CARACTERISATION DU GENE DE LA GLUCOKINASE HEPATIQUE CHEZ LE POULET ET LE

CANARD

Berradi Hanaâ1, Cassy Sandrine1, Taouis Mohammed2, Rideau Nicole1

1
INRA, Station de Recherches Avicoles, 37380 Nouzilly
2
INRA, Laboratoire de Biologie Cellulaire et Moléculaire, 78352 Jouy-en-Josas

Résumé

Pour être utilisé par la cellule, le glucose doit être phosphorylé en glucose-6-phosphate (G6P). Dans le foie et le
pancréas, cette réaction est catalysée par l’hexokinase-D (ou plus communément glucokinase, GK), enzyme clé
de l’équilibre glucidique. A l’heure actuelle, la présence de GK chez les oiseaux est controversée, pourtant elle
pourrait expliquer certaines particularités de leur métabolisme énergétique ainsi que l’engraissement excessif de
certaines souches de poulet ou de canards. Le travail présenté concerne la mise en évidence d’une GK hépatique
aviaire. Par RT-PCR sur des ARN de foie de poulet et de canard, nous avons obtenu un cDNA partiel dont la
séquence est apparentée au fragment de gène correspondant à la GK de mammifère. Par ailleurs, un Western blot
réalisé avec un anticorps dirigé contre la GK humaine confirme la présence d’une protéine de type GK dans les
foies de poulet et de canard. La poursuite de la caractérisation de cet enzyme et l’étude de sa régulation
permettront de mieux comprendre la régulation du métabolisme glucidique aviaire.

Introduction

L’amidon apporté par les céréales couvre environ 50
pour cent des besoins énergétiques des volailles. Les
molécules de glucose libérées dans le tube digestif au
cours de la digestion de l’amidon sont transférées au
foie pour être utilisées et/ou stockées sous forme de
glycogène ou d’acide gras. L’utilisation hépatique du
glucose est soumise à une régulation très fine mettant
en jeu non seulement les hormones pancréatiques
(insuline et glucagon) mais encore l’équipement
enzymatique présent au niveau du pancréas et du foie.
Dans un rapport précédent, nous avons montré à
l’aide d’exemples observés dans différentes situations
d’élevage, comment l’insuline intervient dans
l’orientation du métabolisme, dans la croissance et
dans la composition corporelle des poulets (Rideau,
1997). Dans ce travail, nous nous intéressons à une
enzyme intracellulaire particulière, la glucokinase :
des travaux récents réalisés chez les mammifères
mettent en lumière son rôle fondamental dans la
régulation de l’homéostasie glucidique (Girard et al.,
1997, Kahn, 1998).
La glucokinase est la première enzyme impliquée
dans la transformation du glucose (en glucose-6-
phosphate, G6P) au niveau du foie et du pancréas. Sa
présence en quantité limitée dans les deux tissus en
fait un élément clé contrôlant l’utilisation du glucose.
En effet, dans le foie, la glucokinase sensible aux
variations de la glycémie et aux conditions
nutritionnelles (Matsuda et al., 1990), régule la
production de G6P qui sera orienté selon les besoins
de l’organisme vers la synthèse de lipides, de
glycogène ou encore la création d’énergie
métabolique par la glycolyse et le cycle de Krebs. En
outre, on a récemment montré que la glucokinase est
nécessaire à la transcription des gènes impliqués dans
l’utilisation hépatique du glucose (gènes de la
glycolyse et de la lipogénèse, Girard et al., 1997 ;
Kahn, 1998 ; Lemaire et Rousseau., 1994). Dans le
pancréas la glucokinase agissant comme détecteur du
taux de glucose circulant, est une enzyme régulatrice
clé de la sécrétion d’insuline (Matchinsky, 1996).
Les informations concernant la glucokinase aviaire
manquent actuellement : sa présence chez les oiseaux
est encore contestée et les travaux n’ont porté jusqu’à
présent que sur la mise en évidence d’une activité
enzymatique de type glucokinase et uniquement dans
le foie de diverses espèces aviaires (Cardenas et al.,
1998). L’existence de glucokinase chez les oiseaux est
une question pourtant essentielle étant donné les
implications multiples de l’enzyme (rapportées ci
dessus chez les mammifères). Il faut toutefois rappeler
que les oiseaux ont un métabolisme original. On peut
citer ici leur glycémie basale deux fois plus élevée
que celle des mammifères, une insensibilité relative
du pancréas endocrine au glucose ainsi qu’une
lipogénèse d’origine hépatique contrairement aux
mammifères (où la biosynthèse des lipides est réalisée
par le tissu adipeux). Il est donc possible que des
modifications adaptatives spécifiques aux oiseaux,
aient rendu difficile la mise en évidence de la
glucokinase.
L’objectif du travail est de rechercher, à l’aide des
techniques de la biologie moléculaire et de la

