Scdpha T 2010 Duigou Arnaud

Maîtrise des procédés de culture cellulaire pour la
production de vaccins
Arnaud Duigou
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Arnaud Duigou. Maîtrise des procédés de culture cellulaire pour la production de vaccins. Sciences
pharmaceutiques. 2010. �hal-01739023�
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UNIVERSITÉ HENRI POINCARÉ - NANCY 1
2009
FACULTÉ DE PHARMACIE
Maîtrise des procédés de culture cellulaire

pour la production de vaccins
THÈSE
présentée et soutenue publiquement le 4 mai 2010
pour obtenir :
le Diplôme d’état de Docteur en Pharmacie
Par
Arnaud Duigou
Né le 11 juin 1985, à Colmar (68)
Membres du jury
Président :
Mme. Chantal FINANCE, Professeur, Faculté de Pharmacie de Nancy
Juges :
Mme Annie MARC, Directeur de Recherche au CNRS
M. Frantz FOURNIER, Maître de Conférences à l’ENSAIA
« LA FACULTÉ N’ENTEND DONNER AUCUNE APPROBATION, NI IM-
PROBATION AUX OPINIONS ÉMISES DANS LES THÈSES, CES OPINIONS
DOIVENT ÊTRE CONSIDÉRÉES COMME PROPRES À LEUR AUTEUR ».
UNIVERSITÉ HENRI POINCARÉ, NANCY 1
FACULTÉ DE PHARMACIE
Année universitaire 2009-2010
DOYEN
Francine PAULUS
Vice-Doyen
Francine KEDZIEREWICZ
Président du Conseil de la Pédagogie
Bertrand RIHN
Commission de la Recherche
Christophe GANTZER
Mobilité ERASMUS & Communication
Francine KEDZIEREWICZ
Hygiène Sécurité
Laurent DIEZ
Responsable de la filière Officine

Francine PAULUS
Responsables de la filière Industrie

Isabelle LARTAUD & Jean-Bernard REGNOUF de VAINS
Responsable du CEPH
(Collège d’Enseignement Pharmaceutique Hospitalier)
Jean-Michel SIMON
Doyens Honoraires Professeurs Émérites
Chantal FINANCE
Claude VIGNERON Jeffrey ATKINSON
Marie-Madeleine GALTEAU
Gérard SIEST
Claude VIGNERON
Professeurs Honoraires Maîtres de Conférences Honoraires
Roger BONALY Gérald CATAU

Thérèse GIRARD Jocelyne COLLOMB
Maurice HOFFMANN Michel JACQUE Bernard DANGIEN
Lucien LALLOZ Marie-Claude FUZELLIER
Pierre LECTARD Françoise HINZELIN
Vincent LOPPINET Marie-Andrée IMBS
Marcel MIRJOLET Marie-Hélène LIVERTOUX
François MORTIER Jean-Louis MONAL
Maurice PIERFITTE Dominique NOTTER
Janine SCHWARTZBROD Marie-France POCHON
Louis SCHWARTZBROD Anne ROVEL
Maria WELLMAN-ROUSSEAU
Assistantes Honoraires
Marie-Catherine BERTHE
Annie PAVIS
ENSEIGNANTS
PROFESSEURS
Gilles AULAGNER . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .Pharmacie clinique

Alain BAGREL . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Biochimie
Jean-Claude BLOCK . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Santé publique
Christine CAPDEVILLE-ATKINSON . . . . . . . . . . . . . Pharmacologie cardiovasculaire
Chantal FINANCE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Virologie, Immunologie
Pascale FRIANT-MICHEL . . . . . . . . . . . . . Mathématiques, Physique, Audioprothèse
Christophe GANTZER . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Microbiologie environnementale
Max HENRY . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Botanique, Mycologie
Jean-Yves JOUZEAU . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bioanalyse du médicament
Pierre LABRUDE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Physiologie, Orthopédie, Maintien à domicile
Isabelle LARTAUD . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .Pharmacologie cardiovasculaire
Dominique LAURAIN-MATTAR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Pharmacognosie
Brigitte LEININGER-MULLER . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Biochimie
Pierre LEROY . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Chimie physique générale
Philippe MAINCENT . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Pharmacie galénique
Alain MARSURA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Chimie thérapeutique
Patrick MENU . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Physiologie
Jean-Louis MERLIN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Biologie cellulaire oncologique
Jean-Bernard REGNOUF de VAINS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Chimie thérapeutique
Bertrand RIHN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Biochimie, Biologie moléculaire
Jean-Michel SIMON . . . . . . . . . . . . Économie de la santé, Législation pharmaceutique
MAITRES DE CONFÉRENCES
Sandrine BANAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Parasitologie

Mariette BEAUD . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Biologie cellulaire
Emmanuelle BENOIT . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Communication et Santé
Isabelle BERTRAND . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Microbiologie environnementale
Michel BOISBRUN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Chimie thérapeutique
François BONNEAUX . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Chimie thérapeutique
Ariane BOUDIER . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Chimie Physique
Cédric BOURA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Physiologie
Jean-Claude CHEVIN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Chimie générale et minérale
Igor CLAROT . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Chimie analytique
Joël COULON . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Biochimie
Sébastien DADE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bio-informatique
Dominique DECOLIN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .Chimie analytique
Béatrice DEMORE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Pharmacie clinique
Joël DUCOURNEAU . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Biophysique, Audioprothèse, Acoustique
Florence DUMARCAY . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Chimie thérapeutique
François DUPUIS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .Pharmacologie
Raphaël DUVAL . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Microbiologie clinique
Béatrice FAIVRE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Hématologie
Adel FAIZ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Biophysique-accoustique
Luc FERRARI . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Toxicologie
Stéphane GIBAUD . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Pharmacie clinique
Thierry HUMBERT . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Chimie organique
Frédéric JORAND . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Santé et Environnement
Olivier JOUBERT . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Toxicologie, sécurité sanitaire
Francine KEDZIEREWICZ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Pharmacie galénique
Alexandrine LAMBERT . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Informatique, Biostatistiques
Faten MEHRI-SOUSSI . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Hématologie biologique
Christophe MERLIN . . . . . . . . . . . . . . . Microbiologie environnementale et moléculaire
Blandine MOREAU . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Pharmacognosie
Maxime MOURER . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Pharmacochimie supramoléculaire
Francine PAULUS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Informatique
Christine PERDICAKIS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Chimie Organique
Caroline PERRIN-SARRADO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Pharmacologie
Virginie PICHON . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Biophysique
Anne SAPIN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Pharmacie galénique
Marie-Paule SAUDER . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Mycologie, Botanique
Nathalie THILLY . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Santé publique
Gabriel TROCKLE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Pharmacologie
Marie-Noëlle VAULTIER . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Biodiversité végétale et fongique
Mohamed ZAIOU . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Biochimie et Biologie moléculaire
Colette ZINUTTI . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Pharmacie galénique
PROFESSEUR ASSOCIÉ
Anne MAHEUT-BOSSER . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Sémiologie
PROFESSEUR AGRÉGÉ
Christophe COCHAUD . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Anglais
Bibliothèque Universitaire Santé-Lionnois (Pharmacie-Odontologie)
Anne-Pascale PARRET . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Directeur

SERMENT DES APOTHICAIRES
Je jure, en présence des maîtres de la Faculté, des conseillers

de l’ordre des pharmaciens et de mes condisciples :
D’honorer ceux qui m’ont instruit dans les préceptes de

mon art et de leur témoigner ma reconnaissance en restant
fidèle à leur enseignement.
D’exercer, dans l’intérêt de la santé publique, ma profes-

sion avec conscience et de respecter non seulement la lé-
gislation en vigueur, mais aussi les règles de l’honneur, de
la probité et du désintéressement.
De ne jamais oublier ma responsabilité et mes devoirs en-

vers le malade et sa dignité humaine ; en aucun cas, je ne
consentirai à utiliser mes connaissances et mon état pour
corrompre les moeurs et favoriser des actes criminels.
Que les hommes m’accordent leur estime si je suis fidèle à

mes promesses.
Que je sois couvert d’opprobre et méprisé de mes confrères
si j’y manque.
REMERCIEMENTS
Je tiens tout d’abord à exprimer ma profonde gratitude aux membres du jury qui
ont accepté d’évaluer cette thèse d’exercice.
À mon président de thèse, Madame Chantal Finance, Professeur à la

Faculté de pharmacie de Nancy :
Merci à vous qui me faîtes l’honneur et le plaisir de présider ce jury de
thèse ; vous avez toujours su garder un oeil bienveillant sur moi durant
mon parcours nancéien, mais aussi japonais.
À mon directeur de thèse, Madame Annie Marc, Directeur de Recherche

au CNRS :
Merci pour votre encadrement, vos conseils précieux, ainsi que pour la
confiance que vous m’avez apportée dans la réalisation de ce travail.
À mon juge, Monsieur Frantz Fournier, Maître de conférences à

l’ENSAIA :
Merci pour votre attention et pour votre éclairage savant pour les
parties informatiques de mon travail.
Merci également à Mademoiselle Emma Petiot, Docteur INPL du

Laboratoire des Sciences du Génie Chimique (LSGC-GPBA), qui m’a
fourni tous les résultats expérimentaux nécessaires à la modélisation et
dont le travail bibliographique m’a énormément servi. C’est très
clairement grâce au travail d’Emma que ce document existe aujourd’hui.
Par ailleurs, je tiens aussi à remercier mes proches à qui je dédie ce manuscrit.
À Aude,
Toi qui m’a tant apporté par ton soutien et ta présence. Merci de faire
route avec moi dans la vie, pour la vie.
À mes parents,
Vous avez été présents lorsque j’en ai eu besoin, merci de m’avoir aidé à
réaliser mes ambitions. J’espère que vous serez fiers de cette
concrétisation.
À ma famille plus largement,

À Cousin et Cousine, pour ce lien si particulier qui nous unit,
À Babette et Jean, Laurence et François, pour votre générosité,
À mes grands-mères, pour votre profonde affection,
À mes grands-pères, à qui je pense,
À mon parrain,
À ma tatie, auprès de laquelle j’aurais adoré apprendre à soigner les
Hommes.
À tous mes amis,

Bastien, Thibaut, Sébastien, Jean-Philippe, Xavier, Amandine, Hélène,
Nadine, Carole et Arnaud pour les merveilleux moments passés
ensemble et pour votre amitié.
o
Table des matières
i
Table des figures
ii
Liste des tableaux
iii
Introduction
Les bioprocédés ont connu un essor considérable dans les industries pharmaceu-
tiques au cours de ces dernières décennies ; les biotechnologies y ont réussi leur pari
en passant, en l’espace de quelques années, de la théorie à la réalité. À constater
l’évolution forte du marché des biomédicaments, les biotechnologies et l’industrie
pharmaceutique sont de plus en plus intimement liées. Cela se concrétise particu-
lièrement bien en ce qui concerne le domaine des vaccins, puisque la production de
vaccins est complètement indissociable des techniques de culture de cellules animales.
Sous l’impulsion des autorités de santé et sous l’effet d’une concurrence exacerbée,
les industries de santé se doivent de maîtriser de mieux en mieux leurs procédés de
production, à fortiori les procédés biotechnologiques. Cette maîtrise passe par une
meilleure compréhension des procédés et de leur fonctionnement et par l’utilisation
de nouveaux outils tels que les modèles mathématiques. C’est dans cette optique, de
compréhension et d’amélioration quantitative et qualitative des connaissances, que
s’intègre le travail qui a servi de base à cette thèse d’exercice.
J’ai eu l’occasion de travailler avec les équipes du LSGC-GPBA, dans le cadre de

mon projet de fin d’études à l’ENSIC, sur une thématique de modélisation de cultures
de cellules Vero. Ces travaux se sont déroulés en alternance sur une période de 18
mois environ. J’ai choisi de poursuivre ce travail à travers la rédaction de ma thèse
d’exercice, car cela me permettait de satisfaire deux conditions qui me semblaient
importantes :
– développer des thématiques originales, très peu représentées dans le registre
des thèses de la Faculté de Pharmacie de Nancy ;
1
– exprimer les diverses facettes de ma double formation, à travers un sujet pou-
vant être abordé avec différentes sensibilités.
J’ai donc essayé, au sein de ce document, de réunir différents concepts naviguant

entre ma formation de pharmacien, ma formation d’ingénieur et mon affinité toute
particulière pour le monde de la production pharmaceutique.
Ce document s’articulera autour de trois parties distinctes. En premier lieu, il
situera le sujet dans son contexte à travers plusieurs définitions et apportera des
éléments bibliographiques indispensables à la poursuite de la lecture.
La seconde section sera dédiée à l’approche de la modélisation et présentera des
morceaux choisis réalisés dans le cadre du projet de fin d’études.
Enfin, la dernière partie exposera deux sujets complémentaires : la maîtrise du
procédé de culture cellulaire en lui même, ainsi que la maîtrise des biocontaminations
dans un environnement de production stérile.
J’ai choisi de rédiger cette thèse à l’aide du programme libre et gratuit LATEX. Des
renseignements concernant ce programme efficace et peu répandu sont disponibles
dans l’annexe ??. Le lecteur trouvera notamment un index, une listes de abréviations,
ainsi qu’une nomenclature en fin de document (Annexe ??), afin que la navigation
dans ce document soit plus aisée.
2
Première partie
Revue générale de la littérature

sur le sujet traité
3
Chapitre 1
La classe thérapeutique des

vaccins
Du fait de leur empreinte biologique et de leur caractère préventif, les vaccins

sont pendant longtemps restés des thérapeutiques à part. Ce document étant dédié
aux pharmaciens, mais aussi ouvert à un public plus large, il paraissait doublement
important de consacrer un chapitre entier de cet ouvrage pour redéfinir les grandes
lignes de la vaccinologie.
Après avoir effectué un bref rappel historique concernant l’évolution de la vac-
cination à travers les âges et après avoir brossé une esquisse de l’économie et du
marché actuel, ce chapitre reviendra sur cette classe thérapeutique, ses spécificités
et les technologies associées.
1.1 Définition
La vaccination est un procédé conférant une immunisation active au patient, c’est

à dire durable dans le temps, faisant appel à la stimulation immunitaire de l’individu.
Le vaccin agit sur le système immunitaire de la même manière qu’un agent pathogène
naturel et joue le rôle de la primo-infection sans pour autant déclarer de pathologies.
En cas de contact avec le pathogène, l’organisme réagit comme s’il s’agissait d’une
réinfection et la réponse du système immunitaire est élevée et très rapide.
4
1. La classe thérapeutique des vaccins
1.2. Un bref historique de la vaccination
1.2 Un bref historique de la vaccination
1.2.1 L’antiquité et la variolisation
Dès l’antiquité, les anciens avaient déjà noté que certaines maladies graves inter-
prétées comme étant des intoxications par des miasmes ambiants, ne pouvaient se
contracter successivement à deux reprises. D’où cette idée assez précoce d’imiter la
nature en provoquant de façon artificielle des formes atténuées de certaines maladies.
Cependant cette constatation archaïque est longtemps restée non vérifiée. C’est
seulement au XIème siècle, en Chine, que l’on retrouve des traces précises de la
pratique de la variolisation ; les chinois utilisaient alors le pus ou les squames broyées
d’un patient et les plaçaient dans les narines d’un sujet sain. On doit l’importation
occidentale de cette technique de variolisation à Bartholin qui la rapporte en Europe
dès 1673 [?].
Bien que la variolisation soit souvent efficace pour prévenir la variole, les résul-
tats des campagnes de variolisation restaient mitigés et irréguliers puisque 2 à 3%
des personnes mouraient d’une variole ainsi contractée. En 1760, Daniel Bernouilli,
mathématicien, physicien et docteur en médecine démontrera que, malgré les risques,
la généralisation de cette technique aurait permis de gagner un peu plus de trois ans
d’espérance de vie à la naissance [?], [?].
1.2.2 Fondement du principe de la vaccination par Jenner
Le 14 mai 1796, Edward Jenner inocule dans la peau d’un enfant de paysan
de huit ans, du pus de vache souffrant de variole bovine, encore appelée vaccine. Un
mois plus tard, il vérifie que le sujet est immunisé en lui inoculant cette fois-ci du pus
humain. Le travail de Jenner est sans aucun doute la première approche scientifique
de contrôle d’une maladie infectieuse au moyen d’une inoculation délibérée. S’il s’est
vraisemblablement inspiré des tentatives empiriques restées dans l’Histoire, il est le
premier à avoir situé ses recherches dans une perspective clinique et épidémiologique.
Jenner poursuivit ses études et conclut en 1810 que l’immunité conférée ne durait
pas toute la vie, sans pour autant en identifier précisément la raison. On peut donc
5
attribuer à Jenner la découverte du principe de la vaccination par germes atténués

ainsi que les concepts de virulence, d’atténuation et de revaccination qui ont vu le
jour au début du XIXème siècle [?].
En 1879, Ernest Chambon crée l’Institut de la vaccine à Paris ; il affine et gé-
néralise une technique de préparation de pulpe vaccinale glycérinée, plus facilement
transportable et utilisable. Par la suite, seront mises au point des techniques de
congélation et de préparation de vaccin sec. Grâce aux campagnes menées entre
1967 et 1977 sous l’égide de l’OMS, la variole a pu être définitivement éliminée de la
surface du monde, le dernier cas sauvage étant survenu en août 1977 en Somalie [?].
1.2.3 Louis Pasteur et le principe de l’atténuation
Il a fallu attendre près d’un siècle pour pouvoir percevoir de manière plus claire
les problématiques relatives à la vaccination, grâce à Louis Pasteur. En effet, Pasteur
a démontré l’origine des maladies infectieuses, et a aussi prouvé qu’il était possible de
s’en protéger par l’injection de germes atténués, provoquant une maladie d’expression
bénigne et permettant de développer une immunité solide et durable. À la fin des
années 1870, le travail de Pasteur sur l’atténuation du virus du choléra du poulet fut
un pas décisif supplémentaire avec l’utilisation, non pas d’un organisme proche de
celui provoquant la maladie, mais de cette même souche ayant perdu de sa virulence
[?]. L’étape fondamentale de la vaccination humaine fut franchie le 4 juillet 1885,
quand Pasteur appliqua pour la première fois, au petit Joseph Meister, le premier
traitement antirabique en post-exposition ; ce dernier vaccin cultivé sur moelle de
lapin avait déjà été testé positivement chez le chien [?].
A la fin du XIXème siècle de nombreux travaux sur les vaccins sont menés de façon
indépendante par différents chercheurs. Ainsi, à la fin du siècle, l’humanité disposait
de deux vaccins antiviraux vivants : le vaccin antirabique et le vaccin antivariolique,
ainsi que de trois vaccins bactériens "tués" contre : la typhoïde, le choléra et la peste
[?].
6
1.2.4 L’ère moderne
En décembre 1908, Albert Calmette et Camille Guérin décrivaient à l’Académie

des Sciences une nouvelle souche de bacille tuberculeux, issue d’une souche de My-
cobacterium bovis. Ils l’appelèrent d’abord bacille tuberculeux bilié, puis bacille de
Calmette et Guérin, simplifié ensuite en BCG. Après 13 années de recherche, Cal-
mette et Guérin parvinrent à rendre cette bactérie inoffensive. Depuis la fin de la
deuxième guerre mondiale, le BCG reste le vaccin le plus utilisé au monde, et son ef-
ficacité sur les formes graves de tuberculose de l’enfant est universellement reconnue
[?].
À partir de 1933, la mise au point de techniques de culture de virus sur oeuf de

poulet embryonné permet de stopper l’utilisation d’animaux de laboratoire, et ces
techniques se sont révélées les plus économiques et les plus sûres jusqu’à l’avènement
des cultures cellulaires [?]. Le premier vaccin préparé sur oeuf embryonné est le vaccin
contre la fièvre jaune mis au point par Max Theiler en 1937, suivi par le vaccin
antigrippal inactivé de Jonas Salk et un vaccin vivant atténué contre les oreillons par
Anatol Smorodintsev, en 1949 [?], [?].
L’âge d’or de la vaccination débute après la seconde guerre mondiale, avec la
mise au point des techniques de cultures tissulaires par John Enders, en 1949. Le
premier vaccin de ce type à être mis sur le marché fut le vaccin antipoliomyélitique
inactivé injectable de Jonas Salk, en 1954. De façon contemporaine, en 1957, Al-
bert Sabin développe un vaccin antipoliomyélitique oral [?]. Grâce aux possibilités
de reproduire les virus sur cultures cellulaires puis de les atténuer, se sont ensuite dé-
veloppés successivement les vaccins contre la rougeole, contre la rubéole (1962-1970)
et les oreillons (1966), à partir de virus cultivé sur embryon de poulet ou de cellules
diploïdes humaines [?].
Les vaccins antirabiques ont été considérablement améliorés depuis Pasteur ; ils
sont maintenant préparés sur souriceaux nouveau-nés ou, à un coût plus important,
sur cellules Vero, et beaucoup mieux tolérés.
À partir de 1968 sont mis au point des vaccins utilisant des fragments de capsule
7
1.3. Économie et avenir de la vaccination
des bactéries de nature polysaccharidique, à savoir : vaccins contre les méningites

dues aux méningocoques A et C (1971), contre l’Haemophilus influenzae b (1980),
contre la typhoïde dite Vi (1984) et les infections à pneumocoques (1978) [?].
En 1976, est utilisé pour la première fois en France le vaccin contre l’hépatite
B élaboré par Philippe Maupas. Ce vaccin nécessitait l’utilisation d’antigènes plas-
matiques humains, rendant sa fabrication extrêmement coûteuse et sa disponibilité
limitée. Pour ces raisons, la recherche s’est rapidement orientée vers l’élaboration de
vaccins recombinants, produits par génie génétique 1 .
Une des récentes avancées concerne le cancer du col de l’utérus, qui est une cause
majeure de décès chez les femmes dans les pays en développement. Plus de 9% des
cancers du col de l’utérus sont associés à une infection génitale par un HPV, l’infec-
tion virale la plus fréquente des voies génitales dans le monde, qui touche un nombre
de personnes estimé à 660 millions. Deux vaccins anti-HPV expérimentaux, consti-
tués par des pseudoparticules virales recombinantes dépourvues d’ADN sont en cours
d’essais pour évaluer leur efficacité vis-à-vis des lésions cervicales précancéreuses de
grade modéré et de haut grade chez des femmes de 15 à 25 ans.
Comme nous avons pu le voir, l’histoire de la vaccination est particulièrement

riche et intéressante. Cependant, toutes ces avancées de la science ne se sont pas
déroulées sans obstacles. Un certain nombre d’incidents inhérents à la vaccination
et à sa mise en œuvre ont parfois entraîné un nombre important de morts. Ces
malheureux accidents ont parfois contribué à ternir l’image que l’opinion publique
peut porter à l’encontre des vaccins. Peut-être ces évènements sont-ils responsables
des réticences latentes qui peuvent exister encore actuellement ?
1.3 Économie et avenir de la vaccination
Dans les années 1980, les vaccins ont été considérés comme les parents pauvres des
spécialités pharmaceutiques. Contrairement à ce que l’on pourrait penser, les vaccins
1. Ces vaccins, décrits dans la suite de ce chapitre, sont des vaccins produits à partir des tech-
nologies de recombinaison de l’ADN, soit par délétion de séquences génétiques pathogènes, soit par
assemblage des antigènes seuls.
8
sont quasi négligeables en terme de valeur ; en effet, ils n’ont longtemps représenté
que quelques pour cents des ventes du secteur pharmaceutique. Les vaccins étaient
des produits à technologie plutôt bien maîtrisée, à faible marge, vendus sur un marché
fortement régulé et qui présentaient peu de perspectives de profit [?].
En l’espace d’une vingtaine d’années, les considérations économiques concernant
les vaccins ont beaucoup changé. L’augmentation continue de la demande, l’appa-
rition de nouveaux besoins (grandes pandémies, VIH, bio-terrorisme,...), ainsi que
l’émergence de produits innovants et de nouvelles technologies sont à l’origine d’une
forte croissance du marché des vaccins (figure 1.1).
Figure 1.1 – Un marché en croissance rapide [?]
Plusieurs raisons justifient cette évolution marquante :

