2 - Analyses Quantitatives & Haut Dçbit

Typeurs : Paluch - Reynier BMGC - Biologie Moléculaire Date : 07/02/2017
Fauquet - Evrard Analyses quantitatives Heure : H5-H6

Correcteurs : Montier - Moreul & haut débit Prof : C. Camus
Analyses quantitatives & haut débit

Sommaire :
Introduction ……………………………………………………..1
I. La PCR quantitative ..………………………………………..1
A. La méthode TaqMan ...………………………………………….3
B. La méthode SYBR Green……………………………………….4
C. Conclusion sur la qPCR ..………………………………………6
II. La LAMP ……………………………………………………..6
III. Séquençage - NGS (Next Generation Sequencing)………..7
A. La méthode de Sanger (1976) ..…………………………………7
B. La NGS (Next Génération Sequencing).……………………….9
1. Principe du NGS.…..…………………………………………………9
2. Applications du NGS…….…………………………………………. 10
3. NGS, exemple 1 : l’Oxford Nanopore Technology………………… 10
4. NGS, exemple 2 : évolution des virus influenza A aviaires (H6N1).. 11
Conclusion ……………………………………………………..13
Introduction
Ce cours va traiter de 3 grandes techniques de biologie moléculaire récentes permettant un séquençage, une
quantification ou un dépistage à moindre coût :
- La PCR quantitative en temps réel (en comparaison avec la PCR en point fixe)
- La LAMP : technique d’amplification peu coûteuse permettant de faire du diagnostic. 
Elle permet de détecter la présence d’une séquence d’ADN précise. Comme la PCR, cette technique
utilise des amorces et une ADN polymérase.
- La méthode de Sanger et le séquençage NGS (Nouvelle Génération) qui permet de couvrir le génome
entier : ce sont des méthodes de séquençage haut débit permettant de couvrir énormément de données.
I. La PCR quantitative
NB : PCR quantitative = qPCR = PCR en temps réel
Cette méthode permet de quantifier la quantité de matrice initiale.
Elle s’effectue à partir de la PCR classique mais au lieu de mesurer l’amplification finale, pour laquelle il y a
une variation (due à la perte d’efficacité de la Taq polymérase, de réactifs devenant limitants, d’une
dénaturation moins efficace, etc.), on mesure l’amplification tout au long de la réaction, donc en temps réel.
En effet, le début de la PCR est beaucoup plus reproductible (tandis que la phase plateau va être variable).
On utilise un marqueur fluorescent qui permet de mesurer la quantité d’ADN à chaque cycle
d’amplification : la fluorescence émise augmente en fonction du nombre d’amplicons (c’est-à-dire avec
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l’augmentation de la quantité d’ADN). Cette fluorescence est mesurée à chaque cycle. Ainsi, plus il y a
d’ADN, plus il y a de fluorescence.
On va utiliser des molécules fluorescentes différentes selon la technique.
On parle de PCR en temps réel car on réalisera, grâce à un laser, une lecture de la fluorescence dans les puits
à chaque cycle (souvent réalisé en plaques de 96 puits).
Le nombre de cycles nécessaires pour obtenir la phase d’inflexion détermine la quantité de matrice initiale :
plus il y a de matrice, plus la phase d’inflexion se fait tôt.
Il existe trois méthodes principales de détection :
• Utilisation de molécules fluorescentes s’accrochant à l’ADN double brin (ex : SYBR Green)
La fluorescence est directement fonction de la quantité d’ADN double brin amplifié car la
fluorescence n’est émise que lorsque la molécule est complexée à l’ADN double brin
• Utilisation de sondes d'hydrolyse (par exemple : la méthode TaqMan)
On utilise deux amorces (comme d’habitude) et une sonde qui s’accroche au même fragment
d’ADN. Elle se dégrade lors de l’extension du brin néoformé et c’est sa dégradation qui produit de la
fluorescence.
• Utilisation de sondes d'hybridation (par exemple : la méthode Light Cycler) qui s’accrochent à
l’ADN et augmentent la fluorescence
Nous allons détailler la technique TaqMan puis nous détaillerons la technique SYBR Green.
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A. La méthode TaqMan
Comme pour une PCR classique on utilise un ADN matrice, 2 amorces, 4 dNTPs et une ADN polymérase.
En plus de cela on rajoute une sonde qui va pouvoir s’hybrider sur la matrice entre les deux amorces.
Cette sonde, qui est un oligonucléotide modifié, ne doit pas servir d’amorce. Son extrémité 3’ est donc
bloquée par l’ajout d’un phosphate au niveau du OH (ne peut pas servir d’amorce à la taq pol donc ne peut
pas servir d’amorce pour l’amplification).
Ainsi l’ADN polymérase ne peut rien rajouter à son extrémité.

