Kaylen Nohely Gonzalez Sanchez

Universidad de Costa Rica
Facultad de Ciencias
Escuela de Biología
Determinación de la diversidad de la microbiota intestinal

asociada al pepino de mar Holothuria (Halodeima) inornata,
Semper, 1898 (Holothuriida: Holothuriidae) en Costa Rica
Tesis para optar por el grado de Licenciatura en Biología con énfasis

en Biotecnología y Biología Molecular
Kaylen Nohely González Sánchez
Carné B53132
Ciudad Universitaria Rodrigo Facio
San José, Costa Rica
2022
1
2
Índice general
Dedicatoria……………………………………………………………………………………..8
Agradecimientos……………………………………………………………………………….9
Resumen………………………………………………………………………………………10
Antecedentes……………………………………………………………………………….. 11
Microbiota intestinal en pepinos de mar………………………………………………………. 11
Metagenómica: herramienta para el estudio de microorganismos………………………... 13
Justificación………………………………………………………………………………... 15
Objetivos…………………………………………………………………………………… 18
Objetivo general………………………………………………………………………………….. 18
Objetivos específicos…………………………………………………………………………….. 18
Metodología………………………………………………………………………………... 19
Estandarización del protocolo de extracción de ADN de la comunidad microbiana del
intestino del pepino de mar H. inornata………………………………………………………. 19
Sitio de muestreo…………………………….…………………………………………………… 20
Obtención de individuos…………………………….…………………………………………... 20
Extracción de ADN y secuenciación masiva del gen 16S ARNr…………………………… 22
Ensamblaje de secuencias y clasificación taxonómica……………………………………… 23
Diversidad de la microbiota intestinal de los individuos de la especie H. inornata…….. 24
Comparación entre microbiota intestinal de H. inornata y A. japonicus…………………. 25
Resultados…………………………………………………………………………………..26
intestino del pepino de mar H. inornata…………………………….………………………… 27
Secuenciación a través de la plataforma Illumina…………………………………………… 28
Riqueza, diversidad y complejidad taxonómica por individuo…………………………….. 29
Relación entre el tamaño y la comunidad microbiana de Holothuria inornata…………. 30
Análisis de las comunidades microbianas de Holothuria inornata………………………... 32
Comparación de la composición de microbiota intestinal entre A. japonicus y H.
inornata…………………………………………………………………………………………….. 40
Discusión…………………………………………………………………………………… 44
intestino del pepino de mar H. inornata………………………………………………………. 44
Riqueza, diversidad y complejidad taxonómica……………………………………………… 45
Relación entre el tamaño y la comunidad microbiana de Holothuria inornata…………. 47
Comunidades microbianas de Holothuria inornata…………………………………………. 47
3
inornata…………………………………………………………………………………………….. 52
Conclusiones…………………………………………………………………………………. 53
Recomendaciones……………………………………………………………………………. 56
Referencias……………………………………………………………………………………57
Anexos………………………………………………………………………………………67
4
Índice de Figuras
Figura 1. Reciclaje de nutrientes por parte de los pepinos de mar…………………….16
Figura 2. Sitio de colecta.……………………….…………………………………….. 21
Figura 3. Procesamiento de muestras.……………………….……………………….. 21
Figura 4. Electroforesis de los ADNs en gel de agarosa al 1 %………………………. 23
Figura 5. Índice de similitud de Bray-Curtis entre las muestras de Apostichopus
japonicus de los diferentes bioproyectos examinados.…………………………………... 26
Figura 6. Evaluación de la calidad del ADN extraído con diferentes métodos………...27
Figura 7. Gráfico de funel de la dispersión del índice de A) distintividad taxonómica
(Delta+) y B) Desviación estándar de la distintividad taxonómica (Lambda+)……….30
Figura 8. Análisis de Escalamiento multidimensional no métrico (nMDS) basado en una
matriz de similitud de Bray-Curtis con los datos de abundancia………………………31
Figura 9. Abundancia relativa de filos por muestra e índice de similitud de Bray Curtis
entre las muestras.………………….…………………………….…………………….. 33
Figura 10. Abundancia relativa a nivel de familia por muestra e índice de similitud de
Bray-Curtis ……………………………............................................................................34
Figura 11. Abundancia relativa a nivel de familia por muestra e índice de similitud de
Bray-Curtis …………………..........................................................................................35
5
Figura 12. Abundancia relativa de géneros por muestra para A. japonicus y H.
inornata…………………………………………………………………………………………….. 41
Figura 13. Shadeplot e índice de Bray Curtis realizado a nivel de familia…………….. 42
Figura 14. NMDS a nivel de familia para las muestras de H. inornata y A. japonicus 43
6
Índice de Cuadros
Cuadro 1. Combinaciones realizadas para evaluar la estandarización de métodos de
colecta y extracción de ADN de la comunidad bacteriana que compone la microbiota
intestinal de la especie de pepino de mar H. inornata………………………………… 20
Cuadro 2. Concentraciones (ng/μl) del ADN extraído del contenido intestinal de los
ocho individuos procesados de la especie H. inornata……………………………………. 23
Cuadro 3. Concentraciones (ng/μl) del ADN extraído del contenido intestinal de H.

inornata con distintos métodos………………………………………………………... 28
Cuadro 4. Información general sobre la cantidad de secuencias obtenidas y procesadas

por individuo…………………………………………………………………………... 28
Cuadro 5. Talla (cm) e Índices de diversidad de Variantes de Secuencia de Amplicon

(ASV) de los individuos de H. inornata colectados en Bahía Culebra, Pacífico Norte de
Costa Rica ……………………………………………………………………………..29
Cuadro 6. Análisis de la similitud porcentual de la contribución de especies

(SIMPER) basado en de las Variantes de Secuencia de Amplicón (ASV) ………….32
Cuadro 7. Porcentaje de similitud de los ASV asignados como Propionigenium dentro

de la microbiota intestinal de H. inornata………………………………………………… 37
Cuadro 8. Porcentaje de similitud de los ASV asignados como Vibrio dentro de la

microbiota intestinal de H. inornata………………………………………………………… 39
7
Dedicatoria
El fruto de mi esfuerzo lo dedico a mi madre. Por haberme acompañado, por haberme

comprendido, por haber estado para mí en cada uno de esos momentos, aun cuando yo
no estuve. También a mi tita. Por haberme enseñado tanto, por toda la formación
humana, por todo el amor. Con el ejemplo de ambas he aprendido el significado de
valentía, esfuerzo y caridad. Son las mujeres de mi vida, mi motor, lo merecen todo.
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Agradecimientos
Culminar esta etapa me llena de emoción y satisfacción. Ha sido un camino largo que
inició hace años y ha tenido más sentido gracias a todas las personas que estuvieron para
mí. Porque somos capaces de alcanzar nuestras metas por nosotros mismos, nuestra
determinación y coraje, pero, ¡qué bonito que personas lindas nos acompañen en el
camino! Gracias infinitas a cada una de esas personas tan importantes para mí, por su
tiempo, compañía, apoyo moral y momentos de dispersión.
Agradezco mucho a mi comité asesor por todo su apoyo. A los colegas del CIMAR por
su ayuda en aspectos logísticos. Agradezco también a mis compañeros del GISiHM por
el apoyo y su retroalimentación a lo largo de todo el proceso.
Casi por último, me agradezco a mí misma por permanecer. Porque este no es solamente
un resultado académico ¡somos más que eso! Así que me agradezco muchísimo por
sobrellevar todos esos componentes de la vida y permitirme llegar hasta aquí.
Finalmente, agradezco a Dios y a la vida, por tanto.
Si la cuerda no fuera delgada, no tendría gracia caminar por ella

Antonio Santa Ana
9
Resumen
La microbiota intestinal se define como la comunidad de bacterias, archaeas y microorganismos
eucariotas que habitan en el intestino de un hospedero. Esta comunidad forma un sistema
dinámico relacionado con el desarrollo del sistema inmune, protección contra patógenos,
fisiología y alimentación del hospedero, favoreciendo la salud del mismo. Cuando se toman en
cuenta genes y metabolitos relacionados con la microbiota, se habla de microbioma. Los pepinos
de mar son organismos exclusivamente marinos que pertenecen a la clase Holothuroidea, del
filo Echinodermata. Poseen papeles ecosistémicos importantes como depredadores, herbívoros
y presas, contribuyen con la transferencia de energía y oxigenación del ecosistema marino,
reducen la estratificación de sedimentos, mejoran la productividad de la biota del bentos y
amortiguan la acidificación oceánica. La microbiota intestinal de los pepinos de mar participa
en la generación de metabolitos y enzimas que les permiten aumentar la tasa de asimilación de
materia orgánica, excreción de fósforo inorgánico y nitrógeno. La microbiota intestinal podría
ejercer un rol importante sobre las funciones ecológicas de los holoturoideos. De acuerdo a la
literatura consultada, a la fecha no existen estudios de microbiota intestinal en organismos
marinos en Costa Rica. En esta investigación se describe la diversidad microbiana del intestino
del pepino de mar Holothuria (Halodeima) inornata Semper, 1968, mediante metagenómica,
estrategia independiente de cultivo. Para caracterizar la comunidad bacteriana se utilizó la
secuenciación masiva del gen 16S ARNr. Se trabajó con 8 organismos de un arrecife rocoso
submareal del Pacífico Norte de Costa Rica. Este estudio de H. inornata determinó que se
obtiene ADN de mejor calidad cuando se utiliza RNAlater para el almacenamiento de las
muestras. La microbiota intestinal es diferente según el tamaño del pepino, siendo más variable,
dinámica y diversa en organismos pequeños (< 11.5 cm largo). Se determinó que Proteobacteria,
Fusobacteria y Bacteroidota son los filos más abundantes y podrían estar ejerciendo roles
metabólicos claves en H. inornata. Propionigenium y Vibrio fueron los géneros más abundantes,
forman parte de la microbiota intestinal de otros invertebrados marinos y tienen metabolismo
fermentativo, por lo que pueden contribuir a la asimilación de materia orgánica en sus
huéspedes, resultando fundamental para que estos cumplan con sus funciones ecosistémicas
como el reciclaje de nutrientes. El análisis comparativo de la microbiota intestinal entre las
especies de pepinos de mar H. inornata y Apostichopus japonicus reveló que la comunidad
central está compuesta por las familias Rhodobacteraceae y Flavobacteriaceae, quienes tienen
roles clave en pepinos de mar, relacionados con el proceso de regeneración intestinal.
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Antecedentes
Microbiota intestinal en pepinos de mar
El intestino de los eucariotas está compuesto por un ecosistema complejo y dinámico de
procariotas, arqueas y eucariotas. A esta comunidad se le conoce como microbiota intestinal
(Zhang et al., 2019a). La microbiota intestinal tiene funciones esenciales para el organismo
hospedero, como por ejemplo: 1) Ejercer un papel crítico en el desarrollo y maduración del
sistema inmune (Nayak, 2010). 2) Participar en la digestión del hospedero sintetizando enzimas,
aminoácidos y metabolitos digestivos esenciales (Skrodenyte-Arbaeiauskiene et al., 2006). La
microbiota intestinal se relaciona con casi todos los aspectos de la salud animal, incluso con su
comportamiento (Collins et al., 2012). Por otro lado, las alteraciones o perturbaciones en la
microbiota intestinal conllevan a enfermedades digestivas o metabólicas (Spor et al., 2011).
La descripción de la microbiota intestinal de un organismo consiste en conocer la
diversidad y abundancia de bacterias aeróbicas, anaeróbicas y facultativas que viven dentro del
intestino. Algunos de los taxones que componen la microbiota intestinal ocurren con una
frecuencia alta y están siempre presentes en los organismos de una misma especie, a estos se les
conoce como comunidad central, o core. Una descripción más completa de la microbiota
intestinal de los organismos se realiza al tomar en cuenta los genes y metabolitos relacionados
con la comunidad bacteriana, en ese caso se habla del microbioma intestinal (Turnbaugh et al.,
2007).
El estudio de la microbiota intestinal tuvo su auge a mediados del siglo XX, ayudado
por los grandes avances tecnológicos de la época y teniendo como foco de estudio a los
humanos, debido al interés por entender el papel de las bacterias y microorganismos en el cuerpo
humano (Nayak, 2010). Cerca de 1970 se comenzó a estudiar la microbiota intestinal en otras
especies, y fue hasta entonces que se realizaron los primeros estudios en organismos marinos
como peces (Savage, 1977; Yoshimizu et al., 1980). La estandarización de métodos y reducción
de costos en esta área de investigación han facilitado su estudio actualmente, permitiendo la
inclusión de grupos como equinodermos, y dentro de ellos a los pepinos de mar (Zhang et al.,
2019a).
Los pepinos de mar son organismos exclusivamente marinos que pertenecen a la clase
Holothuroidea del filo Echinodermata. Este es un grupo abundante y con roles ecosistémicos
importantes como depredadores, herbívoros y presas. Arribas et al. (2016) exponen que existe
una carencia de evaluaciones generales sobre los equinodermos. Se considera, de hecho, que
11
han recibido poca atención en comparación con otros organismos marinos como corales o
crustáceos (Alvarado & Cortés, 2010). Dentro de este grupo existen cerca de 1400 especies
descritas (Pawson, 2007), y particularmente en Costa Rica se han encontrado 73 de ellas
(Alvarado et al., 2017). En nuestro país, los estudios se han enfocado en descripción de especies
nuevas dentro del área de la taxonomía (Arriaga et al., 2014), diversidad (Alvarado & Cortés,
2010) y concentración de metales pesados en diferentes partes del cuerpo (Rojas et al., 1998).
Fuera de Costa Rica, el estudio de la microbiota intestinal en pepinos de mar se ha
realizado en especies como Holothuria (Selenkothuria) glaberrina (Pagan et al., 2019),
Holothuria (Mertensiothuria) leukospilota y Stichopus vastus (Wibowo et al., 2019). Sin
embargo, las investigaciones se han enfocado principalmente en la especie Apostichopus
japonicus. Esto se debe a su gran importancia comercial en Asia, donde se considera que su
consumo evita enfermedades y brinda beneficios nutricionales (Wibowo et al. 2019). Se ha
estudiado cómo varía la comunidad microbiana de esta especie cuando se encuentran en buenas
condiciones de salud, con algún cuadro de enfermedad, con diferentes dietas y al hacer uso de
probióticos para mejorar la salud, crecimiento y producción de los individuos (Yang et al., 2017;
Yang et al., 2019). Son pocos los estudios que mencionan el papel ecosistémico de la comunidad
bacteriana que compone la microbiota intestinal de los pepinos de mar. Zhan et al. (2012)
sugieren que las bacterias pueden jugar un papel en la digestión de los detritos, tanto en las
regiones aeróbicas como anaeróbicas del intestino, mejorando su capacidad de influenciar
positivamente el ecosistema.
En el caso particular de los pepinos de mar, la microbiota intestinal participa en la
generación de metabolitos y enzimas que les permiten aumentar la tasa de asimilación de materia
orgánica normalmente indigerible para otros organismos (Bakus, 1973; Tagliafico et al., 2011;
Zhan et al., 2012). Esta función es también crucial al ecosistema, ya que contribuye a la
oxigenación y transferencia de energía (Vergara & Rodríguez, 2015), reduciendo la
estratificación de sedimentos (Tagliafico et al., 2011).
Otros estudios se han centrado en la posibilidad de relacionar la microbiota intestinal de
los pepinos de mar con aplicaciones medicinales (Zhu et al., 2018). Se ha buscado la detección
y aislamiento del microbioma asociado de holothuroideos al considerarse organismos ricos en
compuestos bioactivos (Wibowo et al., 2019). Extractos orgánicos obtenidos a partir de su
intestino han demostrado tener efectos de inhibición contra cepas patogénicas de bacterias como
Escherichia coli, Salmonella typhi, Pseudomonas aeruginosa y Staphylococcus aureus
12
(Adibpour et al., 2014). Sin embargo, a pesar de la relevancia del tema, no existe ninguna
investigación que caracterice la microbiota intestinal de especies de pepinos de mar dentro del
Pacífico Oriental Tropical.
Metagenómica: herramienta para el estudio de microorganismos

