Résultats et discussion

Ces dernières années ont été marquées par une augmentation inquiétante de la multi-
résistance des bactéries pathogènes et l’émergence de nouveaux pathogènes dans les
domaines médical et agricole. Ainsi, la découverte et la production de nouvelles molécules
bioactives fait l’objet de plus en plus de projets de recherche interdisciplinaires. Ces nouvelles
biomolécules sont soit recherchées à partir de sources naturelles (microorganismes et plantes),
soit obtenues par semi-synthèse ou synthèse chimique totale. A ce propos, il faut noter que
l’utilisation des moyens moléculaires pour l’obtention de nouvelles biomolécules hybrides
connait actuellement un essor considérable. Le présent travail de thèse entre dans ce contexte
de recherche de nouvelles biomolécules à partir des bactéries actinomycètes du genre
Streptomyces. Les Streptomyces sont les meilleurs candidats connus par leur capacité de
produire des métabolites secondaires biologiquement actifs qui peuvent être utilisés dans les
domaines agro-alimentaire, agricole et médical. Durant la première partie des travaux de
recherche de la présente thèse, nous nous sommes intéressés à l’isolement et la sélection de
souches d’actinomycètes productrices de métabolites secondaires biologiquement actifs

I. Isolement et sélection des bactéries du genre Streptomyces,

productrices d’activités antimicrobiennes et de pigments à usage industriel

Trente cinq souches d’actinomycètes ont été isolées à partir de trois sites industriels
différents de Rades. Ces isolats ont été testés pour leur capacité de produire des pigments
colorés et des activités antibactériennes en utilisant la technique des puits contre la bactérie à
Gram+ Micrococcus luteus, la bactérie à Gram- Agrobacterium tumefaciens et le champignon
filamenteux Fusarium sp.

Comme résultats, nous avons remarqués que 4 isolats produisent des pigments de différents
couleurs (rose, mauve, …) et un isolat nommé B3 a été retenu pour la production et la
purification des pigments jaune. En effet, ces 4 souches colorées ont été cultivé sur milieu
Bennett liquide. Le suivi de la coloration des milieux de culture pendant 72 h (30°C à 250
rpm) a montré que seule la souche B3 fait virer le milieu transparent vers la couleur jaune au
cours des deux premiers jours alors que les autres souches ne change pas la couleur de milieu
Bennett liquide.

20
 Résultats et discussion

Figure 2: Différentes souches colorées isolées (B3: Souche productrice de spore jaune)

De plus, nous avons constaté que la souche B3 n’inhibe pas la croissance des bactéries
indicatrices testées. Ce résultat favorise davantage l’application des pigments produits par la
souche B3 dans les industries agro-alimentaires, pharmaceutiques et cosmétiques.

L’étude des activités antibactériennes et antifongiques des souches isolées nous a

permis de faire le tri des souches possèdent des activités antibactériennes et/ou antifongiques
parmi les 35 isolats. Comme montre la figure suivante 4 souches F1, F2, A2 et D15 ont été
actives contre l’Agrobacterium tumefaciens avec des zones d’inhibition de 11mm ,44mm, 24
mm et 18 mm.

Figure 3 : Activité antimicrobienne des extraits des différentes souches Streptomyces isolées
contre Agrobacterium tumefaciens

Nous avons retenu l’isolat F2 suite aux études de leurs activités antimicrobiennes. En effet, il
possède des activités antimicrobiennes intéressantes contre les bactéries pathogènes
Salmonella thyphimirium, Listeria monocytogenes, Staphococcus aureus, la levure pathogène

21
 Résultats et discussion

Candida albicans et contre les phytopathogènes, la bactérie Agrobacterium tumefaciens et le

champignon filamenteux Fusarium sp. Les diamètres des zones d’inhibition (ZI) obtenues
sont illustrés dans le tableau suivant.

