"CHROMATOGRAPHIE"

La chromatograhie (TSWETT, 1903): est une méthode pour la séparation analytique

et préparative de tous types de composés dans des mélanges, en les faisant circuler à
travers un milieu fixe inerte (alumine, silice…= phase stationnaire) à l’aide d’un
solvant mobile (gaz, liquide = phase mobile) qui l’entraîne.

Chroma= Couleur (en grec); graphie= dessin

provient de l'origine de la decouverte du phénomène sur les mélanges de produits
colorés que l'on reconnaissait par leur teinte.

Les séparations chromatographiques mettent en œuvre des techniques basés sur des
propriétés physico-chimiques des molécules:
1- La solubilité: tendance d‘une molécule a se dissoudre dans un liquide.
2- La volatilité: tendance d‘une molécule a passer a l’état vapeur.
3- L’adsorption: tendance d‘une molécule a se lier a un solide finement divisé.

I- Classification des méthodes chromatographiques

On peut classer les méthodes chromatographiques de trois manières:
a) selon la nature des phases

• la phase mobile est un fluide:( un liquide ou un gaz)

• la phase stationnaire est un solide, ou un liquide fixé sur un support solide.
La combinaison de ces possibilités conduit à diverses possibilités :
● chromatographie liquide—solide (LSC)
● chromatographie liquide—liquide (LLC)
● chromatographie gaz—solide (GSC ou GC)
● chromatographie gaz—liquide (GLC ou GC)
● la chromatographie supercritique (SFC)

b) selon la nature des phénomènes mis en jeu dans la séparation

Cette classification repose sur la nature de la phase stationnaire et son interaction avec
les molécules à séparer. On distingue ainsi:
1. La chromatographie d'adsorption (LSC, GSC).
C'est lorsque la phase stationnaire est un solide doué de propriétés adsorbantes.
La séparation des différentes substances dans un mélange est basée sur des
mécanismes d’échange impliquant des interactions de type liaison hydrogène, Van der
Waals et des interactions hydrophobes.
2. La chromatographie de partage (CLL, GLC).
La séparation est fondée sur les différences de solubilité des molécules à séparer entre
phase mobile et phase stationnaire liquide c'ad la phase stationnaire est un liquide non
miscible avec la phase mobile (mise en jeu de coefficients de partage).
3. La chromatographie d'échange d'ions (CLS)
où la phase stationnaire porte des groupes fonctionnels acides ou basiques, destinée à
séparer des composés ionisés.
Un soluté ionisé de charge opposée se trouvera d'autant plus retenu que sa charge
(opposée à celle de la phase stationnaire) sera plus forte. C’est la loi de COULOMB
qui régit ces échanges de forte énergie (40 à 80 kJ.mole-1).
Exemple: les résines échangeuses d'ions (cations ou anions), qui sont des résines
polystéréniques sur lesquels sont greffées des groupements anioniques ou
cationiques).
4. La chromatographie d'exclusion encore qualifiée de chromatographie de
perméation ou de filtration sur gel
La phase stationnaire est un solide poreux qui se comporte comme un tamis et sépare
les composés en fonction de leur taille.
5. La chromatographie chirale
La phase stationnaire est chirale sur laquelle une adsorption ou un partage selectif
d'énantiomères se fera.

c) selon la technologie mise en oeuvre.

Selon la présentation de la phase stationnaire, on distingue:
• la chromatographie sur colonne (colonnes analytiques et colonnes préparatives)
• la chromatographie de surface (chromatographie sur papier ou chromatographie sur
couche mince).
Selon les modalités de migration de la phase mobile, on distinguera
• la chromatographie par développement (les constituants de
l'échantillon restent sur la phase stationnaire)
• la chromatographie d'élution (les substances sont entraînées hors de la phase
stationnaire).
II. Choix de la technique

Les séparations chromatograohiques mettent en œuvre des techniques basées sur des
propriétés physiques (Solubilité, Adsorption; Volatilité).
Donc le choix de l’une ou l’autre dépend :
1. de la nature du soluté : gaz, liquide volatil, liquide peu volatil, solide,
macromolécule, espèce organique, polaire, ionique,…
2. du but de l’analyse : identification, contrôle de pureté, purification de produits
(colonnes préparatives), suivi de réaction en continu pour optimiser des paramètres,
dosages, quantification…

 Phase normale ::::› la phase stationnaire est polaire

 Phase inverse ::::› la phase stationnaire est apolaire

La chromatographie en phase gazeuse convient aux molécules gazeuses ou

volatilisables.

