Universitatea de Medicina si Farmacie »Carol Davila” Gabriela Loredana Popa M.D., Ph.D. Sef de lucrari universitar CARTE DE LUCRARI PRACTICE MICROBIOLOGIE PENTRU FACULTATILE DE FARMACIE $I MEDICINA DENTARA Renaissance Bucuresti 2008Partea generala 1. Norme de protectio a muncii in laboratorul de microbiologic. Exemple de echipamente care pot fi utilizate in laborator. Dezinfectie si sterilizare. Tinta activitatii in laboratorul de microbiologic este identificarea agentului patogen gi stabilirea tratamentului adecvat. Datele nu pot fi insa interpretate ,mecanic” si este necesara o pregitire serioasa, teoreticd si practicd. Aceasta pregatire dureaza pentru cei care lucreaza in Jaborator, pana Ja momentul pensionarii, In medicin’ apar in permanent informatii si notiuni noi, Totusi, pentru colegii care vor avea o activitate in domeniul farmaceutic sau in medi ia dentari, o parte din informatiile prezentate reprezinti doar nofiuni de culturi general medicali, in cursul activitatii practice, eel putin in perioada de formare (si chiar daca aceste activititi de microbiologic nu yor mai fi efectuate niciodata, in restul viel), trebuie efectuate toate gesturile necesase prevenirii unei infect, situatic care este supravegheata de asistentul de erupa. 1.1. Norme de protectie a muncii in laboratorul de microbiologie se lucreazi cu microorganisme potential patogene sau patogene, care fi izolate in diferite produse patologice (prescurtat p.p.) (ex. singe, urin’, materii fecale, purvi, diferite alte seoretii cte) sau au fost izolate in culturi, Pentru prevenirca infectiilor, regulile urmatoare trebuie aplicate, strict. 1. Este strict interzis accesul persoanelor straine in laborator. Cei care pot intra, 0 vor face dupa insusirea (proces verbal) regulilor de protect 2. Toate produsele biologice sunt considerate ca potential infectioa: Echipamentului de proteetie este obligatoriu (halat in principal); in functie de sitvatie ar putea fi necesard purtarea de miinugi, ochelari, masca ete; Cand becul de gaz. este aprins, nu purtdim manugi de latex, in apropiere; 5. Nueste voie si se mandnce sau si bea in sala de Iuerari practice; 6. Este interzisa introducerea in guri a oricdrui tip de obiect; pipetarea cu gura nu este permisa; 7. Dac existi materiale contaminate, este bine si lum legitura cu asistentul de grup care ne va sfitui cum trebuie si procedim; toate activititile de prelucrare a microorganismelor se realizeaza in vecindtatea becului de gaz, aprins; 8. insimanfarile se efectucara “la Maca9. Ansa bacteriologic’ se sterilizeaz’ “la rogu”, atat bucla eft gi firul ansei (iar portansa se flambeaz: inainte gi dupa folosire; 10. inainte de inceperea oricdirui test sau a oricirei manevre, trebuie si ne ,schitam’” in minte tot ce avem de facut; daca este ceva care nu ne este clar, trebuie si intrebim asistentul de grup; 11. Pipetele contaminate nu se decontamineazi la rosu”: trebuie si le introducem in flaconul pregitit de personalul catedrei, care este pus pe masa de Iver inainte de ‘nceperea lucréirii practice, contindnd substane dezinfectante; 12. Orice alt obiect, nementionat mai sus, trebuie decontaminat, dar pentru aceasta activitate ne adresim asistentului de grapiis 13. in cazul in care are loc contaminarea avcidentali a suprafetei mesei de lucru, cu substante diverse, cu rea cu produse patologice sau culturi trebuie sii anuntim neintarziat acest eveniment asistentului de grupa; acesta ne va indruma in procesul de decontaminare, dupa caz; 14. La sfirsitului luenalui in laboraior trebuie si se spele mainile cu apa si sipun. Respectarea acestor norme de protectie este strict necesara. 1.2, Exemple de echipamente care pot 11 utilizate in laboratorul de microbiologie in laboratorul de microbiologie putem utiliza: 1. Microsceape, lupe si ruse de coloranti, 3. Termostate si bai de apii sau de nisip, 4. Frigidere, 5. Centrifugi balante, 6. Mojare, agitatoare, dispozitive de triturare a tesuturilor, 7. Aparate pentru distilarea si demineralizarea apei, 8. Aparate pentru stabilirea pH-ului, 9. Fotometre sau colorimetre, 10. Distribuitoare pentru medii de cultura, 11. Aparate si dispozitive pentru sterilizare gi dezinfectie, 12. Containere pentru materialul contaminat, 13, Inventar de sticlirie, 14, Inventar de material plastic si cauciuc, 15. Alte anticole de laborator: trepiede, stelaje, site de azbest, becuri Bunsen, anse bacteriologice, diferite tampoane ete.Cu toate c& nu intra in ,dotarca standard” a unui laborator in care se efectueaza lucririle practi i, trebuie si cunoasiem ca existi si cabinete de siguranta biological (incinte, boxe, nise, hote), clasificate dupa cum urmeazzi: pentru studen = cabinetul de clasi |, in care aerul curat antreneaz’ aerosolii produsi dinspre persoana care Inereazd i care se afld in laborator catre mediul exterior, print--un filtru, = cabinetul de clasa Il, in care aerul curat pitrunde filtrat, este recirculat prin filtre astfel neat suprafata de Jucru vine in contact cu zer steril, = eabinetul de clasii III este complet inchis; medicul igi introduce mainile in zona de Jucru prin manugi fixate etang la aparat; aerul este atdt admis cét si evacuat prin filtr. 1.3. Dezinfectie si sterilizare Sterilizarea prin cAldura useata ‘Are ca mecanism oxidarea sau carbonizarea structurilor bacteriene, 1. Sterilizarea prin incalvire Ia incandescent (“la rosu”) reprezint& introducerea si mentinerea in flacira becului Bunsen pani Ia inrosire, pe toati lungimea, a obiectului care urmeaza a fi sterilizat. Se poate aplica pentru ansa bacteriologied (cu buckt sau fir) sau pentru spatul. Flambarea reprezint& trecerea prin flacdira (de cateva ori) a unui obicet, fir a se atinge temperatura de incandescenga. Flambarea se aplica pentru portansd, gatul unui recipient de stick (tub, eprubeta, Nlacon ete) ete. 2. Sterilizarea eu aer ald se realizeaz’ in etuv’ (pupinel). Etuya este 0 cutie metalic& cu pereti dubli. Cu ajutorul unor rezistente electrice si a unui termostat se obtine si mentine temperatura pentru sterilizare. Uniformizarea temperaturii in interiorul aparatului este realizata cu ajutorul unui sistem de ventilatie. Pentru majoritatea materialelor care urmeazi a fi sterilizate, temperatura din ctuva trebuie si atingé: 180°C, pentru o durati de 1 ord Sterilizarea cu aer cald est icata pentru obiecte de sticla, obiecte de portelan, pulberi inente si termostabile, uleiuri anhidre, instrumentar chirurgical (pentru instrumentarul metalic este de mentionat faptul cd repetarea sterilizérii, in timp, conduce la decilirea otelului) ete. Nu se vor steriliza in etuvi solufiile apoase, obiectele de plastic, obiectele de cauciuc, vata, bumbac, fibri sintetici, ale materiale termolabile, materiale contaminate din laborator. Sterilizarea prin cildurd umedit Are ca mecanism coagularca proteinclor si degradarea enzimelor. Autoclavarea eSte esentiala. Vaporii de apa realizeaza la 0,5 atmosfere o temperatura de 119°C iar la 1 atmosfera o temperatura de 121°C. Exista mai multe tipuri de autoclave: fn autoclavul cu perete simplu, vertical, vaporii provin din apa aflata in cazanul de presiune si ajung in camera de sterilizare, de jos in sus. Pentru punerea in functiune a autoclavului, existi 2 robinete: superior (pentru aer si vapori) gi umul inferior (pentru 7“victare). Pentru a evita accidentele exist o supeps de siguranga care se deschide si permite vacuarea vaporilor atunci cind, accidental, presiunea vaporilor depaseste limita de siguranga. mn partea inferioard a eazamului de presiune se afla un suport pe care se ageazi o placa de Inetal perforal. Pe suport se aycaz matcrialele care trebuie sterilizate iar faptl c& placa este perforatti permite trecerca vaporilor de apa produsi dup inclzirea apei, Activitayi: * verified nivelul apei din parteainferioar; completim, Ja nevete (eu upa dis ata), * _8ezim pe suport ce dorim si sterilizim, ambalat corespunzator; * inchidem etans capacul; * conectim sursa de cilduris * deschidem robinetul pentru evacuarea aerului si vaporilor; * Inchidem robinetul, dupa evacuarea aerulvi si aparitia unui jet continua de vapori; * Presiunea din cazan incepe si crease’; urmirim valoarea pe manometru; eéind presiunea ‘tinge valoarea dori (ex. 1 etmosfers), reghim sursa de cildurd in age fel inedt aceasth Presiune si fie menfinut8 pentru toati duratasterilizarii (ex. 30 minute) * dupl 30 minute stopim sursa de caldurd gi kisim autoclavul si se riceaset © avleplam para cénd presiunea din interior sjunge la nivelul presiunii atmosferice: * deschidem lent robinetul de vapori i doschidem sistemul de etanseizare: * lasim obiectele gi materialcle si se riiceasca in interiorul autoclavului Prin autoclavare putem sterilica diferite substante in soluie, ie (cu exceptia pipetclor i lamelor), materiale contaminate din laborator, instrumentar chirurgical (metalic, de caueiue ‘su bumbac), medii de cultura, aparate de filtrat etc Sterilizarea prin filtrare Microorganismele pot fi refinute mecanic si electrostatic in porit unui fit. Trecerea unui Nichid printt-o substanfi previguti cu pori care va retin microorganismele din Tichidul respectiv poarti numele de sterilizare prin filtrare. De-a lungul timputui au fost utilizate ° serie de filtre clasice (portelan, sticld poroast, azbest impregnat ew caolin, pimant de infzori). Actualmente se folosesc din ce in ce mai frecvent membrane filtrante din acetat de celuloait cu porozityi tntre 8 si 0,025 um. Existi i alte variante tehnice. Cu o importanta Practica partculard ar fi de mentionat filtrele pentru sterilizarea acrului din cabinetcle de Sleurantd biologicd (clasa Ml si elasa IN), filtrele HEPA (High Efficiency Pa Filters). Sterilizarea prin filtrare este utifizata pentru decontar ulate Air rea aerului, a unor medii de culturi (care nu se pot steriiza prin autoclavare), a unor reactivi care sunt sensibili la femperaturile atinse in cazul sterilizarii prin cildurd ete, Sterilizarea prin intermediul radiatiilor Reionizante (UV) sau ionizante (X ct:) au efecte bactericide prin ruperen 8legaturilor de hidrogen, oxidarea legiturilor duble etc. Radiatiile UV sunt utile in sterilizarea suprafetelor de lucru (pentra repartizarca mediilor de cultura, alte manevre aseptice ete) in cazul in care mu existi cabinete de sigurantt biologica cu Mux laminar. Lampile cy UV sunt numite impi germicide. Radiatiile ionizante se pot utiliza in sterilizari industriale (pentru alimente, medicamente, seringi de unica intrebuintare etc), Antiseptice si dezinfectante Hipocloritii * solutiile de hipoctorit se prepara proaspait (in flecare zi de lucra); + concentratia in clor activ este poate s& difere in functie de scopul urmarit: + au efect dezinfectant asupra bacteriilor in forma vegetativa, sporilor hacterieni, fungilor (100 ppm in 0 oF), virusurilor (200 ppm in 10 minute); + efectal este diminuat in prezenta substantelor organice (ex. proteine). Derivatii fenoli * datorita toxicit i, fenolii se folosese sub forma de derivati fenolici; + solutiile fenolice se prepard proaspait (in fiecare ri de Iueru); + concentratia poate si difere in funetie de scopul urmirit; + au efect dezinfectant asupra bacteriilor in forma vegetativa, fungilor, unor virusuri (ex. HIV ¢ inactivat de solutia 0.5%); efectul mai mic pe suprafejele de cauciue, femn ete. Glutaraldebida: * cel mai frecvent este utilizati concentratia de 2%, la un pH alcalin: are efect dezinfeectant asupra bacteriilor in forma vegetativa, fungilor, virusurilor; * pentru ci nu corodeaz metalele se poate folosi si la dezinfectarea suprafetclor metalice; + nu poate fi folositi pentru suprafete (vapor iritanti, timp mare de expunere); ideald pentru dezinfectarea echipamentelor contaminate, imersate in containere mentinute inchise; lodoforii # sunt substante care eliberea7it iodul in solutii apoase; + awefect dezinfectant asupra bacteriilor in forma vegetativa, unor spori bacterieni, fungilor, unor virusuri (ex. virusuri cu invelig lipidic); ‘+ sunt inactivati de substante organice (ex. proteice), mase plastice, detergenti + pot fi utilizati pentru dezinfectia suprafejelor, dezinfectia pipetelor contaminate. Sterilizarea cu etilenoxid (CH2CH,O): + exercitt activititi bactericide; sporii de Bacillus subtilis nu sunt distrusis * se utilizeaza pentru materiale care nu rezista atunci cand sunt supuse actiunii temperaturii sau radiatiilor (ex. materiale din cauciue, plastic, echipament electronic ete);+ ctilenoxidul poate exploda (pentru evitarea exploziei: |. utilizim etilenoxidului speciale, cu presiune negativa; 2. combinaim cu COs in camere de otel); ‘* _indiferent de varianta folosita trebuie respectate toate recomandatile producitorului; © existi si inconveniente (efecte carcinogenetice, efecte la nivclul sistemului nervos ete); * sterilizarea este influentati de: concentrafie, temperatura, umiditatea relativa si timpul de expunere (ex. 0 dublare a concentratiei reduce la jumatate timpul necesar). 