[TP Tale Spé SVT –Mécanismes de défense du Thym] 13 septembre 2021

Matériel TP et préparation labo

Acheter autant de cubes de levure de boulanger fraîche qu’il y a de groupes de Tale Spé SVT
Commander chez Sordalab au moins 2 semaines avant le TP :
- Des boites de pétri déjà coulées
Ou à défaut
- Des boites de pétri 85 mm stériles (vérifier le stock avant)
- Du milieu à couler NPY (1 L pour 50 boites environ)

Ce TP nécessite de travailler dans des

conditions stériles rigoureuses

1. Si possible commander des boites de pétri déjà coulées, sinon voir 2.

2. Couler les milieux de culture (quelques jours avant, 10 btes de pétri à chaque fois):
 Dévisser légèrement le bouchon d’un flacon de milieu complet YPD (permet de couler une
dizaine de boites environ)
 Mettre le flacon au bain-marie à 100 °C pendant 1h30 à 2h ou au mico-onde 30sec/30sec
si la taille du flacon le permet.
 Surveiller l’avancée de la fonte du milieu (agiter doucement le flacon pour homogénéiser –
attention aux brûlures)
 Pour travailler en conditions stériles, utiliser Les 2 becs électriques verts « microbio »,
espacés de 30 cm, afin de créer la zone de stérilité.
 Allumer les becs et les laisser fonctionner jusqu’à ce que les boites de pétri soient
transférées au réfrigérateur.
 Désinfecter la paillasse et les plaques microbio des becs en vaporisant du spray
désinfectant que l’on laissera agir 5 min avant de l’essuyer.
 Attacher ses cheveux, mettre un masque chirurgical et se désinfecter les mains avec la
solution hydroalcoolique. On se désinfectera les mains autant de fois que nécessaire.
 Couler le milieu dans les boites, 20 mL / boite. (boites et couvercles dans le cône de
stérilité)
 Laisser les boites entrouvertes jusqu’à ce que la condensation disparaisse. Cela peut
prendre plus d’une heure.
 Refermer les couvercles, filmer le tour des boites avec une bande fine de Parafilm (2,5
carreaux de long et 1/3 de carreau de large)
 Les stocker couvercle en bas à +4°C

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3. Matériel à stériliser avant le TP (quelques jours à quelques semaines avant, s’y prendre
à l’avance) :
Stériliser le matériel à la cocotte minute, dans les sachets de stérilisation autocollants prévus à
cet effet (SurgiPack chez NmMedical), pendant 30 min : plaque électrique sur thermostat max
et baisser à 4 quand la cocotte se met à chuchoter.
 Matériel pour la préparation des suspensions de levures
- Tubes à hémolyse + bouchons (1 par binôme + 2 en plus)
- Verrerie pour préparation labo (par groupe)
 1 fiole de 10 mL + 1 fiole de 20 mL
 2 tubes à essais avec leur bouchon de silicone
- 2 pipettes en verre non graduées + poires 1 mL en silicone
- 1 Pipette de 2 mL en verre + poire 1mL en silicone  emballer dans du papier alu
scotché avec de l’adhésif pour stérilisation puis mettre à l’étuve à 150°C pendant au
moins 2 h (ne passe pas dans la cocotte minute)
 5 pipettes + poires pour remplir les Eppendorfs élèves
- 3 grandes (dont 1 en rab) pour prélever l’eau stérile et l’eau javellisée
- 2 petites « élèves » (dont 1 en rab) pour prélever l’huile essentielle
 Flacons en PP autoclavables contenant de l’eau distillée (besoin d’environ 50 mL / groupe
classe)
- 2 par groupe : préparation de la suspention + eau stérile pour le TP (tubes Eppendorfs)
 Sachets élèves (1 par binôme + du surplus) de matériel à encemencer
- 1 râteau à ensemencer en verre
- 1 petite pipette en verre (celle des flacons compte-gouttes 60 mL) montée avec une
poire 1 mL en silicone
 Sachets élèves (1 par binôme + du surplus) de matériel pour les tests
- 1 pince fine
- 1 tube eppendorf à capuche transparent contenant des pastilles de papier filtre
 Tubes Eppendorfs à capuche vides (1 par binôme de chaque + surplus)
- 1 sachet avec des tubes roses (pour l’huile essentielle de thym)
- 1 sachet avec des tubes jaunes (pour l’eau de javel)
- 1 sachet avec des tubes bleu (pour l’eau stérile)
- 1 sachet avec des tubes transparent (pour l’eau stérile du rinçage de la pince)

