 2), confrer une charge ngative toutes protines et
enfin 3) permettre une sparation des protines en fonction de leur gomtrie, masse molaire et forme. Il se fixe sur
les protines selon un rapport de masse relativement constant (1 ,4 g de SDS par g de polypeptide) et les transforme
en polyanions. La dissociation dnaturation intervient sous l'action combine des rducteurs des liaisons S-S tels que
le -mercaptothanol ou le dithiothreitol. La protine prend ainsi une forme allonge ("random coil"), dont la
longueur est proportionnelle la masse molculaire. La charge ngative permet la migration des protines vers
l'anode, mais les molcules sont spares uniquement par effet de tamis molculaire. Les marqueurs protiques de
faible poids molculaires suivants sont souvent utiliss pour estimer la masse molculaire des enzymes: aactalbumine (14,4 kDa), inhibiteur de la trypsine (20, 1 kDa), anhydrase carbonique (30 kDa), ovalbumine (43 kDa),
srum albumine bovin (67 kDa) et la phosphorylase b (94 kDa). La droite de calibration a t construite selon le
modle de Fergusson (Log(Mr) = a + b.Rf). La sparation se fait sur deux gels :
-
Un gel de concentration (stacking gel) et un gel de sparation (resolving gel).
L'utilisation en lectrophorse de gels de concentration et de sparation de concentrations en

polyacrylamide
non
convenable
peut
aboutir
2
situations
diffrentes
:
- Elimination des protines incapables de pntrer dans le gel, dans le cas des gels trs concentrs.Absence de sparation des protines de petite taille, migrant avec le front.Entre ces 2 extrmes, les
protines peuvent tre rsolues diffremment selon la concentration en polyacrylamide du gel de
sparation: En faisant varier la concentration d'acrylamide et methylne (bis acrylamide), on obtient des
mailles trs diffrentes par polymrisation.
Figure 1. Description de leffet de SDS et agents rducteurs tels que le -mercapto-thanol sur les
protines
39
Exemple de prparation des gels en fonction du poids molculaire des protines sparer
(Polyacrylamide) (%)
15-20
10-15
5-10
5
2-5
Poids molculaire (Kd)

10-40
40-100
100-300
-300-500
PM>500
acrylamide CH2=CH-CO-NH2 + mthylne bis acrylamide (CH2=CH-CONH)2CH
Mcanisme de la
formation du rseau
(Network) par
polymrisation de
lacrylamide en
prsence du
biscrylamide qui cre
les ponts.
40
Figure 2. Description du dispositif de la cuve dlectrophorse
Figure 2. Description du mcanisme de la mobilit des protines. Les petites molcules migrent plus
rapidement que les grosses molcules
41
Figure 3. Exemple dun gel dune lectrophorse verticale
III. Prparation dun gel SDS-PAGE

