Chromatographie

On peut définir la chromatographie comme une méthode qui permet de séparer les
composants d'un mélange à analyser grâce à leur migration différentielle le long
d'un dispositif séparateur. Ce dispositif séparateur a une forme géométrique qui
peut varier suivant les conditions de mise en oeuvre du procédé analytique ; au sens
théorique, ce dispositif séparateur est dans tous les cas une colonne
chromatographique ; elle peut avoir la forme d'un cylindre plus ou moins long ou
d'un parallélépipède très aplati.

Ce cylindre ou ce parallélépipède est constitué d'une matière solide pulvérulente,

quelquefois fibreuse, baignant dans un fluide convenable : liquide ou gaz ; dans le
cas d'un dispositif séparateur de forme cylindrique, il s'agit d'une vraie colonne
chromatographique ; dans l'autre cas, on a affaire à une feuille ou à une couche
chromatographique. Dans tous les cas, le dispositif séparateur est constitué de deux
phase, l'une granulaire est la phase fixe, l'autre (liquide ou gazeuse) est la phase
mobile, dans laquelle baignent les granules de la phase fixe.

La migration différentielle des diverses substances du mélange à analyser résulte de

l'aptitude qu'a chacune de ces substances à se répartir différemment entre les deux
phases (fixe et mobile) formant le dispositif séparateur. Pour un couple donné de
phases fixe et mobile, chaque substance (i) est caractérisée par la valeur d'un
coefficient (coefficient de répartition de la substitution entre les deux phases)
exprimant le rapport des concentrations en cette substance dans la phase fixe (Cf) et
dans la phase mobile (Cm) :

Ki = Cfi / Cmi .

La mobilité chromatographique des substances, leur position le long du dispositif

séparateur, est fonction de la valeur de répartition entre phases.

Le fluide (phase mobile) qui progresse dans le masse de support granulaire (phase
fixe) provoque des perturbations successives de l'équilibre de répartition entre
phases de chacune des substances (i), tandis que cet équilibre est en permanence
rétabli par suite de l'affinité pour la phase fixe des substances chromatographiées.

En pratique, la chromatographie est faite soit dans un tube en verre, en métal ou en

matière plastique appropriée contenant la matière granulaire constituant la phase
fixe et le fluide mobile intergranulaire (phase mobile), soit dans une couche de
matière granulaire portée par une plaque de verre ou de métal ou de matière
plastique appropriée, soit dans une feuille de matière fibreuse (fibre de cellulose, de
verre...). on parle alors respectivement de chromatographie sur colonne ou de
surface (sur couche, sur feuille). En chromatographie sur colonne, le fluide mobile
(gaz ou liquide) progresse par gravité ou par différence de pression (pompe, source
de fluide comprimé). En chromatographie de surface, la phase mobile progresse par
capillarité entre les grains ou les fibres de phase fixe.

Pour les chromatographies sur colonne, le mélange des substances soumis au

processus séparateur est introduit à l'origine du dispositif, sous forme d'une zone
fine ; dans l'autre cas, il s'agit de petites taches.

Pour ceci, un petit volume du mélange des substances à séparer sera déposé au
sommet de la colonne, ou à une extrémité de la surface chromatographique.

Après passage d'une quantité convenable d'une phase mobile appropriée, les
substances contenues dans la zone ou la tache initiale seront séparées le long du
dispositif séparateur suivant la direction de progression de la phase mobile soit sous
forme de zones successives (colonne), soit sous forme de taches successives
(surface).

Cette étape de la chromatographie est désignée sous le nom de développement du

chromatogramme. Pour recueillir les substances ainsi séparées, on procède à leur
élution hors du dispositif séparateur, grâce à une phase mobile appelée éluant.

La phase mobile utilisée peut être de même nature que celle qui a été employée
pour introduire l'échantillon à analyser à l'origine du dispositif (élution simple).
Elle peut également être de nature différente. Souvent, plusieurs phases mobiles
successives de natures différente sont utilisée (élution par étapes). Dans certains
cas, c'est une phase mobile de composition continuellement variable qui est
employée (élution par gradient de pouvoir éluant).

Les substances séparées sous forme de zones ou de taches distinctes peuvent être
soit mises en évidence, à la sortie de la colonne chromatographique, à l'aide d'un
détecteur approprié (chromatographie en phase gazeuse ou liquide),soit sur le
dispositif séparateur lui-même grâce à l'emploi d'un réactif chromogène (pour les
surfaces...), soit directement sur le dispositif séparateur si les substances
chromatographiées sont colorées.