2. Schema generala a diagnosticului de laborator microbiologic Diagnosticul de laborator in microbiologie poate fi bacteriologic sau micologic (direct), imunologic (indirect) sau 0 combinatie (direct si indirect, pentru acelagi germen). Principalele etape ale diagnosticului microbiologic respect o schema general’, usor de inseles si memorat, aplicata pentra fiecare microorganism in parte, 24, iagnosticul de laborator bacteriologic / micologic Unmiirim 0 serie de etape, pentru fiecare diagnostic in parte. Recoltarca si traasportul produsului patologie (p.p.) (cat mai aproape de debut, inainte de a administra amtibiotice, cat mai rapid posibil, coreet, aseptic etc), 2. Examinarea macroseopica a p.p. este ulila, Examinarea mieroscopied a pp. roprezi Uuneori 0 etapa orientativa, dar poate reprezenta o etapa esentialé (ex. in gonoree). Realizim eu albastru de metilen (AM) si al doilea prin minim 2 frotiuri din p-p. Colorim un fr metoda Gram. Unii autori prefers combinatia Giemsa/Gram. in cazul in care p.p. se recolteaza mai dif il (ex. punetie-biopsie in suspicionarea unui granulom hepatic brucelos), recomand realizarea a 3 frotiuri. in suspiciunea de tuberculoza (TB) realizim minim 3 frotiuri, colorate AM, Gram si Zichl-Neelsen. Frotiurile se examineazi la microscopul optic cu Jmersie. Nu ne ,repezim” in ciutarea de microorganisme. Cautim si notim prezenta cclulelor ‘in respectivul tesut(suferinde sau nu), prezenta celulelor inflamatorii (cx. PMN) yi prezenta Imicrobilor (interpretarea poate fi realizati in functie de experienta). in cazul in care p.p. este reprezentat de materii fecale, realizim coprocitograma (preparat intre lama si lameld, cAutim leucocite si alte structuri sugestive); in cazul in care p.p. este reprezentat de urini, obtinem sedimentul urinar (dupa centrifugarea), si examin’m acest sediment intre lama si lamela (evaluam prezenta si numarul PMNicamp, prezenta unor celule nomnale sau patologice sau alte structuri, ex. cristale diferite ete.). in infectiile micotice realizim preparate Proaspete (ex. preparatul in solutic de KOH- slicerol 10-20%), frotiuri cu ,colorate negativ” (ex. nigrozina) precum rotiurile colorate. 3. Cultivarea pe medii de cultura a pp. se va face in functie de situatie (germen presupus) si trebuie neaparat si obtinem colonii izolate (cultura pura), pentru identificare. 104, Identificarea microorganismului se realizeaza din colonii izolate (la fel ca si etapa 5), bazdndu-ne pe caractere studiate la fiecare curs, pentru germenii principali: a). caractere morfologice (facem un frotiu din colonia izolati, il colorim Gram sau Ziehl- Neelsen, dpi caz, si examindim microscopic; evidentiem numai microorganisme); 4). caractere de culturi (examinim coloniile izolate, pe medi de cultura solide; acesten pot fi de tip $ pentru majoritatea bacteriilor studiate si levurilor, de tip R sau de tip M) ©). caractere biochimice (ex. pe mediile multitest, in cazul enterobacteriilor); ©). caractere antigenice in bara structurii antigenice (reactiile antigen-anticorp sunt specifice; utilizam anticorpi cunoscuti $i identificdim antigenele microbiene necunoscute); ©). Caractere de patogenitate (ex. testul coagulazei pentra S. aureus); 1). lizotipie (sensibilitatea la bacteriofagi specific h). alte caractere wtile in identificarea bacteriilor sau fungilor. 5. Antibiograma si antifungigrama (testarea sensibi la antibiotice si chimicterapice anti-bacteriene si anti-fungice, pentru alegerea tratamentului corespunzitor) de reguli prin metode difuzimetrice, in cacul unor infectii grave facem yi alte determinari, de ex. deiermindim concentrajia minima inhibitorie (CMI) si bactericida (CMB). 2.2. Diagnosticul de laborator imunologic (serologic si / sau imunobiologic) 2.2.1. In diagnostical serologie determindim prezenta anticorpilor (Ac) necunoscuti, in semul pacientului, utilizand antigene (Ag) cunoscute. Ne bazim pe specificitatea reactiilor Ag. Ac, folosim tebnici clasice sau modeme gi trebuie s objinem raspunsal la minim trei intrebiiri: exist Ac in serul pacientului investigat?; care este titrul Ac? gi cum evolueaza ul (realizim minim douk determiniri, la 7-10 zile zile stant, in dina in timp ti ica), Lucrdnd 5i interpretand corect, putem diferentia afectiunile acute (titrul Ac creste, de 4 ori, la a doua determinare), convalescenta (titnul Ac este in scddere), bolile cronice (titrul Ac va fi asemit (or in 2 determingri suecesive). 2.2.2. in diagnosticul imunobiologic studiem, de exemplu, react de un anumit Ag. Intradermoreactia la tuberculin’ (IDR eu PPD/ histoplasmina, candidina ete., reprezinté exemple in acest sens. Tehnica IDR este similard, lerivat proteie purificat), dar, in functic de Ag inoculat/mecanismul implicat, interpretarea se face diferit.ee 3. Prelevarea si transportul produselor patologice Recoltarea (prelevarea) si transportl p.p. este 0 etapa esenglala. Existd o serie de regul ‘care, Fespectate riguros, permit cbjinerea rezultatclor dg. si vindecarea pacientului 34. Recoltarea p.p. * recoltarea si stabilirea modului de transport trebuie si fie ficuti de med: © Prclevarea p.p. trebuie 58 aibi loc inainte ca pacientul 58 primeascd antibiotice sau chimioterapice (nerespectarea acestei reguli, foarte frecventd din picate, constiuie o Problema semnificativa in diagnostic si pete selestia de microorganisme rezisente: chiar si in cazul unei boli grave, ameninjatoare de viald, este suficient timp pentru recoltarea pp. inainte de administrarea medicamentului): * ‘eeoltarea si transportal pp. trebuie si se realizeze cat mai rapid, in momental ‘optim (ex. ‘isonul si accesul febril .dicteazA” recoltarea singelui pentru hemocultura); * Produsul patologic din care am putea izola agentul etiologic poate fi reprezentat deo Seeretic de la nivelul porti de intrare (ex. secretie nazali/faringiand in diferie cau in infectille stafilococice), un produs de la nivetul cailor de eliminare din organism (ex. urind in infectiile tractului urinar/ITU) ete: * din pp. se vor preleva fragmentele sau pirfile reprezentative, din care ave cea mai mare sansiide izolare a germenilor (ex. zonele eu mucus si puro, din materiie fecale); * trebuic si recoltim o cantitate de p.p. suficientt pentru efectuarca diagnosticului, in Condit de asepsie (nu trebuie infectat pacientul, nu trebuie sine infectim, na trebuie si contaminam p.p.) respectind precautiunile universale. Aceste regu este bine si fic cunoscute cel putin de tof cei care formeaz4 comunitatea din SStemul sanitar, dar, unele dintre recomanditi sunt usor de tnfeles $i de aplicat chiar side persoanele fird o pregatire medicali. Mai trebuie subliniat ed: * instrumentele pentru recoliare trebuie si fic sterile si adeevate tipului de recoltare fectuata (ex. tampon cu alginat de calciu si nu cu vata pentru recoliarea de secretii in eare S€ presupune prezenta Bordetella pertussis); * recipientele pentru recoltare gi transport trebuie si fie marcate ‘corespunzator, iar datele de ‘lentficare si fic riguros consemnate in registelsstem yelectronic”, formulae si buletine 4 analizi pentru a evita erori care pot fi dramatice (este cunoscut exemplul unui transplant de organe de la un pacient HIV po: ', in lialia, 2007, situatie care a fost identificatd numai dups ce transplantul a avut loc ta tei receptor entra c& pe buletinul de analiza a aparut HIV negativ”, printr-o eroare de notificare): 23.2. Transportul p.p. Produsele patologice trebuie sa ajunga in laborator in cel mai scurt timp posibil. Daca in anumite situatii (microorganismului nu rezisti in mediul exterior) recomandim recoltarea $i prelucrarea p.p. “la patul boinavului”, pentru foarte multe dintre p.p. se poate accepta un timp de transport de 1-2 ore Exist® unele posibilititi de jconservare” (la rece, mentinut la temperatura de -+4°C, folosirea_mediilor de transport, ex. Cary Blair etc.). 3.3. Exemple de recoltare (ransport pentru céteva p.p. 1. Exsudatele otice sau nazale + pacientul st pe scaun, cu fata spre sursa de lumina (preferabil lumina natural; + utilizdim tampoane cu vat (1 tampon pentru frotiu, 1 tampon pentru instimantare); + tamponul se incarca bine ou p.p. iar prelucrarea trebuic ficutd imediat; daci nu este posil 5.5.2. Exsudatul faringian * se recolteaza preferabil dimineafa (pacientul nu minane I, folosim un mediu de transport. nu bea, nu se cliteste, nu se spali pe dinfi); sti pe scaun, cu fata spre sursa de lumina si gatul in ugoarl extensie + neasezim putin lateral fad de pacient (ca sii nu fim infectati gi chiar gi in aceste condit trebuie si purtim mased gi ochelar * apasim baza limbii, examinam faringete posterior, pilic , amigdalele si recoltam secretia (f’rd a atinge baza limbii sau palatul moale), in special din zonele cu puroi; utilizam tampoane cu vat& obigauite (folosim 1 tampon pentru frotia gi 1 tampon pentru cultivare); + cel mai bine utilizim p.p. imediat, in cel mult 1-3 ore (sau folosim mediu de transport) 3.3.3, Sputa * sputa, recoltata pe cai naturale”, dupa tuse si expectoratie, este un p.p. contaminat; * pp. care permit evitarea contaminirii orofaringiane sunt aspiratul transtraheal, transtoracic si bronhoscopic (prin cateter protejat, lavaj bronhoalveolar, biopsie transbronsici, biopsie pulmonari pe torace deschis ete); se pot face si hemocultu + sputa ramane un p.p. frecvent recoltat; pacientul trebuie si ineleagi diferenta dintre "a expectora" si "a tuyi si scuipa’; Inaintea recoltirii se recomanda periajul dinfilor, clitisea gurii si gargara cu solutie salina fiziologica; * dacd proba este in principal din saliva, trebuie si solicitim imediat prelevarea unei noi probe (ex. mucopunilenti, in cantitate de 2-3 ml, cel putin); p.p. ar trebui preluerat in maxim 1-2 ore (nu se recomanda utilizarea mediilor de transport). B3.3.4. Purviul Puroiul poate fi recoltat cu ansa bacteriologic’, pipeta Pasteur, prin biopsiere etc., sau, Prin punctie si aspirare (folosim tampoane de vat numai daci nu exista alternative de” cu dop prin care nu trece oxigenul; ‘ransportul catre Taborator se va realiza utilizind medii de transport sau containere speciale (pentru asigurarea anaerobiozei); pp. trebuie s& fie prelucrat in maxim 1-2 ore, 3.5. Materiile fecate in male dintre infeejile enterobacteriene, cu sindrom diareic, utlizim coprocultura: se pot recolta seaunul emis spontan (1. ‘ntrun container din material plastic de unica intrebuinjare; utlizim pentru prelevare Tingurita recoltorului alegand fragmente mucopurulente, portiuni cu singe cte., ia cantitate de circa 1 gram, suspensionat in mediul de transport), tampon: reetal (in cazul unei Infectil cronice cu Shigella spp., atunei eind suspicionsim portajul de Shigella spp. sau Salmonella spp.) sou putem wiliza sonda Nelaton (cad urmarim recotarea pip. de la nivelul colonutui sigmoid); in cazul in care p.p. nu poate fi prelucrat imediat sau in maxim 1 or utilizim mediul de transport (Cary-Bl ) sau transportul la rece (#4°C); se asiguri ‘terobacterilor patogene timp de 24-48 de ore, inhibénd in acclayi timp multipticarea Mlorei de asociaie; in suspicionarea V. cholerae, apa peptonad alcalina este in acelasi timp mediu de transport si mediu de imbogistire. 3.3.6. Urina colonizarea mictobiani a uret distale explicd motivul pentra care de regula realizim wrocultura cantitativa; atunci cdnd demonstr’im prezenta a 10° bacteri/ml, este 0 infectie a tractuluj urinar (ITU) in aproximativ 80% dintre cazuris acd nu putem recolia prima uring de dimineati, asteptim 3-4 ore dupa mictiune: ecoltarea se realizeaz dupa igicna organelor genitale si a perineului, intr-un spatiu Sorespanzitor, in apropiere de laborator; nu recomand recoltarea urinei la domiciliu (pot cexista erori de recoltare iar prefungirea timpului de transport va conduece la multiplicarea bacteriilor); reeolldm urina “din mijlocul jetului” (prin mictiune se elimina circa 100 ml urina, indepirtind o parte a germenilor de la nivetul uretrei distale, apoi se recoltear 20-50 mt uring in recipient steril, dupa care micfiunea continu, exist gi alte tehnici de recoltare (ex. punctie si aspiratie suprapubian); 4dupa recoltare, in cazul in care urina nu este prelucrata imediat (in cel mult 30 de pp. trebusie menfinut Ia temperatura frigiderului iar transportul trebuie realizat la 44°C. 3.3.7. Sangele se recomandi recoltarea a minim 2, preferabil 3 probe de singe, in momente diferite, pe parcursul a 24 de ore; deoarece numarul de unitati formatoare de colonii (UFCYml de sdnge este redus, trebuie s& recoltim un volum de singe adecvat (cirea 20 ml de singe la adulti si 1-5 ml de singe Ja nou-nascuti, sugari si copii mici): in singe pot exista factori antimicrobieni (diminuzim impactul acestora prin diluarea 1/10 a sfingelui cultivat in raport cu yolumul mediului de cultura); folosim medi de cultura lichide, imbogat 5.3.8. Lichidul cefalo-rahidian , In conditit de incubare potrivite. se recoltea7 in cazul prezentei unui sindrom meningean; suspiciunea poate fi ficuta si de un student bine pregitit sau de un tindr medic, dar examenul trebuie ficut si de medicul de specialitate (boli infectioase, neurologic etc); recoltarea se face la patul bolnavului de cexemplu prin punctic lombard tn conditii de stricta asepsie: recoltam 5-10 ml LCR in 2-3 tuburi sterile (2 tuburi vor fi supuse centrifugacii iar din al 3- Jea tub realizam teste biochimice): LCR trebuie pretucrat imediat, prelucrarea p.p. trebuie si ineeapi “la patul bolnavului dact transportul nu poate fi evitat, trebuie si se fact foarte rapid, la o temperatura apropiata de temperatura corpului uman (nu ka+4°C). 