Pathologie Biologie 55 (2007) 361–365

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Comparaison des méthodes phénotypiques par rapport

à la PCR pour le dépistage de la résistance
à la méticilline chez les staphylocoques à coagulase négative
Comparison of phenotypic methods with PCR to screening
methicillin resistance in coagulase negative staphylococci
D. Majouri, A. Touati, W. Achour, O. Bouchami, A. Ben Hassen*
Laboratoire de microbiologie, centre national de greffe de moelle osseuse, rue Djebel-Lakhdhar, Bab Saadoun, 1006 Tunis, Tunisie

Reçu le 23 mai 2007 ; accepté le 29 juin 2007

Disponible sur internet le 01 octobre 2007

Résumé
But de l’étude. – Appréciation de la fréquence, du niveau et du support génétique de la résistance à la méticilline.
Matériel et méthodes. – Soixante-treize souches de staphylocoques à coagulase négative isolées de prélèvements divers, de janvier à
juin 2004, ont été étudiées. La détection phénotypique a été réalisée par l’antibiogramme en utilisant un disque d’oxacilline et un disque de
céfoxitine, par l’étude des concentrations minimales inhibitrices de l’oxacilline (E-test), par le test de dépistage à 4 μg/ml d’oxacilline et par la
recherche de la protéine de liaison aux pénicillines (PLP2a) en utilisant le test d’agglutination de particules de latex. Les résultats de ces métho-
des ont été comparés à ceux de la polymerase chain reaction (PCR) du gène mecA.
Résultats. – Quarante-huit souches étaient porteuses du gène mecA dont 30 étaient détectées par le disque d’oxacilline, le disque de céfoxitine,
le test de dépistage, la recherche de PLP2a et avaient des concentrations minimales inhibitrices (CMI) de 24 à 256 μg/ml. Dix-sept souches n’ont
pas été détectées par le disque d’oxacilline mais par le disque de céfoxitine et le test d’agglutination de particules de latex. Parmi ces souches, 13
(76 %) avaient des CMI de 0,5 à 1,5 μg/ml et n’ont pas poussé sur le milieu de dépistage, tandis que quatre (24 %) avaient des CMI de 6 à 16 μg/
ml et ont poussé sur ce milieu. Une souche avait une CMI de 0,19 μg/ml et n’a été détectée par aucune méthode phénotypique.
Conclusion. – L’étude des CMI, la recherche de PLP2a ou plus simplement le disque de céfoxitine ont permis de détecter les souches mecA
(+) de phénotype résistant et prérésistant mais pas la souche de phénotype sensible (2,1 %).
© 2007 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés.
Abstract
The aim of study. – Appreciation of the frequency, the level and the genetic support of methicillin resistance.
Material and methods. – Seventy-three strains of coagulase negative staphylococci isolated from various specimens, from January to June
2004, were studied. The phenotypic detection was carried out by disk diffusion test using oxacillin and cefoxitin disks, by the determination of
oxacillin Minimal Inhibitor Concentration (E-test), by the oxacillin screening test at a concentration of 4 μg/ml and by the search of the penicillin
binding protein PBP2a using the slide latex agglutination test. The results of these methods were compared to PCR of mecA gene.
Results. – Forty-eight strains carried mecA gene whose 30 were detected by the oxacillin disk, the cefoxitin disk, the oxacillin screening test,
the slide latex agglutination test and had a MIC from 24 to 256 μg/ml. Seventeen strains were not detected by oxacillin disk but by cefoxitin disk
and the slide latex agglutination test. Among these strains, 13 (76%) had oxacillin MIC from 0.5 to 1,5 μg/ml and not grew on oxacillin agar
screening, while 4 (24%) had oxacillin MIC from 6 to 16 μg/ml and grew on this agar. One strain had oxacillin MIC of 0,19 μg/ml and was not
detected with any phenotypic method.

* Auteurcorrespondant.
Adresse e-mail : assiabenhassen@yahoo.fr (A. Ben Hassen).

0369-8114/$ - see front matter © 2007 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés.
doi:10.1016/j.patbio.2007.06.010
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Conclusion. – The determination of oxacillin MIC, the search of the PBP2a or more simply the cefoxitin disk had permitted to detect the
strains mecA gene (+) with resistant and pre-resistant phenotype but not the strain with sensible phenotype (2.1%).
© 2007 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés.

