VECTEURS 

ET BANQUES

   

yann audic_2009
 VECTEURS ET BANQUES
● DEFINITIONS
● VECTEURS et CLONAGE
– Utilité
– Principe 
– Différents vecteurs / différents usage
● BANQUES 
– Principe
– Banques génomiques
– Banques d'ADNc
   
– Normalisation
 Définitions

Un vecteur est une séquence d'ADN permettant  la propagation, la 
sélection, la modification d'une séquence d'ADN d'intérêt. En bref 
l'étude et la manipulation d'une séquence d'ADN isolée.

Le clonage est l'action d'isoler et d'insérer dans un vecteur un 
fragment d'ADN d'intérêt pour le multiplier à l'identique.

L'ADN génomique est le support physique de l'ensemble des 
gènes de la cellule

l'ADN complémentaire (ADNc) est la copie en ADN des ARNm.
 
    
 ADN génomique
Transcription
AAAAAAA...AAA
pre­ARNm
Epissage
AAAAAAA...AAA ARNm

ARNm

Transcriptase inverse

ADNc

    IN VITRO
 OLIGOdT
AAAAAAAAAAAAA

AAAAAAAAAAAAA
TTTTTTTTTTTTT

Reverse Transcriptase

Oligonucleotide aleatoire : 
un mélange d'oligonucleotides 
de 6 nucleotides de toutes les 
séquences possibles : 46 = 4096

NNNNNN

Reverse Transcriptase
   
 VECTEURS ET BANQUES
● VECTEURS et CLONAGE
– Utilité
– Principe 
– Différents vecteurs / différents usage
● BANQUES 
– Principe
– Banques génomiques
– Banques d'ADNc
  – Normalisation  
 Utilité
● Permet de conserver une séquence d'ADN 
donnée.
● Permet de la multiplier pour en accroître la 
quantité.
● Permet de la modifier pour y introduire des 
mutations, déletions.
● Permet de la réintroduire dans des cellules.

   
 Principes

Circulaire
● Un Vecteur  Linéaire

Procaryote
● Une Cellule hôte Eucaryote

ADN génomique 
● Un fragment d'ADN d'intérêt. ADNc

   
 Différents vecteurs
 pour différentes utilisations
VECTEURS HOTE INSERT (Kb)
Plasmides Bactérie 20
Phages Bactérie 25
BAC Bactérie 300 BAC
YAC Levure 1000

   
 plasmides
Les plasmides sont des molécules d'ADN circulaires naturellement 
présentes dans les bactéries en plus des chromosomes bactérien. Ils ne 
contiennent généralement pas de gènes indispensables à la survie de la 
cellule. Ils apportent des gènes pouvant présenter un avantages dans 
des conditions de cultures particulières (antibiotique, métaux lourd, 
hyper salinité,...) où ils vont apporter un avantage pour la croissance de 
la cellule les possédant.

   
 Plasmide Type
● Origine de replication 
(E.Coli)
● Gene de résistance a 
un Antibiotique
● Site de clonage
● Gènes de sélection
● Origine de réplication 
(Phage)
   
 MCS

● Sites pour enzymes de restriction uniques. 
● Site pour « primer » de séquencage.
● Promoteurs pour RNA polymerase phagiques 
   
(Phages T7,T3).
 pg­ng d'ADN

µg­mg d'ADN
   
 Bacteriophage Lambda

   
 Bacteriophage M13

   
 Bacterial Artificial Chromosomes 
BAC

● parA, parB and repE sont des genes 
requis pour la stabilité du BAC.
● OriS est une origine de réplication
● CM : gène de résistance au 
7.4kb chloramphenicol

   
 BACs
● Avantages :
– Grande capacité d'insertion
– Facilité de manipulation (comme plasmide)
– Hôte bactérien
– Copie unique
– Pas (peu) de réarrangement

   
 YAC

   
 pg­ng d'ADN

µg­mg d'ADN
   
 VECTEURS ET BANQUES
● VECTEURS et CLONAGE
– Utilité
– Principe 
– Différents vecteurs / différents usage
● BANQUES 
– Définition
– Banques génomiques
– Banques d'ADNc
  – Normalisation  
 Définition
Une banque d'ADN est une POPULATION de vecteurs contenant 
des fragment d'ADN divers représentatif d'un type cellulaire, d'un 
génome, d'un stade particulier de développement.