De plus cette sonde possède en 5’ un fluorochrome et en 3’ un extincteur (Quencher) qui absorbe la
fluorescence du fluorochrome sans en émettre à son tour s’il est assez proche (sonde de petite taille). Ainsi à
t=0, il n’y a pas de fluorescence car elle est immédiatement absorbée par le Quencher.
La fluorescence démarre plus ou moins tard suivant la quantité de matrice de copies de la cible au départ.
Au cours de l’activité de l’ADN polymérase, celle-ci va devoir dégrader la sonde pour pouvoir continuer sa
synthèse. Cette dégradation va alors séparer le fluorochrome de l’extincteur et une fluorescence va
apparaitre. Plus il y a de synthèse d’ADN par l’ADN polymérase, plus il y a de sondes dégradées et donc
plus il y a de fluorescence.
NB : Les polymérases ont soit une activité exonucléasique en 5’3’, soit une activité de déplacement de brin :
elles vont alors seulement décoller la molécule « gênante ».
On mesure alors la fluorescence par un système de laser à chaque cycle ce qui nous permet de réaliser une
courbe (fluorescence en fonction du nombre de cycles de PCR).
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Quantification : deux méthodes possibles

On peut faire de la quantification relative (on va comparer deux quantités) ou absolue (on cherche alors
quel est le nombre de copies de la cible présente dans la réaction, ceci permet par exemple de déterminer une
charge virale sur un animal).
On place un seuil de positivité à partir duquel la fluorescence est détectée (Treshold level) et on détermine,
pour chaque courbe qui passe le seuil, le Ct, c’est-à-dire le cycle pour lequel la courbe passe le seuil de
positivité.
Avec les éléments chiffrés on peut faire de la comparaison mais on va également pouvoir faire une
quantification absolue grâce à l’étude d’une gamme étalon en parallèle des échantillons testés.
Mesures de fluorescence Gamme étalon
La quantification se fait en comparant l’échantillon à une gamme étalon qui est une gamme de
concentrations connues d’un plasmide portant la séquence qui nous intéresse. A partir de ces différents
échantillons (pour lesquels on connaît le nombre de copies du gène qui nous intéresse) on réalise des PCR et
on obtient différentes courbes de fluorescence en fonction du nombre de cycles. Pour chacune de ces courbes
on détermine le Ct et on trace alors la droite Ct=f(log(concentration)). On fait la même chose avec notre
échantillon dont on ne connait pas la concentration à l’issue de la PCR : on récupère le Ct et à partir de la
droite on retrouve le log(concentration) et donc la concentration qu’on recherche (Il existe un logiciel qui sait
faire tout ça et qui donne la valeur tout seul).
Cette technique est très utilisée pour le diagnostic de certaines pathologies car elle permet de connaître le
nombre de copies du gène du pathogène qui est présent dans l’échantillon de départ. Elle peut aussi être
utilisée pour des virus à ARN.
Exemple : VIH ou leucose féline, cette méthode nous donne une idée de l’avancée de l’infection : s’il y a
beaucoup de copies (charge virale importante), la maladie est assez avancée, le chat est en fin de vie.
NB : La quantification absolue est également possible avec le SYBR green (mais moins bien reproductible).
B. La méthode SYBR Green

