UFR DHEMATOLOGIE

LABORATOIRE D HEMATOLOGIE

Polycopi des travaux pratiques

2 anne Pharmacie
me

FEVRIER 2010

Polycopi des Travaux Pratiques dHmatologie 2me anne Pharmacie

Recommandations aux tudiants

-Il est impratif de respecter la rpartition des groupes de TP

-Le port de la blouse blanche et des gants en latex est obligatoire
pendant les sances
-Chaque tudiant avant de quitter la salle doit nettoyer sa paillasse
ainsi que le matriel utilis en se reportant aux rgles de scurit
affiches au laboratoire.

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Objectifs Pdagogiques

1. CYTOHEMATOLOGIE :
-Effectuer un frottis sanguin
-Colorer un frottis sanguin
-Dcrire les cellules sanguines au microscope optique
-Savoir mesurer un hmatocrite
-Dterminer un taux de rticulocytes
-Connatre la mthode de dtermination dune vitesse de
sdimentation.
2. HEMOSTASE :
- Mesurer le temps de saignement par la mthode dIvy
- Raliser le temps de Quik, le convertir en taux de prothrombine
- Calculer lINR
- Raliser le temps de cphaline activ.
3. IMMUNOHEMATOLOGIE
- Effectuer le groupage sanguin ABO D selon les preuves globulaires
et srique
- Savoir interprter le rsultat du groupage sanguin.

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CYTOHEMATOLOGIE

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Confection et coloration dun frottis sanguin

Principe
Une goutte de sang, tale de faon uniforme sur une lame de verre, permet
dobtenir une seule couche de cellules.
Un tel frottis, aprs fixation et coloration, permet une tude morphologique des
lments sanguins, il peut rvler des anomalies.
Matriel
-Lames hmatologique propres, dgraisses et sches
-Lamelle pour taler (ou utiliser une lame bord rod)
Technique :
-Dposer une microgoutte de sang (capillaire ou veineux) 1cm de lextrmit
de la lame hmatologique
-Placer ltaleur au devant de la goutte
-Incliner ltaleur (30-45), le sang suit alors larte par capillarit, et aussitt
taler dun seul geste en levant la main
-Scher rapidement lair
Coloration
La coloration panoptique de May Grnwald Giemsa (MGG) repose sur laction
complmentaire de deux colorants neutres May Grnwald (osine et bleu de
mthylne) et Giemsa (osine et azurs de mthylne).
Le MG fixe le frottis par son mthanol, le MG dilu au 1/2 dans leau neutre
colore les lments acidophiles et les granulations diffrencies.
Le Giemsa surcolore les noyaux et colore les granulations azurophiles.
*Technique :
-Mettre les frottis dans un bac contenant du MG pur pendant 3min
-Puis dans un bac avec MG dilu au 1/2 dans de leau neutre pendant 2 min
-Dposer ensuite les frottis dans un bac contenant du Giemsa dilu au 1/10
dans de leau neutre pendant 20 min
-Rincer et laisser scher lair
*Rsultats :
-les noyaux sont rouge-violet ou rouge
-les cytoplasmes acidophiles sont roses (polynuclaires et hmaties)
-les cytoplasmes basophiles sont bleus (lymphocytes)
-les cytoplasmes polychromatophiles sont gris (monocytes)
-les granulations neutrophiles sont violet lilas
-les granulations osinophiles sont oranges
-Les granulations basophiles sont violet fonc
-les granulations azurophiles sont rouges

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Corps

Queue

Tte

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Analyse morphologique des lments figurs du sang

Cellules
Globule rouge
Polynuclaire
neutrophile
PNN
Polynuclaire
osinophile
PNE

Polynuclaire
basophile
PNB

Taille
7

10-15 -Plusieurs lobes runis par

des ponts trs fins
-Violet fonc
-Chromatine dense
10-15 -2 lobes symtriques,
rarement 3
-violet fonc
-chromatine moins paisse
que PNN
10-12 -rond ou ovalaire
-violet rouge
-chromatine peu marque