– plusieurs vaccins récemment introduits sur le marché ont généré de très impor-
tants bénéfices pour les laboratoires les commercialisant. Certaines spécialités
vaccinales se sont même hissées au rang de blockbuster 2 . On peut ainsi citer
2. Médicament générant plus de 1 milliard de dollars de bénéfices
9
le Prevenarr 3 commercialisé par Wyeth qui capitalise plus de 3 milliards de

dollars, ou encore le Menactrar 4 de Sanofi Pasteur qui avoisine le milliard de
dollars ;
– les récentes poussées pandémiques ont rendu les marchés plus stables, plus
prédictibles et par conséquent plus exploitables ;
– l’acceptation lente mais croissante de cette classe thérapeutique par l’opinion
publique et la croissance économique dans les marchés émergents augmentent
l’intérêt économique.
Cet intérêt croissant des laboratoires pour cette classe thérapeutique se manifeste
par un accroissement certain des dépenses visant à élaborer de nouveaux vaccins et
de nouvelles technologies. En effet, depuis Edward Jenner, les méthodes de dévelop-
pement, de production et les pratiques cliniques associées à la vaccination ont bien
changé et les deux dernières décennies ont été parmi les plus prolifiques en terme d’in-
novation. L’industrie du vaccin investit désormais dans la R&D dans des proportions
comparables à celle du reste de l’industrie pharmaceutique.
Les caractéristiques du marché des vaccins
D’un point de vue économique, le marché des vaccins reste un marché à part,
répondant à certaines caractéristiques bien précises :
– le marché des vaccins est dominé par un petit nombre de producteurs : en raison
de choix stratégiques, le nombre de grandes entreprises produisant des vaccins à
fortement diminué. Comme le montre la figure 1.2 un nombre très restreint d’ac-
teurs se partagent la quasi totalité du marché, à savoir : Sanofi-Pasteur, GlaxoS-
mithKline Biologicals, Wyeth (Pfizer), Merck-Serono et Novartis-Chiron. Les
producteurs de vaccins sont peu nombreux car une taille importante est né-
cessaire pour tirer parti des économies d’échelle. Les barrières à l’entrée sont
considérables non seulement à cause des coûts fixes, mais aussi des contraintes
règlementaires et du temps nécessaire pour maîtriser tous les aspects du pro-
3. Polyoside pneumococcique contre les infections à pnuemocoques
4. Vaccin tétravalent contre la méningite à méningocoques
10
cessus de production ;
Figure 1.2 – Répartition mondiale des parts de marché entre les principaux acteurs
pharmaceutiques en vaccinologie, d’après [?]
– le nombre d’acheteurs internationaux est limité : le vaccin est un produit dont

la consommation est sous l’impulsion des professionnels de santé publique et
des les États.
– le marché des vaccins est segmenté et les prix très différenciés : le marché des
vaccins subit une double segmentation en fonction du type de vaccin (première
génération, seconde génération, vaccins recombinants, ...) et en fonction de
l’acheteur (public, privé, riche, en développement).
– l’importance des économies d’échelle en production : les coûts variables (ma-
tières premières et composants, emballages,...) ne représentent que 15% des
coûts totaux de production. En effet, la majeure partie des coûts est fixe ou
semi-fixe (équipements, usines, R&D,...) et ne dépend pas des doses produites.
Par conséquent, l’offre des vaccins n’est pas élastique de sorte que les chocs sur
l’offre ou la demande peuvent amener, soit à des hausses importantes de prix,
soit à des pénuries ou des ruptures de stock [?].
Perspectives futures du marché des vaccins
11
1.4. Aspects galéniques des vaccins
La recherche sur les vaccins ne cesse de continuer. Le développement du génie

génétique et des vaccins recombinants a permis d’ouvrir de nouvelles perspectives à la
vaccination. Au delà des traditionnels vaccins prophylactiques, la recherche s’oriente
vers la création de nouveaux vaccins thérapeutiques. Les grands défis et les grands
espoirs en ce début de siècle concernent essentiellement le développement de vaccins
thérapeutiques contre le SIDA ou contre certains cancers. Il est possible de citer le
vaccin anti-βHCG qui est en cours de développement pour contrer les cancers βHCG
dépendants comme le cancer des ovaires, le cancer des testicules, le cancer colorectal
ou le cancer du sein.
Outre le développement de nouveaux traitements, l’accès à la vaccination est aussi

une problématique en vue. L’OMS souhaite que l’accessibilité à la vaccination soit la
plus large possible, et ce notamment pour les pays en voie de développement. Pour
améliorer l’accessibilité des vaccins, les recherches doivent intégrer la notion du coût
du traitement afin de diminuer les dépenses pour les campagnes de vaccination. Les
deux paramètres intervenant dans le coût élevé de la vaccination sont : la nécessité
d’un encadrement médical pour effectuer la campagne de vaccination (à cause de
l’utilisation globale de la voie parentérale pour l’administration de vaccins) et surtout
le coût de production des vaccins.
L’OMS souhaite aussi que les recherches s’accentuent pour établir de nouveaux
procédés de fabrication de vaccins, notamment à partir de plantes 5 . Cela permettrait
peut être de diminuer les coûts de production et d’obtenir des vaccins administrables
par voie orale, ou par l’intermédiaire de « véhicules »particuliers tels que les fruits et
légumes vaccinants [?].
1.4 Aspects galéniques des vaccins
La forme galénique des vaccins correspond à la rencontre de plusieurs éléments

majeurs :
– un ou plusieurs principes actifs immunogènes ;
5. Par mise en culture de cellules d’origine végétale
12
– des excipients (adjuvants, stabilisants, . . .) ;

– des concepts technologiques permettant la formulation (stérilisation, lyophili-
sation, séchage, . . .).
1.4.1 Le principe actif
Il existe un très grand nombre de principes actifs immunogènes différents allant

de la plus simple molécule à la structure la plus complexe. Ces principes actifs se
doivent de répondre à certaines propriétés ; ils doivent notamment présenter :
– une certaine pureté ;
– une certaine stabilité et compatibilité avec le solvant et le conditionnement
primaire ;
– une propension plus ou moins forte à la stérilisation.
1.4.1.1 Les différents types de principes actifs et les différents vaccins

associés
1.4.1.1.1 Les vaccins vivants atténués
Ces vaccins sont composés d’agents pathogènes vivants d’origine virale dont la
pathogénicité a été atténuée. L’atténuation s’effectue par sélection de souches du
pathogène présentant une faible virulence chez l’homme et ces souches peuvent être
obtenues de deux manières différentes. Une des stratégies envisageables consiste à
choisir une souche virale spécifique d’une espèce animale présentant des homologies
avec la souche virale humaine, mais non infectieuse en raison de la barrière inter-
espèces [?]. On peut également atténuer un virus par passages successifs sur animal
ou sur culture cellulaire à des températures spécifiques de manière à sélectionner les
mutants adéquats [?]. Ce type de vaccin est parfois considéré comme étant le plus
efficace ; il présente l’avantage d’être actif à faibles doses et est souvent administré
en unidose.
A titre d’exemple, les vaccins contre les oreillons, la rougeole ou la rubéole sont
typiquement des vaccins appartenant à cette classe. Les vaccins atténués vivants ne
13
concernent pratiquement que les vaccins viraux car il s’avère difficile d’amoindrir
le pouvoir pathogène des bactéries sans faire disparaître totalement leur pouvoir
immunogène. Il n’existe en réalité qu’un seul vaccin vivant atténué anti-bactérien :
il s’agit du BCG, luttant contre la tuberculose.
1.4.1.1.2 Les vaccins entiers inactivés
Ces vaccins sont composés d’agents pathogènes dans leur intégrité mais qui ont
été auparavant inactivés par des procédés physiques ou chimiques 6 empêchant toute
réplication de l’agent pathogène [?]. Ces vaccins apportent également au système
immunitaire l’ensemble des antigènes du micro-organisme.
Ils apportent une sécurité supplémentaire pour le patient car il n’y a aucun risque
de réapparition de la pathogénicité. En revanche, ils nécessitent généralement une
injection à plus forte dose et/ou une administration répétée pour maintenir l’état de
protection immunologique à plus long terme.
On peut citer comme représentants de cette classe les vaccins contre la grippe,
l’hépatite A, l’encéphalite japonaise, la poliomyélite ou encore la rage, ainsi que les
vaccins bactériens contre la coqueluche, le méningocoque, le pneumocoque, . . .
1.4.1.1.3 Les vaccins inertes
Les vaccins composés d’anatoxines

La diphtérie et le tétanos sont deux maladies graves qui ne sont pas transmises
directement par l’agent pathogène mais par des protéines sécrétées par les micro-
organismes, appelées anatoxines. Ces anatoxines ont la propriété de provoquer une
réaction immunologique qui protège l’organisme. Tout comme pour les vaccins vi-
vants, ces anatoxines sont fabriquées à partir de sécrétions bactériennes puis sont
purifiées et traitées pour leur faire perdre leur toxicité.
Les vaccins recombinants
6. Par procédé d’inactivation physique, on entend essentiellement l’emploi des méthodes ther-
miques. Les procédés chimiques utilisent quant à eux essentiellement le formol ou la propiolactone
14
D’immenses progrès ont été réalisés ces dernières années dans l’identification des
antigènes des virus, des bactéries et des parasites, et surtout dans l’isolement et le
clonage des gènes permettant la fabrication d’antigènes. Il est maintenant possible
de créer de novo des souches rendues totalement inoffensives par voir génétique. Il
s’agit alors d’inactiver ou d’éliminer les gènes responsables de leur pathogénicité et
de leur virulence. Il est aussi possible de se servir des micro-organismes manipu-
lés comme vecteurs de gènes codants pour d’autres micro-organismes pathogènes.
Ainsi la protection est mixte, à la fois contre le vecteur et contre un gène étranger
supplémentaire ; on parle alors de multivalence.
Ces systèmes sont également plus intéressants du point de vue de la sécurité,
puisque le risque de réversion de la virulence, possible avec les vaccins vivants atté-
nués classiques, est à exclure [?]. Ces nouveaux vaccins sont communément appelés
les vaccins vivants recombinants. Par contre, ils sont faiblement immunogènes d’ori-
gine et nécessitent souvent l’administration conjointe d’une substance qui stimule
leur pouvoir immunogène.
Les vaccins sous-unités
Grâce aux connaissances acquises en génie génétique, des vaccins appelés vaccins
sous-unités peuvent être fabriqués par clonage de la séquence d’ADN antigénique.
Les gènes cibles sont introduits dans le micro-organisme servant alors d’« usine cel-
lulaire »pour la production d’antigènes. Ces antigènes recombinants sont ensuite
purifiés et peuvent servir de base à des vaccins moléculaires aussi appelés vaccins
sous-unités.
L’amélioration des techniques de recombinaison de gènes et l’innocuité des vaccins
obtenus font que la plupart des nouveaux vaccins en développement sont des vaccins
sous-unités. L’exemple de vaccins sous-unités le plus connu sur le marché est le vaccin
contre l’hépatite B, développé par l’institut Pasteur. Il est composé de l’antigène HBs
qui est une protéine de surface du virus de l’hépatite B. Lorsque l’antigène est de
courte taille, comme c’est le cas pour un antigène de type polysaccharidique, il est
nécessaire de conjuguer cet antigène et de le coupler chimiquement à une protéine
porteuse.
15
Les vaccins à ARN nu

Les vaccins à ARN nu correspondent à des séquences d’ADN codant pour l’an-
tigène. L’acide nucléique (ARN) est directement introduit dans les cellules qui fa-
briquent les molécules antigéniques des micro-organismes ce qui déclenche la réaction
immunitaire. Le vaccin est donc produit localement par l’organisme à immuniser.
Le tableau 1.1 se propose de reprendre un certain nombre des informations pré-

sentées précédemment et de résumer cette classification.
1.4.2 Les adjuvants
En 1916, Le Moignie et Pinoy montrent que des émulsions d’huiles minérales aug-
mentent la réponse immunitaire contre un antigène et proposent ainsi une première
version d’adjuvant [?].
On appelle adjuvant en vaccinologie toute substance capable d’augmenter l’in-
tensité de la réponse immune dirigée contre un antigène. Les vaccins inertes et sous-
unités stimulent faiblement et pendant un laps de temps court le système immunitaire
de l’organisme. Administrés seuls, ces vaccins seraient insuffisants pour développer
une immunité correcte. L’activité d’un vaccin inerte dépend donc en grande partie
du choix de l’adjuvant ; ils permettent désormais, en plus d’augmenter la réponse
immunitaire, de cibler le type de réponse.
On distingue parmi les adjuvants, les agents immunostimulants et les véhicules.
Les premiers activent directement les cellules de l’immunité en se liant spécifiquement
à différents récepteurs. Les seconds diffusent l’antigène et déterminent la façon dont
il sera présenté au système immunitaire. Ces véhicules possèdent eux-mêmes des
propriétés immunostimulantes, ne serait ce que parce qu’ils constituent des corps
étrangers à l’organisme.
En plus de l’antigène, les vaccins renferment des molécules destinées à augmen-
ter et améliorer la réponse immunitaire générée suite à l’injection. Ces adjuvants
majorent et potentialisent la réponse immunitaire à travers plusieurs mécanismes :
– ils assurent la liaison des antigènes ;
16
Catégorie Type Définition Exemples

Vaccins vaccins contre rubéole,
Fabriqués à partir d’organismes ayant perdu leur
Première atténués fièvre jaune et oreillons
virulence par dénaturation ou sélection
génération
Vaccins Vaccins contre choléra
Fabriqués à partir de virus de bactéries tués
inactivés ou hépatite A
Vaccins contre tétanos
Toxoïdes Toxine inactivée ou détruite utilisée pour
ou diphtérie
immuniser contre certaines bactéries spécifiques
Vaccin contre
Vaccins Vaccins de
Contiennent un ou plusieurs composants d’un méningocoque, hépatite
traditionnels sous-unités
micro-organisme responsable de la maladie B ou paludisme
Vaccin contre
Vaccins
Contiennent des protéines membranaires Haemophilus influenzae
Deuxième conjugués
d’organismes pathogènes ou méningite de type B
génération
17
Vaccins par
Vaccin contre herpès ou
délétion Identification et ablation par manipulations
choléra
génique génétiques des gènes responsables de la virulence,

de la colonisation, de la réplication
Cervarixr , Pediatrixr ,
Vaccins
Fabriqués via la technologie de l’ADN recombinant Twinrixr , Gardasilr ,
recombinants
Lymerixr , Engerixr
Vaccins vaccins en
Développés principalement pour les patients
Vaccins Génie thérapeutiques développement clinique
atteints de cancer
recombinants génétique
Vaccins à vaccins en
Morceaux principaux d’ADN qui codent plusieurs
ADN développement clinique
protéines. Les protéines produites agissent comme
des antigènes
Table 1.1 – Description des différents types de vaccins [?]

– ils libèrent l’antigène dans les ganglions lymphatiques, un des compartiments

essentiels de la réponse immunitaire ;
– ils retiennent le vaccin au niveau du point d’injection ;
– ils activent le phénomène inflammatoire et attirent les macrophages qui pré-
sentent l’antigène au lymphocyte.
Parmi les principaux adjuvants utilisés, actuellement ou dans le passé, on peut

isoler 4 grandes familles d’adjuvants plus particulièrement [?] :
– les gels et sels d’aluminium (oxyhydroxyde, hydroxyphosphate) ;
– les phosphates de calcium ;
– les émulsions et liposomes, tels que le squalène ;
– les virosomes.
Un certain nombre de ces adjuvants sont maintenant interdits ou, du moins,
déconseillés.
1.4.3 Les autres excipients
Un certain nombre d’autres composants sont aussi présents dans les vaccins ; il
peut s’agir d’anti-bactériens, de stabilisants thermiques ou de tampons chimiques.
Selon les formes et selon les modes d’administration, on trouvera :
– des solvants permettant de former des solutions ou suspensions tels que l’eau
PPI ou des isotonisants (NaCl) ;
– des tampons, notamment tampons phosphates permettant d’élever le pH à des
valeurs usuelles de 7,35 à 7,4 ;
– des solubilisants ;
– des agents antimicrobiens (sulfates de néomycine, kanamycine, . . .) ;
– des conservateurs, dans le cas où le médicament ne supporterait pas la stérili-
sation.
Les conservateurs permettent au vaccin de conserver son intégrité et sa stérilité
à travers le temps et le préservent de conditions extérieures trop agressives. Ces
conservateurs sont particulièrement importants lorsqu’il s’agit d’un conditionnement
multidose, ce qui majore évidemment les risques microbiens associés. Parmi les plus
18
courants, on trouve ceux présentés dans le tableau 1.2.
Conservateurs Exemples
Thiomersal Vaccin diphtérie/tétanos
Anatoxine tétanique
2-phénoxyéthanol et formaldéhyde Vaccin inactivé contre la polio
Phénol Polysaccharide contre typhoïde et pneu-
mocoque
Chloride de benzethonium Anthrax
2-phénoxyéthanol Diphtérie/tétanos/coqueluche
Table 1.2 – Conservateurs et stabilisants utilisés dans les vaccins sous licence U.S.
[?]
Un petit nombre seulement de ces conservateurs est approuvé par les autorités
de santé et l’innocuité de ces molécules secondaires est particulièrement surveillée,
comme le montre le récent abandon du thiomersal, composé organo-mercurien po-
tentiellement dangereux.
1.4.4 Les présentations galéniques et les modes d’administration
Deux présentations galéniques privilégiées sont choisies pour mettre en forme les
vaccins :
– soit à l’état liquide simple, avec des solutions ou suspensions ;
– soit en lyophilisats, ce qui permet l’utilisation immédiate après reconstitution.
Les vaccins sont actuellement administrés par injection par voie sous-cutanée
ou par voie intramusculaire car ce sont les voies d’administration qui sont les plus
immunogènes. La voie intra-veineuse est faiblement immunogène et la voie orale est
tolérogène 7 . Cependant beaucoup d’efforts sont faits pour développer de nouveaux
vaccins pouvant être administrés par voie orale ou nasale car l’administration serait
plus aisée et ne nécessiterait plus un milieu médicalisé, d’où une diminution du
coût des campagnes. En fonction des types d’infection, le vaccin est administré une
7. Par opposition au terme immunogène, une substance tolérogène sera supportée par l’organisme
sans générer de réponse immunitaire
19
1.5. La production de vaccins
première fois et est potentiellement suivi au bout de quelques mois de 1 ou 2 rappels

pour assurer une immunisation correcte du patient. Des rappels peuvent aussi être
effectués tous les 5 à 10 ans pour pouvoir conserver l’immunité acquise lors des
premières vaccinations.
1.5 La production de vaccins
Il existe différentes technologies de procédés qui permettent d’obtenir des vaccins

viraux :
– la production par ovoculture, qui correspond à la culture de virus sur des oeufs
embryonnés. Une des particularité de cette technique de culture consiste en
la présence de traces de protéines d’oeuf 8 dans le produit fini, même après
extraction. Les personnes allergiques aux oeufs sont donc exposées à un risque
supplémentaire et potentiellement très dangereux lors de la vaccination.
– la production en monocouche, dite en « Monolayer », qui correspond à la mise
en culture dans des flacons de culture « roulants », les cellules se fixant aux
parois du flacon. La figure 1.3 rend un aperçu général du procédé de production
en monocouche.
– la production en biogénérateurs, qui correspond à la culture de micro-organismes
dans des fermenteurs de grands volumes. Le second chapitre de ce manuscrit
sera consacré à reformuler les fondements précis de cette dernière technologie.
Le dénominateur commun de ces différentes alternatives est que chacune utilise
l’« usine cellulaire »afin de produire les vaccins. Deux types de lignées cellulaires
peuvent être utilisées :
– les cellules de lignée : cellules sélectionnées pour leurs caractéristiques et no-
tamment pour leur capacité à recevoir le virus inoculé et pour leur aptitude à se
multiplier dans des conditions de culture classique. Conservées dans de l’azote
liquide à une température de -196 °C, ces cellules sont congelées précaution-
neusement dans un cryoprotecteur tel que le DMSO. Après un court passage
de décongélation dans un bain-maire chauffé, les cellules sont diluées lentement
8. albumine et ovalbumine
20
1.5. La production de vaccins
dans le milieu de culture contenant l’ensemble des composants favorables à leur

croissance.
– les cellules primaires : cellules d’oeufs embryonnés âgés de quelques jours, ori-
ginaires d’oeufs de canes ou de poules, conventionnels ou exempts d’organismes
pathogènes spécifiques. Une fois prélevés, les embryons subissent un traitement
enzymatique protéolytique.
Figure 1.3 – Aperçu général du procédé de production de vaccins en monocouche

[?]
21
Chapitre 2
La cellule Vero et sa mise en

culture
Après avoir fait une revue très générale des différents types de vaccins et de leurs
modes de production associés, ce chapitre se propose de recentrer la discussion sur
un contexte plus précis.
La première partie de ce chapitre sera consacrée aux spécificités de la lignée
cellulaire Vero, particulièrement utilisée en bioproduction, notamment de vaccins ;
la seconde partie s’intéressera plus particulièrement à la technologie de la culture
cellulaire en bioréacteurs.
2.1 Description de la lignée cellulaire Vero
Historiquement, la cellule Vero a été isolée et décrite pour la première fois en mars
1962 par Y.Yasumura et Y.Kawakita à l’université de Chiba au Japon. Cette cellule
est issue de rein de singe vert adulte d’Afrique (Certopithecus aethiops) [?]. Son nom
"Vero" résulte de l’abréviation du terme "Verda Reno", qui signifie lui-même "rein
vert" en espéranto.
La lignée Vero à été caractérisée comme substrat pour la production de vaccins
viraux par les équipes de l’Institut Mérieux dans les années 1980. La caractérisation
initiale de cette lignée cellulaire a facilité l’obtention des molécules biologiques à usage
22
2. La cellule Vero et sa mise en culture
2.1. Description de la lignée cellulaire Vero
thérapeutique tout en s’affranchissant de l’utilisation d’animaux et des nombreux

agents infectieux potentiellement présents dans les cultures primaires extraites de
reins de singes verts [?]. Les principales caractéristiques de cette lignée cellulaire
sont présentées dans le tableau 2.1.
Origine Rein de singes verts d’Afrique

Transformation Naturelle ; au cours des passages successifs
Tumorigénicité Non tumorigène (d’après la définition du WHO)
pas de nodules dont la taille augmente avec le temps (>21j)
pas de métastases
Caryotype Aneuploïde : 58 chromosomes dans 66 % des cellules
Culture Adhérente
Référence ATCC CCL81, 124° passage
Traçabilité Suivie depuis son origine, traçabilité complète (milieu, sé-
rum 1 )
Permissivité SV-40, SV-5, rougeole, arbovirus, réovirus, rubéole, adeno-
virus simien, poliovirus, grippe, virus respiratoire syncitial,
virus vaccinia
Caractéristiques Ne produit pas d’interféron
Table 2.1 – Caractéristiques de la lignée cellulaire Vero [?]
Dans le souci de revenir sur ce vocable assez spécifique, une lignée continue peut
être théoriquement répliquée à plusieurs reprises sans pour autant devenir sénescente.
La transformation correspond au passage des cellules d’un état différencié, vers un
état dédifférencié. Enfin, la lignée cellulaire Vero est continue et aneuploïde.
L’aneuploïdie correspond quant à elle à la propriété de présenter un nombre anor-
mal de chromosomes. Contrairement à d’autres cellules mammaliennes, les cellules
Vero ne sécrètent pas d’interféron de type 1 lors de l’infection par un virus ; elles
possèdent par contre toujours des récepteurs aux interférons α et β et répondent
donc correctement aux sources d’interféron extérieures.
23
2.2. Les procédés de culture de cellules Vero
2.2 Les procédés de culture de cellules Vero
Les cellules Vero ont été utilisées pour la première fois en 1984 pour la production
de vaccins viraux contre les poliovirus [?]. Ces cellules peuvent être cultivées en
flacons, ou encore sur microporteurs (figure 2.1).
Figure 2.1 – Cellules Vero cultivées en flacon de culture cellulaire (en haut après 2
et 3 jours de culture) et sur microporteurs (en bas après 1 et 3 jours de culture) [?]
Depuis, de nombreux autres procédés de production ont été développés. En effet,

de part sa capacité à se développer sur microporteurs, la lignée des cellules Vero a
été une des principales lignées cellulaires a être utilisée pour des productions indus-
trielles à grande échelle. Par conséquent, l’utilisation de cellules Vero s’est largement
diffusée ; elles servent maintenant de « substrat »pour la production de multiples
vaccins. Le tableau 2.2 se propose de faire la synthèse des principaux vaccins viraux
vivants ou inactivés, produits à l’aide de cellules Vero.
Dans ce type de procédés de production, une des préoccupations majeures est

d’augmenter la densité cellulaire afin d’augmenter au maximum le titre viral final et
les quantités produites. L’impact de l’aération, de l’agitation, de la concentration en
24
Genre Virus Type de vaccin Produit Société Stade
productrice
Poliovirus poliomyélite inactivé Imovax polior Sanofi Pasteurr 1982
vivant atténué OPV-Mérieuxr Sanofi Pasteur r 1988

Lyssavirus rage inactivé Verorabr Sanofi Pasteurr 1985
Rotavirus rotavirus humain et pentavalent vivant RotaTeqr Merckr 2006
bovin
rotavirus monovalant atténué Rotarixr GlaxoSmithKliner 2007
Flavivirus encéphalite japonaise inactivé atténué Ixiaror Intercellr 2009
inactivé atténué JE-PIV Walter red army Phase II
Institute of research
vivant atténué ChimeriVaxr -JE Acambisr Phase III
chimérique
dengue vivant atténué Blomberg School of
chimérique à partir Public Health / NIH
du sérotype DEN-4
vivant atténué ChimeriVaxr - Acambisr Phase III
chimérique Dengue Sanofi Pasteurr
2.2. Les procédés de culture de cellules Vero

25
tétravalent basé sur

la plateforme
ChimeriVax
encéphalite West vivant atténué ChimeriVaxr -WN02 Acambisr Phase II
Nile chimérique basé sur
la plateforme
ChimeriVax
Lyssavirus ross river virus RRV inactivé Baxterr Phase I/II
tests
chikungunya inactivé Baxterr
précliniques
tests
inactivé Baxterr
précliniques
SARS inactivé Baxterr Phase I/II
Smallpox virus Smallpox virus ACAM2000 Acambisr Phase III
Influenza grippe saisonnière inactivé Baxterr Phase III
grippe A H5N1 inactivé Celvapanr Baxterr 2009
Table 2.2 – Synthèse des vaccins viraux produits à partir de la culture de cellules Vero [?], [?]
2.3. Les milieux de culture
microporteurs, du type de surface d’adhésion ou de la concentration à l’ensemence-

ment sont autant de paramètres primordiaux étudiés afin d’optimiser le procédé.
Un autre paramètre apparaît comme crucial dans le bon déroulement de la culture
cellulaire ainsi que dans la production virale : il s’agit de la composition du milieu
de culture.
2.3 Les milieux de culture
Les cellules animales, plus que les autres lignées cellulaires utilisées en biopro-
duction, sont particulièrement difficiles à cultiver car elles exigent des besoins en
éléments nutritifs particulièrement complexes. Pendant de très nombreuses années,
le sérum de veau fœtal (SVF) a été le complément nutritif de choix qui permettait
d’améliorer au mieux la croissance et le maintien cellulaire. En effet, les milieux
de base sont riches en éléments nutritifs simples 2 , mais sont totalement dépourvus
d’autres molécules pourtant essentielles, telles que des facteurs de croissance, des
facteurs d’adhésion, des agents détoxifiants, des co-facteurs, . . .
L’origine animale du SVF induit cependant quelques inconvénients de taille [?] :
– un problème de sécurité virale manifeste et de biocontaminations à la source,
qui a pris une importance prépondérante depuis les questionnements concer-
nant la présence de prions dans le vaccin de la polio au Royaume-Uni ;
– un problème de qualité des produits, puisque la composition du SVF est sujette
à variation ;
– des difficultés d’extraction et de purification après production virale ;
– un problème de traçabilité.
Une des nouvelles tendances consiste donc à cultiver les cellules dans des milieux sans
sérum. Plusieurs lignées cellulaires, telles que les CHO ou les hybridomes, s’adaptent
plutôt bien à cet environnement sans sérum. En revanche, il est beaucoup plus délicat
d’adapter les cellules adhérentes, aux besoins encore plus spécifiques, à ces nouveaux
milieux [?],[?]. Quelques milieux ont cependant été développés en ce sens pour les
lignées cellulaires Vero (tableau 2.3).
2. sucres, acides aminés, vitamines, ions, . . .
26
Milieu Composition Origine Lignée cellulaire Publication
Ex-cell medium Contient des hydrolysats JRH biosciences Vero Kalell et al., 2007
de plantes et a un faible
contenu en protéines re-
combinantes
MDSS2 Axcell Biotechnologies Vero / BHK Merten et al., 1994
M-VSFM Addition de 10 % à un mi- Department of Microbio- Vero / MDCK / BHK Butler et al., 2000
lieu DMEM logy, University of Mani-
27
toba
VP-SFM Invitrogen Vero Frazatti-Gallina et al.,
2004
SFM 1 :1 volume VP-SFM / Invitrogen / Sigma Vero Quesney et al., 2003
William’s E
2.3. Les milieux de culture

Table 2.3 – Milieux sans sérum dédiés à la culture de cellules Vero
2.4. La culture cellulaire en bioréacteur
La culture en milieu sans sérum implique cependant un inconvénient : la crois-

sance des cellules est clairement diminuée et la productivité s’en retrouve impactée
[?]. C’est la raison pour laquelle la plupart des cultures en milieu sans sérum se font
sur microporteurs. En effet, les lignées cellulaires cultivées sur microporteurs pré-
sentent généralement des rendements antigéniques plus importants que les lignées
cultivées en suspension, ce qui compense en partie la perte de croissance. Les vo-
lumes moyens des bioréacteurs sont par contre plus faibles dans le cas des cultures
sur microporteurs.
2.4 La culture cellulaire en bioréacteur
Les bioréacteurs sont des unités technologiques permettant la multiplication maî-

trisée de micro-organismes. L’objectif visé peut être soit la production de biomasse
en tant que telle, ou encore la production d’un métabolite particulier par ces micro-
organismes.
Ces cuves sont le plus souvent en verre pour les petits contenants (figure 2.2) ou
en inox pour les plus gros volumes (figure 2.3, 2.4). Elles sont munies d’un dispo-
sitif d’agitation, d’un système d’aération et de balayage en différents gaz (O2 , N2 ,
CO2 , air. . .), ainsi que de voies permettant l’apport et l’extraction des substrats et
produits. Contrairement aux fioles ou aux spinners 3 , les bioréacteurs sont munis
de systèmes de contrôle et permettent de maîtriser plus précisément les paramètres
physiques de culture (agitation, température,. . .) et chimiques (pH, oxygène, nutri-
ments,. . .) à partir de mesures réalisées en ligne par des sondes. Les systèmes à grande
échelle sont également munis de dispositifs de nettoyage et de stérilisation en place.
2.4.1 Les différents modes d’alimentation et les cinétiques associées
La figure 2.5 présente les différents modes d’alimentation des cultures en milieu
nutritif :
3. Un spinner est un type de bioréacteur, de taille modérée, qui met en place un système d’agi-
tation du milieu de culture, direct ou indirect. voir figure 6.1, 73
28
Figure 2.2 – Bioréacteur en verre 5L, BIOSTAT B-DCUr Single version [?]
Figure 2.3 – Bioréacteur de culture cellulaire 300L, BioFlo Pror [?]
29
Figure 2.5 – Les différents modes de culture [?]