III.1. Matriel :
- Separating gel : gel de sparation

- Stacking gel : gel de concentration
- Butanol satur en H2O
- Running buffer 1X : tampon de migration
- Laemmli loading buffer : tampon dapplication
- -Mercaptoethanol
- Bleu de Coomassie R250
- Solution dcolorante
II.2 Solutions prparer:
Separating gel buffer (pour 100ml, garder temprature pice) :
18.17 g Tris-base, 2 ml SDS 20 % ; ajuster le pH 8.8 avec du HCl 12 N, complter le volume
100ml
Stacking gel buffer (pour 100ml, garder temprature pice) :
6.06 g Tris-base, 2 ml SDS 20%, ajuster le pH 6.8 avec du HCl 12 N, complter le volume
100 ml
Acrylamide (30%) bisacrylamide (0.8%) (pour 250ml, garder 4C) :
75 g acrylamide, 2 g bisacrylamide, complter le volume 250 ml
filtrer et garder 4C dans une bouteille brune ou papier daluminium
Eletrodes buffer : tampon des lectrodes 10X
25 mM Tris, 192 mM Glycine, 0.1% (w/v) SDS, pH 8.3. Ne pas adjuster le pH.
Stock 10X
-10 g SDS, 30 g Tris + 144 g Glycine, adjuster le volume 1000 ml.
Pour usage diluer 10 fois cette solution, c.a.d : 900 ml H2O + 100 ml stock
Stock sample buffer : Tampon de lchantillon
42
60 mM Tris-HCl, pH 6.8, 2% SDS, 10% glycerol, 0.025 % bromophenol blue
H20..4.8 ml
0.5 M Tris-HCl, pH 6.8.1.2 ml
10% SDS.2 ml
Glycerol..1 ml
0.5% Bromophenol blue (w/v)..0.5 ml
La solution SDS-reducing buffer est prpare journalirement en mlangeant 50 l de mercaptoethanol (SH-CH2-CH2OH) 950 l du stock samplebuffer. Eventuellement conserver
cette solution 30C.
*Lacrylamide et le bisacrylamide sont de puissants agents neurotoxiques, il
faut les peser avec un masque.
II.3. Montage dun gel SDS-PAGE
Separating gel
10%
H2O
62 ml
Acrylamide 30%/bis 0.8% 48 ml
Separating gel buffer
38 ml
APS 10 %
2.24 ml
TEMED
100 l
Volume total*
150.34 ml
*Effectuer les mlanges selon le volume dsir
12.5%
15%
50 ml
36 ml
60 ml
74 ml
38 ml
38 ml
2.24 ml
2.24 ml
100 l
100 l
150.34 ml
150.34 ml
en tenant compte du volume total.
Pour sealer le bas : 1ml + 14l APS 10% + 6l TEMED
Stacking gel
H2O 1 ml 20 ml
Acrylamide 30%/bis 0.8% : 3ml
Stacking gel buffer 4.44 mll
APS 10% 280 l
TEMED 50 l
Running buffer 10X (pour 1L) : diluer 10 fois dans leau distille avant utilisation.
10 g SDS
30 g Tris
144 g Glycine
ne pas ajuster le pH et filtrer.
Prparation de lchantillon
Prendre 100 l de la solution de lchantillon convenablement dilu et lajouter 100 l de

solution tampon de lchantillon sample buffer contenant du -mercaptothanol, dans un tube
Eppendorf. Si la solution lchantillon est trs concentre, dissoudre lchantillon laide du
sample buffer . Chauffer le tube au bain marie pendant 5 min. Centrifuger le tube et utiliser le
surnageant pour llectrophorse. Certains chantillons, notamment les extraits bruts contiennent
beaucoup de sels ou dautres petites molcules qui interfrent avec la migration. Pour cela, il est
43
ncessaire deffectuer une dialyse (Figure 3) afin de desalter lchantillon avant
llectrophorse.
Avant
quilibre
A lquilibre
Figure 3. Principe de la dialyse

Montage dun gel SDS-PAGE
Mthode:
1. Monter les vitres du gel laide du montage.
2. Prparer la solution de separating gel .
3. Sealer le bas du gel.
4. Couler le separating gel selon la concentration du gel dsir et garder le
restant de la solution dans le contenant pour voir quand la polymrisation
sera complte.
5. Rajouter un peu de butanol (satur en H2O) pour galiser le gel.
6. Laisser polymriser environ 45 min.
7. Enlever compltement le butanol.
8. Placer le peigne et couler le stacking gel.
9. Laisser polymriser au moins 10 min.
10. Enlever le peigne et monter les gels sur la cuve dlectrophorse pour la migration.
11.Ajouter du running buffer 1X entre le gel et le montage jusqu ce quil soit
rempli et en mettre dans le montage environ 2 cm.
NB. Si on utilise un seul gel, il faut mettre une vitre de lautre ct et le
remplir galement de running buffer.
12.Laver les puits avec le running buffer laide dune seringue.