Cinquièmes Journées de la Recherche Avicole, Tours, 26 et 27 mars 2003

biochimie, l’expression du gène et l’existence d’une
protéine de type glucokinase dans le foie de deux
espèces aviaires : le poulet et le canard. Pour cela un
fragment de cDNA a été amplifié par RT PCR et
séquencé et la présence de la protéine a été testée par
Western-blot à l’aide d’un anticorps anti-GK
humaine.
1. Matériels et méthodes
1.1. Les animaux
Les expériences ont été réalisées sur des poulets de
type chair mâle et de croisement commercial (Shaver :
poids vif de 1250g) âgés de 4 semaines. Les animaux
ont reçu une alimentation équilibrée à base de maïs et
de soja (12,6 MJ d’énergie métabolisable/kg
contenant 20% de protéines).
Des canards mâles de 13 semaines (poids vif 4000g)
issus du croisement d’un canard Barbarie et d’une
cane Pékin (croisement MMG x PKL, Grimaud
sélection) ont été utilisés. Ils ont été élevés à la station
d’Artiguères (SEFPG, INRA, France). Les canards
ont reçu un aliment commercial. (11,5 MJ d’énergie
métabolisable /kg contenant 15,5% de protéines).
L’aliment et l’eau ont été distribués à volonté.
Les poulets tués par dislocation cervicale et les
canards étourdis par électronarcose ont été saignés par
section des carotides et des jugulaires à la base de la
tête. Dans les deux cas le foie est rapidement prélevé
dans l’azote liquide et stocké à –80°C jusqu’au
moment de l’essai.
1.2. Caractérisation du gène
Extraction des ARN
Les ARN totaux ont été extraits du foie de poulet et
de canard par la méthode de Chomczinski et Sacchi
(1987). Les cDNA ont été obtenus par transcription
inverse (RT) : 5 µg d’ARN totaux dénaturés sont
hybridés avec des amorces aléatoires (random primer)
et incubés en présence de la transcriptase inverse
Superscript II (Invitrogen, Cergy Pontoise).
Choix des amorces
Les séquences des ADNc des glucokinases humaine
(accession gi15967158), murine (accession gi886343)
et téléostéennes (truite accession gi7662682 et
daurade accession gi7662680) ont été comparées à
l’aide d’un logiciel d’alignement multiple (multialin,
Corpet, 1988). Des amorces de PCR ont été choisies
dans des domaines conservés. Ces domaines codent
pour des régions qui comportent les sites fonctionnels
de l’enzyme (sites de liaison au glucose et à l’ATP)
(Figure 1).
Amplification (PCR) et purification de l’ADNc
Les ADNc (2 µl) ont été amplifiés par PCR avec 5
pmol des amorces dégénérées dans un mélange
réactionnel de 50 µl contenant 0.5 mM dNTP et 2.5 U
Taq polymérase (Promega). Trente cinq cycles de
PCR (dénaturation 30 sec à 95°C , hybridation 30 sec
à 58°C ; élongation 30 sec à 72°C) ont été réalisés.
Les produits de PCR ont été analysés par
électrophorèse sur gel d’agarose 1% en présence de
vistra green®. Les fragments de taille attendue ont été
purifiés (QIAquick gel extraction kit, QIAGEN).
Clonage et séquençage des produits PCR
Les fragments d’ADN purifiés ont été clonés dans un
plasmide pCR®2.1-TOPO (Invitrogen, Cergy-
Pontoise, France). Des bactéries E.Coli (One Shot®,
Invitrogen) ont été transformées par ces constructions.
Les clones positifs ont été analysés par digestion
enzymatique (EcoRI) du plasmide purifié. Les
plasmides contenant l’insert ont été séquencés.
Analyse des séquences
Les séquences des cDNA obtenus ont été comparées
avec celles contenues dans les différentes banques de
données grâce au logiciel de recherche et
d’alignement BLAST (Atlschul et al, 1990). Les
alignements de séquence et les pourcentages
d’identité ont été vérifiés à l’aide du logiciel
d’alignement multiple Clustal W (Higgins et Sharp,
1989) en comparant les séquences aviaires clonées
avec les séquences du gène GK de différentes
espèces.
1.3. Caractérisation de la protéine
Solubilisation des tissus
500 mg de foie ont été homogénéisés sur la glace dans
3 ml de tampon de solubilisation à l’aide d’un
Ultraturax puis traités comme décrit précédemment
(Dupont et al., 1998). Les protéines des surnageants
ont été dosées par la méthode de Bradford avec un
réactif Bio-Rad (Bradford, 1976) en utilisant
l’albumine sérique bovine comme protéine étalon
Détection immunologique (Western blot)
La présence de protéine de type glucokinase dans le
foie de poulet et de canard a été mise en évidence par
Western blot. Pour cela, les protéines solubilisées
(dénaturées à 100° C dans du tampon de Laemmli
contenant du dithiothréitol, DTT, 80 mM) ont été
séparées par électrophorèse sur gel de polyacrylamide
(12 %, SDS-PAGE) puis transférées sur une
membrane de nitrocellulose par électrotransfert (100
Volts, 90 min). Après incubations successives de la
membrane avec un anticorps de lapin dirigé
spécifiquement contre la glucokinase humaine (Santa
Cruz, Biotechnology, CA.) et un anticorps secondaire
anti-IgG de lapin couplé à la peroxydase, les bandes
spécifiques ont été révélées par chemiluminescence à
l’aide du réactif ECL (Enhanced Chemiluminescence
Amersham, France).
2. Résultats Références bibliographiques