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4. Préparation de la suspension de levures de boulangerie :

 Se placer en conditions stériles : becs stériles microbio + désinfection
 Pour travailler en conditions stériles, utiliser 2 becs électriques micro-bio (vert)  stérilité
sur la paillasse à 30 centimètres en tous sens
 Allumer les becs électriques et les laisser fonctionner durant tout le temps des
manipulations.
 Désinfecter la paillasse et les plaques microbio des becs en vaporisant du spray
désinfectant que l’on laissera agir 5 min avant de l’essuyer.
 Attacher ses cheveux, mettre un masque chirurgical et se désinfecter les mains avec la
solution hydroalcoolique. On se désinfectera les mains autant de fois que nécessaire.
 Rassembler tout le matériel nécessaire, emballé dans ses sachets stériles, autour du plan
de travail
 Les tubes à hémolyse + leurs bouchons
 Les fioles 10 mL + 20 mL avec leurs bouchons
 Les tubes à essais
 1 portoir 12 tubes à essais pour y déposer les tubes à essais, ensemenceur,
éventuelles pipettes
 4 pipettes compte-gouttes en plastique stériles sous emballage individuel (Labbox)
 1 pipette stérile 2 mL (emballée dans l’alu)
 2 pipettes en verres + poire silicone stériles
 Ensemenceur métallique
 Le cube neuf de levure de boulangerie, toujours emballé
 Les 2 flacons d’eau distillée stérile
 Les différents tubes Eppendorf
 Les pipettes pour le remplissage des tubes Eppendorf
 Déballer le matériel dans le cône de stérilité, au fur et à mesure des besoins.
 Mettre les sachets à la poubelle et le matériel au lavage (bac à proximité) au fur et à
mesure pour ne pas encombrer l’espace de travail.
 Se désinfecter les mains à chaque fois

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 Préparer la suspension de levures

 Verser un peu d’eau distillée dans un tube à essai
 Prélever des colonies de levures dans le cœur du cube de levures de boulanger
(cette zone est stérile car pas en contact avec l’air ambiant) avec l’ensemenceur
(chauffé au rouge et refroidi dans le cône de stérilité ; le poser sur une zone du cœur
du cube où on ne prélèvera pas pour vérifier son refroidissement)
 Les mettre en suspension dans le tube à essai
 Recommencer l’opération jusqu’à obtention d’une solution assez trouble
 Boucher le tube et bien agiter
 Préparer la solution mère de levures
 Prélever 1 mL de la suspension précédente (utiliser un compte-gouttes stérile, la
précision n’est pas importante)
 Verser dans la fiole de 10 mL et compléter avec l’eau distillée (utiliser 1 pipette
stérilisée pour ajuster le volume et conserver ce compte-gouttes dans le flacon d’eau
distillée pour l’ajustement de la 2nde fiole plus tard)
 Boucher la fiole et agiter
 Comptage des levures et calcul de la concentration de la solution mère (Cell / mL)
 Prélever un peu de solution mère avec un compte-gouttes stérile
 Verser une goutte dans une lame Kova
 Observer au microscope grossissement x100 (objectif moyen)
 Compter les levures dans plusieurs petits carrés (5 à 6) et faire une moyenne
 Moy = nb total de levures comptées / nb de carrés comptés
 La moyenne doit être >20
 Si la moyenne est inférieure à 20 : En conditions stériles, prélever un peu plus
de suspension dans le tube à essai et les rajouter dans la fiole de solution
mère.
 Recommencer le comptage
 Calculer la concentration de la solution mère
 1 petit carré de lame Kova contient 0,01 µL. Donc 1 mL = 100 000 carrés de
0,01 µL
 Cm (cell / mL) = moy x 100 000
 Cette concentration doit être supérieure ou égale à 2 000 000 (soit 2.106) : d’où
une moyenne >20
 Préparation de la solution élèves Cé = 2.105 cell / mL
 Calculer le volume de solution mère à prélever (calcul de dilution)
 Cm x Vm = Cé x Vé
 Si Vé = 20 mL (préparation pour une dizaine de binômes)
 Vm (en mL) = (2.105 x 20) / Cm
 Vm (en mL) = (2.105 x 20) / moy x 100 000
 Vm (en mL) = 40 / moy Vm doit être compris entre 1 et 2 mL
 Prélever précisément le volume nécessaire de solution mère (agiter la fiole avant) avec
la pipette de 2mL
 Verser dans la fiole de 20 mL et compléter avec l’eau distillée (utiliser la pipette
conservée pour ajuster le volume, en cas de doute, prendre la 2nde)
 Boucher la fiole et agiter
 Verser 1 à 2 mL dans les tubes à hémolyse et les boucher (compte goutte stérile
Labbox)
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5. Maturation des boites après le TP :