Principe physico-chimiques

Comme pour l'échangeur d'ions, des processus d'équilibre physico-chimique

réversibles sont à l'origine des séparations chromatographies, et plus
particulièrement les liaisons chimiques covalentes et surtout non-covalentes.

En fait la chromatographie utilise toutes les forme possibles d'interactions

réversibles entre les molécules de la phase fixe et celles du soluté.

Pour classer les méthodes chromatographiques, on utilisera généralement les états

physiques des phases mobile et fixe.
 Avantages et efficacité

La chromatographie est plus rapide avec du gaz qu'avec du liquide : une séparation
prend quelques secondes ou minutes avec la première, quelques minutes ou heures
pour la deuxième. De plus la sensibilité de détection est meilleure avec la première.
La seule limitation de cette méthode est que le soluté doit être volatile, ce qui n'est
pas toujours le cas pour des substances organiques. De plus, l'utilisation de hautes
températures induit des risques de dénaturation des composés organiques (risques
moins importants avec des fluides super-critiques). Le problème majeur reste
néanmoins le choix de la phase mobile.

La chromatographie en phase gazeuse a envahi la biochimie et l'industrie et la

recherche pour la production d'insecticides, de solvants...

Pour des molécules plus larges, la méthode est totalement inappropriée. On lui
préférera celle utilisant un liquide.

L'échangeur d'ions est utilisée avec des groupes ionisés.

La chromatographie avec colonnes est plus efficace que les chromatographies à

feuille. Toutefois, elle est très utilisée pour des applications biochimiques, à cause
de leur rapidité et de leur faible coût.

Chromatographie en phase liquide

La chromatographie, un moment éclipsée par la chromatographie en phase gazeuse,
a fait des progrès considérables, grâce à la miniaturisation des colonnes et à la
détection en continu des fractions. L'appareil est constitué d'une colonne d'acier
d'une longueur de l'ordre de 200 mm et de diamètre intérieur de 4 mm, remplie de
particules de tailles inférieure à 20 microns; cette colonne est précédée d'une
pompe à haute pression, permettant d'injecter le solvant sous une pression de
plusieurs dizaines de bars. Des microvannes assurent l'introduction de quelques
microlitres de solution à analyser, en tête de colonne. La détection des fractions est
le plus souvent faite par absorption U.V. ou réfractométrie; elle est suivie de
l'enregistrement graphique des signaux ou de leur traitement direct par calculateur.
Toutes les opérations peuvent être automatisées dans les cas d'analyses de routine.
Les quantités analysées sont de l'ordre du milligramme et l'efficacité varie entre
1000 et 10 000 plateaux théoriques; sur des colonnes appropriées on sépare par
exemple tous les aminoacides naturels, alors des quantités de substance aussi que
10-12 peuvent être décelées.

Par ailleurs, l'extension de cette chromatographie au niveau de la préparation est

facile pour des quantités de quelques grammes, et les laboratoires l'emploient très
couramment. Le problème à l'échelle industrielle est de trouver des phases fixes
dont le prix ne soit pas prohibitif; la chromatographie en phase liquide est ainsi très
compétitive pour des produits comme les antibiotiques ou les protéines: des unités
arrivent à produire quelques centaines de kilogrammes par jour.

Les méthodes utilisées pour préparer les échantillons, et les différentes phases fixes
sont très nombreuses ; un choix judicieux fournira la solution de n'importe quel
problème analytique.

Chromatographie en phase gazeuse

Cette chromatographie utilise comme son nom l'indique, une phase mobile gazeuse.
Les échanges ont lieu entre ce gaz et un solide immobile qui n'a, le plus souvent,
d'autre rôle que de servir de support à un liquide qui l'imprègne et constitue la
véritable phase fixe. Les constituants du mélange à séparer se partagent entre le gaz
vecteur et le liquide dans lequel ils se dissolvent au niveau de chaque grain et l'on a
donc, dans ce cas, une résolution basée sur l'équilibre de partage liquide-gaz. Plus
rarement, on fait appel à des équilibres d'adsorption gaz-solide: la phase fixe est
alors un solide poreux tel que l'alumine ou le carbone activé. Cette dernière
technique est la mieux adaptée, notamment à l'analyse de composés gazeux ou très
volatils.