Figure 2.4 – Bioréacteur inox de 60 L photographié chez Amgen [?]
Chacune de ces différentes configurations induit une cinétique qui lui est propre
(figure 2.6).
Figure 2.6 – Cinétiques de croissance, de consommation et de production en fonction

du mode d’alimentation du bioréacteur [?]
Le choix du mode d’alimentation du bioréacteur dépend du comportement de la li-

gnée cellulaire, de la stabilité du produit, de la productivité envisagée, des contraintes
techniques et économiques.
2.4.1.1 Les cinétiques de culture en réacteur fermé
La figure 2.7 représente une cinétique de culture cellulaire classique en mode

discontinu.
30
Figure 2.7 – Représentation schématique d’une cinétique cellulaire classique
Elle se compose :
– d’une phase de latence, correspondant entre autre à la phase d’adhérence des
cellules sur leur support ;
– d’une phase de croissance exponentielle, caractérisée par une pente fortement
positive ;
– d’une phase de ralentissement de la croissance cellulaire ;
– d’une phase stationnaire, pour laquelle on note un équilibre entre le taux de
croissance réel et le taux de décès entraînant un taux de croissance apparent
nul ;
– d’une phase de mort cellulaire, le phénomène de mort cellulaire étant princi-
palement dû à l’accumulation de métabolites toxiques tels que le lactate.
Dans le cas du mode discontinu, encore appelé « batch », le système est dit fermé
et le milieu n’est pas renouvelé. La concentration en substrat diminue tandis que
celle du produit augmente avec la croissance cellulaire. Le milieu, une fois épuisé en
éléments nutritifs et enrichi en métabolites, n’assure plus son rôle nutritif. Dans le
cas de production à usage pharmaceutique, c’est le plus souvent ce mode de culture
qui est choisi puisqu’il est en entière adéquation avec la démarche de lot.
31
2.4.1.2 Les autres modes de culture
En plus du mode discontinu, le schéma 2.6 présente un certain nombre d’autres

modes de culture.
A titre informatif, le mode semi-continu, ou « fed-batch », correspond à l’ajout
de milieu frais, sans aucun soutirage ; il permet de maintenir la concentration en
substrat et de prolonger la phase de production des cellules. Le mode continu consiste
en l’alimentation en milieu frais et au soutirage du même volume de milieu usagé avec
les cellules. Ce mode permet de maintenir un équilibre dans les concentrations en
substrats, produits et cellules. Quant au mode perfusé, il permet le renouvellement
du milieu en parallèle d’un soutirage sans cellule 4 .
Ces différents modes de culture sont aujourd’hui minoritaires dans l’ensemble
des procédés biotechnologiques à destination pharmaceutiques ; cependant ils se dé-
veloppent de plus en plus, notamment le mode semi-continu.
2.4.2 Les différentes technologies de bioréacteurs dédiés à la culture

cellulaire
Les bioréacteurs à agitation mécanique et les bioréacteurs à bulles sont couram-

ment utilisés depuis plusieurs dizaines d’années pour les fermentations microbiennes
et les cultures de cellules animales [?]. Les critères de sélection d’un bioréacteur pour
un procédé donné dépendront essentiellement du produit final que l’on souhaite ré-
cupérer et des caractéristiques des cellules hôtes cultivées. Les transferts massiques
en oxygène ou en nutriments, ainsi que les forces de cisaillement mises en jeu seront
aussi des paramètres à considérer.
2.4.2.1 Les bioréacteurs à agitation mécanique
Le réacteur agité (figure 2.8), ou « continuous stirred-tank bioreactor »(CSTBR),

est le réacteur le plus simple qui peut être mis en œuvre en production.
Les principaux avantages de ce type de bioréacteur sont sa flexibilité, sa capacité
4. Les système de rétention possibles sont des méthodes séparatives telles que la centrifugation,
l’ultrafiltration, la décantation,. . .
32
Figure 2.8 – Schématisation d’un bioréacteur à agitation mécanique [?]
à assurer un transfert massique important ainsi qu’un mélange efficace assurant une
bonne homogénéisation du milieu de culture, ce qui favorise le contrôle du process.
En contrepartie, ce mélange efficace induit une contrainte mécanique sur les cellules ;
ce phénomène peut être particulièrement agressif vis-à-vis des cellules [?]. Les carac-
téristiques d’agitation et le type de mélangeur sont donc des paramètres majeurs à
optimiser lors de la mise en place et de la transposition industrielle (« scale-up », ou
extrapolation d’échelle) de cette technologie de réacteur.
2.4.2.2 Les bioréacteurs pneumatiques
Les bioréacteurs pneumatiques (colonnes à bulles ou à ascension d’air)(figure

2.9) sont des types de réacteur à dispersion gaz-liquide constitué d’une enceinte cy-
lindrique à travers laquelle circule verticalement des bulles d’air par ascension. C’est
uniquement le mouvement de l’air qui assure l’aération, le mélange et la circulation
du fluide, sans l’aide d’aucune pièce mécanique. A l’inverse du bioréacteur précédent,
le risque est de voir apparaître des hétérogénéités locales au sein du réacteur ainsi
que des phénomènes de floculation. Les cultures cellulaires de haute densité, et par
conséquent de viscosité importante, ne sont pas compatibles avec ce type de réacteur
33
[?].
Ils présentent cependant l’avantage d’être plus économiques en coût de fonction-
nement, plus propices aux procédés aseptiques et relativement faciles à dimensionner.
Figure 2.9 – Schématisation d’un bioréacteur pneumatique [?]
2.4.2.3 Les bioréacteurs à basculement
Les bioréacteurs à basculement (figure 2.10) consistent en une poche de polyéthy-

lène contenant le milieu de culture ; cette poche est animée d’un mouvement de vague
alternative assurant le mélange des milieux de culture en suspension. Ils présentent
l’avantage d’être des réacteurs à usage unique ; par conséquent ils sont assez peu
coûteux et assurent des conditions de stérilité optimales. Les transferts de masse et
de chaleur sont maîtrisés par la vitesse et l’angle de basculement [?]. L’oxygénation
du milieu se fait naturellement par diffusion dans le milieu de culture exposé à l’air.
A titre comparatif, un bioréacteur de 50L tel que celui décrit en figure 2.11
contient une biomasse équivalente à celle contenue dans 1000 à 1200 fois plus impor-
tante que celle contenue dans des flacons de 250 mL.
Ces réacteurs sont le plus souvent utilisés pour des productions de petite échelle,
ou encore pour certaines étapes intermédiaires d’un procédé de production.
34
Figure 2.10 – Schématisation d’un bioréacteur à basculement [?]
Figure 2.11 – Photographie d’un réacteur « à usage unique » de 50L équipé d’une
sonde de pH, de température et de pO2 [?]
2.4.2.4 Les bioréacteurs à membrane
Les bioréacteurs à membrane (figure 2.12), ou « bioréacteurs compartimentés »,

mettent en jeu des membranes spécifiques permettant de filtrer les espèces en fonction
de leur masse moléculaire. La biomasse est retenue à l’intérieur du bioréacteur alors
que l’aération, l’apport en nutriments et l’extraction des produits se font in situ.
Ce type assez spécifique de technologie est utilisé en première intention pour les
procédés d’échelle réduite ; l’extrapolation d’échelle à de grands volumes est particu-
35
lièrement délicate à mettre en œuvre.
Figure 2.12 – Schématisation d’un bioréacteur à membrane [?]
36
Chapitre 3
Quelques notions sur le

métabolisme des cellules animales
L’optimisation des milieux de culture dénués de matériaux d’origine animale né-

cessite obligatoirement une bonne compréhension des phénomènes de croissance, de
mort cellulaire et du métabolisme usuel des cellules animales. Contrairement au mé-
tabolisme cellulaire des hybridomes, des CHO et des BHK, le métabolisme des cellules
Vero reste peu documenté. Par conséquent, les paragraphes suivants se proposent de
reprendre un certain nombre de concepts théoriques indispensables pour l’élabora-
tion et l’interprétation d’un modèle cinétique. On admettra que le lecteur possède
déjà un minimum de connaissances dans le domaine de la prolifération cellulaire et
des cycles de division cellulaire ; de plus, ces généralités ne seront pas directement
étudiées dans le cadre de notre travail de modélisation.
3.1 Le phénomène de mort cellulaire
Dans le souci d’optimiser la production virale, on cherchera à maximiser la crois-

sance cellulaire tout en réduisant au minimum le phénomène de mort cellulaire. Bien
évidemment, ce phénomène de mort cellulaire impacte de manière importante les ren-
dements de culture ainsi que la qualité de la production. La mort cellulaire s’exprime
à travers deux mécanismes bien différenciés : la nécrose et l’apoptose.
37
3. Quelques notions sur le métabolisme des cellules animales
3.1. Le phénomène de mort cellulaire
3.1.1 La nécrose
La nécrose est une mort cellulaire qualifiée « d’accidentelle »qui survient suite à
une agression du milieu extérieur. On pourrait encore la définir comme : « un arrêt
pathologique, autrement dit anormal, du fonctionnement d’une cellule ». Elle n’est
pas déterminée par des facteurs intrinsèques, mais est généralement la résultante
de conditions extrêmes et d’un environnement stressant (température, contraintes
mécaniques, physico-chimie du milieu, . . .).
Les cellules sont endommagées physiquement ce qui provoque un gonflement et
une rupture de leur membrane cytoplasmique, et, par conséquent, la libération de leur
contenu cellulaire dans l’environnement extérieur. La libération du contenu intracel-
lulaire dans le milieu environnant induit généralement une réponse inflammatoire
des tissus proches [?] (figure 3.1).
Figure 3.1 – Les modifications morphologiques de la nécrose [?]
3.1.2 L’apoptose
L’apoptose correspond à un processus de mort cellulaire programmée, ou suicide

cellulaire. Ce mécanisme, hautement régulé, a été introduit en 1972 [?] ; ce concept
veut que les cellules déclenchent leur auto-destruction en réponse à différents signaux
internes ou externes. Ce mécanisme est une réponse physiologique de la cellule in-
duisant l’activation d’une cascade d’évènements qui conduisent à la mort cellulaire
en quelques heures. Cette cascade correspond à l’activation successive d’enzymes
38
protéolytiques appelées caspases.

L’apoptose se caractérise par une condensation et un flétrissement du noyau et
du cytoplasme, puis par la fragmentation des matériaux cellulaires en corps apopto-
tiques. Les cellules sont ainsi détruites de manière « propre »et n’entraînent pas de
réponse inflammatoire localisée [?] (figure 3.2).
Figure 3.2 – Les modifications morphologiques de l’apoptose [?]
Paradoxalement, cette mort cellulaire programmée est aussi un mécanisme de

survie pour les organismes multicellulaires, puisqu’elle participe à la régénération
des populations cellulaires et au renouvellement des cellules dysfonctionnelles. Dans
le cas des organismes multicellulaires, l’apoptose est une stratégie essentielle au dé-
veloppement morphologique des individus. Les principales différences entre nécrose
et apoptose sont résumées dans le tableau 3.1 et la figure 3.3.
Si l’on transpose cette problématique aux cultures en bioréacteurs, le phénomène
de mort cellulaire est principalement dû à trois facteurs :
– l’agitation et l’aération du milieu de culture ; en effet, le cisaillement et les
contraintes hydrodynamiques appliquées sur les cellules peuvent provoquer la
lyse des cellules cultivées ;
– un apport insuffisant en oxygène ou des limitations nutritives, qui peuvent
engendrer des dérèglements métaboliques internes provoquant, une fois les voies
de secours épuisées, la destruction de la cellule ;
39
Nécrose Apoptose
Mort anormale des cellules Mort cellulaire programmée
Caractère spontané, pas d’apport éner- Caractère contrôlé, nécessite de l’éner-
gétique gie sous forme d’ATP
Bourgeonnement cellulaire Bourgeonnement par corps apopto-
tiques
Fragments d’ADN de tailles aléatoires Condensation de la chromatine puis
fragmentation de l’ADN par des endo-
nucléases (tailles multiples)
Perte de l’intégrité membranaire Dissolution de l’enveloppe nucléaire
Libération du contenu cellulaire Rétrécissement de la cellule
Déclenchement d’une réaction inflam- Contenu cellulaire encapsulé
matoire
Phagocytose des débris cellulaires chez Phagocytose des corps apoptotiques
les organismes multicellulaires chez les organismes multicellulaires
Table 3.1 – Comparatif entre nécrose et apoptose [?]
Figure 3.3 – Comparaison morphologique de la nécrose et de l’apoptose [?]
– des agents infectieux, tels que des virus, bactéries, champignons ou parasites
non désirés.
40
3.2. Le métabolisme des substrats
3.2 Le métabolisme des substrats
3.2.1 Le métabolisme du glucose
Les cellules immortalisées et cultivées in vitro présentent la caractéristique com-

mune d’un métabolisme du glucose très actif mais cependant très peu efficace. La
métabolisation de ce substrat entraîne la formation d’un métabolite secondaire po-
tentiellement inhibiteur de la croissance cellulaire, le lactate. Pour ces raisons, le
métabolisme du glucose à donc été largement étudié dans le cas des cellules ani-
males.
Le glucose est le principal nutriment consommé par les cellules animales. Compte
tenu de sa structure, il ne peut pas diffuser seul à travers la membrane cytoplasmique
et nécessite l’aide de transporteurs spécialisés pour la franchir 1 ; cette étape de trans-
port est relativement rapide.
Une fois incorporé dans le cytoplasme, le glucose s’intègre dans deux voies méta-
boliques principales : la glycolyse et le cycle des pentoses phosphates [?], [?].
La voie majoritaire est celle de la glycolyse qui convertit le glucose en pyruvate
en générant de nombreux intermédiaires de biosynthèse, 2 ATP et 2 NADH. Le
pyruvate est ensuite intégré dans le métabolisme énergétique de la cellule via le
cycle TCA. Tout le pyruvate provenant du glucose n’est pas assimilé pour autant
dans le cycle TCA, une partie sera en effet dégradée ; c’est de cette dégradation que
résulte le lactate [?]. Les proportions rentrant en jeu dans chacun de ces cycles sont
fortement liées aux concentrations en glucose dans le milieu. Ainsi, pour de fortes
concentrations, on note une augmentation de la proportion de glucose dégradé en
lactate et inversement.
Pour la majorité des lignées cellulaires continues, le métabolisme carboné central
présente une forte dérégulation. En effet, si l’on expose la cellule à de fortes concen-
trations en glucose, la majorité du pyruvate formé sera métabolisée en lactate, de
1. Les mécanismes de transport sont au nombre de deux : un transport actif par des protéines
de transport actif (SLGT-1 et SLGT-2), un transport passif par l’intermédiaires d’hexokinases
membranaires (famille SLC-2 : Glut 1, glut 2, . . .)
41
Figure 3.4 – Le mécanisme de la glycolyse dans les cellules animales
manière à régénérer le co-facteur NADH (figure 3.5), alors qu’une faible partie entrera
dans le TCA, voie métabolique impliquée dans la production d’énergie cellulaire. Ce
mécanisme constaté est fortement délétère pour la cellule pour une double raison :
– il produit une espèce potentiellement inhibitrice de la croissance, le lactate ;
– la voie métabolique privilégiée ne produit que 2 ATP, contre 36 ATP pour le
cycle de Krebs.
Le métabolisme cellulaire carboné semble être plus efficace et mieux adapté à
des concentrations en glucose faibles, contrôlées par exemple pour une alimentation
progressive.
42
Figure 3.5 – Place du co-facteur NAD+ dans la métabolisation du glucose en lactate

[?]
La voie des pentoses phosphates, plus minoritaire, permet quant à elle la régéné-
ration du NADPH.
3.2.2 Le métabolisme de la glutamine
La glutamine est décrite dans la littérature comme étant le second substrat ma-
jeur des milieux de culture. De part son rôle prépondérant dans le métabolisme
carboné central des cellules, ce second substrat a été largement étudié ces dernières
décennies.
Contrairement au glucose, la glutamine ne possède pas de systèmes de transport
qui lui soit propres et pénètre la cellule de manière non-spécifique, notamment à l’aide
de systèmes de transport peptidiques. Une fois à l’intérieur de la cellule, la glutamine
subit la glutaminolyse et participe à la formation de glutamate et d’aspartate [?].
La glutamine joue donc un double rôle au sein de la cellule [?] :
– elle sert de précurseur à la synthèse de molécules indispensables telles que les
bases azotées (purines, pyrimidines) et de certains acides aminés par transami-
nation (proline, ornithine,...).
– elle assure aussi un rôle important dans l’approvisionnement énergétique de la
cellule à travers le cycle TCA. Via la synthèse de glutamate par désamination
(formation d’une molécule de NH+
4 ), la glutamine entre dans le cycle TCA
au niveau de l’α-cétoglutarate (αKG). Elle entretient alors le cycle TCA et
43
Figure 3.6 – Métabolisme de la glutamine (glutaminolyse)
permet la formation de molécules centrales telles que le malate, l’oxaloacétate,

l’acétyl-coenzyme A, . . .[?]. Le glutamate étant une des espèces principales
approvisionnant le cycle TCA, le métabolisme de la glutamine et celui du
glucose sont donc interdépendants (figure 3.7).
Bien que le glucose constitue le principal flux de carbone vers la cellule, il semble
que ce dernier, une fois entré dans le cycle TCA, soit majoritairement exporté de
la mitochondrie avec pour finalité la synthèse lipidique. Il est donc nécessaire de
disposer d’un apport de carbone supplémentaire tel que la glutamine pour produire
les différents intermédiaires du cycle TCA.
La métabolisation de la glutamine met en jeu un grand nombre de voies métabo-
liques et d’intermédiaires différents. Ces voies métaboliques sont à la fois mitochon-
driales et cytosoliques et peuvent interagir les unes avec les autres. La glutaminolyse
est donc un phénomène particulièrement complexe qui, en contrepartie, manifeste
une grande souplesse et une grande capacité d’adaptation aux conditions de culture.
De la même façon que le glucose, la glutamine est généralement consommée très
rapidement ; cette consommation excessive traduit une certaine dérégulation de la
44
Figure 3.7 – Interdépendance du métabolisme du glucose et de la glutamine [?]
cellule. Ceci s’explique par le fort excès de nutriments présents dans les milieux de
culture classiques. Tout comme le glucose, elle est aussi, en partie, responsable de
l’apparition d’une espèce délétère pour la cellule, puisqu’elle est la principale source
de production d’ions ammonium. La littérature montre que dans des milieux de
culture faiblement concentrés en glutamine, la vitesse de consommation en glutamine
est réduite sans pour autant modifier la croissance cellulaire. Cette dérégulation est
généralement accompagnée par l’accumulation importante d’ions ammonium dans le
milieu de culture.
3.2.3 Le métabolisme des acides aminés
A l’inverse des procaryotes, les cellules animales ne peuvent synthétiser toutes les
branches carbonées ou cycles constitutifs des acides aminés. Certains acides aminés
devront donc être présents nécessairement dans le milieu de culture pour permettre
45
3.3. Le métabolisme des produits
aux cellules mammaliennes de mener à bien leurs fonctions métaboliques. Ces acides
aminés essentiels sont l’arginine, l’histidine, l’isoleucine, la leucine, la lysine, la mé-
thionine, la phénylalanine, la thréonine, le tryptophane et la valine. Si ces acides
aminés ne sont pas apportés directement ou indirectement par le milieu de culture,
cela induira le phénomène de mort cellulaire.
Figure 3.8 – Métabolisme des acides aminés [?]
Le schéma suivant (figure 3.8) retrace les interactions principales et clairement

identifiées de la majorité des acides aminés avec le métabolisme central de la cellule.
3.3 Le métabolisme des produits
3.3.1 Le métabolisme du lactate
Le lactate est un co-produit du métabolisme du glucose défavorable à la croissance

cellulaire. Le lactate présente un caractère néfaste pour trois raisons principales [?] :
– l’effet inhibiteur direct que présente le lactate sur le métabolisme cellulaire ;
– la production de lactate dans les cultures cellulaires est accompagnée d’une
acidification du milieu de culture. Ceci implique en pratique une régulation du
46
3.3. Le métabolisme des produits
pH du bioréacteur sous peine de ralentir la croissance cellulaire ;

– l’accumulation de lactate induit aussi une augmentation de l’osmolarité du
milieu.
Les cellules Vero utilisées dans le cadre de ces expériences sont sensibles à des
concentrations de lactate comprises entre 10 et 20 mM [?], alors que d’autres lignées
telles que les CHO sont sensibles à des gammes de concentrations supérieures : 40 à
50 mM. Cependant, on constate une grande variation entre cette valeur théorique et
les valeurs usuelles en lactate ; cette concentration très élevée n’est quasiment jamais
rencontrée dans la pratique.
Les cellules animales semblent aussi présenter en fin de culture un comportement
singulier de consommation du lactate initialement produit. Ce phénomène dépend de
la concentration et de la nature du glucide présent dans le milieu de culture ; il sem-
blerait aussi qu’il existe une interconnexion possible entre les mécanismes d’apoptose
et le métabolisme cellulaire [?].
3.3.2 Le métabolisme des ions ammonium
Tout comme le lactate, les ions ammonium sont des métabolites secondaires issus
de la métabolisation, ou encore en moindre proportion de la dégradation spontanée,
de la glutamine. Les ions ammonium participent avec le pyruvate, par une réaction
de transamination, à la formation de l’alanine [?] ; cette réaction participe ainsi à la
détoxification du milieu de culture.
Les effets délétères de l’ammonium sur le métabolisme cellulaire apparaissent à

des concentrations bien plus faibles que celles de lactate ; en effet, on commence à voir
ses effets inhibiteurs sur une culture de CHO en réacteur fermé à partir de seulement
2 à 4 mM. Les cellules cultivées en continu semblent beaucoup moins sensibles, à
concentration en ammonium équivalente, que leurs homologues en réacteur fermé.
Une des explications possibles serait qu’une augmentation de la diffusion de NH3 et
qu’une modification de l’équilibre N H3 /N H4+ provoquent une modification des pH
intracellulaire et extracellulaire [?].
47
3.4. Une vision d’ensemble du métabolisme cellulaire
En plus de réduire la prolifération cellulaire, de fortes concentrations d’ions am-

monium perturbent aussi le phénomène de production virale. En effet, il a été prouvé
que les ions ammonium présentent un effet inhibiteur sur la multiplication du HSV
à une concentration supérieure à 50 mM.
Tout comme pour le lactate, un certain nombre de travaux ont contribué à limiter
la production d’ions ammonium à travers différentes stratégies présentées dans le
paragraphe suivant.
3.4 Une vision d’ensemble du métabolisme cellulaire
Le schéma suivant (figure 3.9) proposé par Emma Petiot [?], résume un certain
nombre des informations développées précédemment. Il permet de se rendre compte
des voies métaboliques clés ; un tel schéma est un document de travail essentiel si
l’on cherche à modéliser les voies métaboliques intracellulaires.
3.5 Amélioration des performances par le contrôle du

métabolisme cellulaire
Le fait de placer les cellules dans des milieux de culture pléthoriques, trop riches
en substrats carbonés induit une accumulation de produits néfastes situés en fin de
chaîne métabolique tels que le lactate et l’ammonium. Pour optimiser les perfor-
mances en culture cellulaire, il faudra alors veiller à apporter la bonne quantité, le
juste équilibre de substrat aux cellules, sans pécher par excès ou par défaut.
Les stratégies de rééquilibrage du métabolisme cellulaire sont diverses :