Mots clés : Staphylocoques à coagulase négative ; Méthodes phénotypiques ; Gène mecA ; Résistance à la méticilline ; Phénotype ; PCR

Keywords: Coagulase negative staphylococci; Phenotypic methods; mecA gene; Methicillin resistance; Phenotype; PCR

1. Introduction ● S. epidermidis WHO 36 a été utilisé comme contrôle de

qualité positif de la PCR.
Les staphylocoques à coagulase négative (SCN) résistants à
la méticilline, représentés essentiellement par Staphylococ- 2.2. Isolement et identification
cus epidermidis, Staphylococcus haemolyticus et Staphylococ-
cus hominis, sont devenus parmi les premiers pathogènes res-
ponsables de bactériémies chez les patients neutropéniques L’identification bactérienne a été réalisée par les méthodes
souvent porteurs de cathéters veineux centraux. La résistance conventionnelles et par API ID32 STAPH (BioMérieux®).
à la méticilline est croisée entre toutes les β-lactamines et elle
est rencontrée surtout en milieu hospitalier, où elle s’associe à 2.3. Antibiogramme
de nombreuses résistances à d’autres familles d’antibiotiques
imposant ainsi le recours aux glycopeptides. Il a été effectué sur milieu gélosé Mueller Hinton (MH) à
La résistance intrinsèque à la méticilline est médiée par partir d’un inoculum de 106 UFC/ml selon les normes et les
l’acquisition du gène mecA, d’origine Staphylococcus sciuri recommandations du Comité de l’antibiogramme de la Société
[1,2], faisant partie d’une région chromosomique transposable française de microbiologie (CA-SFM, 2005). La lecture a été
et large d’ADN exogène de 21 à 67 kDa appelée SCCmec faite après 24 heures d’incubation à 37 °C.
(staphylococcal chromosome cassette mec). Le gène mecA
Trois phénotypes ont été individualisés en fonction des dia-
code pour la synthèse d’une protéine de liaison aux pénicillines
mètres d’inhibition de l’oxacilline [Oxa] (5 μg) et de la céfoxi-
additionnelle, dénommée PLP2a ou PLP2′ de 78 kDa, caracté-
tine [Fox] (30 μg). Le phénotype résistant (résistance à
risée par une affinité de liaison négligeable aux β-lactamines
l’oxacilline et à la céfoxitine [OxaR–FoxR]), le phénotype pré-
[3,4].
résistant (résistance isolée à la céfoxitine [OxaS–FoxR]) et le
L’expression de la résistance à la méticilline dépend de plu-
phénotype sensible (sensibilité à l’oxacilline et à la céfoxitine
sieurs facteurs responsables d’une variation phénotypique
[OxaS–FoxS]).
importante entre les souches et posant parfois des problèmes
de détection. Le but de ce travail a été de comparer les métho-
des phénotypiques par rapport à la polymerase chain reaction 2.4. Détermination de la CMI de l’oxacilline
(PCR) pour la détection de la résistance à la méticilline chez
les SCN isolés au laboratoire du Centre national de greffe de Elle a été réalisée sur milieu MH à partir d’un inoculum de
moelle osseuse (CNGMO) de Tunis. 106 UFC/ml par la méthode E-test (AB Biodisk) selon les nor-
mes du CA-SFM. La lecture a été faite après 24 heures d’incu-
2. Matériel et méthodes bation à 37 °C. Les concentrations critiques de l’oxacilline sont
0,25 et 2 μg/ml.
2.1. Souches bactériennes
2.5. Gélose de dépistage à l’oxacilline
2.1.1. Souches cliniques
Nous avons collecté, de janvier à juin 2004, 73 souches de
Toutes les souches ont été ensemencées sur gélose MH
SCN (45 souches de S. epidermidis, 15 souches de
additionnée de 4 μg/ml d’oxacilline (Sigma) et de 40 mg/ml
S. haemolyticus et 13 souches de S. hominis) isolées des prélè-
de NaCl (Chemi-Pharma) à partir d’un inoculum de
vements pathologiques divers dans le laboratoire du Centre
108 UFC/ml. La lecture a été effectuée après 48 heures d’incu-
national de greffe de moelle osseuse (CNGMO) de Tunis.
bation à 37 °C. Toute croissance sur ce milieu a été considérée
comme une indication de la résistance à la méticilline.
2.1.2. Souches de référence