2.1. Identification de séquences aviaires de type

GK
Les séquences de l’ADNc de la GK hépatique de
l’homme, de la souris, de la truite et de la daurade ont
été comparées pour déterminer les régions les plus
conservées entre ces espèces : les séquences les plus
conservées s’étendent de l’exon 5 à l’exon 7. Des
amorces de PCR ont été choisies dans ces régions.
Elles ont permis d’amplifier par RT-PCR un fragment
d’ADNc de 230 paires de bases à partir des ARN
totaux de foie de poulet et de canard (Figure 1). Ces
fragments ont été purifiés, clonés et séquencés. Les
séquences nucléotidiques des deux espèces aviaires
obtenues présentent 82 à 88% d’homologie avec les
séquences correspondantes de glucokinase de
mammifères et de poissons. Ceci a permis de
caractériser le fragment d’ADNc comme le cDNA
partiel de la glucokinase aviaire.
Pour les deux oiseaux, la séquence du fragment est
plus proche de celle des mammifères que des espèces
appartenant à d’autres classes.
2.2. Détection d’une protéine homologue de la
glucokinase dans les foies de poulet et de canard
L’anticorps utilisé pour le Western blot reconnaît dans
les homogénats protéiques de foie de poulet, de
canard et de rat une protéine de même poids
moléculaire (50 kDa) que la glucokinase de
mammifère (Figure 3). La spécificité de la réaction est
confirmée par la mise en évidence d’un effet
proportionnel à la dose de protéine hépatique
appliquée sur la membrane.
Altschul SF, Madden TL, Schaffer AA, Zhang J,
Zhang Z, Miller W, Lipman DJ. Nucleic Acids Res.
1997;25(17):3389-402. Review.
Cardenas ML, Cornish-Bowden A, Ureta T. Biochim
Biophys Acta. 1998;1401(3):242-64. Review.
Chomczinsky P, Sacchi N. Analytical Biochem.
1987 ;162 :156-159.
Corpet F. Nucl. Acids Res. 1988; 16 (22); 10881-
10890.
Girard J., Ferré P. and Foufelle F. Ann. Rev. Nutr.
1997, 17, 325-352.
Higgins DG, Sharp PM. Comput Appl Biosci.
1989;5(2):151-3.
Inedjian PB. Biochem J. 1993;293:1-13.
Kahn A. C.R. Soc. Biol. 1998, 192, 813-827.
Lemaire FP, Rousseau GG. Biochem. J. 1994, 303, 1-
14.
Matschinski FM. Diabetes. 1996;223-241.
Matsuda T, Noguchi T, Yamada K. J Biochem 1990 ;
108 :778-784.
Myers MR, Klasing KC. J Nutr. 1999;129(10):1896-
904.
Rideau N. Ann N Y Acad Sci. 1998 ;839:162-5.
Review.
Rideau N., 1997, 2èmes Journées de la Recherche
Avicole; Tours (FRA) 1997/04/0/-10, Vol.1; 107-110.
ITAVI, Paris (FRA).
Stanley JC, Dohm GL, McManus BS, Newsholme
EA. Biochem J. 1984;224(2):667-71.