Petit lymphocyte 7-9

Grand
lymphocyte

Monocyte

noyau
--

9-15

-occupe presque toute la

cellule
-rond, parfois incurv violet noir
-chromatine trs dense
-arrondi ou ovalaire
-violet rouge
-chromatine dense

15-30 -irrgulier, encoch, central

ou priphrique
-rouge brun assez clair
-chromatine rticule

Cytoplasme
Beige orang avec
halo clair
-rose ou clair granulations
nombreuses,
fines, violet lilas
-lgrement bleu granulations
volumineuses,
nombreuses,
rouge orang
brillant
-lgrement rose granulations peu
nombreuses,
grosses,
recouvrant parfois
le noyau, violet
fonc
-trs rduit, mince
couronne bleue pas de
granulations
-clair, bleu ciel granulations peu
nombreuses,
volumineuses,
rouge pourpre
-trs clair, gris granulations trs
nombreuses, trs
fines, rouges

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Schmatiser des lments figurs du sang

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Mesure de lhmatocrite
Principe
Lhmatocrite reprsente le volume occup par les hmaties dans un volume
de sang total connu.
La dtermination se fait en sparant les hmaties du plasma par
centrifugation du sang dans des conditions standardises de dure et de
vitesse.
Matriel
-Prlvement sanguin : sang capillaire ou sang veineux prlev sur EDTA
-Tube hmatocrite : tube capillaire de 75 mm de long et de 1mm de
diamtre ouvert aux deux extrmits
-Centrifugeuse : prsente un plateau spcial et peut tourner 10 000
tours/min
Technique
-Plonger une extrmit du tube dans le sang veineux homognis (ou
dans goutte du sang capillaire)
-Laisser le sang monter par capillarit, arrter le remplissage environ 1cm
de lautre extrmit
-Essuyer lextrieur du tube avec un papier imprgn dthanol
-fermer lextrmit libre avec la pte sceller
-Placer le tube sur le plateau, lextrmit scelle vers la priphrie
-Centrifuger 3min 10 000 tours/min
-Lire sur un abaque permettant de ramener la hauteur totale du sang 100%

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Rsultats
-Homme : 40-54%
-Femme : 37-47%

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Numration des rticulocytes

Principe
Le rticulocyte reprsente la fin de maturation de la ligne rythrocytaire.
Elabor dans la moelle osseuse, il est libr dans le sang. Il se diffrencie dune
hmatie adulte par un diamtre lgrement plus grand et surtout par la
prsence dans son cytoplasme dun reste dARN.
Pour le distinguer parfaitement dune hmatie mature, on utilise une
coloration supra-vitale : le bleu de crsyl brillant. Ce colorant prcipite et
colore lARN rsiduel en un rseau de petites granulations ou filaments
constituant la substance granulo-filamenteuse.
Matriel
-Prlvement sanguin : sang veineux sur EDTA ou sang capillaire
-Tubes hmolyse
-Lames hmatologiques
Colorant
Bleu de crsyl brillant dans leau physiologique (NACL 9/1000) additionn
dun anticoagulant (citrate de sodium). Cette solution est filtre et conserve
4C.
Technique
-Dans un tube hmolyse, introduire quelques gouttes de solution colorante
-Ajouter le mme volume de sang
-Mlanger, boucher, laisser en contact 30 min temprature ambiante ou
15 min 37C
-Homogniser la suspension et raliser quelques frottis rguliers et minces
-Les hmaties sont colores en bleu verdtre et les rticulocytes plus
gros comportent une substance granulo-filamenteuse colore en bleu fonc,
violet.
-Compter lobjectif immersion 1000 hmaties sur diffrents champs et
noter le nombre de rticulocytes rencontrs.
Rsultats
Adulte : 0,5-2% soit 20-80 Giga/L

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Mesure de la vitesse de sdimentation