● S. aureus ATCC 25 923 sensible à la méticilline et 2.6. Recherche de PLP2a

S. epidermidis WHO 36 résistant à la méticilline ont été
inclus comme contrôle de qualité interne pour l’étude phé- La PLP2a (produit du gène mecA) a été détectée par le test
notypique de la sensibilité à la méticilline ; d’agglutination de particules de latex (BioMérieux®).
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2.7. Amplification du gène mecA résistant, quatre avaient des CMI de 6 à 16 μg/ml et ont été
détectées par tous les tests sauf par le disque d’oxacilline,
Elle a été réalisée par PCR simplex en utilisant deux amor- alors que les 13 autres avaient des CMI de 0,5 et 1,5 μg/ml
ces spécifiques, de 25 nucléotides chacune, mecA-F (5′GTA et ont été détectées seulement par le disque de céfoxitine, le
GAAATGACTGAACGTCCGATAA3′) et mecA-R (5′ E-test et la recherche de PLP2a. Une souche (2,1 %) de phéno-
CCAATTCCACATTGTTTCGGTCTAA3′) [Proligo] pour type sensible (CMI de 0,19 μg/ml) n’était détectée par aucune
amplifier une séquence de 310 pb [5]. des méthodes phénotypiques utilisées (Tableau 1).
L’extraction de l’ADN a été réalisée par lyse thermique. Les tests phénotypiques les plus sensibles pour la détection
Pour chaque milieu réactionnel de PCR de 50 μl on a utilisé de la résistance à la méticilline étaient le disque de céfoxitine,
5 μl de cet ADN bactérien. Les concentrations finales ont été : la détermination des CMI de l’oxacilline et la recherche de
200 µM pour chaque dNTP (Amersham Biosciences) ; 1X du PLP2a, avec 97,9 % chacun. En revanche, le disque d’oxacil-
tampon d’enzyme (Promega) ; 1,5 mM de MgCl2 (Sigma) ; line et le test de dépistage à l’oxacilline à 4 μg/ml avaient des
0,5 µM pour chaque amorce mecA-F et mecA-R (Proligo) et sensibilités plus faibles de 62,5 % et 70,83 % respectivement.
1,25 U de Taq polymérase (Promega). Tous les tests utilisés avaient une spécificité de 100 %
Dans chaque série on a inclus un contrôle positif (ADN de (Tableau 2).
la souche S. epidermidis WHO 36) et un contrôle négatif
(ADN remplacé par l’eau). L’amplification a été effectuée 4. Discussion
dans un appareil thermique programmable à blocs chauffants–
refroidissants (Thermocycler Perkin Elmer Applied biosystem Les SCN sont les germes les plus fréquemment retrouvés
9700). Chaque amplification a débuté par une dénaturation ini- dans les hémocultures et les cathéters veineux centraux chez
tiale (précycle de dénaturation) à 94 °C pendant deux minutes, les patients hospitalisés dans notre centre avec un taux de résis-
suivie par 30 cycles (dénaturation à 94 °C pendant une minute, tance à la méticilline de 51 % [9].
hybridation des amorces à 55 °C pendant une minute et exten- La distribution des trois espèces de SCN dans notre collec-
sion des amorces à 72 °C pendant deux minutes) et s’est termi- tion a été similaire à celles trouvées dans d’autres études [10,
née par une élongation finale à 72 °C pendant cinq minutes 11].
Une électrophorèse de 10 μl d’amplifiat et de 4 μl de bleu de
Parmi nos souches, 64,38 % ont été classées phénotypique-
dépôt (bleu de bromophénol et saccharose) a été réalisée par
ment résistantes à la méticilline. Cette fréquence varie de 42 à
migration pendant une heure environ à 90 V sur gel d’agarose
55,4 % au Canada [12,13], de 45 à 50 % en Suède [14,15], de
(Sigma Chemical) à 1,5 % contenant du bromure d’éthidium à
53,6 à 65 % aux États-Unis [16,17] alors qu’elle est plus élevée
0,5 μg/ml. Le tampon de migration utilisé a été le Tris-Borate-
en Colombie et en Norvège de 73 et 70–80 % respectivement
EDTA 0,5X. Le gel a été observé sous UV puis photographié.
[18,19].
La taille des fragments a été estimée par un marqueur de taille
Nos souches étaient porteuses de gène mecA dans 65,75 %
de 100 pb (Promega).
des cas avec prédominance du phénotype résistant (62,5 %) par
rapport au phénotype prérésistant (35,4 %) et au phénotype
3. Résultats
sensible (2,1 %).
Cette fréquence du gène mecA a été proche de celles retrou-
Un total de 73 souches de SCN appartenant à trois espèces a
vées au Kuwait (62,5 %) [20] et en Allemagne (62 %) [21]. La
été identifié avec prédominance de S. epidermidis (61,64 %)
comparaison des résultats des différents tests phénotypiques a
suivi par S. haemolyticus (20,55 %) et S. hominis (17,81 %)
isolées essentiellement d’hémocultures (29 %) et de cathéters Tableau 2
(29 %) [6–8]. Quarante-huit (65,75 %) souches étaient porteu- Apport des tests phénotypiques de détection de la résistance par rapport à la
PCR
ses du gène mecA (27 souches de S. epidermidis, 14 souches de
S. haemolyticus et sept souches de S. hominis). Ces souches Test Antibiogramme E- Test de Test
Disque Disque de test dépistage d'agglutina-
avaient un phénotype résistant (62,5 %), prérésistant (35,4 %) tion
d'oxacilline céfoxitine
et sensible (2,1 %). La résistance à la méticilline a été détectée Sensibilité 62,5 97,9 97,9 70,83 97,9
par les méthodes phénotypiques parmi 47 souches (97,9 %) : (%)
les 30 souches de phénotype résistant ont été détectées par Spécificité 100 100 100 100 100
tous les tests utilisés. Parmi les 17 souches de phénotype pré- (%)