La metagenómica se refiere al conjunto de herramientas que permiten acceder,
almacenar y analizar el ADN extraído de una muestra ambiental, constituida principalmente por
una comunidad microbiana. Esta técnica permite obtener una visión más completa sobre la
ecología y evolución de microorganismos ambientales (Demanèche et al., 2009). Dentro del
campo de herramientas que permiten estudiar la microbiota intestinal se encuentran técnicas
independientes de cultivo, como la metagenómica. Esta facilita el conocimiento de la diversidad
y abundancia de bacterias aeróbicas, anaeróbicas y facultativas que viven dentro del intestino y
de microorganismos transitorios cuyo hábitat es el agua o sedimento. Para estudiar la comunidad
microbiana a partir de la metagenómica, inicialmente se requiere una muestra proveniente del
intestino o de heces del organismo (Wang et al., 2018b). El segundo paso es la extracción de
ADN, para lo cual generalmente se utilizan protocolos estandarizados para suelos, debido a la
estructura física del material intestinal (Zhang et al., 2019b). Posteriormente, se realiza la
amplificación de un gen que permita la identificación taxonómica de la comunidad microbiana.
El gen 16S ARNr se encuentra en todas las bacterias con un alto número de copias
(Reller et al., 2007). La combinación que posee entre regiones variables y conservadas permite
utilizarlo como código de barras para identificar bacterias, con resolución taxonómica a nivel
de especie (Renvoisé et al., 2013). Para estudiar la diversidad de las comunidades se procede a
realizar la amplificación por PCR del amplicon 16S ARNr, conformado por distintas regiones
hipervariables (Xu et al., 2019). Generalmente se amplifican las regiones V3-V4 del gen, que
han demostrado brindar una resolución taxonómica adecuada para la caracterización de
comunidades bacterianas (Drengenes et al. 2021). El análisis continúa con la preparación de
bibliotecas, la secuenciación masiva y finalmente el análisis bioinformático y estadístico de toda
la información obtenida. A partir de este análisis se puede caracterizar la comunidad bacteriana
en las distintas regiones del intestino de los organismos (Wang et al., 2018a) y realizar
comparaciones entre comunidades.
Las identidades taxonómicas se asignan con ayuda de bases de datos de referencia. La
unión de secuencias bajo un umbral de identidad evita que los errores de secuenciación se
13
consideren variaciones nucleotídicas biológicamente reales. Sin embargo, esto también tiene un
costo de resolución taxonómica (Nearing et al., 2018). Como resultado se puede tener una
Unidad Taxonómica Operacional (OTU), que en realidad represente la agrupación de especies
distintas con información genética similar, perdiendo información biológica importante. Por
otro lado, las Variantes de Secuencia de Amplicon (ASVs) permiten la distinción en variantes
de secuencia con diferencias en un único nucleótido, demostrando sensibilidad, especificidad y
resolución taxonómica mejorada con respecto a las OTUs (Needham et al., 2017). Es probable
que, debido al algoritmo de agrupamiento (clustering) los OTUs puedan juntar secuencias que
representan especies distintas, que sí son detectadas y separadas a través de las ASVs.
Actualmente está comprobado que el método de agrupamiento tiene implicaciones en las
interpretaciones biológicas. El método basado en OTUs tiende a subestimar la diversidad
(Edgar, 2017). Además, brindan diferentes resultados de diversidad alfa, afectando sobre todo
la representación de individuos de baja abundancia (Nearing et al., 2018). Se ha comprobado
previamente que las ASVs permiten discriminar de una mejor manera los patrones ecológicos
(Needham et al., 2017).
El empleo de estas técnicas metagenómicas ha ampliado las posibilidades de conocer las
comunidades microbianas que se encuentran asociadas a diferentes ambientes u organismos.
Esto principalmente al ser técnicas independientes de cultivo, que requieren de un menor tiempo
para la detección de ASVs (Hammes et al., 2010) y permiten identificar organismos para los
cuales aún no se conocen los medios de cultivo apropiados para su crecimiento (Rappé &
Giovannoni, 2003). Además, para la caracterización general y preliminar de bacterias que
habitan un ecosistema específico, como el intestino de H. inornata, resulta más práctico el uso
de técnicas independientes de cultivo, permitiendo determinar una mayor cantidad de especies
que forman parte de dicha comunidad a través de un solo método.
14
Justificación
En general, el estudio de la microbiota intestinal en Costa Rica inició hace poco más de
dos décadas, pero ha aumentado en los últimos años. El enfoque inicial de estos estudios se basó
en insectos (Sittenfeld et al., 2002; Warnecke et al., 2007; He et al., 2013). Desde entonces se
han estudiado otros grupos como mamíferos, principalmente primates (Amato et al., 2016;
Mallott et al., 2018; Orkin et al., 2019). También se ha descrito el microbioma intestinal y de la
piel de algunos anfibios (Jiménez & Sommer, 2017; Abarca et al., 2018a; Abarca et al., 2018b;
Jiménez et al., 2020) y aves (San Juan et al., 2020). Además de los estudios de microbiota
intestinal, se ha estudiado la microbiota de suelos (McGee et al., 2019), hidrotermales (Arce et
al., 2019, Uribe et al., 2019) y frutas (Köberl et al., 2016). Según las referencias consultadas,
hasta el día de hoy no existen estudios de microbiota intestinal en organismos marinos en Costa
Rica.
Los pepinos de mar tienen la capacidad de actuar sobre los ecosistemas bentónicos a
través de funciones ecológicas posiblemente mediadas por su microbiota intestinal (Yamazaki
et al., 2019). A pesar de su pequeño tamaño, su alta densidad genera un impacto relevante en el
ecosistema, de hecho, su papel es crítico para la estructura de los sedimentos (Arribas et al.,
2016). Esto se debe a su aporte sobre la productividad del bentos, mediante la bioturbación,
limpieza del sedimento, el reciclaje de nutrientes mediante el consumo de materia orgánica, su
influencia sobre la química del agua al amortiguar la acidificación oceánica (Purcell et al., 2016)
y el mejoramiento del sustrato mediante la adición de nutrientes como amonio y pequeñas
cantidades de fosfato, que constituyen fuente de nutrientes para productores primarios (Uthicke,
2001) (Figura 1). Y debido a las densidades poblacionales de los pepinos de mar, los flujos de
estos nutrientes son altos (Pourcell et al., 2016). Se cree que estos papeles ecológicos son
resultado de la interacción entre los pepinos de mar y su microbiota (Yamazaki et al., 2019), por
lo que se ha propuesto que el estudio de estas funciones ecológicas no debería llevarse a cabo
sin tomar en cuenta sus microbiomas asociados (McFall-Ngai et al., 2013). Esto conlleva a la
necesidad de conocer la comunidad de bacterias que componen la microbiota intestinal de
diferentes especies de holoturoideos, información base que podría servir para futuros estudios
ecológicos.
15
Figura 1. Reciclaje de nutrientes por parte de los pepinos de mar. La imagen representa el ciclo
de consumo de compuestos nitrogenados y con fosfato, que después de ser digeridos se excretan
en formas inorgánicas que pueden ser aprovechadas por productores primarios. Figura adaptada
de Purcell et al. (2016).
Holothuria inornata se distribuye desde el Golfo de California hasta el norte de Perú,

incluyendo las Islas Clarión, Socorro, del Coco y Galápagos (Solís et al., 2009). Esta especie
vive sobre fondos rocosos y someros, de 0 a 18 m y pueden llegar a medir hasta 40 cm (Alvarado
et al., 2013). En Costa Rica, es una de las especies de pepino de mar más comunes en el
intermareal rocoso, siendo sujeto de extracción pesquera; sin embargo, no existen registros ni
regulación legal para esta actividad (Alvarado et al., 2013), poniendo en riesgo sus poblaciones
y los servicios ecosistémicos que brinda esta especie. Sin embargo, estas funciones cruciales al
ecosistema no deberían evaluarse sin entender cuál es el rol de la microbiota intestinal en ellos.
Por lo anterior, es necesario desarrollar un estudio que permita caracterizar de manera general
la microbiota intestinal de H. inornata, con ello establecer información base que permita, en
futuros estudios, comprender cómo se relaciona con los aportes ecológicos de esta especie en la
zona.
Este estudio permite relacionar y comparar la comunidad bacteriana de H. inornata con
las comunidades establecidas en la microbiota intestinal de otras especies de holoturoideos
como A. japonicus. Además, aporta por primera vez información sobre la biodiversidad
16
microbiana presente en una especie de pepino de mar en Costa Rica, y la estandarización de
protocolos de extracción de ADN para este tipo de matrices. Esto es importante porque
proporciona información científica base para futuros estudios relacionados con metagenómica
y ecología, como la identificación de genes posiblemente relacionados con el metabolismo del
nitrógeno y fósforo, que podrían contribuir a la comprensión de los papeles ecológicos de los
pepinos de mar.
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Objetivos
Objetivo general
Caracterizar la diversidad de la microbiota intestinal del pepino de mar Holothuria (Halodeima)
inornata en el Pacífico norte de Costa Rica a través de técnicas de secuenciación masiva.
Objetivos específicos
1) Determinar el método más apropiado para la colecta y extracción de ADN de la

microbiota intestinal de la especie H. inornata.
2) Realizar un análisis bioinformático que permita el ensamblaje, filtrados de calidad y
asignación taxonómica de las secuencias obtenidas a partir de la secuenciación del ADN
extraído de muestras intestinales de H. inornata.
3) Caracterizar taxonómicamente los grupos más abundantes presentes en la microbiota
intestinal de H. inornata a través de secuencias del gen 16S ARNr.
4) Comparar la microbiota intestinal de la especie H. inornata con la de la especie A.
japonicus para determinar si existe una comunidad central.
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Metodología
Estandarización del protocolo de extracción de ADN de la comunidad microbiana
del intestino del pepino de mar H. inornata
El procedimiento de colecta de muestras y extracción de ADN utilizado se detalla
puntualmente más adelante. Para definir dichas técnicas se realizaron comparaciones entre
distintos métodos de colecta y extracción de ADN con el fin de determinar el más adecuado
para estas muestras. Se realizaron cinco pruebas distintas mezclando tres métodos de colecta y
tres de extracción de ADN. La calidad de la extracción de ADN fue evaluada a través de una
electroforesis de Agarosa al 1 % y la cuantificación haciendo uso de un Nanodrop 2000c Thermo
Scientific. Las combinaciones y métodos utilizados se detallan a continuación:
Método de colecta A - Alcohol: Los individuos se colectaron en pozas intermareales, se

congelaron, disectaron y se almacenaron en alcohol 96 %.
Método de colecta B - Nitrógeno: Los individuos se colectaron en pozas intermareales, se
congelaron, disectaron y se almacenaron sin buffer en nitrógeno líquido.
Método de colecta C – RNAlater + Nitrógeno: Los individuos se colectaron en pozas
intermareales, se congelaron, disectaron y se almacenaron en buffer RNAlater y se mantuvieron
congeladas con nitrógeno líquido.
Método de extracción A - Macherey: Uso del kit de extracción de suelos NucleoSpin Soil de
la marca Macherey-Nagel.
Método de extracción B – Extracción con solventes: Uso de los solventes cloroformo y fenol.
Método de extracción C - Qiagen: Uso del kit de extracción para suelos DNeasy Power Soil
de la marca Qiagen.
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Cuadro 1. Combinaciones realizadas para evaluar la estandarización de métodos de colecta y
extracción de ADN de la comunidad bacteriana que compone la microbiota intestinal de la
especie de pepino de mar H. inornata.
Prueba Método de colecta Método de extracción de ADN