– optimiser les apports en substrats vers la cellule. Une solution possible, dans le
cas des cultures en continu et en semi-continu, est ainsi de veiller à conserver
à chaque instant de faibles concentrations de glucose et de glutamine dans le
milieu de culture, de manière à réduire les flux d’entrée.
– substituer le glucose et la glutamine par d’autres substrats carbonés dont le
transfert et/ou la consommation sont plus lents. Ainsi remplacer la glutamine
48
3.5. Amélioration des performances par le contrôle du métabolisme cellulaire
Figure 3.9 – Aperçu schématique du métabolisme de la cellule Vero [?]
par de l’asparagine ou du glutamax et le glucose par du galactose ou du fructose

permet de limiter et contrôler dans le temps les apports de la cellule [?]. Parmi
les principaux substrats de substitution du glucose, on trouve : le thréalose, le
49
3.5. Amélioration des performances par le contrôle du métabolisme cellulaire
turanose, le D-glucose-6-Phosphate, le D-glucose-1-Phosphate, le D-fructose 2 ,

le D-galactose, le D-mannose, le cellobiose, le mélibiose, le sorbitol, le D-talose,
le D-xylose, le D-ribose, . . .Concernant la glutamine, on trouve : le glutamate,
l’asparagine, le glutamaxr 3 , le pyruvate, d’autres peptides, . . .Ces 2 alterna-
tives permettent, en réduisant la vitesse d’approvisionnement en nutriments,
de nourrir la cellule par « perfusion ».
– une modification du métabolisme à la source en jouant notamment sur les
activités enzymatiques. Des lignées cellulaires déficientes en lactate déshydro-
génase ou en protéines de transport, générant par conséquent moins de lactate,
devraient en théorie présenter un intérêt pratique en ayant une phase de crois-
sance prolongée. Bien que cette approche soit conceptuellement intéressante,
les cellules ayant subi des modifications génétiques souffrent parfois d’un in-
convénient de taille, à savoir, leur manque de stabilité.
2. Le fructose par exemple traverse beaucoup moins vite la membrane cellulaire que le glucose
3. Le glutamax est un dipeptide qui subit une hydrolyse pour redonner de l’alanine et de la
glutamine, avec une cinétique d’hydrolyse qui lui est propre
50
Deuxième partie
Élaboration d’un modèle cinétique

de croissance
51
Chapitre 4
Quelques éléments de cinétique

biologique
Il est possible d’exprimer les cinétiques de culture de manière simplifiée à l’aide

de quelques équations simplifiées et de quelques paramètres choisis. Ce chapitre se
propose de revenir sur les définitions des principales variables et sur les variations que
l’on peut envisager dans les expressions mathématiques en fonction des hypothèses
choisies.
4.1 Paramètres cinétiques et relations de base
4.1.1 Quelques définitions
On définit respectivement XT , XV et XM comme étant les concentrations en

cellules totales, viables et mortes.
On peut aisément, à partir de ces trois termes, accéder aux vitesses de croissance et
de décès cellulaire, en écrivant les bilans de matière en réacteur fermé (eq. 4.1, 4.2) :
F luxd′ entree + P roduction = F luxdesortie + Accumulation + degradation
(4.1)
52
4. Quelques éléments de cinétique biologique
4.1. Paramètres cinétiques et relations de base
Soit en réacteur fermé (par définition) :
P roduction = Accumulation (4.2)
Et appliqué à notre problématique précise (eq. 4.3, 4.4) :
dXV
rX = (4.3)
dt
dXM
rM = (4.4)
dt
avec :
XV et XM , les concentrations cellulaires en cellules viables et mortes, en 105 cellules.mL−1
dt, un intervalle de temps, en h
rX et rM , les vitesses volumiques de croissance et de décès cellulaire, en 105 cellules.mL−1 .h−1
Les vitesses spécifiques de croissance et de décès cellulaires peuvent être définies

par les équations 4.5 et 4.6 :
rX
µreel = (4.5)
XV
rM
kM = (4.6)
XV
avec :
µreel et kM , les vitesses spécifiques de croissance et de décès, en h−1
En pratique il est aussi possible de réunir ces 2 derniers termes et de travailler

avec un µ apparent. La vitesse spécifique de croissance apparente, µapp , correspon-
dant à la vitesse spécifique de croissance vraie (eq. 4.5), de laquelle vient se déduire
la vitesse spécifique de décès (eq. 4.6) :
dXV 1
µapp = µreel − kM = (4.7)
dt XV
53
avec :
XT , la concentration cellulaire totale, en 105 cellules.mL−1
µapp , le taux de croissance apparent, lui aussi exprimé en h−1
Dans le cadre de notre étude, nous n’avons pas quantifié le phénomène de mort
cellulaire, par conséquent il sera impossible d’accéder aux valeurs chiffrées de kM .
C’est donc cette dernière variable globale µapp que nous utiliserons pour caractériser
la croissance de nos cellules.
Initialement, on définit un rendement instantané (eq. 4.8) :
rX
YX/Z = (4.8)
rZ
Puis sous l’hypothèse d’un rendement YX/Z constant, on estime ce rendement :

– soit à partir d’une mesure locale (eq. 4.9) :
dX
dt
YX/Z ≈ dZ
(4.9)
dt
– soit à partir d’une mesure globale.

En admettant que la consommation de substrats est dépendante de la concentra-
tion cellulaire, il est possible de définir des rendements cellules / substrats :
Rendement cellule / glucose globaux :
XV − XV0
YXV /Glc = (4.10)
Glc0 − Glc
Rendement cellule / glutamine :
XV − XV0
YXV /Gln = (4.11)
Gln0 − Gln
De la même manière, il est aussi possible de relier les concentrations en produits for-
més aux concentrations de substrats consommés, sous l’hypothèse que les produits
ne proviennent que des substrats :
54
Rendement ammonium / glutamine :
Ammo − Ammo0
YAmmo/Gln = (4.12)
Gln0 − Gln
Rendement lactate / glucose :
Lact − Lact0
YLact/Glc = (4.13)
Glc0 − Glc
avec :
[S] et [P ], les concentrations en substrats et produits, en g.L−1
[S]0 et [P ]0 , les concentrations initiales en substrats et produits, en g.L−1
YX/S et YP/S , les constantes de rendement 1
Bien que l’on utilise le terme de « rendement », il convient de garder à l’esprit

que ces valeurs ne sont pas des rendements stricto sensu. En effet, dans le cas où le
substrat ne compte que pour une fraction minime de la biomasse, ces rendements
dépasseront les 100%.
L’utilisation de ces rendements pour quantifier la croissance de nos cellules im-

plique d’accepter une hypothèse fondamentale, à savoir la constance des rende-
ments durant la culture. Cette hypothèse du rendement constant suppose que la
biomasse produite est proportionnelle au substrat consommé. L’hypothèse du rende-
ment constant suppose qu’une fraction constante de substrat limitant est convertie
en biomasse au cours de la croissance ; dans le cas inverse, on ne peut qu’accéder à des
rendements instantanés. La traduction graphique de cette hypothèse est représentée
en figure 4.1 : l’évolution de l’état du système se fait en suivant une droite.
4.1.2 Système d’équations final
A partir des bilans (eq. 4.1, 4.2), des modèles de croissance (eq. 4.3, 4.4, 4.7) et
des rendements précédents (eq. 4.10, 4.11, 4.12, 4.13), il est possible de formuler les
1. Les unités des rendements sont variables en fonction du type de rendement : en
105 cellules.mL−1 .g−1
S , ou en gP .gS
−1
55
Figure 4.1 – L’hypothèse du rendement constant [?]
vitesses de consommation et de production sous la forme d’un système d’équations

différentielles (eq. 4.17 à 4.21).
dXV
= +rXV avec rXV = µapp XV (4.14)
dt
d[S] 1
= −rS avec rS = rX V (4.15)
dt YXV /S
d[P ] YP/S
= rP avec rS = rX (4.16)
dt YXV /S V

dXV
= µapp XV (4.17)


dt




d[Glc] 1


=− µapp XV (4.18)






 dt YXV /Glc


 d[Gln] 1
=− µapp XV (4.19)
 dt YXV /Gln

d[Ammo] YAmmo/Gln




 = µapp XV (4.20)
dt YXV /Gln






 d[Lact] YLact/Glc
= µapp XV (4.21)



 dt YXV /Glc
56
4.2. Les variations autour du taux de croissance
C’est ce système d’équations différentielles qui servira de base constitutive aux

travaux de modélisation ; comme nous allons le voir par la suite, il est possible d’en-
visager des variations permettant d’ajuster in fine la pertinence du modèle.
4.2 Les variations autour du taux de croissance
Parmi les solutions les plus courantes pour exprimer un taux de croissance, on
trouve deux alternatives principales, à savoir l’expression de Monod et l’expression
de Andrews.
4.2.1 L’expression de Monod
Le modèle à été proposé par Monod pour la première fois en 1941 pour rendre
compte de la croissance des micro-organismes. Il s’agissait, à l’origine, de modéliser
cette croissance en mode de croissance discontinu, à partir du trouble créé par le
développement bactérien.
Cette expression de base est la plus connue pour proposer une première approche
simplifiée de la croissance cellulaire ; cette relation se propose de lier la vitesse spéci-
fique de croissance cellulaire aux concentrations en substrats dans une expression qui
contient deux paramètres : µmax et KS . Cette équation n’est pas sans rappeler, dans
son formalisme, l’équation de Michaelis-Menten. Ainsi, en supposant les rendements
constants par rapport aux substrats, la loi de Monod s’écrit de la manière suivante
(eq. 4.22) :

[S]
µ = µmax (4.22)
[S] + KS
avec :
µ la vitesse spécifique de croissance ([temps]−1 )
µmax la vitesse spécifique maximale de la période étudiée ([temps]−1 )
[S] la concentration en substrat (mmol.L−1 )
KS la concentration en substrat à demie-saturation (mmol.L−1 )
57
La vitesse spécifique de croissance pouvant être dépendante simultanément de

plusieurs substrats, il est tout à fait possible de proposer un terme de Monod dit
"double" (eq. 4.23), proposé initialement par McGee et al. [?], selon :

[S1 ] [S2 ]
µ = µmax (4.23)
[S1 ] + KS1 [S2 ] + KS2
où S1 et S2 sont 2 substrats présents dans le milieu.
4.2.2 L’expression de Andrews/Haldane
Il existe un grand nombre d’autres modèles, se situant dans la continuité du

modèle de Monod, et censés représenter des phénomènes biologiques plus complexes,
tels que des phénomènes d’inhibition (compétitive, non compétitive) ou de synergie.
Un des plus connus pour représenter un effet inhibiteur de l’un des substrats à l’égard
de la croissance est l’équation de Haldane proposée par Andrews (eq. 4.24) :
!
[S]
µ = µmax [S]2
(4.24)
KS + [S] + KI
avec :
KS la concentration de subtrat à demie-saturation (mmol.L−1 )
et KI la constante d’inhibition (mmol.L−1 )
Une constante d’inhibition élevée rapprochera les résultats fournis par ce modèle à
ceux du modèle de Monod.
4.2.3 Autres possibilités
Outre Monod, Andrews, beaucoup d’autres modèles existent et peuvent s’ap-

pliquer à la culture cellulaire 2 . Ces modèles utilisés pour des applications variées
(action enzymatique, dépollution,. . .) peuvent potentiellement constituer de bonnes
sources d’inspiration. Un certain nombre de ces modèles sont conçus spécifiquement
pour décrire des phénomènes de synergie et d’inhibition bien particuliers. Le tableau
2. Le modèle de Contois est un notamment un autre modèle assez fréquemment utilisé en culture
de cellules animales
58
4.2 suivant décrit de manière non exhaustive quelques unes de ces formulations en-
visageables pour la modélisation.
Figure 4.2 – Tableau récapitulatif de différentes variations autour du taux de crois-

sance [?]
Il faut cependant prendre ces publications avec précaution ; en effet, depuis Mo-
nod, on assiste à une prolifération impressionnante de modèles. Mais, dans le domaine
des avatars du modèle de Monod, et à l’exception de Contois (1959) et Andrews
(1968) qui ont connu un succès certain, il existe de nombreuses généralisations gra-
tuites restées sans lendemain avec un impact négligeable sur la communauté scienti-
59
4.3. Variations autour des vitesses spécifiques de consommation ou de production
fique [?].
4.3 Variations autour des vitesses spécifiques de consom-

mation ou de production
Les vitesses de consommation et de production correspondent aux bilans de ma-

tière formulés précédemment. Beaucoup d’articles de la littérature, affinent ces termes
de consommation et de production en y ajoutant notamment un terme de mainte-
nance cellulaire (eq. 4.18 à 4.21).


 ∆S = ∆S (croissance) + ∆S (maintenance) (4.25)

1


rS = rX + mXV (4.26)


YGlc/XV




1
 qS = µ+m (4.27)



 YGlc/XV
1 qS 1 m




 = = + (4.28)
YX/S µ YG µ

avec :
rS , la vitesse de consommation en substrat, en mM.h−1 3
qS , la vitesse spécifique de consommation, en gS .gbiomasse .h−1
YGlc/XV , le rendement de croissance, en 105 cellules.mL−1
m, le terme de maintenance cellulaire
Il est aussi possible d’associer une expression spécifique à la production cellulaire.

La plus connue est celle de Luedeking-Piret (eq. 4.22 à 4.23). Elle se décompose en 2
termes principaux : un associé à la croissance (facteur α) et un second indépendant
de la croissance (facteur β). La plupart du temps, la production est couplée à la
croissance en début de culture, puis devient indépendante de la croissance dans un
3. ou équivalent
60
4.3. Variations autour des vitesses spécifiques de consommation ou de production
second temps.
rP = αrX + βXV (4.29)

(
qP = αµ + β (4.30)
avec :
rP , la vitesse de production, en mM.h−1
qP , la vitesse spécifique de production, en gP .gbiomasse .h−1
α et β, des constantes
Par ailleurs, plusieurs publications présentent ces vitesses spécifiques sous une
forme polynômiale en déterminant les coefficients via une régression. Cette approche,
bien qu’offrant de bons résultats mathématiquement parlant, réduit la validité du
modèle par une perte d’informations significative et va ainsi à l’encontre de la logique
mise en place dans nos travaux.
Dans notre étude, nous nous sommes concentrés sur les variations concernant
l’expression de la vitesse spécifique de croissance et non sur celles concernant les
vitesses de consommation ou de production.
61
Chapitre 5
La phase de modélisation
expérimentale
Ce chapitre est consacré à une discussion générale sur la modélisation mathé-

matique des bioprocédés. Il permet, d’une part, d’introduire un certain nombre de
concepts qui serviront plus précisément dans le chapitre suivant et d’autre part,
d’esquisser le contexte général dans lequel ce travail de modélisation s’opère.
Ce chapitre se veut sensibilisant et informatif, mais en aucun cas exhaustif, vis-
à-vis d’une thématique relativement éloignée de la formation de pharmacien.
5.1 Les modèles mathématiques
5.1.1 Définition
Dans son sens scientifique général, un modèle est une représentation ou une des-
cription d’un aspect du monde réel auquel on s’intéresse. Le modèle permet d’ap-
préhender de manière simplifiée les principes généraux des phénomènes physiques ou
biologiques étudiés. Dans la mesure où un modèle permet, en plus de qualifier un
phénomène, de le quantifier, on utilise l’expression de "modèle mathématique".
Dans notre cas, le modèle sera un modèle cinétique s’exprimant par un ensemble
de fonctions mathématiques qui rendent compte du mieux possible de la croissance,
du décès, du métabolisme cellulaires, ainsi que de l’évolution de la composition du
62
5. La phase de modélisation expérimentale
5.1. Les modèles mathématiques
milieu de culture.
5.1.2 Pourquoi utiliser un modèle mathématique ?
Figure 5.1 – Cartographie du réseau de régulation protéine-protéine chez la levure

[?]
La figure 5.1 propose une cartographie des interactions protéine-protéine chez la

levure Saccharomyces Cerevisiae ; cette cartographie, qui ne présente que la partie
visible du réseau de régulations d’un organisme unicellulaire, est déjà d’une rare
complexité. Bien évidemment, cette complexité sera d’autant plus importante pour
les cellules animales. On comprend aisément que, face à des systèmes biologiques
aussi complexes, il est indispensable de posséder des outils permettant de simplifier
les raisonnements.
Ces outils conduisent à une première compréhension de systèmes très complexes
et deviennent le moyen de jeter un pont entre les niveaux d’organisation cellulaire et
63
5.1. Les modèles mathématiques
les niveaux macroscopiques. Ces modèles, qui placent la cellule en position centrale,
permettront ainsi de modéliser le procédé de culture.
Outre l’intérêt schématique et descriptif que propose le modèle, la modélisation
d’un procédé de production de produits pharmaceutiques présente plusieurs autres
objectifs plus pratiques. Ils permettent aussi [?] :
– d’aider l’utilisateur à la prise de décision grâce aux vertus prédictives du mo-
dèle ;
– d’optimiser et d’améliorer les performances du procédé ;
– de contrôler les variations du système en anticipant les dysfonctionnements
trop importants ;
– de tester, puis de valider ou d’infirmer certaines hypothèses.
Ce dernier point est particulièrement intéressant ; en effet, dans le cadre de modèles
reposant sur des hypothèses, le fait qu’un modèle traduise bien la réalité permet de
valider les hypothèses préalablement formulées 1 .
5.1.3 Qualités et limites de la modélisation
Il est important de comprendre que la complexité mathématique n’est pas un cri-

tère suffisant en soi pour juger de la pertinence d’un modèle. À résultat comparable,
on préfèrera bien sûr le modèle dont le formalisme est le plus simple.
Un modèle sera jugé comme pertinent, notamment :

– s’il couvre bien le champ du problème réel et s’il est capable de s’adapter aux
variations expérimentales ;
– s’il permet d’obtenir le résultat escompté (description du phénomène avec le
niveau de précision souhaité ou prévisions se révélant justes à posteriori).
La précision et l’adaptabilité du modèle sont deux notions en opposition. Il faudra
veiller à définir au plus juste le champ d’application du modèle pour atteindre le
meilleur résultat, compromis entre précision et capacité d’adaptation [?].
Il faut néanmoins rester conscient que les modèles sont des vues de l’esprit, don-
1. Ou tout du moins de supposer que ces hypothèses sont partiellement vraies
64
5.2. Les différentes types de modèles
nant seulement un aperçu de la réalité. Selon le statisticien George Box : « Tous les
modèles sont faux, certains sont utiles ».
5.2 Les différentes types de modèles
Avant d’aborder les grandes classes de modèles mentionnés dans la littérature

concernant spécifiquement les bioprocédés, il apparaît utile de citer quelques carac-
téristiques de base des modèles, au sens tout à fait général de la théorie des systèmes
[?].
5.2.1 Modèles de type « boîte noire » ou modèles phénoménolo-

giques
On caractérise de « boîte noire » les modèles dépourvus de toute interprétation

physique ou biologique. Le principe est alors de calquer sur un système une expres-
sion purement mathématique dénuée de signification, telle qu’un polynôme de degré
n ou un réseau de neurones. A l’inverse les modèles phénoménologiques, qualifiés
par opposition de « boîte blanche », sont des modèles dans lesquels les équations
traduisent les phénomènes physiques, chimiques ou biologiques dans le système. La
figure 5.2 illustre l’opposition, tant dans la démarche, que dans la finalité, qui peut
exister entre ces deux types de modèles.
5.2.2 Modèles comportementaux et modèles fonctionnels
Alors que les modèles comportementaux s’attachent à identifier les liens remar-
quables entre les variables d’entrée et de sortie à la façon d’un modèle boîte noire, les
modèles fonctionnels tentent de décrire le fonctionnement intrinsèque du système ;
ils s’appuient donc sur une description bien plus détaillée de la cellule. Ainsi des
modèles tendant à décrire le comportement « macroscopique » des cellules à l’aide
d’expressions de Monod ne tenant pas compte du métabolisme seront des modèles
strictement comportementaux. A l’inverse, des modèles basés sur une description,
même simplifiée, du métabolisme interne de la cellule seront classés comme étant
65
5.2. Les différentes types de modèles
Figure 5.2 – Schématisation des divergences entre modèles comportementaux et

fonctionnels [?]
des modèles fonctionnels ; on parle aussi de modèles « structurés ». Cette distinction

est à rapprocher de celle présentée précédemment entre « boîte noire » et « boîte
blanche ».
5.2.3 Modèles globaux et modèles locaux
Les modèles locaux s’attachent à décrire une application particulière, alors que
les modèles globaux tentent de représenter structurellement un champ d’application
le plus large possible. Un modèle sera d’autant plus général qu’il sera capable de
reproduire le comportement des cultures d’un champ expérimental étendu. Il est
évident que plus un modèle détaille de façon précise le métabolisme cellulaire et les
conditions opératoires, plus il risque d’être spécifique à une lignée cellulaire et à une
situation expérimentale donnée.
Après avoir passé en revue les caractéristiques générales des modèles mathéma-
tiques de manière générale, le paragraphe suivant s’intéresse aux qualificatifs typi-
quement destinés à la culture cellulaire.
66
5.3. La modélisation appliquée à la culture cellulaire
5.3 La modélisation appliquée à la culture cellulaire
La modélisation de culture cellulaire existe maintenant depuis plusieurs dizaines

d’années ; par conséquent, il s’est développé un vocabulaire propre concernant la
modélisation des bioprocédés. Un modèle est dit structuré lorsqu’il prend en compte
les paramètres intérieurs à la cellule et non structuré s’il considère la cellule comme
un compartiment unique, comme une entité, sans se soucier de sa structure interne.
Par ailleurs un modèle est dit ségrégé s’il tient compte des hétérogénéités au sein
de la population cellulaire (ex : position dans le cycle cellulaire, taille des cellules,
. . .) et non ségrégé s’il considère la population parfaitement homogène.
Cette classification, proposée en 1966 par Tsuchiya et al. [?], aboutit au tableau
5.1 ; malgré son âge, elle est encore relativement utilisée dans la littérature aussi bien
pour des supports bactériens, que pour des levures ou des cellules animales [?].
Modèles Non ségrégés Ségrégés
Population cellulaire Population cellulaire

Non structurés homogène ; cellule hétérogène ; cellule
mono-composant mono-composant
Population cellulaire Population cellulaire

Structurés homogène ; cellule hétérogène ; cellule
multi-composants multi-composants
Table 5.1 – La classification de Fredrickson [?]
Nous avons mis en pratique deux types différents de modèles dans le cadre de ce
travail.
5.3.1 Les modèles non structurés, non ségrégés
Les modèles non structurés, non ségrégés sont les plus simples à imaginer. Dans
ces modèles, la cellule est considérée comme un compartiment (figure 5.3), et l’on
essaye de relier les facteurs entrants et sortants entre eux.
Ce type de modèle offre généralement une bonne souplesse et permet l’obtention
d’un modèle assez robuste, reflet très simplifié du procédé, qui peut être extrapolé
67
Figure 5.3 – Les différentes espèces entrant en jeu dans l’approche de modélisation
non structurée
et transposé à des systèmes de plus grande taille. Un des défis de ces modèles est
d’arriver à prédire à l’aide d’un seul jeu de paramètres l’ensemble des phases et des
phénomènes de nature complexe. Un certain nombre de phénomènes connexes basés
sur des connaissances peuvent être intégrés dans ce système pour affiner le modèle :
il s’agit par exemple du phénomène de mort cellulaire, de maintenance cellulaire ou
encore de la production de métabolites secondaires.
5.3.2 Les modèles structurés, non ségrégés
Devant les erreurs de prédiction constatées dans le cadre des modèles non struc-
turés, l’idée de modéliser le fonctionnement interne de la cellule peut être une alter-
native intéressante. Ces modèles passent par une ébauche simplifiée des mécanismes
intracellulaires. Cela permettra d’introduire dans le modèle de nouveaux concepts
permettant peut être d’affiner ce dernier.
Suite aux recherches bibliographiques menées sur les cellules mammaliennes, on
68
s’aperçoit qu’une espèce possède un rôle central dans le métabolisme cellulaire ; il

s’agit du pyruvate. Effectivement, comme le précise le paragraphe 3.2.1, le pyruvate
fait le lien entre le substrat principal (glucose), l’espèce que l’on suppose inhibitrice
de croissance (lactate) et le système énergétique de la cellule (cycle de Krebs) ; par
ailleurs, il se trouve à la jonction des voies métaboliques des substrats carbonés et
azotés. C’est aussi le "dénominateur commun" entre les différents substituts hydro-
carbonés que l’on peut administrer à la cellule en alternative au glucose (figure 5.4).
Figure 5.4 – Représentation simplifiée du métabolisme intracellulaire [?]
Le principe de ce modèle est simple ; on divise la cellule en deux compartiments

intracellulaire et extracellulaire, lesquels sont reliés par des bilans sur les différentes
espèces. Par conséquent, le glucose, la glutamine et le lactate feront l’objet de deux
phénomènes différents :
– le transport des nutriments d’un compartiment vers un autre, parfois exprimé
à l’aide de la loi de Michaelis-Menten ;
– la transformation des substrats en produits, à nouveau exprimée à l’aide des
rendements Y ;
– la participation à la croissance cellulaire ;
– le transport des produits en sens inverse des substrats.
69
5.4. La démarche de modélisation pas à pas
Plus le niveau de détail est élevé, plus on quitte le domaine des modèles compor-
tementaux pour se diriger vers celui des modèles fonctionnels. Ces modèles complexes
font ainsi intervenir un certain nombre de paramètres à optimiser dans les bilans de
matière. Il existe plusieurs grands courants de modélisation structurée : la théorie des
systèmes biochimiques de Savageau, l’analyse du contrôle métabolique de Westerhoff
ou encore les modèles cybernétiques de Ramkrishna.
5.4 La démarche de modélisation pas à pas
La mise en place d’un modèle cinétique est une réalisation longue qui s’intègre
du début à la fin de la démarche expérimentale ; les différentes étapes de réalisation
d’un modèle peuvent être résumées de la manière suivante [?], [?] :
– la définition des objectifs de la modélisation 2 ;
– le choix de la nature du modèle à établir ;
– une réflexion sur les paramètres d’intérêt à intégrer dans le modèle ;
– la formulation d’un plan d’expérience adapté ;
– le traitement des résultats expérimentaux ;
– la formulation des hypothèses et la proposition des différentes équations du
modèle (expression du taux de croissance, du taux de décès et des bilans de
matière) ;
– l’identification paramétrique, qui correspond à « l’optimisation » et au calcul
des paramètres ;
– de nombreux "aller-retours" entre le modèle et les expressions théoriques, avec
l’acquisition d’informations expérimentales et, en parallèle, une discussion des
hypothèses ;
– la validation du modèle par un test des capacités prédictives du modèle sur de
nouvelles valeurs expérimentales.
2. En effet, la construction du modèle sera fonction des objectifs visés
70
5.5. La mise en œuvre de la modélisation et l’utilisation de l’outil informatique
5.5 La mise en œuvre de la modélisation et l’utilisation