Comme pour une PCR classique on utilise de l’ADN matrice, 2 amorces, 4 dNTPs et une ADN polymérase
(mais pas de sonde). On utilise en plus une molécule intercalante (SYBR Green) qui se fixe sur le petit
sillon de la double hélice de l’ADN double brin. Quand cette molécule est fixée à l’ADN double brin elle
émet une fluorescence à la bonne longueur d’onde d’excitation.
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Molécule de SYBR green au niveau de l'ADN
Cette méthode a l’avantage de permettre le suivi d’un état de l’ADN : quand on le dénature, la
fluorescence diminue, mais elle est rétablie quand on diminue la température (car réappariement des deux
brins d’ADN).
On fait subir à notre mélange une série de cycles de PCR puis on le chauffe en continu tout en mesurant la
fluorescence. On suit ainsi la dénaturation de l’ADN (plus l’ADN est dénaturé et plus la fluorescence
diminue). Attention : Au début, il n’y a pas assez d’ADN pour que la fluorescence soit détectable. Dès qu’on
passe le seuil de sensibilité de la machine, la fluorescence est détectée
Applications : Cette méthode est très utile dans le diagnostic des maladies infectieuses (détection de la
charge virale dans le cas du VIH par exemple, sensibilité à la tremblante ovine), mais aussi pour détecter des
cancers, des mutations ou des maladies génétiques.
Elle est aussi utilisée pour le sexage (on en fera un peu en TP, utile chez les oiseaux par exemple) et en
recherche car elle permet de comparer l’expression d’un très grand nombre de gènes (RT-qPCR).
Depuis quelques années, la PCR est passé à du haut débit, voire du très haut débit. Par exemple, pour le
diagnostic de maladies infectieuses, on utilise souvent la technique Biomark™ qui utilise une plaque
contenant 96 puits, on peut donc suivre 96 mélanges en même temps (sauf si on utilise certains puits pour
une gamme étalon).
Exemple de Biomark™ :
On dépose d’un côté les échantillons à tester (96 échantillons ou possibilité de faire 2x48) et de l’autre
différents couples d’amorces (de même, 96 couples ou 2x48). Tous les éléments (amorces et échantillons)
vont se mélanger grâce à un réseau de capillaires et de valves (les puits sont interconnectés par des canaux),
ce qui va permettre d’obtenir un tableau avec en abscisse les échantillons, en ordonnée les amorces et au
niveau des croisements la couleur de la case indique si le pathogène testé est présent ou non dans
l’échantillon. Il ne l’est pas si la case est noire, et plus on se rapproche du ! VIOLET ! plus le test est positif.
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Il s’agit en fait d’une PCR quantitative « miniaturisée » qui permet de faire du très haut débit. Les volumes
utilisés sont de l’ordre du picolitre, ce qui permet un coût réduit et une utilisation moindre de matériel.
Il y aura plein d’exemples de diagnostics de maladies infectieuses dans le cours sur le diagnostic
moléculaire.
C. Conclusion sur la qPCR