1 A - Alcohol C – Dneasy Powe Soil
2 B - Nitrógeno A – Nucleo Spin Soil
3 B - Nitrógeno B – Cloroformo - fenol
4 B - Nitrógeno C - Dneasy Powe Soil
5 C - RNAlater + Nitrógeno C - Dneasy Powe Soil
Sitio de muestreo
La colecta de muestras se llevó a cabo dentro del Golfo de Papagayo, en Bahía
Culebra. Esta es una de las bahías más protegidas en la costa Pacífica de América Central
(Jiménez et al., 2001) y se caracteriza por su alta biodiversidad marina, siendo un foco para el
desarrollo de investigaciones marinas (Cortés, 2012). Además, posee una zona rocosa con alta
presencia de lagunas intermareales donde se pueden encontrar los pepinos de mar. Las muestras
se obtuvieron específicamente de la zona rocosa intermareal del sitio llamado Güiri-Güiri
(10.613675°N -85.690042°W) el 21 de julio 2021.
En el sitio de colecta, el promedio anual (enero – setiembre de 2021) de la temperatura
superficial del agua de mar fue de 27.94 ± 1.14 °C. El día de la colecta, el agua se encontraba a
29.03 ± 0.59 °C. La salinidad anual promedio del agua de mar en esta zona fue de 33.63 ± 0.70
ppm y la concentración de fosfatos fue de 0.19 ± 0.15 μM, amonio 4.79 ± 0.55 μM y nitrato
6.33 ± 0.37 μM (Anexo 1). Estos datos se obtuvieron a través del laboratorio de Oceanografía
Química del CIMAR, UCR.
Obtención de individuos
En el sitio de muestreo se colectaron ocho individuos de la especie H. inornata. A
cada uno de ellos se le asignó un código de colecta, colocando un número del 01 al 08 y las
letras Hi al inicio del identificador. La colecta se realizó manualmente en la zona intermareal
rocosa (Figura 2). Los individuos fueron anestesiados y sacrificados haciendo uso de bajas
temperaturas, se mantuvieron a 4°C durante cuatro horas. Con ayuda de una balanza granataria
de campo se midió la masa de cada individuo. Además, al estar totalmente relajados y
encontrándose extendidos, se tomó la medida de la longitud de cada uno con ayuda de una regla.
20
Seguidamente se realizó una disección de cada organismo para extraer su intestino, el cual se
guardó en un tubo de fondo cónico de 15 ml con el buffer RNAlater (Thermo Scientific ™), se
añadió la cantidad necesaria de buffer para cubrir el material intestinal almacenado (Figura 3
F). El tubo cónico fue transportado hasta el laboratorio en nitrógeno líquido y posteriormente
almacenado a -80°C hasta su uso.
Figura 2. Sitio de colecta de individuos de la especie H. inornata en Bahía Culebra. A. Poza

intermareal de la cual se obtuvieron las muestras, en la zona rocosa de Güiri-Güiri. B. Tres de
los individuos colectados de la especie H. inornata en fondo arenoso. Para distinguirlos mejor,
cada individuo se encuentra señalado con una flecha blanca.
21
Figura 3. Procesamiento de los individuos de la especie H. inornata colectados en Bahía
Culebra. A. Método de medición de longitud corporal, realizado cuando el individuo se
encontraba totalmente relajado y extendido. B. Método de almacenamiento de las muestras en
hielo, desde el sitio de colecta hasta el sitio de procesamiento. C. Método de medida de masa.
D y E. Método de disección de individuos con instrumentos totalmente esterilizados y en
presencia de mechero. F. Almacenamiento del material intestinal en tubos cónicos de 15 mL
con RNALater.
Extracción de ADN y secuenciación masiva del gen 16S ARNr

Con ayuda de pinzas estériles, el contenido fue separado del tejido intestinal. Todo el
material fue mezclado y se tomó una alícuota de 0.2 g. Se realizó la extracción del ADN
utilizando DNeasy Soil Kit (Qiagen ™), siguiendo las indicaciones del fabricante. La calidad
del ADN fue evaluada mediante un gel de agarosa al 1% (Figura 4) y el Nanodrop 2000 (Thermo
Scientific ™) (Cuadro 1). Se consideraron exitosas las muestras que presentaron una banda sin
degradación y una relación 260/280 entre 1.8–2. Bajo estos criterios, todas las extracciones de
ADN fueron exitosas y enviadas a la empresa Macrogen ®, Korea, para la amplificación del
gen 16S ARNr en la región V3-V4, la preparación de bibliotecas y la secuenciación. Se
utilizaron los primers 341F (5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′) y 805R (5′-
GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′) (Klindworth et al. 2012). La secuenciación se llevó a
22
cabo mediante el equipo Illumina Miseq® (pair end read de 300 pb [pares de bases]), siguiendo
la preparación de las bibliotecas Ilumina TruSeq PCR-free Library Preparation.
Figura 4. Electroforesis de ADN genómico perteneciente a cada uno de los individuos

colectados de la especie H. inornata, visualizados en un gel de agarosa al 1 %. El primer carril
posee la escalera molecular de 100 pb. Se muestra en el carril dos y tres ADN poco degradado
(muestras Hi 01 y Hi 02). El resto de las muestras presentan ADN con un alto grado de
degradación.
Cuadro 2. Concentraciones (ng/μl) del ADN extraído del contenido intestinal de los ocho
individuos procesados de la especie H. inornata.
Muestra Concentración de ADN (ng/μl) 260/280

Hi 01 4.6 1.88
Hi 02 10.9 1.94
Hi 03 11.4 1.87
Hi 04 31.8 1.96
Hi 05 12.6 1.9
Hi 06 11.4 1.8
Hi 07 9.3 1.88
Hi 08 14.4 1.79
Ensamblaje de secuencias y clasificación taxonómica

Una vez obtenidos los resultados de secuenciación (archivos en formato .fastq), se
realizó el análisis y procesamiento de las secuencias del gen 16S ARNr a través de las
herramientas bioinformáticas en el clúster del Centro Nacional de Alta Tecnología (CeNAT)
utilizando la herramienta Quantitative Insights Into Microbial Ecology (Qiime2 versión-2019.4)
23
(Bolyen et al., 2018). Para evaluar la calidad de las secuencias y definir la longitud adecuada, el
procesamiento de los datos inició con un análisis de calidad (DADA2). Seguidamente se utilizó
un método de agrupamiento de secuencias basado en ASVs. Se removieron secuencias con un
Phred Score menor a 33 y se cortaron en 220 pb. Posteriormente se realizó un proceso de
filtrado, removiendo secuencias quiméricas, que se derivan de dos o más secuencias originales,
secuencias con abundancia igual a 1, conocidas como singletons y plastidios, mediante la
herramienta Vsearch (Edgar, 2010). Finalmente, se utilizó la base de datos Silva V138 (Quast
et al., 2013) como referencia para el proceso de asignación taxonómica de los ASVs.
Con la información de asignación taxonómica se obtuvo una tabla que constituye la base
de datos principal para los análisis. Se realizó un proceso de depuración de esta base de datos
excluyendo ASVs identificados fuera del dominio Bacteria, como lo son arqueas, mitocondrias,
cloroplastos y eucariotas, donde la mayor representación fue de equinodermos. Los ASVs se
ordenaron según su abundancia y para cada uno se completó la información de los diferentes
rangos taxonómicos con la clasificación taxonómica más alta obtenida. Es decir, si se obtuvo
una identificación solamente a nivel de familia, se completó la casilla de género indicando que
es un ASV sin cultivar de dicha familia. Después de este proceso se realizó una revisión de la
clasificación taxonómica de los ASVs, comprando sus secuencias con las secuencias disponibles
en la base de datos en línea EZBioCloud (Yoon et al., 2017). Además de comprobar la
taxonomía, este proceso permitió obtener información sobre las cepas más similares a los ASVs,
por ejemplo, sitio de colecta y ecosistema en el que se encontraron. Esta revisión se realizó
únicamente con los 500 ASVs más abundantes.
Una vez depurada la tabla, se realizó el primer análisis de datos utilizando Excel
(Microsoft Corporation, 2018). Se realizaron tablas dinámicas para manipular la información y
generar tablas específicas que indicaron la relación entre la abundancia relativa y las categorías
taxonómicas de filo, familia y género. Con la información de estas tablas se generaron gráficos
de abundancia relativa para los ocho individuos.
Diversidad de la microbiota intestinal de los individuos de la especie H. inornata

Para conocer la riqueza de especies se calculó el índice de Margalef (d). Para conocer
la diversidad alfa, se estimaron valores del índice de Shannon-Wiener (H´), equitatividad de
Pielou (J´) y además se realizó un análisis de distintividad taxonómica. Para este último análisis
24
se estimaron los valores de los indicadores Delta y Lambda, basándose en una matriz de
presencia ausencia, estos valores se representaron en un gráfico de funel.
Los pepinos de mar colectados se categorizaron en dos grupos: Grandes y pequeños.
Para evaluar si la comunidad microbiana es diferente entre ambos grupos se realizó un Análisis
de Escalamiento No-Métrico Multidimensional (nNMDS) entre grupos, tomando en
consideración la variable tamaño. Los resultados de esta prueba se evaluaron a través de un
permanova. Además, se realizó una prueba Simper para determinar porcentualmente la
contribución de ASVs por grupo (pequeño, grande).
Todos los análisis anteriores se realizaron en el software Plymouth Routines In
Multivariate Ecological Research (PRIMER7) (Clarke & Goyle, 2015). Para ello los datos
fueron estandarizados y transformados utilizando raíz cuadrada y Log(X+1)) para el análisis de
distintividad taxonómica. Finalmente, se obtuvieron las abundancias relativas de cada filo,
familia y género por muestra.
Comparación entre microbiota intestinal de H. inornata y A. japonicus

Se utilizaron datos crudos (SRA) de libre acceso depositados en Genbank, siete
muestras del bioproyecto PRJNA337986, el cual posee datos de la microbiota intestinal de la
especie A. japonicus, colectados en el año 2016 en dos ambientes distintos naturales en China,
y se encuentran asociadas al trabajo de Wang et al. (2018a). Además, se utilizaron nueve
muestras del bioproyecto PRJNA483340, para este la única información asociada disponible es
que las muestras pertenecen a microbiota intestinal de la especie A. japonicus colectadas en
China. Para ambos bioproyectos la plataforma de secuenciación utilizada fue Illumina Miseq®
(pair end reads de 300pb), misma que se utilizó para las muestras de Costa Rica. Estos datos
fueron sometidos al mismo procesamiento bioinformático y estadístico que se llevó a cabo para
la especie H. inornata, con el fin de generar datos comparables. Para disminuir la homogeneidad
dentro del análisis y utilizar un número menor de muestras sin perder información, se realizó un
análisis de disimilitud de Bray-Curtis con todas las muestras de cada bioproyecto en PRIMER
7 y se removieron las muestras que presentaron una similitud mayor o igual al 80 %. Esto
permitió obtener al menos un representante de cada uno de los clados formados (Figura 5).
Se realizó un análisis de estadística multivariada para determinar la similitud entre
la comunidad microbiana que compone la microbiota intestinal entre ambas especies. Para ello
los datos fueron estandarizados y transformados utilizando la raíz cuadrada. Se utilizó el
25
Análisis de Escalamiento No-Métrico Multidimensional (nNMDS) para mostrar el patrón de
agrupamiento entre las muestras y conocer el porcentaje de similitud entre las mismas. Estos
análisis se realizaron en el programa PRIMER 7 (Clarke & Goyle, 2015). Para determinar las
familias que contribuyen a la similitud entre las muestras y visualizar las agrupaciones entre las
mismas, se construyó un shadeplot. Este es una representación visual de las matrices de
abundancia de datos transformados, tomando en cuenta las 50 familias más contribuyen a la
similitud entre las muestras. Además, se añadieron etiquetas para indicar el filo al que pertenece
cada familia.
Figura 5. Índice de similitud de Bray-Curtis entre las muestras de Apostichopus japonicus de

los bioproyectos PRJNA337986 y PRJNA483340. Las muestras sombreadas con rosado
representan las pertenecientes al bioproyecto PRJNA337986 y las sombreadas con celeste
representan las pertenecientes al bioproyecto PRJNA483340 utilizadas en las comparaciones
posteriores de este estudio.
26
Resultados
El mejor método de colecta de individuos para este análisis fue el que, además de
contemplar la disección in situ y asegurar el mantenimiento de cadena fría hasta la extracción,
contó con un buffer para el almacenamiento del contenido intestinal, RNAlater. El resto de los
métodos de colecta condujeron a extracciones de baja calidad con ADNs muy degradados
(Figura 6). En cuanto al método de extracción, se consideró más eficiente el realizado con el kit
de extracción DNeasy Power Soil, porque dio los mejores resultados cuando se utilizó el método
de colecta B y buenos resultados con el mejor método de colecta (Cuadro 3). Sin embargo, no
se evaluaron otros métodos de extracción con el mejor método de colecta.
Figura 6. Evaluación de la calidad, a través de una electroforesis de agarosa al 1 %, del ADN

extraído de la comunidad bacteriana de la microbiota intestinal de H. inornata con diferentes
métodos. A. Dos muestras por prueba de la uno a la cuatro. B. Ocho muestras de la prueba 5.
27
Cuadro 3. Concentraciones (ng/μl) del ADN extraído del contenido intestinal de H. inornata
con las pruebas de la 1 a la 4. La concentraciones de los ADNs extraídos con la prueba 5 se
encuentran descritas en la metodología, ya que fue el protocolo utilizado para el análisis de los
datos.
Muestra Concentración de ADN

Prueba (ng/μl) 260/280
1 1 7.0 1.23
1 2 40.0 1.88
1 3 10.2 1.69
2 1 11.8 1.78
2 2 1.9 1.89
3 1 3.8 1.79
3 2 11.6 1.88
4 1 6.0 1.96
4 2 8.3 1.88
Secuenciación a través de la plataforma Illumina

El proceso de secuenciación permitió la obtención de 91 228 secuencias promedio por
muestra. Después del análisis de calidad este promedio se redujo a 82 213. Se conservó el 90.1
% de los datos, en promedio por muestra. Los valores por muestra se detallan en el Cuadro 4.
Cuadro 4. Información general sobre la cantidad de secuencias obtenidas y procesadas por

individuo
Total de Secuencias Total de Porcentaje de

Muestra secuencias filtradas por secuencias secuencias
obtenidas calidad utilizadas sobrevivientes
Hi 01 101605 9641 91964 90.5
Hi 02 94010 9189 84821 90.2
Hi 03 110516 11933 98583 89.2
Hi 04 90334 8933 81401 90.1
Hi 05 103186 11013 92173 89.3
Hi 06 85863 8991 76872 89.5
Hi 07 90825 7190 83635 92.1
Hi 08 53488 5226 48262 90.1
28
Riqueza, diversidad y complejidad taxonómica por individuo
Los individuos colectados se encontraban en una poza intermareal, todos en un diámetro
menor a 2 m. Los valores de longitud corporal fueron distintos para cada uno de los individuos,
oscilando entre 9.5 cm y 14 cm. Los individuos se clasificaron como grandes cuando su longitud
fue mayor a 11.5 cm (Cuadro 5).
Los pepinos de mar de la especie H. inornata muestreados, presentaron un promedio de
433 ASVs. La mayor cantidad se encontró en el pepino Hi 06 con 606 ASVs, seguido de Hi_08
con 505 ASVs. La menor cantidad se obtuvo en Hi_01 con 308 ASVs (Cuadro 5).
El individuo Hi 06 muestra la mayor riqueza de especies (d) y la mayor diversidad, según
el índice de Shannon-Weiner y también posee el mayor valor de Delta+: 57.4, 2.524 y 77.52
respectivamente. Después de Hi_06, Hi_08 posee los valores más altos, mientras que Hi_01
presenta una riqueza de 28.75, diversidad 1.803 y Delta+ 65.41, siendo estos los valores más
bajos obtenidos. En cuanto al índice de equitatividad de Pielou (J´), es mayor en el individuo Hi
08 con un valor de 0.9165 y menor en Hi 01 con 0.7246 (Cuadro 5).
Cuadro 5. Talla (cm) e Índices de diversidad de Variantes de Secuencia de Amplicon (ASV)

de los individuos de H. inornata colectados en Bahía Culebra, Pacífico Norte de Costa Rica. S:
especies totales, N: Individuos totales, d: Riqueza de especies de Margalef, J´: Equitatividad de
Pielou; H´: índice de Shannon-Weinner en base a log10; Delta+: Distintividad Taxonómica.
Individuo Talla (cm) ASVs N d J´ H´ Delta+

