mdecine/sciences 2016 ; 32 : 768-70

Vers une
lectrophysiologie
optique in vivo

mdecine/sciences

Laurie Lambot1, David Gall2

> La capacit de mesurer simultanment et in

vivo lactivit lectrique dans diffrentes rgions
du cerveau est lun des outils cls ncessaires
au progrs des neurosciences. Or, comparativement aux techniques lectrophysiologiques
permettant de mesurer lactivit neuronale
lchelle cellulaire, nous disposons de peu de
moyens permettant ltude fonctionnelle des circuits neuronaux, en particulier in vivo. Lessentiel
de nos connaissances drive dextrapolations
des donnes lectrophysiologiques obtenues au
niveau cellulaire, le plus souvent ex vivo. Ces
donnes, trs parcellaires, permettent difficilement dapprhender les proprits mergentes
de populations neuronales interconnectes, limitant ainsi notre comprhension de linteraction
entre physiologie et connectivit dans des situations normales et pathologiques. Nous prsentons ici de nouveaux types d'indicateurs fluorescents permettant de raliser des enregistrements
lectrophysiologiques optiques in vivo. <

Department of physiology,
Feinberg school of medicine,
Northwestern university,
303 East Chicago avenue,
Chicago, IL 60611, tats-Unis ;
2
Laboratoire de physiologie
et pharmacologie (CP604),
facult de mdecine,
Universit Libre de Bruxelles,
route de Lennik 808,
B-1070 Bruxelles, Belgique.

laurie.lambot@northwestern.edu
dgall@ulb.ac.be

modification de 100 mV, ce qui correspond lamplitude dun potentiel

daction, entrane une modification de lintensit de fluorescence de
lordre de 2 10 %. Le marquage cellulaire par ces molcules est obtenu
soit par micro-injection, soit par pr-incubation. Dans le premier cas,
la difficult technique inhrente linjection au niveau cellulaire rend
impossible le marquage dun grand nombre de cellules. Dans le second
cas, la pr-incubation induit un marquage indiscrimin qui ne permet pas
le ciblage dun circuit neuronal prcis. Rcemment, une nouvelle classe
dindicateurs, cods gntiquement, a permis de dpasser ces limitations.

Une nouvelle classe dindicateurs fluorescents

cods gntiquement
Mesures optiques du potentiel membranaire
Une approche exprimentale prometteuse, dveloppe
depuis plus de quarante ans, repose sur limagerie fonctionnelle base sur lutilisation dindicateurs fluorescents
sensibles au potentiel membranaire [1]. Cette technique
permet potentiellement une mesure directe et simultane
de la dynamique spatiotemporelle de lactivit lectrique
dun grand nombre de neurones et donc, de la connectivit des rseaux impliqus. Nanmoins, cette stratgie
exprimentale tait jusquici en butte des limitations
techniques importantes, lies aux types de molcules
fluorescentes utilises. En effet, sil existe des indicateurs
fluorescents de synthse ayant une rsolution temporelle
suffisante pour dtecter les potentiels daction, leur
sensibilit est relativement faible [2] ; typiquement, une
Vignette (Photo Laurie Lambot et David Gall).

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Les indicateurs fluorescents cods gntiquement permettent de cibler

des populations neuronales spcifiques en utilisant des techniques
dexpression gnique existantes et prouves comme le systme Cre/Lox1
ou le recours des vecteurs viraux. De premiers indicateurs performants
ont t crs et ont dj eu un impact majeur dans les neurosciences :
des indicateurs fluorescents sensibles la concentration en calcium [3].
Nanmoins, la mesure des signaux calciques ainsi obtenue ne constitue
pas un reflet fidle de lactivit lectrique neuronale. En effet, faute
dune rsolution temporelle suffisante, elle ne permet pas la mesure
des potentiels daction neuronaux, en particulier haute frquence2. De
plus, elle ne peut dtecter des modifications du potentiel membranaire
nentranant pas dentre de calcium extracellulaire. Ds lors, le recours
des indicateurs cods gntiquement et sensibles au potentiel membranaire est ncessaire. Dbuts la fin des annes 1990, les progrs
1

Le systme de recombinaison Cre-lox utilise lenzyme recombinase Cre, une tyrosine recombinase issue
du bactriophage P1, afin de cibler des squences loxP (galement issues du bactriophage P1), permettant ainsi dactiver, rprimer, voire mme changer, les gnes situs entre les squences lox.
2
Les potentiels daction sont des vnements trs courts et la frquence de dcharge dun neurone peut
tre de lordre de 100 Hz.