Une Banque est caractérisée par :

­ le type de vecteur
­ la nature des inserts (ADN genomique, ADNc), leur 
origine
­ le pourcentage de vecteurs possédant un insert
­ la taille moyenne des inserts
­ la taille de la banque c.a.d la quantité de clones / 
ml de banque
   
 Construction d'une banque d'ADN 
genomique dans un BAC
ADN Génomique 
fragmenté 

   
 Construction d'une banque d'ADN 
genomique dans un BAC
ADN Génomique 
fragmenté 

   
 Banque non ordonnée vs banque 
ordonnées

Chaque colonie est repiquée individuellement 
  dans un puit de la plaque de 384 puits.
 
 Exemple une banque d'ADN 
génomique humain
Segment 1
Vector pTARBAC1.3
Restriction Enzyme MboI
DNA Source blood
Plate Numbers 1 to 384
Plate Count 384
Empty Wells 1917 (1.3%)
Non­Insert Clones Approx. 3097 (2.1%)
Recombinant Clones 142372
Average Insert Size 156 Kbp
Genomic Coverage 6.7X

1,4 .105 X 156 103 = 2,18 1010  bp
HG = 3,2 109  bp
  Couverture = 6.7 X
 
 Banque ADNc

Polishing of cDNA 
ends

   
 Clonage bout franc

   
 Clonage avec linker

   
 Clonage avec linker

46 = 4096 

   
 Que faire pour éviter de digérer les 
ADNc ?

   
 Clonage directionnel
Reverse transcriptase,methyl­dCTP
dATP,dGTP,dTTP

Rnase H, DNA pol I, dNTPs

EcoRI adaptateurs

Digestion XhoI

   
ADNc permettant clonage directionnel
 MCS

EcoRI Xho I
   
 Les EST
● Une banque permet d'avoir une image des ADNc présents dans le tissu 
étudié. Pour cela, le séquencage partiel de l'ensemble des clones de la 
banques permet d'obtenir des EST ou Expressed Sequence Tag. c.a.d des 
étiquettes des séquences exprimées.

   
 Les EST
● Celles­ci permettent 

1) l'identification des ARNm exprimés.

2) l'attribution d'une identité à chaque clone.

2) Une estimation du niveau d'expression par 
comptage des EST correspondant à un ARNm 
donné.

   
   
 ● Une banque d'ADNc va donc normalement 
représenter sous forme de clones l'ensemble 
des ARNm présent dans le tissus initial.
● La représentation de chaque clone 
représentant en proportion la quantité d'ARNm 
dans la cellule.
● Ceci pose le problème des ARNm rares qui 
peuvent n'être représentés que par 1 clone ou 
même aucun tandis que des ARNm très 
abondant peuvent représenter une proportion 
importante des clones de la banque.  
   
 Criblage différentiel
– Pour déterminer quels sont les gènes 
différentiellement exprimés entre 2 tissus. 
Par exemple, tissus sains versus tissu 
cancéreux

   
 Criblage differentiel

Maspin, a Serpin with Tumor­Suppressing Activity in Human Mammary 
Epithelial Cells (Science, 1994)

   
 LA NORMALISATION DES 
BANQUES
● BUT : Faire que chaque ARNm de la cellule 
quelque soit son nombre de copie dans le 
tissus étudiés soient représentés en nombre de 
clones identique dans la banque.

   
 Banque ADN simple brin

Banque partiellement double 
brin

Sélection vecteur avec double 
brin

Les clones dont la concentration 
est importante reforment du 
double brin ceux dont la 
concentration est faible, non.

Sélection vecteur simple brin = 
Banque Normalisé.

   
 Pour Quoi  Faire ?
● Pour les organiser et automatiser la gestion

● Pour les analyses fonctionnelles (post­
génomique)

   
 Pour Quoi  Faire ?
● Analyses fonctionnelles :

­ Vecteurs d'expression : étude du rôle de la 
protéine X sur tel ou tel mécanisme cellulaire.

Neomycin

pCMV

    Wasserman_film
 ● Criblage fonctionnel : ou QUI FAIT QUOI ?

   
   
 Lecture ?
● Visiter le site du NCBI 
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
● Molecular Cloning: A Laboratory Manual
(Third Edition)