La PCR quantitative permet de gagner en sensibilité par rapport à la PCR classique et en se plaçant en début
de courbe on va pouvoir faire de la quantification. La qPCR est particulièrement intéressante dans le
diagnostic des maladies infectieuses et a une influence sur le pronostic qu’on va pouvoir faire sur l’animal.
II. La LAMP
LAMP= Loop-mediated isothermal amplification.
Il s’agit d’une amplification isotherme (et non 3 températures différentes comme la PCR un bain
marie) qui utilise les boucles de l’ADN (en épingles à cheveux).
Cette technique a été inventée dans les années 2000 par des japonais. Elle est utilisée principalement pour le
diagnostic de maladies infectieuses présentes dans les pays en voie de développement car elle ne nécessite
pas de matériel coûteux (un bain marie suffit, pas besoin de thermocycleur). Cette technique permet un
diagnostic fiable et rapide.
Pour la LAMP quantitative, de nouveaux appareils plus coûteux existent.
Principe :
Vidéo reprenant le principe : http://loopamp.eiken.co.jp/e/lamp/anim.html
A voir et revoir, cette technique est relativement complexe…
On choisit des amorces dans la région de la zone que l’on veut amplifier. (4 ou 6 amorces qui reconnaissent 6
régions de la cible dans une LAMP classique).
Les amorces externes (F3 et B3) sont simples alors que les internes (FIB et BIP) sont doubles (constituées de
2 fragments différents) et reliées par 4 nucléotides T pour ajouter de la souplesse.
La réaction se fait en une seule étape à la température constante de 65°C : on utilise une ADN polymérase
sans activité exonucléase, avec une activité de déplacement de brin (élément important qui permet
d’expliquer la suite). En 30 à 60 minutes, on a une amplification d’un facteur 1010, donc très importante.
/!\ Contrairement à la PCR, il n’est pas nécessaire de savoir schématiser la LAMP mais il faut connaître
le principe.
Pour chaque action de l’ADN polymérase on a un déplacement de brin et la formation de boucles du début à
la fin de l’amplification. On obtient des molécules en zigzag de plus en plus longues au fur et à mesure des
cycles de la polymérase. Les molécules obtenues ont alors des séquences différentes de celles de départ mais
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une grande quantité d’ADN est amplifiée à partir de peu de matériel. Quand un nucléotide est ajouté au cours
de l’amplification, on a libération d’un pyrophosphate de magnésium. On considère que la quantité dégagée
est tellement importante que les pyrophosphates précipitent et créent un trouble visible à l’œil nu dans le tube
contenant l’échantillon.
L’identification peut ensuite se faire sur gel d’agarose ou par observation du trouble ou non de l’échantillon
dans un tube à essai (clair : négatif ; trouble : positif).
L’observation de la turbidité est très théorique mais pas suffisante dans la pratique. Il faut alors ajouter une
molécule qui colore l’ADN (SYBR Green par exemple car il y a beaucoup d’ADN double brin) à la réaction
et puis éclairer avec des UV. Les échantillons positifs sont clairement fluorescents.
La visualisation peut également se faire en spectre visible, les échantillons négatifs apparaissant oranges
alors que les positifs sont verts.
Intérêt de la LAMP :
Avoir, avec peu de matériel (congélateur, bain marie…), la possibilité de mettre en place un test de maladies
infectieuses. Techniques utilisées dans les pays en voie de développement, par exemple pour le diagnostic
de la peste des petits ruminants en Afrique. On peut également envisager de faire des analyses
quantitatives en utilisant des turbidimètres en temps réel (mesure de l’apparition du précipité). La
quantification n’est pas aussi précise qu’avec la PCR quantitative mais on voit qu’elle est tout de même
utilisable car la gamme étalon est assez droite. On perd alors l’avantage d’une technique bon marché à cause
du coût important des turbidimètres.
Conclusion sur le LAMP :

Comparé à la qPCR et à la PCR classique, il n’y a pas d’étape de dénaturation puisque l’unique étape se
fait à température constante. La LAMP est très efficace (amplifie en quantité beaucoup plus importante et de
façon beaucoup plus spécifique). La révélation est simplifiée en théorie (en regardant le tube) et le coût
total est réduit. La quantification est possible si on utilise un turbidimètre mais on préfèrera alors passer à la
PCR quantitative. La RT-LAMP est également possible pour des virus à ARN. MAIS cette technique est
utilisable uniquement en diagnostic car on perd la structure initiale de l’ADN, on ne peut donc pas faire de
clonage par exemple.
III. Séquençage - NGS (Next Generation Sequencing)

