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UE2 : Biologie cellulaire

Chapitre 4 :
La communication inter-
cellulaire via les récepteurs
membranaires
Docteur Laurent PELLETIER
Année universitaire 2011/2012
Université Joseph Fourier de Grenoble - Tous droits réservés.
Récepteurs membranaires

• Propriétés générales

• Mise en évidence – caractérisation

• Structure

• Divers types de récepteurs


Récepteurs membranaires
« Ligand »

Milieu R
« Transduction »
extracellulaire é
c
e
Membrane p
plasmique t
e « Effecteur
Cytosol u primaire »
r

« 2nd
messager »

« Effecteur
secondaire »
Récepteurs membranaires
Récepteurs membranaires
Ehrlich, 1910 : « Pour qu’une substance puisse agir, elle doit se fixer »

R membranaires : protéines membranaires intrinsèques


reconnaissant des molécules hydrophiles
(peptides, protéines…)

3 Domaines :
- Extracellulaire
hydrophile (glycosylé)
site de reconnaissance & fixation spécifique du ligand
- Transmembranaire
Séquence(s) hydrophobe(s)
- Intracellulaire
Domaine fonctionnel (Transduction)

Mono / multimère
Récepteurs membranaires

Ligand
libre Complexe L-R
Récepteur

Liaison de faible énergie


L. hydrogène
L. Van der Waals
L. ioniques
L. hydrophobes
Grand nombre

Sensibles l’environnement (pH, ions…)


Récepteurs membranaires

Mise en évidence

1. Liaison du ligand marqué (3H, 125I, 14C…)

2. Lavage

3. Mesure du ligand fixé


Récepteurs membranaires

Interaction ligand-récepteur :


• Réversible 
L R  L R
[ L][ R ]  10-8 M
• Haute affinité Kd 
[ L  R]
• Spécificité

• Capacité limitée
Récepteurs membranaires
Tous les ligands sont-
ils égaux devant un
récepteur ?
Ligands / Agonistes / Antagonistes
Agoniste
Ligands
Antagoniste - Compétitifs
- Non compétitifs

« Agent qui se lie à un récepteur spécifique en induisant son activation »

« Substance qui se lie à un récepteur spécifique sans provoquer son


activation mais qui peut bloquer l’action d’un médiateur agoniste »
Agoniste
Signal intracellulaire

Antagoniste
Signal intracellulaire
Ligands / Agonistes / Antagonistes
- Curare, -bungarotoxine
- Tétracaïne et Proadifen
Récepteurs membranaires

FGF

FGF-R3
FGF-R3

- Cellules épithéliales (vessie, prostate) Chondrocytes


- lignée B

 Prolifération  Prolifération

Carcinome Hypochondroplasie,
Nanisme thanatophore
Récepteurs membranaires
Exemples
VEGF-B VEGF-A Ang-1 Ang-2

1 ligand → x récepteurs + + + + -
&
x ligands → 1 récepteur

Membrane
plasmique

Cytosol

VEGF-R1 VEGF-R2 Tie-2


Cellule endothéliale
Récepteurs membranaires

1 récepteur → plusieurs ligands

1 ligand → plusieurs récepteurs

1 ligand + 1 récepteur → plusieurs effets (cellules)

Effet cellulaire = F (récepteur, ligand, type cellulaire)

Sans oublier les interactions entre les voies de signalisation !!!


Récepteurs membranaires
Purification
Purification difficile car - concentration basse
- protéines membranaires

Marquage d’affinité
Chromatographie d’affinité
Clonage par expression
Purification
Marquage d’affinité
O O
C—C
│ │
NH2 NH2 NH2 NH2
NH NH
│ │ │ │
│ │
+
L marqué R L-R Réactif
de pontage L-R
ex : N-hydroxysuccinimide (NHS)

→ Visualisation de R-L*
→ Caractérisation moléculaire (PM en SDS-PAGE)
→ Purification
Purification
Chromatographie
d’affinité

- Support solide
+ ligand spécifique
(agoniste / antagoniste)

- R retenu par liaison au ligand

- R élué par ligand en excès


(ou pH, force ionique)
Récepteurs membranaires
Récepteurs
membranaires

À activité Sans activité


enzymatique enzymatique

RTK RTP Canaux Couplés R


(RYK) (RYP) ioniques Prot G cytokines
Récepteurs membranaires
Récepteurs
membranaires

