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Technologie de l’ ADN Recombinant
Amplifica<on
de
l’
ADN
par
PCR
Polymerase
Chain
Reac1on
• Problem:
Les
instruments
modernes
ne
peuvent
pas
detecter
facilement
des
molecules
d’ADN
lorsque’
elles
sont
presentent
en
pe1tes
quan1tées.
• Solu<on:
PCR
doubles
le
nombre
de
fragments
d’ADN
d’une
façon
itera1ve.
1…
2…
4…
8…
La PCR un procédé d’amplification
• La PCR.
• Abrévia1on
de
l’expression
anglaise
Polymerase
Chain
Reac1on
ou
Réac1on
en
Chaîne
par
Polymérase
• La
PCR
est
l’amplifica1on
enzyma1que
``In
vitro´´
d’une
séquence
nucléo1dique
donnée
(amplifiats).
• La découverte de PCR.
• Le
concept
technologique
a
été
découvert
par
Kary
Mullis
en
1983.
aujourd’hui,
la
méthode
est
devenue
l’une
des
techniques
de
bases
pour
ne
pas
dire
l’une
des
techniques
de
référence,
pour
un
large
spectre
d’applica1on
en
biologie
moléculaire.
PCR: "chercher une aiguille dans une
meule de foin" ?
• À
par1r
d’un
échan1llon
complexe
et
peu
abondant
(par
ex.
une
gouUe
de
sang),
la
PCR
permet
mul1plier
spécifiquement
le
segment
d'ADN
d'intérêt
(aussi
appelé
ADN
cible)
• L'ordre
de
grandeur
est
du
million
de
copies
en
quelques
heures.
(généralement
suffisant
pour
une
u1lisa1on
ultérieure).
PCR
Définition et principe général
• Il
s'agit
de
réaliser
une
succession
de
réac1ons
de
réplica1on
d'une
matrice
double
brin
d'ADN.
• Chaque
réac1on
met
en
oeuvre
deux
amorces
oligonucléo1diques
dont
les
extrémités
3’
pointent
l'une
vers
l'autre.
Les
amorces
ou
«primers»
en
anglais
définissent
alors,
en
la
bornant,
la
séquence
à
amplifier.
Quelques
• L'astuce
consiste
à
u1liser
les
produits
de
chaque
molécules
étape
de
synthèse
comme
matrices
pour
les
étapes
suivantes,
au
lieu
d'être
linéaire,
l'amplifica1on
PCR
obtenue
est
exponen1elle.
Quelques
Repeat.
La
quan1te
de
l’DNA
augmente
d’une
centaines
de
maniere
exponen1elle:
milliard
de
1→2→4→8→16→32→64→128→256…
molécules
PCR
Principe général
• Le principe de cette technique
fait appel à 3 éléments:
– Un ADN double brin chauffé au-
dessus d’une certain température
se sépare
Séquence cible
A cette température, les liaisons faibles qui assuraient la cohésion de la double
hélice d'ADN sont rompues pour donner deux simples brins d'ADN.
PCR: Principe et conditions
Hybridation (annelage)
• L'hybridation des amorces sur
l'ADN repose sur le principe de
l'appariement des bases
complémentaires.
U1lisa1on
d’ADN
polymérases
thermostables
PCR
1 2 3 4 5 6 7 8
111
4
900
692
501
404
320
242
Autre Types de PCR
Reverse Transcrip<on PCR (RT‐PCR)
• RT-PCR
– Utilisation d’une « reverse transcryptase » avant la
PCR. Elle permet de détecter cibles ARN (RNA virus,
RNA ribosomale, mRNA)
RT-PCR
Principe
Reverse
Transcrip<on
:
(La
reverse
transcrip1on)
• Certains
virus
à
ARN
appelés
rétrovirus
présente
un
sens
à
``l’envers``
de
la
circula1on
de
l’informa1on
géné1que,
grâce
à
une
enzyme
spécifique
nommé
reverse
transcriptase,
qui
transcrit
de
l’ADN
à
par1r
d’une
matrice
d’ARN.
L’ADN
nouvellement
formé
s’intègre
alors
sous
forme
de
provirus
dans
le
génome
de
la
cellule
infectée
par
ce
virus.
CeUe
enzyme
est
exploitée
en
biologie
moléculaire
dans
les
réac1ons
de
reverse
transcrip1on
suivie
de
PCR
(RT‐PCR).
ADN
ARN
transcription Reverse transcription
ARNm ADN
Protéines
La PCR conventionnel est
seulement semi quantitative
• La
PCR
en
temps
réel
(Real‐1me
PCR)
consiste
à
mesurer
la
quan1té
d’ADN
polymérisé
à
chaque
cycle
grâce
à
un
marqueur
fluorescent.
• Elle
permet
par
son
principe
de
faire
des
mesures
quan1ta1ves.
Le
nom
le
plus
communément
u1lisé
est
la
Q‐PCR
pour
Quan1ta1ve
PCR.
• Il
ne
faut
surtout
pas
la
confondre
avec
la
RT‐PCR
(Reverse
Transcrip8on
PCR)
La
PCR
en
temps
réel
Fonc<onnement
de
la
PCR
en
temps
réel
:
La
plupart
des
PCR
temps
réel
sont
basées
sur
la
mesure
d’émission
de
fluorescence
propor1onnelle
à
la
quan1té
de
gènes
amplifiés.
Plusieurs
techniques
existent
:
elles
u1lisent
•
soit
des
molécules
se
liant
à
l'ADN,
•
soit
des
sondes
moléculaires
spécifiques
de
la
cible
amplifiée.
27
La PCR en temps réel
les méthodes de détections
28
PCR
en
temps
réel
les
méthodes
de
détec<ons
Le
système
Taqman
La
méthode
de
TaqMan
est
basée
sur
l’ac1vité
5’‐3’
exonucléase
de
l’ADN
polymérase
qui
clive
une
sonde
doublement
marquée
hybridé
à
la
séquence
cible
pendant
l'amplifica1on
de
la
PCR.
Deux
marqueurs
sont
nécessaires
:
un
marqueur
R
(reporter)
émeUeur
de
fluorescence
et
un
marqueur
Q
(quencher)
qui
absorbe
ceUe
fluorescence
lorsque
R
et
Q
sont
proches.
Lorsque
Q
et
R
sont
séparés
par
hydrolyse
de
la
sonde
la
fluorescence
de
R
n’est
plus
absorbée.
La
mesure
de
la
fluorescence
est
donc
propor1onnelle
au
nombre
d'ADN
produits
par
la
PCR
29
PCR
en
temps
réel
Système
de
détec<on
PCR
en
temps
réel
PCR
en
temps
réel
versus
PCR
conven<onnelle
Avantages
de
la
PCR
en
temps
réel
Applications de la PCR
La
PCR
a
beaucoup
d’applica<ons:
• Applica1on
aux
études
épidémiologiques,
domaine
de
l’hygiène
hospitalière
– (recherche
de
pathogènes
dans
l’eau
ou
environnement)
• Diagnos<que
– Détec1on
d’organismes
non‐cul1vables,
fas1dieux
ou
de
croissance
lente
directement
sur
l’échan1llon
(Legionella,
Mycobacterium,
champignons…)
– Détec1on
d’organismes
présents
en
très
faible
quan1tés.
– dans
le
cas
ou
revêt
un
caractère
d’urgence
(méningite)
– Détec1on
de
virus
RNA
• Mesure
de
la
réponse
géné1que
(mRNA)
des
organismes
à
différents
s1mula1ons
• Recherche d’éléments géné1ques d’intérêt, variabilité et expression de gènes.
• Criminologie
• Test de paternité