de l’outil informatique
Dans le but d’obtenir la meilleure adéquation possible entre notre modèle et la

réalité, il convient de déterminer les paramètres de fonctionnement de notre modèle
qui minimisent l’erreur entre les grandeurs prédites et observées. Pour ce faire, on uti-
lise un programme d’optimisation basé sur un algorithme évolutionniste. Le principe
de ces algorithmes, conceptuellement intéressant, sera détaillé dans l’annexe ??.
Sans rentrer dans les détails, l’objectif de cet algorithme informatique est d’ob-
tenir un jeu de coefficients optimaux permettant de rapprocher au mieux la courbe
théorique du modèle, des points expérimentaux. De la même manière que pour une
régression linéaire, cet algorithme évalue la somme des écarts quadratiques (eq. 5.1)
et tend à minimiser cette valeur.
 !
2
X X (Xtheo − Xexp )
J=   (5.1)
especes
Xexp
nbpts
Cette méthode est particulièrement efficace et permet, si les paramètres de fonction-

nement sont judicieusement choisis, de converger vers l’optimum global.
C’est Matlab r qui a été choisi pour développer cet algorithme. Matlab r est
à la fois un environnement de développement ainsi qu’un langage de programma-
tion indépendant. Matlabr possède un grand nombre de boîtes à outils permettant
d’utiliser des fonctions utiles pour le traitement et l’analyse des informations.
71
Chapitre 6
Un exemple illustré de la
démarche de modélisation
Ce chapitre se propose de montrer pas à pas et à travers des graphiques la dé-

marche de modélisation présentée précédemment. Pour ce faire, il se focalise sur les
modèles non structurés et montre comment, à partir de cinq modèles construits sur
des hypothèses différentes, on peut identifier le modèle le meilleur et le plus pertinent.
L’accent sera mis plus particulièrement sur la démarche globale et son esprit, plus
que sur les résultats expérimentaux eux-mêmes.
6.1 Description des données brutes
Les résultats présentés dans cette thèse sont les résultats expérimentaux obtenus
par Mademoiselle Emma Petiot dans le cadre de sa thèse réalisée au LSGC [?]. Les
cultures cellulaires en question étaient des cultures de cellules Vero en spinner (figure
6.1) ; ces cellules étaient cultivées en milieu sans sérum, sur microporteurs 1 , à 37 °C
et pour une vitesse de rotation de 45 rpm. La concentration initiale en milieu de
référence est de 2,75.105 cellules.mL−1 , de 4 g.L−1 de glucose et de 0,6 g.L−1 de
glutamine.
Les conditions de culture des différents spinners sont rappelées dans le tableau
1. type Cytodexr
72
6. Un exemple illustré de la démarche de modélisation
6.2. Traitement et interprétation des données expérimentales
Figure 6.1 – Photographie de spinners
6.1.
Spinner 1
Spinner 2
Milieu de référence
Spinner 3
Spinner 4
Spinner 5 Culture en milieu de référence avec [Glc] = 1 g.L−1
Spinner 6 Culture en milieu de référence avec [Glc] = 2 g.L−1
Table 6.1 – Comparaison des conditions expérimentales des différents spinners
6.2 Traitement et interprétation des données expérimen-

tales
Cette première étape de traitement des données expérimentales brutes est im-
portante, aussi basique soit-elle ; elle présente un double intérêt :
– elle permet notamment de s’imprégner des allures et tendances des courbes de
chacune des espèces et éventuellement d’éliminer certains points expérimentaux
apparaissant comme aberrants ;
– elle permet aussi de dégager des expériences des valeurs approchées des constan-
73
tes à insérer dans le modèle. En effet, pour que l’algorithme d’optimisation

fonctionne, il convient de lui fournir au préalable un encadrement de valeurs
cohérentes.
6.2.1 Visualisation de l’évolution des différentes espèces en fonction

du temps
Les profils types des espèces d’intérêt sont tracés ci-dessous ; ils représentent, pour
un spinner donné, l’évolution de la concentration d’une espèce en fonction du temps.
L’encadré apparaissant sur chacune de ces figures correspond au(x) coefficient(s)
de lissage appliqué(s) 2 . L’heure à laquelle le premier dosage est réalisé variant en
fonction du spinner considéré et la première mesure étant parfois absente, il est à
noter que ces courbes ne démarrent pas toutes au même moment.
On retrouve ainsi les courbes types caractérisant l’évolution de la concentration
de cellules vivantes(figure 6.2), du glucose (figure 6.3), de la glutamine (figure 6.4),
des ions ammonium (figure 6.5) et du lactate (figure 6.6), en fonction du temps.
Le principal objectif concernant cette partie du travail est d’obtenir un lissage
qui présente le moins possible d’artefacts et de bruits de fond, tout en conservant
le maximum d’informations sur le système. Plutôt que d’utiliser une interpolation
polynômiale qui aurait peut être été difficilement transposable d’une expérience à
l’autre, notre choix s’est tourné vers les fonctions « splines ». Le travail mené autour
des fonctions « splines » a permis d’apporter des solutions aux problématiques récur-
rentes de l’interpolation en permettant à l’expérimentateur de choisir de découper les
courbes en deux parties distinctes possédant chacune un lissage qui leur est propre.
Les différents résultats sont donc traités différemment soit par une simple, soit par
une double interpolation et avec des coefficients de lissage différents.
Il faut aussi retenir de ce travail que l’interpolation des valeurs expérimentales
d’un spinner à l’autre ne peut pas être complètement automatisée et c’est à l’opé-
rateur d’effectuer le choix entre les différentes approches et d’apprécier au mieux la
2. En mathématique, le lissage d’une courbe correspond simplement à l’obtention d’une courbe
lisse (sans singularité), par interpolation, entre différents points expérimentaux. Les fonctions dites
« splines » sont une solution intéressante, car contrairement aux polynômes de haut degré, on
n’observera peu d’artefacts d’interpolation
74
Figure 6.2 – Évolution de la concentration cellulaire en fonction du temps - spinner

1
Figure 6.3 – Évolution de la concentration de glucose en fonction du temps - spinner

1
cohérence des résultats finaux.
75
Figure 6.4 – Évolution de la concentration de glutamine en fonction du temps -

spinner 5
Figure 6.5 – Évolution de la concentration d’ions ammonium en fonction du temps

- spinner 5
6.2.2 L’extraction des valeurs caractéristiques
En dérivant les courbes présentées précédemment, il est possible d’extraire et

d’estimer un certain nombre de paramètres impliqués dans le modèle.
76
Figure 6.6 – Évolution de la concentration de lactate en fonction du temps - spinner

1
6.2.2.1 µmax , Xmax et tmax
La figure 6.7 présente l’évolution de la vitesse spécifique en fonction du temps.
Figure 6.7 – Évolution de la vitesse spécifique en fonction du temps - spinner 1
L’outil informatique permet alors de déterminer la valeur maximale de la vitesse

spécifique de croissance, le nombre maximal de cellules ainsi que, par interpolation,
77
la valeur de temps associée. A noter que ces estimations sont très dépendantes des
choix faits précédemment durant l’étape de lissage, d’où son intérêt. Les valeurs de
vitesses de croissance des spinners étudiés sont présentées dans le tableau 6.2.
Spin. Spin. Spin. Spin. Spin. Spin.

1 2 3 4 5 6
µappmax (h−1 ) 0,035 0,037 0,025 0,031 0,035 0,027
Xmax (105 cell.mL−1 ) 9,50 8,10 9,55 10,41 7,54 8,91
tmax (h) 99 91 112 109 47 71
Table 6.2 – Tableau de résultats des paramètres cinétiques de chaque spinner
6.2.2.2 Les vitesses spécifiques de consommation, de production et les

KS associés
Une simple dérivation des lissages précédents permet aussi d’accéder aux varia-
tions spécifiques de consommation et de production du glucose/lactate, qGlc /qLact
(figure 6.8), et de l’ammonium/glutamine, qGln /qAmmo (figure 6.9)
Figure 6.8 – Évolution des vitesses spécifiques de consommation/production de

glucose et de lactate - spinner 1
Les KS et KP de chacune des espèces étudiées peuvent être déterminés de manière

approximative en traçant les courbes : µ = f(Espèces). Comme le montre l’exemple
78
Figure 6.9 – Évolution des vitesses spécifiques de consommation/production de

glutamine et d’ammonium - spinner 1
Figure 6.10 – Détermination du KS du glucose - spinner 1
suivant (figure 6.10), le KS et KP correspondent alors à la concentration de l’es-

pèce pour une vitesse de croissance de µmax /2. Les KS des différentes espèces sont
présentés dans le tableau 6.3.
Les points expérimentaux des spinners 3 et 4 étant particulièrement dispersés, il
79
Spin. Spin. Spin. Spin. Spin. Spin.

Y
1 2 3 4 5 6
KGlucose (mM) 10,68 11,08 - - - 6,59
KGlutamine (mM) 1,78 2,60 - - 1,91 2,68
KAmmonium 0,81 0,87 - - 1,60 0,78
(mM)
KLactate (mM) 12,16 14,87 - - 10,19 5,36
Table 6.3 – Tableau de résultat des constantes KS et KP de chaque spinner, évaluées

à partir des données expérimentales
a été impossible d’obtenir un lissage suffisamment fiable pour en extraire la valeur

des paramètres KS et KP . En fonction du degré de confiance que l’on accorde à ces
résultats, nous sommes alors en mesure de fixer des bornes, réalistes, du domaine de
recherche des paramètres du modèle.
6.2.2.3 Les rendements
Le calcul des rendements s’effectue par une régression linéaire durant la phase de
croissance exponentielle ; c’est en effet durant cette période que les phénomènes sont
les plus intenses, et par conséquent les mieux observables. malgré les légères variations
en cours d’expérimentation, on considérera ces rendements comme étant constants
durant toute la durée de l’expérience (figure 6.11, 6.12, 6.13, 6.14). Comme précisé
dans le paragraphe 4.1.1, ces rendements sont en fait des rapports de vitesses de
conversion ; ainsi YLactate/Glucose représente le taux de conversion molaire du glucose
en lactate. En connaissant le taux maximal de conversion du glucose en lactate, qui
est théoriquement de 2 mmoles de lactate pour 1 mmole de glucose, on peut par
soustraction déduire la proportion de glucose rentrant dans le cycle.
Les valeurs des rendements des spinners étudiés sont résumées dans le tableau
6.4.
Les rapports de conversion molaire laissent apparaître que le glucose est un sub-
strat plus nutritif que la glutamine ; en effet, il participe de façon plus efficace à
la formation de biomasse. Le rendement lactate/glucose, compris entre 0,44 et 1,05
selon les spinners, est inférieur à la valeur théorique présentée précédemment de 2
g.g−1 . De la même manière, le rendement ammonium/glutamine, compris entre 1,41
80
Figure 6.11 – Calcul du rendement YX/Glucose - spinner 2
Figure 6.12 – Calcul du rendement YX/Glutamine - spinner 2
et 2,34, est proche de la valeur théorique, à laquelle on pourrait à première vue

s’attendre, de 2 g.g−1 3 .
3. Car la molécule de glutamine contient deux groupements « amine »
81
6.3. Présentation des modèles et des résultats obtenus
Figure 6.13 – Calcul du rendement YLactate/Glucose - spinner 2
Figure 6.14 – Calcul du rendement YAmmonium/Glutamine - spinner 2
6.3 Présentation des modèles et des résultats obtenus
Pour statuer sur la qualité d’un modèle, il convient de comparer les coefficients
optimisés de différents spinners entre eux, ainsi qu’aux ordres de grandeur provenant
des lissages des courbes expérimentales. Sur chacune des figures présentées par la
82
Spinner Spinner Spinner Spinner Spinner Spinner

1 2 3 4 5 6
YCellule/Glucose 0,74 0,40 - - 1,19 0,74
YCellule/Glutamine 5,63 2,86 - - 3,41 3,35
YLactate/Glucose 0,63 0,44 - - 1,05 1,03
YAmmonium/Glutamine 1,60 1,41 - - 2,34 2,21
Table 6.4 – Tableau de résultats des rendements de chaque spinner
suite, un trait plein représente la courbe théorique fournie par le modèle, les points
correspondent aux points expérimentaux.
6.3.1 Modèle de Monod simple sur le glucose
Tout en sachant que ce modèle, basique dans sa formulation (eq. 6.1), ne serait
sûrement pas représentatif du métabolisme cellulaire, il paraissait intéressant de tes-
ter cette approche particulièrement simple. La figure 6.15 présente l’évolution des
différentes espèces (cellules, substrats, produits) en fonction du temps ; l’ensemble
des coefficients utilisés pour obtenir ces courbes d’évolution sont listés dans le tableau
6.5).
[Glc]
µ = µmax (6.1)
[Glc] + KGlc
Paramètre Valeur
µmax 0,025 h−1
KGlc 12,98 mM
YX/Glc 0,33 105 cellules.mL−1 .g−1
YX/Gln 1,36 105 cellules.mL−1 .g−1
YLact/Glc 0,32 gP .g−1
YAmmo/Gln 1,08 gP .g−1
Critère J 4 30,37
Table 6.5 – Coefficients optimisés du Modèle de Monod simple - spinner 2
On observe que ces résultats ne sont pas cohérents avec les variations réelles et
que le déclin de la croissance menant à la phase stationnaire est bien trop tardif.
La valeur élevée du facteur J témoigne du fait que les courbes théoriques du modèle
ne suivent pas bien les variations expérimentales. Exprimer la vitesse spécifique de
83
Figure 6.15 – Modèle de Monod simple sur le glucose uniquement - spinner 2
croissance en fonction du glucose seul ne suffit donc pas pour obtenir un modèle
satisfaisant.
6.3.2 Modèle de Monod double
En réponse au constat fait sur le modèle de Monod simple, nous avons ensuite
testé un modèle de Monod double (eq. 6.2), tel que celui décrit dans le paragraphe
4.2.1. Les résultats graphiques et numériques sont présentés dans la figure 6.16 et
dans le tableau 6.6
[Glc] [Gln]
µ = µmax (6.2)
[Glc] + KGlc [Gln] + KGln
Cette fois ci, l’adéquation du modèle aux points expérimentaux semble beaucoup
plus encourageante, comme en atteste le critère J ayant pour valeur 7,53. Les 4 valeurs
des rendements apparaissent relativement faibles en comparaison de celles que nous
avions pu identifier précédemment. La valeur de µmax est quant à elle légèrement
84
Figure 6.16 – Modèle de Monod double - spinner 2
Paramètre Valeur
µmax 0,055 h−1
KGlc 10,62 mM
KGln 2,19 mM
YX/Glc 5
0,37 10 cellules.mL−1 .g−1
Critère J 7,53
Table 6.6 – Coefficients optimisés du Modèle de Monod double - spinner 2
surélevée.
6.3.3 Modèle de Monod avec inhibition par le lactate
Au vu des résultats satisfaisants du modèle de Monod double, il paraissait judi-

cieux de compléter le modèle en utilisant un terme correspondant à l’inhibition de la
vitesse spécifique de croissance cellulaire par le lactate (eq. 6.3, figure 6.17, tableau
85
6.7).
[Glc] [Gln] KLact

µ = µmax (6.3)
[Glc] + KGlc [Gln] + KGln [Lact] + KLact
Figure 6.17 – Modèle de Monod avec inhibition par le lactate - spinner2
Paramètre Valeur
µmax 0,046 h−1
KGlc 9,01 mM
KGln 0,07 mM
KLact 11,91 mM
YX/Glc 0,85 105 cellules.mL−1 .g−1
Critère J 31,43
Table 6.7 – Coefficients optimisés du Modèle de Monod avec inhibition du lactate

- spinner 2
Bien que la littérature (paragraphe 3.3.1) et les connaissances réunies autour

du métabolisme des cellules Vero laissent présager que la croissance est vraisembla-
86
blement stoppée par l’accumulation de lactate, ce modèle ne fournit pas de bons

résultats. On s’aperçoit que dans ce cas, la superposition de ces trois contributions
glucose - glutamine - lactate dans l’expression de la vitesse spécifique de croissance, ne
fournit pas de résultats satisfaisants. Ce résultat souligne la complexité du processus
de modélisation où, malgré des hypothèses réalistes, l’identification des paramètres
peut se révéler difficile et conduire à des prédictions de mauvaise qualité.
6.3.4 Modèle de Monod double avec un terme de dégradation de

la glutamine
Ce modèle correspond au modèle de Monod double avec pour seule différence

un terme de cinétique d’ordre 1 correspondant à la dégradation chimique (ou en-
zymatique) de la concentration de glutamine dans le milieu de culture (eq. 6.4 et
6.5).

[Glc] [Gln]
µ = µmax (6.4)



 [Glc] + KGlc [Gln] + KGln
d[Gln] 1
 dt = − Y µapp XV − Kdeg [Gln] (6.5)



XV /Gln
La valeur Kdeg choisie pour la constante de dégradation de la glutamine a été

identifiée dans la littérature [?], elle est de 0,00416 h−1 . On cherche alors à modéliser
plus finement la diminution de glutamine dans le spinner. La valeur de la constante
de dégradation a été trouvée dans la littérature [?]. Les résultats graphiques et nu-
mériques sont présentés dans la figure ?? et dans le tableau ??.
On observe que ce modèle fournit des résultats strictement identiques au modèle
précédent. Les tests sur des spinners différents montrent que les résultats sont plutôt
similaires d’un spinner à l’autre. Des différences notables concernant le KGln , le
YX/Gln et le rendement Yammo/Gln sont cependant à considérer. La valeur faible
de la constante KGln du spinner 5 peut être expliquée soit par une erreur lors de
l’optimisation, soit par l’hypothèse, à vérifier, qu’une faible concentration de glucose
entraîne une diminution de la consommation de glutamine.
87
Figure 6.18 – Modèle de Monod double avec dégradation de la glutamine - spinner

2
Spinner Spinner Spinner Spinner Spinner

Moyenne
1 2 5 6 7
µmax 0,074 0,061 0,070 0,054 0,073 0,067
KGlc 9,22 8,46 7,92 9,61 9,17 8,88
KGln 3,52 3,09 0,07 1,07 0,77 1,70
YX/Glc 0,49 0,36 0,60 0,46 0,26 0,43
YX/Gln 2,06 1,56 1,85 2,68 1,48 1,93
YLact/Glc 0,40 0,39 1,08 1,17 0,73 0,75
YAmmo/Gln 1,12 1,31 1,84 1,67 1,18 1,42
Critère J 7,05 8,08 6,07 3,63 9,23
Table 6.8 – Coefficients optimisés du Modèle de Monod double avec terme de dé-
gradation - spinner 1, 2, 5, 6 et 7
6.3.5 Modèle d’Andrews/Haldane
Le modèle d’Andrews est un modèle assez couramment utilisé en modélisation

biologique, notamment pour représenter les phénomènes d’inhibition par le substrat,
dans notre cas : la glutamine (eq. ??). De par son formalisme mathématique, l’ex-
88
pression de Haldane induit une augmentation de la vitesse de croissance en fonction

de substrat plus rapide que celle observée dans le cas de l’expression de Monod. De
fortes concentrations en glutamine feront tendre ce terme vers 0, alors que de faibles
concentrations effaceront son effet (figure ??, tableau ??).
!
[Glc] [Gln]
µ = µmax [Gln]2
(6.6)
[Glc] + KGlc KGln + [Gln] + KI
Figure 6.19 – Modèle d’Andrews avec inhibition par la glutamine - spinner 2
Ce modèle présente des résultats relativement cohérents sur l’ensemble des ex-
périences excepté concernant la valeur de la constante KGln qui semble varier énor-
mément d’un cas à l’autre. En prenant en considération la valeur du facteur de
performance J, ce modèle est celui qui apporte les résultats les plus performants.
Cependant, même s’il semble fournir les meilleurs résultats mathématiquement par-
lant, l’hypothèse biologique d’inhibition par la glutamine sur laquelle il repose est
discutable, et il n’est pas forcément le plus pertinent.
89
6.4. Discussion des résultats
Spinner Spinner Spinner Spinner Spinner

Moyenne
1 2 5 6 7
µmax 0,063 0,058 0,064 0,063 0,069 0,0635
KGlc 9,37 10,09 7,62 9,16 8,70 8,89
KGln 2,01 1,76 0,01 0,97 0,69 1,09
KI 11,99 6,94 8,21 9,07 8,84 9,01
YX/Glc 0,45 0,35 0,37 0,45 0,23 0,37
YX/Gln 1,57 1,25 0,76 1,72 1,21 1,30
YLact/Glc 0,31 0,32 0,71 0,80 0,68 0,57
YAmmo/Gln 1,09 1,32 1,84 1,69 1,18 1,42
Critère J 7,40 6,61 7,30 3,53 9,43
Table 6.9 – Coefficients optimisés du Modèle d’Andrews - spinner 1, 2, 5, 6 et 7
Cet exemple illustre bien les limites de la modélisation : une hypothèse fausse à
la base peut, pour autant, conduire à un résultat d’allure satisfaisante.
6.4 Discussion des résultats
6.4.1 Discussion des graphes
Les modèles de Monod avec dégradation de la glutamine et d’Andrews présentent

des résultats relativement satisfaisants en ce qui concerne le spinner 2. A partir des
résultats obtenus sur les données du spinner 2, deux modèles ont été retenus et testés
sur les spinners 1, 5, 6 et 7 5 . Le graphe ?? suivant résume les différents critères J
calculés pour chaque modèle.
Les valeurs des vitesses spécifiques de croissance obtenues suite à l’optimisation
?? sont globalement plus élevées que celles obtenues par lecture des résultats expé-
rimentaux ; le modèle semble surestimer les vitesses spécifiques de croissance.
Les courbes relatives au glucose et au lactate présentent, aux erreurs expérimen-
tales près, une bonne similitude avec les valeurs réelles ; la courbe des ions ammonium
est, quant à elle, en parfaite adéquation avec les valeurs cibles, et ce, pour tous les
modèles. On note régulièrement des divergences entre les courbes correspondants à
la glutamine et les points expérimentaux de cette dernière. Ceci explique sûrement,
5. Plutôt que de tester tous les modèles sur l’ensemble des spinners, nous avons choisis de
procéder en deux temps. Cette façon de procéder n’est pas la seule possible et résulte d’un choix
propre à la personne manipulant les données
90
Figure 6.20 – Valeurs du critère de performance J des différents modèles
Figure 6.21 – Courbes résultantes du modèle de Monod double
par la même occasion, les faibles valeurs de rendement YX/Gln optimisées et les fortes
variations ressenties sur le KGln .
Cet écart constaté concernant les cellules et la glutamine est sûrement dû à l’op-
timisateur ; en effet si l’on utilise uniquement les points expérimentaux situés dans
la phase exponentielle, on s’aperçoit que les courbes du modèle ont une allure beau-
coup plus juste. Ceci permettrait de conclure que les formulations de nos modèles
non structurés représentent bien la phase de croissance, mais pas forcément l’inté-
91
gralité de l’expérience. On peut ainsi supposer que le modèle est encore incomplet
pour décrire l’ensemble d’une culture.
D’autre part, Matlabr donne accès à d’autres outils qui permettent, en aval, de
« valider »en partie la structure de nos modèles. A l’issu d’une optimisation par l’al-
gorithme, celui ci propose un grand nombre de vecteurs de paramètres qui conduisent
tous à une erreur J minimale et équivalente. L’analyse de l’ensemble des valeurs pro-
posées pour un paramètre comme µmax et l’analyse de ces ensembles de paramètres
deux à deux, décrit ici la distribution des paramètres identifiés et les corrélations
entre les paramètres. Par exemple, la figure ?? suivante montre la distribution des
différents coefficients optimisés dans le cas du modèle d’Andrews ; on peut ainsi se
rendre compte de l’impact de chacun des facteurs et des interactions pouvant exister
entre ces derniers. Ce tableau possédant le même nombre de lignes et de colonnes
permet de visualiser la répartition des valeurs de chacun des paramètres optimisés
au sein de la population finale. La diagonale présente ainsi la distribution purement
statistique des valeurs optimisées pour un même paramètre 6 . Plus la distribution
est large et éparse, moins la précision sur la valeur du paramètre en question est
importante dans le modèle ; à l’inverse un paramètre présentant un nuage de points
concentrés aura un poids important sur le système.
Ce type de diagramme met aussi en évidence les corrélations éventuelles entre les
différents paramètres du système. Une répartition des points de manière linéaire et
oblique entre deux paramètres traduit alors que ces paramètres se compensent l’un
et l’autre et qu’un seul peut suffir à caractériser le système. A titre d’exemple, nous
avons créé un tel graphique en recréant artificiellement un modèle contenant deux
termes dépendants l’un de l’autre (exemple figure ??).
En conclusion, les résultats que nous avons pu obtenir suite à ces travaux de
modélisation répondent en partie à la problématique développée initialement. Tout
en conservant une certaine simplicité dans le formalisme mathématique et dans les
phénomènes décrits, nous avons identifié un modèle permettant, à quelques variations
près, de représenter l’évolution de notre système de culture cellulaire. Comme nous
6. à la manière d’un intervalle de confiance
92
Figure 6.22 – Distributions au sein de la population optimisée et interactions entre

les différents facteurs - spinner 2
l’avons vu, il existe un certain nombre de difficultés à palier concernant la phase de

modélisation. La principale d’entre elle est qu’il faut être particulièrement vigilant
dans la validation des hypothèses et l’interprétation des résultats. Ainsi un modèle
reposant sur des postulats incorrects peut très bien fournir de bons résultats en
apparence, et inversement. Un certain nombre de pistes pourront être développées
pour aller plus loin dans l’approche de modélisation ; on peut par exemple citer :
– la modélisation des phénomènes intracellulaires, notamment à travers la carac-
térisation du pyruvate ;
– la description des phénomènes de mort et de maintenance cellulaire ;
– la limitation forcée par une espèce inconnue 7 ;
7. Il est tout à fait possible d’ajouter au système une espèce inconnue de nature non identifiée
et de supposer que l’entrée en phase stationnaire est consécutive à la disparition de cette espèce
inconnue. Il peut par exemple s’agir de facteurs de croissance, d’acides aminés particuliers ... etc.
93
Figure 6.23 – Exemple de phénomène de compensation - spinner 2
– l’introduction d’un terme concernant les acides aminés.
94
Troisième partie
Aspects industriels de la maîtrise

des procédés de production de
vaccins
95
Chapitre 7
L’approche PAT appliquée à la

culture de cellules animales
Après avoir suivi et après avoir compris l’intérêt théorique de la démarche de

modélisation, il est légitime de se demander comment faire le lien entre le côté
très conceptuel des modèles et la pratique de la production de terrain. L’apport
de connaissances sur le procédé est tout à fait cohérent avec une nouvelle démarche
prônée par les institutions règlementaires : le PAT.
Après avoir redéfini ce qu’est le PAT et après avoir brossé une description du
contexte dans lequel le PAT s’impose, ce chapitre expliquera quels sont les outils
nécessaires à sa mise en place, sur le terrain, en ce qui concerne les problématiques
de culture cellulaire.
7.1 Une nouvelle approche du développement et de la

production : le PAT
7.1.1 Définition du PAT
La démarche PAT, pour Process Analytical Technology, existe depuis plusieurs

décennies dans des industries diverses, telles que les industries des secteurs chimique,
agroalimentaire ou pétrolier. Elle est apparue beaucoup plus récemment dans le
96
7. L’approche PAT appliquée à la culture de cellules animales
7.1. Une nouvelle approche du développement et de la production : le PAT
domaine des industries biotechnologiques.