III. Processus de séparation:

Le principe de la chromatographie consiste à entrainer l‘échantillons à l‘aide d‘un
éluant (gazeux ou liquide) appelé ici phase mobile (PM), qui se déplace au contact
d‘une seconde phase fixée sur un support (colonne ou surface plane). Celle-ci, dite
stationnaire (PS), est insoluble dans la première.
Les espèces différentes sont retardés par la phase stationnaire sur la base des
interactions telles que:
- Adsorption à la surface
- Solubilité relative
- Interaction de charge
donc les partenaires de la séparation sont des forces intermoléculaires qui assurent ces
interactions.

* Rappel: Nature des forces intermoléculaires

Van der Waals (1 à 9 kJ.mole -1 )
_ Force de dispersion de London: attraction entre dipoles instantanés.
_ Force de Keesom: attraction entre dipoles permanents.
_ Force de Debye: attraction entre dipole instantané et dipole permanent.
interactions hydrophobes (4 à 12 kJ.mole -1 ): interactions entre molécules ou
groupements qui ont très peu d'affinité pour le solvant (H 2O) dans lequel elles
sont dissoutes.

Pont Hydrogène (8 à 40 kJ.mole -1 ): liaison entre un hydrogène lié à un

atome électronégatif et un autre atome électronégatif (comme F, O, N).

Chaque composé est caractérisé par un coefficient de distribution de Nernst K (appelé

également coefficient de partition) défini comme suit:

* Quelques terminologies utilisés en chromatographie

Elution
L’élution est l’entraînement d’un soluté à travers la phase stationnaire par le
mouvement de la phase mobile. En chromatographie liquide solide, la phase mobile
peut être appelée éluant.
Eluant
L’éluant peut être composé d’un solvant unique ou d’un mélange de solvants ; il ne
doit pas être ni trop polaire (entraînant les composants) ni trop apolaire (empêchant
leur migration). Les solvants sont caractérisés par leur différence de polarité et leur
non miscibilité.
Chromatogramme
Un chromatogramme est un diagramme montrant l’évolution du signal du détecteur
(par rapport à la concentration en soluté) en fonction du temps d’élution (plus
rarement du volume d’élution). Ce graphique est utilisé à la fois en:
°° Analyse qualitative : permet l’identification des composés par la position du pic.
°° Analyse quantitative : évaluer la concentration ou la masse d’un composé en
utilisant l’aire des pics.

Figure A. Chromatogramme d'un constituant

Rétention: ‫استبقاء احتفاظ‬

La rétention est l'action de retenir ou de garder pour un certain temps quelque chose

(des substances chimiques) qu'on devrait mettre en circulation ou diffuser

Révélateur ‫ كاشف‬Solution employée pour rendre visible quelque chose.

Autres terminologies seront abordés pour chaque type de chromatographie dans les
Cours qui suit.

A-Chromatographie d'adsorption

1-Chromatographie sur couche mince

La chromatographie sur couche mince CCM (chromatographie d'adsorption) est la
plus simple des techniques où:

- l'échantillon (adsorbat) est deposé sur une plaque de sélice ou alumine (à faible
épaisseur et une grande surface) (adsorbant)

- l'ensemble est placé dans une cuve couverte,

- l'éluant monte à travers la phase stationnaire, essentièllement par capillarité et

chaque composant de l'échantillon se déplace à sa propre vitesse derière le front du
solvant. [La vitesse dépend des forces électrostatiques retenant le composant sur la
phase stationnaire et de la solubilité dans la phase mobile].

L'action de rétention de la phase stationnaire étant principalement controlé par des

phénomènes d'adsorptions; les substances de faible polarité migrent plus rapidement
que les composants polaires. Aprés élution, la révélation se fait à l'œil nu si le produit
est coloré, sinon sous UV ou après une coloration spécifique par un révélateur
chimique (Iode, vanilline, ninhydrine, KMnO4,,,). On obtient à la fin un
chromatogramme !!. La CCM est utilisé pour des fins analytiques (Fig. 1)

Figure 1. Dispositif de la chromatographie sur couche mince

Paramètre de séparation

Chaque substance est caractérisée par sa mobilité appelée rapport frontal (Fig. 2).
Le rapport frontal ou rétention frontale (Rf ) de chaque composé est défini par le
rapport : Rf = x/y
x : distance parcourue par le composé (mesure au centre de la tache)
y: distance parcourue par le front de solvant

Figure 2. Plaque CCM: calcul du rapport frontal

Le Rf d’une substance est une constante et constitue une des caractéristiques

physiques. On peut donc se servir de cette valeur pour identifier une substance
inconnue. Lorsque la polarité de l’éluant augmente, le R f augmente.

Relation entre polarité de l'éluant et celle du soluté

La polarité c'est l'existance de dipoles dans une molécule (soluté ou solvant)

Lorsque la polarité de l’éluant augmente, le R f augmente, x augmente.(et

l'inverse est vraie).