Pratiquement on emploie comme phase mobile l'hélium, l'hydrogène, l'azote ou

l'argon. Le mélange à analyser est introduit dans le circuit gazeux par brusque
vaporisation dans une chambre d'injection; le tampon de vapeur formé circule dans
la colonne au contact de la phase fixe. Comme dans tous les autres procédés, il se
fixe sur ses premières sections; puis le gaz vecteur l'entraîne progressivement sur
les suivantes, en même temps que la séparation commence à se produire.

Une des raisons du très grand succès de la chromatographie en phase gazeuse est
qu'il existe de nombreux procédés de détection des variations de composition d'un
élément gazeux, sensibles et se prêtant bien à une traduction en signaux électriques.
Ils ont tous le même principe: le gaz vecteur passe avant d'entrer dans la colonne,
sur un filament chauffé dont la résistance est comparée à celle d'un filament
identique balayé par l'effluent. La présence d'une vapeur organique dans l'effluent
réduit le refroidissement et les signaux électriques sont traduits en un
enregistrement. Les constituants sont alors décelés et on peut mesurer leur
concentration suivant l'aire des pics (dépendance linéaire). On peut aussi citer les
détecteurs à ionisation de flamme, à ionisation d'argon et à capture d'électrons.
Parfois le chromatographe est associé à un spectrographe de masse.

Cette chromatographie est très efficace comme moyen de séparation. Elle est aussi
utilisée pour la préparation de substances en petite quantité. Les colonnes
industrielles perdent, elles, de leur efficacité.
 Chromatographie en phase liquide à haute
pression
elle met en oeuvre, comme phase mobile, un fluide porté au delà de l'état critique
(fluide super-critique) par un contrôle adéquat de la température et de la pression.

Pour cette méthode, on utilise le fluide à l'état critique (Tc, Pc, masse volumique
critique). Les propriétés des fluides critiques apportent de nombreux avantages à la
chromatographie : la diffusion d'un soluté sera beaucoup plus rapide dans un fluide
supercritique que dans un liquide. On a pu dire qu'un fluide supercritique était
analogue au métro aux heures de pointe : la densité des usagers y est élevée et,
pourtant, le milieu reste fluide et les déplacements rapides.

Ainsi, l'intérêt d'utiliser un fluide supercritique en chromatographie réside dans les

caractéristiques suivantes :

 possibilité d'y dissoudre des solutés variés,

 séparation de composés thermosensibles dans la mesure où la température, à
l'état supercritique, reste modérée,
 meilleur efficacité du système chromatographique en raison de la faible
viscosité du fluide supercritique ; les séparations pourront être très rapides
dans les cas de colonnes remplies (quelques minutes),
 possibilité de mettre en oeuvre, comme en chromatographie en phase
gazeuse, des colonnes capillaires de grande taille (plusieurs dizaines de
mètres) : on peut alors séparer des mélanges complexes,
 les méthodes de détection de la chromatographie en phase supercritique
peuvent être associées soit à celle de la chromatographie en phase liquide,
soit à celle de la chromatographie en phase gazeuse : transparence du CO2
dans l'ultraviolet (absorptiométrie U.V.), spectrométrie infrarouge.

On utilise le CO2 pour une détection par flamme ; on peut aussi associer à cette
méthode des détecteurs par fluorimétrie, spectrométrie de masse ou diffusion de la
lumière.

Le CO2 est le fluide le plus utilisé à cause de nombreuses propriété intéressantes :

manipulation aisée, bon pouvoir solvant, non-toxicité, ininflammable, non corrosif,
inodore, bon marché.

Deux points pratique doivent être soulignés :

 la mise en oeuvre des fluides supercritiques nécessite un contrôle strict de la

pression plutôt qu'un contrôle du débit,
  l'état supercritique doit être maintenu jusque dans le système de détection.

Un domaine important de cette méthode chromatographique consiste en la

séparation des oligomères des polymères, comme ceux de polystyrènes. On analyse
fréquemment aussi les produits pétroliers (séparation en familles : alcanes, oléfines,
aromatiques, composés polaires), des acides gras.

La chromatographie en phase supercritique est promise à un grand avenir.

Extraction liquide-liquide
Principe physico-chimique

L'extraction liquide-liquide est une opération qui permet la séparation d'un ou

plusieurs constituants par l'utilisation de leur distribution inégale dans deux liquides
pratiquement non-miscibles.