Hi_01 12 308 43441 28.75 0.7246 1.803 65.41
Hi_02 12 331 44007 30.86 0.7393 1.863 69.93
Hi_03 12.5 500 48009 46.29 0.7638 2.061 71.05
Hi_04 11 469 42586 43.91 0.8107 2.165 73.88
Hi_05 13.5 401 44263 37.39 0.7501 1.953 73.32
Hi_06 9.5 606 37773 57.4 0.9071 2.524 77.52
Hi_07 14 340 43144 31.76 0.7532 1.907 67.67
Hi_08 11.5 505 27953 49.23 0.9165 2.478 74.33
Promedio (±ds) 12±1.40 433±37.0 41394±2160 40.70±3.59 0.7957±0.076 2.904±0.10 71.63±1.63
Los pepinos de mar con talla pequeña (Hi 04, Hi 06 y Hi 08) poseen la mayor cantidad
de ASVs. El pepino pequeño Hi 06 y los grandes Hi 03 y Hi 02 poseen valores de diversidad
taxonómica muy cercanos al promedio (Figura 7.A), esto además sugiere que están compuestas
por más variedad de grupos taxonómicos. Por ejemplo, Hi 01 posee pocos ASVs y la mayoría
29
se encuentra dentro de pocos grupos taxonómicos, por eso su valor del índice Delta+ es bajo.
Al observar los resultados del índice Lambda+, Hi 01 representa la muestra con más diversidad
en cuanto a las clasificaciones taxonómicas más bajas de los ASVs que componen su microbiota.
Es decir, Hi 01 posee pocos ASVs, pertenecientes a las mismas clasificaciones taxonómicas
superiores (filo, clase), pero con más diversidad en las clasificaciones taxonómicas más bajas,
como géneros.
Figura 7. Gráfico de funel de la dispersión del índice de A) distintividad taxonómica (Delta+)

y B) Desviación estándar de la distintividad taxonómica (Lambda+) de las Variantes de
Secuencia de Amplicon (ASV) de los individuos de H. inornata colectados en Bahía Culebra,
Pacífico Norte de Costa Rica. Factor tamaño del pepino de mar: grande (triangulo rosado),
pequeño (triangulo amarillo). Línea punteada representa el valor promedio, líneas de los
extremos los intervalos de confianza. Las regiones sombreadas en morado y celeste representan
las muestras con valores fuera del intervalo de confianza del 95 %.
Relación entre el tamaño y la comunidad microbiana de Holothuria inornata

En cuanto a la similitud en la composición de los ASVs, se observa que todos los
pertenecientes a pepinos de talla grande se agrupan con un 26 % de similitud, mientras que los
pertenecientes a pepinos pequeños están muy dispersos entre sí (Figura 8). A pesar de esto, la
30
composición de ASVs por talla sí difiere de manera significativa (PERMANOVA: Pseudo-F1,6:
1.2345, P= 0.019). En el análisis de la similitud porcentual de la contribución de especies
(SIMPER) basado en los ASVs (Cuadro 6), los pepinos grandes son similares en un 28.41 %,
en donde tan solo 16 ASV contribuyen a un 29.19 % y en su mayoría pertenecen al género
Propionigenium. Por su parte, el grupo pequeño es similar en un menor porcentaje, 19.88 %,
con 21 ASVs que contribuyen a un 30.15 % de esa similitud y los más contribuyentes pertenecen
al género Vibrio. Los grupos son disimilares entre sí en un 77.57%, un total de 380 ASVs los
que contribuyen a un 30% de esa disimilitud (Cuadro 6).
Figura 8. Análisis de Escalamiento multidimensional no métrico (nMDS) basado en una matriz

de similitud de Bray-Curtis con los datos de abundancia transformados (Log(X+1)) de las
Variantes de Secuencia de Amplicon (ASV) de los individuos de Holothuria (Halodeima)
inornata colectados en Bahía Culebra, Pacífico Norte de Costa Rica. Factor tamaño del pepino
de mar: grande (triangulo azul), pequeño (triangulo rojo). ANOSIM: R= 0.528, P =0.018;
PERMANOVA: Pseudo-F1,6: 1.2345, P= 0.019.
31
Cuadro 6. Análisis de la similitud porcentual de la contribución de especies (SIMPER) basado
en de las Variantes de Secuencia de Amplicón (ASV) de los individuos de H. inornata
colectados en Bahía Culebra, Pacífico Norte de Costa Rica.
Grupo grande 28.41 % de similitud

ASVs % acumulado de contribución al grupo
ASV_403, 402, 401, 400, 2533, 399, 1289, 1690, 2532, 2531,
29.19
2530, 1288, 2529, 772, 1294, 1287
Grupo pequeño 19.88 % de similitud
ASV_2533, 772, 2532, 2531, 2530, 1289, 1690, 2529, 403, 1288,
30.15
402, 508, 1287, 1689, 401, 158, 2528, 400, 399, 856, 771
Grupo grande y pequeño 77.57 % de disimilitud
ASV_1155, 29, 2340, 856, 1851, 190, 2501, 1157, 893, 556,
2516, 597, 2020, 2215, 768, 2214, 1812, 1804, 595, 2134, 1662, 3.59 (380 ASV = 30.05%)
2136, 1806, 1676, 2341, 2213
Análisis de las comunidades microbianas de Holothuria inornata

Se asignaron un total de 2577 ASVs. Estos se clasificaron en 33 filos, donde
Proteobacteria fue el más abundante, con una abundancia relativa entre el 38 % y el 58 % en
cada uno de los individuos. El segundo filo que predominó fue Fusobacteriota, con abundancia
relativa entre el 20 % y el 45 %, con excepción en los individuos Hi 06 y Hi 08. El último filo
que destaca en cuánto a abundancia fue Bacteroidota, con valores entre el 10 % y el 18 % de
abundancia relativa. El índice de similitud de Bray-Curtis muestra que, a nivel de filo todas las
muestras tienen una similitud del 73 %. Sin embargo, son más similares entre sí las muestras Hi
06 y Hi 08, con un porcentaje de similitud en su composición de 86 %. El resto de muestras
forma una agrupación con una similitud entre ellas del 83 % (Figura 9).
32
Figura 9. Abundancia relativa a nivel de filos por muestra e índice de similitud de Bray-Curtis
entre las diferentes muestras de H. inornata. En la categoría de otros se incluye a los filos con
una abundancia relativa igual o menor al 1%. Las líneas incompletas indican agrupaciones no
significativas.
De los 33 filos que componen la microbiota intestinal de los individuos de H. inornata

