Mthodes

de laboratoire
Identification des bactries cultivables
MTHODE ANALYTIQUE 341

Applicabilit
Cette mthode est utilise pour identifier des bactries cultivables.
Norme(s)1
Aucune norme.
Systme dchantillonnage
Matrices multiples.
Volume et dbit dchantillonnage recommands
N.A.
Analyse
Stromicroscopie fibre optique, microscopie la lumire transmise,
chromatographie en phase gazeuse.
Valeur minimale rapporte (VMR)
N.A.
Domaine dapplication
N.A.
Fidlit
N.A.
Incertitude analytique (CVA)
N.A.

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2009
ISBN : 978-2-89631-346-4 (PDF)
ISBN : 978-2-89631-255-9 (1re dition, 2008)
ISSN : 0820-8395

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en sant et en scurit du travail,
2009

Mthodes
de laboratoire
Identification des bactries cultivables
MTHODE ANALYTIQUE 341
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requrir lutilisation de matriels, doprations ou
dquipements dangereux. Ces mthodes nont pas
pour but de mentionner tous les problmes de
scurit associs avec leur utilisation. Cest la
responsabilit de lutilisateur dtablir les pratiques de
sant et de scurit appropries. Lutilisation des
donnes incluses dans ces mthodes se fera aux
seuls risques de lutilisateur : lIRSST se dgage de
toute responsabilit.relative aux erreurs ou aux
dommages qui dcouleraient de telle utilisation et de
telle application. Les hyperliens qui apparaissent
dans ce document ont t valids au moment de la
publication

Responsable technique de la mthode

Genevive Marchand, Ph.D., microbiologiste,

Services et expertises de laboratoire, IRSST
Approbation

Genevive Marchand, Ph.D., microbiologiste,

Marie-Claude Barrette, M.Sc., chimiste,
responsable du programme dassurance qualit
et Jacques Lesage, M.Sc., chimiste, directeur,
Services et expertises de laboratoire, IRSST
Autorisation pour publication

Marie Larue, M.Sc., prsidente-directrice gnrale

Prsidence-direction gnrale, IRSST

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Ce document technique a t financ par lIRSST. Les conclusions et recommandations sont celles des auteurs.

CONFORMMENT AUX POLITIQUES DE LIRSST

Les rsultats des travaux de recherche publis dans ce document
ont fait lobjet dune valuation par des pairs.

TABLE DES MATIRES

Prambule .............................................................................................................................................. 4
1.

Principe de la mthode........................................................................................................................ 5

2.

Interfrences ........................................................................................................................................ 5

3.

Matriel ................................................................................................................................................. 5

4.

Ractifs................................................................................................................................................. 5

5.

chantillonnage ................................................................................................................................... 6

6.

Protocole analytique............................................................................................................................ 6

7.

Paramtres dapplication .................................................................................................................... 7

8.

9.

7.1

Limite de dtection et limite de quantification

7.2

Fidlit

7.3

Exactitude

7.4

Incertitude de mesure

Contrle de qualit .............................................................................................................................. 7

8.1

Contrle inter laboratoire

8.2

Contrle des produits utiliss

Sant et scurit .................................................................................................................................. 8

10. Rfrences............................................................................................................................................ 8
11. Bibliographie........................................................................................................................................ 8