Généralement on met en contact intime la .solution d'alimentation, contenant les

constituants à séparer (solutés) avec un autre solvant appelé solvant qui extrait
préférentiellement un ou plusieurs des solutés. Le solvant qui contient alors le ou
les solutés est désigné sous le terme :d'extrait, la solution d'alimentation ayant
perdu la majeure partie de ces mêmes constituants est appelé raffinat.

En pratique l'utilisation d'un procédé liquide-liquide requiert deux opérations

successives :

 une mise en contact intime des deux liquides durant un temps suffisant à
l'obtention de l'équilibre pendant lequel le ou les solutés sont transférés de
la phase d'alimentation dans le solvant ; à l'équilibre, le rapport des
concentrations du soluté dans l'extrait et le raffinat , appelé coefficient de
distribution, donne une mesure de l'affinité relative du soluté pour les deux
phases.
 après leur contact, une séparation ultérieure des deux liquides (extrait et
raffinat)

Même si le principe de l'extraction liquide-liquide parait simple, sa mise en place

est assez complexe. Comme nous allons le voir, il faut successivement choisir le
soluté, le système liquide-liquide, le procédé et enfin l'appareil qui donneront les
meilleures performances.

Choix d'un système industriel d'extraction liquide-liquide

Il faut savoir que l'extraction industrielle s'accompagne souvent d'une des deux
opérations suivantes : une séparation sélective ou une séparation de matières
premières diluées. La nécessité économique d'une bonne efficacité des séparations
conduit à ne considérer que des systèmes continus. L'extraction peut se diviser en
trois étapes :

 l'extraction du soluté à l'aide d'un solvant contenant l'agent actif de la

séparation
 le lavage par reflux au cours duquel les impuretés sont réextraites du
solvant
 la récupération des composés de l'extrait (solvant et soluté purs), elle peut
être faite par une nouvelle extraction liquide-liquide ou par cristallisation,
précipitation ou complexation chimique.

Etant donné un soluté, comment choisir le meilleur système de deux phases pour

lequel le soluté présente une solubilité différentielle exploitable industriellement ?.

Pour un bon procédé industriel il nous faut une installation économique, fiable,

compacte, efficace, qui assurera la séparation avec une excellente sélectivité, une
cinétique d'échange rapide à des températures et pressions voisines des conditions
ambiantes.

 Le choix du solvant est primordial et très complexe, en effet celui-ci doit

satisfaire différentes conditions : avoir une forte capacité d'extraction, une
grande sélectivité, des caractéristiques physico-chimiques permettant une
récupération à la fois facile du soluté et du solvant, une solubilité
négligeable dans le raffinat, être stable chimiquement etc ...
 Des données thermodynamiques sont nécessaires à la détermination des
courbes de distribution qui nécessite de nombreuses et fastidieuses
mesures. Pour éviter ces expérimentations trop nombreuses, un système
de corrélation, basé sur les mécanismes de transfert de masse, a été mis en
place et permet la modélisation dynamique des unités industrielles.
 Les données cinétiques rendent compte de la vitesse à laquelle s'effectue le
transfert du soluté d'une phase à l'autre.

Définition du procédé

Le soluté et son système liquide-liquide étant choisis, la réalisation d'un atelier

industriel requiert la détermination d'un diagramme de procédé. Celui-ci définit
les conditions opératoires : flux entrant et sortant ainsi que leurs débits et
compositions (bilan matière).

Il est établi à partir des données indispensables suivantes :

  le nombre d'étages nécessaires aux séparations pour chaque étape du
procédé
 le rapport des phases dans chaque contacteur
 les performances des séparations caractérisées par la teneur en soluté du
raffinat, la teneur en soluté de l'extrait avant et après lavage éventuel à
reflux, les coefficients de séparation des solutés, notamment des impuretés
du composé principal à traiter.

Classification des extracteurs liquide-liquide industriels

On distingue trois classes d'appareils d'extraction liquide-liquide :

 les mélangeurs-décanteurs constitués d'une chambre de mélange suivie

d'une chambre de décantation.
 Leurs principaux avantages sont : une efficacité élevée, une extrapolation
fiable et une grande flexibilité.
 Leurs inconvénients majeurs : le coût par étage, le temps de séjour, la taille
de l'installation.
 Les extracteurs-colonnes dans lesquels la circulation est due à la différence
de densité entre la phase lourde (introduite en haut de colonne) et la phase
basse (introduite en bas de colonne).
 Les extracteurs centrifuges peuvent être de deux types à étage (mélangeur
et décanteur sont regroupés) ou différentiels continus (les phases circulent
à contre-courant dans des garnissages variés).