Tableau 2 : activité antimicrobienne de l’extrait de l’isolat F2 contre les différentes souches
indicatrices. Pour chaque test, 50l d’extrait dissout dans acétate d’éthyle) ont été déposés.Φ:
diamètre de la zone d’inhibition en mm

Souche Agrobacteriu Staphococcu Salmonella Listeria Candid Fusarium

indicatric m tumefaciens s aureus thyphimiriu monocytogene a sp.
e m s albican
s
Φ (mm) 44 32 17 17 12 10

D’parés le tableau ci-dessous, la zone d’inhibition de la souche F2 varie entre 32 mm et 17

mm contre les souches indicatrices (Staphococcus aureus, Salmonella thyphimirium et
Listeria monocytogenes) alors qu’elle est de l’ordre de 44 mm pour la phytopathogène
Agrobacterium tumefaciens, de 10 mm contre le champignon Fusarium sp et 12 mm contre
la levure Candida albicans.

Suite aux résultats obtenus au cours de cette étude et vue l’importance des activités
biologiques et notamment antifongiques de la souche F2 et la production de pigments jaunes
par la souche B3, nous avons décidé de les identifier.

Plusieurs critères sont utilisés dans la classification et l’identification des bactéries.

Généralement, les deux critères les plus utilisés sont: les critères morphologiques (suivi du
changement de la morphologie de la bactérie en fonction de l’âge sur différents milieux de
cultures), et les critères moléculaires à savoir l’analyse de la séquence du gène ARN 16S et la
détermination de la phylogénie.

II. Identification morphologique et moléculaire des deux souches

d’actinomycètes F2 et B3

II.1. Identification moléculaire

22
 Résultats et discussion

La concentration d’ADN est déterminée par spectrophotométrie « Nanodrop », la

concentration ainsi que le rapport DO260/DO280 sont présentés dans le tableau suivant :

Tableau 3: Estimation de la concentration et de la qualité de l’ADN

des deux souches F2 et B3

Echantillon ng/µl A260 A280 260/280

B3 1887,22 37,685 17,685 2,13
F2 1810,37 17,317 17,317 2,09

La concentration des deux souches F2 et B3 est de 1887,22 ng/µl et 1810,37 ng/µl

respectivement. Une étape de dilution sera nécessaire avant de passer à l’étape
d’amplification.

L’électrophorèse des produits de la PCR des gènes de l’ARNm 16S des deux souche F2 et B3
à été effectuée. Le gel d’agarose-TBE est photographié sur table UV, les bandes d’ADN ont
migré dans la région 1500 paires de bases (Figure 18).

Figure 4 : Résultats de l’électrophorèse des produits de la PCR des souches

d’actinomycètes F2 et B3 (SL: smart ladder)

La suite de ce travail a été consacrée à l’identification moléculaire des deux isolats F2 et B3.
Le clonage et le séquençage de ce gène sont en cours de réalisation.

23
 Résultats et discussion

II.2. Optimisation des conditions de sporulation

Sept milieux de cultures ont été utilisés : Milieux ISP2, ISP3 et ISP4, milieu gruau, milieu
gruau*, milieu HT et milieu PDA. D’après les résultats présentés sur la figure 1 et 2, nous
pouvons déduire que:

* L’isolat F2 présente une croissance et une sporulation abondantes sur les milieux gruau et
HT. La croissance est aussi abondante sur PDA mais sans production de mycélium aérien; elle
est par contre moyenne sur ISP2, ISP3, ISP4 et gruau*.

* L’isolat B3 présente une croissance et une sporulation jaune abondantes sur les milieux
PDA, Gruau et HT. La croissance est aussi abondante sur Gruau* mais sans production de
mycélium aérien. Elle est par contre moyenne sur les autres milieux.

Figure 5 : Morphologie de la souche F2 sur Figure 6: Morphologie de la souche B3 sur

différents milieux de culture différents milieux de culture

II.3. Optimisation des conditions de production des biomolécules

Les métabolites secondaires biologiquement actifs (antibiotiques, antifongiques,..) sont

généralement liés et influencés par le métabolisme primaire de la bactérie productrice. Un ou
plusieurs métabolites intermédiaires du métabolisme primaire servent fréquemment comme
précurseur pour leur synthèse. Toutefois, la composition du milieu de culture influence la
capacité et la quantité de métabolites secondaires produites par le micro-organisme en
question. Suite à des études préliminaires, pour chacune des deux souches F2 et B3, nous
avons réalisé des cultures liquides sur les différents milieux de culture : HT, Gruau, PDA et
Gruau*.

