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Cours
4


Technologie
de
l’
ADN
Recombinant


Amplifica<on
de
l’
ADN
par
PCR

Polymerase
Chain
Reac1on

•  Problem:
Les
instruments

modernes
ne
peuvent
pas

detecter
facilement
des

molecules
d’ADN
lorsque’

elles
sont
presentent
en

pe1tes
quan1tées.

•  Solu<on:
PCR
doubles
le

nombre
de
fragments
d’ADN

d’une
façon
itera1ve.




1…








2…







4…






8…

La PCR un procédé d’amplification

•  La
PCR.


•  Abrévia1on
de
l’expression
anglaise
Polymerase
Chain
Reac1on
ou

Réac1on
en
Chaîne
par
Polymérase


•  La
PCR
est
l’amplifica1on
enzyma1que
``In
vitro´´
d’une
séquence

nucléo1dique
donnée
(amplifiats).



•  La
découverte
de
PCR.


•  Le
concept
technologique
a
été
découvert
par
Kary
Mullis
en
1983.

aujourd’hui,
la
méthode
est
devenue
l’une
des
techniques
de
bases
pour

ne
pas
dire
l’une
des
techniques
de
référence,
pour
un
large
spectre

d’applica1on
en
biologie
moléculaire.

PCR: "chercher une aiguille dans une
meule de foin" ?

•  À
par1r
d’un
échan1llon
complexe
et

peu
abondant
(par
ex.
une
gouUe
de

sang),
la
PCR
permet
mul1plier

spécifiquement
le
segment
d'ADN

d'intérêt
(aussi
appelé
ADN
cible)


•  L'ordre
de
grandeur
est
du
million
de

copies
en
quelques
heures.

(généralement
suffisant
pour
une

u1lisa1on
ultérieure).


PCR
Définition et principe général

•  Il
s'agit
de
réaliser
une
succession
de
réac1ons
de

réplica1on
d'une
matrice
double
brin
d'ADN.



•  Chaque
réac1on
met
en
oeuvre
deux
amorces

oligonucléo1diques
dont
les
extrémités
3’
pointent

l'une
vers
l'autre.
Les
amorces
ou
«primers»
en

anglais
définissent
alors,
en
la
bornant,
la
séquence
à

amplifier.


Quelques

•  L'astuce
consiste
à
u1liser
les
produits
de
chaque
 molécules

étape
de
synthèse
comme
matrices
pour
les
étapes

suivantes,
au
lieu
d'être
linéaire,
l'amplifica1on
 PCR

obtenue
est
exponen1elle.

Quelques

Repeat.
La
quan1te
de
l’DNA
augmente
d’une
 centaines
de

maniere
exponen1elle:
 milliard
de

1→2→4→8→16→32→64→128→256…
 molécules

PCR
Principe général

•  Le principe de cette technique
fait appel à 3 éléments:
–  Un ADN double brin chauffé au-
dessus d’une certain température
se sépare

–  Après chauffage le refroidissement


permet une nouvelle hybridation
entre séquences complémentaires

–  Les ADN polymérases sont des


enzymes capables de recopier un
brin d’ADN en s’appuyant sur un
fragment complémentaire
préalablement hybridé
PCR: Principe et conditions
PCR réaction
Principe
de
la
PCR
:
La
réac1on
enzyma1que
PCR
nécessite.

•  _
Un
extrait
d’ADN.

•  _
l’enzyme
:
ADN
polymérase
(Ampli
Taq
de
la
bactérie

Thermus
aqua1cus).

•  _
Deux
amorces
(Primers).

•  _
dNTP
:
les
différentes
nucléo1des
(A,
T,
C
&
G).

•  _
Tampon
(Buffer)
qui
assure
un
PH
op1male
(8‐9)
ainsi

que
la
présence
d’ions
Mg²+
.

Taq DNA polymerase 


A thermophilic (heat-loving) bacteria called Thermus aquaticus


is the source of Taq DNA polymerase used in PCR reactions.
PCR: Principe et conditions
dénaturation
   

Séquence cible

  A cette température, les liaisons faibles qui assuraient la cohésion de la double
hélice d'ADN sont rompues pour donner deux simples brins d'ADN.
     
PCR: Principe et conditions
Hybridation (annelage)
• L'hybridation des amorces sur
l'ADN repose sur le principe de
l'appariement des bases
complémentaires.

• Le choix de la température


d'hybridation est calculée en
fonction de la longueur et de la
séquence des amorces.

• La température d'hybridation est


inférieure à la température de
dénaturation.
PCR: Principe et conditions
élongation
• Les amorces hybridées à l'ADN servent de point de départ à la polymérisation du
brin d'ADN complémentaire de l'ADN matrice.
• par ajout successif des désoxyribonucléotides (présents dans le mélange en
large excès). Chaque base ajoutée est complémentaire de la base
correspondante du brin matrice.
•  La copie de l'ADN initial génère des copies plus longues que souhaité.
La
PCR
(«
polymerase
chain
reac<on
»)
 =>
amplifica1on
d’ADN


U1lisa1on
d’ADN
polymérases
thermostables

PCR


• A chaque fois, la quantité d'ADN double dans le tube.