Principe
Quand un chantillon de sang recueilli sur anticoagulant est laiss au repos dans
un tube vertical, les hmaties sdimentent.
Elles se disposent en rouleaux trs denses qui progressivement se tassent,
laissant ainsi surnager une couche de plasma. La formation de ces rouleaux
dhmaties est due lexistence de force lectrostatiques neutralises par les
protines plasmatiques charges pour la plupart ngativement ; Les hmaties ne
se repoussent plus mais au contraire sagrgent en pile dassiettes qui
sdimentent plus facilement.
La vitesse de sdimentation (VS) dpend donc du courant descendant des
cellules et du courant ascendant du plasma. Elle se traduit par la mesure de la
hauteur du plasma (en mm) obtenue au bout dun certain temps (1 heure).
Matriel
-Prlvement sanguin : sang veineux sur citrate trisodique raison de 4 volumes
de sang veineux et 1 volume danticoagulant ;
-Pipette de Westergreen : longueur 300mm/2,5mm diamtre intrieur, gradue
en mm de 0 200 de haut en bas
-Support adapt aux pipettes pour les maintenir en position verticale
Technique
-Aspirer le mlange solution anticoagulante-sang, bien homognis, dans la
pipette de Westergreen, jusquau trait 0
-placer aussitt la pipette sur le support en position strictement verticale
Actuellement, il est commercialis des pipettes munies dun systme individuel
de remplissage
-Lire la hauteur du plasma surnageant (exprime en mm) au bout d 1 heure
Rsultat
-Homme : 3-10 mm
-Femme : 4-20 mm

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HEMOSTASE

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TEMPS DE SAIGNEMENT (TS)

Principe
Le temps de saignement mesure la dure de l'hmorragie provoque par une
brche dermopidermique. Il explore l'hmostase primaire.

Indication
Bilan dune hmorragie cutanomuqueuse

Techniques
Mthode dIVY INCISION
Matriel
- Appareil de mesure de la pression artrielle
- Dispositif jetable pour la ralisation de lincision
- Papier filtre pais
- Chronomtre
- Coton imbib d'ther, gants
Technique
Mettre en place le brassard et rgler la pression 4 cm d'Hg, qui doit tre
maintenue tout au long du test.
Dsinfecter la peau de l'avant-bras par l'ther.
Raliser une incision de 1 cm de long et 1 mm de profondeur (dispositif).
Dclencher le chronomtre, absorber le sang avec le papier filtre toutes les 30
secondes jusqu' l'arrt de l'hmorragie.
Rsultats
Le TS normal est de 4 8 mn, il est allong s'il est suprieur 10 mn

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Mthode dIVY 3 POINTS

Mme matriel et mme technique, mais au lieu d'appliquer une incision,
raliser par un vaccinostyle 3 points de piqres espacs d'un centimtre et
formant les sommets d'un triangle.
Rsultats :
Le TS normal est de 2 6 mn, il est allong s'il est suprieur 6 mn.

Variations pathologiques : TS allong

-

Thrombopnies ou thrombopathies
Maladie de Willebrand
Dficits constitutionnels ou acquis en fibrinogne
Prise de certains mdicaments (aspirine, ticlopidine, AINS,.)

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LE TEMPS DE QUICK (TQ)

1. Principe
Le temps de Quick est le temps de coagulation d'un plasma citrat, recalcifi en
prsence d'un excs de facteur tissulaire et de phospholipides.
Le temps de Quick consiste comparer en prsence de thromboplastine
calcique, les temps de coagulation d'un plasma pauvre en plaquettes par rapport
un plasma tmoin normal trait dans les mmes conditions.
Le TQ est un test d'orientation et de premire intention dans le bilan
d'hmostase.

2. Indications
-

Bilan propratoire,
Atteinte hpatique,
Bilan d'une hmorragie,
Surveillance de traitement AVK

3. Matriel et mthode
Prlvement sut tube citrat (9 parties sang, 1 partie citrate trisodique),
centrifug 10 minutes 2500g. Le plasma pauvre en plaquettes peut tre
conserv -30C.

