Pelletier Laurent p04

UE2 : Biologie cellulaire
Chapitre 4 :
La communication inter-
cellulaire via les récepteurs
membranaires
Docteur Laurent PELLETIER
Année universitaire 2011/2012
Université Joseph Fourier de Grenoble - Tous droits réservés.
Récepteurs membranaires
• Propriétés générales
• Mise en évidence – caractérisation
• Structure
• Divers types de récepteurs

« Ligand »
Milieu R
« Transduction »
extracellulaire é
c
e
Membrane p
plasmique t
e « Effecteur
Cytosol u primaire »
r
« 2nd
messager »
« Effecteur
secondaire »
Ehrlich, 1910 : « Pour qu’une substance puisse agir, elle doit se fixer »
R membranaires : protéines membranaires intrinsèques

reconnaissant des molécules hydrophiles
(peptides, protéines…)
3 Domaines :
- Extracellulaire
hydrophile (glycosylé)
site de reconnaissance & fixation spécifique du ligand
- Transmembranaire
Séquence(s) hydrophobe(s)
- Intracellulaire
Domaine fonctionnel (Transduction)
Mono / multimère
Ligand
libre Complexe L-R
Récepteur
Liaison de faible énergie

L. hydrogène
L. Van der Waals
L. ioniques
L. hydrophobes
Grand nombre
Sensibles l’environnement (pH, ions…)

Mise en évidence
1. Liaison du ligand marqué (3H, 125I, 14C…)
2. Lavage
3. Mesure du ligand fixé

Interaction ligand-récepteur :

• Réversible 
L R  L R
[ L][ R ]  10-8 M
• Haute affinité Kd 
[ L  R]
• Spécificité
• Capacité limitée
Tous les ligands sont-
ils égaux devant un
récepteur ?
Ligands / Agonistes / Antagonistes
Agoniste
Ligands
Antagoniste - Compétitifs
- Non compétitifs
« Agent qui se lie à un récepteur spécifique en induisant son activation »
« Substance qui se lie à un récepteur spécifique sans provoquer son

activation mais qui peut bloquer l’action d’un médiateur agoniste »
Agoniste
Signal intracellulaire
Antagoniste
Signal intracellulaire
Ligands / Agonistes / Antagonistes
- Curare, -bungarotoxine
- Tétracaïne et Proadifen
FGF
FGF-R3
FGF-R3
- Cellules épithéliales (vessie, prostate) Chondrocytes

- lignée B
 Prolifération  Prolifération
Carcinome Hypochondroplasie,
Nanisme thanatophore
Exemples
VEGF-B VEGF-A Ang-1 Ang-2
1 ligand → x récepteurs + + + + -
&
x ligands → 1 récepteur
Membrane
plasmique
Cytosol
VEGF-R1 VEGF-R2 Tie-2

Cellule endothéliale
1 récepteur → plusieurs ligands
1 ligand → plusieurs récepteurs
1 ligand + 1 récepteur → plusieurs effets (cellules)
Effet cellulaire = F (récepteur, ligand, type cellulaire)
Sans oublier les interactions entre les voies de signalisation !!!

Purification
Purification difficile car - concentration basse
- protéines membranaires
Marquage d’affinité
Chromatographie d’affinité
Clonage par expression
Purification
Marquage d’affinité
O O
C—C
│ │
NH2 NH2 NH2 NH2
NH NH
│ │ │ │
│ │
+
L marqué R L-R Réactif
de pontage L-R
ex : N-hydroxysuccinimide (NHS)
→ Visualisation de R-L*
→ Caractérisation moléculaire (PM en SDS-PAGE)
→ Purification
Purification
Chromatographie
d’affinité
- Support solide
+ ligand spécifique
(agoniste / antagoniste)
- R retenu par liaison au ligand
- R élué par ligand en excès