La FDA définit le PAT comme étant :
« a system for designing, analysing and controlling manufacturing through

timely measurement (i.e., during processing) of critical parameters, with
the goal of ensuring final product quality »([?]).
Le but de cette systématique est de permettre le développement et la mise en

place de procédés assurant de manière quasi certaine un niveau de qualité pré-défini
comme acceptable.
Cette nouvelle tendance implique un bouleversement profond dans la façon de
penser et d’appréhender le développement, la qualification et la validation des bio-
procédés. Actuellement, pour s’assurer de la qualité du produit fini, l’approche la plus
répandue consiste à contrôler le produit en fin de chaîne de production. A contrario,
l’approche PAT propose, en complément du contrôle qualité, de suivre en temps réel
l’évolution des variables du procédé.
Par conséquent, on assiste à une translation de la notion de qualité. Alors qu’au-
paravant la qualité se concrétisait en fin de procédé, dans le cadre du PAT, la qualité
se construit en amont et au cours du procédé. Ceci implique que le procédé repose
sur un socle de connaissances solides, étayées lors du développement, qui en assure
sa maîtrise.
« Quality cannot be tested into products, it should be built in, or by

design ».
Les objectifs du PAT sont multiples ; il permet au final :

– d’améliorer la compréhension et de maîtriser la variabilité des procédés ;
– de réduire le taux de rejet : la productivité s’en retrouve alors augmentée ;
– d’optimiser la durée des cycles de production ;
– de réduire les risques d’erreurs humaines en augmentant les automatismes ;
– de permettre la libération des lots en temps réel et de limiter les contrôles
finaux à un petit nombre d’échantillons ;
97
– d’améliorer la productivité en facilitant potentiellement les procédés en continu,

par rapport aux procédés discontinus.
7.1.2 La mise en pratique du PAT
L’initiative PAT repose sur 4 piliers principaux :

– l’analyse multi-variable des données, qui s’oppose à la tendance actuelle à ne
contrôler les procédés qu’en fonction du temps de production 1 . L’analyse multi-
variable du procédé implique la présence d’outils informatiques puissants per-
mettant l’acquisition des données et leur analyse.
– des méthodes d’analyse qui permettent de suivre l’évolution temporelle des
paramètres d’importance.
– une meilleure maîtrise globale et une meilleure automatisation des procédés,
permettant de prendre et d’appliquer en temps réel des décisions.
– la mise en place d’un management des connaissances (Knowledge management)
permettant la pérennité des connaissances globales sur le produit et sa fabri-
cation.
C’est dans cette optique que s’intègrent les outils de modélisation mathématique
tels que ceux que nous avons pu présenter. Comme nous l’avons vu précédemment,
les modèles permettent d’augmenter le degré de connaissance du procédé en validant
certaines hypothèses. Ils permettent aussi de prédire l’évolution du procédé et d’aider
l’utilisateur à la prise de décision, en vu de réduire les variations du procédés et par
conséquent d’optimiser et d’améliorer ses performances.
Le PAT passe par l’identification et la mesure des paramètres critiques du pro-
cessus, encore appelés CCP pour « Critical Process Parameters »et par la définition
d’un domaine de confiance définissant les frontières d’application du procédé. Ce
dernier point rapproche le PAT d’une autre notion récente : celle de QbD.
1. La très grande majorité des procédés pharmaceutiques reposent actuellement sur des pro-
cédures opératoires standards (SOP), que l’on pourrait assimiler à des recettes, à des routines
pré-conçues (contrôle en boucle ouverte, sans « retro-action »)
98
7.1.3 Les outils du PAT
On peut classifier les outils pour la mise en œuvre du PAT en trois catégories :
– « at-line » : ces techniques impliquent des mesures et des analyses hors ligne
suite à des prélèvements d’échantillons,
– « on-line » : la mesure est réalisée quasiment en temps réel, et elle est non
invasive. Le capteur , ou la technologie, est implanté en boucle fermée sur le
procédé afin de ne pas perturber son évolution,
– « in-line / in-situ » : la mesure est réalisée en temps réel et ne perturbe pas
le système étudié étant donné que le capteur stérilisable, ou la technologie, est
non invasif et est implanté dans le procédé à étudier.
7.1.4 La méthodologie QbD
La méthodologie QbD, pour « Quality by Design », a pour but l’établissement

d’un espace de confiance (ou Design space) qui tient compte de la variabilité naturelle
et des interactions entre les différents paramètres opératoires influant sur le procédé
et sur la qualité finale du produit. L’objectif premier est de déterminer les paramètres
critiques du procédé tels que, par exemple, la composition des matières premières,
la recette 2 de production, les conditions opératoires, . . .
L’espace de confiance représente alors un espace dans lequel les perturbations
n’auront pas d’effet sur la qualité du produit, et ne nécessiteront pas de modifications
du dossier d’acceptation.
La méthodologie QbD s’appuie donc sur une grande connaissance et une bonne
maîtrise du procédé de production résultant d’un grand nombre d’informations ac-
quises, soit, au cours du procédé par les technologies PAT d’analyse en ligne, soit,
par des techniques de plans d’expériences préalables (DOE : Design Of Experiment).
Les approches PAT et QbD impliquent un surcoût évident lors des opérations
de développement et une maîtrise des procédé beaucoup plus exigeante. Cependant,
2. Terme trivial désignant le protocole complet de production
99
7.2. Le PAT appliqué à la culture cellulaire
elles entraînent aussi des économies considérables en production. En effet, ces ap-
proches modernes permettent, à travers une meilleure compréhension des processus,
de réduire de façon conséquente leur variabilité intrinsèque 3 . On améliore ainsi la
qualité et la productivité des procédés, deux notions souvent en opposition.
7.1.5 Référentiel normatif
Le premier document officiel, évoquant ces nouvelles directives règlementaires,

provient de la FDA [?] et date de 2002. A travers ce document, dont le sous-titre est
« A scientific, risk-based approach », la FDA pose les premières bases du management
des risques ; il est précisé que les entreprises pharmaceutiques devront :
– adopter et intégrer les nouvelles évolutions technologiques. ICH Q8 : Pharma-
ceutical Development including Quality by Design with focus on Drug Product
Development ;
– adopter les derniers systèmes en cours de management de la qualité. ICH Q9 :
Quality risk management 4 ;
– adopter un management de la qualité basé sur le risque. ICH Q10 : Quality
systems 5 .
7.2 Le PAT appliqué à la culture cellulaire
Comme cela à été mis en évidence dans la partie concernant le traitement de

la modélisation, les paramètres dont le suivi en ligne est particulièrement approprié
pour la compréhension et l’amélioration des procédés sont les suivants :
X la concentration et la viabilité cellulaire ;
X les concentrations en éléments nutritifs, principalement glucose et glutamine ;
X les concentrations en co-produits du métabolisme, principalement ammonium
et lactate.
3. La variabilité inhérente à un procédé est souvent appelée statistiquement capabilité.
4. Ce document concerne le contrôle, la communication et contient un listing des risques encourus
pour la qualité d’un médicament durant son cycle de vie
5. Il s’agit d’un complément aux actuelles GMP qui a pour objectif l’introduction de l’amélio-
ration continue dans les procédés de fabrication pharmaceutiques
100
D’autres paramètres auront aussi leur importance, tels que :

– les paramètres physico-chimiques de fonctionnement du réacteur (pH, tempé-
rature, pO2 , pCO2 , osmolarité, agitation et hydrodynamique, . . .) ;
– la concentration et la qualité du produit (quantités de virus ou de protéines
produites, taux de particules virales non infectieuses, produits de dégradation,
. . .).
L’analyse de la littérature proposée ci-dessous ciblera essentiellement le suivi en-
ligne de la concentration et de la viabilité cellulaire, ainsi que celui des éléments
nutritifs et produits principaux.
7.2.1 La mesure du pH et de la pO2
A l’inverse des autres paramètres énumérés précédemment 6 , la plupart des bio-

réacteurs assurent le suivi en ligne en routine du pH, de la température et de la
pO2 par des capteurs stérilisables. L’utilisation de ces indicateurs pour le suivi et
l’amélioration des cultures cellulaires est donc une méthode particulièrement avanta-
geuse en terme d’investissement, puisqu’elle ne nécessite pas de lourdes installations
supplémentaires.
Il est notamment possible de déterminer à partir de la pO2 et des vitesses de
consommation en oxygène, les moments privilégiés pour l’infection, la récolte ainsi
que les changements de milieu [?] (figure ??).
7.2.2 La mesure de la concentration et de la viabilité cellulaire
La concentration cellulaire est une des variables clefs pour le contrôle des pro-
cédés de culture cellulaire. Elle est particulièrement utile pour déterminer les mo-
ments optimaux d’infection virale des cultures. Les premières techniques mises en
place quantifiaient la concentration cellulaire de manière indirecte à partir de don-
nées intermédiaires telles que la consommation d’oxygène ou la quantité de glucose
consommée [?]. Les inconvénients de ces méthodes de quantification sont qu’elles se
6. Ces paramètres ne sont pas suivis en systématique, mais uniquement en fonction des besoins
et de manière plus artisanale.
101
Figure 7.1 – Exemple de suivi des concentrations cellulaires dans le cadre du PAT
[?]
déroulent la plupart du temps hors-ligne, et qu’elles impliquent l’hypothèse, discu-

table, des rendements constants.
La spectroscopie diélectrique
En physique, on désigne par spectroscopie diélectrique l’ensemble des techniques

de mesures des propriétés diélectriques d’un milieu en fonction de la fréquence.
Par analogie, on peut assimiler la cellule à une sphère contenant un cytoplasme
conducteur, baignant dans une solution (milieu de culture), elle aussi conductrice. En
102
raison, de la membrane cytoplasmique, naturellement imperméable aux ions, l’appli-

cation d’un champ électrique à la suspension cellulaire va induire une polarisation des
cellules. La mesure de cette polarisation permet d’accéder à la permittivité cellulaire,
qui peut être enregistrée dans le bioréacteur par une sonde stérilisable.
En modifiant la fréquence du champ électrique, on peut provoquer une chute de la
permittivité induite par la polarisation des membranes. A travers quelques relations
mathématiques, il est alors possible de relier la permittivité enregistrée, au volume
cellulaire global.
7.2.3 Le dosage des métabolites
Il est possible d’assurer un suivi en-ligne des espèces par la mise en place de
méthodes permettant de doser ces métabolites directement dans le surnageant de
culture. En effet, le suivi de la concentration de certains métabolites clefs du méta-
bolisme peut permettre d’améliorer le contrôle de la culture par le calcul des rapports
stœchiométriques [?].
Actuellement, le suivi des métabolites est communément réalisé par des mesures
hors-ligne, soit par des méthodes enzymatiques, soit par CLHP. D’autres outils poin-
tus tels que la spectroscopie de fluorescence, la RMN ou la spectroscopie de masse
sont aussi envisageables. Tous se heurtent cependant à une problématique de taille,
à savoir la nécessité de prélever de manière stérile et automatisée des échantillons
dans le milieu de culture. D’autre part, la matrice d’analyse est particulièrement
complexe et ces techniques imposent le plus souvent une extraction en amont visant
à purifier l’échantillon. La présence de microporteurs rend cette phase de purification
relativement délicate et longue à réaliser, inconvénient majeur pour une démarche
PAT.
Dans ce contexte, les méthodes spectroscopiques, telles que la spectroscopie Ra-

man et la spectroscopie infrarouge sont particulièrement avantageuses. Implantées
in situ par le biais de sondes stérilisables, elles permettent d’acquérir des données
en temps réel rapidement, de manière non invasive et sans préparation préalable des
103
échantillons.
7.2.3.1 La spectroscopie Raman
La spectroscopie Raman est une méthode non-destructive permettant de caracté-

riser la composition moléculaire et la structure d’un milieu. Cette technique est forte-
ment complémentaire de la spectroscopie infrarouge, qui permet également d’étudier
les modes vibrationnels d’un matériau. La méthode consiste à focaliser un faisceau de
lumière monochromatique sur un échantillon puis à étudier et à analyser la lumière
diffusée 7 .
Le spectre Raman résultant présente l’intensité des radiations, fonction de la
longueur d’onde du faisceau d’excitation. En raison de la complexité des milieux
de culture, les spectres obtenus sont parfois particulièrement chargés et difficiles à
traduire.
La spectroscopie Raman a déjà montré son potentiel pour l’identification de com-
posés solubles dans divers procédés biotechnologiques. Pour l’instant aucune appli-
cation ne concerne directement les cellules animales, mais la spectroscopie Raman a
déjà été utilisée, notamment pour suivre la production d’éthanol par les levures [?].
7.2.3.2 La spectroscopie IR
La spectroscopie infrarouge est une classe de spectroscopie qui traite de la ré-

gion infrarouge du spectre électromagnétique (figure ??). Dans cette technologie, on
étudie la réponse vibrationnelle d’une molécule suite à l’absorption de radiations
électromagnétiques. La radiation émise en retour est fonction du squelette et de la
nature des liaisons composant la molécule ; chaque fonction organique, et par consé-
quent chaque molécule, va ainsi présenter une empreinte spectrale bien particulière
(figure ??).
Longtemps cette technique analytique n’a été considérée que comme une tech-
nique qualitative permettant de tester la présence ou l’absence de composés. Les
avancées significatives dans le domaine du traitement des signaux notamment, ont
7. La lumière résultante est recueillie et envoyée dans un monochromateur et son intensité est
alors mesurée avec un détecteur
104
Figure 7.2 – Position de l’infrarouge dans le spectre électromagnétique
Figure 7.3 – Exemples de spectres proche infrarouge de composés classiques des

milieux de culture [?]
permis d’explorer une nouvelle partie du spectre électromagnétique et d’étudier des

échantillons avec des longueurs d’ondes plus faibles (MIR, NIR) permettant le do-
sage des métabolites. Cette méthode analytique est maintenant très présente dans
105
l’arsenal analytique des laboratoires de contrôle qualité ; son caractère non invasif en
fait une méthode de choix pour tester les matières premières, les produits finis ainsi
que pour s’assurer du bon déroulement de certaines opérations unitaires en cours de
production 8 .
Dans le cas précis des cultures cellulaires animales, la spectroscopie proche in-
frarouge a déjà démontré son intérêt dans le dosage des métabolites. Cependant, la
plupart des applications restent pour l’instant « at-line », et non « in situ », ce qui
constitue l’objectif final.
La principale difficulté inhérente à l’utilisation de ces techniques réside dans l’in-
terprétation des spectres obtenus. En effet, un spectre infrarouge classique est com-
posé d’une multitude de signaux superposés, qu’il va falloir individualiser par des
outils mathématiques et informatiques tels que la PCA (Analyse en composante
principale), les méthodes de régression ou les transformées de Fourier [?]. Ces tech-
niques vont permettre d’extraire de façon sélective les informations contenues. Un
autre obstacle à surmonter pour mettre en place un suivi en ligne par NIR tient à
la complexité physique des milieux de culture. En effet, la présence de bulles, la vis-
cosité du milieu ou encore une répartition biphasique, seront autant de phénomènes
qui risquent de perturber l’acquisition et la qualité des spectres [?] (figure ??).
Comme nous avons pu le voir, le PAT est une solution particulièrement intéres-
sante dans la maîtrise au quotidien des bioprocédés. Bien que l’approche PAT soit
maintenant connue de tous, et qu’elle ait trouvée sa place dans les textes règlemen-
taires les plus récents, un grand nombre d’entreprises pharmaceutiques restent encore
très peu expérimentées vis-à-vis de ce concept. Il est résulte un certain scepticisme et
une certaine difficulté à faire admettre les conséquences de taille que le PAT induit.
Dans cette période de crise, l’argument économique sera certainement un argument
critique, poussant les organisations à adopter assez rapidement ce nouvel outil.
8. Les problématiques de mélange, de séchage, de lyophilisation, de polymorphismes, . . ., sont

particulièrement propices à l’application de cette technique.
106
Figure 7.4 – Les différents niveaux de complexité dans l’application de la spectro-

scopie NIR aux bioprocédés [?]
107
Chapitre 8
La maîtrise de la qualité dans une

production aseptique
Nous avons pu mettre en évidence dans le chapitre précédent que l’approche PAT
offre une meilleure maîtrise du procédé. Cette approche tend à augmenter le degré
de connaissance relatif au procédé, à réduire sa variabilité intrinsèque et à mettre
en place un suivi ciblé sur chaque lot. Par conséquent, le PAT présente le double
avantage d’améliorer la productivité du procédé, par la recherche de rendements
optimaux, mais aussi le degré de qualité final du produit.
Un autre facteur va venir impacter directement la qualité du produit final asep-
tique ; il s’agit, non plus du procédé en lui même, mais de son environnement. Effec-
tivement, dans le cadre de productions stériles, un ensemble de mesures préventives
sont mises en place pour s’assurer qu’aucune contamination ne peut survenir durant
la production. Il apparaît donc particulièrement important de consacrer un chapitre
aux spécificités des productions stériles.
Ce chapitre s’attachera donc en premier lieu à redéfinir la notion de stérilité, à
présenter les différentes méthodes pouvant être mises en œuvre et enfin à décrire les
moyens permettant, en pratique, de limiter les biocontaminations.
108
8. La maîtrise de la qualité dans une production aseptique
8.1. Stérilité et stérilisation
8.1 Stérilité et stérilisation
Le vaccin est un produit obligatoirement stérile ; son mode d’administration ex-

clut formellement que le vaccin soit vecteur d’un quelconque micro-organisme intro-
duit au cours de sa fabrication. Par ailleurs, il est aussi indispensable de préserver
le procédé de culture en lui même, de toute contamination extérieure qui viendrait
entraver son bon déroulement.
8.1.1 La notion de stérilité
8.1.1.1 Définition
Selon les BPF et la Pharmacopée européenne, la stérilité est définie par l’absence
de tout organisme vivant dans ou sur le produit ; les conditions de l’essai de stérilité
sont décrites dans la Pharmacopée européenne [?].
En réalité, un produit considéré comme stérile ne signifie pas forcément qu’il est
exempt de micro-organismes non désirés, mais seulement :
« qu’aucun micro-organisme contaminant n’a pu être décelé dans l’échan-

tillon examiné, dans les conditions de l’essai ».
Par définition, l’état stérile d’un produit se traduit par la probabilité d’au plus 1/106
d’y trouver un germe viable ou revivifiable. Cette notion est introduite par les auto-
rités de santé sous le terme de niveau d’assurance de stérilité, ou NAS ; ce concept
est explicité en Annexe ??.
Selon la Pharmacopée européenne [?], les formes pharmaceutiques strictement
stériles sont :
– les préparations parentérales, telles que les injectables, les préparations pour
perfusion 1 , les gels et les implants ;
– les préparations ophtalmiques ;
– les fils chirurgicaux non résorbables stériles.
1. à utiliser en l’état, à diluer ou à dissoudre
109
8.1. Stérilité et stérilisation
8.1.2 La stérilisation
La stérilisation est une technique destinée à éliminer tout micro-organisme d’une

préparation ou d’un produit. Ce procédé à été inventé par Nicolas Appert à la fin
du XVIIIème siècle sous le nom original d’appertisation. En revanche, l’explication
théorique du phénomène n’a été fournie par Louis Pasteur qu’au XIXème siècle.
Dans le domaine de l’industrie pharmaceutique, la stérilisation est employée dans
le but d’éliminer les germes viables ou revivifiables, potentiellement infectieux, des
médicaments ou des dispositifs médicaux [?].
Les lois qui régissent l’inactivation des micro-organismes sont les mêmes quel que
soit le procédé choisi. Au cours de la stérilisation, la concentration d’une population
bactérienne décroît de façon logarithmique en fonction du temps (figure ??).
Figure 8.1 – Droite d’inactivation des micro-organismes
Une stérilisation efficace est une stérilisation qui permet d’obtenir une très faible
probabilité de survie des spores bactériennes. La plupart des bactéries sont facilement
tuées par l’action des différents procédés de stérilisation, à l’exclusion de certaines
spores et de certaines formes de résistance. L’efficacité de la stérilisation dépend prin-
cipalement de la charge microbienne de départ : plus le nombre de micro-organismes
présents initialement est important, plus le NAS est difficile à atteindre.
Il est à noter que la stérilisation est un processus au résultat permanent ; tant
110
8.2. Les différentes méthodes d’obtention de la stérilité
que la barrière protectrice de l’élément stérilisé n’est pas rompue, un produit stérile
le restera forcément.
8.1.2.1 Validation de la stérilisation
Un certain nombre de tests sont mis en place avant et pendant la production pour
s’assurer que le processus de stérilisation s’est déroulé en bonne et due forme. Selon
la Pharmacopée européenne, un procédé de stérilisation doit être validé pour assurer
une reproductibilité et une efficacité maximale. Cette validation de la stérilisation
consiste en 3 éléments :
– la validation microbienne : cette étape ne concerne que les procédés de stéri-
lisation dont les paramètres physiques (température, temps, . . .) ne sont pas
faciles à contrôler. A l’aide d’indicateurs biologiques répartis dans la charge
soumise à stérilisation, la qualification consiste à démontrer que le procédé
inactive l’ensemble des micro-organismes du test. Ces indicateurs biologiques
sont des supports de micro-organismes de référence.
– les essais de stérilité : ces tests consistent à observer l’effet du procédé de
stérilisation sur les produits fabriqués. Ils correspondent donc au contrôle d’un
certain nombre d’échantillons de la production.
– la détermination de la contamination initiale : l’efficacité de la stérilisation
dépend de cette biocharge initiale.
8.2 Les différentes méthodes d’obtention de la stérilité
Il existe différentes méthodes approuvées par les BPF et la Pharmacopée eu-

ropéenne pour la fabrication d’unités stériles. Bien que les principes mis en œuvre
diffèrent, on peut les répartir en deux grandes écoles :
– la stérilisation terminale et la filtration stérilisante ;
– le remplissage aseptique, réalisé dans des conditions particulièrement surveillées
de stérilité.
111
8.2.0.2 La stérilisation terminale
La stérilisation terminale consiste à effectuer un traitement physique sur la solu-

tion après sa fabrication. Cette stérilisation peut se faire avec ou sans le condition-
nement final.
Quelle que soit la méthode employée pour stériliser un produit, le cycle de stéri-
lisation, c’est à dire l’ensemble des opérations effectuées dans un stérilisateur pour
stériliser une charge, est défini par des paramètres physiques précis (température,
temps, pression, taux d’humidité, concentration en gaz selon les procédés). La sté-
rilisation est validée prioritairement par l’examen de ces caractéristiques physiques,
mais comme nous avons pu le voir, il est également possible de renforcer le contrôle
par des indicateurs chimiques ou biologiques disposés au sein même de la charge à
stériliser [?], [?].
Les moyens de réalisation de la stérilisation d’un produit et son contenant sont
les suivants :
– la stérilisation à la vapeur d’eau : le produit est introduit dans un autoclave.
L’autoclave est une enceinte close et sous pression dans laquelle la vapeur d’eau
est envoyée sur les produits de manière à ce qu’aucune unité ne soit épargnée.
L’action de l’eau et de la chaleur permet d’obtenir un produit stérile en dénatu-
rant les protéines bactériennes grâce à une réaction d’hydrolyse, inhibant ainsi
les mécanismes de duplication moléculaire. Cette technique possède une action
sporicide particulièrement efficace. Par conséquent, elle est recommandée en
première intention dès l’instant que le contenant du produit peut résister à ce
traitement. Elle reste la technique la plus utilisée dans l’industrie pharmaceu-
tique de part sa fiabilité de résultat et de part son coût.
– la stérilisation par chaleur sèche : le produit est placé dans un four muni d’un
système de circulation de l’air. Ce four est appelé étuve de Poupinel ou four
Pasteur. La stérilisation se fait encore une fois par l’action de la chaleur. Cette
méthode est principalement utilisée pour la dépyrogénisation de la verrerie en
amont d’un remplissage aseptique.
– la stérilisation par irradiation ionisante : un rayonnement gamma d’isotope ou
112
un faisceau d’électrons traverse le produit et les matériaux à stériliser. L’action

bactéricide résulte de l’ionisation des molécules vitales telles que l’ADN ou les
protéines. Cette solution est privilégiée pour les produits sensibles à la chaleur
mais elle reste peu utilisée sauf pour sécuriser les PSM et les enceintes.
– la stérilisation à l’aide d’un gaz : les gaz les plus courants sont l’oxyde d’éthy-
lène et l’acide peracétique. En raison de l’effet fortement cytotoxique du gaz,
cette méthode est employée exclusivement dans le cas où aucune des autres
méthodes n’est utilisable. Ces gaz nécessitent des précautions de protection
particulières pour le personnel et possèdent un caractère explosif pour des
concentrations supérieures à 3%, d’où une certaine difficulté de manipulation.
8.2.0.3 La filtration stérilisante
La filtration stérilisante est une technique purement mécanique qui consiste à

faire passer le produit à stériliser au travers d’un filtre. Ce dernier est constitué
d’une membrane stérile à pores d’un diamètre nominal de 0,22 µm.
La filtration est le résultat de deux phénomènes : d’une part, la rétention des
particules par interception directe des particules en fonction de leur taille et, d’autre
part, le mécanisme d’adhésion des bactéries sur les matériaux composant le filtre.
La rétention des bactéries par un filtre est dépendante de plusieurs facteurs [?], tels
que :
– le type de filtre : sa structure, sa composition chimique, la taille de ses pores,
son épaisseur, ses dimensions, . . .
– le type de fluide : sa compatibilité avec la structure du filtre, la présence de
surfactants, ses composants, son pH, sa viscosité, sa force ionique, sa biocharge
initiale, . . .
– les conditions de la filtration : température, pression, vitesse d’écoulement du
fluide, temps de contact entre le fluide et le filtre, la durée d’utilisation, . . .
La filtration stérilisante est utilisée pour les médicaments qui ne peuvent pas être
stérilisés dans leur récipient final car ils ne résistent pas aux traitements classiques
113
présentés précédemment 2 . Ce procédé est aussi le procédé de choix pour filtrer des
matières premières fluides comme par exemple les milieux de culture ou l’eau.
Malgré son optimisation permanente, la filtration reste tout de même moins per-
formante que les autres méthodes car les risques en terme de stérilité demeurent
encore importants. De plus, la filtration ne retient que les bactéries et les moisissures
alors que les virus, certains mycoplasmes et les pyrogènes ne sont pas ou peu éliminés
du liquide.
8.2.0.4 Le remplissage aseptique
Le remplissage est réalisé dans des conditions d’aseptie, en ZAC. Ce procédé de

fabrication s’adresse aux produits qui ne peuvent pas subir un cycle de stérilisation
normal car ils seraient détériorés par la montée en température. Le remplissage a lieu
soit sous hotte à flux de classe A, soit dans un isolateur dans un local de classe B, afin
de limiter au maximum les risques d’introduction de contaminants dans le produit ;
les produits et matières premières ont été eux aussi dûment stérilisés. C’est pourquoi
cette étape de remplissage n’est pas suivie d’une stérilisation supplémentaire, les
conditions de stérilité étant normalement respectées en tout point de la fabrication.
Ne pouvant pas démontrer la stérilité de chaque unité d’un lot, les industries
pharmaceutiques emploient la méthode de libération paramétrique. Selon les BPF
[?], la libération paramétrique des produits stériles est :
« un système de libération propre à assurer que le produit est de la qualité

requise, sur la base d’informations recueillies en cours de fabrication ».
La libération d’un lot aseptique repose sur un ensemble de paramètres qui doivent
être tous conformes pour pouvoir assurer que chaque unité de produit fabriquée
est stérile (figure ??). La libération du produit fini est basée à posteriori sur les
données de suivi et sur les contrôles de l’ensemble de ces paramètres. Les informations
recueillies in-process peuvent être multiples :
– contrôle de la contamination microbiologique ;
– test de stérilité des produits ;
2. produits hygrosensibles ou thermolabiles
114
– indicateurs biologiques de stérilisation d’équipements.
Figure 8.2 – Recueil de données aux différentes étapes du procédé de fabrication