 Désinfecter l’incubateur à l’éthanol
 Allumer l’incubateur à 30° C avant le TP pour que la température se stabilise
 Mettre les boites de pétri tête en bas
 Laisser en culture pendant environ 2 à 3 jours : surveiller la pousse des levures
 Lorsque les levures ont bien poussé, filmer au parafilm et conserver au frais, couvercle en
bas

6. Préparation de l’eau de javel à environ 1%

 Dissoudre une pastille de javel effervescente dans 200 mL d’eau

7. Matériel pour 1 binôme :

 Bec électrique + 1 plaque microbiologie
 1 panier contenant :
- 1 pissette d’eau de javel
- 1 flacon compte-gouttes plastique contenant du savon
- 1 flacon compte-gouttes plastique contenant la solution hydroalcoolique (s’il n’y en a
pas sur les paillasses)
- 2 masques chirurgicaux (sauf si les élèves en portent déjà un)
- 1 feutre verrerie indélébile
- Un bac plastique (glace 1L) contenant de l’eau javellisée
- Une éponge
- 1 rouleau d’essuie-tout
- Le matériel pour ensemencer, stérilisé, dans son sachet individuel de stérilisation
- Le matériel pour réaliser les tests, stérilisé, dans son sachet individuel de stérilisation
- 1 support à Eppendorf contenant les 4 tubes Eppendorfs remplis selon l’étiquetage
suivant
 1 grand chiffon (pour s’essuyer les mains)

8. Au bureau
 Les boites de pétri coulées
 Les tubes à hémolyse de la classe remplis avec la suspension de levures
 Une réserve de masques pour le 2ème groupe (si besoin)

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Principe de la manipulation

Certains végétaux ont développé des mécanismes de défense en émettant des substances toxiques
contre certains micro-organismes pathogènes. On a remarqué que le thym est particulièrement
efficace contre la prolifération des ces derniers.

On cherche à déterminer si l’essence aromatique (huile essentielle) produite par le thym

participe à la lutte contre la prolifération des micro-organismes.

Pour cela, nous allons mettre en culture des levures de boulangerie sur des boites de pétri coulées
avec un milieu nutritif. Ensuite, nous déposerons, sur les géloses, des pastilles de papier filtre
imbibées de différents substrats. Une fois que les levures auront incubé et poussé, nous pourrons
comparer les résultats. Le travail se fait en conditions stériles, le matériel a été stérilisé au préalable.

1. Choix des différents substrats :

Il nous faut deux substrats aux effets connus sur les levures (témoins positifs et négatifs), plus le
substrat test
 Substrat connu pour ne pas avoir d’effet destructeur sur les micros-organismes  Eau
 Substrat ayant un effet connu pour sa destruction des micro-organismes  eau de Javel
 Substrat dont on veut vérifier l’effet sur les micro-organismes  huile essentielle de Thym

2. Manipulation
 Sur le fond de la boite de pétri (boite fermée) placer 3 points, très espacés les uns des autres,
à environ 1,5 cm du bord de la boite. C’est là que seront placées les pastilles
 A côté de ces points, noter les initiales des différents substrats (écrire à l’envers si possible,
cela facilite la lecture des résultats).
- E pour eau stérile
- J pour eau de javel
- T pour huile essentielle de thym
 Déposer une goutte de suspension de levures au milieu de la gélose
 Etaler avec le râteau à ensemencer, avec délicatesse pour ne pas lacérer la gélose, mais en
multipliant les passages pour bien répartir les levures sur toute la surface.
 Réalisation des 3 dépôts
- Avec la pince fine, prélever une pastille de papier filtre
- La tremper dans l’un des substrats et bien l’égoutter sur le rebord du tube Eppendorf
- Déposer la pastille imbibée sur la gélose, sur le point correspondant à sa lettre et
appuyer légèrement dessus pour que la pastille adhère bien à la gélose
- Rincer la pince dans le tube d’eau stérile prévu à cet effet et la sécher à la chaleur du
bec électrique
- Recommencer l’étape 1 pour le dépôt suivant
 Refermer la boite de pétri et la conserver couvercle en bas jusqu’à sa mise en incubation.

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Résultats obtenus

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