24
 Résultats et discussion

Des testes antibactériennes ont été réalisé ensuite contre la souche Agrobacterium
tumefaciens. La figure 7 montre la variation de la zone d’inhibition des deux souches F2 et
B3 en fonction du milieu de culture utilisé. 

Figure 7: Activité antibactérienne contre la souche Agrobacterium tumefaciens des deux

souches Streptomyces F2 et B3 après leurs cultures sur différents milieux.

F2 : Souche F2, B3 :Souche B3, PDA :Milieu PDA, G :milieu gruau, G*:milieu gruau*, HT :milieu HT.

D’après cette figure, nous remarquons que la souche B3 ne présente pas des activités
antibactériennes contre Agrobacterium tumefaciens par contre la capacité et la quantité de
métabolites secondaires produites par la souche F2 étaient différentes. En effet, la production
des biomolécules actives est plus importante sur les deux milieux gruau et PDA (la zone
d’inhibition est de 20 mm) que sur milieu HT. Toutefois, cette production est faible sur le
milieu Gruau*.

II.4. Extraction, Purification et caractérisation chimique des biomolécules

II.4.1.Méthode Résine sur milieux solide et liquide

Des cultures solide et liquide sur les milieux HT avec et sans Résine ont été réalisées pour
la souche F2. Après 72 h d’incubation, chaque résine a été extrait par deux solvants
successivement, l’acétate d’ethyle et le méthanol. Pour la souche B3, seulement des cultures
solides sur le milieu PDA avec et sans Résine ont été réalisées. Les masses des Résines et des
extraits des deux souches B3 et F2 obtenues après culture sur différents milieux sont
présentées dans le tableau 4.

25
 Résultats et discussion

Tableau 4: les masses des résines et des biomolécules des deux souches B3 et F2 après
culture sur milieu solide et liquide

+R : avec Résine, -R : sans Résine

Souche B3
Souche F2
Culture sur milieu HT Culture sur milieu HT Culture sur milieu PDA
liquide (1l) solide (200ml) solide (200ml)
sR +R -R +R -R +R
Masse de
la Résine 55,40 113,90 - 54,82 - 41,60
(g)
Masse de
l’extrait 15,40 11,50 0.56 14,82 0,60 1,60
(g)

Pour la souche F2, la masse de la Résine est de même ordre 54.82 g et 55.4 g pour les
deux cultures sur milieu HT solide avec Résine et liquide sans Résine respectivement.

Le rendement des extraits de la souche Streptomyces F2 issus de culture solide avec

Résine 14.82g est plus important que celle sans Résine 0,56g. Cela est dut peut être à la
richesse de la souche F2 des pigments mélanoïdes qui ont était adsorbés par la Résine et ne
sont pas passés dans la gélose de milieu de culture comme montre la Figure 7.

Pour la souche Streptomyces B3, le rendement des extraits issus de culture sur milieu
PDA solide avec Résine est 1,6 g plus important que celle sans Résine 0,6g.

Figure 8 : Gélose de milieu de Culture HT solide de la souche Streptomyces F2

Gauche :F2-Culture.solide avec Résine, Droite: F2-Culture.solide sans Résine

26
 Résultats et discussion

Chaque Résine a été extraite par deux solvants successivement (l’acétate d’éthyle puis le
méthanol). La Figure 9 présente le schéma global adopté pour l’extraction des biomolécules
de la souche F2 après culture sur les différents milieux utilisés.

Souche F2

Culture sur Milieu solide 200 ml Culture sur Milieu liquide 1l

Sans Résine Avec Résine Sans Résine Avec Résine

Ext.Acet Ext.Acet Ext.Acet Ext.Acet

F2-C.solide-sR-Acet F2-C.solide+R-Acet F2-C.liquide-sR-Acet F2-C.liquide+R-Acet

Ext.MeOH Ext.MeOH Ext. MeOH Ext. MeOH

F2-C.solide -sR- M F2-C. solide +R- M F2-C.liquide-sR- M F2-C.liquide+R- M

CCM/HPLC CCM/HPLC CCM/HPLC CCM/HPLC

Figure 9: Schéma d’extraction des biomolécules de la souche F2 après culture de 72 h sur

milieu HT liquide et solide. F2-C. liquide: Culture liquide de la souche F2, +R : avec resine,
sR : sans resine, F2-C.solide: Culture solide de la souche F2, +R : avec resine, sR : sans
resine

Les extraits secs obtenus de la souche F2 sont analysés en CCM (Chromatographie en

Couche Mince) tout en utilisant comme phase mobile optimisée le mélange (Heptane-acétate
d’éthyle, 5-5, v-v) (Figure 10).