Conclusion

Dans le présent travail, nous démontrons pour la

première fois l’existence d’une protéine homologue à
la glucokinase de mammifère dans le foie de poulet et
celui de canard. La caractérisation du gène de la
glucokinase dans le foie de poulet et de canard apporte
un argument décisif démontrant l’existence de
l’enzyme chez les oiseaux. Le cDNA partiel obtenu est
un outil important pour poursuivre les investigations
concernant la régulation du métabolisme glucidique
des oiseaux et comprendre en particulier les
mécanismes qui orientent l’utilisation hépatique du
glucose vers la synthèse du glycogène et/ou d’acides
gras. Actuellement, nous recherchons s’il existe des
relations entre le niveau d’expression de la
glucokinase, l’activité de l’enzyme et l’état nutritionnel
des animaux.
 FIGURE 1: Représentation schématique des ARNm de la glucokinase dans le foie et le pancréas de mammifère.
Les flèches montrent les positions des amorces choisies pour la PCR. Ces amorces ont permis l’amplification d’un
fragment de 230 paires de base (pb) visualisé sur un gel d’agarose 1% coloré au Vistrat green® (MT = marqueur
de taille)

300 bp
foie Amorce sens Amorce anti-sens
1L 2 3 4 5 6 7 8 9

Liaison ATP
Liaison glucose
MT poulet canard MT
230 pb

FIGURE 2 :Comparaison des séquences nucléiques partielles de la GK aviaire avec celle d’autres espèces. (a)
alignement obtenu avec le logiciel Clustal W (P, poulet ; C, canard ; H, homme ; S, souris ; R, rat ; T, truite ; D,
daurade, dans l’ordre). La séquence U représente une séquence consensus déduite d’après les degrés d’identités entre les
séquences («.» ≥20% «: » ≥40% « + » ≥60% « ∗ » ≥80% et le caractère lui-même s’il est identique pour l’ensemble
des séquences). Les régions surlignées sont les zones où les séquences de l’ensemble des espèces sont identiques. (b)
pourcentages d’identités entre les séquences nucléotidiques des espèces comparées (calculées par le logiciel BLASTn).
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120
P GAGGGGACTTCGAGATGGACGTGGTGGCCATGGTGAACGACACCGTCGCCACCATGATCTCCTGCTACTACGAGGACCACCGCCGCGAGGTCGGCATGATCGTGGGGACGGGCTGCAACG 120
C GAGGGGACTTCGAGATGGACGTGGTGGCCATGGTGAACGACACCGTCGCCACCATGATCTCCTGCTACTACGAGGACCACCGCTGCGAGGTCGGCATGATCGTGGGGACGGGCTGCAACG 120
H GAGGGGACTTTGAAATGGATGTGGTGGCAATGGTGAATGACACGGTGGCCACGATGATCTCCTGCTACTACGAAGACCATCAGTGCGAGGTCGGCATGATCGTGGGCACGGGCTGCAATG 120
S GAGGGGACTTTGAGATGGATGTGGTGGCAATGGTGAATGACACGGTGGCCACAATGATCTCCTGCTACTATGAAGACCGCCAATGTGAGGTCGGCATGATTGTGGGCACCGGCTGCAACG 120
R GAGGGGACTTTGAGATGGATGTGGTGGCAATGGTGAACGACACAGTGGCCACAATGATCTCCTGCTACTATGAAGACCGCCAATGTGAGGTCGGCATGATTGTGGGCACTGGCTGCAATG 120
T GAGGGGACTTTGAGATGGACGTCGTTGCCATGGTGAACGATACAGTTGCCACCATGATATCCTGTTACTATGAGGACCGCAGCTGCGAAGTGGGAATGATTGTGGGTACTGGGTGTAACG 120
D GAGGGGACTTCGAGATGGATGTGGTTGCCATGGTGAACGACACAGTAGCCACCATGATTTCCTGCTATTATGAAGATCGCAGCTGTGAAGTCGGGATGATTGTTGGTACTGGTTGTAATG 120