son Proteobacteria, Fusobacteria, Bacteroidota, Desulfobacterota, Actinobacteriota, Firmicutes
y Plantomicetota los filos más abundantes, y comprenden al menos el 85 % de la comunidad
bacteriana. La abundancia relativa de Proteobacteria es muy similar entre las muestras, lo mismo
ocurre con Bacteroidota. En el caso de Fusobacteria, la abundancia relativa difiere mucho en las
muestras Hi 06 y Hi 08, con valores de 3 % y 4 % respectivamente. Por otro lado, los filos con
menor abundancia relativa, así como los pertenecientes a la categoría otros (Anexo 1), son
notablemente más abundantes en dichas muestras: Hi 06 y Hi 08.
33
Se encontraron un total de 207 familias, las más predominantes fueron Fusobacteriaceae
y Vibrionaceae con abundancias relativas entre el 20 % y el 48 % y del 14 % al 38 %
respectivamente, exceptuando las muestras Hi 06 y Hi 08. El índice de similitud de Bray-Curtis
revela que a nivel de familias todas las muestras tienen una similitud del 59 %. Las muestras Hi
06 y Hi 08 forman un clado aparte del resto, con un 70 % de similitud entre ellas. El resto de
muestras tiene una similitud del 65 % (Figura 10).
Figura 10. Abundancia relativa a nivel de familia por muestra e índice de similitud de Bray-
Curtis entre las diferentes muestras de H. inornata. En la categoría de otros se incluye a los
filos con una abundancia relativa igual o menor al 1 %. Las líneas incompletas indican
agrupaciones no significativas.
Por otro lado, se obtuvieron un total de 222 géneros, donde Propionigenium destaca
como el más abundante, con abundancia relativa entre el 19 % y el 44 %, excluyendo las
34
muestras de los individuos Hi 06 y Hi 08. Seguido del género Vibrio con abundancia relativa
entre el 12 % y el 36 %. A nivel de género las muestras son muy diferentes ent re sí,
compartiendo apenas un 20 %, según el análisis de similitud de Bray-Curtis. Al excluir las
muestras Hi 06 y Hi 08, la similitud entre el resto de las muestras aumenta a 40 %. (Figura 11).
Figura 11. Abundancia relativa a nivel de géneros por muestra de H. inornata. En la categoría
de otros se incluye a los filos con una abundancia relativa igual o menor al 1 %. Las líneas
incompletas indican agrupaciones no significativas.
Las Figuras 10 y 11 muestran las 13 familias y los 9 géneros con mayor abundancia
relativa en la comunidad de bacterias que componen la microbiota intestinal de H. inornata.
Como ya se mencionó anteriormente, Proteobacteria es el filo más representado, con cinco
familias y cuatro géneros. Fusobacteriota se encuentra representado por una única familia que
es Fusobacteriacea, y dos géneros, además, éstos son la familia y el género con mayor
abundancia relativa. Los distintos géneros y familias poseen rangos de abundancias relativas,
35
en términos generales, similares en las diferentes muestras. Destacan nuevamente Hi 06 y Hi 08
como excepción, ya que los grupos más abundantes en ellas son los menos abundantes en el
resto de las muestras, y viceversa. También se observa una variación particular para el individuo
Hi 07.
Como se indicó anteriormente, uno de los géneros más abundantes fue Propionigenium,
sin embargo; no es el género que más ASVs tiene asignados. Se asignó un total de 12 ASVs a
Propionigenium. La clasificación taxonómica de estos ASVs fue confirmada utilizando EZBio.
Dentro de los resultados generales vale la pena mencionar que ASVs previamente clasificados
como género Propionigenium, tuvieron un porcentaje de similitud del 98.18 % con secuencias
clasificadas como Ilyobacter insuetus, otras como Propionigenium maris con una similitud de
97.93 %. Estos ASVs más abundantes se asocian con muestras colectadas en sedimento marino
rico en materia orgánica (Cuadro 7).
36
Cuadro 7. Porcentaje de similitud de los ASV asignados como Propionigenium dentro de la microbiota intestinal de H. inornata, con la
especie más similar según la base de datos EZBio, nombre de la cepa a la que pertenece, sitio donde fue encontrada y referencia bibliográfica.
ASV Accesión Especie más similar Cepa Similitud (%) Aislado de Referencia
DSM Sedimento
ASV 1 AJ307980 Ilyobacter insuetus 6831 98.18 marino Brune et al., 2002
DSM Sedimento
DSM Sedimento
DSM Sedimento
DSM Sedimento
Propionigenium Sedimento
ASV 6 X84049 maris 10succ1 97.73 estuarino Janssen & Liesack 1995
37
El segundo género más abundante fue Vibrio. Se asignaron un total de 68 ASVs como
diferentes especies de este género. Los cinco ASVs con más secuencias fueron identificados como
Vibrio hepatarius con un porcentaje de similitud de 97.25 %. Otros ASVs definidos previamente
como Vibrio, se identificaron clonas de Vibrio japonicus, Vibrio maritimus, Vibrio sinaloensis,
Vibrio sinensis, entre otros, con porcentajes de similitud que varían entre los 96.76 y 100 % (Cuadro
6). Estas secuencias de referencia se han encontrado formando parte de la microbiota intestinal de
peces, corales, langostas, almejas y ambientes marinos en general (Gomez-Gil et al., 2008;
Chimetto et al., 2011; Yoshizawaet al., 2012; Richards et al., 2014; Xu et al., 2009). Además de
formar parte de la microbiota intestinal de muchas especies, también existen cepas de Vibrio
patogénicas para pepinos de mar, como Vibrio splendidus, Vibrio alginolyticus y Vibrio
cyclitrophicus (Deng et al., 2019).
38
Cuadro 8. Porcentaje de similitud de los ASV asignados como Vibrio dentro de la microbiota intestinal de H. inornata, con la especie más
similar según la base de datos EZBio, nombre de la cepa a la que pertenece, sitio donde fue encontrada y referencia bibliográfica
Similitud
ASV Accesión Mejor hit Cepa Aislado de Referencia
(%)
ASV 13 AJ345063 Vibrio hepatarius LMG 20362 97.25 Ambiente marino Thompson et al 2003
ASV 18 MW934528.1 Vibrio japonicus JCM 31412 98.56 Agua marina
ASV 19 GU929925 Vibrio maritimus R-40493 99.53 Asociado a coral Chimetto et al 2011
Gomez-Gil et al.
ASV 20 NR_043858.1 Vibrio sinaloensis CAIM 797 98.62 Bazo de pez
2008
ASV 21 HE613734 Vibrio aestivus M22 97.73 Agua marina Lucena et al. 2012
ASV 22 NZ_JXXV00000000.1 Vibrio galatheae S2757 99.55 Mejillón Machado et al. 2015
ASV 23 NZ_CAKLDI000000000.1 Vibrio stylophorae KTW-12 97.73 Asociado a coral -
ASV 24 NZ_QVMU00000000 Vibrio sinensis BEI233 99.09 Agua marina -
ASV 25 NZ_ABCH00000000.1 Vibrio shilonii AK1 98.64 - -
ASV 27 GU929925 Vibrio maritimus R-40493 100 Asociado a coral Chimetto et al 2011
Asociado a
ASV 28 NZ_ATWU00000000.1 Vibrio natriegens DSM 759 99.55 Maida et al. 2013
marismas
ASV 29 NZ_JTKH00000000.1 Vibrio renipiscarius DCR 1-4-2 98.64 Asociado a pez Arahal et al. 2015
Asociado a
ASV 31 TCFB 0772 Vibrio jasicida NR_113182.1 99.55 Yoshizawaet al. 2012
langosta
Asociado a
ASV 32 NZ_ATWU00000000.1 Vibrio natriegens DSM 759 99.55 Maida et al. 2013
marismas
ASV 33 GU929925 Vibrio maritimus R-40493 100 Asociado a coral Chimetto et al 2011
ASV 34 NR_117550.1 Vibrio variabilis R-40492 99.54 Asociado a coral Chimetto et al 2011
39
Vibrio tapetis subsp. Balboa & Romalde
ASV 35 NR_132307.1 HH6087 98.64 Asociado a pez
Britannicus 2013
ASV 37 GU266284.1 Vibrio xuii LMG 21346 100 Asociado a coral Chimetto et al 2011
ASV 39 NR_113604.1 Vibrio parahaemolyticus NBRC 12711 99.55 - -
ASV 41 GU266284.1 Vibrio xuii LMG 21346 100 Asociado a coral Chimetto et al 2011
Vibrio tapetis subsp. Balboa & Romalde
ASV 43 NR_132307.1 HH6087 99.09 Asociado a pez
Britannicus 2013
ASV 44 NR_113604.1 Vibrio parahaemolyticus NBRC 12711 100 - -
ASV 51 NR_044396.1 Vibrio hangzhouensis CN83 99.55 Sedimento marino Xu et al. 2009
ASV 52 AP014636.1 Vibrio tritonius JCM 16456 99.55 - -
Asociado a
ASV 53 NR_113182. Vibrio jasicida TCFB 0772 99.55 Yoshizawaet al. 2012
langosta
Asociado a
ASV 55 NZ_LHPJ00000000.1 Vibrio nereis DSM 19584 99.18 Sea et al. 2015
mejillón
Asociado a
ASV 56 CP009359.1 Vibrio tubiashii ATCC 19109 99.55 Richards et al. 2014
almeja
40
inornata
En el análisis comparativo de la microbiota entre estas especies de pepinos, se
encontraron un total de 726 ASVs. De estos, 305 son exclusivos de las muestras provenientes de
la especie A. japonicus, mientras 113 son exclusivos de H. inornata. Ambas especies comparten la
presencia de 308 ASVs. Sin embargo, la abundancia relativa de esos ASVs parece distribuirse de
una manera distinta en cada especie, ya que no se observan patrones compartidos entre las muestras
de ambas especies (Figura 12).
Figura 12. Abundancia relativa de géneros por muestra para A. japonicus (códigos 40110 y 76191)
y H. inornata (códigos Hi).
A nivel de familia, la similitud entre las muestras fue del 20 % (Figura 13). Se observa
que varias familias son más abundantes en H. inornata y otras son más abundantes para cada uno
de los bioproyectos de A. japonicus. Entre esta exclusividad destaca la familia Fusobacteraceae,
41
quien es muy abundante y casi exclusiva en las muestras de H. inornata. Vibronaceae también
destaca en cuanto abundancia para H. inornata, sin embargo, también se comparte con A. japonicus
en uno de los bioproyectos. Por otro lado, estos resultados indican que sí existe una comunidad
central o core de microorganismos compartidos entre ambas especies, pero se reduce a tres
familias: Rhodobacteraceae, Flavobacteriaceae y unc_Bacteria. Por ende, la comunidad central se
restringe a los filos Proteobacteria y Bacteroidota.
Esta diferenciación entre especies también es detectable en el resultado del nMDS
(Figura 14). Se observa que entre especies la similitud no es mayor al 20 %, y de hecho, esta
similitud se encuentra solamente entre las muestras de H. inornata y las muestras de A. japonicus
de uno de los bioproyectos. A nivel de familia la similitud alcanza un 60 % entre las muestras de
H. inornata.
Figura 13. Shadeplot e índice de Bray Curtis realizado a nivel de familia para la comunidad
bacteriana que compone la microbiota intestinal de las especies H inornata y A. japonicus. Los
tonos rosados representan las familias con mayor abundancia de ASVs.
42
Figura 14. nMDS a nivel de familia para las muestras de H. inornata y A. japonicus. Las
muestras de A. japonicus de la izquierda pertenecen al bioproyecto PRJNA337986 y las de la
derecha al PRJNA483340.
43
Discusión
En estudios de biología molecular algunos investigadores suelen almacenar los tejidos
que necesitan para extraer el ADN en etanol. Esto sucede por varias razones, un principio teórico
que respalda esta práctica es que este solvente inactiva enzimas y metabolitos secundarios que
pueden causar la ruptura del ADN (Berkelmans et al., 2014). Un principio práctico es que es un
reactivo fácil de trasladar al campo para mantener el tejido en almacenamiento desde su colecta,
sin altos cuidados (solamente por su flamabilidad) o preparaciones y de bajo costo (Bressan et al.,
2014). Sin embargo, tal como en este estudio, se ha demostrado que la extracción de ADN de
tejidos almacenados en alcohol genera ADN degradado y de baja concentración, aunque parece
que esta degradación sucede durante el proceso de extracción más que durante el almacenamiento,
y se podría mejorar dejando reposar el tejido en un buffer de lisis antes de la extracción (Kilpatrick,
2002).
El almacenamiento de muestras en nitrógeno líquido para extracción de ADN se ha
recomendado como una técnica que disminuye la probabilidad de obtener ADN degradado (Sahu
et al., 2012). Esta es una de las técnicas más utilizadas para la extracción de ADN de bacterias
presentes en el contenido intestinal de pepinos de mar (Zhang et al., 2019a; Zhao et al., 2019;
Zhang et al., 2019b). De hecho, el método de disección, almacenamiento inmediato del tejido en
nitrógeno líquido y extracción del ADN con un kit de suelos Qiagen, fue previamente utilizado
para extraer el ADN de la comunidad bacteriana de la microbiota intestinal del pepino de mar A.
japonicus (Jia et al., 2020; Hu et al., 2019). Sin embargo, este método no funcionó para la especie
H. inornata.
El método de extracción con el que se obtuvo mejores resultados fue el practicado después
de utilizar el buffer RNAlater en la colecta del material. Este buffer consiste en una mezcla de sales
que penetran la célula, permite conservar el ADN y asegura un mejor rendimiento en la extracción
del ADN en comparación con otros métodos de almacenamiento de tejidos. Además, tiene el
beneficio colateral de que las muestras almacenadas en este buffer pueden procesarse
posteriormente para extraer ADN o realizar histología (Gray et al., 2013).
Esta comparación evidencia que el contenido intestinal de la especie de pepino H. inornata
requiere de un buen método de almacenamiento antes de la extracción, tal como lo es el buffer
44
RNAlater. En cuanto a los métodos de extracción de ADN, no se puede definir con certeza si uno
es mejor puesto que no se realizaron comparaciones con el método de colecta más adecuado. Es
muy importante destacar que el método de extracción se estandarizó con éxito y puede probarse
para otras especies tropicales, para las cuales no hay mucha información al respecto.
Riqueza, diversidad y complejidad taxonómica

Los factores ambientales tienen una influencia directa sobre las comunidades microbianas
(Zhang et al., 2019a) y hay una correlación entre los factores del entorno y la comunidad de la
microbiota intestinal de los organismos (Ley et al., 2006). Considerando esto y que los individuos
aquí analizados fueron colectados de una misma poza intermareal, se esperaría que los valores de
alfa y beta diversidad de estos individuos sea similar. Sin embargo, se detectaron algunas
diferencias que se detallan a continuación.
Los pepinos de mar clasificados como pequeños (Hi 06, Hi, 08, Hi 04) y el grande Hi 03
son los cuatro individuos con mayores valores de riqueza y diversidad de ASVs. Varios factores
tienen influencia sobre la composición, riqueza y diversidad de la comunidad microbiana que forma
parte de la microbiota de los organismos. Algunos de estos factores son la salud, la edad y el
ambiente al que esté expuesto el hospedero (Zhang et al., 2019a).
En pepinos de mar se ha demostrado que condiciones de enfermedad producen una
disminución en cuanto a la riqueza y diversidad de la comunidad microbiana intestinal (Zhang et
al., 2019a). Se desconoce si este fenómeno puede estar afectando la riqueza o diversidad de las
muestras de H. inornata, ya que no se tiene información sobre su estado de salud; sin embargo, no
se observaron síntomas externos de alguna enfermedad. Las dos muestras que poseen valores
mayores de riqueza y diversidad son Hi 06 y Hi 08. Al aceptar la hipótesis de la enfermedad,
explicada anteriormente, asumiríamos que estas dos muestras están en mejores condiciones de
salud que el resto. Esto es consistente con la información aportada por Zhang et al. (2019b) quienes
explican que ante alteraciones en la salud de pepinos de mar, causadas por Vibrio, las comunidades
de Flavobactericeae aumentan, y de hecho, son los individuos Hi 06 y Hi 08 quienes tienen menor
abundancia relativa de esta familia. Sin embargo, este estudio carece de evidencia para atribuir las
diferencias de riqueza y diversidad al estado de salud de los individuos muestreados.
Por otro lado, Zhang et al. (2019a) también determinan que los valores de diversidad alfa
difieren según la región intestinal que se esté analizando. Esto se ha evidenciado en otros
organismos marinos como el pez kifósido Kyphosus sydneyanus (Moran et al., 2005). Zhang et al.
45
(2019a) adjudican estas diferencias a la dieta, pH del lumen intestinal y comunidades autóctonas
de cada una de estas regiones intestinales de pepinos de mar, ya que cada región cumple una
función específica, por lo que requerimientos estructurales y funcionales de su microbiota también
deben ser específicos.
La diferencia en términos de riqueza y diversidad de especies que habitan las distintas zonas
intestinales no se consideró en este estudio. Al hacer una sola muestra de todo el contenido
intestinal se perdió la diferenciación por zona, por lo que se desconoce si se obtuvo más material
de una región intestinal específica y cómo esto pudo afectar los resultados de diversidad detectados.
Se sugiere que los valores de diversidad observados pueden estar influenciadas por las porciones
diferenciales de cada zona intestinal.
La microbiota intestinal ejerce roles específicos y fundamentales sobre el hospedero, por
ejemplo, ya se ha mencionado su influencia sobre el sistema inmune y digestivo. Esta comunidad
microbiana también tiene la capacidad de influenciar el crecimiento del hospedero especialmente
a través de funciones digestivas, proporcionando maduración y homeostasis del epitelio intestinal
(Schwarzer et al., 2018). Conforme ocurre esta maduración, la microbiota intestinal de pepinos de
mar va cambiando y la comunidad se hace más estable cuando alcanzan la adultez (Yamazaki et
al., 2019). Esto ocurre también en otras especies de invertebrados como por ejemplo la langosta
Panulirus ornatus (Ooi et al., 2017) y la mosca Drosophila melanogaster (Schwarzer et al., 2018).
Estos cambios que ocurren en la microbiota intestinal durante el crecimiento y maduración
de los hospederos también podría explicar las variaciones en términos de abundancia, riqueza y
diversidad de ASVs. La edad de los pepinos de mar puede relacionarse con su longitud, por
ejemplo, se ha calculado que para individuos de 22 cm la edad se aproxima a 5 años (Ramos-
Ramírez, 2013). A partir de esto se puede inferir que los individuos Hi 06, Hi, 04 y Hi 08 son más
jóvenes. Debido a la edad y maduración, la microbiota intestinal de estos individuos es más
cambiante, y probablemente por esto se encuentra enriquecida con una mayor cantidad de ASVs
que podrían ser transitorios debido al estado de maduración.
Con respecto al índice de diversidad taxonómica, no hay una distinción a destacar entre el
grupo grande y pequeño. A pesar de que los pepinos pequeños poseen mayores valores de
diversidad, como Shannon, no son precisamente los que poseen más diversidad taxonómica. De
hecho, el análisis revela la riqueza de la muestra Hi 01, que aun teniendo pocos ASVs y un valor
de Shannon más bajo que el resto, tiene una buena representación taxonómica de distintos grupos.
Este índice también revela la importancia de tomar en cuenta siempre las clasificaciones
46
taxonómicas superiores, permitiendo tener una perspectiva más completa de la composición y
diversidad taxonómica.
Relación entre el tamaño y la comunidad microbiana de Holothuria inornata

El hecho de que la etapa de desarrollo del hospedero influencia la comunidad bacteriana
que compone la microbiota intestinal (Benson et al., 2010) podría explicar las diferencias
encontradas entre los grupos grande y pequeño. Como se explicó anteriormente, la microbiota
intestinal de los pepinos de mar cambia conforme crecen los individuos y son precisamente estos
cambios los que se ven reflejados en la figura 7. Otros estudios han encontrado esas diferencias de
composición según el tamaño de pepino de mar (Yamazaki et al., 2016), además, la variación de
esta comunidad microbiana durante la juventud de los hospederos y su estabilización en la edad
adulta es normal en muchos organismos, tal como ocurre en humanos (Bokulich et al., 2016).
Entonces, se comprende que debido a aspectos de desarrollo y maduración, la
microbiota intestinal de los pepinos que pertenecen al grupo grande difiere de la que caracteriza al
grupo pequeño. Ahora bien, el grupo pequeño tiene una similitud a penas del 19.88 %, y esto
podría entenderse debido al dinamismo que ocurre dentro de los hospederos juveniles. Si bien es
cierto todos se encuentran dentro de la categoría de pepinos pequeños, se carece de información
exacta de la edad de los individuos, que determina la presencia de especies.
Comunidades microbianas de Holothuria inornata