Choix d'un extracteur liquide-liquide

La détermination du contacteur optimal à un procédé défini est un problème

complexe.

En effet , ce choix doit prendre en compte :

 des contraintes liées aux propriétés physiques du système : masse

volumique, viscosité, tensions interfaciales ...
 des contraintes liées à la thermodynamique du transfert : débit et
concentrations des phases;
 des contraintes liées à la cinétique du transfert : temps de séjour des
phases, aires interfaciales de contact;
  des contraintes industrielles : de conception (fiabilité d'extrapolation), de
construction (faisabilité des appareils), économiques (coûts des
immobilisations, d'exploitation et d'entretien), opératoires (facilité
d'exploitation et d'entretien, souplesse et adaptivité aux variations
commerciales).

Il existe des tableaux de comparaison qualitative des extracteurs liquide-liquide ,

fondés essentiellement sur les contraintes résultant du système des phases et sur les
caractéristiques essentielles des extracteurs. On utilise ces tableaux pour effectuer
une présélection des appareils. Ces derniers devront ensuite être comparés sur des
critères industriels en atelier pilote. Malheureusement leur classement diffère
presque toujours selon le critère retenu (constructif, opératoire ou économique)
ainsi que d'après leur fiabilité d'extrapolation, le choix sera un compromis
empirique relevant plus d'une expérience individuelle que d'une analyse rigoureuse
difficile à faire.

Economie des procédés d'extraction liquide-liquide

La conception d'une unité passe par des choix concernant la phase d'alimentation,
la phase solvant, les contacteurs liquide-liquide, les conditions opératoires. De
plus l'économie d'un procédé est influencée par les traitements subis en amont et en
aval de l'unité d'extraction.

L'extraction liquide-liquide est une opération fondamentale à faible coût direct. Sa

sensibilité à un grand nombre de facteurs n'en permet pas l'application sans une
étude préalable d'optimisation. Les facteurs suivants sont favorables :

 une forte concentration du soluté à extraire

o le choix dans un mélange à séparer du soluté minoritaire (coût
d"extraction d'une mole constant pour un système donné)
o la récupération des sous-produits d'un autre procédé qui fournit des
matières premières à bas prix (cas de l'uranium sud-africain extrait
des résidus aurifaires)

Applications industrielles

L'essor industriel des procédés d'extraction liquide-liquide en chimie minérale a son

origine dans les besoins de l'industrie nucléaire en sels de pureté exceptionnelle. Au
cours de la période 1960-1970 on a assisté à l'application généralisée de cette
technique à l'hydrométallurgie, favorisée par la mise au point d'un complexant
spécifique du cuivre (chélate). Actuellement fonctionnent 200 unités industrielles
hydrométallurgiques, assurant la récupération, la séparation et la purification de très
nombreux métaux.
De plus l'extraction liquide-liquide est appliquée à la fabrication de l'acide
phosphorique très pur, du brome, du nitrate e potassium, et des acides
nitrofluorydriques.

En chimie organique, les applications sont aussi nombreuses et importantes tant au

point de vue quantitatif (pétrochimie) que qualitatif (industries alimentaires et
pharmaceutique, récupération des polluants dans des effluents d'usine).

Extraction haute pression par solvant

Remarque : cette technique est de plus en plus utilisée pour la dépollution des sols.

Principe

L'utilisation d'un solvant sous haute pression, ou même à l'état supercritique,

permet d'augmenter son pouvoir solvant ainsi que la solubilité des différents
solutés.

Le solvant choisi doit avoir un bon pouvoir solvant et une bonne solubilité. Si le
mélange initial ne comporte qu'un seul solvant, le pouvoir solvant ne sera
prépondérant dans le choix du solvant. Par contre, si plusieurs solvants coexistent
dans le mélange initial et si la pureté du produit final est primordial, la sélectivité
du solvant sera privilégiée. D'une manière générale, le traitement des effluents
recherchant la pureté du raffinat, le pouvoir solvant sera un critère de choix. Le
pouvoir solvant détermine également la quantité de solvant à utiliser.

Le choix du solvant repose donc sur son pouvoir solvant et sa sélectivité, mais aussi
sur des critères autres tels que son coût, son absence de danger et l'accessibilité du
point critique.