À activité Sans activité


enzymatique enzymatique

RTK RTP Canaux Couplés R


(RYK) (RYP) ioniques Prot G cytokines
Récepteurs membranaires
Récepteurs
membranaires

À activité Sans activité


enzymatique enzymatique

RTK RTP Canaux Couplés R


(RYK) (RYP) ioniques Prot G cytokines
Récepteur canal ionique
Canal ionique = pore aqueux → transport passif d’ions
(sens gradient électrochimique)

Ionotropique Métabotropique
Récepteur canal ionique

Ionotropique Métabotropique
Acétylcholine Nicotinique Muscarinique
(muscle squelettique) (muscle cardiaque)

Glutamate NMDA, AMPA, kainate mGluR

GABA GABAA GABAB


(Ac. -amino butyrique)
Autres Sérotonine Adrénaline (β-adr.)
Récepteur canal ionique
Récepteurs cholinergiques
Ionotropique Type Métabotropique

nicotinique Nom muscarinique

rapide Conduction Lente

SNC (10 %) SNC (90 %)


Expression S.N.
+ SNP + SNP
Expression Musc. card.,
Cell. Musc. Sq. périphérique Cell. Endo.

7 Sous-types 5

Excitateur Effet Excitateur / Inhibiteur


Récepteur nicotinique

Structure

pentamérique : 2,  ou 

Monomère : 4 hélices  (M1-M4)


Récepteur nicotinique

M2→ Canal
Récepteur nicotinique

Activation
2 Ach → 2 
10 000 Na+ / 0.5 s

Désensibilisation

Ach rapidement dissociée

AchE

Phosphorylation → fermeture
Récepteur nicotinique

AXONE

MUSCLE
Récepteur nicotinique
La jonction neuro-musculaire
Sarcolemme
Cellule satellite

Myofibrille

Sarcoplasme
Récepteur nicotinique
La jonction neuro-musculaire
Triade

Citernes Tubule T
terminales
Mitochondrie
Sarcolemme
Filament épais
Filament fin

Myofibrille

Reticulum
Myofibrilles
sarcoplasmique
Récepteur nicotinique
La jonction neuro-musculaire
Récepteur nicotinique
La jonction neuro-musculaire
R. à la Dihydropyridine

• Sarcolemme (Tubule T)

• Canal Ca2+

• Voltage-dépendant

R. à la Ryanodine

• Mb R. sarcoplasmique

• Canal Ca2+
Récepteur nicotinique
La jonction neuro-musculaire

3.105 Ach /AChE/min


Récepteur nicotinique

Pharmacologie
CH3 CH3
O +
O +
C O CH2 CH2 N CH3 C O CH2 CH2 N CH3
CH3 CH3 NH2 CH3
Acétylcholine Carbachol

Autres : Pathologie
• Tubocurarine
• Myasthénie
• Physostigmine
Récepteur nicotinique

Pharmacologie
CH3
O +
C O CH2 CH2 N CH3
CH3 CH3
Acétylcholine

Et la toxine botulique ?!
Récepteur muscarinique

Acétylcholine

Effet biologique

Protéine G
Récepteur muscarinique

 
… …
 
Dépolarisation Hyperpolarisation
Récepteur canal ionique
Patch clamp

Etude des canaux ioniques et de la perméabilité membranaire

ddp

Temps (ms)
Récepteur canal ionique
Patch clamp
Echelle : 1 canal
Récepteur canal ionique
Patch clamp

Cellule attachée « Inside out »

2nd
messager
Ligand
Ions

Récepteur-canal Messager intracellulaire


Récepteurs membranaires

Récepteurs
membranaires

À activité Sans activité


enzymatique enzymatique

RTK RTP Canaux Couplés R


(RYK) (RYP) ioniques Prot G cytokines
Phosphorylation
Généralités
Adénine

Groupements
phosphate ATP ADP
Ribose

Protéine kinase
Protéine Protéine
│ │
OH Protéine phosphatase O
I
HO – P = O
Pi H2O I
OH
Phosphorylation
Généralités

Tyrosine (Y) Sérine (S) Thréonine (T)