Tableau 1
Répartition des souches en phénotypes et génotype de résistance à la méticilline
Phénotype Nombre de souches (%) Antibiogramme E-test Test de dépistage (4 μg/ml) PLP2a PCR
Oxa (5 μg) Fox (30 μg) Intervalles des CMI (μg/ml)
Résistant 30 (41, 1) R R 24–256 Croissance + +
Prérésistant 13 (17, 80) S R 0,5–1,5 Pas de croissance + +
4 (5, 48) 6–16 Croissance
Sensible 1 (1, 37) S S 0,19 Pas de croissance – +
25 (34, 25) 0,023–0,25 –
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montré une corrélation de 100 % entre le disque de céfoxitine,
la détermination des CMI par E-test et la recherche de PLP2a
par le test d’agglutination de particules de latex avec 97,9 % de
sensibilité. Plusieurs études ont montré l’intérêt du disque de
céfoxitine dans l’antibiogramme [22–24] et de la recherche de
la PLP2a [3,11,21,25] pour la détection de la résistance à la
méticilline. La détermination des CMI de l’oxacilline par E-
test permet une catégorisation des souches en fonction de
leurs niveaux de résistance [11,26].
La variation phénotypique entre les souches porteuses du
gène mecA est due à une régulation complexe de l’expression
de la résistance [26–28]. Cette régulation est essentiellement
sous la dépendance du système régulateur mecI–mecR1 de
l’opéron mec codant respectivement pour les protéines régula-
trices MecI (répresseur puissant) et MecR1 (antirépresseur) et
du système régulateur blaI–blaR1 de l’opéron bla qui code
pour les protéines BlaI (répresseur faible) et BlaR1 (antirépres-
seur). Vu l’homologie des séquences d’acides aminés entre les
protéines MecI–BlaI et MecR1–BlaR1, BlaI et BlaR1 jouent le
rôle de corégulateurs de la biosynthèse de la PLP2a dans le cas
d’un système mecI–mecR1 non fonctionnel [29].
Les souches ayant une expression élevée de la résistance
hébergeraient un système régulateur mecI–mecR1 non fonc-
tionnel (mutations, délétions). Dans ce cas le répresseur BlaI
exerce un contrôle négatif plus faible que celui exercé par le
répresseur MecI sur la transcription du gène mecA. En présence
des β-lactamines, BlaR1 s’attache à l’antibiotique permettant
ainsi la naissance d’un signal activateur de la transcription du
gène mecA d’où synthèse de PLP2a.
En revanche, les souches de phénotype prérésistant expri-
mant un bas niveau de résistance se distinguent des souches
résistantes par une différence remarquable des valeurs des
CMI (0,5–16 contre 24–256 μg/ml), ce qui suggère l’existence
d’un système régulateur mecI–mecR1 plus fonctionnel que les
souches exprimant un haut niveau de résistance. Il en est de
même pour la souche porteuse du gène mecA de phénotype
sensible, caractérisée par une CMI basse de 0,19 μg/ml et qui
hébergerait un système régulateur mecI–mecR1 fonctionnel
caractéristique des souches typiques SARM N315 et
S. haemolyticus Sh621 appartenant à la classe A de la cassette
SCCmec qui apparaissent phénotypiquement sensibles malgré
la présence du gène mecA dans leurs génomes [30–32].
En plus de l’opéron bla, d’autres déterminants génétiques
peuvent être responsables de cette variation phénotypique
[33] tel que l’opéron chromosomique femAB impliqué dans le
métabolisme de peptidoglycane par formation des ponts penta-
glycines, dont l’inactivation des gènes femA et femB provoque
la réduction des liaisons entre les chaînes peptidiques et la
diminution de la résistance à la méticilline, indépendamment
de l’activité du gène mecA et sans affecter la synthèse de la
PLP2a [27,34,35].
5. Conclusion
L’étude des CMI de l’oxacilline par E-test, la recherche de
PLP2a par le test d’agglutination de particules de latex ou plus
simplement le disque de céfoxitine ont permis de détecter tou-
tes les souches de SCN porteuses du gène mecA de phénotype
résistant et prérésistant mais pas la souche de phénotype sen-
sible (2,1 % du total des souches).
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