[?]
– A : contrôle des matières premières et des articles de conditionnement à la

livraison par les fournisseurs. Les contrôles permettent de vérifier notamment
que ces composants sont exempts de tout micro-organisme afin qu’ils ne soient
pas source de contamination.
– B : contrôles en cours de production : contrôles intermédiaires effectués tout
au long du procédé de fabrication permettant de suivre la qualité du produit.
– C : auto-contrôles : contrôles directement réalisés par les producteurs. Par
exemple, la mesure de pH ainsi que la coloration du milieu d’une culture cel-
lulaire peuvent refléter une contamination bactérienne.
– D : contrôles du produit fini : contrôles physico-chimiques, bactériologiques et
fonctionnels aboutissant à la libération du lot.
Il est communément reconnu [?] :
« qu’un ensemble exhaustif d’essais et de contrôles en cours de fabrica-

tion peut constituer un moyen plus efficace de garantir le respect des
spécifications du produit fini que les tests pratiqués sur le seul produit
fini ».
Selon l’EMEA, la libération paramétrique n’est possible qu’à condition que le procédé
de stérilisation soit validé, qu’un suivi en cours de production soit instauré et que la
115
8.3. Limitation des sources de contamination
robustesse du procédé soit démontrée. Elle est validée par une étude pointue visant
à assurer le niveau de stérilité du produit qui nécessite la validation du procédé de
fabrication de produits stériles et une bonne définition des critères d’acceptation d’un
lot conforme.
8.3 Limitation des sources de contamination
Comme nous avons pu le préciser, limiter les sources de contamination est une
préoccupation cruciale pour assurer la qualité du produit final.
Cette limitation des biocontaminations repose sur deux piliers essentiels : la maî-
trise des salles propres et du personnel.
8.3.1 Les salles propres
8.3.1.1 Définition
Les produits stériles sont fabriqués dans des zones de travail particulières appe-
lées : salle propre, salle blanche, zone à empoussièrement contrôlé ou encore zone à
atmosphère contrôlée. Selon la norme NF EN ISO 14644 [?], une particule se définit
comme étant :
« Un objet solide ou liquide dans le cadre de la classification de la propreté

de l’air, appartenant à une distribution cumulée qui est fondée sur une
taille, de limite inférieure, dans l’intervalle allant de 0,1 µm à 0,5 µm ».
Selon la même norme, une salle propre est :
« Une salle dans laquelle la concentration de particules en suspension dans

l’air est maîtrisée et qui est construite et utilisée de façon à minimiser
l’introduction, la production et la rétention de particules à l’intérieur
de la pièce et, dans laquelle d’autres paramètres pertinents tels que la
température, l’humidité et la pression sont maîtrisés comme il convient ».
116
8.3.1.2 Classification
La ZAC est un espace clos construit et utilisé de façon à réduire l’introduction,

la multiplication ou la persistance de substances contaminantes. Ce sont des zones
de travail conçues de manière à pouvoir maîtriser l’environnement de la production.
Comme leur nom l’indique, l’air est contrôlé régulièrement pour s’assurer qu’il n’y a
pas eu de micro-organismes ou de particules introduites dans ces locaux.
Ainsi, suivant l’activité au sein de la ZAC, les exigences règlementaires diffèrent.
Selon le niveau de qualité d’environnement requis, les salles propres sont classées en
quatre catégories. Pour chacune d’elles, les BPF définissent des normes à respecter [?].
En effet, le taux de particules solides et le nombre de micro-organismes tolérés dans
l’environnement sont plus stricts pour des médicaments injectables, obligatoirement
stériles (classe A), que pour des comprimés (classe C ou D).
Il existe différentes sources règlementaires qui régissent la classification des salles
propres. Le tableau ?? présente les correspondances entre les trois règlementations
en vigueur.
Selon les BPF [?], la classe 1, classe la plus stricte, correspond à la qualité d’air
présent dans un isolateur ou une hotte à flux laminaire (HFL). Cet équipement est
toujours installé dans un environnement de classe B afin de diminuer la probabilité
d’introduction de contaminants sous la hotte. Les classes C et D suffisent pour la
production de médicaments lorsqu’il n’y a aucun contact du produit avec l’environ-
nement extérieur : le produit est contenu dans un récipient fermé (ampoule, flacon,
bouteille, . . .)
8.3.1.3 La conception des locaux
Les locaux sont construits de manière à limiter les risques d’accumulation en

micro-organismes dans la zone [?]. Plusieurs aspects sont pris en compte avant la
construction d’une ZAC : les matériaux, l’agencement des locaux et les installations.
Le but est de minimiser l’exposition du produit stérile à des contaminations po-
tentielles. Ainsi, les consignes données par les autorités américaines sont les suivantes
[?] :
117
référentiels GMP BPF ISO 14644-1 Surveillance Surveillance
particulaire au microbiologique
repos, part. de UFC/m3
0,5µm/m3
M 3.5 ou 100 A 5 3500 <1
118
M 4.5 ou 1000 B 6 3500 10
Classes
M 5.5 ou 10 000 C 7 350000 100
M 6.5 ou 100 000 D 8 3500000 200

Table 8.1 – Correspondance des différentes classifications caractérisant les salles propres
– limiter la durée d’exposition du produit à l’environnement ;

– contrôler l’environnement ;
– optimiser le flux de production ;
– choisir des équipements adaptés aux conditions de la classe A ;
– optimiser les flux du personnel et du matériel pour prévenir des mouvements
superflus ;
– limiter les mouvements du personnel en installant des postes de travail ergo-
nomiques ;
– encadrer le nombre d’opérateur et limiter leurs allées et venues ;
– concevoir les équipements de manière à réduire les interventions ;
– utiliser des sas de transfert entre les zones ;
– faciliter la stérilisation des équipements ;
– organiser les flux d’air sans perturbation.
Les ZAC sont construites de façon à ce que [?] :
« Chaque opération soit réalisée dans une zone dédiée et organisée de

manière à éviter toute contamination ou mélange de produits ».
Pour chaque zone, il faut tenir compte des points suivants :

– des conditions de travail : la zone en pression positive doit être équipée de
système HVAC (Heating, Ventilating, Air, Conditionning), de système de trai-
tement de l’air et de ventilation.
« Pendant la fabrication, une alimentation en air filtré doit maintenir

en toutes circonstances une pression positive ». [?]
La température (18 à 20 °C) et l’humidité relative (30 à 55%) sont contrôlées

car elles ne doivent pas être trop élevées pour ne pas favoriser la croissance
bactérienne et pour conserver des conditions de travail confortables.
– de l’agencement de la zone : toutes les surfaces sont lisses, imperméables, sans
fissures et résistent aux traitements chimiques ; les coins sont à bannir. Les
meubles, les étagères et le matériel sont en nombre limité.
– des équipements : les éviers sont exclus des zones classées A et B.
119
– des matériaux et matériels : l’inox est le matériau le plus souvent employé, il

possède les propriétés adaptées pour l’environnement d’une ZAC : peu rugueux,
facilement lavable et stérilisable avec un faible pouvoir relarguant. Le matériel
est le plus souvent du matériel à usage unique, plus pratique à manipuler. La
gestion des déchets prend par contre un caractère particulièrement important.
– de l’alimentation en fluide : l’eau et l’air entrant dans la ZAC sont transportés
dans des canalisations conçues de telle manière qu’il n’existe pas de niche.
L’eau est maintenue à une température de 70 ◦ C pour ne pas favoriser le
développement bactérien.
– des sas d’entrée et de sortie : l’air filtré ventile les différents sas tout en main-
tenant une cascade de pression de telle façon que les particules ne pénètrent
pas dans la ZAC, c’est à dire par une surpression de l’intérieur vis-à-vis de
l’extérieur. Ceci permet de limiter les mouvements d’air et donc les transferts
de particules vers la ZAC.
La conception des salles blanches a changé depuis l’apparition des isolateurs.

L’isolateur présente pour avantage principal la réduction du contact Homme/pro-
duit. Cependant l’investissement de départ est conséquent, c’est pourquoi ce type
d’équipement est tout de même réservé à des productions spécifiques comme celles
de produits à caractère thermolabile remplis en conditions aseptiques ou de produits
dangereux.
8.3.1.4 La problématique de l’air
Il s’avère nécessaire de limiter le risque de dépôt des particules. Pour cela, des
systèmes réalisant des flux d’air laminaires, c’est à dire réguliers, homogènes et uni-
directionnels, sont mis en place dans les zones de fabrication. Ceci permet aux parti-
cules d’être portées par des courants horizontaux, tourbillonnaires ou ascensionnels
et d’éviter ainsi leur chute sur les surfaces, sur le personnel ou directement sur le
produit.
Les ZAC sont alimentées d’air stérile obtenu par des filtres absolus HEPA situés
aux points de soufflage et d’extraction d’air dans la zone. Ils retiennent à la fois
120
les particules solides et les micro-organismes contenus dans l’air. La maîtrise du

traitement de l’air consiste à contrôler régulièrement le taux de renouvellement de
l’air, le taux d’empoussièrement et les surpressions afin de conserver un taux de
particules bas dans la zone de travail.
8.3.2 Le personnel
Le personnel est la source principale d’introduction des biocontaminants ; c’est

pourquoi il est indispensable de travailler de manière rigoureuse. Une augmentation
de l’activité du personnel s’accompagne irrémédiablement d’une augmentation, plus
ou moins forte, du taux de particules dans l’espace de travail.
8.3.2.1 Deux principes fondamentaux
Afin de limiter l’intrusion de particules et donc de micro-organismes dans le

produit stérile, il est nécessaire de suivre ces règles élémentaires.
Le nombre de personnes en ZAC
L’homme est la première source de contamination dans une salle blanche. En
effet, augmenter le nombre de personnes engendre également des mouvements d’air
plus importants. Les flux d’air conçus pour diriger l’ensemble des particules vers
les systèmes de filtration sont alors perturbés et ne peuvent plus jouer leur rôle.
Les contaminants potentiellement présents dans la zone ont alors plus de chance
d’atteindre le produit.
Pour réduire au maximum les contaminants, le nombre de personnes circulant
dans la ZAC en activité doit être réduit au strict nécessaire pour la production ou
tout autre activité à réaliser.
L’hygiène du personnel
Le personnel doit faire preuve d’une propreté et d’une hygiène remarquables.
Par exemple, si un technicien est amené à intervenir dans 2 zones distinctes où sont
manipulées des cultures en micro-organismes différents, il est obligé de se doucher
entre les deux zones afin d’éviter toute contamination croisée des produits.
Il est à noter qu’une personne malade ou blessée ne peut pas entrer dans une
121
ZAC car elle risque d’introduire des particules ou micro-organismes dans l’environ-
nement (blessure en contact avec le produit, gouttelettes de salive projetées lors d’un
éternuement, . . .).
8.3.2.2 La formation du personnel
D’après les BPF [?] :
« le personnel doit recevoir, initialement et de façon répétée, une forma-

tion comprenant les aspects théoriques et pratiques du concept d’assu-
rance qualité ».
Dans le cas des productions aseptiques, le personnel amené à intervenir dans une
ZAC reçoit également une formation spécifique comportant des consignes d’hygiène
et des notions de microbiologie. Il convient également d’évaluer régulièrement les
acquis du personnel [?] :
« La formation continue du personnel doit être assurée et son efficacité

pratique périodiquement évaluée ».
On constate en effet une certaine dérive dans les gestes et les bonnes pratiques du
personnel qu’il convient de limiter.
8.3.2.3 L’habillage
Pour éviter la contamination du produit, le personnel doit s’habiller avec une

tenue spécifique afin de contenir les particules [?].
« Un vêtement protecteur propre et stérile (stérilisé ou désinfecté) doit

être fourni à chaque opérateur en classe A/B lors de chaque séance de
travail... ».
Le personnel doit ainsi respecter les procédures d’habillage en vigueur. Les vête-
ments personnels ne peuvent être introduits dans les vestiaires conduisant aux zones
B et C. Quelques règles simples sont à respecter :
– enfiler sa tenue sans qu’elle touche le sol ;
– se laver les mains avant de rentrer en zone ;
122
– respecter les précautions d’usage pour enfiler les gants sans en contaminer la
surface extérieure. Le gant est en effet un des vecteurs majeurs de contamina-
tion par les micro-organismes.
Selon la classe de la salle propre, la tenue à porter peut être différente : plus
les normes particulaires sont strictes, plus la tenue est protectrice. Dans certains
cas, si le germe manipulé est fortement pathogène, les habits ont aussi pour rôle de
protéger l’opérateur vis-à-vis du risque biologique inhérent au produit. Selon les BPF
[?] (tableau ??) :
« Les vêtements et leur qualité doivent être adaptés aux fabrications et

aux classes des zones de travail ».
Les vêtements utilisés sont de deux types :

– à usage unique en matière non tissée. Par définition, l’usage unique présente
deux avantages : la diminution des risques de contamination croisée et une
facilité de gestion des tenues car la tenue est utilisée puis jetée.
– réutilisable après stérilisation. Pour être réutilisées, ces tenues doivent être
stérilisées par autoclavage, rayonnement β ou γ.
123
A/B C D
Corps Veste + pantalon ou Veste + pantalon ou Vêtement protecteur normal
combinaison, serrées au combinaison, serrées au
poignet avec un col montant poignet avec un col montant
Tête Cagoule pour les cheveux, Cheveux, barbe et Cheveux, barbe et
masque pour le visage, barbe moustaches recouvertes moustaches recouvertes
et moustaches recouvertes

124
Mains gants en plastique ou - -

caoutchouc stérilisés et non
poudrés
Pieds Bottes stérilisées ou Chaussures et Chaussures et
désinfectées, enserrant le bas couvre-chaussures couvre-chaussures
de pantalon
Table 8.2 – Les tenues de travail selon la classification des zones [?]
Conclusion
Les vaccins constituent une classe thérapeutique qui possède plusieurs spécifici-
tés, tant au niveau des méthodes de production en vigueur, qu’au niveau de leur
formulation et de leur administration. Historiquement, les vaccins sont les premiers
représentants d’une catégorie de spécialités en forte croissance : biomédicaments. A
travers le temps, les vaccins n’ont cessé d’évoluer jusqu’à atteindre, de nos jours, des
formes faisant largement appel aux techniques de génie génétique. Malgré tout, cette
classe thérapeutique est totalement indissociable des technologies de culture cellu-
laire. Ces dernières décennies, la lignée cellulaire Vero a massivement été utilisée par
de nombreux laboratoires pour permettre la production de vaccins à des échelles im-
portantes. A des fins d’optimisation, il est donc particulièrement utile de connaître
les spécificités de culture, ainsi que d’avoir un aperçu juste du métabolisme de cette
lignée.
Pour répondre à ces problématiques de compréhension du métabolisme cellulaire,
une alternative de choix repose sur la mise en place de modèles mathématiques
schématisant le comportement des cellules en culture. Nous avons pu constater, à
travers notre étude, que la modélisation est une solution de choix, qui peut fournir
des résultats satisfaisants. En contrepartie, cet outil est aussi relativement complexe,
et impose d’être mis en place avec des personnes compétentes en la matière. Pour
l’instant, les outils de modélisation sont encore assez peu présents dans les industries
de santé, mais il est fort à parier qu’il deviendront certainement une habitude dans
les années à venir.
L’age d’or de l’industrie pharmaceutique est révolu et cette dernière doit mainte-
125
nant faire face à de nouveaux défis. Actuellement, le climat économique est beaucoup
moins faste ; les pertes de brevet et l’arrivée des génériques créent un environnement
fortement concurrentiel pour lequel productivité et économies sont de rigueur. Pa-
rallèlement, les autorités de santé exigent un degré de qualité de plus en plus élevé,
alors même que les procédés de production sont de plus en plus complexes. Ces deux
raisons justifient la démocratisation de l’approche PAT au sein des entreprises de
santé. Cette nouvelle démarche implique de mieux comprendre les différentes étapes
de la fabrication de manière à pouvoir en maîtriser et en certifier le bon déroulement.
L’emploi du PAT est particulièrement approprié dans le domaine des biotechnologies
qui mettent en jeu des phénomènes relativement complexes ; en effet, les procédés
biotechnologiques sont soumis aux aléas liés à l’utilisation de matériel biologique. En
terme de résultat, l’objectif du PAT est in fine de réduire la variabilité intrinsèque
aux process, ce qui permet de gagner aussi bien en terme de productivité que de
qualité.
Parallèlement à l’application sur le terrain de bonnes pratiques de fabrication
permettant la maîtrise des biocontaminations, il est alors possible des standardss de
qualité particulièrement élevés. Cependant, bien que cette approche soit indiscuta-
blement positive, en terme de productivité et de qualité, elle suscite encore plusieurs
inquiétudes et l’avenir reste flou quant à la rapidité de sa mise en place.
126
Bibliographie
[1] 2000 AFNOR. Norme NF EN ISO 14937 ; Stérilisation des produits de santé.
[2] 2003 AFNOR. Norme ISO 14644 ; Salles propres et environnement maîtrisés
apparentés, Partie 6 : Vocabulaire.
[3] AFSSAPS. Bonnes pratiques de production et de fabrication pharmaceutique,

Chapitre 2 : le personnel. 2007.
[4] AFSSAPS. Fabrication des médicaments stériles. Ligne directrice particulière

1, 1 edition, 2007. 48-59.
[5] AFSSAPS. Fabrication des médicaments stériles. Ligne directrice particulière

1, 1 edition, 2007. 108-110.
[6] P.N. Barrett, W. Mundt, O. Kistner, and M.K. Howard. Vero cell platform in
vaccine production : moving towards cell culture-based viral vaccines. Vaccines,
8(5) :607–618, 2009.
[7] E.J. Bauer. Pharmaceutical packaging handbook. Informa Healthcare, Pitts-

burgh, 1st edition, 2006.
[8] LEEM Comité Biotech. Bioproduction 2008, État des lieux et recommandations
pour l’attractivité de la France. Rapport de synthèse - LEEM, 2008.
[9] G. Birol, P. Doruker, B. Kirdar, Z.I. Ansan, and K. Algen. Mathematical descrip-
tion of ethanol fermentation by immobilised Saccharomyces cerevisiae. Process
Biochemistry, 33(7) :763–771, 1998.
[10] P. Bogaerts. Contribution à la modélisation mathématique pour la simulation et

l’observation d’états des bioprocédés. PhD thesis, Université libre de Bruxelles -
Faculté des sciences appliquées, 1999.
127
BIBLIOGRAPHIE BIBLIOGRAPHIE
[11] S. Carmaux. Caractérisation de la mort des cellules animales cultivées en bio-

réacteur. Master’s thesis, Faculté de pharmacie de Nancy, 2008.
[12] S. Chevret. Modèles mathématiques utilisés en médecine. Réanimation,

16(3) :240–244, 2007.
[13] C. Danan and A. Rachon. Qualification des performances des filtres stérilisants.
Techniques de l’ingénieur, Réf. P3 354, 2006.
[14] C. Danan and C. Vadrot. Contrôle et validation des procédés de stérilisation

des dispositifs médicaux par des méthodes microbiologiques. Techniques de
l’ingénieur, Réf. P3 354, 2006.
[15] Roche Diagnostics. Apoptosis and Cell Proliferation. http://www.

roche-applied-science.com/sis/apoptosis/docs/21552_Apoptosis.
pdf-Consultationfévrier2010.
[16] H. Dorai, S.K. Yun, D. Ellis, C. Kinney, C. Lin, D. Jan, G. Moore, and M.J. Be-
tenbaugh. Expression of anti-apoptosis genes alters lactate metabolism of Chi-
nese Hamster ovary cells in culture. Biotechnology and Bioengineering, 103(3),
2009.
[17] D. Duval, C. Demangel, I. Geahel, K. Blondeau, and A. Marcadet. Compari-

son of various methods for monitoring hybridoma cell proliferation. Journal of
Immunological Methods, 134(2) :177–185, 1990.
[18] J.M. Eakman, A.G. Fredrickson, and H.M. Tsuchiya. Statistics and Dynamics of
Microbial Cell Populations. Chemical Engineering Progress Symposium Series,
69 :37–49, 1966.
[19] R.W. Ellis. New technologies for making vaccines. Vaccine, 17(13-14) :1596–
1604, 1999.
[20] Food and Current good manufacturing practice drug administration. Guidance
for industry, Sterile drug products produced by aseptic processing. 2004.
[21] Food and Current good manufacturing practice drug administration. Manufac-
turing, processing, packaging or holding drugs, 21 CFR, Part 211. 2003.
128
[22] Food and Guidance for Industry drug administration. PAT - A Framework
for Innovative Pharmaceutical Development, Manufacturing, and Quality Assu-
rance. http://www.fda.gov/cvm/guidance/published.html.2004.
[23] P. Gaulé and M. Kaddar. Le marché mondial des vaccins : évolution et dyna-
misme. ReMed ; Réseau médicament & développement, 29 :1–4, 2004.
[24] N. Guerin. Histoire de la vaccination : de l’empirisme aux vaccins recombinants.

La Revue de médecine interne, 28(1) :3–8, 2007.
[25] J.C. Guichard. Les salles propres (salles blanches), du Fédéral Standard aux
normes ISO. http://www.aspec.fr;Consultationmars2010.
[26] Gleave S. Butler M. Hassell, T. Growth inhibition in animal cell culture -

The effect of lactate and ammonia. Applied Biochemistry and Biotechnology,
30(1) :29–41, 1991.
[27] H. Huang, Y. Yu, X. Yi, and Y. Zhang. Nitrogen metabolism of asparagine

and glutamate in VERO cells studied by 1H/15N NMR spectroscopy. Applied
Microbiology and Biotechnology, 77(2) :427–436, 1996.
[28] M. Kaddar. Marché mondial du vaccin et besoins des PED. Extrait de conférence
- OMS, 2006.
[29] J.F. Kerr, A.H. Wyllie, and Currie A.R. Apoptosis : a basic biological phe-
nomenom with wide-ranging implications in tissue kinetics. British Journal of
Cancer, 26(4) :239–257, 1972.
[30] C. Kontoravdi, D. Wong, C. Lam, Y.L. Yih, M.G.S. Yap, E.N. Pistikopoulos, and
A. Mantalaris. Modeling amino acid metabolism in mammalian cells - Toward
the development of a model library. Biotechnology Progress, 23(6) :1261–1269,
2007.
[31] P. Kourilsky. Extrait de conférence - La vaccination : problèmes de science,

question de société. Collège de France - Chaire d’immunologie moléculaire,
2003-2004.
[32] M. Lecina, A. Soley, J. Gracia, E. Espunya, B. Lazaro, J.J. Cairo, and F. Go-
dia. Application of on-line OUR measurements to detect actions points to im-
129
prove baculovirus-insect cell cultures in bioreactors. Journal of Biotechnology,

125(3) :385–394, 2006.
[33] F. Llaneras and J. Pico. Stoichiometric modelling of cell metabolism. Journal

of biosciences and bioengineering, 105(1) :1–11, 2008.
[34] J. Lobry. Réévaluation du modèle de croissance de Monod. Effet des antibiotiques

sur l’énergie de maintenance. PhD thesis, Université Claude Bernard - Lyon I,
1991.
[35] L. Luanfeng, S. Ming, and S. Yigao. A single-use, scalable perfusion bioreactor

system. BioProcess International, 7(5S) :18–23, 2009.
[36] R.D. Mcgee, J.F. Drake, A.G. Fredrickson, and H.M. Tsuchiya. Studies in in-
termicrobial symbiosis. Saccharomyces cerevisiae and Lactobacillus casei . Ca-
nadian Journal of Microbiology, 18(11) :1733–1742, 1972.
[37] S. Mendivil and A. Burns. Quality by Design : Current Regulatory Status and
Future Challenges. BioProcess International, 7(S) :84–87, 2009.
[38] O.W. Merten. Editorial : Safety for vaccine(e)s. Cytotechnology, 34(3) :181–183,
2006.
[39] O.W. Merten. Introduction to animal cell culture technology - Past, present
and futur. Cytotechnology, 3(1-3) :181–183, 2006.
[40] O.W. Merten, R. Wu, E. Couvel, and R. Crainic. Evaluation of the serum-free
medium MDSS2 for the production of poliovirus on Vero cells in bioreactors.
Cytotechnology, 25(1-3) :35–44, 1997.
[41] J. Montagnon, A. Nicolas, B. Fanget, and L. Peyron. Comparison of sensitivity

of VERO cell line versus primary monkey kidney cells in the detection of resi-
dual live polio virus during and after inactivation. Developments in biological
standardization, 47 :151–156, 1981.
[42] J. Neermann and R. Wagner. Comparative analysis of glucose and glutamine

metabolism in transformed mammalian cell lines, insect and primary liver cells.
Journal of Cellular Physiology, 166(1) :152–169, 1996.
130
[43] New Brunswick Scientific. Catalogue New Brunswick Scientific. http://www.

nbsc.com/bioflopro_cc.aspx-Consultationmars2010.
[44] Institut Pasteur. Les vaccins du futur. http://www.pasteur.fr/actu/presse/

com/dossiers/vaccins/vacfuturs.html;Consultationjanvier2010.
[45] M. Pedot. Maîtrise des biocontaminations au cours d’une production aseptique.

