1 Introduction : La coloration diffrentielle ou coloration de gram est ltape essentielle de lidentification bactrienne, surtout dans le domaine mdical , partir

r dune culture pure (culture pure contenant une seule espce), elle est aussi appelecoloration V.L.A.iolet,Lugol,Alcool,F uschine)La coloration de gram est un caractre Tinctorial cset dire laffinit de la cellule bactrienne se colorer. La coloration de Gram doit son nom au bactriologiste danois Hans Christian Gram qui a mis au point leprotocole en 1884. C'est une coloration qui permet de mettre en vidence les proprits de la paroi bactrienne ,et d'utiliser ces proprits pour les distinguer et les classifier. Son avantage est de donnerune information rapide sur les bactries prsentes dans un produit ou un milieu tant sur le type que sur laforme. But : La coloration de Gram est la mthode de coloration la plus utilise en bactriologie mdicale; elle permetde colorer lesbactrieset de les distinguer l'examen direct par leur aptitude fixer le violet de gentiane(Gram +) ou la fuschine (Gram -). L'intrt de cette coloration est de donner une information rapide etmdicalement importante. Principe : La coloration de Gram est fonde sur l'action successive d'un colorant d'aniline, le cristal violet, d'iodepuis d'un mlange d'alcoolet d'actone. Dans un premiertemps,le colorant pntre dans la paroi et lecytoplasme.Dans un second temps, l'iode ragit avec le colorant et le rend insoluble. La permabilitplus grande desbactries Gram ngatif l'alcool permet la dcoloration. Lesbactries Gram positif restent colores en violet ou mauve. Une contrecoloration (par exemple en rose) permet devisualiser nouveau, les corps cellulaires des bactries Gram ngatif. Mode opratoire :

Ractif :le violet phnique : violet de gentiane (Crystal de violet) + alcool absolu + eau phnique- liquide de Lugol : iode + iodure de potassium + eau distille- alcool

96 (agent de dcoloration)- solution de fuschine ou de safranine (colorant de contraste) : solution de fuschine sature a lalcool+eau distille

Matriels :Microscope optique, lame, bec de bunsen, pipette pasteur, anse de platine, huile de cdre, ainsi que lematriel habituel du laboratoire de Microbiologie.

Prparation du Frottis : En effectuant une fixation simple l'eau et la flamme selon les indications suivantes : sur une lame, dposer unegoutte d'eau strile. Ajouter l'ansede platine strilise une goutte de la colonie isole. taler et fixer la chaleur environ 40C pendant 10 15 minutes. Poser la lame sche sur le portoir reposant sur un bac de coloration.

Ralisation de la coloration :1Coloration primaire : Coloration par leviolet de gentianeou cristal violet. Laisser agir de 30 secondes 1 minute. Rincer l'eau dminralise. 2 -Mordanageaulugol(solution d'iodeiodo-iodure): taler le lugol et laisser agir 60 secondes ; Rincer l'eau dminralise. On peut raliser une deuxime fois l'opration identiquement pour plus de scurit. 3 - Dcoloration (rapide) l'alcool(+actone): verser goutte goutte l'alcool ou un mlange alcool- actone sur la lame incline obliquement, et surveiller la dcoloration (5 10 secondes). Le filet doit treclair la fin de la dcoloration. Rincer sous un filet d'eau dminralise. 4 - Contre-coloration lasafranineou lafuchsine.Laisser agir de 30 secondes 1 minute. Laver doucement l'eau dminralise. Scher la lame sur une platine chauffante 40C, 10 15 minutes.

3 Les tapes 1 et 2 colorent en violet le contenu de labactrie.Le violet de gentiane se fixe sur lescomposants cytoplasmiques de toutes les bactries. Le lugol permet de fixer cette coloration interne.L'tape 3 (alcool) sert dcolorer le cytoplasme des bactries qui seront dites Gram ngatives. Eneffet, celles-ci ont uneparoipauvre enpeptidoglycanes- donc plus fine - qui va laisser passer l'alcool (molcule lipophile) ou le mlange alcool-actone, et qui dcolorera le cytoplasme en liminant le violetde gentiane. Au contraire, pour les bactries dites Gram positif la paroi constitue une barrireimpermable l'alcool car elle est compose d'une couche de peptidoglycanes plus importante doncde ce fait ; plus paisse. Elles resteront alors violettes. L'tape 4 est une contrecoloration ayant pour butde donner aux bactriesGram ngativesprcdemment dcolores une teinte rose permettant de lesvisualiser au microscope. Les bactries Gram positif restes violettes seront videmment insensibles cette contre-coloration plus ple que le violet imprgnant leur cytoplasme. la coloration de Gram permetde diffrencier la paroi bactrienne et de scinder les bactries en deux grand groupes:- Gram+ qui ont une paroi de peptidoglycanes paisse (ex : Bacillus cereus ) - Gram- qui ont une paroi de peptidoglycanes fine, mais ont en plus unemembrane externelipidique(ex : Escherichia coli ). Ces diffrences de coloration et les diffrences de formes(bacilleoucocci)sont l'origine de la classification des bactries . LugolDcolorisation Contre-coloration par laSafranine ou la Fuschine