A. La méthode de Sanger (1976)
Exemple de séquençage obtenu par méthode

Sanger
Autoradiographie
Cette méthode est souvent utilisée afin d’effectuer le séquençage ponctuel d’une petite séquence. Pour le
séquençage d’un génome entier, on utilise le séquençage nouvelle génération (NGS, voir plus bas).
Il s’agit d’une méthode de marquage, suivie d’une lecture sur film d’autoradiographie. Pour le marquage,
on a d'abord utilisé des nucléotides radioactifs, mais maintenant, ils sont marqués avec un fluorochrome.
Cela permet une analyse informatique.
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La méthode Sanger nécessite une ADN polymérase, une seule amorce et 4 dNTP. L’ADN peut être cloné
dans un plasmide ou amplifié par PCR.
Elle repose sur le principe de terminaison de chaîne : on réalise une extension à partir du brin
complémentaire. En effet, en plus des 4 dNTP on ajoute un ddNTP (di-déoxynucléotide comportant un H à
l’extrémité 3’ au lieu du OH). Le ddNTP empêche la polymérase de continuer sa synthèse, ce qui stoppe
l’élongation. Il est donc qualifié de terminateur de chaîne.
On prépare 4 échantillons différents : chacun des ddNTP (ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP) est couplé à un
fluorochrome différent pour chaque réaction.
Exemple : réaction en présence du ddATP : celui-ci, peu présent dans le mélange, peut être intégré à la
place du dNTP équivalent : on obtient des molécules de tailles différentes où les plus petits fragments vont
migrer plus loin et les plus gros fragments vont migrer moins loin.
On réalise ensuite une électrophorèse : dans chaque puits, on dépose les échantillons, qui vont migrer en
fonction de leur taille. Dans le cas de marquage radioactif, la lecture est manuelle.
Si on utilise les fluorochromes (de couleurs différentes selon le ddNTP utilisé), on peut mélanger les 4
échantillons (dépôt dans un seul puits). La lecture se fait grâce à un laser qui détecte la fluorescence et la
retranscrit sous forme de pic, et la lecture se fait de 5' vers 3' du bas vers le haut.
Dans certains cas, le manipulateur peut être amené à vérifier manuellement la séquence (par exemple quand
un même nucléotide se succède plusieurs fois dans la séquence : au lieu d’obtenir des pics séparés, on obtient
des pics accolés).
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Il y a quand même une intervention manuelle à la fin pour mettre les séquences dans le bon ordre afin de
séquencer le génome.
La méthode de Sanger présente donc plusieurs intérêts : on peut avoir des systèmes informatisés, des
systèmes capables de corriger des séquences, et on peut lire plusieurs données en même temps.
IMPORTANT : Il peut y avoir des variations d'un virus à l'autre. C'est le cas si l'on prend par exemple un
échantillon avec un virus Influenza.
La séquence mise en avant par la méthode de Sanger est alors la séquence consensus, c'est-à-dire la
séquence la plus abondante parmi toutes celles présentes.
Les séquençages de nouvelle génération permettent de faire apparaître aussi les variants minoritaires.
B. La NGS (Next Generation Sequencing)

1. Principe du NGS
Le séquençage à haut débit (ou NGS) permet de séquencer rapidement de grandes quantités d'ADN,
même des génomes entiers.
C'est une méthode plus rapide, qui ne nécessite pas de clonage, et avec des coûts beaucoup plus faibles
puisqu’il n'y a pas besoin cloner quoi que ce soit. On peut réaliser une lecture en temps réel (comme la PCR
quantitative).
Le NGS offre une grande profondeur de lecture, permettant de déterminer et différencier les variants
minoritaires.
Il y a différents appareils de séquençage :

• 454 (= pyroséquençage) de la firme 454 Life Sciences (cette méthode est déjà obsolète)
• Illumina
• Nanopore DNA sequencing
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2. Applications du NGS
Les applications du NGS sont multiples :