Como en este estudio, la predominancia del filo Proteobacteria en la microbiota intestinal
ha sido descrita para otras especies de pepinos de mar (Gao et al., 2014; Yang et al., 2015;
Yamazaki et al., 2016; Ma et al., 2018; Wang et al., 2018a; Wang et al. 2018b; Wibowo et al.,
2019; Yamazaki et al., 2019; Xu et al., 2019; Jia et al. 2020). Las proteobacterias son bacterias
Gram negativas que habitan distintos entornos, pero se consideran el filo más abundante en
ambientes marinos (Joint et al., 2010). Debido a esta gran abundancia podría considerarse común
encontrar proteobacterias en análisis de comunidades bacterianas en estos ambientes. Algunas
investigaciones sugieren que las beta-proteobacterias, específicamente, son particularmente
abundantes en ríos, mientras que las alfa-proteobacterias y gamma-proteobacterias son muy
abundantes en ambientes marinos (Glöckner Fuchs & Amann 1999; Cottrell & Kirchman 2000a;
Cottrell & Kirchman 2000b9; Eilers et al., 2000). Esto es consistente con los resultados de este
estudio, donde gamma-proteobacteria es la clase más abundante de Proteobacteria en estas
47
muestras (Figura 6). Las proteobacterias tienen la capacidad de ejercer muchos roles funcionales,
esto les permite ser ampliamente abundantes, por ejemplo, en los océanos (Zhou et al., 2020). En
los sistemas hospedero - microorganismo las gammaproteobacterias tienen la capacidad de oxidar
azufre reducido, metano, hidrógeno y monóxido de carbono (Li et al., 2018). Además, otras
proteobacterias se han descrito con potencial reductor de nitrógeno (Zhou et al., 2020). Es
importante mencionar que estos roles metabólicos pueden ser diferentes según el organismo
hospedero, por lo que se debe estudiar más a fondo la relación H. inornata - gammaproteobacterias,
para comprender mejor el papel que éstas ejercen en el metabolismo de sus hospederos y sobre
todo entender si es esencial para el cumplimiento de la función ecológica de esta especie de pepino
de mar. Además, debido a la amplia variedad de funciones que cumplen las gamma-
proteobacterias, se puede obtener información más específica si se hace una evaluación a nivel de
familia. Dicha evaluación no se puede hacer en este estudio debido a que las familias dentro de
este grupo se clasifican como gammaproteobacterias no cultivadas.
Fusobacteriota constituye un filo de bacterias anaeróbicas obligadas (Hofstad, 1992). Se
han encontrado en el intestino de otras especies marinas como peces (Clements et al., 2014; Tyagi
& Singh, 2017), pero no forman parte de los grupos más abundantes en la microbiota intestinal de
pepinos de mar. Se detectó que su presencia no es muy abundante en las muestras de A. japonicus,
presentando abundancias relativas de 0.92 %, mientras que Proteobacteria presentaron valores de
abundancia relativa de hasta el 95.78 % (Zhao et al., 2019). Fusobacteriota se detectó como un
grupo un poco más abundante en la microbiota intestinal de Holothuria glaberrina, con
abundancias relativas de 4.2 % (Pagán et al., 2019). Esto podría sugerir que este filo ejerce un rol
particular en especies del género Holothuria. Zhao et al. (2019) sugieren que la presencia de
Fusobacteriota en la microbiota intestinal de pepinos de mar se podría asociar con enfermedades,
sin embargo, aclara que esta condición debe estudiarse más a fondo.
El filo Bacteriodota se ha encontrado previamente como un grupo abundante en la
microbiota intestinal de pepinos de mar (Gao et al., 2014; Yang et al., 2015; Yamazaki et al., 2016;
Pagán et al., 2019; Yamazaki et al., 2019). Este filo también se considera muy abundante en
ambientes marinos (Llobet-Brossa et al., 1998). Particularmente en pepinos de mar, se cree que
son más abundantes en individuos juveniles (Gao et al., 2014), aunque en este estudio no hay un
patrón claro para representar esta sugerencia. Estas bacterias participan en la degradación de
polímeros como celulosa, peptina y quitina (Kirchman, 2002).
48
Las proporciones de abundancias relativas de bacterias a nivel de filo, familia y género son
similares entre las muestras, con excepción de los individuos Hi 06 y Hi 08. A nivel de filo
presentan abundancias relativas muy bajas (2.1 %) de Fusobactecteriota en comparación a otras
muestras como Hi 03 (32.1 %). La baja abundancia en comparación al resto de muestras también
es observada a nivel de la familia Fusobacteriaceae. En los pepinos pequeños se da un aumento en
la abundancia relativa de otras familias, en comparación a la abundancia que presentan en el resto
de muestras. Algunas de estas familias son Rhodobacteraceae, Halieaceae y Desulfovibrionaceae,
Como se mencionó anteriormente, Zhao et al. (2019) explican que las variaciones en la
abundancia de Fusobacteriaceae se pueden relacionar con alteraciones en el estado de salud de los
pepinos de mar. Sin embargo, dicho criterio no fue evaluado en detalle en este estudio. Además, se
mencionó que debido a las etapas del desarrollo, individuos jóvenes tendrán una microbiota
intestinal distinta a los más maduros. Precisamente Yu et al. (2022) determinan que algunos
miembros de la familia Rhodobacterales son de los primeros colonizadores en intestinos de pepinos
de mar, por lo que se espera que haya más abundancia de miembros de esta clase en individuos
más jóvenes, tal como sucede con los pepinos pequeños Hi 06 y Hi 08.
En la muestra Hi 07 también se observa una variación particular. En ella, la familia
Vibrionaceae posee una abundancia relativa de 37 %, más del doble del promedio del resto de
muestras: (15 %). Esta alteración podría representar un signo de disbiosis, ya que el incremento en
abundancia de la familia Vibrionaceae está relacionado con un aumento de las especies patogénicas
de este género (Becker et al., 2004).
Por otro lado, no solo las condiciones fisiológicas pueden influenciar en la microbiota
intestinal de un pepino de mar, sino también la ingesta particular de alimentos (Hacquard et al.,
2015; Benson et al., 2016), cuya dieta está dominada por la materia orgánica que reposa en los
sedimentos, como restos de organismos (Shi et al., 2015). Los resultados sugieren que Hi 06 y Hi
08 podría tener una dieta diferente al resto. Si bien estos dos individuos fueron colectados en la
misma poza intermareal, los pepinos de mar tienen un movimiento diario reducido y el sedimento
circundante no es del todo homogéneo. Aunque estas características incrementan las posibilidades
de una dieta diferencial, debido a las condiciones ambientales similares, es poco probable que
variaciones en dieta expliquen las variaciones en abundancias relativas. La variación en las
abundancias relativas entre las muestras también podría ser explicada por aspectos intrínsecos de
cada organismo, como factores genéticos, ontogénicos (Hacquard et al., 2015; Benson et al., 2016).
49
Los pepinos de mar poseen un mecanismo de defensa poco observado en la naturaleza,
llamado evisceración (Li et al., 2017). Este es el proceso mediante el cual se desprenden de su
sistema digestivo, sistema hemal y árboles respiratorios, los cuales se regeneran en pocas semanas
(Sun et al., 2011). Zhang et al. (2019b) demuestran que el intestino se encuentra colonizado por
diferentes grupos de bacterias según la etapa de regeneración, por ejemplo aumento de diversidad
y presencia de Vibrio conforme pasan los días de regeneración. Esto sugiere que las poblaciones
de Vibrio serán menores cuando hay eventos recientes de regeneración, lo cual podría estar
sucediendo con las muestras Hi 06 y Hi 08. A pesar de esto, no se notó ninguna diferencia
morfológica en cuanto a estructuras internas de estas dos muestras, en comparación al resto y es
importante mencionar que al momento de la colecta los individuos tenían su sistema digestivo
completo. Si bien no existe un patrón morfológico claro, no se puede descartar la posibilidad de
que un evento de evisceración previo a la colecta haya afectado la microbiota intestinal de estos
dos individuos, puesto que los efectos de este proceso sobre la comunidad bacteriana no han sido
descritos para esta especie.
Por otro lado, la revisión manual a través de la herramienta EZBioCoud valida la
importancia de la revisión manual sobre la asignación taxonómica realizada con Qiime2 y Silva
V.138. Esto se debe principalmente a que permite mejorar y detectar errores en cuanto a la
identificación taxonómica. Además, permite obtener información sobre ambientes y organismos
con los cuales se relacionan las cepas detectadas en la microbiota intestinal de H. inornata, como
Propionigenium y Vibrio.
En la microbiota intestinal de pepinos de mar, no se ha encontrado presencia del género
Propionigenium como un grupo abundante en estudios previos. Sin embargo, sí se ha encontrado
en órganos internos de otros invertebrados marinos, como en la ascidia Lissoclinum patella
(Behrendt et al., 2012). Propionigenium se ha identificado como una bacteria comensal, anaerobia
obligada y aprovechador del succinato, producto del metabolismo anaerobio (Schink & Pfennig,
1982).
La especie Ilyobacter insuetus se encuentra muy relacionada a P. maris y otras especies del
género Propionigenium. I. insuetus se caracteriza por tener actividad catalasa, oxidasa, un
metabolismo fermentativo, además de ser anaerobio obligado (Brune et al., 2002). P. maris también
es anaerobio obligado y se ha encontrado previamente asociado con otros equinodermos como
Tripneustes gratilla (Brink et al., 2019). Por sus características enzimáticas y ser anaerobios
obligados, se sugiere que este grupo forma parte de la comunidad asociada al intestino de H.
50
inornata, y no se trata de especies transitorias del intestino, esto es importante porque indica que
probablemente poseen un rol importante en la asimilación de materia orgánica que ejerce H.
inornata.
Vibrio es un género abundante en aguas poco profundas (Plotieau et al., 2013) y ha sido
descrito como parte de la microbiota intestinal de pepinos de mar (Pagán et al., 2019). Especies
particulares de este género han sido causantes de enfermedades en estos organismos (Ramírez et
al., 2022) y también se han descrito como patógenos oportunistas y comensales de animales
marinos como corales, ostras, langostas, peces y otras especies de pepinos de mar (Becker et al.,
2004). Estas bacterias participan en la fermentación dentro del intestino de pepinos de mar y pueden
contribuir a la asimilación de materia org ánica en sus huéspedes (Wang et al., 2018a), por lo que
su presencia en pepinos de mar podría resultar fundamental para que estos invertebrados cumplan
con sus funciones ecosistémicas como el reciclaje de nutrientes mediante el consumo de materia
orgánica (Purcell et al., 2016). De hecho, Yamazaki et al. (2019) demuestran que hay bacterias
enriquecidas en el intestino de estos organismos que ejercen roles relacionados a la descomposición
activa de carbohidratos.
La especie Vibrio hepatarius ha sido previamente descrita como parte de la microbiota
intestinal en organismos marinos, como el camarón Litopanaeus vannamei. V. hepatarius se
caracteriza por tener un metabolismo anaeróbico facultativo, además, participan en la degradación
de glucosa, manitol, sacarosa, entre otras moléculas, además, tienen actividad oxidasa y participan
en la reducción de NO3 (Thompson et al., 2003). Dadas las características enzimáticas de V.
hepatarius, y su considerable abundancia en las muestras, se sugiere que podría tener un rol muy
importante asociado al rol ecológico de H. inornata, facilitando los procesos de asimilación de
materia orgánica. Inclusive, podría tener alguna inferencia sobre el enriquecimiento de nitrógeno
que ocurre en los intestinos de algunas especies de pepino de mar, aumentando además la
disponibilidad de este elemento en el sedimento circundante (Slater et al., 2011).
En el campo de la acuacultura se utiliza como estrategia la aplicación de probióticos para
mejorar la salud de los organismos, se ha evidenciado que cepas de Vibrio utilizadas como
probióticos han mejorado la respuesta inmune de organismos como camarones (Gulliam et al.,
2004). Vibrio hepatarios ha sido utilizada como probiótico, ya que se ha comprobado que tiene
capacidad de controlar la vibriosis, es decir, tiene la capacidad de producir la exclusión de cepas
Vibrio patogénicas (Ramírez et al., 2022) como Vibrio esplendidus y Vibrio lentus, que causan
enfermedades en pepinos de mar (Yingeng et al., 2006; Zhang et al., 2010). Analizando esta
51
información y tomando en cuenta que las muestras con menor abundancia Vibrio son Hi 06 y Hi
08, se fortalece la hipótesis de que estos individuos pueden encontrarse con algún tipo de
enfermedad, alterando el resto de los resultados. No se infiere que haya un aumento de patógenos,
sino que se pueden estar perdiendo algunos otros beneficios que aporta V. hepatarius como
probiótico.
Comparación de la composición de microbiota intestinas entre A. japonicus y H.

inornata
Como se ha discutido anteriormente, la comunidad de bacterias que componen la
microbiota intestinal de un organismo puede variar dependiendo de condiciones ambientales,
fisiológicas y particulares del desarrollo de cada individuo. El hecho de que este análisis
comparativo de llevó a cabo entre especies distintas, colectadas en ambientes distintos, se podría
considerar como la razón por la cual la comunidad intestinal es tan diferente y son pocos los grupos
core.
Las familias Rhodobacteraceae y Flavobacteriaceae, que conforman la comunidad
central compartida entre la microbiota de H. inornata y A. japonicus, se encuentran en una variedad
de ambientes, pero más comúnmente en los marinos (Jooste & Hugo, 1999; Doberva et al., 2018).
Particularmente Rhodobacteraceae se considera una familia clave en ambientes marinos e impulsa
importantes reacciones biogeoquímicas relacionadas al ciclo del carbono y azufre (Wagner-Döbler
& Biebl, 2006). Miembros de esta familia se han encontrado asociados a esponjas (Mohamed et
al., 2008), dinoflagelados (Amin et al., 2015) y diatomeas (Patzel et al., 2013). En el caso de
Flavobacteraceae, es una familia que ha colonizado muchos nichos, algunas especies se consideran
patogénicas, se han encontrado en animales enfermos, asociado a peces marinos y también en agua
dulce (Jooste & Hugo, 1999) y algunas de sus especies poseen muchos géneros relacionados al
metabolismo de carbohidratos (Zhang et al., 2020).
Entonces, la comunidad central detectada en la microbiota para estas especies de pepino
de mar consta de familias muy abundantes en el mar, con muchos espectros funcionales, y
normalmente asociadas a otros invertebrados marinos, por lo que puede resultar común
encontrarlas en este ecosistema estudiado. Más interesante que su abundancia en los océanos es
que estas dos familias tienen roles clave en el intestino de A. japonicus, promoviendo la tasa de
regeneración intestinal (Zhang et al., 2020). Probablemente están ejerciendo el mismo papel en la
especie H. inornata, y por esta razón forman parte de la comunidad central entre ambas especies.
52
En cuanto a la similitud a nivel de familia entre los diferentes bioproyectos, como se ha
mencionado con anterioridad, son muchos los factores que pueden influir en la distribución de la
comunidad microbiana de la microbiota intestinal. Llama la atención la agrupación entre uno de
los bioproyectos de A. japonicus y H. inornata, y no entre ambos de la misma especie. Sin embargo,
es importante mencionar que no existe mucha información que respalde los datos de uso libre para
el bioproyecto PRJNA483340. Se desconoce si las muestras vienen de acuacultura, práctica muy
común para esta especie en China (Zhang et al., 2019a). Este hecho puede causar diferencias en la
composición de la microbiota por ser un ambiente controlado y sanitizado, muy distinto al natural
en aspectos como dieta y uso de probióticos. Es muy probable que las condiciones particulares de
estas muestras puedan explicar su separación de los otros proyectos, aunque no se puede definir
con certeza debido a la falta de esta información.
53
Conclusiones
Este estudio preliminar de H. inornata permitió estandarizar el protocolo de colecta y