3. 9. Secretiile recoltate de Ia nivelul aparatului genital ‘in cazul secretiei uretrale, la birbat recoltarea p.p. trebuie si se fact dimineata, inainte de mictiune, sau la cel putin 2 ore dupa aceasta; sunt necesare tampoane de vati sterile (un tampon pentru examenul microscopic si al doilca pentru cultivare); se observa penisul si meatul urinar precum gi dact exist secrefie uretrala; daca exista secretie uretrala, aceasta este revoltati cu tamponul; in cazul in care nu se evidentiazA spontan secre(ia uretral in mod, cu mana protejati de o minus, exprimim uretra utilizand degetul mare si indexul si recolttim secretia care apare; daca nici aga nu putem objine p.p. recurgem la recoltarea intrauretrali; sunt necesare tampoanc de dimensiuni mai mici (din alginat de calciu sau dacron); dup: roducerea blanda (circa 2 centimetsi, cw rotire intrauretral) a primului tampon, al doilea tampon va fi inserat cu aproximativ | centimetru mai profund;In cazul secretiilor cervicale, la femei Tecoltarea se face preferabil in primele 10 zile dupa ciclu, pe masa ginecologied, dup introducerea valvelor si examinarea vizuala a vaginului si colului uterin; daca se remarca © seerefie purulent, cu ajutorul unor comprese sterile se indeptirteaz’ secrefia de la nivelui colului extern; folosim 3 tampoane sterile introduse gi rotite ugor 1-2 centimett colulutcrin @ dintre tampoane le transfer’m pe frotiui, al treilea pentru culivare); in suspiciunea de gonoree se recomands cultivarea imediat dupa recoliare pe mediul de ulturd inedlzit la 37°C; in cazul in care acest lucru nu se poate realiza, tamponul cu Pp. va fi transmis laboratorului in mediu de transport (ex. mediul Stuart pentra Neieseria spnorhoeae sau alte variante pentru Chlamydia spp. sau Mycoplasma spp) 33.10. Diferite pp. recottate in suspiciunea unor infectii fungice in micozele cutanate superficiale, dupa antiseptizarea leziunii eu alcool! medicinel (70°) raclam tegumentul si utilizim pentru examinare scuamele produsc; impachetim p.p. in hartie sterila care se introduce into cutie Petri si se trimite pentr: relucrare si examinare in laborator (In maxim 48 de ore); im micozele profunde, in functie de localizare, recollim pp. gi il transmitem citre laborator avind grija sa prevenim deshidratarea produsului; Se recomandéprelucrarea si examinarea imediat& (unii fungi sunt fragili; daci Tecomandarea nu poate fi respectati, adiugim penicilina, streptomicind si cloramfenicol Pentru inhibarea multiplicarii bacteriene gi menginem p.p. la-¥4°C.4. Preparate microscopice, frotiuri si principalele coloratii utilizate in microbiologie. Examenul microscopic. Microorganismele au dimensiuni foarte mici (de ordinul micronilor); necesito mi ‘cel putin 900-1.000x. Este necesar si pregitim diferite preparate mieroscopice. 4.1. Preparate mieroscopice proaspete (Intre lama si lameta) Folosim lame si lamele noi. Dupa uscarea si degresarea lamelor (prin flambare, trecdnd Jama de citeva ori prin flacra becului Bunsen aprins), depunem pe lami o picdtura din produsul care urmeariia fi studiat: + dact pip. are consistent lichidiand (ex. urind, materii focale, LCR, serozitate din sancru ete) il utilizim ca atare (putem adduga A.M., lugol, nigrozina etc); ‘© daci vrem sa verificam mobilitatea microorganismelor dintr-o colonie, descarcam o ans din colonie intr-o picaturd de solutie salina fiziologic’ si privim la microscop; ‘+ daca pp. este recoltat intr-o suspiciune de micoza, pe lama de microseop vom depune © piciturd dintr-o solutie 10-20% KOH-glicerol in care desciircaim isperstim p.p.s * daci yrem Si studiem aspectul fungilor filamentosi (mucegaiuri) dintr- colonie, depunem pe lama o picdtura de solutie lactofenol-albastru coton in care vorn descarca un fragment din periferia coloniei respective Acoperim picitura cu o lameli si presim usor lamela pentru a elimina eventualete bule de aer. in cazul p.p. recoltat intr-o suspiciune de micoz’ superficial’, incAlzim ugor preparatul prin trecere cu griji, de 2-3 ori, pe deasupra flacirii becului. Dac& vrem si studiem aspectul fungilor filamentosi (mucegaiuri) dints-o colonie, nu trebuie si miycdm sau s& presi lamela, jin microscopia optica (camp luminos) agezam preparatul pe platina microscopului gi examinim initial cu obiectivul 10x, apoi cu obiectivul 20x sau 40x. 4.2, Rrotiuri (preparate fixate si colorate) Putem realiza frotiuri din p.p. sau din culturi (colonii sau bulion). Frotiul trebuie bine fntins, tn strat subtire (preferabil un igur strat). Trebuie si folosim lame noi uscate 5) degresate, ca mai sus, + Frotiuri din p.p. cu consistent lichida sau din culturi in mediu de culturd lichid ‘+ flambiim lama gi 0 ajezim cu partea flambala in sus; sterilizzim ansa bacteriologica si asteptim si se riceasca; prelevaim aseptic p.p/cultura si depunem in centrul lamei; ‘© intindem prin migcari de “hasurare”, pe axul lung al lamei p.p,, in strat cat mai subtire, {rd a ne apropia de marginile lamei; 17+ Tisim lama si se usuce lingi becul de gaz (nu grabim uscarea); * fixim frotul, de ex. prin caldura - trecem frotiul prin acini (eu partea ‘opus frotiului), de céteva ori; frotiul fixat es gata pentra colorare, * Frotiuritor din p.p.cu consistent solid sau din culturi in media de cultura solid © flambam lama si o asezim cu partea flambats in sus; depunem in centrul lamei o Plcaturd de solute salind ficiologicd sau apa distlat; sterlizém ansa hacteriologica si asteptim si se riceaset; preleviim aseptic p.p/un fragment din colonie si depunem Produsul in picitura de fluid de pe lama; omogenizam foarte bine; * intindem prin migcari de “hasurare”, pe axul hung al lamei p.p., in strat ct mai subjire, fara. ane apropia de marginile lamei, intindem, uscim, fixtim. 4.3. Colorarea frotiarilor Existi foarte numeroase metode de colorare, dintre acestea voi Prezenta o parte. in vederea coloririi avem © trusi pentru colorare (stativ de colorare, coloranti, apa istilata Pentru spilare, stativ de uscare). Pentru colorarea frotiurilor din produs Patologie folosim el mai Irecvent coloratile cu A. M/Giemsa, Gram $i dupa caz, Ziehl-Neclsen, Putem folos si alte colorai (ex. coloratia Gimenez pentra depistarearickeitiilor sau coloratia cw albastra de ‘oluidina pentru evidentierea Prewnoeystis carinii elc,). 43.1. Coloratia cu albastra de metilen * acoperim frotiul cu solufie A.M., 3-4 minute: spalim eu apa distilata, * ajezim frotiul in stativ pentru uscare: * €xaminam la microscop, notim observatiile, interpretim, 43.2. Colorajia Giemsa * fixarea frotiului nu se face ,la cald™ ci cu alcool metilic: scurgem lama gi asteptim vaporarea alcoolului; acoperim fotiul cu solujie May-Griinwald pentra 3 minute: * inclindm lama si scurgem solutia coloranta (care are gi rl fixator); * acoperim frotiul cu solute Giemsa, pentry 10 minute; spalam cu tampon fosfat: * asezim frotiul in stativ pentru uscare; * examindm la microscop. notim observaiiile, interpretim 4.3.3. Coloratia + diluam fuesina (1/10); * acoperim frotiul cu violet de metil, 1-3 minute; indepartim colorantul: mute; indepartm lugolul Gram * acoperim frotiul cu lugol (fixator), 1-3 18* scoperim frotiul cu un amestec de alcool-acetonai (1 parte acetona/3 parti alcool de 96"), sapid, 7-8 secunde: spalim insistent cu apa distilat © acoperim frotiul cu fucsina diluat 1/10 pentru 1 minut; spakim cu apa distilati; + 2sezim frotiul in stativ pentru uscare; + examiniim la microscop, notim observat 434. + interpretim, oloratia Ziehl-Neelsen Este 0 coloratie utilé in identificarea prezentei de bacili acid-alcool rezistenti (BAAR): + punem frotiul uscat si fixat pe un suport situat deasupra tivitei de colorare: acoperim ‘complet lama cu fuesin’ bazic’ nedilnatt (filtrati proaspit); + trecem beeul de gaz. aprins pe sub lama acoperiti de fucsini, pani la emiterea de vaporis adiugim colorant, Ia nevoic; pe parcursul a 10 minute repetim de 3 ori operatia de {nealzire a lamei pana la emiterea de vapori; spalam insistent cu apa distilata; + adaugim amestecul decolorant acid-alccol (3 ml acid clothidric concentrat / 97 ml alcool jc 90.95%), 2-3 minute; spilim cu api distilati; ‘+ recolorim cu albastra de metilen, 1 minut; spilkim cu opa distila + a3ezim frotiul in stativ pontra uscare; ‘* examindm la microscop, notim observatiile, interpreta. 4.35. Coloratii fuorescente Existii mai muite variante, inclusiv coloratii in care utilizim Ac marcati fluorescent. Spre ‘exemplu, .coloratia fluorescent” cu auramina O este utiki in vizualizarea BAAR + colorim cu solutic de auramini © (amestee de auraminé O, aleool etilic, fenol, apis distilata), timp de 15 minute; spalam cu apa distilatz, + decolorim cu amestec de acid-alcool, timp de 5 minute; spiilim cu api distilati + .contracolorim” cu solutie de permanganat de potasiu, timp de 2 minute; + spalim cu api distilata; © asezim frotiul in stativ pentru uscar ‘+ examinam la microscop, notim observatiile, interpretim. In continuare prezint microscopului optic (in cmp luminos). Vor fi prezentate in cele ce urmeazii cdteva inform: privind elementele care pot fi observate in cursul examindrii microscopice. 4.4, Tehnica examenului microscopic Microscopul este strict necesar in diagnostic microbiologic direct Freevent utilizim 19‘microscopul optic (existé si microscopia eu fond negru, microscopia cu contrast de fas sau ‘microscopia cu luorescenta, pentru care ayem nevoie de.o camer’ obscura), 44.1. Microscopal optic; microscopia in emp luminos Micrescopul optic fonmeaza imagini virtuale, matrite si risturnate ale objectului eu ajutorul Uunui sistem de lentile obiectiv si de lentil ocular. Distanta minima dintre dou puncte ale Linul obieet care mai pot fi vizute separat unul de celalalt prin microseop respect o formula, in functie de lungimea de undi a radiatici folosite, #4 care mai pitrund in obiectiv. Pentru a micsora aceasti distanté (pentru imbundtai Performanfele microseoputui) putem utiliza radiafi cu hangime de unda mai mica (ex radiat ultraviolet) sau un mediu (intre obiect si obiectiv) cu un indice de refrac 11 mm, in jurul microcomprimatului cu 0.1 U bacitracin, ~ Streptococeus pyogenes © Martor negativ ~ Streptococcus agalactiae 6.5.3. Testul bilolizei (Neufeld) i (Strepiovoceus pneumoniae) capsulati sunt lizati tn prezenta bile: sau sérurilor biliare prin activarea unei enzime autolitice. Materiale necesare: colonii izolate, a-hemolitice, solutie de dezoxicolat de sodiu 10%, ie salin’ izoton’, apa distilata ‘Tebniea de Iveru: Preparim in solutie salini fiziologic’ o suspensie pomind de la coloniile a-hemolitice izolate. Repartizaim cate 0,5 ml din suspensie in 2 eprubete de sticla. in primul tub adaugém 0,5 ml dezoxicolat de sodiu iar in al doilea tub adaugim 0,5 mi apa . Interpretare: * aparitia unei zone de inhibitic cu diametral mai mare de 14 mm, semnificd un test pozitiv: © absenta inhibitiei in jurul discului semnifica un test negativ Control de ealitate: 39* Martor pozitiv — Streptococcus pneumoniae + Martor negativ ~ Sereptococcus viridans, ea a Testele prezentate reprezint doar cfteva exemple. Testele fenotipice utilizabile in iagnesticul de laborator microbiologic sunt mult mai numeroas, Intelegerea principiilor si mai ales a necesiti controlului intern de calitate, necesar Pentru orice test $i in orice laborator, sunt foarte utile. 7. Testarea sensibi itatii/rezistentei la antibiotice sic ioterapice ‘Testarea sensibilititii la medicamentele antimicrobiene este strict necesara datorita aparitici si extinderii rezistentei microorganismelor la aceste medicamente Deoarece intre rezultatele testi fectul terapeutic in vivo pot exista anumite diferente, metodele de testare a sensibi a. metode de testare a sensibi b. metode in vivo, care tin cont de relatia agent terapeutic-infectie. 