(ou pH, force ionique)
Récepteurs
membranaires
À activité Sans activité

enzymatique enzymatique
RTK RTP Canaux Couplés R

(RYK) (RYP) ioniques Prot G cytokines
Récepteurs
membranaires


Récepteurs
membranaires


Récepteur canal ionique
Canal ionique = pore aqueux → transport passif d’ions
(sens gradient électrochimique)
Ionotropique Métabotropique
Ionotropique Métabotropique
Acétylcholine Nicotinique Muscarinique
(muscle squelettique) (muscle cardiaque)
Glutamate NMDA, AMPA, kainate mGluR
GABA GABAA GABAB

(Ac. -amino butyrique)
Autres Sérotonine Adrénaline (β-adr.)
Récepteurs cholinergiques
Ionotropique Type Métabotropique
nicotinique Nom muscarinique
rapide Conduction Lente
SNC (10 %) SNC (90 %)

Expression S.N.
+ SNP + SNP
Expression Musc. card.,
Cell. Musc. Sq. périphérique Cell. Endo.
7 Sous-types 5
Excitateur Effet Excitateur / Inhibiteur

Récepteur nicotinique
Structure
pentamérique : 2,  ou 
Monomère : 4 hélices  (M1-M4)

M2→ Canal
Activation
2 Ach → 2 
10 000 Na+ / 0.5 s
Désensibilisation
Ach rapidement dissociée
AchE
Phosphorylation → fermeture
AXONE
MUSCLE
La jonction neuro-musculaire
Sarcolemme
Cellule satellite
Myofibrille
Sarcoplasme
Triade
Citernes Tubule T
terminales
Mitochondrie
Sarcolemme
Filament épais
Filament fin
Myofibrille
Reticulum
Myofibrilles
sarcoplasmique
R. à la Dihydropyridine
• Sarcolemme (Tubule T)
• Canal Ca2+
• Voltage-dépendant
R. à la Ryanodine
• Mb R. sarcoplasmique
• Canal Ca2+
3.105 Ach /AChE/min

Pharmacologie
CH3 CH3
O +
O +
C O CH2 CH2 N CH3 C O CH2 CH2 N CH3
CH3 CH3 NH2 CH3
Acétylcholine Carbachol
Autres : Pathologie
• Tubocurarine
• Myasthénie
• Physostigmine
Pharmacologie
CH3
O +
C O CH2 CH2 N CH3
CH3 CH3
Acétylcholine
Et la toxine botulique ?!
Récepteur muscarinique
Acétylcholine
Effet biologique
Protéine G
Récepteur muscarinique
 
… …
 
Dépolarisation Hyperpolarisation
Patch clamp
Etude des canaux ioniques et de la perméabilité membranaire
ddp
Temps (ms)
Patch clamp
Echelle : 1 canal
Patch clamp
Cellule attachée « Inside out »
2nd
messager
Ligand
Ions
Récepteur-canal Messager intracellulaire

Récepteurs
membranaires


Phosphorylation
Généralités
Adénine
Groupements
phosphate ATP ADP
Ribose
Protéine kinase
Protéine Protéine
│ │
OH Protéine phosphatase O
I
HO – P = O
Pi H2O I
OH
Phosphorylation
Généralités
Tyrosine (Y) Sérine (S) Thréonine (T)
Tyrosine kinases Sérine-thréonine kinases

Récepteurs : EGF-R, Ins-R… Ex : MAPKs, PKA, PKC, ERK1,2, Raf…
Autres : JAK, Src, MEK…
Récepteurs à activité TK
Mise en évidence de la phosphorylation
de protéines in vitro
ATP 32P
stimulus
Na332PO4 Stimulus
- +
-
cellules en culture
Extraction protéines
Electrophorèse +
SDS-PAGE
Coloration Autoradiographie
Phosphorylation
Un interrupteur biochimique
Phosphorylation
Protéine Kinase A
(PK AMPc-dépendante)
5’AMP
Phosphodiesterase
(PDE)
ATP PP AMPc
PKA
Phosphorylation
Protéine Kinase A
• AMPc
• PKA
Cytoplasme
Noyau
Phosphorylation
Glycogène Glycogène + UDP-glucose
n+1 n
Glycogène Glycogène P
synthase synthase
syntase
PKA
Phosphorylase Phosphorylase P
kinase kinase
Glycogène Glycogène P
phosphorylase phosphorylase
Phosphorylase
Glycogène Glycogène
n n-1
+
Glycolyse glucose 1-P
Récepteurs
membranaires