4. Ractifs
-

Thromboplastine calcique lyophilise

Tampon type Koller
Pool de plasmas normaux
Contrle normal et pathologique

5. Mode opratoire
Prparation de la gamme d'talonnage:
La gamme d'talonnage est ralise l'aide de plasma talon titr 100% : le
diluer au 1/2, 1/4, 1/8 en tampon Owren Koller.
- Le plasma pur correspond un taux de prothrombine de 100%.
- La dilution au 1/2 correspond un taux de prothrombine de 50%.
- La dilution au 1/4 correspond un taux de prothrombine de 25%.
- La dilution au 1/8 correspond un taux de prothrombine de 12.5%.

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6. Technique
Dans un tube hmolyse 37C introduire successivement :
- Plasma . 0.1 ml (laisser incuber environ: 2minutes)
- En dclenchant un chronomtre, ajouter la thromboplastine .... 0.2 ml
- Mlanger et noter le temps de coagulation.
- A partir de cette droite d'talonnage, dduire les taux de prothrombine
des chantillons de patients tudier.
- Calculer l'International Normalized Ratio (INR) chez les patient sous
AVK.
INR = (TQ M / TQ T) ISI

7. Rsultats :
Valeurs normales TP= 70 100%
Patient sous traitement AVK : INR 2 3.5
8. Variations pathologiques :
- Dficits constitutionnels ou acquis en facteurs de la voie exogne et
commune (F I, II, V, X et VII)
- CIVD
- Anticoagulant circulant
- Traitement par AVK

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TEMPS DE CEPHALINE AVEC ACTIVATEUR

(TCA)
1. Principe
Le TCA consiste en la coagulation d'un plasma pauvre en plaquettes recalcifi
en prsence de phospholipides (PL) et d'un activateur (acide ellagique).
Comme le temps de quick, le TCA est un test d'orientation et de premire
intention dans le bilan d'hmostase.
-

2. Indications
Bilan propratoire
Bilan d'une hmorragie
Surveillance de l'hparinothrapie curative (HNF)
Anticoagulants circulants

3. Matriels et ractifs
Matriel et accessoires
BM thermostat 37C
Micropipettes 0,1
Chronomtre
Gants
Crochets
Compresses
Cristallisoirs contenant l'eau javellise
Tubes hmolyse en verre

Ractifs
-Cphaline lyophilise (cphaline
reconstitue par la solution de
l'activateur, puis incube en tube
hmolyse en plastique 37C) Activateur
-CaCI2
-Plasma tmoin
-Contrles normal et pathologique

4. Prlvement
- Fait partie de l'examen
- Ralis par ponction veineuse franche
- Sur citrate trisodique 0,109M (9 volumes de sang pour 1 volume
d'anticoagulant)
- Centrifugation sans dlai pendant 15 mn 2500 g

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5. Mode opratoire
Le TCA du malade doit tre compar celui dun plasma tmoin
Dans un tube hmolyse plac au BM 37C
Plasma tmoin, (contrle, malades)
0,1 ml
Cphaline + activateur
0.1 ml
MIanger et laisser incuber exactement 3 mn
En dclenchant un chronomtre, ajouter le CaCI2 pr incub 37C
Mlanger, surveiller l'apparition du caillot par le crochet ou par
retournements successifs du tube raction.
0,1 ml
Saisir le moment de la formation du caillot en arrtant le
chronomtre.
Vrifier que les rsultats pour les contrles se situent dans s
fourchettes fournies par le fabricant.