(a) U GAGGGGACTT:GA*ATGGA:GT*GT+GC:ATGGTGAA+GA*AC:GT:GCCAC:ATGAT+TCCTG*TA*TA:GA:GA*C:*+::*G:GA+GT*GG+ATGAT:GT*GG:AC:GG+TG+AA:G

130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240
P CCTGTTACATGGAGGAGATGCACAACGTGGAGCTGGTGGAGGGCGACGAGGGCCGCATGT-GTGTGAACACGGAGTGG--GGCGCATTTGGG-GCGTCGGGGG--------AGCTGGA--CGAGTT 232
C TCTGTTACATGGAGGAGATGCACAACGTGGAGCTGGTGGAGGGCGACGAGGGCCGCATGT-GTGTGAACACGGAA-AG--GGCGAATTCCAGCACACTGGCGGCCGTTACTAG-TGGATCCGAGCT 230
H CCTGCTACATGGAGGAGATGCAGAATGTGGAGCTGGTGGAGGGGGACGAGGGCCGCATGT-GCGTCAATACCGAGTGG--GGCGCCTTCGGGGACTCCGGCG---------AGCTGGA--CGAGTT 226
S CCTGCTACATGGAGGAGATGCAGAATGTGGAGCTGGTGGAAGGCGATGAGGGGCGCATGT-GTGTCAACACAGAGTGG--GGCGCCTTCGGGAACTCCGGTG---------AGCTGGA--CGAGTT 232
R CCTGCTACATGGAGGAAATGCAGAATGTGGAGCTGGTGGAAGGGGATGAGGGACGCATGT-GCGTCAACACGGAGTGG--GGCGCCTTCGGGGACTCGGGCG---------AGCTGGA—TGAGTT 232
T CTTGCTACATGGAGGAGATGCGGACAGTGGAGCTGGTGGAGGGGGAAGAGGGGAGGATGT-GTGTGAACACAGAGTGG--GGGGCCTTTGG------------------------------ 208
D CGTGTTACATGGAGGAGATGAGGACCGTGGAGCTGGTAGAAGGCGAGGAGGGCCGGATGTCGTGTTA-CATGGAGGAGATGAGGACCGTGGAGCTGGTAGAAGGCGAGGAGGGCCGGAT----GT- 240
U *+TG:TACATGGAGGA*ATG*++A+:GTGGAGCTGGT*GA:GG:GA:GAGGG:*G+ G+GT:A**A*:GA*++G G*+G++**:**+::+:::+*:+: .. +*++***. :++*++

(b) GK Homme Souris Daurade Xénope

Poulet 87% 86% 83% 85%
Canard 87% 85% 83% 84%

FIGURE 3 : Caractérisation de la glucokinase dans le foie de poulet et de canard par Western blot. (a) Protéines de foie de
canard et protéines de foie de poulets. (b) Effet de la quantité de protéines de foie de poulet déposées. C : contrôle positif
(extraits protéiques de foie de rat, Santa Cruz)

50 kDa

C 150 125 100 75 50 25 0

canard poulet
µg protéines de foie de poulet / puits

a b