Tyrosine kinases Sérine-thréonine kinases


Récepteurs : EGF-R, Ins-R… Ex : MAPKs, PKA, PKC, ERK1,2, Raf…
Autres : JAK, Src, MEK…
Récepteurs à activité TK
Mise en évidence de la phosphorylation
de protéines in vitro
ATP 32P
stimulus
Na332PO4 Stimulus
- +
-
cellules en culture

Extraction protéines

Electrophorèse +
SDS-PAGE
Coloration Autoradiographie
Phosphorylation

Un interrupteur biochimique
Phosphorylation
Protéine Kinase A
(PK AMPc-dépendante)

5’AMP

Phosphodiesterase
(PDE)
ATP PP AMPc

PKA
Phosphorylation
Protéine Kinase A

• AMPc

• PKA

Cytoplasme

Noyau
Phosphorylation
Glycogène Glycogène + UDP-glucose
n+1 n

Glycogène Glycogène P
synthase synthase
syntase

PKA

Phosphorylase Phosphorylase P
kinase kinase

Glycogène Glycogène P
phosphorylase phosphorylase
Phosphorylase

Glycogène Glycogène
n n-1
+
Glycolyse glucose 1-P
Récepteurs membranaires
Récepteurs
membranaires

À activité Sans activité


enzymatique enzymatique

RTK RTP Canaux Couplés R


(RYK) (RYP) ioniques Prot G cytokines
Récepteurs à activité TK
Caractères communs
N Protéines transmembranaires

Domaine extracellulaire :
N-terminal, glycosylé, riche en cystéines,
Site de reconnaissance du ligand

Domaine transmembranaire :
hélice , 22-25 aa

Domaine intracellulaire
C
C-terminal, domaine activité TK,
Tyrosines
Récepteurs à activité TK
Principe d’activation
Principe d’activation

P P

P P

P P
Récepteurs à activité TK
Mise en évidence de l’autophosphorylation
Méthode historique :

ATP 32P EGF


Na332PO4

Lysat cellulaire

Electrophorèse + autoradiographie
Récepteurs à activité TK
Mise en évidence de l’autophosphorylation

UnT EGF

EGF-R 170 kDa

Pi-EGF-R 170 kDa

UnT : Non traité (Témoin)


EGF : cellules stimulées avec l’EGF
Récepteurs à activité TK
Principe d’activation

?
Opération séduction en Espagne
la biocel…
Récepteurs à activité TK
Principe d’activation
Récepteurs à activité TK
EGF-R
Récepteurs à activité TK
EGF-R
Domaines SH = Src homology domains

N SH4 SH3 SH2 SH1 C

• SH1 : Tyrosine Kinase activity

• SH2 : pTyr-Met/Val-X-Met

• SH3 : R-X-X-P-X-X-P

• SH4 : myristylation
Récepteurs à activité TK
EGF-R
Src
1911, Peyton ROUS
Rous Sarcoma Virus (RSV) Gag, pol, env, src

Oncogène, proto-oncogène
V-src, c-src
1966, Nobel
EGF-R Récepteurs à activité TK
Récepteurs à activité TK
EGF-R

GRB-2
(Growth Receptor Binding protein)

SH3 SH2 SH3

SOS
(Son Of Sevenless)

RasGEF Pro-rich
Récepteurs à activité TK
EGF-R

Ras
21 kDa
Monomère
GTPase
GTP / GDP
Active / Inactive
Proto-oncogène

Ras/GDP
Récepteurs à activité TK
EGF-R

SOS (GEF)

GAP

GEF : Guanine nucleotide Exchange Factor


GAP : GTPase Activating Protein
Récepteurs membranaires
EGF Récepteur à activité TK

membrane

Ras Ras
GDP GTP Raf MAPKKK
P GRB2 SOS

P MAPKK
MEK MEK
P P
ERK1/2 ERK1/2 MAPK
MAPK… : Mitogen-Activated Kinase (Kinase…)
MEK : MAPK/ERK Kinase Cytoplasme Noyau
ERK : Extracellular signal-Regulated Kinase
Récepteurs
membranaires

ERK
ATP
MEK
ADP
P
P

P P

ERK
SRF : Serum Response Factor
SRE : Serum Response Element
Récepteurs
membranaires