m/s n 8-9, vol. 32, aot-septembre 2016

DOI : 10.1051/medsci/20163208026

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Figure 1. Mcanismes molculaires

permettant de rendre la fluorescence dindicateurs - cods gnB
C
D
A
tiquement - sensible au potentiel
+
+
+
+
membranaire. La partie suprieure
N
N
de la figure illustre la configuration

H+
H+
molculaire des indicateurs lorsque
la membrane est hyperpolarise,
et la partie infrieure, lorsque la
membrane est dpolarise. A. Un
premier mcanisme possible utilise
une protine de fusion comprenant une protine fluorescente (FP)

et un domaine transmembranaire
N
N
sensible au potentiel (DTMV). Lors
+
+
H
H
+
+
+
+
dune dpolarisation, le changement de conformation induit une
diminution de lmission de lumire
par la protine fluorescente. B. Une
DTMV/FP
DTMV/FRET
Opsine
Opsine/FRET
seconde possibilit consiste en une
protine de fusion comprenant un
domaine sensible au potentiel et une paire de protines fluorescentes permettant une mission fluorescente par transfert dnergie par rsonance
de type Frster (FRET, Frster resonance energy transfer) entre les deux fluorophores lors dune dpolarisation membranaire. C. La troisime approche
repose sur lutilisation dopsines bactriennes. Parmi ces constructions molculaires, Arch (archaerhodopsin) montre une fluorescence intrinsque
sensible aux variations du potentiel due un transfert de proton. un potentiel dpolaris, lopsine comprend une base de Schiff (double liaison carbone azote, lazote tant li un groupe aryle ou alkyle) protone. Dans cette configuration lopsine absorbe fortement les longueurs dondes dexcitation et lmission de fluorescence augmente. un potentiel hyperpolaris, aucune fluorescence nest mise. D. La quatrime approche comprend des
indicateurs utilisant le FRET entre une protine fluorescente et une opsine. Lorsque la membrane est dpolarise, lopsine est protone, il ny a pas de
transfert dnergie par FRET et aucune fluorescence nest mise par la protine annexe. DTM : domaine transmembranaire.

Opsine sensible au potentiel

dans le dveloppement de ces indicateurs se sont avrs nettement

plus lents que ceux raliss dans la mise au point des sondes calciques
codes gntiquement.
Quatre approches ont t utilises dans la conception de ces indicateurs
sensibles au potentiel membranaire (Figure 1). La premire a consist
fabriquer une protine de fusion comprenant une protine fluorescente
et un domaine transmembranaire sensible au potentiel. Nanmoins, les
indicateurs ainsi obtenus, dont lun des plus rcents est ASAP1 (accelerated sensor of action potentials 1) [4], se sont avrs peu performants
tant en terme de sensibilit que de rsolution temporelle. Dans une
seconde approche, la protine de fusion comprenait un domaine sensible
au potentiel et une paire de protines fluorescentes. Le potentiel de
membrane pouvait ainsi moduler lmission fluorescente par transfert
dnergie par rsonance de type Frster (FRET, Frster resonance energy
transfer) entre les deux fluorophores3 (pour plus () Voir le Dossier
dexplications voir [5]) ().
technique de
Ces sondes prsentent une meilleure sensibilit au G. Trugnan et al., m/s
potentiel membranaire mais leur cintique reste n 11, novembre 2004,
page 1027
trop lente pour permettre une mesure fidle des
potentiels dactions [6]. La troisime catgorie de sondes repose sur
3

Substance chimique capable dmettre de la fluorescence aprs excitation.

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DOSSIER TECHNIQUE

Dpolarisation

REVUES

DTM sensible au potentiel

lutilisation dopsines4 bactriennes dont la fluorescence

intrinsque est sensible aux variations du potentiel
membranaire. Cependant, mme les variantes les plus
brillantes et qui prsentent une grande sensibilit de
mesure sont faiblement fluorescentes [7]. Enfin, trs
rcemment, des indicateurs utilisant le FRET entre une
protine fluorescente et une opsine ont t crs [8],
dont les Ace-mNeon [9]. Les Ace-mNeon sont des protines de fusion composes dune rhodopsine provenant
de Acetabularia acetabulum5 et dune protine fluorescente mNeonGreen6, permettant une mission optimale
par FRET. Ces sondes prsentent la fois une grande
sensibilit aux variations du potentiel membranaire et
une fluorescence intense.
Les donnes obtenues in vitro montrent que les AcemNeon permettent une dtection des potentiels daction avec une fidlit remarquable, mais galement
4

Les opsines sont une famille de protines capables de ragir lnergie lumineuse
grce leur liaison avec un chromophore.
5
Algue commune sur les rochers, blanchtre ou vert clair, en forme de parasol.
6
Qui drive dune protine ttramrique fluorescente du Cphalocord
Branchiostoma lanceolatum.