extracción de ADN de la comunidad bacteriana que conforma su microbiota intestinal. Las pruebas
realizadas evidencian que se requiere de un buen método de almacenamiento del contenido
intestinal antes de la extracción. El ADN de la comunidad bacteriana se obtuvo satisfactoriamente
al utilizar RNAlater como buffer de almacenamiento. Esto se debe a la capacidad que tiene el buffer
para conservar el ADN en la muestra, previo al proceso de extracción. Además, el proceso de
secuenciación, a través de la plataforma Illumina, permitió obtener un conjunto de 2577 ASVs que
se utilizaron para caracterizar satisfactoriamente la microbiota intestinal de H. inornata.
La microbiota intestinal detectada en los pepinos de mar más grandes difiere a la que
caracterizó a los más pequeños. Debido a aspectos de desarrollo y maduración, la comunidad
bacteriana que compone a la microbiota intestinal es más dinámica en los pepinos jóvenes y se
vuelve más estable en la etapa adulta. Este dinamismo hace que los pepinos pequeños tengan una
microbiota intestinal más diversa, más enriquecida en ASVs y menos similar entre los individuos,
en comparación a la que caracterizó al grupo grande. Probablemente por esta razón las muestras
Hi 06 y Hi 08 generaron patrones de abundancias relativas, en todos los niveles taxonómicos, tan
distintos al resto. Además, la riqueza y diversidad de especies que componen la microbiota
intestinal de H. inornata puede ser distinta debido a otras razones como alteraciones en salud,
región intestinal analizada, factores genéticos, ontogénicos y procesos de regeneración intestinal.
Se determinó que Proteobacteria, Fusobacteria y Bacteroidota son los filos más abundantes
que componen la microbiota intestinal de H. inornata. Dentro de Proteobacteria, las gamma-
proteobacterias se encuentran ampliamente distribuidas en ambientes marinos y fueron muy
abundantes en este estudio. Pueden estar ejerciendo roles metabólicos importantes en H. inornata,
posiblemente relacionados con la función ecológica del pepino. Fusobacteria no es tan común en
la microbiota intestinal de especies como A. japonicus, pero sí en otra especie del género
Holothuria. Esto sugiere que podría ejercer un rol específico en especies de dicho género. El filo
Bacteroidota también es muy abundante en ambientes marinos. Las relaciones entre estos grupos
particulares de bacterias y el organismo hospedero deben estudiarse más a fondo. Las familias más
abundantes fueron Fusobacteriaceae y Vibrionaceae. Estas se relacionan con alteraciones en el
estado de salud de algunos animales, sin embargo, este factor no fue tomado en cuenta en este
estudio.
54
Propionigenium fue el género más abundante. A través de la revisión manual se asignó a
cepas de Propionigenium maris e Ilyobacter insuetus, usuales en sedimentos marinos ricos en
materia orgánica. Tienen metabolismo fermentativo y son anaerobios obligados, por lo que se
sugiere que forman parte de la comunidad asociada al intestino de H. inornata, y no se trata de
especies transitorias. Eso indica que podrían ejercer un rol importante en la asimilación de materia
orgánica por parte del hospedero.
El segundo género más abundante en este estudio fue Vibrio. Asignado, a través de la
revisión manual, a cepas de Vibrio hepatarius, Vibrio japonicus, Vibrio maritimus, Vibrio
sinaloensis y Vibrio sinensis. Estas especies forman parte de la microbiota intestinal de diferentes
invertebrados y ambientes marinos en general. Participan en la fermentación dentro del intestino
de los pepinos y pueden contribuir a la asimilación de materia orgánica en sus huéspedes, por lo
que su presencia en H. inornata podría resultar fundamental para que estos invertebrados cumplan
con sus funciones ecosistémicas como el reciclaje de nutrientes.
El análisis comparativo de la microbiota intestinal entre las especies H. inornata y A.
japonicus reveló que comparten pocos grupos y en abundancias relativas distintas. La comunidad
central detectada para ambas especies se reduce a dos familias muy abundantes en ambientes
marinos: Rhodobacteraceae y Flavobacteriaceae, restringiéndose a los filos Proteobacteria y
Bacteroidota. Estas dos familias tienen roles clave en el intestino de A. japonicus, promoviendo la
tasa de regeneración intestinal. Probablemente están ejerciendo el mismo rol en la especie H.
inornata.
55
Recomendaciones
Se recomienda realizar el análisis descriptivo de microbiota intestinal para otras

especies del género Holothuria, con el fin comparar con la microbiota de H. inornata y determinar
la comunidad central para el género. Además, a futuros análisis se podrían agregar colectas en otras
regiones del Pacífico así como el Caribe y se podría describir la microbiota presente en las
diferentes secciones intestinales de esta especie. Además, se podría caracterizar la microbiota del
sedimento circundante para compararla con la intestinal. También se podrían realizar
comparaciones de esta comunidad bacteriana entre individuos de la misma especie, pero
provenientes de zonas geográficas distintas.
La secuenciación de amplicones 16S ARNr permitió generar la descripción de la
comunidad que se encuentra formando parte de la microbiota intestinal de H. inornata. A pesar de
esto, es importante considerar que esta secuenciación es de un fragmento del gen 16S ARNr (región
V3-V4). Se deben utilizar otros tipos de secuenciación como la metagenómica tipo shotgun y
metatranscriptómica, para estudiar en detalle las comunidades. Además, los datos metagenómicos
pueden proporcionar información adicional sobre la dinámica genética y funciones que llevan a
cabo los distintos microorganismos que conforman esta comunidad. También se recomienda repetir
este análisis pero con el marcador molecular 18S o ITS, lo que permitiría conocer las comunidades
de microeucariotas y hongos que también habitan en el intestino de los pepinos de mar.
Estudiar con más detalle estas comunidades y sus roles dentro del organismo hospedero
podría conducir a aplicaciones con interés biotecnológico como la generación de compuestos
antimicrobianos. Por lo anterior, se recomienda el aislamiento de las bacterias detectadas a través
de técnicas independientes de cultivo. Las estrategias dependientes de cultivo permitirán obtener
cepas de bacterias de estos ambientes. Se pueden aplicar técnicas de cultivo en presencia de
oxígeno o en condiciones anaerobias que imiten las condiciones intestinales.
56
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66
Anexos
Anexo 1. Datos ambientales promediados por mes durante el año 2021
T (°C) Sd T (°C) Inc. Inc. Inc.

Mes Fosfatos Amonio Nitratos
promedio promedio Fosfatos Fosfatos Fosfatos
Enero 26.19 1.48 0.3 0.22 6.59 0.58 2.14 0.59
Febrero 26.29 1.68 NA NA 4.15 0.59 2.11 0.59
Marzo 25.74 2.09 NA NA 6.71 0.57 2.5 0.59
Abril 27.41 2.63 0.34 0.22 3.73 0.6 2.65 0.59
Mayo 29.18 0.45 NA NA 5.5 0.58 4.43 0.6
Junio 23.73 0.32 0.18 0.07 4.21 0.51 7.23 0.4
Julio 29.08 0.59 0.1 0.07 3.88 0.51 6.33 0.37
Agosto 29.28 0.37 0.15 0.07 3.72 0.52 5.89 0.36
Setiembre 28.58 0.66 0.09 0.07 4.66 0.51 6.93 0.39
Promedio
27.94 1.14 0.19 0.15 4.79 0.55 4.46 0.49
anual
*Sd corresponde a la desviación estándar.

*Inc corresponde a incertidumbre
67
Anexo 2. Lista de filos que se encuentran agrupados en la categoría Otro, en los gráficos de
abundancia relativa de los diferentes subgrupos que componen la microbiota intestinal de la especie
H. inornata. Los diferentes taxones se encuentran agrupados según abundancia.
Lista de filos agrupados en la categoría Otros

Deferribacterota, Sumerlaeota, SAR324, Margulisbacteria, Fibrobacterota, Dadabacteria,
Latescibacterota, Deinococcota, Nitrospirota, Entotheonellaeota, Halanaerobiaeota, Nitrospinota,
Hydrogenedentes
68
Anexo 3. Lista de filos, familias y géneros que se encuentran agrupados en la categoría Otro, en los gráficos de abundancia relativa de los
diferentes subgrupos que componen la microbiota intestinal de la especie H. inornata. Los diferentes taxones se encuentran agrupados según
abundancia.
Lista de familias agrupados en la categoría Otros

Pirellulaceae, Flavobacteriaceae, Colwelliaceae, Microtrichaceae, unc_Alphaproteobacteria, Rhizobiaceae,
Rubritaleaceae, Flammeovirgaceae, unc_Bacteroidia, unc_Peptostreptococcales-Tissierellales, DEV007,
unc_Actinomarinales, Alteromonadaceae, Cyclobacteriaceae, Woeseiaceae, Lachnospiraceae, unc_NB1-j,
unc_Cellvibrionales, Marinilabiliaceae, Saprospiraceae, unc_Campylobacterales, Kiloniellaceae,
Thermoanaerobaculaceae, Peptostreptococcaceae, Xanthobacteraceae, unc_Microtrichales, Phycisphaeraceae,
Cryomorphaceae, Bacteriovoracaceae, Cyanobiaceae, Geminicoccaceae, unc_HOC36, Sphingomonadaceae,
Saccharimonadales, Sandaracinaceae, unc_Bacilli, Arcobacteraceae, unc_Acidimicrobiia, BD2-7,
Erysipelotrichaceae, unc_Gaiellales, unc_Actinobacteria, Desulfosarcinaceae, Clostridiaceae, unc_Cyanobacteriales,
unc_Firmicutes, unc_Acidobacteriota, Ruminococcaceae, unc_Clostridia, Xenococcaceae, unc_Actinobacteriota,
Rubinisphaeraceae, unc_KD4-96, unc_BD2-11, Hyphomicrobiaceae, Gracilibacteriaunc_OM190, unc_UBA10353,
Sulfurospirillaceae, Puniceicoccaceae, Rhodothermaceae, Obscuribacteraceae, Hyphomonadaceae,
unc_Eurycoccales, Deferribacteraceae, Nitrosococcaceae, GvenF17, Propionibacteriaceae, unc_Enterobacterales,
Shewanellaceae, Crocinitomicaceae, unc_Rhizobiales, Staphylococcaceae, unc_KI89A, Tenderiaceae,
Enterococcaceae, unc_EV818SWSAP88, unc_Planctomycetota, Amoebophilaceae, Methyloligellaceae,
Geopsychrobacteraceae, unc_Sumerlaeia, Blastocatellaceae, Caulobacteraceae, Streptococcaceae,
unc_Entomoplasmatales, Moraxellaceae, unc_PAUC43f, unc_Verrucomicrobiales, Caldilineaceae, Chromatiaceae,
unc_Verrucomicrobiae, unc_Desulfuromonadia, unc_Cytophagales, unc_Planctomycetales, Arenicellaceae,
Gimesiaceae, unc_Rhodospirillales, Phormidesmiaceae, unc_SAR324, Margulisbacteria, unc_Desulfobulbales,
Rhizobiales, unc_pItb-vmat-80, unc_WCHB141, Enterobacteriaceae, NS7, Chitinivibrionaceae, Stappiaceae,
Pseudomonadaceae, Dadabacteriales, unc_BD78Bdellovibrionaceae, BIrii41, unc_SBR1031, unc_Kiloniellales,
Microbacteriaceae, unc_Chitinophagales, unc_D90, Prolixibacteraceae, Oscillospiraceae, Peptostreptococcales-
Tissierellales, Erysipelatoclostridiaceae, unc_Latescibacterota, unc_Sva1033, Bifidobacteriaceae, Caedibacteraceae,
Comamonadaceae, Bacillaceae, Lentisphaeraceae, Prevotellaceae, unc_vadinHA49, Entomoplasmatales, unc_C86,
unc_Gracilibacteria, Defluviicoccaceae, Mycoplasmataceae, unc_WCHB181Nitrospiraceae, unc_Babeliales,
69
unc_Bdellovibrionota, unc_Oceanospirillales, unc_Vicinamibacteria, Leuconostocaceae, Cyanobacteriaceae,
unc_Ardenticatenales, unc_PAUC26f, Marinobacteraceae, unc_Saccharimonadales, unc_PB19,
Gemmatimonadaceae, unc_03196G20, unc_Solirubrobacterales, 6714, Coleofasciculaceae, Streptomycetaceae,
Desulfobacteraceae, Fusibacteraceae, unc_WWE3, Parvularculaceae, Cellvibrionaceae, Gastranaerophilales,
unc_028H05-P-BNP5, Halomonadaceae, unc_bacteriap25, unc_Polyangiales, Acidobacteriaceae, Beijerinckiaceae,
Corynebacteriaceae, Rhodanobacteraceae, unc_Patescibacteria, unc_Planctomycetes, Geodermatophilaceae,
Holosporaceae, Trueperaceae, unc_Oligoflexales, Desulfobulbaceae, Parcubacteria, Veillonellaceae, Kangiellaceae,
Sericytochromatia, Coriobacteriaceae, Lactobacillaceae, Nitriliruptoraceae, unc_Bacteroidota, unc_P.palmC41,
Pasteurellaceae, unc_Chthoniobacterales, Aminicenantales, Entotheonellaceae, unc_Deinococcales,
Vulgatibacteraceae, Kordiimonadaceae, unc_ABY1, Anaerolineaceae, Chitinophagaceae, Saccharimonadaceae,
Sedimenticolaceae, Acidaminococcaceae, Desulfolunaceae, Eubacteriaceae, Kiritimatiellaceae, Phormidiaceae,
WWH38, Oxalobacteraceae, Pseudoalteromonadaceae, Simkaniaceae, Xanthomonadaceae, Methylacidiphilaceae,
unc_Micrococcales, Verrucomicrobiaceae, Alcaligenaceae, unc_OPB41, unc_Pla3, Coxiellaceae, Schleiferiaceae,
unc_Gitt-GS-136, Bacteroidaceae, Halobacteroidaceae, Pedosphaeraceae, unc_mle18Weeksellaceae,
unc_Acidobacteriae, unc_Erysipelotrichales, Rubrobacteriaceae, unc_Oligoflexia, unc_Opitutales, Dojkabacteria,
unc_Chlamydiales, unc_Ga0077536, unc_Sva0485, Acetobacteraceae, Burkholderiaceae, Terasakiellaceae,
unc_Izemoplasmatales, unc_Syntrophobacterales, Ardenticatenaceae, Monoglobaceae, unc_Microgenomatia,
Chlamydiaceae, Haliangiaceae, Magnetospiraceae, unc_Parcubacteria, Acholeplasmataceae, Izemoplasmatales,
unc_P9X2b3D02, Spirosomaceae, unc_Oligosphaerales, unc_Desulfobacterota, Caenarcaniphilales,
Christensenellaceae, Hydrogenedensaceae, unc_Verrucomicrobiota
70
Anexo 4. Lista de géneros que se encuentran agrupados en la categoría Otro, en los gráficos de abundancia relativa de los diferentes subgrupos
que componen la microbiota intestinal de la especie H. inornata. Los diferentes taxones se encuentran agrupados según abundancia.
Lista de géneros agrupados en la categoría Otros