ERK
ATP
MEK
ADP
P
P

P P

ERK
SRF : Serum Response Factor
SRE : Serum Response Element
Récepteurs à activité TK
EGF-R
Récepteurs à activité TK
EGF-R
GF
Récepteurs à activité TK
EGF-R - Cross-Talk
membrane
Ras
P PLC PIP2 DAG Ras
GDP GTP

IP3
RasGRF
Cm
[Ca2+]
Ca2+-dependent Ras activation

Voie PLCγ Voie Ras


Cm : calmoduline
Récepteurs à activité TK
EGF-R
Récepteurs à activité TK
PI3K = phosphatidylinositol-3-OH kinase
Lipide kinase  3’ du cycle inositol des phospho-inositides
membranaires.
PI(4,5)P2  PI (3,4,5)P3 >> PI  PI(3)P ; PI(4)P  PI(3,4)P2

Hétérodimères :
• p110 (110 kDa) : Sous-unité catalytique
• p85 (85 kDa) : Sous-unité régulatrice (2 domaines SH2)

An aval…
• PKB (Akt) & PDK (Phosphoinositide-Dependent Kinase)
• Pleckstrin Homology domain (PH)
Récepteurs à activité TK
PI3K
PIP2
PIP3
Récepteurs à activité TK
Ins-R

 PI3K
IRS : Insulin Receptor Substrate  Grb2/SOS & Ras
Récepteurs à activité TK
Ins-R
Pathologie

Défaut dans la voie de signalisation de l’insuline


Conséquences :
• Hyperglycémie,
• Glycosurie,
•…

• Type 1
Diabète juvénile ou diabète sucré insulino-dépendant (IDDM)

• Type 2
Diabète sucré non insulino-dépendant (NIDDM)
Récepteurs à activité TK
En médecine…
EGR, ErbB, Herceptine et Cie…

EGF

EGF-R EGF-R EGF-R EGF-R


ErbB
/ / / ErbB-2 /
3 ou 4
ErbB-1 ErbB-1 ErbB-1 ErbB-1
Récepteurs à activité TK
En médecine…
EGR, ErbB, Herceptine et Cie…

• EGFR/ErbB-1
•    30 % des cancers du poumon
• Agressivité, mauvais pronostic

• ErbB-2 (HER2/neu)
– Normal: 20 000 - 100 000 recepteurs à la surface d’une cellule
–    nombreux cancers (cell. épithéliales) → 1-2 106 récepteurs
– Cancer du poumon : Agressivité, survie courte
– Oncogène +++
– Orphelin

• ErbB-3, ErbB-4
Récepteurs à activité TK
En médecine…
EGR, ErbB, Herceptine et Cie…

Surexpression de ErbB-2 : Immunohistochimie

Tumeur du poumon Tumeur du poumon


ErbB-2 + ++ ErbB-2 +
Effets de l’activation de Tyrosine
Kinase de EGFR
EGF & cellules cancéreuses
R R

K K

Transcription génique et
progression du cycle
myc cyclin D1

Jun Fos
Effets de l’activation de Tyrosine
Kinase de EGFR
R
EGF & cellules cancéreuses
R

P P
RAS RAF
K K
PI3-K SOS
P
GRB2
MEK

AKT
MAPK

Transcription génique et
progression du cycle
myc cyclin D1
Inhibition de
l’apoptose Jun Fos
Prolifération

Angiogenèse Invasion & metastases


EGR, ErbB, IRESSA, Herceptine & Cie…

R
EGF & cellules cancéreuses
R

P P
RAS RAF
K K
PI3-K SOS
P
GRB2
MEK

AKT
MAPK

Transcription génique et
progression du cycle
myc cyclin D1
Inhibition de
l’apoptose Jun Fos
Prolifération

Angiogenèse Invasion & metastases


Récepteurs à activité TK
En médecine…
EGR, ErbB, Herceptine et Cie…

Herceptin® (Trastuzumab)

• Anticorps monoclonal

• Humanisé

• IV

• ErbB-2

• Inhibiteur
Récepteurs membranaires
Récepteurs
membranaires

À activité Sans activité


enzymatique enzymatique

RTK RTP Canaux Couplés R


(RYK) (RYP) ioniques Prot G cytokines
Récepteurs membranaires
Cytokines

Erythropoïétine (EPO), Interleukines (IL)