Pour l'ensemble de ces raisons, le CO2 est un des solvants les plus utilisés.

Les technologies disponibles

Elles sont de deux types :

 les extracteurs


o colonnes statiques :à pulvérisation, à garnissage, à plateaux

o colonnes à agitation mécanique
o colonnes pulsées
  les régénérateurs :


o par distillation
o par évaporation
o par extraction

Les déchets liquides huileux (mélanges liquides eau/ hydrocarbures, huiles

contenant des PCB ou PCT), les boues de peinture, les déchets d'encres, les
colorants, vernis, colle avec phase organique, les déchets de synthèse et autres
opérations de chimie organique (eaux mères de fabrication non-salines, résidus
liquides de distillation de fabrication) peuvent être traités par ces méthodes. Les
principaux secteurs concernés sont : les secteurs industriels d'application de
peinture dans les usines de construction mécanique, électrique ou électronique et le
secteur de la parachimie fabrication d'encres et de peintures

LE RELARGAGE
1) But :
 Améliorer la récupération d'un produit organique (A) mélangé à de l'eau lorsque sa solubilité dans
l'eau n'est pas négligeable.

2) Principe :
Diminuer la solubilité de (A) dans l'eau.

3) Méthode :
Saturer la phase aqueuse en sel (Chlorure de sodium, NaCl, généralement).

4)Technique opératoire :
On ajoute au mélange A + H2O du chlorure de sodium solide et l'on agite de façon à dissoudre le
maximum de chlorure de sodium dans la phase aqueuse et à la saturer en sel.
La présence de sel fait diminuer la solubilité des composés organiques  dans l’eau ; A, en solution
dans l'eau, va sortir de la phase aqueuse et rejoindre la phase organique. On dit qu'il y a relargage.
Remarque :
A peut-être un liquide et le relargage doit être complété par une décantation liquide-liquide.
A peut-être un solide et le relagage doit être suivi d'une filtration (Exemple: préparation d'un savon).

5) Le salage:
Parfois deux phases liquides dont l'une est aqueuse ont du mal à se séparer du fait de leurs densités
voisines. On sature la phase aqueuse avec du sel (chlorure de sodium) et la séparation est facilitée.

Extraction par voie chimique

GOAL!
L'extraction solide-liquide peut être utilisée pour enlever des composés indésirables comme la
caféine du café ou pour collecter des composés intéressants comme les métaux en industries
agro-alimentaires, pharmaceutiques et parfumerie aussi l'obtention des produits de haute pureté
comme les sels d'uranium de qualité nucléaire
MÉTHODES PHYSIQUES DE SÉPARATION ET
D'ANALYSE ET MÉTHODES DE DOSAGE DES BIOMOLÉCULES

A-Techniques chromatographiques
1-GENERALITES

Le terme de "chromatographie" a été crée par Mikhail TSWETT en 1905, pour décrire une technique de
séparation de pigments végétaux (chlorophylles et caroténoïdes) sur des colonnes remplies d’une
substance adsorbante. Il évoque donc la couleur des substances analysées, mais il est possible que
l’origine du nom soit tout autre : en effet, le nom de l’auteur signifie "couleur" en russe, et il est donc
possible que ce dernier ait voulu donner son nom à la technique qu’il avait mise au point (Jaussaud,
1996). Les méthodes chromatographiques regroupent des techniques très variées qui peuvent être
classées selon trois modalités différentes :

• Classification selon la nature physique des phases

• Classification selon le phénomène mis en oeuvre
• Classification selon le procédé opératoire.

1-1-Classification selon la nature des phases :

• la phase mobile est un fluide, donc soit un liquide, soit un gaz (soit encore un fluide "supercritique")
• la phase stationnaire est soit un solide, soit un liquide.

La combinaison de ces possibilités conduit à diverses possibilités :

• chromatographie liquide—solide (cas de Tswett) (LSC)
• chromatographie liquide—liquide (LLC)
• chromatographie gaz—solide (GSC ou GC)
• chromatographie gaz—liquide (GLC ou GC)
• la chromatographie supercritique (SFC)

La SFC représente un cas intermédiaire entre LC et GC, les fluides supercritiques possédant des propriétés à la
frontière entre celles des liquides et celles des gaz.