13.Pour loader les chantillons, rajouter du Laemmli loading buffer (contenant 10% SDS et du 2-mercaptothanol) dans les chantillons pour avoir une concentration finale de loading buffer
de 1X.
14.Chauffer les chantillons 100 C pendant 5 min puis centrifuger les chantillons 30 sec
pleine vitesse.
15.Remettre les chantillons dans le bloc chauffant pour loader les chantillons.
Nota bene: Il faut loader la mme quantit dchantillon dans chaque puits.
44
16.Faire migrer le gel 200V, 150 mA et 100W pendant environ 45 min ou jusqu ce que le
bleu se rende au bas du gel.
17.Arrter la migration et dfaire le montage
18.Coloration du gel au Bleu de Coomassie: Mettre le gel dans un contenant avec du bleu de
Coomassie et laisser agiter pendant au moins 1h, le temps que le bleu pntre dans le gel.
19.Dcoloration du gel: Remettre la solution colorante dans le contenant initial, puis ajouter du
vieux
destaining et agiter un peu pour enlever lexcs de colorant.
Le jeter dans lvier puis remettre du destaining et laisser agiter jusqu ce que
les bandes apparaissent.
20. scanner les gels
IV. Diffrentes techniques de coloration et dcolorations :
IV. 1. Coloration au Bleu de Coomassie :
Aprs la migration lectrophortique, les gels sont tremps successivement dans les
solutions suivantes
a) Fixation des protines: acide trichloroactique 20 % (20 min, 20C). Etape non
ncessaire pour I'SDS-PAGE.
b) Lavage 1: mlange mthanol-acide actique-eau 30/10/60 ( 2 min, 20C) ou dfaut thanolacide actique-eau 30/10/60
c) Coloration: Bleu de Coomassie Brillant R250 0,1 % (p/v) dans un mlange mthanol- acide
actique-eau 40/10/50 (10 min, 50C). Du CUSO4 0,1 % (p/v) est additionn pour l'IEF.
d) Lavage 2: solution b. Trois fois pour I'SDS-PAGE et Native-PAGE, une fois pour l'IEF . e)
Prservation: glycrol 5% (5 min, 50C)
Coloration au nitrate d'argent (AgNO3)
Aprs la migration lectrophortique, les gels sont tremps successivement dans les solutions
suivantes:
a) Fixation des protines: acide trichloroactique 20 % (20 min, 20C). Pas ncessaire pour
I'SDS-PAGE.
b) Lavage 1. Mlange d'thanol-acide actique-eau millipore 50/10/40 (2 min, 50C)
c) Lavage 2. Mlange d'thanol-acide actique-eau millipore 10/10/80 (2-4 min, 50C). 2
trempages successifs. Etape non ncessaire pour I'SDS-PAGE
d) Sensibilisateur: glutardiadhyde 8,3 % dans l'eau millipore (6 min, 50C)
e) Lavage 3.2 trempages successifs de la solution b (3-5 min, 50C). Etape non ncessaire pour
I'SDS-PAGE
f) Lavage 4: eau millipore (2 min, 50C). 2 trempages successifs.
g) Coloration au nitrate d'argent: AgNO3 0,5% (p/v) pour l'IEF et Native-PAGE, 0,25% (p/v)
pour I'SDS-PAGE (10-13 min, 40C).
h) Lavage 5: eau millipore (0,5 min, 30C). 2 trempages successifs.
i)
ii)
Dveloppement: formaldhyde 0,015 % (v/v) dans du carbonate de sodium 2,5 % (p/v),

pendant 0,5 4 min, 30C.
j) Lavage 6: acide actique 5 % (2 min, 50C)
k) Prservation: mlange acide actique-glycrol-eau 10/5/85 ou 10/10/80 (3 min, 50C). Etape