Par ordre décroissant de polarité pour quelques solvants (éluants) utilisés en

chromatographie ou (Le pouvoir éluant décroissant des solvants) est le suivant:

Acide acétique (CH3COOH) > H2O> Ethanol (CH3CH2OH) > Propanone (CH3-CO-
CH3) > Acetate d'éthyle (CH3-CO-O-CH2-CH3) > Dichloromethane (CH2Cl2) > Ether
diéthylique (CH3-CH2-O-CH2-CH3) > Benzène (C6H6) > Toluene (C6H5-CH3) >
Tetrachloromethane (CCl4) > Hexane (C6H12)

Lorsque la polarité du soluté augmente, le R f diminue, x diminue (et l'inverse

est vraie).

Exemple de solutés polaires: Acide carboxylique > Aldhyde > Alcool> Amine;;;;;
_ Moins un copmposé est polaire, moins il s'acroche à l'adsorbant, plus il migre avec
l'éluant →→ choix d'un éluant peu polaire.
_ Plus un copmposé est polaire, plus il s'acroche à l'adsorbant, moins il migre avec
l'éluant →→ choix d'un éluant polaire.

Efficacité d’une plaque CCM

L’efficacité N d’une plaque CCM et la hauteur H de plateau théorique pour un

composé est donné par les relations :

La résolution est exprimée par la relation

w est le diamètre de spot

Le facteur de rétention k’ d’un composé est relié aux distances de migration sur la
plaque.

2-Chromatographie sur colonne

La chromatographie sur colonne est basée sur le meme principe et s'emploie pour
préparer une bonne quantité de soluté.

B- Chromatographie de partage

Les séparations chromatographiques sont basées sur la répartition différente(partage
différent) des solutés dans deux phases ou ( basé sur la différence de solubilité d’un
soluté entre deux liquides non miscibles, il s’agit d’un équilibre de partage).  

soluté S (phase mobile)   ↔  soluté S (phase stationnaire)
La constante d'équilibre de cette réaction est appelée: rapport de distribution K ou
coefficient de partage K est égal au rapport des concentrations du soluté S dans les
deux phases:

 K = [Ss]/[Sm]          où   [Ss] = ms/Vs  et [Sm] = mm/Vm 

.Avec mm=masse du soluté S dissous dans la phase mobile

ms = masse du soluté S dissous dans la phase stationnaire 

Vm = volume de la phase mobile (équivalent au volume mort)            

Vs = volume de la phase stationnaire            

Vm et Vs sont constants pour une colonne donnée avec une phase stationnaire donnée
.( β= Vm/Vs)

Le paramètre  β, appelé rapport de phases est une constante qui caractérise une
.colonne de chromatographie

β sera calculé par la suite pour une colonne capillaire en chromatographie en phase  
.gazeuse

             

Plus le soluté aura une grande affinité avec la phase stationnaire et plus K sera élevé,
le composé sera fortement retenu.

Plus le soluté aura une grande affinité (plus soluble) avec la phase mobile et plus K
sera faible, le composé sera faiblement retenu (il se déplacera plus facilement que
celui qui l'est moins).

En chromatographie on utilise plutôt une grandeur proportionnelle à K qu’on

désigne par le terme de facteur de rétention k.

La relation entre K et k est : k = K V S / V M

V S est le volume de phase stationnaire contenu dans la colonne et V M est son

volume mort c’est a dire le volume « vide » de celle-ci et occupé par le solvant
lors de l ’utilisation de la colonne.

On définit la porosité de la colonne par : p = V M / V S

Sélectivité α de la séparation

On définit la sélectivité α d’une séparation par le rapport k 2 /k 1 des facteurs de

rétention de deux composés. α = k 2 /k 1

Plus α sera élevé et meilleure sera la séparation.

Efficacité N de la colonne

Par analogie avec la distillation, on défini l’efficacité N d’une colonne par

son nombre de plateaux.

L’efficacité d’une colonne dépend de trois facteurs :

1) de sa géométrie : Plus une colonne sera longue et/ou plus son diamètre

interne sera gros et plus elle sera efficace.

2) de son garnissage : Plus les particules de silice seront fines et plus la

colonne sera efficace.

3 ) du débit de l’éluant : Il existe un débit optimal d’utilisation d’une colonne pour

lequel son efficacité est la plus grande. Loi de Van Deemter ou de Knox.

Résolution R d’une séparation

On définit la résolution R d’une séparation.

Remarque: Il existe d'autres formules de α et R en fonction des temps de rétention;;;

seront abordés en détail dans la suite du cours (HPLC)

Comparaison phases stationnaires polaires et apolaires

PS PM Gradient d'élution Ordre d'élution

Phase normale Très polaire Peu polaire Polarité croissante. Les moins
(NP) Exp: hexane + proprtion polaires sont plus
croissante d'acétate d'éthyle. rapide
Phase inverse apolaire Très polaire Polarité décroissante. Les plus polaires
(RP) Exp: H2O + proprtion sont plus rapide
croissante de CH3OH.