Caractères communs
N Protéines transmembranaires
Domaine extracellulaire :
N-terminal, glycosylé, riche en cystéines,
Site de reconnaissance du ligand
Domaine transmembranaire :
hélice , 22-25 aa
Domaine intracellulaire
C
C-terminal, domaine activité TK,
Tyrosines
Principe d’activation
P P
P P
P P
Mise en évidence de l’autophosphorylation
Méthode historique :
ATP 32P EGF

Na332PO4
Lysat cellulaire
Electrophorèse + autoradiographie
Mise en évidence de l’autophosphorylation
UnT EGF
EGF-R 170 kDa
Pi-EGF-R 170 kDa
UnT : Non traité (Témoin)

EGF : cellules stimulées avec l’EGF
?
Opération séduction en Espagne
la biocel…
EGF-R
EGF-R
Domaines SH = Src homology domains
N SH4 SH3 SH2 SH1 C
• SH1 : Tyrosine Kinase activity
• SH2 : pTyr-Met/Val-X-Met
• SH3 : R-X-X-P-X-X-P
• SH4 : myristylation
EGF-R
Src
1911, Peyton ROUS
Rous Sarcoma Virus (RSV) Gag, pol, env, src
Oncogène, proto-oncogène
V-src, c-src
1966, Nobel
EGF-R Récepteurs à activité TK
EGF-R
GRB-2
(Growth Receptor Binding protein)
SH3 SH2 SH3
SOS
(Son Of Sevenless)
RasGEF Pro-rich
EGF-R
Ras
21 kDa
Monomère
GTPase
GTP / GDP
Active / Inactive
Proto-oncogène
Ras/GDP
EGF-R
SOS (GEF)
GAP
GEF : Guanine nucleotide Exchange Factor

GAP : GTPase Activating Protein
EGF Récepteur à activité TK
membrane
Ras Ras
GDP GTP Raf MAPKKK
P GRB2 SOS
P MAPKK
MEK MEK
P P
ERK1/2 ERK1/2 MAPK
MAPK… : Mitogen-Activated Kinase (Kinase…)
MEK : MAPK/ERK Kinase Cytoplasme Noyau
ERK : Extracellular signal-Regulated Kinase
Récepteurs
membranaires
ERK
ATP
MEK
ADP
P
P
P P
ERK
SRF : Serum Response Factor
SRE : Serum Response Element
Récepteurs
membranaires
ERK
ATP
MEK
ADP
P
P
P P
ERK
SRF : Serum Response Factor
SRE : Serum Response Element
EGF-R
EGF-R
GF
EGF-R - Cross-Talk
membrane
Ras
P PLC PIP2 DAG Ras
GDP GTP
IP3
RasGRF
Cm
[Ca2+]
Ca2+-dependent Ras activation
Voie PLCγ Voie Ras

Cm : calmoduline
EGF-R
PI3K = phosphatidylinositol-3-OH kinase
Lipide kinase  3’ du cycle inositol des phospho-inositides
membranaires.
PI(4,5)P2  PI (3,4,5)P3 >> PI  PI(3)P ; PI(4)P  PI(3,4)P2
Hétérodimères :
• p110 (110 kDa) : Sous-unité catalytique
• p85 (85 kDa) : Sous-unité régulatrice (2 domaines SH2)
An aval…
• PKB (Akt) & PDK (Phosphoinositide-Dependent Kinase)
• Pleckstrin Homology domain (PH)
PI3K
PIP2
PIP3
Ins-R
 PI3K
IRS : Insulin Receptor Substrate  Grb2/SOS & Ras
Ins-R
Pathologie
Défaut dans la voie de signalisation de l’insuline