Granulocyte Colony-Stimulating
Factor (G-CSF),

Granulocyte Macrophage Colony-


stimulating Factor (GM-CSF),

Thrombopoïétine (TPO),

Prolactine (PRL),

Hormone de croissance (hGH)


Lymphocyte
T Erythrocyte
Récepteurs membranaires
Lymphocyte
B Méga-
caryocyte
pré-T BFU-E
Cellule
dendritique

pré-B
Progéniteur
Macrophage
lymphoïde

Neutrophile
CSF CFU-GM
Flt3L

Cellule Cellule Mastocyte


souche hématopoïétique CFU-GEMM
pluripotente Progéniteur
myéloïde Basophile
Eosinophile
Récepteurs membranaires
EPO-R

Erythropoïétine

165 AA ~ 40% glucides

• Produite par le rein


• Progéniteurs érythrocytaires
• Anémie
Récepteurs membranaires
EPO-R
Prolifération

EPO
Cellule souche BFU-E CFU-E

Maturation

EPO EPO
EPO Réticulocyte Globule
rouge
Récepteurs membranaires
EPO-R
Récepteurs membranaires
EPO-R

IP : anti-EpoR
EpoR WB : anti PY

Epo - +
Récepteurs membranaires
EPO-R

P P P P
JAK JAK JAK JAK

P P

JAK = Janus Kinase ou Just Another Kinase


Récepteurs membranaires
EPO-R

Cytosol P P
STAT JAK JAK
P P
STAT
Noyau P P P P
STAT STAT
STAT Transcription
P P
STAT

STAT : Signal Transducing


Transcription Activator
Récepteurs membranaires
EPO-R
Récepteurs membranaires
EPO-R

P P P P
JAK JAK CIS JAK JAK

CIS P P CIS P P

CIS : Cytokine Inducible SH2-containing proteins SHP-1 : SH2- containing


SOCS : Suppressor of Cytokine Signalling phosphotyrosine Phosphatase -1
Récepteurs membranaires
Récepteurs
membranaires

À activité Sans activité


enzymatique enzymatique

RTK RTP Canaux Couplés R


(RYK) (RYP) ioniques Prot G cytokines
Récepteurs membranaires
Récepteur phosphotyrosine phosphatase

Substrats cytosoliques, membranaires

CD45 / Leucocyte Common Antigen


1 Chaîne transmembranaire.
Cell. hémato. & cell. immun.
Récepteurs membranaires
Récepteurs
membranaires

À activité Sans activité


enzymatique enzymatique

RTK RTP Canaux Couplés R


(RYK) (RYP) ioniques Prot G cytokines

Et les autres !
Récepteurs membranaires
Récepteur guanylyl cyclase
Facteur Natriurétique Atrial (ANF)
• Détection de l’extension (stretch) des fibres musculaires des
oreillettes

prohormone ANF
Pro-ANF (126 aa) (28 aa)
Récepteurs membranaires

Récepteur guanylyl cyclase

Mb pl

Domaine TK

Domaine GC
Récepteurs membranaires
Récepteur guanylyl cyclase
• ANF → R Guanylyl cyclase → cGMP → PKG → phosphorylations
(→ GMP (PDE))

• Rein :
  natriurèse (sortie Na+ + H2O) →  volume plasmatique

 PA
 Cellules musculaires lisses :
  relaxation → vasodilatation
Récepteurs membranaires
Récepteur
guanylyl cyclase
Récepteurs membranaires
Récepteur guanylyl cyclase
The Nobel Prize in Physiology
or Medicine 1998
"for their discoveries concerning nitric oxide as a
signalling molecule in the cardiovascular system"

Robert F. Louis J. Ferid


Furchgott Ignarro Murad

USA USA USA


SUNY Health UCLA School University of
Science Center of Medicine Texas, Health
Brooklyn, NY, USA Los Angeles, Science Center
1916 - CA, USA Dallas, TX, USA
1941 - 1936 -
Récepteurs membranaires
Récepteur guanylyl cyclase
Récepteurs membranaires

Hanahan and Weinberg


Cell 100:57
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