7-1. Metode de testare a sensibilititii in vitro Anvibiogramma reprezinti metoda de laborator prin care se apreciava sensibilitatea la snubiorce a germenilor recoltati de la bolnavii cu infect bacteriene, dupa cuttivare pe medi Speciale (ex. agar Mueller-Hinton). Pentru testaretrebuie sd folesim culturi pure. Exists * Tehnici calitative (antibiograma difuwimetrica comuni, antibiograma difzimetrica comparativa, antibiograma difuzimetricd standardizatd etc) si © Tehnici eantit ve (metoca dilutiilor in mediu lichid, metoda dilutitor in agar, metoda mmicroditutiilor in agar, metoda “punetelor de rupturi”, testul “ET, metode si sisteme comerciale, automatizate, de testare ete.) TALL. Antibiograma metric comuna Din punet de vedere tehnic insimantim germenul de testat pe mediul solid (ex. agar Mueller-Hinton) turnat in plici Petri. insimantarea se poate realiza prin “inundarea” plicit ‘urmald de aspirarea (aseptic) excesului de inocul (exists i alte variant), Dupa circa 20 ‘minute se aplici microcomprimatele in care sunt incorporate antibiotice. Aplicarea mcrocomprimatclor se poate face cu sjutorul unci pense, sau cu ajutorul unui aplicater “automat” (minim 30 mm distanyétntre cle $i minim 15 mm de marginea plicii; 5 antibiotice diferite pentru o placa Petri cu diametrul de 9 cm). Microcomprimatele trebuie si. vind in contact perfect cu medial (le prestim usor, dupa caz). Dupi ined 20 minute, ineubim phi 40peste noapte in termostat, la 28° (pentru fungi) sau Ja 35-37°C (pentru majoritatea bacteriilor). aeari in mediw si realizeaz’i zone de inhi Antibioticul eliberat din microcomprimat care coloniile microbiene nu se dezvolti (daci populatia bacteriand este sensibili). Cu cat Giametrul zonei de i este mai mare, cu atét germenul va fi considerat mai sensibil. Daci in interiorul zonei de inhibitie (indiferent de valoarea diametrului) se dezvolta colonii (mutangi rezisten{i”), germenul va fi considerat rezistent, Aceasti metod’, cu toate ca este folosita pe scara larga in laboratoare, permite de fapt numai climinarea antibioticelor complet inactive si eventual selectionarea antibioticelor foarte active (tehnica nu este standardizati). 7.1.2. Antibiograma difazimetries comparativa (Stokes, Bals) Se efectucazi pentru microorganismul de testat in paralel cu un microorganism de referinta, din aceeasi specie (sau o specie asemiinitoare). Spre exemplu, pentru coeii gram pozitivi putem alege pentra comparatic 0 tulpina de Staphylococcus spp. Tulpina de refering’ are o sensibilitate cunoscuti fa antibioticele pe care fe utitizam (cuncastem inclusiv CMI). Pe o plac de forma unui patrat ( ,imparfita” in 3 zone egale) inoculim in treimea medie microorganismul de referinti iar in treimile exterioare 2 microorganisme diferite, pentru a fi testate. Incculul trebuie si fie astfel realizat incit sti conduc la aparifia dupa incubare a unor colonii foarte apropiate, dar care si nu fie confluente, Plasim microcomprimatele cu ‘amtibiotive pe liniile de demarcatie dintre culturi. Incubiim peste noapte la 35-37°C. Rezultatele se exprima cu termenii: “sensibil”, “intermediar”, “rezistent”, in functie de diametril zonelor de inhibitie a mattiplicarii celor doi germeni, fata de acelasi antibiotic (jumatitile de cere se exarmineazi comparativ). Putem aprecia CMI (vezi si in continuare) 7.1.3. Antibiograma difurimetrick standardizati (Kirby-Bauer) ‘Tehnic, procedim avemiinator cu ceca ce am mentionat 1a prima metoda, dar foarte importanta este standardizarea. Aceasta este singura metoda difwzimetrica recunoscutd pe plan ional, rezultatele sunt reproductibile si corelabile intre laboratoare, Elementele necesare standardizrii sunt: + mediul (ex. agar Mueller-Hinton), cu elemente minerale ,specifice” testirii unor anumite mieroorganisme (ex. Mg” gi Ca’’, Pseudomonas aeruginosa, pentru sensibilitatea Is szide); plT-ul mediului (freevent intre 7, aminog 4); cu suplimente nutritive procurate comercial; grosimea mediului trebuie si fie de 4mm; + inoculal trebuie si aiba o turbiditate corespunzitoare standardalui 0,5 McFarland (circa 10° unititi formatoare de colonii/ ml) in multe dintre cazuri; + timpul de incubare, atmosfera de incubare; + concentrafia substantelor din microcomprimate si dimensiunea acestora (6 mm diametru): 41* alegerea substantelor antimicrobiene pentru care se face testarea: * uuilizarca tulpinilor de referinta pentru controlul de calitate; merPretarea rezulatelor (rezultatul obfinut se compara rezultatele din tabelele ete: Nu permit aprecierea CMI sau CMB. Metoda dil Oferd informatii cu privire la CMI (concentratia minim inhibitorie) pentru fiecare 7. ilor in mediu lichid antibiotic stadiat. CMI reprezinté cea mai mica concentratie de agent antimicrobian, in micrograme / ml, cu actiune bacteriostatic supra germenuln testat Pentru fiecare antibiotic testat utlizim mai multe tuburi cu bulion Mueller-Hinton Concentra eserescdnde (dilutilbinare) pomind spre ex. de la 64 micrograme / ml s pnd a 9125 micrograme / mi, in total 9 tubur, plas 2 tuburi martor, fi antibiotic (1 ml'infeware {ub In final). Prepardm inoculul standardizatturbidimetrc si inceultim toate cele 11 tuburi, cu te | ml de inocul, Agitim pentru @ omogeniza, Incubai cele 9 tuburi cu antibiotice $i 1 tub Imartor timp de 16-20 ore la 35-37°C iar al doilea tub martor il pas fim Ia frigider, Pentru controll ds ealitate milizam si un sir de tuburi pe care le inoculéim cu o tulpina de refering corespunzitoare. in ziua urmaloare citim si interpretiim. Deoarece am utilizat 0 cantitate de inocul egald cu cantitatea de medi, concentratia final de antibiotic se va Injuméitati (de ex. in tubul in care dilutia initial a fost de 64 Hg / ml, dilutia final va fi 32 pg / ml). in tubul ‘martor mentinut la +4°C nu trebuie sai existe erestere tn timp ce in tubul martor la 35-37°C cresterea trebuie sa fle evidentiabild. In tuburile inoculate cu tulpina de referinta trebuie si ‘avem rezullatele corespunzatoare datelor oferite de producitor, in tuburile test. ultima dilutie care a Inhibat dezvoltarea microorganismului ~ CMI, Se considera (cu diferente intre speci Uiferite) ci microorganismele in cazul carora CMI este <2 ug / ml pot fi eficient inhibate de cdtre antibioticul respectiv si in vivo, 7.15. Determinarea CMB (concentratia minim’ bactericid’) ‘vem reaultatul CML, Folosim ca sursi de inocul tuburle in care dezvoltarea microbiand a fost inhibata. Impartim o placa Petri (agar Mueller-Hinton) in sectoare (de ex. 4 sectoare daca inhibitia a ayut loc in ultimele 4 tuburi). Tnsémantam (aseptic) din fiecare tub firs erestere microbian§, in sectorul de placd. corespunzitor. Incubim 16-18 ore fa 35-37°C. CMB Corespunde sitimei concentra! de antibiotic care a distrus microorganismele insimémate (Sectoare de placa fird apartia culturif). Se considers ci antibioticul va fi eficient in vivo daca le antibiotic care sa depaseascd de 4-8 ori CMR, Determinarea CMI si CMB se face pentru aprecierea Cficacititii antimicrobiene unui jn serul pacientului se pot atinge concentrati antibiotic asupra unei tulpini bacteriene. in ‘ratamentul infectiilor severe (ex, endocardite, ‘meningite, septicemii) si Ia imunodeprimati, efectuarea acestei metode este indispensabila, 427.1.6. Determii E test reprezinta 0 metoda de testare in vitro; se ascamana metodei dilutiei in agar; este yrea CMI prin testul E (E test) mai usor de utilizat; permite determinarea valorii CMI (dar are un cost mai ridicat). Preparim un inocul bacterian standardizat si il cultivim in pkici Petri (in functie de numarul de medicaments antimicrobiene testate; cite plac pentru maxim dow medisamente teste), Benzile Fhest confin un gradient de medicament. Aplicim bando dup Insindnpe. in ince 0 antibiotic, gradientul acoperd un gir continu de concentra de ex. intre 0,002 si 32 ug/ml. Incub’m 16-18 ore la 35-37°C si dacé bacteria este sensibila, se formeaz 0 zonii eliptica de inhibitie (E vine de la epsilon). Valoarea CMI se citeste acolo unde cresterea bacterian’ intersecteaz banda Etest ‘Tehnica de Iucru: + scoutem plicile cu mediul de culturd si benzile Etest din congelator, le lisim la temperatura camerei pentru echilibrare termica circa 20 minute; * scoatem benzile din folie cu ajutorul unei pensete si le punem in plici Petri sterile: benzile nefolosite le conservim in tuburi, impreun’ cu o substanfi desicant’ si introducem tuburile in congelator, la -20° C; © dupa obtinerea incculului standard si dupa ce verificim daca mediul de cultura nu mai prezinta condens, transferim inoculul pe mediu (cu un tampon) avand grija sa acoperim complet suprafata mediului; ‘© Tisim placa timp de circa 10 minute, inainte de a aplica henzile Ftest; + Inim cu griji o band’ si o aplicim banda pe suprafata mediului de cultura, cu capaitul ce contine cor entratia cea i mare aproape de marginca plicii (putem aplica 2 benzi Etes intr-o pla de 90 mm si maxim 6 benzi di Tucram cu placi cu diametrul de 150 mm); + banda trebuie 88 fie in contact perfect ca suprafata mediului; daci am gresit in aplicarea benzii nu o deplasim in alta pozitie (eliberarea medicamentului are Joc imediat, Ia fel ca gi {n cazull microcomprimatelor de la antibiograr ); ineubaim de ex. la 35-37°C, 16-18 ore; Inferpretarea rezaltatelor: + putem citi rezultatul atunci cind cultura este conflventa sau aproape confluent; © valoarea CMI corespunde liniutei in care cresterea bacteriand intersecteazd banda Btest: pe _geloz4-sfinge citim zona de inhibitie a eresterii bacteriene nu zona de inhibitie a hemolizei: + daca nu apare nici 0 zona de inhibi , Faportim valoarea CMI ca fiind mai mare decdit cea mai mare concentratie notati pe banda, daci zona de inhibitic nu intersecteaza banda, valoarea CMI este mai mica dec&t concentrajia cea mai seZzuta menjionata pe banda; 43‘aportim rezultatul obfinut pentru tulpina studiatS dup ce verificdim revultatul obfinut Pentru tulpina de refcringa (control de calitate): 7.2, Metode de testare a sen: ivo $i aprecierea efficient terapeutice determinarea NEI (nivel de eficiena inhibitor) pentra ser, LCR sau alte unors Cultivares se face pe medit selective (ex, medi cu vancomicina, colistin,trimetoprimn si nistatin) daca pp, este contaminat, Recomandim cultivarea atit pe medii selective cat gi pe Imedil neselective, in atmosfert de 3-10% COp, la 35-37°C. Cotoniile apar in 24-48 de ore Sunt colonii de tip S, de 0,5-1 mm, sau cotonii de tip M. 4. Identificarea rezulta in urma analizei caracterelor: * Morfotinctoriale: coci gram-negativi, in diplo, eventual inconjurati deo. structura capsular comun’; * De cultura: coloniile sunt de tip $ sau M; * Biochimice: metabolizeaza diferitl earbohidrati (ex. glucoza) si produc citocrom-oxidara (estul oxidazel este test cheie in idemtficare);testul catalazei este intens pocitiv; + Antigeni * Altor caractere (de ex. studiate prin metode ale biologiei molecular), 5: Antibiograma este recomandatit yi se realizeaza de obicei prin metode difwimetrice. Este necesara testarea producerii de fs-lactamazi, 6212. Diagnosticul de laborator in infectiile produse de enterobacteri Familia Ererobacteriaceae cuprinde un mare numa de genuri 34 numeroase specii (peste 2000, daca sunt uate In considerare speciile din genul Salmoneffa). Familia include germeni care se pot multiplica pe medii simple, aerobi facultativ anaerobi, utilizeaz’ glueoza cu sau fird producere de gaz, oxidazo-negativi, catalazo-pozitivi. Formeaza colonii de tip $ (R in cazul culturilor “vechi”) sau M (pentru speciile apsulate), pot fermenta lactoza (ex Escherichia coli, Klebsiella spp.) sau sunt lactozi negativi (ex. Salmonella spp., Shigella spp.). Pentru izolare puter folosi medii selective si selectivo-diferenfiale. Exist medii cu selectivitate mai redusd (ex. Mac Conkey), medii cu selectivitate medic (ex. ADCL) si medi cu selectivitate inalta (ex. Wilson-Blair). Caracterele biochimice sunt esentiale pentru identificare. Studiul caracterelor Ag, prin reactii Ag-Ac este de asemenea foarte util (toate enterobacteriile au AgO, cele mobile au AgHL, enterobacteriile capsulate au AgK, Salmonella typhi prezintin plus AgVi ete). 12.1. Diagnosticul de laborator in infec! bu le produse de Escherichia coli Genul Escherichia cuprinde de Bs parte germeni comensali. Specia tip este reprezentata therichia coli. Desi cele mai multe tulpini de E. coli sunt saprofite sau conditionat Patogene, exista si tulpini patogene (patotipuri; K. coli enteroagregativ, E.coli enterohemoragic. E. coli enteroinvaziv, E. coli enteropatogen, E. coli enterotoxigen, F. coli aderent difuz). Diagnosticul de laborator este bacteriologie, direct. Diagnosticul de laborator microbiologic in infectiite cu localicare digestivas 1. Recoltarea gi transportul p.p. respecti regulile cunoseute; recoltiim materii fecale, lichid de viirsitur’ etc. Dupii cxaminarca macroscopic’, continu examenul de laborator. Spre ex., daca infectia ar fi produsa de E. colt enterohemoragic (EHEC), am putea vizualiza cele ce urmeaz, Materiile fecale pot avea aspect hemoragic, cu lambouri de mucoasi epiteliali. 