Mthode analytique 341 Identification des bactries cultivables

Page 4

Prambule
La Loi sur la sant et la scurit du travail au Qubec a comme objet l'limination la source des dangers
pour la sant, la scurit et l'intgrit physique des travailleurs. Des valeurs dexposition admissibles (VEA)
aux substances chimiques ont t fixes lannexe 1 du Rglement sur la sant et la scurit de travail
(RSST). Larticle 44 de ce rglement intitul Mthodes spcifie que :
Ces gaz, ces fumes, ces vapeurs, ces poussires et ces brouillards prsents dans le milieu de
travail doivent tre prlevs et analyss de manire obtenir une prcision quivalente celle
obtenue en appliquant les mthodes dcrites dans le Guide d'chantillonnage des contaminants de
l'air en milieu de travail publi par l'Institut de recherche Robert-Sauv en sant et en scurit du
travail ...
Pour atteindre ces objectifs, des mthodes danalyse visant quantifier le degr d'exposition des
travailleurs sont dveloppes et rdiges pour implanter les moyens de contrle adquats. Afin d'assister
les intervenants en milieu de travail, lIRSST publie, rvise priodiquement et diffuse le Guide
d'chantillonnage des contaminants de l'air en milieu de travail et la direction Services et expertises de
laboratoire publie des mthodes danalyses des contaminants.
Ces mthodes doivent tre utilises de concert avec les rfrences rglementaires et normatives
suivantes :
9 Loi sur la sant et la scurit du travail. L.R.Q., chapitre S-2.1. diteur officiel du Qubec, (1er aot 2007).
http://www2.publicationsduquebec.gouv.qc.ca/dynamicSearch/telecharge.php?type=2&file=/S_2_1/S2_1.html
9 Rglement sur la sant et la scurit du travail. S-2.1, r.19.01, Dcret 885-2001. diteur officiel du Qubec (25
juillet 2007).
http://www2.publicationsduquebec.gouv.qc.ca/dynamicSearch/telecharge.php?type=2&file=%2F%2FS_2_1%2F
S2_1R19_01.htm
9 Guide d'chantillonnage des contaminants de l'air en milieu de travail. Direction des oprations, IRSST, T-06
Guide technique, Montral, Qubec, (mars 2005). http://www.irsst.qc.ca/files/documents/PubIRSST/T-06.pdf
9 NIOSH, National Institute for Occupational Safety and Health .
9 ISO Guide 30, Termes et dfinitions utiliss en rapport avec les matriaux de rfrence, 2e dition, 1992.
9 ISO, Vocabulaire international des termes fondamentaux et gnraux de mtrologie, 2e dition, 1993.

9 American Industrial Hygiene Association (AIHA), organisme qui accrdite le laboratoire de lIRSST dans le
domaine de lanalyse des contaminants chimiques en milieu de travail et pour lanalyse environnementale
microbiologique.

Par ailleurs, toute la terminologie utilise dans cette mthode est dcrite dans linstruction de travail
I-G-014 du systme de gestion documentaire associe au systme qualit de lIRSST.

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Mthode analytique 341 Identification des bactries cultivables

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1. PRINCIPE DE LA MTHODE
Isoler en culture pure des colonies de bactries. Procder leur identification partir de
caractrisations macro et microscopiques, du profil en acide gras (mthode IRSST-344) ainsi que de
tests biochimiques.

2. INTERFRENCES
La sensibilit de cette mthode varie selon :
9
9
9
9

La rencontre des conditions de croissance des microorganismes leur dveloppement ;

Une surpopulation ;
Lenvahissement de microorganismes sur un ptri qui rend lisolement difficile ;
Lobtention dune culture pure de chaque colonie.

3. MATRIEL
9 Gloses :
- Trypticase de soya
- Autres selon les besoins
9 Tige boucle
9 Microscope lumire transmise muni dun contraste de phase
9 Oculaire 10X ou 12,5X
9 Objectifs (ex :10X, 40X, 60X et 100X)
9 Lame et lamelle
9 Stromicroscope 20X-120X
9 Source lumineuse fibre optique
9 Chromatographe en phase gazeuse avec colonne de silice fondue
9 Base de donnes informatique Sherlock
9 Base de donnes informatique Biolog
9 Rfrigrateur temprature constante (4C 3C)
9 Incubateur (25C 2C)
9 Autoclave (121C, 15 PSI)
9 Hotte flux laminaire

4. RACTIFS
9
9
9
9
9
9

Eau strile
Coloration de GRAM
Produits Biolog
Ractifs oxydase
Ractifs catalase
Huile immersion

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5. CHANTILLONNAGE
Non applicable

6. PROTOCOLE ANALYTIQUE
6.1 Faire le repiquage, en culture pure, de toutes les colonies diffrentes retrouves sur le ptri
dorigine.
6.2 Confirmer la puret de la colonie au stromicroscope. Si une culture mixte est identifie, il faut
tenter nouveau lisolement des colonies prsentes. Il faut sassurer de ne pas doubler
lidentification dun isolement dj ralis partir du ptri de dpart. Bien comparer les
repiquages avec la colonie de dpart.
6.3 Dautres milieux de culture peuvent tre utiliss pour faciliter lidentification de certains genres.
6.4 Pour chaque colonie isole en culture pure, vrifier les caractristiques macroscopiques de la
colonie (dimension, couleur, texture, pigmentation du milieu, etc.).
6.5 Un montage humide effectu laide de leau peptone permet de vrifier les caractristiques
microscopiques de la bactrie dcrites dans les livres de rfrence 2-3.
6.6 Un test doxydase permet de vrifier la prsence du cytochrome C caractristique certains
genres bactriens.
6.7 Une coloration de Gram permet de diffrencier entre les bactries Gram positif et celles Gram
ngatif.
6.8 Selon les rsultats des tests biochimiques, faire une analyse du profil en acide gras ou une
analyse par tests biochimiques, tel que dcrit ci-dessous :
6.8.1 En prsence dun Gram positif ou dun Gram ngatif loxidase positive, effectuer
lanalyse du profil en acides gras selon la mthode IRSST 344.
6.8.2 En prsence dun Gram ngatif loxidase ngative, effectuer une identification partir
des plaques didentification de BIOLOG ou Microscan ou dautres systmes
didentification pour vrifier les caractristiques biochimiques de la souche identifier.
Effectuer une inoculation des plaques en suivant les recommandations du manufacturier
pour inoculer, et lire les ractions biochimiques 4.