• Le séquençage haut débit permet de séquencer des petits génomes d'un pathogène en un seul
« run », donnant accès à toutes les séquences individuelles alors que Sanger ne permet de séquencer
qu’une séquence consensus.
• Il permet également de séquencer le génome d'un individu (ex : humain)
• On peut aussi faire de la métagénomique : on séquence de l'ADN d'un prélèvement donné
(prélèvement d'air, d'eau, d'un animal malade …) et on accède ainsi à la séquence de chaque
pathogène qui est présent dans le prélèvement
• Le NGS a une grande profondeur de lecture, c'est-à-dire qu'il permet de relever tous les génomes
de toutes les particules virales ou bactériennes présentes dans un mélange : virome, microbiome,
bactériome…
• Le NGS permet aussi de faire un génotypage, une recherche de variants rares (infections, cancers,
comme par exemple le VIH). Le fait d'avoir accès à toutes les séquences permet une surveillance
régulière de certaines d'entre elles. On peut donc déceler la présence de variants rares néfastes très
tôt (ex : résistance à un médicament).
• On peut aussi séquencer le transcriptome (ARN) en réalisant d'abord une rétrotranscription en
ADN.
Avant 2005, le séquençage haut débit se faisait dans d’énormes usines à séquençage, nécessitait 100 à 150
séquenceurs capillaires, 5 à 10 robots de repiquage de colonies, des douzaines de machines PCR, des milliers
de plaques à 384 puits et des douzaines de techniciens, pour des budgets de plusieurs millions de dollars.
Tout cela était nécessaire pour analyser 1,2.106 bases/jour/instrument, au prix de 1 à 2 millions de dollars
pour 1Gb de données brutes.
Maintenant, le système s’est fortement miniaturisé, et ne nécessite plus qu'une paillasse, un séquenceur, et
une personne pour produire 2500.106 bases/jour/instrument jusqu’à 10 Gb de données brutes pour
600€.
3. NGS, exemple 1 : l'Oxford Nanopore Technology
Le principe est basé sur un nanopore (protéine) inséré dans un polymère électriquement résistant. On va
mesurer la variation de potentiel au niveau du pore grâce à l'appareil portatif minIONTM, qui est un
appareil miniaturisé se branchant par port USB pour faire une étude informatisée.
On a désormais la possibilité de séquencer directement des lésions, cultures, sans amplification

préalable.
En cas de lésions pathogènes des tissus par exemple, on utilise un échantillon très riche en pathogène, on
purifie l'ADN, et l'on analyse sans l'amplifier.
Ce séquençage haut débit a pour intérêt de voir s'il y a des variants. Si l'amplification par PCR introduit de
nouvelles mutations, on ne peut pas savoir si elles étaient déjà dans la séquence ou si elles sont apparues à
cause de la PCR. Cette nouvelle méthode permet de ne plus avoir besoin de passer par une PCR.
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Principe : (voir vidéo disponible sur la diapositive n° 32 du cours)

Sur tous les pores le même phénomène se produit : on lit la séquence d'ADN (complexé par une enzyme qui
a déjà séparé un des brins). Le système lit les bases 3 par 3. On a une variation du potentiel en fonction
des bases qui passent au niveau du lecteur.
Il y a jusqu'à 512 pores par support. Il n'y a pas besoin de sélectionner préalablement la longueur du
fragment. Les séquences peuvent donc être très longues si l'ADN est de bonne qualité, alors que la méthode
454 nécessite des séquences de 500 à 1000 pb, et la méthode illumina de séquences de 150 pb.
Plus les séquences sont longues, plus l'alignement est facile à réaliser. Il faut un système informatique qui
réaligne toutes les données obtenues de séquence à séquence pour obtenir la séquence consensus.
L'Oxford nanopore technology est une technique qui est encore en cours de développement.
Exemple : essai sur fowlpox cultivé sur œufs.

On a séquencé 610000 séquences dont 39625 séquences de virus. Cela a permis d'aligner une séquence
consensus de 288539 pb, qui est égale à la longueur totale du génome fowlpox. La profondeur de lecture
moyenne est de 638X. Cela permet une bonne couverture et compense les erreurs inhérentes à la technique.
La séquence la plus longue obtenue est de 70 kb, soit un quart du génome séquencé en une seule technique.
4. NGS, exemple 2 : évolution des virus Influenza A aviaires (H6N1)
Les virus Influenza sont faiblement pathogènes. Ils ne donnent pas de symptômes chez les palmipèdes
domestiques, mais en donnent chez les galliformes (dinde, poulet). Il y a alors un certain nombre de
mutations, entraînant une influence sur les protéines Hemagglutinine ou Neuramidinidase (d’où les noms
des virus HxNx).
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On s'intéresse à la variation de taille de Neuraminidase (protéine N).