1-2-Classification selon le phénomène chromatographique :

Ce dernier dépend de la nature (et de la structure) de la phase stationnaire utilisée. On distinguera donc :

• la chromatographie d'adsorption (LSC, GSC) (lorsque la phase stationnaire est un solide); par extension

on
pourrait y rattacher la chromatographie d'affinité, qui correspond à un cas où les propriétés d'adsorption de
la phase stationnaire sont spécifiques vis-à-vis d'un (ou une famille de) composé(s).
• la chromatographie de partage (LLC, GLC), lorsque la phase stationnaire est un liquide non miscible avec
la phase mobile (mise en jeu de coefficients de partage).
• la chromatographie d'échange d'ions (IEC), où la phase stationnaire porte des groupes fonctionnels
acides ou basiques, destinée à séparer des composés ionisés.
• la chromatographie d'exclusion (SEC) où la phase stationnaire (poreuse) se comporte comme un tamis et
sépare les composés en fonction de leur taille; on parle aussi de chromatographie de perméation de gel (GPC).

1-3-Classifications selon les procédés utilisés :

Selon le conditionnement de la phase stationnaire, on distinguera :

• la chromatographie sur colonne (y compris systèmes à contre-courant)

• la chromatographie sur papier
• la chromatographie sur couche mince.

Selon les modalités de migration de la phase mobile, on distinguera

• la chromatographie par développement (les constituants de l'échantillon restent sur la phase stationnaire)

• la chromatographie d'élution (les substances sont entraînées hors de la phase stationnaire).
Les méthodes chromatographiques, bien que très diverses, mettent en jeu un certain nombre de principes
communs :
- les substances se répartissent entre deux phases non miscibles, selon un équilibre lié à un coefficient de
partition, qui dépend à la fois de la nature des composés et de celle des deux phases considérées;
- le renouvellement continu de la phase mobile remet en cause cet équilibre et entraîne une succession d'autres
équilibres, ce qui se traduit par une migration des substances le long de la phase stationnaire;
- la séparation estobtenue car chaque composé migre avec une vitesse qui lui est propre (et dépend
du coefficient de partition décrit ci-dessus).

B-Techniques éléctrophorétiques
1-DEFINITION ET PRINCIPES DE FONCTIONNEMENT

Définition : L'électrophorèse est une méthode de séparation de particules chargées électriquement

par migration différentielle sous l'action d'un champ électrique. Le terme d'ionophorèse est utilisé
dans le cas d'ions de petite taille.

L’électrophorèse libre, en veine liquide selon Tisélius (1937), est réalisée dans un tube en U de

section carrée (ceci afin de pouvoir réaliser des mesures optiques au travers du tube, comme avec une
cuve de spectrophotomètre) : la séparation n'est pas totale, mais les frontières qui se forment sont mises
en évidence par des méthodes optiques (absorption UV, indice de réfraction, fluorescence...). Cette
méthode est utilisée en recherche pour mesurer la mobilité électrophorétique et pour vérifier la pureté
des protéines.

L’électrophorèse sur support ou électrophorèse de zones permet de stabiliser la phase liquide grâce à

l’utilisation d’un support poreux imprégné d'un solvant tamponné.
Appareillage: -Le support doit être homogène, poreux et inerte (cette dernière condition n'est jamais
totalement réalisée).

 
 v

On peut utiliser du papier, de l'acétate de cellulose, du gel de polyacrylamide, du gel d'agarose,

du gel d'amidon, du gel de silice, ...

- On peut procéder sur bande (papier, acétate de cellulose), sur lame ou en tube (gels)

Principes de la migration électrophorétique : la migration dépend de plusieurs facteurs :

• de la mobilité électrophorétique U, qui est fonction de la charge et de la géométrie de la particule. Une

particule de charge électrique Q, placée dans un champ électrique E, est soumise à une force F qui l'entraîne
vers l'électrode de signe opposé :

Des forces de frottement f, dues à la viscosité du milieu  , s'opposent à la migration de la particule, et ce

d'autant plus que la particule est grosse (r = rayon) et que la vitesse de migration (v) est grande :

(N.B. Le coefficient de viscosité   dépend de la température)

Il arrive un moment où ces deux forces s'équilibrent, et la particule se déplace alors à vitesse constante; on
peut alors écrire:

On définit pour chaque particule sa mobilité µ, de manière indépendante du champ électrique, par la relation :
La mobilité est une caractéristique de chaque particule; il est donc possible d'effectuer une séparation en se
basant sur cette propriété.

