ANNEE

MODULE : INITIATION A LA RECHERCHE

ATELIER DE GENETIQUE 01 : EXTRACTION DE L’ADN 2020/2021

INFORMATIONS ETUDIANT

NOM PRENOM

ID_ETUDIANT ETABLISSEMENT

INFORMATIONS ATELIER

ETABISSEMENT & NIVEAU FDA5 DUREE DE L'ATELIER 1 SEANCE : 2H

THEME BIOLOGIE MOLECULAIRE - EXTRACTION ADN

OBJECTIFS EXTRAIRE DE L'ADN CONTENU DANS LES LYMPHOCYTES

FICHE PÉDAGOGIQUE
RESUME
Cette expérience permet aux jeunes médecins de pouvoir observer à l’œil nu un concentré d’ADN qui, stocké dans le noyau des cellules, est normalement invisible.
Le principe est donc d’isoler les brins d’ADN et de les précipiter pour les rendre visibles.
MISE EN CONDITION
Chez les eucaryotes, l’ADN est compacté sous forme de chromosomes dans le noyau cellulaire. Toutes les cellules d’un individu, à l’exception des gamètes (ovules et
spermatozoïdes) contiennent le même patrimoine génétique. En fait, l’ensemble des chromosomes d’une cellule forment une sorte de « carte d’identité » de l’espèce.
LISTE DU MATERIEL NECESSAIRE POUR L’EXPERIENCE
• Sang total
• Tubes 15ml et 1.5ml
• Kit d’extraction Wizard DNA purification (Promega)
• Centrifugeuse
• Bain Marie à 37°C

EXPERIENCE
Le kit de purification de l'ADN génomique Wizard® est conçu pour l'isolement de l'ADN des globules blancs (cellules sanguines), ou de cellules de différents tissus. Il est basé sur
un processus en quatre étapes :
I. LYSE DES GLOBULES ROUGES

Les globules rouges sont dépourvues d’ADN et seront lysées au cours de cette première étape en ne gardant que les globules blancs

II. LYSE DES GLOBULES BLANCS

Dans cette étape nous procédons à la lyse des membranes lipidiques des globules blancs
formée d’une double couche de phospholipides et de la double membrane entourant le
noyau afin de libérer l’ADN. Une digestion par RNase (facultative) peut être incluse à ce
moment et a pour objectif d’éliminer les ARN.

III. PRECIPITATION DES PROTEINES

Les protéines cellulaires sont ensuite éliminées par une étape de précipitation saline, qui précipite les protéines mais laisse l'ADN génomique de haut poids moléculaire en
solution.
IV. PRECIPITATION DE L'ADN

L'ADN génomique est concentré et dessalé par précipitation à l'isopropanol.

Apparition d’une méduse ou pelote d’ADN

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 MODULE : INITIATION A LA RECHERCHE ANNEE
PROTOCOLE DE GENETIQUE 01 : EXTRACTION D'ADN A PARTIR DU SANG TOTAL
- KIT PROMEGA (A1125) - 2020/2021

INFORMATIONS GENERALES

CODE PROTOCOLE PROTO_GEN_01

TYPE DE PROTOCOLE BIOLOGIE MOLÉCULAIRE

INTITULE EXTRACTION D'ADN A PARTIR DU SANG TOTAL - KIT PROMEGA (A1125)

ETABLISSEMENT & NIVEAU FDA 5

PROTOCOLE

L’extraction d’ADN à partir du sang total est la première étape de tout test de génétique constitutionnelle.
Un prélèvement sanguin est réalisé sur tube EDTA et stocker jusqu’au moment d’extraction.

ETAPES

1 Aliquoter 1 ml du sang à partir du tube EDTA dans un tube 15 ml.

2 Ajouter 2mL de la solution Cell Lysis au tube.

3 Secouer le tube de sang doucement pour bien le mélanger.

4 Incuber le mélange 10 minutes à température ambiante (inverser 5-6 fois durant l’incubation) pour lyser les globules rouges.

5 Centrifuger à 2 000 × g (notre centrifugeuse à 3400 rpm) pendant 10 minutes à température ambiante.

6 Jeter le surnageant sans décoller le culot.

7 Ajouter 2 ml de la solution Cell Lysis au tube.

8 Secouer le tube de sang doucement pour bien le mélanger.

9 Incuber le mélange 10 minutes à température ambiante (inverser 5-6 fois durant l’incubation) pour lyser les globules rouges.

10 Centrifuger à 2 000 × g (notre centrifugeuse à 3400 rpm) pendant 10 minutes à température ambiante.

11 Jeter le surnageant sans décoller le culot blanc. Approximativement 50-100 µl du liquide va rester dans le tube de 15 ml.

12 Vortexer vigoureusement 10s à 15s jusqu’à ce que le culot soit bien dégradé.

13 Ajouter 1 ml de la solution Nuclei Lysis au tube, mélanger doucement par up&down 5-6 fois pour lyser les globules blancs. La solution doit apparaître très visqueuse. S’il reste encore d

14 Ajouter 5 µl de RNase au lysat, mixer le mélange en remuant le tube 2-5 fois. Incuber à 37°C pendant 15 minutes et laisser refroidir à température ambiante.

15 Ajouter 350 µl de la solution Protein Precipitation au lysat, vortexer vigoureusement 10-20 secondes. Des petits fragments de protéines peuvent apparaître après le vortex.

NOTE Si un volume additionnel de la solution Nucleic Lysis a été ajouté à l’étape 13, il faut ajouter 400 µl de la solution Protein Precipitation.

16 Centrifuger 2 000 × g (notre centrifugeuse à 3400 rpm) pendant 10 minutes à température ambiante.

17 Transférer le surnageant dans un tube de 15 ml contenant 1 ml d’isopropanol à température ambiante

18 Mélanger doucement la solution en secouant jusqu’à apparition de filaments blancs d’ADN qui forme une masse visible.

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