L’analyse chromatographique des extraits des Résines de la souche F2 issus des

cultures sur milieu HT liquide et solide après révélation par le photomolybdique montre la
variation de la composition des différents extraits. En effet, les extraits issus de la culture sur
milieu liquide F2-C.liquide, sont plus complexes que ceux du milieu solide F2-C.solide. La
richesse en molécules organiques des extraits issus des cultures solide avec Résine F2-CS+R
est très remarquable par rapport à celle sans Résine F2-CL-sR.

27
 Résultats et discussion

Figure 10: Profil CCM après révélation par le photomolybdique des extraits des Résines de
la souche F2 issus des cultures sur milieu HT liquide et solide
F2-CL: Culture liquide de la souche F2, +R : avec Résine, sR : sans resine F2-Cs: Culture
solide de la souche F2, +R : avec Résine, sR : sans resine ; B : Extrait brute d’acétate d’éthyl
de la souche F2 après fermentation.
Souche B 3

Milieu solide 200 ml

Sans Resine Avec Resine

Ext.Acet Ext.Acet

B3-C.S-sR-Acet B3-C.s+R-Acet

Ext. MeOH Ext. MeOH

B3-C.S-sR- MeOH B3-C.S+R- MeOH

CCM/ HPLC CCMHPLC

Figure 11: Schéma d’extraction des biomolécules de la souche B3 après des culture de 72 h
sur milieu solide PDA avec et sans Résine.

28
 Résultats et discussion

Les extraits secs obtenus de la souche Streptomyces B3 sont aussi analysés en CCM
(Chromatographie en Couche Mince) tout en utilisant comme phase mobile optimisée le
mélange (Heptane-acetate d’ethyl, 5-5, v-v) (Figure 12).

Figure 12: Profil CCM après révélation par le photomolybdique des extraits des Résines de
la souche B3 issus des cultures sur milieu PDA solide B3-Cs: Culture solide de la souche B3,
+R : avec resine, sR : sans resine
L’analyse chromatographique des extraits des Résines de la souche B3 issus des cultures sur
milieu PDA solide après révélation par le photomolybdique montre la variation de la
composition des différents extraits. En effet, l’extrait acétate issus de la culture sur milieu
PDA solide avec Résine, est le plus complexe. La richesse en biomolécules organiques est
très remarquable par rapport aux autres extraits.

Des tests biologiques réalisés sur les extraits secs collectés des deux souches F2 et B3
contre la bactérie Agrobacterium tumefaciens montrent que seulement les extraits de la
souche F2 issus de la culture sur milieu HT solide sont actifs avec des zones d’inhibition
allant de 20 mm à 25 mm et l’éxtrait acétate d’éthyle de la souche F2 issus d’une culture HT
liquide sans Résine avec des zones d’inhibition de 20 mm. Les masses des extraits ainsi que
leurs activités antibactériennes sont présentées dans le Tableau suivant.

29
 Résultats et discussion

Tableau 5: Les masses des différents extraits obtenus et les activités antibactériennes des
biomolécules des deux souches B3 et F2 contre Agrobacterium tumefaciens.

(40µl par puits de concentration mère 1mg/ml), (++) Active, (+) Faiblement active, (-) Non
active.

Masse Agrobacteriu
Souche Extrait de la souche de
l’extrait m tumefaciens
(mg)
F2-C.solide-sR-Acet 73,2 ++
F2-C.s solide +R-Acet 164,8 ++
F2-C.solide -sR- MeOH 25,5 +
F2-C. solide +R-MeOH 1140 ++
F2 F2-C.loquide-sRMeOH 87,8 -
F2-C.liquide+R- MeOH -
F2-C.liquide-sR-Acet +
F2-C.liquide+R-Acet 269 -
F2-Fermetation 5l -Acet 145 ++
B3-C.s solide -sR-Acet 64,8 -
B3-C. solide +R-Acet 17,9 -
B3 B3-C. solide -sRMeOH -
B3-C. solide +R-MeOH 13,1 -

D’après ce tableau, nous remarquons que pour la souche F2, la masse des extraits obtenus
après culture sur les milieux HT solides varie entre 73,2 mg à 1,14 g alors que pour la culture
sur milieu HT liquide est entre 87 mg à 1g.