• De façon théorique, en partant de 2 brins d'ADN initiaux
• on obtiens 4 segments d'ADN à la fin du premier cycle
•  8 à la fin du second, 16 à la fin du troisième
• et jusqu'à 2 à la puissance n après n cycles ...
• soit plus d'un million de copies en une vingtaine de cycles !
2- La PCR un procédé d’amplification.
2- 5- Représentation de la quantité d’ADN double brin à différents
cycles d’amplification.
PCR
Amplifies
DNA
Exponen1ally

Détection et analyse du produit
de réaction
Analyse sur gel d’agarose

1 2 3 4 5 6 7 8

111
4
900
692
501
404
320
242
Autre Types de PCR

Reverse
Transcrip<on
PCR
(RT‐PCR)

•  RT-PCR
–  Utilisation d’une « reverse transcryptase » avant la
PCR. Elle permet de détecter cibles ARN (RNA virus,
RNA ribosomale, mRNA)
RT-PCR
Principe
Reverse
Transcrip<on
:
(La
reverse
transcrip1on)


•  Certains

virus
à
ARN
appelés
rétrovirus

présente
un
sens
à
``l’envers``
de

la
circula1on
de
l’informa1on
géné1que,
grâce
à
une
enzyme
spécifique

nommé
reverse
transcriptase,
qui
transcrit
de
l’ADN
à
par1r
d’une
matrice

d’ARN.
L’ADN
nouvellement
formé
s’intègre
alors
sous
forme
de
provirus

dans
le
génome
de
la
cellule
infectée
par
ce
virus.
CeUe
enzyme
est

exploitée
en
biologie
moléculaire
dans
les
réac1ons
de
reverse

transcrip1on
suivie
de
PCR
(RT‐PCR).



ADN
ARN
transcription Reverse transcription

ARNm ADN

Protéines
La PCR conventionnel est
seulement semi quantitative

La PCR conventionnel ne peut


pas être considéré une analyse
quantitative et les résultats sont
habituellement exprimés en termes
de positivité / négativité.
Une évaluation sémi-quantitative est
possible sur la base de l'aspect de
positivité (faible/forte) de bande
électrophorétique, mais cette
approche est fortement subjective et
la sensibilité est très basse.
Autre Types de PCR:

La PCR en temps réel



La PCR en temps réel

•  La
PCR
en
temps
réel
(Real‐1me
PCR)
consiste
à

mesurer
la
quan1té
d’ADN
polymérisé
à
chaque
cycle

grâce
à
un
marqueur
fluorescent.



•  Elle
permet
par
son
principe
de
faire
des
mesures

quan1ta1ves.
Le
nom
le
plus
communément
u1lisé

est
la
Q‐PCR
pour
Quan1ta1ve
PCR.


•  Il
ne
faut
surtout
pas
la
confondre
avec
la
RT‐PCR
(Reverse

Transcrip8on
PCR)

La
PCR
en
temps
réel

Fonc<onnement
de
la
PCR
en
temps
réel
:


La
plupart
des
PCR
temps
réel
sont
basées
sur
la

mesure
d’émission
de
fluorescence
propor1onnelle
à

la
quan1té
de
gènes
amplifiés.

Plusieurs
techniques
existent
:
elles
u1lisent


• 
soit
des
molécules
se
liant
à
l'ADN,


• 
soit
des
sondes
moléculaires
spécifiques
de
la
cible

amplifiée.


27

La PCR en temps réel
les méthodes de détections

Le SYBER Green est un colorant


luminescent se lie à l’ADN double brin
mais pas à l’ADN simple.

Utilisé pour contrôler la synthèse d’ADN


durant la réaction PCR en temps réel (RT-
PCR).

28

PCR
en
temps
réel

les
méthodes
de
détec<ons

Le
système
Taqman

La
méthode
de
TaqMan
est
basée
sur
l’ac1vité

5’‐3’
exonucléase
de
l’ADN
polymérase
qui
clive

une
sonde
doublement
marquée
hybridé
à
la

séquence
cible
pendant
l'amplifica1on
de
la
PCR.


Deux
marqueurs
sont
nécessaires
:
un
marqueur
R

(reporter)
émeUeur
de
fluorescence
et
un

marqueur
Q
(quencher)
qui
absorbe
ceUe

fluorescence
lorsque
R
et
Q
sont
proches.

Lorsque
Q
et
R
sont
séparés
par
hydrolyse
de
la

sonde
la
fluorescence
de
R
n’est
plus
absorbée.
La

mesure
de
la
fluorescence
est
donc

propor1onnelle
au
nombre
d'ADN
produits
par
la

PCR


29

PCR
en
temps
réel

Système
de
détec<on

PCR
en
temps
réel

PCR
en
temps
réel
versus
PCR
conven<onnelle


Avantages
de
la
PCR

en
temps
réel

Applications de la PCR
La
PCR
a
beaucoup
d’applica<ons:


•  Applica1on
aux
études
épidémiologiques,
domaine
de
l’hygiène
hospitalière


–  (recherche
de
pathogènes
dans
l’eau
ou
environnement)


•  Diagnos<que

–  Détec1on
d’organismes
non‐cul1vables,
fas1dieux
ou
de
croissance
lente

directement
sur
l’échan1llon
(Legionella,
Mycobacterium,
champignons…)

–  Détec1on
d’organismes
présents
en
très
faible
quan1tés.

–  dans
le
cas
ou
revêt
un
caractère
d’urgence
(méningite)

–  Détec1on
de
virus
RNA


•  Mesure
de
la
réponse
géné1que
(mRNA)
des
organismes
à
différents

s1mula1ons


•  Recherche
d’éléments
géné1ques
d’intérêt,
variabilité
et
expression
de
gènes.


•  Criminologie


•  Test
de
paternité