2. Nu facem frotiu. Examinam intre fa lamela si am putea vedea hematiilor si PMN 3. Cultivim pe MacConkey eu D-sorbitol (EHEC nu fermenteaz3 sorbitolul, sau il fermenteaza tardi ). Coloniile suspecte, sunt de tip S, 1-3 mm, necolorate (coloniile sorbitol- Povitive au 0 culoare roz). 4, Identificarea se face pe baza: * Caracterelor morfotinctoriale: bacili gram-negativi; ‘* Caracterelor de cultura: colonii de tip S, cu caracterele mentionate mai sus; + Caracterelor biochimice (se examineazi numai acolo unde sunt conditii de biosiguranti, conform irective Europene): fermenteaza glucoza (cu producere de gaz), lactozi- 63Pozitivi, nu fermenteaza (sau fermenteaza tardiv) sorbitolul, nu produe HS, pot produce indo}, sunt ureazat-pozitivi, mobili (exi i tulpini imobile) etc.; * Caracterelor antigeni Prin reaetii de aglutinare sau latex aglutinare (seruti ‘monovatente anti 0157 si anti H17). 3. Antibiograma este recomandaii pentru supravegherea aparitici fenomenului de Tezistenfi la antibjotice si chimioterapice; se realizeaza prin metode difuwzimetrice Diagnosticul in infectiile urinare kn principal se recolteaza urina. in funetie de forma clinic se poate recolta si singe (ex. in Picloneffita acuti) sau chiar si LCR. Discutind recoltarea urine, pe Hingé regulile cunosewe ‘orese si subliniez €8 iniial se realizeazd toaleta locals, Atunci cénd nu se poate recolta Prima urina de dimineat2, trebuie asteptat pentru recoltare 3-4 ore dup mictiune, Daca pp. nu ste prelucrat imediat (in maxim 30 de minute dup& recoltare), trebuie mentinut la ‘emperatura frigiderului iar transpertul tiebuic realizat fa 44°C. Se recoltearA urina “din mijlocul jetului”. Exist si alte tehnici de recoltare, neinvazive sau invazive (punctic gi sspiratie suprapubiand, cateterizare uretrali, cu riscurile respective) Pupil cxamenul macroscopic (ex. urina poate fi tulbure) pregitim un ,sediment urinar” Examiniim preparatul intre lami si lamel; Incerctim si stabilim numeral de bacterit Pe camp ic). diferite. Este de retinut ci facem 0 si respectiv numarul de PMN pe cmp (daci existé leuc Pentru cultivare putem utiliza mai multe me Uuroculturd cantitativa (trebuie si determinim numérul de bacteriiiml de urind). De ex., daca insimangim 0,1 mililitri de ws diluata (ex. 1/1.000), incubsim si dup aparitia coloniilor caleulim numirul de bacterin! inmulfind nr. de coloniicu 10 si cu 1.000, Asta inseamnt a, ‘in conditiile de mai sus, prezenta a 7 colonii inseamni 70.000 bacterii/m, ce seamna uroculturd cantitativa? Avand in vedere cele de mai sus, daca numarul de bacterii/ml este mai mare de 100.000, considerim urocultura ca fiind ozitiva. Lipsa coloniilor sau un numér de maxim 10.000 bacterii/ml, semnifica o uroculturi negativa, Dacl urocultura este pozitive, bacteria izolaut se identifica pe baza caracterelor prezentate anterior si se trateaza conform antibiogramei. 12, Diagnosticul de laborator in infectiile produse de genul Klebsiella Sant enterobacteri imobile, nesporulate. Degradeaca glucoza este degradti cu producere e gaz si fermenteaza Inctoza. Specia tip este Klebsiella pneumoniae (bacili Gram negativi capsulal). Este un microb condiionat patogen. Peate produce TIA de tip infectios, infect ale tractului respirator superior, infecii urinare etc, inclusiv infectii nosocomiale 64Pentru diagnostic, lulim drept exemple situati in cazul pneumonici produse de Klebsiella preunoniae. Diagnosticul integral include clemente clinice, paraclinice si de laborator: diagnosticul bacteriologic permite stabilirea ctiologiei gi tratamentului corespunzitor. 1. Revoltarea i transportul p.p. respect regulile cunoscute (recoltim sputi) Macroscopic, poate avea un aspect mucoid, de culoare rosu inchi eu de coacize”. 2. Examinim microscopic p.p. $i notam prezenta celulelor (cx. macrofage alveolare), cclulelor inflamatorii (PMN) si a bacililor gram negativi, de dimensiuni relatiy mari, eu capsula (halon, vizibil) 3. Cultivam pe medii de culturd obignuite (18-24 ore, 35-37°C) si examinim coloniile izolate, pentra a incepe identificarea. Utilizim medii slab selective (ex. MacConkey) Kiebsiella pneumoniae nu se dezvelta pe medii inalt sclective gi ste partial inhibat’ pe cele moderat selective. K. pneumoniae formeacii colonii lactozi-pozitive, mari, de tip M, cu aspect de “curgere” pe suprafata mediului de cultura (tendinta de confluare). 4, Identificarea microorganismului se face urmarind caracterele: morfotinetoriale: bacili.gram-negativi, dimensiani mari, capsulati, dispusi in lanturi seurte, perechi sau izolaf © de cultura: colonii kaetoza pozitive, de tip M, mari 2-3 mm la 24 de ore, peste 4 mm la 48 ore), bombate, vascoase, cremoase, in “picatur’ de miere", care dau aspectul de “curgere” pe suprafata mediului de cultura, cu tendinta la confluare; = biochimice: glucoz povitiv (cu producer: de gaz), lactozi poziti nu. produce H2S, imobil, ureazd pozitiv, indol negativ, se dezvoltS folosind citratul ca unied sursé de C. ‘© antigenice: utilizim seruri cu Ac cunoscuti pentru identificarea tulpinilor de Kfebsiella, prin aglutinare, coaglutinare sau latex aglutinare (in laboratoare de referint®); © testarea sensibilititii la bacteriofagi etc. 5. Antibiograma este obligatorie si se realizeaza de obicei prin metode difuzimetrice. 12.3. Diagnosticul de laborator in infectiile produse de genul Proteus Genul Proteus este format din germeni foarte pleomorfi, foarte mobili, Gram negativi, aerobi facultativ anaerobi, nu fermenteaza lactoza, produc urcaza. Exist 2 speeti principale, Proteus mirabilis $i Proteus vulgaris. Sunt germeni conditions patogeni. Pot produce TIA de tip infectios, infect ale tractului urinar (ITU), dar chiar si alte infect (‘egumentare, genitale, infectii nosocomiale ete). Discutam diagnosticul de kaborator al ITU. Diagnosticul de laborator microbiologic este bacteriologie, direct 1, Recoltarea gi transportul p.p. se realizeaz aga cum am discutat anterior. Urina poate fi tulbure, purulent’. Transportul trebuie realizat in maxim 30 minute, iar dacd nu e posibil, p.p. 6tebuie transportat “Ia rece” (44°C), 2. Examinarea microseopick a produsului patologic include realizarea Preparatului Proaspit intre Tami gi lamela, din sedimental urinar, Acest tip de examinare este foarte important (usor de realizat, icin, permite observarca unor clemente utile, care orienteazat diagnosticul), Mobi Yea poate fi evaluati. Urmirim numiral de leucocite/edimp. im pe medi de cultura simple. Trebuie s& demonstrdim prezenta a peste 100,000 bacteriiim! de urina. Pe medille simple u7uale, nu se pot obfine colon Wolate; apare fenomenul de inyazie. 4 Identificarea microorganismului se va realiza pe baza mai multor carsctere: * Caractere morfotinctoriale: baci gram-negativi, cu polimorfism (bacili, cocobacili, forme filamentoase de peste 30 jum); + Caractere de cultura: * Fenomenul de invazie (daci insimantim o tulpind la periferia unei pRici Petri cu mediu simplu, cultura se *dezvolé in valuri concentrice”, pe toatl suprafita mediului), © Pe anu medii selective (cu struri biliare), invazia este inhibatd si se obtin colonii izolate, de tip S, lactora negative © Fenomenul “liniei de demarcate” (daci pe o placi eu media solid cultivam 2 tulpini di He; In 2 puncte opuse,tulpinile se vor dezvolta invadand pana in apropierea linii de intalnite, unde se va crea 0 “linie de demarcai * intre cele 2 tulpini); © Fenomenul de “cai * Caractere biochimice: sunt microonganisme lactozo negative (alte earastere biochimice se Pot stadia pe mediile multi test, TSI, MIU ete.), gluco pozitive, produc IS, mobile, sreavd pozitive, se pot dezvolta folosind citratul ca unicd sursi de carbon: Caractere antigen > Antibiograma este obligatorie si se realizeara de obicei prin metode dif imetrice. 12.4. Diagnosticul de laborator in infect Genul Salmonella include bacili gram negativi, mobili eu cili peritrichi, necapsulati, ile produse de genul Salmonella, nesporulati, nu fermenteaza lactoza, produc HS, utilizeaza citratul ca unica sursa de ‘carbon. Pot produce salmoneloze minore (ex. TIA) si salmoneloze majore (ex. febra tifoida). In cazul TlA/enterocolitelor, diagnosticul de laborator este bacteriologic, direct. in cazul afectiunilor sistemice, diagnesticul poate fi bacteriologie si serologic. Diagnosticul de laborator tn nfectite cu tocatizare digestivi |. Recoltarea si transportul p.p. (ex. materii feeale) respect regulile cunoscute. 2. Examiniim microscopic pp, intre lama gi lamela (remareéim Prezenta granulocitelor). 663. Cultivzim pe urmitoarele me de culturé: un mediu hid de imbogitire (bulion selenit) si dous medii sclectivo-diferentiale (MacConkey si ADCL). Dup& 18-24 ore la 35- 37°C, pe mediile solide pot aptirea colonii bacteriene suspecte (Jactozo-negative) din care obtinem cultura pura. Cultura de 18-24 ore din bulion sclenit o repiciim pe medii solide, 4. Identificdm microorganismului pe baza mai multor caractere: + Caractere morfotincioriale: sunt bacili gram-negativi; = Caractere de cultura: produe colonii de tip S, lactoz4-negative (necolorate pe MacConkey: necolorate, cu centrul negra pe ADCL): ‘* Caractere biochimice: fermenteaz glucoza (cu producere de gaz), sunt lactoz-negativi, produc HS si utilizeaza citratul ca unied sursa de carbon; ‘© Caractere antigenice: utilizim seruri inmune cu Ac anti-O si ulterior Ac anti-H (react aghutinare pe lama, respectind protocolul de hueru); + Sensibilitatea la bacteriofagi. sul 5. Antibiograma este recomandati in cazul pacientilor foarte in vérsti, sau inc copiilor foarte mici, prematuri, cu alte boli adiugate 51 penta supravegherea aparitici fenomenului de rezistenta la antibiotice si chimioterapice, Diagnosticul de laborator in febrele enterale (ex. febra tifoida) Diagnosticul cert este repreventat de izolarea si identificarea S. typhi din p.p. Diagnosticul baeteriolegie, direct respect etapele prezenta interior. {in prima siptimana de boul’, p.p. © reprezentat de singe; ulterior putem recolta materi fecale, urind, lichid biliar, miduva hematogeni ete. Daci pp. este reprezentat de materi fecale, respectim ceea ce am prezentat mai sus (exist yi particulari Coloniile de S. typhi pot si nu prezinte centrul de culoare neagra pe ADCL. S. typhi nu produce gaz din glucoza iar HS este in cantitate mic’, Nu foloseste eitratul ca unica sursa de carbon. Pentru identi AgO este necesari 0 inactivare prealabild (termic’). Prezenta AgVi poate crea probleme in identificarea AgO. Lizotipia poate fi foarte utila. Testarca sensibilititii la antibiotice chimioterapice este indicati in toate infectiile produse de S. phi Diagnosticul serologic: sc realizeazi respectind principiile generale. Serodiagnosticul Widal (folosind culturi vii) nu se mai practic astazi. Technica actual parts numele de analiza sericd cantitativa (aglutinare in tuburi). Utilizim serii de tuburi (cate o serie pentru ficcare Ag cunoscut folosit), Utilizdim 6 serii de tuburi pentru a evidentia Ac anti-O (TO - S. wyphi, AO - S. paratyphi A, BO - 8. paratyphi B), si anti-H (d - S. phi, a- S. paratyphi A, b - S. paratyphi B). Pregatim dilutiile, incubiim pentru Ac anti-O timp de 18-20 ore la 52°C si 10 minute la temperatura camerei iar pentru Ac anti-H timp de 2 ore la 52° C si 10 minute la temperatura cametei. Apoi citim reactia. Un titra de 1/250 in cazul Ac anti-O si respectiv oT1/2.500 in eazul Ac ant HH este sugestiv. Cresterea de 4 ori a titrului, la 2 determinari suecesive confirma diagnosticul. in cazul convalescentilor si purtitorilor este recomandata reactia de aglutinare in tuburi pare de 1/40), Pentru identificarea prezen{ei si titrului Ac anti-Vi (ttru m 12.5. Dingnosticul de Iaborator i fectiile produse de genul Shigella {ngonul Shigella exists 4 subgrape: A. Shigella dysenteriae (13 serotipuri), B.S. fleeneri (6 serotiputi), C. S. boyd (18 serotipuri) 54 D. S. some (I serotip eu 2 fare, R iS). Sunt baeili gram negati mobili, nesporulati, necapsulali, aerobi facultativ anacrobi, glucozt Poritivi (Fira producere de gaz), oxidazi negativi, lactoz% negativi. Subgrupcle se pot ‘ferent, de ex. pe baza lermentirii manitei (subgrapul A este maniti negaty) Produc infecti la nivelultractului intestinal. Dizenteria poate aparea dupa ingestia a numai 10-100 bacteri. Shigella spp. poate produce yi toxiinfetitalimentare de tip infectios. Diagnosticul de laborator este bacteriologie (direct si trebuie pus rapid, 1. Recoltarea transportul pp. (materii fecale) respectt regulile cunoscute Macroscopic, mf. pot fi in cantitate mica (mucus, puroi, singe). Transportul trebuie si fe altfel, trebuie si folosim mediul de realizat rapid (recomand insamantarea le patul bolnavul ransport, &x. Cary-Blair). Recoltarea se poate face si cu ajutorul sondei Nelaton, din colonul sigmoiu. 