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Mthode analytique 341 Identification des bactries cultivables

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7. PARAMTRES DAPPLICATION
7.1 Limite de dtection et limite de quantification
Non applicable
7.2 Fidlit
Non applicable
7.3 Exactitude
Non applicable
7.4 Incertitude de mesure
Non applicable

8. CONTRLE DE QUALIT
8.1 Contrle inter laboratoire
Un contrle de qualit interlaboratoires est effectu avec lAIHA (American Industrial Hygiene
Association). Les chantillons sont achemins au laboratoire trois reprises chaque anne.
Chaque srie dchantillons contient au moins trois inconnus de bactries qui nous proviennent
sous forme lyophilise. Dans certains envois, des chantillons deau ou de poussires contenant
une ou plusieurs bactries doivent galement tre traits.
8.2 Contrle des produits utiliss
8.2.1 Un contrle de qualit est effectu pour chaque coloration de Gram. Les lames utilises
pour raliser les colorations de Gram sont inocules avec une bactrie Gram positif et
une Gram ngatif. La coloration obtenue doit correspondre celle attendue.
8.2.2 Un contrle de qualit est ralis sur les plaques didentification BIOLOG ou autres pour
chaque nouveau lot reu. Des souches pour contrle de qualit sont inocules dans les
plaques didentification respectives. Les ractions biochimiques sont connues pour ces
microorganismes et les rsultats doivent correspondre aux ractions attendues.

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9. SANT ET SCURIT
9.1 Dversement mineur :
Lors dun petit dversement (quelques ptris) de microorganismes, le technicien doit mettre un
produit dsinfectant (alcool, eau de javel) sur la surface contamine. Recouvrir ensuite, puis
quitter le laboratoire pendant environ trente (30) minutes pour que les particules se dposent.
Mettre une affiche sur la porte du laboratoire afin den limiter laccs si ncessaire. Aprs ce
trente minutes, bien nettoyer la surface. Il faut autoclaver tout le matriel qui a t en contact
avec le contaminant.
9.2 Dversement majeur :
Lors dun gros dversement (plusieurs ptris), le technicien doit sortir du laboratoire, mettre une
affiche sur la porte pour limiter laccs au laboratoire, puis aviser le professionnel responsable et
son suprieur. Aprs 30 minutes dattente pour que les particules se soient dposes, il faut
mettre un produit dsinfectant (alcool, eau de javel ) sur la surface contamine et recouvrir
pour laisser agir. Aprs une trentaine de minutes, bien nettoyer la surface contamine. Il faut
autoclaver tout le matriel qui a t en contact avec le contaminant. Le port dun masque N-95
est ncessaire lors du nettoyage. Selon lampleur du dversement, le professionnel
responsable pourrait demander que toute les surfaces (murs, comptoirs, bchers) ayant
possiblement t en contact avec le contaminant soient dcontamines.
10. RFRENCES
1. Microbial Identification System, Operating manual, Version 6, MIDI Inc., Newark, Delaware, 1998.
2. Bergeys Manual of Determinative Bacteriology, Holt J.G., Krieg, N.R., Sneath, P.H.A., Staley, J.T.
et Williams, S.T., Ninth edition, Williams & Wilkins, Baltimore, 1994.
3. Bergeys Manual of Systematic Bacteriology, Murray, R.G.E., Brenner, J.D., Bryant, M.P., Holt,
G.J., Krieg, R.N., Moulder, J.W., Pfennig, N., Sneath, P.H.A., Staley, J.T., Mair, N.S., Sharpe, M.E.
et Williams, S.T., vol 1 et 2, Williams & Wilkins, Baltimore, 1986.
4. Manuel dutilisation des plaques didentification et manuel contrle de qualit, BIOLOG.

11. BIBLIOGRAPHIE
1. Microbiological Methods, Collins, C.H., Sixth Edition, Butterworths, London. 409p. 1989.
2. Assessing Bioaerosols in Indoor Environment Workshop, sponsored by the University of Michigan
and ACGIH, Oct. 4-6 1988, Ann Arbor, Michigan.

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