6. Expression des rsultats

- Le TCA patient est exprim en secondes, il est donn par rapport au TCA
tmoin
- Les valeurs normales se situent autour d'un rapport de 1
- Un allongement du temps de coagulation du patient dpassant de 6
secondes celui du tmoin dfinit un dsordre du test (ou rapport TCA
malade / TCA tmoin > 1,2)

7.Variations pathologiques
- Dficits constitutionnels ou acquis en facteurs de la voie endogne et
commune (F I, II, V, X, VIII, IX, XI, XII, Kininogne HPM et
Prkallikrine).
- CIVD
- Anticoagulants circulants
- Hparinothrapie curative (HNF=> TCA patient doit tre de 2 3 fois
celui
du
tmoin)

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IMMUNOHEMATOLOGIE

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GROUPAGE ABO, RH
1. Principe :
Le groupage standard ABO se fait par deux preuves :
- Epreuve globulaire : Epreuve de Beth Vincent consiste rechercher,
par technique d'agglutination, les antignes la surface des globules
rouges en utilisant des srums tests antiA, antiB et antiAB.
- Epreuve srique : Epreuve de Simonin consiste rechercher, par
technique dagglutination, les anticorps Anti A et Anti B dans le plasma
en utilisant des globules rouges tests A, B et O.
Le groupage standard RH consiste rechercher, par technique l'agglutination,
l'antigne D la surface des globules rouges en utilisant le srum test antiD.

2. Indications :
-

Donneur de sang
Receveur d'une transfusion
Bilan prnatal
Bilan d'une allo-immunisation ftomaternelle

3. Prlvement :
Obtenu par ponction veineuse sur tube contenant un anticoagulant.

4. Matriel, consommables, ractifs :

Matriel et consommables
Verres pied contenant de l'eau
physiologique
Cristallisoir contenant de l'eau
javellise
Pipettes Pasteur
Plaque dopaline
Tubes hmolyse en verre
Cartes gel

Ractifs
- Srums tests antiA,
antiAB
- GR tests A, B, O
- Srum test antiD

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antiB,

5. Technique
Techniques sur plaque dopaline, tube hmolyse, carte gel.
Technique sur plaque : sur une mme plaque, raliser le groupage standard
ABO et le groupage standard RH : preuves globulaire et srique (ABO) et
preuve globulaire (RH D).
Epreuve de Beth Vincent :
Sur la plaque, placer successivement une goutte de chaque srum test,
Ajouter l'aide d'une pipette Pasteur une goutte d'une suspension globulaire de
l'chantillon en eau physiologique ct des gouttes des srums tests,
Mlanger l'aide d'un agitateur qui sera chaque fois nettoy
Constater l'agglutination immdiate des globules rouges.
Epreuve de Simonin :
Sur la mme plaque, placer successivement une goutte de chaque globule rouge
test
Ajouter l'aide d'une pipette Pasteur une goutte du plasma de lchantillon
ct des gouttes des globules rouges tests,
Mlanger l'aide d'un agitateur qui sera chaque fois nettoy
Constater l'agglutination des globules rouges tests avec le srum.
Recherche de l'antigne D :
Sur la mme plaque, les globules rouges de lchantillon sont tests avec le
srum test antiD.

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6. Interprtation des rsultats :

Ltudiant doit respecter l'ordre des ractions antigne anticorps du tableau.

Epreuve globulaire :

Technique
Srum test

Srum test

Rsultat

Srum test

Srum test

AntiB
AntiA
AntiAB
AntiD
+ 1 goutte de suspension de GR grouper
+
+
+
+
-

+
+
+
+
-

+
+
+
+
+
+
-

+
+
+
+
-

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Groupe
A RH+
A RHB RH+
B RHAB RH+
AB RHO RH+
O RH-

Epreuve srique :

Technique
GR test A1
GR test B
GR test O
+ 1 goutte du plasma du sujet grouper
+
+

+
+

Rsultat
Groupe

A
B
AB
O

La dtermination doit tre ralise deux fois par deux techniciens diffrents,
deux techniques diffrentes et deux lots de ractifs diffrents.
Une carte de groupe sanguin ne devrait tre dlivre qu'aprs deux
dterminations
pratiques
sur
deux
prlvements
diffrents

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