2. Examinarea microscopici a pp, este foarte importanta, Poate oferi un rispuns coneret, Fapid, util, Examinim preparatul intre lami si lameld, initial cu obiectivel 40x. Daca evidentiem numeroase PMN, mecanismul producerii bolii este de tip is faziv, iar daci emaredm un provent de peste 75% YMN, alituri de hemati, acest aspect este sugestiv pentru dizenteria bacteriana 3. Cultivam pe medii slab si moderat selective. Dac& apar colonii lactozs negative, repicdim pe medii multitest (TSI, MIU, MILF). ‘+. Identificarea microorganismului se realizeaza pe baza mai multor caractere: * Caractere morfotinctoriale: sunt bacili Gram-negativi: * Caractere de cultura: produe colonii de tip S, lactaz’ negative, 1-2 mm; ‘© Caractere biochimic: Sunt glucoz’ pozitivi, fir producere de gaz, lactozA negativi, nu produc HDS, imobili, ureaza negativi, indol nega * Caractere antigenice: utili im seruri imune polivalente anti-subgrup sau seruri imune Specifice de tip (reacfii de agtutinare pe lama, conform schemelor de lucru) ‘Testarea sensibility la bacteria (lizotipia) poate fi ulilzati in seop epidemiologic 68ifuzimetric’ standardizati 5. Antibiograma este recomandala. Se realizeaza prin metoda tat in special in Scopul supravegherii aparitiei unor tulpini rezistente cit i pentru stabilrea tratamentului antimicrobian corespunziitor. 12.6. agnosticul de laborator in infectiile produse de genul Yersinia Genu! Yersinia include mai multe speci. Infectit umane pot produce Yersinia pestis (ciumay, ¥, pseudoruberculosis $i Y. enterocolitica. Sunt beeili sau cocobacili gram negativi colorati bipolar. Prezinta pleomortism. Crese pe med mple. Yersiniovele cu poarta de intrare digestiv’ pot avea drept agenti etiologici Y: enterocolitica sau Y, pseudotuberculosis. Diagnosticul de laborator in yersiniozele cu poarti de intrare digestivi este hacteriologie, direct. Pentru manifestiri extra-digestive se poate face si diagnostic serologic. Diagnosticul bacteriologie 1. Recoltarca si transportul pp. (materii fecale), se face conform regulilor prezentate anterior. Se poate folosi mediul de transport Cary-Diair. 2. Examinarea microscopica a p.p. include realizarea unui preparat intre lam’ si lamels ‘Vom evidentia prezenta celulelor inflamatorii. 3. Cultivim pe medii selective clasice (MacConkey, ADCL) sau mediul CIN (cefsulodins, irgasan, novobiosina). Incubiim gi la temperatura camerei (20-30"C). 4, Identificim pe baza caracterelor: ‘* morfotinetori cocobacili sau bacili gram-negativi, pleomorfi; « deculturi: produc colonii de tip S, 1-1,5 mm (2-3 mm dupi 48 ore); = bicchimice: fermenteazi glucoza firk producere de gaz, nu fermenteazA lectova, nu produe HS, sunt imobile la 37°C si mobile la 22" C, nu produc indol, produc ureaza; + antigenice: uilzaim seruri specifice anti-Yersinia (reactii de aglutinare pe lame). e recomands realizarca antibiogramei, prin metoda difuzimetrica standardizat Diagnosticul serologic Diagnosticu! serologic poate fi uti in determinarea etiologiei artritelor reactive, eritemuli nodos sau in cazul allor manifestiri extra-intestinale. Anticorpii apar la circa 4-7 zile de la debutul bolii, ating valoarea maxima dup circa 14 zile si persista cAtcva luni. Se pot practica diferite tehnici, de ex. reactia de aglutinare in tuburi, Un titru mai mare de 1/160 poate avea semnificatie. Se recomanda testarea in dinamica. Trebuie st fie luatz in considerare posibilitatea aparitia unor reactii Incrucisate, datorita existentei unor Ag asemnanatoare la microorganisme din genurile Brucella sau Salmonella. 013. Diagnosticul de Jaborator jin infectiile produse de microorganisme din genurile Vibrio si Pseudomonas 13.1. Diagnosticul de laborator in holers (Vibrio cholerae) Genul Vibrio include mai multe specii. mai bi \e cunescuta specie este Vibrio cholerae (vibrionul holeric), mobil, acrob fecultativ anacrob, oxidaza povitiv, rezistent la pH alealin gi ‘iruri biliare. Produce toxina holeric’ gi respectiy holera, iagnosticul este bacteriologic, direct, Trebuie realizat urgent. 3. Recoliarea si transportul p.p. respect regulile prezentate anterior. Recoltim n fecale sau/si lichid de varsiturd. Materiile fecale sunt apoase, riziforme (ca “apa de ore culoare verzuie, miros fetid, contin mucus. Cel mai bine insimangim rapid. Dac nu putem Ajunge la laborator 1-3 ore folosim mediul de transport Cary-Dlair. Apa peptonatal alealina (DH 9-9,5) poate fi utilizata ea mediu de transport dar 5i ca mediu de imbogatire, 4. Examinim microscopic p.p., in preparatul Intre lama gi lamela (nu frotiuri). Utilizaim obicctivul 40x. Nu se evidentiazi PMIN. Exista vibrioni care prezinti migcari active. 3. Cultivam (direct sau dupa transport) in api peptonat’ alealing (APA). Dupi 6-8 ore la -37°, trecem pe un mediu selecti cu siruri biliare (TCBS si/sau BSA), prelevand de ka Suprafata mediului lichid (unde ar putea s& apard un val”). Dac’ examinim microscopic Cntre lama si lamela) continutul ,valului” am putea grabi diagnosticul jcarea microorganismului s¢ va realiza pe baza caracterelor: + morfotinctoriale: bacili pram-negativi: * de cultura: predue colonii de tip S (galbene, mari, 2-4 mm, pe TCBS) sau colonii de tip $ (rotunde, strilucitoare, transparente ca piciturile de roud, pe BSA); + biochimice: V. cholerae este oxidazi pozitiv; alte teste biochi lice se pot efectua in Jaboratoral de referint * antigenice: utilizém ser anti-holeric O:1 (reactii de aglutinare pe lama); in centrul de referinf{ se confirma reactia pozitivi si se identified serotipul (Ogawa, Inaba sau Hikojima); daca rezultatele sunt negative se foloseste si senul anti-holeric 0:139: * testarea sensibilititi la bacteriofagi se poate utiliza in studii epidemiologice sau in scop de cercetare (in laboratorul de referints), 5 Antibiograma se realizeazi prin metoda difuzimetricd standardizata, pentru supravegherea aparit rezistente la medicamentele antimicrobiene uunor tulpit 13.2, Diagnostical de laborator in infectiile produse de geaul Pseudomonas Genul Pseudomonas include mai multe specii, specia tip fiind reprezentati de Pseudomonas aeruginosa (bacilul piocianiebacilul puroiului albastru”). Sunt bacili Gram- 7egativi, aerobi, oxidaz’ pozitivi, nesporulafi, mobili (unul sau mai mult ill polar Bacilul pivcianie poate produce diferite infectii (legumentare superficiale sau profunde, sepsis cu evolutie prava ete). InfecteazA persoanele care prerint& arsuri. Poste fi implicat in diferite infectii de spital. P. aeruginosa este izolat de la pacientii eu fibrozi chistic’, Discutm diagnosticul de laborator in infecfiile supurative ale tegumentelor, care este un diagnostic bacteriologi are cclor discutate anterior direct, ctapele flind sin 1. Recoltarea $i transportul p.p. (puro) respect recomandiirile cunoscute. Macroseopic, pop. poate avea un aspect stigesti (culoare albastra/galben-verzui fluorescent) 2, Examin’m microscopici dupi realizarea a cel putin 2 frotiuri (colorate cu A.M. 3i Gram). Notim prezenta celulelor, prezenta celulelor inflamatorii (ex. PMIN) si a ba gram-negativi, 1-5]/0,5-11, dispuyi in lanturi seurte, perechi sau izolati. 3, Cultivim pe medii de cultura obisnuite, timp de 18-24 ore. Bacilul piccianic se poate rultipica la temperaturi care variaza intre 3-42°C, insi dezvoltarca optim’ este Ia 30-37°C- Recomandim utilizarea unor medii de cultura selective (p.p. contaminat). Formeazat colonii de tip § care se pigmenteaz, insotindu-se de pigmentarea mediului (ex. altastru sau zgalben-verde fluorescent). Cultura poate avea win miros ca al florilor de ti. 4, [dentificm microorganismului pe baza caracterelor: «+ morfofinetoriale: sunt bacili Gram-negativi, dispusi in lanturi scurte, perechi, izolati relativ polimorfi. in culturi mai vechi pot apirea diferite forme (filamentoase, cocoide). Mobilitatea se poate examina pe preparatul proaspat, tre kama yi tame. «de cultura: produc colonii de tip S pigmentate (se remarca si pigmentarea mediului, albastru sau galben-verde fluorescent). Cultura poate avea un miros aromat, ca al florilor de tei, Pe mediile cu singe produc hemoliza. « biochimice: produce diferiti pigmenti (de ex. piveianina/albastrs i pioverdina sau Alucresceina/galben-verzui fluorescent’); degradeaz’ oxidativ glucoza, mu fermenteazi Jactoza; este oxidaz’ pozitiv: 5, Antibiograma este obligatorie si se realizeaza de obicei prin metode difuzimetrice. 114, Diagnosticul de laborator in infectii produse de bacili Gram pozitivi 14.1. Diagnosticul de laborator in difterie Genul Corynebacterium include mai multe specii de bacili Gram-pozitivi. Grupul Corynebacterium diphtheriae cuprinde speciile C. diphtheriae, C. pseudotuberculosis $i C. ulcerans. Tulpinile lizogene (infectate cu bacteriofagi toxt) sintetizeaz toxina difterick: aceasta are efecte importante la nivel cardiac (miocardita), nerves (demielinizare), renal (ncoroza tubular), suprarenali sscular si hepatic. Diagnosticul de laborator in difterie este bacteriologic (direct) si trebuie realizat urgent. Se pomeste de la un diagnosticul de suspiciune (clinic) si se realizeazi diagnosticul de laborator. Examinarea frotiurilor din p.p. in contextal clinic poate conduce la recomandarea . 5. Recoltarea i transportul p.p. respectii recomandarile obisnuite, cu anumite de ins imediat, ire a tratamentului (administrare de Ac antitoxing particularitifi. Trebuic si recoliim seeretii de la nivelul faringelui si secretii nazale. Daca caisti o ,falsi membrana” se recomanda detasarea cu grija a acestcia gi recoltarea secretiei. Trebuie wtilizate minim 4 tampoane diferite, 3 pentru recoltarea secretiilor faringiene si al 4- tea pentru recoltarea secretiilor nazale. Un tampon va fi utilizat pentra realizarea frotiurilor, al doilea se va utiliza pentru cultivare pe diferite medii de cultur’ solide, selective si neselective (ex. gelozi singe, LoefMer $i medii cu telurit de potasiu), AI treilea gi al patralea tampon sunt i introduse intr-un mediu de imbogitire (OST, ou-ser-telurt) 6. Examenul microscopic este foarte important si ofera (in context clinic sugestiv) clementele necesare pentra inceperea tratamentului specific (prezenta pe frotiul colorat Gram a leucocitelor sia unor bacili gram-pczitivi, cu capetele mai umflate, asezati in V, L). 3. Cultivam si continuam diagnosticul, chiar daci tratamentul a fost inceput. Trebuie si obtinem colonii izolate, si le identificam si si punem in evident capacitatea toxigent Coloniile caracteristice apar pe mediile cu telurit de potasiu, dupi 24-48 de ore (colonii de tip R pentru biotipul gravis). 4, Identificarca microorganismului se realizeazi pe baza mai multor caractere: + Caractere morfotinctoriale: bacili gram-pozitivi, polimorfi, cu capete umflate, asezati in Y, L sau sub forma de ,litere chinezesti”. Recomandim gi IF. + Caractere de cultura: produc colonii de tip $ sau R, in functie de biotip (R pentru gravis); pe mediul Loeffler (electiv) coloniile apar in 18 ore (albe, lucioase, bombate, semicremoase); RD© Caractere biochimice: diferentierea pu tureazei (negativ), reducerea nitratilor gi fermentarea unor zaharari; 1 se realizeazi prin testul catalazei (pozitiv), © Caractere antigenice: utilizim ser cu Ac anti-toxini difterick pentrs identificaren producerii toxinei (testul ELEK); = Caractere de patogenitate: testarea producerii de toxin pe celule Vero sau prin alte metode (\Western-blot, ELISA, PCR pentru subunitifi ale genei toxt etc,). 5, Antibiograma se poate realiza prin metoda difuzimetrici standardizata, in special in apari regula, tulpinile de C. diphuheriae sunt sensibile la penicilind sau eritromicin’. scopul supraveghe unor tulpini rezistente la medicamentele antimicrobiene. De P 14.2. Diagnosticul de laborator in infeetiile produse de Listeria spp. Genul cuprinde mai multe specii dintre care cea mai important: specie este Listeria monoeytogenes, care poate produce infectii variate, umane si animale. Sunt bacili fini gram pozitivi, acrobi facultativ anaerobi, mobili Ia 25°C, care se dezvolti preferential la 20-30°C dar se poate multiplica si la temperatura frigiderului (,imbos ire la rece”), Listeria monocytogenes este patogen’ prin multiplicare i invazivitate, Listerioza este 0 oonozi. Infectia umana apare accidental. Dintre manifes Ie grave sunt de amintit listerioza perinatala, probabil o infectie intrauterina (avort spontan, nastere prematuri, sepsis cu deces inainte sau relativ repede dupa momentul nasterii etc). La adulfi poate determina meningoencefalita, bacteriemie urmati de metastaze septice (mai ales la imunodeprisaji) 0,01UAVm!), ‘+ demonstrarea prezentei toxinei botulinice in alimente, materii fecale, ser sau in medi de cultura [prelevim cultura din bulion VP, centrifugiim yi supematantul i impiirtim in 2 tuburi; un tub il incdilzim la 100°C; racim; inocukim intraperitoneal la dou Joturi de soareci; dacd soarecii injectati cu p.p. inactivat termic mor, nu este vorba de toxina botulinicd (pentra ci toxina botulinica este termosensibili): prezenta toxinei botulinice poate {i confirmati prin seroneutralizare (protejim un soarece cu anti-toxina de tip A si un alt soarece cu anti-toxina de tip B, apoi ti injectim cu p.p.; dac& animalul seroprotejat cu anti-toxina de tip A supravictuieste far cetalalt animal moare cu semne caracteristice pentru botulism, tn mediul de cultura a existat C. botulinum de tip A). 