A la lumière des résultats obtenus, nous avons décidé d’analyser par chropatoghraphie
HPLC-UV couplée à un spectre de masse MS les molécules bioactives produites par ces deux
souches (Figures 13 et 14).

30
 Résultats et discussion

Figure 13: Profils HPLC-MS des extraits de la souche B3 après cultures sur milieu PDA
liquide avec et sans Résine. (Volume d’injection 50µl (5mg/ml)).

L’analyse HPLC-MS des extraits de la souche B3 montre la présence de plusieurs pics

dont la masse molaire varie entre 262 g/mol et 664 g/mol. Ces biomolécules sont quasiment
absent dans l’extrait méthanol de la souche B3 après culture sur milieux PDA solide.

31
 Résultats et discussion

F2-C.Solide+R-Acet (1)
D-252
D-268
D-386 278

F2-C.Solide-sR-Acet (2)

F2-C.Liquide+R-Acet (3)
280

F2-C.Liquide-sR-Acet (4)
264
280

Figure 14: Profils HPLC-MS des extraits acétate d’éthyle de la souche F2 après cultures sur
milieu HT liquide et solide, avec et sans Résine. (Volume d’injection 50µl (5mg/ml)).

L’analyse HPLC-MS de la fraction acétate de la souche F2 après une culture solide

avec Résine (spectre 1) montre la présence de 2 pics majoritaires et 2 pics minoritaires.

La masse des pics entre 252 g/mol et 278 g/mol pourraient être des dérivés de
dikétopipérazine DKP (comme le L-Leucine, L-Arginine avec une structure cyclique dont la
masse molaire est de 269 g/mol ou une structure linéaire avec une masse de 287 g/mole,
Figure 15). Alors que le pic 386 g/mol ne pourrait être qu’un macrolide (un kétolide ou un
polykétide) ou un derivé de phtalate le di-(2-éthylhexyl) phtalate de masse moélculaire égale à
390 g/mole. Ces pics étaient absents sur le spectre (2) de l’extrait acétate de la souche F2 sans
Résine. De même le spectre (4) de l’extrait acétate de la souche F2 après culture liquide sans
Résine, montre aussi la présence de 2 pics majoritaires de masse de 246 et 280 g/mole alors

32
 Résultats et discussion

qu’un seul pic majoritaire de 280g/mole se présente dans le spectre (3) de l’extrait acétate de
la souche F2 après culture sur milieu liquide avec Résine.

Figure 15 : Structure chimique de DKP L-Leucine, L-Arginine

(a) structure linéaire, (b) structure cyclique

III.4.2.Méthode de Fermentation

Pour l’extraction et la purification des biomolécules de La souche Streptomyces F2

nous avons préparé quatre fermentations de 5 l de volume utile chacune ont été réalisées en
utilisant le milieu Bennett comme milieu de production (Roda AL-Thani et all 2011). Après
incubation de 72 h à 30°C, le jus de fermentation est filtré puis centrifugé. Le surnageant
obtenu est extrait deux fois par un volume égale d’acétate d’éthyle. La phase organique
biologiquement active est évaporée à sec par Rotavapor. Les quatre extraits secs obtenus (des
quatre fermentations successives) de couleur marron verdâtre ont été mélangés pour donner
une masse totale de 800 mg (Figure 16).

33
 Résultats et discussion

Culture liquide 20 l

Filtration et Centrifugation

Culot cellulaire Surnageant

Extraction deux fois par

L’acétate d’éthyle

Evaporation

Extrait sec (800mg)

HPLC/MS

«  Combiflash C18 »

(Heptane /acétate d’éthyle)

F1 F2 F3 F4 …. 

CCM/HPLC CCM/HPLC CCM/HPLC CCM/HPLC

Figure 16: schéma d’extraction et de purification des biomolécules de la souche F2 après

quatre fermentations de 5l chacune (CCM= Chromatographie sur Couche Mince).