Cas d’application : production de principe actif viral produit par la technique
dite en "Monolayer". Master’s thesis, Faculté de pharmacie de Nancy, 2008.
[46] E. Petiot. Procédés de cultures de cellules Vero en milieu sans sérum : contribu-
tion au développement d’une stratégie PAT. PhD thesis, Institut polytechnique
de Lorraine, Nancy, France, 2009.
[47] 5ème édition Pharmacopée européenne. Chapitre 2.6.1 : Stérilité, Référence 01-
2005-20601. http://online.pheur.org/entry.htm;Consultationmars2010.
[48] S.L. Plotkin and S.A. Plotkin. A short history of vaccination. In Vaccines, 4th
edition.
[49] M.N. Pons, S.L. Bontao, and O. Potier. Spectral analysis and fingerprinting for
biomedia characterisation. Journal of Biotechnology, 113(1-3) :211–230, 2004.
[50] S. Quesney, A. Marc, C. Gerdil, C. Gimenez, J. Marvel, Y. Richard, and B. Mei-

gnier. Kinetics and metabolic specificities of Vero cells in bioreactor cultures
with serum-free medium. Cytotechnology, 42(1) :1–11, 2003.
[51] M. Rey and R. Triau. Les vaccins. La Semaine des hôpitaux de Paris, 62(48-
49) :3823–3848, 1986.
[52] M. Rhiel, M.B. Cohen, D.W. Murhammer, and M.A. Arnold. Nondestruc-
tive near-infrared spectroscopic measurement of multiple analytes in undiluted
samples of serum-based cell culture media.
[53] J.E. Ricci. Les mécanismes moléculaires de l’apoptose. INSERM U526, Faculté
de médecine de Nice. http://www.123bio.net/revues/jericci/iapoptose.
html-Consultationfévrier2010, 2000.
131
[54] Ozturk S. and Wei-Shou H. Cell culture technology for pharmaceutical and
cell-based therapies. Biotechnology and bioprocessing, taylor & francis ltd, 1st
edition edition, 2004.
[55] M. Scarff, S.A. Arnold, L.M. Harvey, and B. McNeil. Near infrared spectroscopy
for bioprocess monitoring and control : Current status and future trends. Critical
Reviews in Biotechnology, 26(1) :17–39, 2006.
[56] Wikipedia Johann Dréo schéma libre de droit. Les algorithmes

évolutionnistes. http://fr.wikipedia.org/wiki/Algorithme_
evolutionniste;Consultationmars2010.
[57] M. Schneider, I.W. Marison, and U. Von Stockar. The importance of ammonia
in mammalian cell culture. Journal of Biotechnology, 46(3) :161–185, 1996.
[58] B. Schwikowski, P. Uetz, and S. Fields. A network of protein-protein interactions

in yeast. Nature Biotechnology, 18(12) :1257–1261, 2000.
[59] Sartorius Stedim. Catalogue Sartorius Biotech. http://www.

sartorius-stedim.com/index.php?id=2016&L;Consultationmars2010.
[60] M. Thilakavathi, T. Basak, and T. Panda. Modeling of enzyme production

kinetics. Applied Microbiology and Biotechnology, 73(5) :991 1007, 2007.
[61] N. Trijau. Production de vaccins et d’anticorps par les plantes. Master’s thesis,
Faculté de pharmacie de Nancy, 2008.
[62] D. Wang, W. Liu, B. Han, and R. Xu. The bioreactor : a powerful tool for large-
scale culture of animal cells. Current Pharmaceutical Biotechnology, 6(5) :397–
403, 2005.
[63] J.N. Warnock and M. Al-Rubeai. Bioreactor systems for the production of
biopharmaceuticals from animal cells. Biotechnology and Applied Biochemistry,
45(1) :1–12, 2006.
[64] W. Whitford and J. Cadwell. Interest in hollow-fiber perfusion bioreactors is

growing. BioProcess International, 7(5) :54–64, 2009.
132
[65] Dong Z., Saikumar P., Weinberg J. M., and Venkatachalam M.A. Internucleoso-
mal DNA cleavage triggered by plasma membrane damage during necrotic cell
death. American journal of pathology, 151(5) :1205–1213, 1997.
[66] A.-P. Zeng, W.-S. Hu, and W.-D. Deckwer. Variation of stoichiometric ratios and
their correlation for monitoring and control of animal cell cultures. Biotechnology
Progress, 14(3) :434–441, 1 998.
133
Annexe A
Rédiger un document sous LATEX
A la lecture de cette thèse, peut être aurez-vous remarqué qu’elle se distingue

des autres thèses d’exercices en pharmacie par son allure et par son style typogra-
phique. Ce constat s’explique par le fait que l’intégralité de cette thèse a été réalisé
sous LATEX.
Qu’est ce que LATEX ?

LATEX est un logiciel de traitement de texte que j’ai découvert à l’ENSIC et qui
est une bonne alternative aux autres logiciels de traitement de texte plus connus tels
que Word r 1 .
LATEX permet un rendu visuel proche de celui des ouvrages d’imprimerie et s’oc-
cupe automatiquement de la mise en forme des documents : table des matières,
légendes, liste des tableaux, références, gestion de la bibliographie, ... etc. LATEX
constitue donc un outil particulièrement propice à la rédaction de documents scienti-
fiques tels que les thèses, puisqu’il est parfaitement adapté à la taille des documents,
à l’insertion de graphiques et de tableaux, ainsi qu’à la gestion de la bibliographie.
En contrepartie, ce confort et cette qualité de présentation ont un coût ; en effet,
LATEX est beaucoup plus compliqué à prendre en main pour un néophyte et demande
un certain investissement à l’origine. Cela demande un peu d’effort et de temps pour
1. A l’inverse de LATEX, Wordr est un logiciel de traitement de texte, dit WYSIWYG : What
You See Is What You Get
134
A. Rédiger un document sous LATEX
assimiler les fonctions de base mais cela fait économiser par la suite énormément
d’énergie.
LATEX fonctionne en deux étapes :
– l’écriture du texte sous forme d’instructions de codage ;
– l’interpolation et la création du document final, après compilation.
Pour exemple, voici un morceau choisi de ce chapitre :
\chapter{Rédiger un document sous \LaTeX{}} \label{annexe:latex}
A la lecture de cette thèse, peut être aurez vous remarqué qu’elle

se distingue des autres thèses d’exercices en pharmacie par son
allure et par son style typographique. La raison à cette constatation
est que l’intégralité de cette thèse a été réalisé sous \LaTeX{}.
\index{Latex@\LaTeX{}}
\noindent \textbf{Qu’est ce que \LaTeX{} ?}
\LaTeX{} est un logiciel de traitement de texte que j’ai découvert à

l’ENSIC, qui est une bonne alternative aux autres logiciels de
traitement de texte plus connus tels que \emph{Word}$^{\circledR}$.
Les solutions que j’ai utilisées
Si vous êtes parvenus jusqu’ici c’est que LATEX vous intéresse au moins un peu
et que vous allez peut-être l’essayer. Dans ce cas vous remarquerez que LATEX ne
fonctionne pas comme un logiciel traditionnel et qu’il fonctionne grâce à deux entités
distinctes : le coeur de LATEX, qui travaille en coulisses, et l’éditeur de texte.
Pour ma part, j’ai utilisé les éléments suivants qui sont extrêmement populaires :
– Le coeur de LATEX : utilisation de MikTEX, disponible sur http://miktex.
org/ ;
– L’éditeur de texte : utilisation de TEXmaker.
135
Annexe B
Les algorithmes évolutionnistes
Définition principe de fonctionnement

La classe des algorithmes évolutionnistes regroupe toutes les métaheuristiques
basées sur des populations et qui utilisent des mécanismes inspirés de l’évolution
biologique et des théories néo-darwiniennes. Cette méthodologie d’optimisation em-
prunte d’ailleurs tout son vocabulaire à la biologie.
L’idée des algorithmes évolutionnistes est de s’inspirer du modèle de la théorie
de l’évolution proposée par Darwin pour faire évoluer une population initiale d’in-
dividus sur plusieurs générations de manière à sélectionner les meilleurs individus.
Bien entendu les mots de « population » et « d’individus » recouvrent ici un sens
mathématique tout à fait singulier :
– un individu correspond en réalité à un vecteur de coefficients ;
– une population est quant à elle un ensemble d’individus.
La notion de « meilleur » individu est associée à celle de performance des indivi-
dus. D’un point de vue mathématique, cette performance est exprimée à partir du
critère que l’on cherche à optimiser (eq. ??).
 !
X X (Xtheo − Xexp )2 
M inX J (X) =  (B.1)
especes
Xexp
nbpts
Principe de fonctionnement
1. La première étape consiste à générer aléatoirement un nombre d’individus,
136
B. Les algorithmes évolutionnistes
Figure B.1 – Schéma récapitulatif du fonctionnement d’un algorithme évolutionniste

[?]
notés i sur le schéma.
2. On applique ensuite le modèle sur chacun de ces individus. Chaque individu

décrit un vecteur de paramètres du modèle qui permet de prédire des pro-
fils de concentrations. On évalue ensuite leur performance ; dans notre cas, la
performance correspond à l’écart quadratique entre valeurs théoriques et expé-
rimentales.
3. S’en suit l’étape de sélection (Se) pour laquelle on conserve les individus les
plus performants et on rejette les individus les moins efficaces.
4. Ces individus performants seront croisés entre eux (Cr ). D’un point de vue
mathématique, cela signifie que l’on mélange entre eux les coefficients d’indi-
vidus différents. On exploite les caractéristiques des meilleurs individus pour
créer de nouveaux individus encore plus performants.
5. Parallèlement, les individus subissent aléatoirement des mutations (Mu). La

force de ces algorithmes est qu’à chaque génération on réintroduit une part de
hasard dans les populations.
137
B. Les algorithmes évolutionnistes
6. La performance des individus est à nouveau réévaluée par f(x).
7. un certain nombre d’individus sont remplacés, et si le critère d’arrêt n’est pas

satisfait, le cycle recommence en position 3.
A l’issue de plusieurs générations, ce processus itératif permettra à l’algorithme de

faire converger la population vers un ensemble d’individus proches de l’optimum.
Parmi les différentes options que l’on peut modifier pour faire varier l’optimisa-
tion, on trouve :
– les bornes du domaine de recherche : qui définissent l’intervalle dans lequel
pourront se trouver les valeurs aléatoirement générées ;
– le nombre d’individus : qui correspond au nombre de points dans la population
par génération. Plus ce nombre est élevé, plus les chances de générer un individu
performant sont importantes mais plus la convergence est longue à obtenir (car
l’algorithme traite plus d’informations) ;
– les caractéristiques d’élimination : qui définissent comment on choisit d’éliminer
certains individus ;
– le critère d’arrêt stoppant l’algorithme : ici, il correspond à la différence entre
le critère de performance du meilleur individu et celui du dernier individu de
la population ;
– le type de codage d’un individu (haploïde ou diploïde) : dans l’algorithme
utilisé, on définit un pourcentage d’individus homozygotes et hétérozygotes
(les homozygotes s’apparentent à un codage haploïde) ;
– la nature des mutations et leur fréquence d’occurrence : qui correspond au
nombre d’individus ou de gènes nouvellement créés au sein de la population.
L’optimum final et la durée de convergence du programme dépendront des valeurs
rentrées pour ces différents critères et de la cohérence des bornes choisies.
138
Annexe C
Le niveau d’assurance de stérilité
Un niveau d’assurance de stérilité (NAS) défini est toléré puisqu’il est impossible
de garantir une absence totale de micro-organismes viables pour tous les articles
d’un même lot. Ce niveau d’assurance correspond à une contamination maximale
tolérée même si, dans l’absolu, nous recherchons un taux de contamination nul au
sein de l’ensemble du lot. Il convient de réaliser un plan d’échantillonnage et de faire
intervenir des notions de probabilité.
L’inactivation des micro-organismes par des procédés de stérilisation suit une

loi exponentielle. Pour un procédé de stérilisation donné, le NAS est fixé selon la
probabilité de survie d’un micro-organisme après stérilisation. Ce NAS est fonction
du nombre, du type et de la résistance des micro-organismes présents dans le produit.
Quelle que soit la méthode de stérilisation choisie, le NAS recherché est de 10−6 selon
différents textes règlementaires dont la Pharmacopée européenne [?]. Ainsi, un NAS
de 10−6 correspond à une probabilité d’au plus un micro-organisme viable pour 1.106
unités stériles du produit final.
139
Annexe D
Liste des abréviations et

nomenclature
140
D. Liste des abréviations et nomenclature
αKG : Alpha Cétoglutarate

ADN : Acide Désoxyribonucléique
AFSSAPS : Agence Française de Sécurité Sanitaire des Produits de Santé
ARN : Acide Ribonucléique
ATP : Adénosine Tri-Phosphate
BCG : Bacille de Calmette et Guérin
BHK : Baby-Hamster Kidney (cell)
BPF : Bonnes Pratiques de Fabrication
CHO : Chinese Hamster Ovary (cell)
CLHP : Chromatographie Liquide Haute Performance
CNRS : Centre National de la Recherche Scientifique
CPP : Critical Process Parameters
CO2 : Dioxyde de carbone
CSTBR : Continuous Stirred-Tank Bioreactor
DMSO : Diméthylsulfoxide
DOE : Design Of Experiment
EMEA : European Medicines Agency
EPPI (ou Eau : Eau Pour Préparation Injectable
PPI)
ENSAIA : Ecole Nationale Supérieure d’Agronomie et des Industries Ali-
mentaires
ENSIC : École Nationale Supérieure des Industries Chimiques
FDA : Food and Drug Administration
(c)GMP : (current) Good Manufacturing Practices
GPBA : Génie des Procédés Biotechnologiques et Alimentaires
βHCG : Hormone Chorionique Gonadotrope
HEPA : High Efficiency Particulate Air (filter)
Table D.1 – Liste des abréviations
141
HFL : Hotte à Flux Laminaire

HPV : Human Papillomavirus
HSV : Herpes Simplex Virus
HVAC : Heating, Ventilating, Air, Conditionning
ICH : International Conference on Harmonisation (of Technical Requi-
rements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use)
INPL : Institut National polytechnique de Lorraine
IR : Infrarouge
ISO : International Organization for Standardization
LSGC : Laboratoire des Sciences du Génie Chimique
PAT : Process Analytical Technology
MDCK : Madin-Darby Canine Kidney (cell)
N2 : Diazote
NaCl : Chlorure de Sodium
+
NAD /NADH : Nicotinamide Déshydrogénase
NAS : Niveau d’Assurance de Stérilité
NH3 /NH+ 4 : Ammoniac / Ammonium
NIR : Near Infrared (proche infrarouge)
O2 : Dioxygène
OMS : Organisation Mondiale de la Santé
PCA : Analyse en Composante Principale
pH : Potentiel Hydrogène
PSM : Poste de Sécurité Microbiologique
QbD : Quality by Design
R&D : Recherche et Développement
RMN : Résonance Magnétique Nucléaire
RPM : Rotation par minute
SARS : Severe Acute Respiratory Syndrome
SIDA : Syndrome d’Immunodéficience Acquise
SVF : Sérum de Veau Fœtal
TCA : Tricarboxylic Acid (cycle des)
UFC : Unités Formant Colonies
VIH : Virus de l’Immunodéficience Humaine
WHO : World Health Organisation
ZAC : Zone à Atmosphère Contrôlée
Table D.2 – Liste des abréviations (suite)
142
XV : Concentration en cellules viables, 105 cellules.mL−1

XM : Concentrations en cellules mortes, 105 cellules.mL−1
dt : Intervalle de temps, h
rX : Vitesse de croissance cellulaire, 105 cellules.mL−1 .h−1
rM : Vitesse de décès cellulaire, 105 cellules.mL−1 .h−1
µapp : Vitesse spécifique de croissance apparente, en h−1
kM : Vitesse spécifique de décès, en h−1
µreel : Vitesse spécifique de croissance, en h−1
[S] : Concentration en substrat, g.L−1
[S]0 : Concentration initiale en substrat, g.L−1
[P ] : Concentration en produit, g.L−1
[P ]0 : Concentration initiale en produit, g.L−1
YX/S : Constantes de rendement Cellule/Substrat
YP/S : Constantes de rendement Produit/Substrat
KS : Concentration à demi-saturation, mol.L−1
KI : constante d’inhibition, mol.L−1
Table D.3 – Nomenclature
143
Index
Adjuvants, 16 Milieu sans sérum, 27

Algorithmes évolutionnistes, 71 Modèle mathématique, 62
Algorithmes évolutionnistes, 135 Modèles
Anatoxines, 14 boîte noire, 65
Andrews, 88 comportementaux, 65
Andrews, Expression de, 58 cybernétiques, 70
fonctionnels, 65
Batch, 31
phénoménologiques, 65
Cinétique de culture, 30 Modes d’administration, 19
Conservateurs, 18 Monod, Expression de, 57
Croissance, 52
Ovoculture, 7, 20
Culture
en bioréacteurs, 20 Louis Pasteur, 6
en Monolayer, 20 Principe actif, 13
Décès cellulaire, 52 Rendement, 80

Rendements, 54
Fredrickson, Classification de, 67
Taux de croissance, 77
Edward Jenner, 5
Vaccins
KS , 78
à ARN nu, 16
LATEX, 133 entiers inactivés, 14
Lignée cellulaire, 22 recombinants, 14
Lissage, 74 sous-unités, 15
vivants atténués, 13
Microporteurs, 24, 26
Variolisation, 5
144
INDEX INDEX
Vitesse spécifique de croissance, 53
145
FACULTE DE PHARMACIE UNIVERSITE HENRI POINCARE • NANCY 1
DEMANDE D'IMPRIMATUR
Date de so utenance : 4 ma i 2010
DIPWME D' ETAT DE DOCTEUR

EN PHARMACIE
présenté par Arnaud DUIGOU Vu.
Sujet : Maîtrise des procédés de culture cellulaire pour la

Nancy, le l-'1 /\"., ( 'z.. 1- o
production de vaccins.
Le Président du Jury Le Direct eur de Thèse
iJ!a :
Président : Mme. Chantal FrNANCE, Pro fesseur à la Faculté Mm" C hanta l ~A NC E Mm" Annte MARC
lJ ~~
de Pharmacie
Directeur : Mme. Ann ie MAR C. Directeur de Recherch e
CNRS
Juges : M . Frantz FOURNIER.. Maitre de Conférences à

l'ENSAIA
J/7 1
-/ ~ L ~
Vu et approuvé, Vu.
Nancy, le Ob A/Il ZOlO Nancy.le .A ~ O ~ , )", 0
Doyende la Faculté de Pharmacie Le Président de J'Université Henri Poincaré - Nancy 1.

de l' Université Henri Poincaré - Nancy l , r <'o llT le Pré ~ir1~n t
et par Délég:ttil1n.
La wce-Prëstdenre de Conseil
d;rrj~~l~~i'e,
Fran cin e PA. UL US J~ ~N
<..-
Ns d'enregistreœeœ : :'>l~
N° d’identification :
TITRE
Maîtrise des procédés de culture cellulaire pour la production de vaccins
Thèse soutenue le 4 mai 2010

par Arnaud Duigou
RÉSUMÉ
Les bioprocédés ont connu un essor considérable dans les industries pharmaceu-
tiques au cours de ces dernières décennies ; les biotechnologies y ont réussi leur pari en
passant, en l’espace de quelques années, de la théorie à la réalité. À constater l’évo-
lution forte du marché des biomédicaments, les biotechnologies et l’industrie phar-
maceutique sont de plus en plus intimement liées. Ce constat est particulièrement
vrai en ce qui concerne le domaine des vaccins, puisque la production de vaccins est
indissociable des techniques de culture de cellules animales. Par conséquent, les prin-
cipes de culture cellulaire et le métabolisme des cellules animales sont des thématiques
particulièrement étudiées depuis plusieurs décennies.
Sous l’impulsion des autorités de santé et sous l’effet d’une concurrence exacer-
bée, les industries de santé se doivent de maîtriser de mieux en mieux leurs procédés
de production, à fortiori les procédés biotechnologiques. Cette maîtrise passe par une
meilleure compréhension des procédés et de leur fonctionnement, ainsi que par l’uti-
lisation de nouveaux outils tels que les modèles mathématiques. Dans ces conditions,
les modèles mathématiques permettent de jeter un pont entre l’entité microscopique
qu’est la cellule, et l’aspect macroscopique et le fonctionnement du procédé.
Les problématiques de modélisation s’intègrent parfaitement dans une nouvelle ap-

proche définie par les autorités de santé : le PAT, pour Process Analytical Technology.
Le déploiement de cette méthodologie PAT permet de rationaliser et d’optimiser la
maîtrise du procédé. Outre l’optimisation du procédé, en lui-même, il est tout au-
tant indispensable de veiller à l’environnement du procédé pour assurer la qualité du
produit fini. Un second point déterminant dans la pratique industrielle sera donc de
connaître les concepts fondamentaux pour se prémunir des biocontaminations.
MOTS CLÉS
Culture cellulaire ; (Cellules) Vero ; Production de vaccins ; PAT ; Biocontaminations
Directeur de thèse Intitulé du laboratoire Nature
Laboratoire des Sciences Expérimentale

Docteur Annie MARC du Génie Chimique UPR
Bibliographique ⊠
CNRS 6811
Thème : 3, 5, 6
Thèmes 1 - Sciences fondamentales 2 - Hygiène/Environnement

3 - Médicament 4 - Alimentation - Nutrition
5 - Biologie 6 - Pratique professionnelle

Scdpha T 2010 Duigou Arnaud

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Maîtrise des procédés de culture cellulaire pour la

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HAL is a multi-disciplinary open access L’archive ouverte pluridisciplinaire HAL, est

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Il est soumis à la propriété intellectuelle de l'auteur. Ceci

D'autre part, toute contrefaçon, plagiat, reproduction illicite

Code de la Propriété Intellectuelle. articles L 122. 4

Maîtrise des procédés de culture cellulaire

présentée et soutenue publiquement le 4 mai 2010

Responsable de la filière Officine

Responsables de la filière Industrie

Doyens Honoraires Professeurs Émérites

Roger BONALY Gérald CATAU

Gilles AULAGNER . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .Pharmacie clinique

Sandrine BANAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Parasitologie

Anne MAHEUT-BOSSER . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Sémiologie

Christophe COCHAUD . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Anglais

Bibliothèque Universitaire Santé-Lionnois (Pharmacie-Odontologie)

Anne-Pascale PARRET . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Directeur

Je jure, en présence des maîtres de la Faculté, des conseillers

D’honorer ceux qui m’ont instruit dans les préceptes de

D’exercer, dans l’intérêt de la santé publique, ma profes-

De ne jamais oublier ma responsabilité et mes devoirs en-

Que les hommes m’accordent leur estime si je suis fidèle à

À mon président de thèse, Madame Chantal Finance, Professeur à la

À mon directeur de thèse, Madame Annie Marc, Directeur de Recherche

À mon juge, Monsieur Frantz Fournier, Maître de conférences à

Merci également à Mademoiselle Emma Petiot, Docteur INPL du

À ma famille plus largement,

À tous mes amis,

J’ai eu l’occasion de travailler avec les équipes du LSGC-GPBA, dans le cadre de

J’ai donc essayé, au sein de ce document, de réunir différents concepts naviguant

Revue générale de la littérature

La classe thérapeutique des

Du fait de leur empreinte biologique et de leur caractère préventif, les vaccins

La vaccination est un procédé conférant une immunisation active au patient, c’est

1.2 Un bref historique de la vaccination

1.2.1 L’antiquité et la variolisation

1.2.2 Fondement du principe de la vaccination par Jenner

attribuer à Jenner la découverte du principe de la vaccination par germes atténués

1.2.3 Louis Pasteur et le principe de l’atténuation

1.2.4 L’ère moderne

En décembre 1908, Albert Calmette et Camille Guérin décrivaient à l’Académie

À partir de 1933, la mise au point de techniques de culture de virus sur oeuf de

des bactéries de nature polysaccharidique, à savoir : vaccins contre les méningites

Comme nous avons pu le voir, l’histoire de la vaccination est particulièrement

1.3 Économie et avenir de la vaccination

Figure 1.1 – Un marché en croissance rapide [?]

Plusieurs raisons justifient cette évolution marquante :

le Prevenarr 3 commercialisé par Wyeth qui capitalise plus de 3 milliards de

Les caractéristiques du marché des vaccins

– le nombre d’acheteurs internationaux est limité : le vaccin est un produit dont

Perspectives futures du marché des vaccins

La recherche sur les vaccins ne cesse de continuer. Le développement du génie

Outre le développement de nouveaux traitements, l’accès à la vaccination est aussi

1.4 Aspects galéniques des vaccins

La forme galénique des vaccins correspond à la rencontre de plusieurs éléments

– des excipients (adjuvants, stabilisants, . . .) ;

1.4.1 Le principe actif

Il existe un très grand nombre de principes actifs immunogènes différents allant

1.4.1.1 Les différents types de principes actifs et les différents vaccins

1.4.1.1.1 Les vaccins vivants atténués