5. Antibiograma nu se recomanda, in ink le cu bacili Gram-pozitivi sporulati (ucrurile a in caznl germenilor anaerobi Gram-negativi). Clostridiile sunt sensibile la penicilin’, cefalosporine, vancomicina, tetracicline, metronidazol etc, insi tratamentul este mai complex. 1645. Diagnosticul de laborator in infectii produse de Mycobacterium tuberculosis Genul Mycobacterium include peste 100 de specii si subspecii diferite. Discutiim aspectele legate de diagnosticul de laborator (microbiologic) in infectiile produse de M. tuberculosis, varianta hominis. Tuberculoza (TB) poate avea diferite localizari. Cea mai freevent intalnita este TB pulmonar’. Epidemiologic, pacientit cu TB pulmonara (elimina prin sputa bacili a alcool rezistenti/BAAR) reprezinta sursa de infectie. Diagnosticul, tratamentul coreet si complet al acestor pacienti este esenfial. Diagnosticul poate fi sugerat clinic, paraclinic (ex. radiologic), de alte elemente de Jaborator, dar trebuie confirmat prin izolatea si identilicarea M. tuberculosis. Diagnosticul de laborator esentialmente baeteriologic, direct. Datele obtinute in cadrul diagnosticului imunobiologie si serologic pot completa informatie si pot fi utile 1. Recoltarea gi transportul p.p. se realizeazi respectind 0 serie de reguli, discutate anterior cu mare atentie gi respectind toate normele privind protectia personalului medical Am putea recolta si lichid de spalitur’ brongic’, LCR, urina, lichide recoltate prin punctie articulara, probe obtinute prin biopsie, puroi etc. dar esential este si recoltim sputit. Sputa trebuie decontaminata (de ex. prin tratare cu NaOH 4%) si neutralizata (cu acid) in yederea realizarii etapelor 2 gi 3. | 2. Examinarea mieroscopica a pp. include minim 3 frotiuri (colorate A.M., Gram si Ziel Neelsen). Examiniim gi notim prezenta celulelor de la nivelul tractului respirator inferior (ex. macrofage alyeolare), prezenta ¢elulelor inflamatorii (PMN) si prezenta BAAR. BAAR apar ca bacili subjiri, drepti, de 0,43pm, rogii pe fond albastra (celelalte structuri au culoare albastr) Revuliatele examenului microscopic (IF/Z-N) trebuie si fie cuantificate prin mumaral de BAAR jn raport cu numirul de cémpuri examinate (10-30 campuri tn cazul IF, 100-300 in cazul Z-N). De ex. 1-9 BAAR/10 cimpuri (in IF) sau 1-9 BAAR/100 de cmpuri (Z-N) ne permite si notim in buletinul de anatiz’ 1+ (maxim sunt 4+, la peste 9 BAAR/I cimp/Z-N). ‘Acest mod de notare permite si comparim rezultatele intre laboratoare diferite sau rezultatele unui botnay in cursul tratamentului. Examenul microscopic negatiy nu exelude diagnosticul de TB. 3. Cultivarea se poate face pe 3 grupe de medii de cultura (lichide, semisolide si solide, pe bara de ou, de ex. mediul Lawenstein-Jensen). Ta compozitia mediului I.-J se adauga verde malachit (inhib multiplicarea unor microorganisme). Pentru izolare este necesara o atmosferd de 8-10% CO>. Incubarea se face la 35-37°C. Este foarte important s& examinim mediile in 7fiecare zi (in prima saptimana dupa inoculare), ulterior sipttimanal pénd la implinirea a 6-12 saptimani (M. tuberculosis are 0 rata de diviziune de 12-27 ore). Exist si metode de cultura rapide”, 4. [dentificarea microorganismului se realizeazdi pe baza caracterelor: ‘© morfotinctoriale: BAAR; + de culturé: AM. tubereulosis: si M. bovis:BCG formeaza colonii de tip R, rugoase, grunjoase, nepigmentate, Tulpinile de M. tuberculosis rezistente la HIN pot forma colonii * biochimice: testul producerii de niacina, testul reducerii nitratilor si testul catalazei la 22°C si dupa incalzire la 68°C. sunt pozitive pentru M. tuberculosis; ‘+ _antigenice (se pot examina in centre de referinti); © de patogenitate: Mf. tuberculosis €: € pattogen pentru cobai; 5. Antibiograma este necesara; se realizeazi conform recomandzrilor Programulvi National de Control al TB. Se pot utiliza metoda metoda proportiilor, metoda rapoartelor de reristenti ete. Diagnosticul imanobiologie are Ia baz’ un mecanism de RIC. Se utilizeaza IDR cu PPD. Diagnosticul serologic se bazeazi pe rispunsul imun de tip moral (Ac anti- prin tehnica ELISA). in diagnosticul TB nici un clement nu poate fi considerat ca find lipsit de imporianta intrum context clinic, paraclinic si epidemiologic. ry16. gnosticul de laborator in sifilis Sunt discutate: familia Spirochaetaceae (cu genurile Treponema si Borrelia) si familia Lepiospiraceae cu emul Leptospira. Genul Treponema include specia Treponema pallidum si alte cu patru subspecii care pot produce infeetii la om. Sifilisul este produs de Treponema pallidum subspecia pallidum. Poste fi congenital saw dobindit, Sifilisul dobandit poate evolua in mai multe stadii (primar, secundar, latent si stadiul terfiar. Infectia se transmite cel mai freevent prin contact sexual. in 2-10 siptimani de la contactul infectant, la locul inocula ¢ formear yaneral dur (cu lichid clar, foarte bogat in treponeme). Dup alte 2-10 saptimani apar leziunite secundare (maculopapule ros lovalizate 1a orice nivel, dar si condiloame in diferite regiuni ale corpului. Diagnosticul pomneste de la elemente clinice si epidemiologice si trebuie confirmat prin metode de laborator; poate fi baeteriologie (direct) sau serologic. Diagnosticul bacteriologie Treponema pallida nu poste fi cultivati pe medii artificiale. Diagnosticul bacteriologic cuprinde numai 2 ctape i poate fi realizat att tn sifiisul primar ct iin sifilisul scoundar. |. Recoltarea si transportul p.p. se face asa cum am discutat, dar exista si particularitai Produsul patologic este reprezentat de lichidul clar de la nivelul leziunilor primare sau poate fi prelevat de la nivetul leziunilor secundare, din ganglionii limfatici regionali ete. Recoltim p-p. cu grija (nu trebuie si producem sAngerare) dupa indepirtarea crustelor care acoper’ lez Rea izdim preparate microscopice intre lam’ gi Jamel’, Examinarea trebuie ficuti rapid (in maxim 20 de minute). Accasti ctapa este £. importanta, ‘aminarea microscopica a p.p. se face fie cu ajutorul microscopului ea fond intuneeat, fie prin LF directa (exista si alte tehnici) Pentru examenul microscopic pe fond intunecat (MF), pregitim 2 lame pentru fiecare leziune din care am recoltat p.p. Preparatele in asteptare” sunt menfinute intr-o cutie Petri in care exist puting vati umeziti, pentru a pistra atmesfera umedi gi a preveni uscarea. Preparatul trebuie examinat insistent, cel pujin 10 minute in cazul unui rezuliat aparent negativ. Trebuie si existe antrenament si experienta pentru a identifica aspectele caracteristice (microorganisme foarte subtiri si lungi, spiralate, luminoase pe fondul negru al cAmpului, mobile - deplasarea nu este foarte rapida, seaman cu o migcare de insurubare). Rezultatul pozitiv pune diagnosticul de sifilis primar. O problem ar putes fi reprezentata de existenta treponemelor saprofite, care microscopic ariti foarte aseminiitor eu 7: pallidum, IF direct permite di rentierea T. pallidum de alte treponeme cu ajutorul anticorpilor marcafi fluorescent. Frotiul poate fi “colorat” cu Ac anti 79pallidum objinufi de ta pacienti cu sifilis sau de la iepuri infectati cu 7: pallidum [scrul este tratat pentru cresterea specificitatii cu tulpina Reiter (0 tulpind nepatogenit de 7: phagadenis) iar Ac sunt apoi marcati cu izotiocianat de Auoresceina] sau cu Ac monoclonali anti-7. pallidum subspecia pallidum marcati fluorescent. Treponema pallidum ii pastrea7 sensibilitatea la penicilin’ (medicament de electie in sifilis). Trebuie respectate recomandarile terapeutice Picuie de edire comisia de specialitate a ministerului sinatitii publice, pentru fiecare forma de sifilis in parte Diagnosticul serologic Se pot folosi Ag nomtreponemice (nespecifice) si Ag treponemice (specifice), care se ‘completeara reciproc. Testele nontreponemice sunt utile in screening dar si in diagnostic. Diagnosticul se bazeazi pe combinarea acestor tipuri de teste. Spre exemplu puter utiliza VDRL (prima categorie) coordonat cu TPHA (a doua categorie). Produsul testat de regula este serul, dar putem folosi si plasma sau LCR. in care utiliziim Ag nespecifice (nontreponemice) + Ag nontreponemice au structura lipidic’ (ex. cardiotipina), cuplat cu colesterol pentru cresterea sensibilitatii, Ac anti-cardiolipina pot fi detectati in ser la 2-3 saptdmani (iar in LCR Ja 4-8 stptiméni) de la debutul infectiei. © Reactia de fixarea a complementului Bordet-Wasserman (RBW) se utilizeaz’ din 1906. Este 0 metoda laborioasii. O discutim in cadrul REC. + Col mai frecvent se utilizeaz VDRL (Veneral Disease Research Laboratories), un test de floculare. O varianta este roreactia VDRL, in plici cu godeuri. Utilizim: Ag tip VDRI (preparat comercial), serul de cercetat (inactivat, 30 minute 1a 56°C), folosit Riri a-1 dilua, o temperaturi care trebuie si fie intre 23- 29°C, martori (seruri cu reactivitate cunoscuti, martor pentru Ag), + Punem in ficeare godeu 0,05 ml ser (in godeul pentru martor Ag punem solutic salingi fiziologic’); © Dupa agitarea flaconului cu suspensia Ag, utilizdind o seringa cu ac calibrat depunem cate o picituri (1/60 mi) in fiecare godeu; * Acoperim placa gi 0 agezim pe un agitator care poate fi reglat la 180 turati pe minut, pe o duratii de 4 minute (aspect foarte important); © Citim imediat reaultatul, pe fond negru, cu ajutorul unei lupe, incepand cu martorii (negativ, slab pozitiv, pozitiv, martorul pentru Ag) $i continudind cu serurile de testat. ‘+ Rezultatul este negativ dacd lichidul nu prezinta flocoane. Rezultatul este slab pozitiv atunci céind vedem flocoane de dimensiuni mici intr-un lichid 80ugor turbid. Rezultatul este intens pozitiv atunci cand vizualizim flocoane de dimensiuni mari iar lichidul este clar. + Rezultatul negativ nu elimina diagnosticul de sifilis: in cazul_ unui pacient suspect, repetim testul dupa 1 siptimani, 1 lund si la 3 luni + Luim in considerare un rezuliat pozitiv in corelatie cu rezultatul obfinut Ia testul treponemie, diagnosticul bacteriologic, clementele cli si epidemiologice. Un rezultat pozitiv in conditiile in care toate celelalte date sunt negative este de obicet un rezultat fals pozitiv. Pot aparea rezultate fals pozitive 1a persoane cu hepatiti viral acuti, pheumonii virale, rujeoli, malarie, mononucleoza infectious, alte infectii virale, la persoane care au fost recent vaccinate, precum gi la persoane cu boli ale fesutului colagen, persoane care se drogheaz, Ia persoancle in vairsti etc. Renetiile fals pozitive pot apirea si pe parcursul sarcin estul RPR (Rapid oT ma Reagin) se realizeaza pe carduri din material plastic (exista mai multe cercuri cu diametrul de 18 mm). Ag este preparat asemii itor VDRL (dar nu mai este necesara inactivarea prin cildura): contine si particule de cirbune. Antigenul RPR este amestecat cu serul de cercetat in cercul de pe card. Daci exist Ac anti-7. pallidum, are loc combinarea cu particulele lipidice din Ag sirezultd aglutinarea. Apar granule negre pe fondul alb al cardului. * A fost pus la punct gi o tehnica de tip ELISA cu acest tip de Ag. Reactii in care utilizam Ag speeifice (treponemice) Exist ten de grup). Mai importante su (ex. RFC) care utilizeaz Ag treponemice extrase din T. reiter (specificitate reacfiile care utilizeazi Ag treponemice extrase din tulpina Nichols de T: pallidum (au specificitate mare, de tip) + Testul imobilizatii teponemelor (TPT): serul de cerceiat este diluat $i amestecat cu complement si treponeme vii, mobile (obtinute din testicul de iepure), Daca in ser exista Ac specifici, treponemele sunt imobilizate (examinarea se face eu MFI); * Testele de imunofluorescenti indirect’ (Fluorescent Treponemal Antibody, FTA): serul de cercetat era initial diluat 1/5, ulterior 1/200 (FT.A-200). in ultimii 45 de ani se utilizeazi FTA-Abs (se objine din tulpina Reiter un exiract Ag, util pentru indepiirtarea Ac care nu sunt spec pentru 7. pallidum; serul de ta pacient se dilueaza 1/5, se pune in contact cu extractul care contine Ag treponemice de grup/Reiter $i asa sunt inlaturati Ac nespecifici; apoi se practica IF). In cazul in care serul de cercetat este pozitiv, treponemele apar Muorescente (ex. galben verzui). 