unc_Peptostreptococcales-Tissierellales, unc_DEV007, unc_Microtrichaceae, unc_Actinomarinales, Spirochaeta,
Woeseia, Sva0996, ,Desulfovibrio, Dinoroseobacter, unc_Cyclobacteriaceae, Rhodopirellula, Ruegeria,
unc_Pirellulaceae, Blastopirellulaunc, NB1-junc, Cellvibrionales, unc_Alteromonadaceae, Algivirga,
unc_Campylobacterales, unc_Thermoanaerobaculaceae, Parahaliea, unc_Lachnospiraceae, unc_Saprospiraceae,
unc_Xanthobacteraceae, Flammeovirga, unc_Microtrichales, unc_Peptostreptococcaceae, unc_Cryomorphaceae,
Labilibacter, Rubritalea, unc_Kiloniellaceae, Urania-1B-19, unc_Cyanobiaceae, unc_Geminicoccaceae,
OM60(NOR5), unc_HOC36, Saccharimonadales, Neiella, unc_Sphingomonadaceae, Roseibacillus, Zeaxanthinibacter,
unc_Sandaracinaceae, DBS1, Actibacter, Blautia, unc_Bacilli, Halarcobacter, Desulfotalea, unc_Acidimicrobiia,
unc_BD2-7, unc_Gaiellales, unc_Actinobacteria, unc_Cyanobacteriales, unc_Firmicutes, unc_Acidobacteriota,
unc_Desulfosarcinaceae, Peredibacter, Turicibacter, unc_Clostridia, unc_Ilumatobacteraceae,
unc_Hyphomicrobiaceae, unc_Actinobacteriota, unc_Vibrionaceae, Clostridium, unc_Xenococcaceae,
unc_Rhizobiales, unc_KD4-96, unc_Colwelliaceae, unc_BD2-11, Halobacteriovorax, Gracilibacteria, unc_OM190,
unc_Rubinisphaeraceae, Robiginitalea, unc_UBA10353, Sulfurospirillum, Pelagibius, unc_Rhodothermaceae,
Obscuribacteraceae, Colwellia, unc_Eurycoccales, unc_Deferribacteraceae, unc_Nitrosococcaceae, unc_Gven-F17,
Cutibacterium, unc_Enterobacterales, unc_Marinilabiliaceae, Roseobacter, Halodesulfovibrio, Staphylococcus,
unc_KI89A, Subdoligranulum, Rubripirellula, unc_Tenderiaceae, Enterococcus, unc_EV818SWSAP88,
unc_Planctomycetota, unc_Amoebophilaceae, unc_Flammeovirgaceae, unc_Geopsychrobacteraceae, unc_Sumerlaeia,
Methyloceanibacter, Haloferula, unc_Caulobacteraceae, unc_Entomoplasmatales, unc_Crocinitomicaceae,
Lentimonas, Acinetobacter, Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium, Luteolibacter, unc_PAUC43f,
unc_VerrucomicrobialesEudoraea, unc_Caldilineaceae, unc_Chromatiaceae, unc_Verrucomicrobiae,
unc_DesulfuromonadiaI, MCC26207, Persicirhabdus, unc_Cytophagales, unc_PlanctomycetalesCarboxylicivirga,
unc_Gimesiaceae, unc_Rhodospirillales, unc_Clostridiaceae, Shewanella, unc_SAR324, Margulisbacteria,
unc_Desulfobulbales, unc_pItb-vmat-80, Acrophormium, Desulfovibrionaceae, Blastocatella, Silicimonas,
unc_WCHB1-41, Ferrimonas, Lewinella, Cetobacteriumuncultured, unc_Oscillatoriaceae, unc_NS7, Halioglobus,
71
Labrenzia, unc_Chitinivibrionaceae, Pseudomonas, Dadabacteriales, unc_BD7-8CAG-352, unc_BIrii41, Escherichia-
Shigella, Streptococcus, unc_SBR1031, Faecalibacterium, Robiginitomaculum, unc_Kiloniellales, Porphyrobacter,
unc_Microbacteriaceae, unc_Chitinophagales, unc_D90Roseimarinus, Grimontia, unc_Bacteriovoracaceae, Fluviicola,
unc_Latescibacterota, Epulopiscium, unc_Sva1033Bifidobacterium, unc_Caedibacteraceae, unc_Comamonadaceae,
Bacillus, Lentisphaera, Prevotella, unc_vadinHA49, Ahrensia, Fulvivirga, unc_Arenicellaceae,
unc_Entomoplasmatales, Lactococcus, Arenicella, unc_C86, unc_Gracilibacteria, Defluviicoccus, SM1A02,
unc_WCHB1-81, Nitrospira, Paracoccus, unc_Babeliales, unc_Bdellovibrionota, unc_Oceanospirillales,
unc_Vicinamibacteria, Weissella, Winogradskyella, unc_Ardenticatenales, unc_PAUC26f, unc_Puniceicoccaceae,
Marinobacter, unc_Saccharimonadales, unc_PB19, Coraliomargarita, HelleaOM27, unc_0319-6G20,
unc_Gemmatimonadaceae, unc_Rubritaleaceae, unc_Solirubrobacterales, Anaeromicrobium, unc_Mycoplasmataceae,
Erysipelotrichaceae, Moorea, Streptomyces, unc_67-14, Filomicrobium, Fusibacter, Reichenbachiella,
unc_Blastocatellaceae, unc_WWE3, Cyanobacterium, unc_Parvularculaceae, Flavobacteriaceae, Gastranaerophilales,
unc_Cellvibrionaceae, Bdellovibrio, unc_028H05-P-BN-P5, unc_Desulfobacteraceae, Pirellula, Pleurocapsa,
unc_bacteriap25, unc_Halomonadaceae, unc_Polyangiales, Chujaibacter, Corynebacterium, Methylobacterium-
Methylorubrum, Muricauda, Pseudofulvibacter, unc_Acidobacteriaceae, unc_Patescibacteria, unc_Planctomycetes,
Holosporaceae, Tenacibaculum, unc_Geodermatophilaceae, Truepera, unc_Oligoflexales, Parcubacteria,
unc_Desulfobulbaceae, Veillonella, Aliikangiella, Sericytochromatia, Collinsella, Lactobacillus, Nitriliruptoraceae,
Pir4, unc_Bacteroidota, Enterovibrio, Erysipelatoclostridium, Planctomicrobium, Sporosalibacterium, Sva0081,
unc_P.palmC41, unc_Phycisphaeraceae, Haemophilus, unc_Chthoniobacterales, Aminicenantales, Entotheonellaceae,
unc_Deinococcales, Vulgatibacter, Holdemanella, Kordiimonas, Terrisporobacter, unc_ABY1, Sedimenticola, TM7a,
unc_Anaerolineaceae, unc_Chitinophagaceae, Desulfofaba, Eubacterium, Phascolarctobacterium, R76-B128,
Seonamhaeicola, unc_Phormidiaceae, unc_WWH38, AlgimonasJannaschia, Pseudoalteromonas, Sediminitomix,
unc_Simkaniaceae, unc_Methylacidiphilaceae, unc_Micrococcales, unc_Verrucomicrobiaceae, Achromobacter,
unc_OPB41, unc_Pla3Coxiella, Ruminococcus, Schleiferia, unc_Gitt-GS-136, unc_Methyloligellaceae, Bacteroides,
Cloacibacterium, FuerstiaSCGC, unc_Halobacteroidaceae, unc_mle1-8, unc_Acidobacteriae, unc_Erysipelotrichales,
unc_Ruminococcaceae, Ekhidna, Rubrobacter, Stenotrophomonas, unc_Enterobacteriaceae, unc_Oligoflexia,
unc_Opitutales, Verruc-01, Dojkabacteria, Fabibacter, Mycoplasma, Symphothece, unc_Chlamydiales,
unc_Ga0077536, unc_Sva0485, unc_Acetobacteraceae, unc_Burkholderiaceae, unc_Izemoplasmatales,
unc_Syntrophobacterales, unc_Terasakiellaceae, Cohaesibacter, Kordia, Monoglobus, Phormidium,
unc_Ardenticatenaceae, unc_Microgenomatia, Haliangium, Magnetovibrio, unc_Chlamydiaceae,
unc_ParcubacteriaIzemoplasmatales, Portibacter, unc_Acholeplasmataceae, unc_P9X2b3D02, unc_Oligosphaerales,
72
Desulfobacter, Phycisphaera, unc_Desulfobacterota, Caenarcaniphilales, unc_Christensenellaceae,
unc_Hydrogenedensaceae, unc_Verrucomicrobiota
73

Kaylen Nohely Gonzalez Sanchez

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Universidad de Costa Rica

Determinación de la diversidad de la microbiota intestinal

Tesis para optar por el grado de Licenciatura en Biología con énfasis

Kaylen Nohely González Sánchez

Ciudad Universitaria Rodrigo Facio

San José, Costa Rica

Figura 1. Reciclaje de nutrientes por parte de los pepinos de mar…………………….16

Figura 2. Sitio de colecta.……………………….…………………………………….. 21

Figura 3. Procesamiento de muestras.……………………….……………………….. 21

Figura 4. Electroforesis de los ADNs en gel de agarosa al 1 %………………………. 23

Figura 5. Índice de similitud de Bray-Curtis entre las muestras de Apostichopus

japonicus de los diferentes bioproyectos examinados.…………………………………... 26

Figura 6. Evaluación de la calidad del ADN extraído con diferentes métodos………...27

Figura 7. Gráfico de funel de la dispersión del índice de A) distintividad taxonómica

(Delta+) y B) Desviación estándar de la distintividad taxonómica (Lambda+)……….30

Figura 8. Análisis de Escalamiento multidimensional no métrico (nMDS) basado en una

matriz de similitud de Bray-Curtis con los datos de abundancia………………………31

entre las muestras.………………….…………………………….…………………….. 33

Figura 13. Shadeplot e índice de Bray Curtis realizado a nivel de familia…………….. 42

Cuadro 3. Concentraciones (ng/μl) del ADN extraído del contenido intestinal de H.

Cuadro 4. Información general sobre la cantidad de secuencias obtenidas y procesadas

Cuadro 5. Talla (cm) e Índices de diversidad de Variantes de Secuencia de Amplicon

Cuadro 6. Análisis de la similitud porcentual de la contribución de especies

Cuadro 7. Porcentaje de similitud de los ASV asignados como Propionigenium dentro

Cuadro 8. Porcentaje de similitud de los ASV asignados como Vibrio dentro de la

El fruto de mi esfuerzo lo dedico a mi madre. Por haberme acompañado, por haberme

Finalmente, agradezco a Dios y a la vida, por tanto.

Si la cuerda no fuera delgada, no tendría gracia caminar por ella

Metagenómica: herramienta para el estudio de microorganismos

Holothuria inornata se distribuye desde el Golfo de California hasta el norte de Perú,

1) Determinar el método más apropiado para la colecta y extracción de ADN de la

Método de colecta A - Alcohol: Los individuos se colectaron en pozas intermareales, se

Prueba Método de colecta Método de extracción de ADN

Figura 2. Sitio de colecta de individuos de la especie H. inornata en Bahía Culebra. A. Poza

Extracción de ADN y secuenciación masiva del gen 16S ARNr

Figura 4. Electroforesis de ADN genómico perteneciente a cada uno de los individuos

Muestra Concentración de ADN (ng/μl) 260/280

Ensamblaje de secuencias y clasificación taxonómica

Diversidad de la microbiota intestinal de los individuos de la especie H. inornata

Comparación entre microbiota intestinal de H. inornata y A. japonicus

Figura 5. Índice de similitud de Bray-Curtis entre las muestras de Apostichopus japonicus de

Figura 6. Evaluación de la calidad, a través de una electroforesis de agarosa al 1 %, del ADN

Muestra Concentración de ADN

Secuenciación a través de la plataforma Illumina

Cuadro 4. Información general sobre la cantidad de secuencias obtenidas y procesadas por

Total de Secuencias Total de Porcentaje de

Cuadro 5. Talla (cm) e Índices de diversidad de Variantes de Secuencia de Amplicon (ASV)

Individuo Talla (cm) ASVs N d J´ H´ Delta+

Figura 7. Gráfico de funel de la dispersión del índice de A) distintividad taxonómica (Delta+)

Relación entre el tamaño y la comunidad microbiana de Holothuria inornata

Figura 8. Análisis de Escalamiento multidimensional no métrico (nMDS) basado en una matriz

Grupo grande 28.41 % de similitud

Análisis de las comunidades microbianas de Holothuria inornata

De los 33 filos que componen la microbiota intestinal de los individuos de H. inornata

Riqueza, diversidad y complejidad taxonómica

Relación entre el tamaño y la comunidad microbiana de Holothuria inornata

Comunidades microbianas de Holothuria inornata

Comparación de la composición de microbiota intestinas entre A. japonicus y H.

Este estudio preliminar de H. inornata permitió estandarizar el protocolo de colecta y

Se recomienda realizar el análisis descriptivo de microbiota intestinal para otras

T (°C) Sd T (°C) Inc. Inc. Inc.

*Sd corresponde a la desviación estándar.

Lista de filos agrupados en la categoría Otros

Lista de familias agrupados en la categoría Otros