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quelles savrent capables de mesurer des modifications minimes du

potentiel membranaire en labsence dactivit lectrique. Lors dun
saut du potentiel membranaire de 100 mV, cette sonde prsente une
variation de fluorescence, mesure ltat stationnaire, suprieure
80 %, cette rponse prsentant une dpendance linaire au potentiel
membranaire dans tout lintervalle physiologique. La rsolution temporelle obtenue est de plus infrieure la milliseconde, permettant
ainsi la dtection des potentiels daction neuronaux.

Application ltude de circuits neuronaux in vivo

Afin de pouvoir utiliser ces indicateurs, laspect le plus crucial est de
vrifier si la sensibilit observe in vitro permet effectivement des
mesures in vivo. Dans ce but, Gong et al. [9] ont slectivement exprim
la sonde Ace-mNeon dans les neurones des couches 2/3 du cortex visuel7
de la souris. Lactivit lectrique de ces neurones marqus, situs plus
de 100 m sous la surface du cerveau, a pu ainsi tre mesure optiquement dans le cerveau dune souris anesthsie. La rsolution temporelle
obtenue dans ces conditions a permis dobserver des potentiels daction
spars par des intervalles allant jusqu 10 ms. Cette rsolution temporelle est vingt fois meilleure que celle obtenue avec GCaMP6f, un
indicateur cod gntiquement sensible aux variations de concentrations de calcium intracellulaire et possdant une cintique rapide [10].
Ces rsultats dmontrent galement que la capacit de dtection des
potentiels in vivo par Ace-mNeon est quivalente celle obtenue par les
techniques lectrophysiologiques classiques.
Il est ds lors possible dtudier directement lactivation in vivo de
circuits neuronaux spcifiques activs lors de tches comportementales. Lactivit lectrique de neurones exprimant lAce-mNeon dans
les couches 2/3 du cortex visuel primaire a ainsi pu tre enregistre lors
du traitement de linformation visuelle chez des souris veilles. Cette
mthode a galement pu tre utilise pour la drosophile, chez laquelle
les enregistrements lectrophysiologiques in vivo sont difficiles raliser. Dans cette espce, des mesures optiques ont pu tre effectues dans
les neurones olfactifs exprimant lAce-mNeon. La dtection optique des
potentiels daction in vivo a pu tre ainsi corrle la prsentation de
stimulus olfactifs spcifiques. Au niveau subcellulaire, ces mesures ont
galement pu mettre en vidence la propagation des signaux lectriques
des dendrites vers laxone, un effet que ni limagerie calcique ni llectrophysiologie ne permettaient jusqu prsent de mesurer in vivo.

Observer et manipuler les rseaux neuronaux in vivo

La mise au point dindicateurs fluorescents cods gntiquement permettant la mesure fidle de lactivit lectrique ouvre la voie une
approche purement optique de llectrophysiologie. En effet, lutilisation

7
Le cortex est compos de 6 couches cellulaires qui diffrent par le type cellulaire et le type de
connexions. La couche 2 est appele couche granulaire externe et contient des cellules toiles et des
petites cellules pyramidales. La couche 3 est appele couche pyramidale externe et contient des cellules
pyramidales moyennes et des interneurones. Lensemble de ces deux couches peut tre dsign sous le
terme couche 2/3. Les cellules pyramidales de la couche 2/3 ont leurs axones qui vont projeter (effrences) vers dautres rgions corticales.

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de tels outils en combinaison avec loptogntique

[11] va permettre la fois de mesurer et de manipuler
lactivit lectrique au niveau cellulaire in vivo dans des
circuits neuronaux spcifiques. Il ne fait aucun doute
quune telle stratgie permettra de raliser des progrs
dcisifs en neurosciences.

SUMMARY
Towards optical in vivo electrophysiology
Optical imaging of voltage indicators is a promising approach
for detecting the activity of neuronal circuits with high spatial and temporal resolution. In this context, genetically
encoded voltage indicators, combining genetic targeting
and optical readout of transmembrane voltage, represent
a technological breaktrough that will without doubt have a
major impact in neuroscience. However, so far the existing
genetically encoded voltage indicators lacked the capabilities to detect individual action potentials and fast spike
trains in live animals. Here, we present a novel indicator
allowing high-fidelity imaging of individual spikes and dentritic voltage dynamics in vivo. Used in combination with
optogenetics, which allows to manipulate neuronal activity,
this opens the possibility of an all-optical electrophysiology.
LIENS DINTRT
Les auteurs dclarent navoir aucun lien dintrt concernant les donnes publies dans cet article.

RFRENCES
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TIRS PART
D. Gall

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