81* Tehniea ELISA (ex. detectarea Ac de tip IgM anti-7-. pallidum) este utili penta diagnosticul sifilisului congenital Interpretarea rezultatelor s¢ face in context clinic, epidemiologic si de laborator. Daca, de x, att VDRL cat si FTA dau un rezultat negativ, infectia este de obicei exclusa. ins’, in cazul in care pacientul se afla la debutul bolii iar Ac nu sunt nedectabili (suspiciunea clinica sau epidemiologic’ persist), repetiim testele dupa 3 siptimdini. Nu intru in amanunte privind strategia diagnostica si terapeutic’, dar subliniez.c& acestea sunt elaborate de citre specialistii in domenia si trebuie respey te cu strictete, 17. Diagnosticul de laborator fectii cu Candida albicans Sunt cunoscute cdteva mii de specii de levuri si icegaiuri, Cateya sute au fost izolate de Ja oameni sau animale. Genul Candida cuprinde cateva zeci de specii (sunt levuri). Din speciile care pot produce infectii la om, cea mai cunoscuta este Candida albicans. C. albicans poate face parte din flora microbiand normal: produce pseudomicelii (pseudohife) atat in culturi cat si in produse patologice sau Ia nivel tisular. Boala apare datorit& unor factor’ intrinseci (ex. varste extreme, endocrinopatii, hemopatii maligne, SIDA) si extrinseci (ex. le la nivel tegumentar, tratament abuziv cu an si chimioterapice, terapie imunosupresiva, diferite manevre medico-chirurgicale). Exist mai multe forme clinice (bucale si peribucale, genitale, localizate la nivel cutanat sau la nivelul fanerelor, localizate la nivel visceral sau diseminate).. Diagnosticul poate fi micologie (direct) sau imunologie (indirect). 17.1, Diagnosticul micologie Ficcare laborator clinic trebuie si poati realiza micar o parte din acest diagnostic (recoltare, examinare microscopic’, evidentierea levurilor - structurilor miceliene ~ structurilor pseudo-miceliene, dar chiar si testul filamer Recoltarea si transportul p.p. se fac respectnd aceleasi reguli, discutate in cazul lor bacteriene. Spre ex. intr-o candidoz superficial, antiseptizim, ractam si colectim scuamele rezultate. Putem recolta fire de par, fragmente de unghie etc. Timpul de transport nu trebuie si depigeasei 48 de ore (jar p.p. nu trebuie si se usuce). Pentru. prevenirea multiplic 2 i bacteriane adiugim de ex. penicilind, streptomicina sau cloramfenicol. ‘aminarea microscopica a p.p. are citeva particularitati: © Daca examindim un p.p. de la nivel tegumentar sau fragmente unghiale, facem intai un preparat intre lami si lameki, folosind o solutie 10-30% KOH-glicerol. Dac’ utilizam si calcofluor alb (fluorocrom), levurile se vid ovoide, cu dimensiuni relativ mari, iar 82pseudomiceliile si miceliile se vid galben-verzui sau alb-albastrui. Aceste aspecte ne fac si suspicionim prezenta Candida spp. (ctapa 3 este ins striet necesar’) © Dac examinam un p.p. recoltat de la nivelul mucoasclor, pregiitim si preparate intre Jama-lamela si frotiuri (colorate A.M. si Gram). in cazul preparatelor proaspete folosim gi calcofluor all. Daca vedem levuri si pseudomiceli, suspiciondm prezenta Candida spp. 3. Cultivarea p.p. o facem pe mediul Sabouraud (putem adzuga, pentru selectivitate, cloramfenicol, gentamicina, cicloheximida). Un p.p. necontaminat il cultivim pe Sabouraud nesclectiv. Un p.p. contaminat il cultivaim gi pe Sabouraud neselectiv dar si seleetiv. Poti termostatul la 28°C, pentru incubare yi asteptim 24-96 ore. 4, Identificarea o facem prin examinarea caracterclor « morfotinctoriale: Examindm preparate proaspete colorate cu laciofeno! si frotiuri fixate gi colorate, remarcind prezenfa levurilor (rotunde, ovoide sau putin mai alungite, Gram pozitive); dovedim si puritatea coloniei. In particular, daca repi din colonie pe un mediu cu agar gi fini de porumb (slab nutritiv) si apoi facem un preparat intre lami si lamela, vom vedea aparitia de chlamidospori (Is extremitatea pseudomiceliilor. + de cultura: Produc colonii de tip S (rotunde, bombate, netede, albe, care seaman cu coloniile bacteriene dar sunt mai mari). Apar in 24-94 ore. = bicchimice: Facem spre ex. auxanograma (levurile au un echipament enzimatic si pot si utilizeze un anumit carbohidrat ca unica sursi de carbon; C. albicans asimileazi glacoz’, mnahoza, trehalozi, galactoz’ cte.). Testarea fermentiiii unor carbohidraji poart’i numele de zimograma. + antigenice: Putem folosi diferite tehnici (aghatinare pe la atex-aglutinare, ELISA). alte teste utile + Testul filamentarii prin care verificdim capacitatea blastoconidiilor de a produce, in anumite conditii, tabi germinativi [repicim tulpina pe medii care contin ser de iepure; 60 in 60 de minute pregitim preparate fntre lami si lameli gi examindim micrescopie pentru a detecta prezenta tubilor germinativi; C. albicans produce in maxim 4 01 pseucdofilamenteltubi germinativi relativ (scurte, fara stricturi, cu un calibra similar)) + Detectarea unor metaboliti prin tehnici cromatografice. 5. Antifungigrama a fost pusii la punet (standardizata) relativ recent, 172. Diagnosticul imunoiogic poate fi serologic si imunobiolos gnosticul imunologic Diagnosticul serologic Exist studii care arati ci identificarea si titrarea Ac anti-C. albicans poate fi util in diagnosticul candidozelor profunde. Inifial au fost utilizate tehnici de aghutinare pentra 83detectarea prezentei Ac anti-manan. Utterior au fost puse ta punet ‘ehnici pentru detectarea prozentei Ac fati de Ag localizate in citoplasma C. albicans. Diagnosticul imunobiologic Intradermorcactia cu candidind este pozitiva la majoritatea persoanclor adulte, fiind astfel uutila in aprecierea existentei RIC. Se mai poate utiliza testul transformarii blastice a limfocitelor in prezenta unor Ag de C. albicans. 18. Elemente de microbiologie orala La nivelul cavititii bucale exist microbiocenoza, formati dintr-un ansamblu de specii bacteriene care nu creazi o patologie gazdei pe eare o colonizeazi. Formeaza un ecosistem. Intre bacterii se stabilesc anumite relatii. Sunt circa 700-1,000 specii care formeaz’ aceastit microbiocenoza (multe dintre acestea nu pot fi cultivate, dar pot fi studiate prin metode ale biologie! moleculare). Studiul ARN ribozomal 16s a putut, astfel, si identifice un grup, mumit generic TM7, identificat de curdnd la nivelul plicii dentare subgingivale Microbiocenoza are rol de apirare in cavitatea bucali, prin pH, prin relatiile inter- bacteriene (ex. prin competitia pentru hrani, oxigen, receptori de legare). Cea mai mare antitate de bacterii se pare c& se afld tn spatiile inter-dentare, in apropicrea santului gingival, sublingual etc. Pe suprafata dintilor, mucoasei jugale sau la nivel lingual se gasesc in special bacterii aerobe in timp ce in spatiul gingival putem identifica bacterii facuttativ saw strict anaerobe. Problemele patologice principale incep cu formarea plicii bacteriene. Aceasta se formeaz ca un biofilm care adera la suprafata dentari, Aceasti atagare este mediat’, se pare, de receptori, Pelicula de saliva de pe suprafata dentari si respectiv matricea plicti dentare in curs de formare au in compozitic atat substante ale gazdei cat si produsi bactericni. Exist si un film” de materie alba, subtire, format din resturi alimentare, bacterii, PMN, celule epiteliale orale descuamate etc si care nu reprezinta placa bacteriand (acest ..film” se acumuleaza pe dinte in cazul lipsei de igien’, dar este usor de Indepirtat, de ex. chiar si prin Utilizarea unui jet mai puternic de api, ceea ce nu se petrece in cavul plicii bacteriene). Bacteriile pot coloniza suprafetele dentare gi pot incepe si formeze placa dentari, deoarece pot s& adere Ja aceste suprafete. Placa dentarii se dezvolti in cfteva ctape, prima find aderarea primului ,strat” bacterian. Bacteriile aflate tn saliva pot adera de acest strat, Ingrosandu-l. Cu et bacteriile se multiplica mai usor, placa bacteriana se dezvolta mai mult. in timp, 1a 0 jumatate de ori de la precedenta spalare a dinfilor, apare o peliculi de substante mucoide, care se depun pe suprafafa smalfului dentar. Cu cat cantitatea de glucide este mai mare, cu atét formarea acestei pelicule este mai rapida (de ex. streptococul prezint& afinitate 84pentru glucide jar prin fermentarea acestora, pH-ul vireazA spre aciditate (se formeaza acid lactic}; consumul exagerat de dulciuri face ca resursele naturale de neutralizare, existente in saliva, si fie depasite; la un pH mai mic de 4-5, are loc preci jtarea structurilor mucoide). In continuare, evolutia este influentati substantial de igiena personal. Daci aceasta este deficitar, faza de atasare gi colonizare bacterianii determinti structurarea plicii bacteriene. Se formeaz’ un depozit, care aderi ta pel ‘ula descrisi mai sus. Bacteriile pot si adere (pe receptori) sau si se alageze de: bact aderate anterior. Streptococcus sanguis si 8, mutans, precum si Actinomyces spp. poseda fimbrii si adera (acestea sunt doar cateva dintre exemple). si ale metode de aderare. Se poate forma o retea in care unele bacterii sunt deja fixate iar allele sunt suspendate, relativ ferm. Ulterior se atageazé ji alte bacterii (stafilocoe spirochete), fungi (Ievuri, filamente) ete. Existi atit produsi bacterieni eat gi produgi proveniti de la gazdi. Daca igiena este in continuare deficitar’, dac’ nu sunt indepatate aceste structur colonizarea se accentueaz, dup 48 ore indepartarea devine dificil’ $i foarte dificila dupa 7-9 ile (bacteriile se ,,cupleazai” uncle de altele, alcatuiesc o matrice). La nivel pla ii bacteriene pot fi idemtificate specii de sireptococi (ex. 5. sanguis, 8. gordoni, S. oralis), actinomicete, precum si elementele mentionate anterior. In cazul in care apare gingiviti, se pot identifica Fusobacterium nucleatum, Prevotella intermedia, Selenomonas sputigena, Campylobacier sputorum, Haemophilus parainjluenzae. in periodontita cronicé (pierdere de tesut conjunctiy Jax periodontal gi de suport a dintelui in alveoli) identifi m spirochete, genmeni ram pocitivi filamentosi, bacterii Gram negative mobile, speci anaerobe (P. gingivalis, P inermedia, Tannerelta forsythia etc.). Apar fenomene inflamatorii. placa bacteriandi abundenti are intotdeauna o implicare palologica. Placa supragingivali este implicat in producerea cariilor dentare in timp ce placa subgingival’ este implicat& in producerea paradontopatiilor. Caria dentari reprezint& o leziune la nivel dentar. Apare initial pata de smalt” (pierde ‘ata (in small). Eroziunea inainteaza si poate ajunge pind 1a nivelul pulpei dentare. Cariile se pot luciul caracteristic), apoi zona respet ivi se ingalbencste, are loc © eroziune supert ‘nsofi de complicatii (gangrena pulpei dentare, abcese et Factorul determinant este reprezentat de bacterii si influentat esenfialmente de placa dentara. Parodontopatiile reprerinti initial o afectare a gingiilor la nivelul santului subgingival rezultind 0 gingivi cronic& datorita placii bacteriene supragingivale, abundente. Unmand scesteia, rezultd si placa bacteriani subgingivali (domin’ bacteriile anacrobe). Apare paradontopatia superficiala cu evolutie caitre paradontopatie cronicd profunda (Ieziunile ajung pana ta jesutul parodontal). Sunt afectate mecanismele prin care dintele este mentinut in 85alycola dentari. Bacteriile determina liza ligamentelor de sustinere. Pot rezulta chiar gi distrugeri ale tesuturilor osoase. Parodontopatia poate evolua spre profunzime, cu distrugeri ale osului alveolar. Dintii devin mobili si se poate ajunge la edentatie Dac’ in trecut se considera cai paradontopatia are ta baz traume sau malform: este Iuati in seam’ drept principal factor etiologic, flora microbiani (mai ales. germenii anaerobi, Gram negativi). Exist’ si teoria imunologic’. Aceasta sust & mecanismul imun duce la degenerare, retractic gingivali, expulzie dentara di alveoli (boli ale jesutului colagen). Diagnosticul microbiologic al acestor afectiuni este realtiv dificil, pentru ca bacteriile implicate au o serie de necesitati fiziologice si biochimice, mai deosebite. Ca si un principin general, pp. recoltat trebuie pus in mediul de transport (de fapt 2 medii, in aerobioz4 gi anaerobiozi). Datorita tendintei de co-agregare a bacteriilor, inainte de insiméntarea pe medii de culturi, tuburile cu pop. trebuie agitate energie. Avnd in vedere numirul foarte mare de speci diffrite care ar putea fi cultivate, o alti recomandare generala ar fi de a dilva pp. Condifiile de incubare trebuie s& fie aidt in aerobiozé cat si in anacrobioza. Geloza-singe asigura condifii de crestere pentru majoritatea speciilor pe care am putea si le studiem prin metode ale bacteriologiei clasice. Utilizarea mediilor selective (ex. cu bacitracin pentru S. mutans) sau adivgarea unor anumite suplimente nutritive (ex. acid N-acetil muramic pentru Tannerella forsyihia) permit izolarea wnei irfi din totalul speciilor bacteriene identificabile. Majoritatca speciilor pot fi identificate numai prin metode ale biologiei molecul 86