Conséquences :
• Hyperglycémie,
• Glycosurie,
•…
• Type 1
Diabète juvénile ou diabète sucré insulino-dépendant (IDDM)
• Type 2
Diabète sucré non insulino-dépendant (NIDDM)
En médecine…
EGR, ErbB, Herceptine et Cie…
EGF
EGF-R EGF-R EGF-R EGF-R

ErbB
/ / / ErbB-2 /
3 ou 4
ErbB-1 ErbB-1 ErbB-1 ErbB-1
En médecine…
• EGFR/ErbB-1
•    30 % des cancers du poumon
• Agressivité, mauvais pronostic
• ErbB-2 (HER2/neu)
– Normal: 20 000 - 100 000 recepteurs à la surface d’une cellule
–    nombreux cancers (cell. épithéliales) → 1-2 106 récepteurs
– Cancer du poumon : Agressivité, survie courte
– Oncogène +++
– Orphelin
• ErbB-3, ErbB-4
En médecine…
Surexpression de ErbB-2 : Immunohistochimie
Tumeur du poumon Tumeur du poumon

ErbB-2 + ++ ErbB-2 +
Effets de l’activation de Tyrosine
Kinase de EGFR
EGF & cellules cancéreuses
R R
K K
Transcription génique et
progression du cycle
myc cyclin D1
Jun Fos
Effets de l’activation de Tyrosine
Kinase de EGFR
R
R
P P
RAS RAF
K K
PI3-K SOS
P
GRB2
MEK
AKT
MAPK
myc cyclin D1
Inhibition de
l’apoptose Jun Fos
Prolifération
Angiogenèse Invasion & metastases

EGR, ErbB, IRESSA, Herceptine & Cie…
R
R
P P
RAS RAF
K K
PI3-K SOS
P
GRB2
MEK
AKT
MAPK
myc cyclin D1
Inhibition de
l’apoptose Jun Fos
Prolifération
Angiogenèse Invasion & metastases

En médecine…
Herceptin® (Trastuzumab)
• Anticorps monoclonal
• Humanisé
• IV
• ErbB-2
• Inhibiteur
Récepteurs
membranaires


Cytokines
Erythropoïétine (EPO), Interleukines (IL)
Granulocyte Colony-Stimulating
Factor (G-CSF),
Granulocyte Macrophage Colony-

stimulating Factor (GM-CSF),
Thrombopoïétine (TPO),
Prolactine (PRL),
Hormone de croissance (hGH)

Lymphocyte
T Erythrocyte
Lymphocyte
B Méga-
caryocyte
pré-T BFU-E
Cellule
dendritique
pré-B
Progéniteur
Macrophage
lymphoïde
Neutrophile
CSF CFU-GM
Flt3L
Cellule Cellule Mastocyte

souche hématopoïétique CFU-GEMM
pluripotente Progéniteur
myéloïde Basophile
Eosinophile
EPO-R
Erythropoïétine
165 AA ~ 40% glucides
• Produite par le rein

• Progéniteurs érythrocytaires
• Anémie
EPO-R
Prolifération
EPO
Cellule souche BFU-E CFU-E
Maturation
EPO EPO
EPO Réticulocyte Globule
rouge
EPO-R
EPO-R
IP : anti-EpoR
EpoR WB : anti PY
Epo - +
EPO-R
P P P P
JAK JAK JAK JAK
P P
JAK = Janus Kinase ou Just Another Kinase

EPO-R
Cytosol P P
STAT JAK JAK
P P
STAT
Noyau P P P P
STAT STAT
STAT Transcription
P P
STAT
STAT : Signal Transducing

Transcription Activator
EPO-R
EPO-R
P P P P
JAK JAK CIS JAK JAK
CIS P P CIS P P
CIS : Cytokine Inducible SH2-containing proteins SHP-1 : SH2- containing

SOCS : Suppressor of Cytokine Signalling phosphotyrosine Phosphatase -1
Récepteurs
membranaires