non ncessaire pour l'IEF. Aprs rvlation, les gels sont photographis ou scanns, puis
45
conservs 4C au rfrigrateur dans des boites de ptris, contenant un mlange de glycrolacide actique-eau millipore 5/10/85.
Rfrences :
Laemmli, U. K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of
bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685
Garfing, D.E. ( 1990) One dimensional gel electrophoresis. Methods Enzymol. 182, 425-441.
Schaggerard, Hermann, and Gebhard von Jagow (1987) Tricine sodium dodecyl sulfate
polyacrylamide gel electrophoresis for the sparation of proteins in range from 1 to 100 kDa.
Anal Biochem. 166, 368-379.
DICKO, M. H., HILHORST, R., GRUPPEN, H., TRAORE, A. S., LAANE, C., van BERKEL, W. J.
H. and VORAGEN, A. G. J. (2002) Comparison of content in Phenolic compounds, polyphenol
oxidases and Peroxidases in grains of fifty sorghum varieties from Burkina Faso. Journal of
Agricultural and Food Chemistry (USA). 50, 3780-3788.
DICKO, M. H., HILHORST, R., GRUPPEN, H., LAANE, C., van BERKEL, W. J. H. and
VORAGEN, A. G. J. (2002) Zymography of momophenolase and o-diphenolase activities of
Polyphenol oxidase. Analytical Biochemistry (USA). 360, 336-339.
DICKO, M. H., GRUPPEN, H.; TRAORE, A. S.; van BERKEL, W. J. H. and VORAGEN, A. G. J. (2006). Effects of
germination on amylases and phenolics related enzymes in fifty sorghum varieties grouped according to food-end
use properties. J. Sci. Food Agric. (Sci, England). Vol. 86, 1-11. In press

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From the SelectedWorks of Pr. Mamoudou H.

Travaux Pratiques de Biochimie Structurale et

Start Your Own

Unit de Formation et de Recherche

Centre de Recherche en Sciences Biologiques

Pr. Mamoudou H. DICKO, MSc, DSc, PhD

- Obam Luis Clment (Thse Biochimie)

TP. Licence Biochimie, DUT-CQA-2me Anne, Pr. M. H. DICKO

Inutile de rappeler ici les exigences en matire de comportement au laboratoire, la conduite

Les objectifs globaux de ce TP sont de :

Pr. Mamoudou H. DICKO, PhD

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LAMYLOSE ET LAMYLOPECTINE ................................................................. 4

CARACTERISATION DES FRACTIONS OBTENUES ..................................... 33

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a. Courbe dtalonnage de lamidon standard

Disperser 0.5 g damidon dans 20 ml deau distille. Y ajouter 80 ml deau distille

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DO2 (720 nm)

b. Prparation de lchantillon analyser

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Rfrence. Jarvis, C. E. and Walker, J. R. L. (1993) Simultaneous, rapid, spectrophotometric

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TP2. Dosage spectrophotomtrique des sucres totaux et des sucres rducteurs

a. Etablissement des courbes dtalonnage

Tableau 1. Courbe dtalonnage pour les sucres totaux :

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Tracer la courbe A492 = f([maltose]); et donner lquation de la droite.

Tableau 2. Courbe dtalonnage pour les sucres rducteurs

Tracer la courbe f([maltose]) = A546 ; et donner lquation de la droite.

b. Prparation et dosage des chantillons analyser

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TP. 3 Comparaison des pouvoirs rotatoires des mono et polysaccharides :

[] = pouvoir rotatoire spcifique du compos

Figure 1. Description du polarimtre

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Lorsquon dpasse la valeur exacte de langle , on observe limage ci-dessous :

Valeur de mesure >

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Etude de la mutarotation du glucose

1. Calculer les pourcentages d et de -glucose prsents aprs 15 et 30 min dincubation.

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TP. 4 Etude cintique de lhydrolyse enzymatique de lamidon

O Vi= vitesse initiale de la raction enzymatique ( t 0)

a. Extraction des amylases du sorgho

Peser 1 g de farine de sorgho germe et les disperser dans 20 ml de tampon McIlvaine pH 6

b. Etude de la variation de vitesse initiale en fonction de la concentration en

Disperser 0.1 g damidon dans 20 ml deau distille. Y ajouter 80 ml deau distille

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c. Etude de lactivit enzymatique en fonction du pH

La prparation des solutions tampons se fera selon le tableau suivant :

Ractif I2/KI 0.04

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Figure 1. Mode daction des principales enzymes impliques dans lhydrolyse de

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TP. 5. Comparaison du dosage spectrophotomtrique des protines par la

NH4++ autres minraux

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d. Dosage des protines par la mthode de Kjeldahl

Dans un matras de Kjeldahl, sont introduits 0.2 g de farine, un tablet de catalyseur (1 g) et 10 ml

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