Dans un élevage à canards de Barbarie dans le bâtiment A et à dindes de chair dans le bâtiment B, on
observe d'un seul coup une forte mortalité chez les dindes.
Le vétérinaire est appelé et fait des prélèvements trachéaux chez les dindes. Les canards étant déjà partis à
l’abattoir, des prélèvements de lisiers sont réalisés pour récupérer de l'ARN. On trouve la présence de virus
H6N1 faiblement pathogènes.
Avec les prélèvements réalisés, on fait une PCR classique avec gel avec des amorces qui encadrent la
position. Celle-ci met en évidence la perte de 60 nucléotides chez le virus touchant la dinde par rapport à
celui du canard. On se demande alors comment on est passé d'une forme à l'autre : y a-t-il eu une
modification de la taille au moment du passage aux dindes, ou des copies de la forme plus courte étaient-
elles présentes de façon minoritaire chez les canards ?
La PCR n'étant pas assez sensible pour savoir quand l'adaptation a été faite, on est donc passés au
séquençage. On a fait une extraction d'ARN directe soit à partir du lisier soit à partir des écouvillons
trachéaux de dinde. 8 segments ont été séquencés.
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GRAPHIQUE : en abscisse il y a la longueur du

fragment, et en ordonnée le maximum de lecture. Il y
avait beaucoup plus de matériel dans le lisier que dans les
écouvillons.
Les délétions sont représentées par des traits. On voit tout
d'abord qu'il n'y a pas de délétion chez le canard mais
qu'il y en a une chez la dinde. Mais, en zoomant sur les
délétions, on voit que 13 des 670 génomes viraux lus
dans le lisier des canards présentent la délétion de 60
nucléotides.
Résultats : le virus avec la délétion était déjà présent chez le canard, mais en faible quantité car il n'avait
aucun avantage. Celui-ci a réussi à contaminer les dindes, et il a fallu seulement quelques copies du virus
avec la délétion pour infecter toutes les dindes (transmission par l'éleveur en passant d'un bâtiment à l'autre)
car il a un grand avantage sélectif chez elles. La délétion était donc déjà présente et a été sélectionnée quand
le virus est passé des canards aux dindes.
Le séquençage profond a donc permis d’expliquer d’où venait la délétion en ayant accès à chaque
fragment d’ADN.
Conclusion
De nouveaux appareils sont actuellement en cours de développement : Le NNGS (Next Next Generation
Sequencing) permettrait le séquençage d'une molécule unique, sans amplification donc avec moins de risques
d'introduire des erreurs, avec des performances toujours plus hautes pour des coûts toujours plus bas.
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Typeurs : Paluch - Reynier BMGC - Biologie Moléculaire Date : 07/02/2017

Fauquet - Evrard Analyses quantitatives Heure : H5-H6

Analyses quantitatives & haut débit

Ainsi l’ADN polymérase ne peut rien rajouter à son extrémité.

Quantification : deux méthodes possibles

B. La méthode SYBR Green

Molécule de SYBR green au niveau de l'ADN

C. Conclusion sur la qPCR

Conclusion sur le LAMP :

III. Séquençage - NGS (Next Generation Sequencing)

Exemple de séquençage obtenu par méthode

B. La NGS (Next Generation Sequencing)

Il y a différents appareils de séquençage :

Les applications du NGS sont multiples :

3. NGS, exemple 1 : l'Oxford Nanopore Technology

On a désormais la possibilité de séquencer directement des lésions, cultures, sans amplification

Principe : (voir vidéo disponible sur la diapositive n° 32 du cours)

Exemple : essai sur fowlpox cultivé sur œufs.

4. NGS, exemple 2 : évolution des virus Influenza A aviaires (H6N1)

On s'intéresse à la variation de taille de Neuraminidase (protéine N).

GRAPHIQUE : en abscisse il y a la longueur du

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