Récepteur phosphotyrosine phosphatase
Substrats cytosoliques, membranaires
CD45 / Leucocyte Common Antigen

1 Chaîne transmembranaire.
Cell. hémato. & cell. immun.
Récepteurs
membranaires


Et les autres !
Récepteur guanylyl cyclase
Facteur Natriurétique Atrial (ANF)
• Détection de l’extension (stretch) des fibres musculaires des
oreillettes
prohormone ANF
Pro-ANF (126 aa) (28 aa)
Mb pl
Domaine TK
Domaine GC
• ANF → R Guanylyl cyclase → cGMP → PKG → phosphorylations
(→ GMP (PDE))
• Rein :
  natriurèse (sortie Na+ + H2O) →  volume plasmatique
 PA
 Cellules musculaires lisses :
  relaxation → vasodilatation
Récepteur
guanylyl cyclase
The Nobel Prize in Physiology
or Medicine 1998
"for their discoveries concerning nitric oxide as a
signalling molecule in the cardiovascular system"
Robert F. Louis J. Ferid

Furchgott Ignarro Murad
USA USA USA

SUNY Health UCLA School University of
Science Center of Medicine Texas, Health
Brooklyn, NY, USA Los Angeles, Science Center
1916 - CA, USA Dallas, TX, USA
1941 - 1936 -
Hanahan and Weinberg

Cell 100:57
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• Mise en évidence – caractérisation

• Divers types de récepteurs

R membranaires : protéines membranaires intrinsèques

Liaison de faible énergie

Sensibles l’environnement (pH, ions…)

1. Liaison du ligand marqué (3H, 125I, 14C…)

3. Mesure du ligand fixé

« Agent qui se lie à un récepteur spécifique en induisant son activation »

« Substance qui se lie à un récepteur spécifique sans provoquer son

- Cellules épithéliales (vessie, prostate) Chondrocytes

VEGF-R1 VEGF-R2 Tie-2

1 récepteur → plusieurs ligands

1 ligand → plusieurs récepteurs

1 ligand + 1 récepteur → plusieurs effets (cellules)

Effet cellulaire = F (récepteur, ligand, type cellulaire)

Sans oublier les interactions entre les voies de signalisation !!!

- R retenu par liaison au ligand

- R élué par ligand en excès

À activité Sans activité

RTK RTP Canaux Couplés R

À activité Sans activité

RTK RTP Canaux Couplés R

À activité Sans activité

RTK RTP Canaux Couplés R

Glutamate NMDA, AMPA, kainate mGluR

GABA GABAA GABAB

nicotinique Nom muscarinique

rapide Conduction Lente

SNC (10 %) SNC (90 %)

Excitateur Effet Excitateur / Inhibiteur

pentamérique : 2,  ou 

Monomère : 4 hélices  (M1-M4)

Ach rapidement dissociée

3.105 Ach /AChE/min

Etude des canaux ioniques et de la perméabilité membranaire

Cellule attachée « Inside out »

Récepteur-canal Messager intracellulaire

À activité Sans activité

RTK RTP Canaux Couplés R

Tyrosine (Y) Sérine (S) Thréonine (T)

Tyrosine kinases Sérine-thréonine kinases

À activité Sans activité

RTK RTP Canaux Couplés R

ATP 32P EGF

EGF-R 170 kDa

Pi-EGF-R 170 kDa

UnT : Non traité (Témoin)

N SH4 SH3 SH2 SH1 C

• SH1 : Tyrosine Kinase activity

SH3 SH2 SH3

GEF : Guanine nucleotide Exchange Factor

Voie PLCγ Voie Ras

Défaut dans la voie de signalisation de l’insuline

EGF-R EGF-R EGF-R EGF-R

Surexpression de ErbB-2 : Immunohistochimie

Tumeur du poumon Tumeur du poumon

Angiogenèse Invasion & metastases

Angiogenèse Invasion & metastases

À activité Sans activité

RTK RTP Canaux Couplés R

Erythropoïétine (EPO), Interleukines (IL)

Granulocyte Macrophage Colony-