La charge Q est fonction du pH isoélectrique de la particule et du pH du solvant : on appelle pH

isoélectrique d'une particule (pHi ou pI) le pH pour lequel cette particule ne migre pas dans un champ
électrique (ceci est une définition expérimentale). Pour les molécules de petite taille, on peut prévoir la valeur
du pHi en calculant le pH isoionique, pH pour lequel la charge nette est nulle, à partir des pKa des différents
groupements ionisables de la molécule; mais cela n'est pas possible pour les macromolécules, car leur
environnement ionique modifie notablement leur charge réelle.

La différence pH - pHi détermine le signe de la charge Q d'une particule :

si pH > pHi charge nette négative (anion) migration vers l'anode

si pH < pHi charge nette positive (cation) migration vers la
cathode
si pH = pHi charge nette nulle pas de migration

La différence pH - pHi détermine l'intensité de la charge Q d'une particule : plus cette différence est grande
en valeur absolue, plus la charge est importante.

 du champ électrique E : E = v / µ

• des courants liquidiens :

- le courant d'électro-endosmose :
Dans les conditions expérimentales, le support se charge négativement; une couche mobile de charges
positives se forme dans le solvant, au contact du support et entraîne globalement la phase liquide vers la
cathode.

Ce courant accélère ou ralentit la migration des molécules, suivant qu'elles migrent vers la cathode ou vers
l'anode. Il peut dans certains cas être plus puissant que les forces électriques, ce qui fait que des protéines
chargées négativement peuvent globalement migrer vers la cathode : c'est particulièrement vrai avec les gels
d'agarose et nous le verrons aussi dans le cas de l’électrophorèse capillaire.

- les courants d'évaporation : le passage du courant s'accompagne d'un échauffement du support (par effet
Joule), ce qui entraîne l'évaporation de l'eau de la phase liquide; cet effet est maximal au milieu de la bande; il
s'établit ainsi un courant liquidien depuis chaque extrémité vers le centre de la bande. Pour limiter ce
phénomène, la cuve est fermée par un couvercle; on utilise aussi des cuves réfrigérées.
• de la durée de migration, qui influe sur la distance de migration :

d=v.t

(d = distance, v = vitesse , t = temps de passage du courant)

Cette formule n'est pas applicable dans le cas de l'électrophorèse sur support, car les molécules effectuent un
trajet non linéaire dans les microcanaux du support poreux.

• de facteurs liés à la nature du support : adsorption, texture...

A-Techniques chromatographiques
6-LA CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE / MÉCANISMES ET MODALITÉS

6-2-Les différents modes de chromatographie liquide

On dispose d'un grand nombre de modes de chromatographie. Certains ont un champ d'application très
large, d'autres au contraire correspondent à des applications très spécialisées.
On distinguera dans ce qui suit :

1 - chromatographie d'adsorption

2 - chromatographie de partage (en phase directe (2A) ou inverse (2B))
3 - chromatographie d'échange d'ions (+ chromatographie ionique)
4 - chromatographie de paires d'ions
5 - chromatographie d'exclusion (séparation selon la taille)
6 - chromatographie d'affinité
7 - chromatographie adaptée à la séparation d'énantiomères

Le choix de tel ou tel mode obéit à des règles logiques directement liées à la nature des composés à
séparer :

6-2-1-La chromatographie d'adsorption

C'est la première chromatographie réalisée : séparation des pigments végétaux par adsorption sur de la craie
(Tswett 1906).
Définition : Ce mode de chromatographie met en jeu un mécanisme d'adsorption du soluté sur la phase
stationnaire solide et un mécanisme d'élution (désorption) par la phase mobile liquide ou gazeuse (éluant).

Principe :

- L'adsorption est la fixation plus ou moins énergique d'un gaz, d'un liquide ou d'un soluté sur une surface
solide; elle met en jeu des liaisons à faible énergie (liaisons hydrogène, interactions électrostatiques...). Pour
être utilisable à des fins séparatives, l'adsorption doit être réversible.

- L'élution ou désorption consiste à extraire le soluté adsorbé à l'aide d'un solvant appelé éluant.

- Les différents solutés sont plus ou moins adsorbés sur la phase stationnaire, et plus ou moins solubles dans la
phase mobile; il en résulte une migration différentielle des solutés en fonction de la résultante entre les deux
forces (de rétention et d'entraînement) et donc une séparation de ces solutés.
Le schéma ci-après résume les interactions entre le soluté, le solide adsorbant et l'éluant :