34
 Résultats et discussion

L’extrait sec obtenu est dissout dans l’acétate d’éthyle et analysé en CCM
(Chromatographie en Couche Mince) tout en utilisant comme phase mobile optimisé le
mélange (Chloroforme 95%-Méthanol 5%). L’analyse par CCM de l’extrait F2 après
révélation par le p-anisaldéhyde montre sa richesse en molécules bioactives pourraient être
des DKP, des indoles ou des macrolides (Figure 17).

Les DKP: en bleu ou bleu-violet

Les β-carbolines: en jaune
Les indoles: tâches orangées
Les macrolides: tâches noires

Figure 17 : Profil chromatographie après pulvérisation par le p-anisaldéhyde de l’extrait

acétate de la souche F2 analysé par chromatographie sur couche mince (Chloroforme-
Méthanol 95-5, v-v).

III .4.3. Purification et caractérisation chimique des biomolécules

L’extrait sec actif obtenu (800 mg) a été dissous dans 5 ml d’acétate d’éthyle mélangé avec de
la silice puis séché. Ensuite, le mélange sec a été déposé sur une colonne de chromatographie
pré-tassée (Silice C18) en utilisant comme éluant un mélange de Hetptane –Acétate d’éthyle
(1-9). Cette première étape de purification nous a permis d’obtenir plusieurs fractions qui ont
été réduites à 17 fractions (Figure 16) suite aux analyses chromatographiques sur couche
mince (CCM).

35
 Résultats et discussion

Figure 18 : Profil Chromatographie sur couche mince après révélation par le
photomolybdique des différentes fractions issus de l’extrait à l’acétate d’éthyle de la souche
F2 après purification par « Combiflash » Gradient :(Heptane:acétate d’éthyle, 1:9), B: Extrait Brut de
l’extrait acétate de la souche F2.

Des tests biologiques réalisés sur les extraits secs collectés montrent la présence d’un
pouvoir inhibiteur de certaines fractions contre la bactérie Agrobacterium tumefaciens. Les
masses des fractions obtenues ainsi que leurs activités antibactériennes sont présentées dans le
Tableau suivant.

Tableau 6 : les masses et les activités antibactériennes contre Agrobacterium tumefaciens

des différentes fractions issues de la purification de l’extrait à l’acétate d’éthyle F2 (40 yl par
puits de concentration mère de 1mg/ml), (++) Active, (+) Faiblement active, (-) Non active.

N Fractions Masse Activité N Fractions Masse Activité

(mg) (mg)
1 F4-F20 43,3 - 10 F82-F100 7,6 ++
2 F22-F23 3,3 - 11 F102-F108 5,6 ++
3 F24-F27 2,2 - 12 F110-F112 6,7 +
4 F28-F30 2,2 - 13 F113-F121 2,6 +
5 F31-F34 12,2 - 14 F122-F130 28,5 -
6 F36-F40 14 - 15 F132-F138 15,2 -
7 F42-F58 33,1 + 16 F140-F142 5,4 -
8 F62-F74 23,5 ++ 17 F144-F152 6,9 -
9 F75-F81 19,5 ++ 18 - - -
D’après ce tableau, nous remarquons que seules les fractions 8, 9, 10, 11, 12 et 13 sont les
plus actives contre Agrobacterium tumefaciens.

36
 Résultats et discussion

L’analyse par HPLC-UV de ces fractions (Figure 19), montre la présence des
fractions pures comment le spectres 8 et 12 qui présente un seul pic majoritaire. De même, les
deux fractions 2 et 14 montrent un seul pic majoritaire mais ne sont pas actives contre
Agrobacterium tumefaciens.

Figure 19: Profil HPLC-UV des différentes fractions de l’extrait d’acétate d’éthyle de la
souche F2 (fermentation de 20 l) âpres purification par « Combiflash C18 » (Volume
d’injection 50µl (5mg/ml)).

Pour la fraction 10, nous suggérons une deuxième étape de purification par HPLC
préparative avant l’identification chimique des biomolécules pures.

A la lumière des résultats obtenus, ces fractions peuvent être intéressantes pour
l’identification des biomolécules pures par LC-MS, IR (Infra-rouge) et par RMN (Résonance
magnetique nucleaire).

37