Université de REIMS CHAMPAGNE-ARDENNE

UFR de Pharmacie

Ecole Doctorale : Sciences Technologie Santé

THESE

Pour obtenir le grade de

Docteur de l’Université de Reims Champagne-Ardenne

Discipline : Parasitologie

Présentée et soutenue publiquement par

Leila ZIANI HADJ-HENNI

Le 9 Décembre 2014

Taxonomie intégrative des Culicoides (Diptera : Ceratopogonidae) de la

région Champagne-Ardenne

JURY

M. Arezki Izri , Rapporteur

M. Denis Augot , Directeur de Thèse
M. Jérôme Depaquit , Examinateur
Mme Claire Garros , Examinatrice
M. Vincent Robert , Rapporteur
Mme Isabelle Villena , Examinatrice (Présidente du jury)
 Université de REIMS CHAMPAGNE-ARDENNE

UFR de Pharmacie

Ecole Doctorale : Sciences Technologie Santé

THESE

Pour obtenir le grade de

Docteur de l’Université de Reims Champagne-Ardenne

Discipline : Parasitologie

Présentée et soutenue publiquement par

Leila ZIANI HADJ-HENNI

Le 9 Décembre 2014

Taxonomie intégrative des Culicoides (Diptera : Ceratopogonidae) de la

région Champagne-Ardenne

JURY

M. Arezki Izri , Rapporteur

M. Denis Augot , Directeur de Thèse
M. Jérôme Depaquit , Examinateur
Mme Claire Garros , Examinatrice
M. Vincent Robert , Rapporteur
Mme Isabelle Villena , Examinatrice (Présidente du jury)
 à Amine et Hichem

à mes chers parents et beaux-parents…

Remerciements
Cette thèse est le résultat de trois ans de travail au laboratoire de « Transmission vectorielle et
Epidémiosurveillance de maladies parasitaires - EA 4688 ». Je tiens à remercier toutes les
personnes qui ont contribué à cette expérience aussi enrichissante qu’intéressante.

Mes plus vifs remerciements vont tout d’abord à mon directeur de thèse, Denis Augot, qui m’a
soutenu et encouragé depuis notre rencontre en 2011, a partagé sans compter sa passion pour
les insectes avec moi et m’a offert l’opportunité de travailler sur ce sujet qui me tient à cœur.
Sa patience, sa disponibilité et son efficacité m’ont permis d’effectuer cette thèse dans les
meilleures conditions possibles. Merci pour sa gentillesse, son humanité et son courage, dans
le travail comme en dehors, qui me resteront comme un modèle à suivre.

Si je n’ai qu’un seul directeur officiel, Jérôme Depaquit, le directeur de l’EA 4688, n’a jamais
manqué de me rappeler aux bons moments la rigueur scientifique nécessaire à
l’accomplissement du travail de recherche et de rédaction. Merci de m’avoir accueilli dans son
laboratoire. Je lui exprime ici ma reconnaissance et ma gratitude pour ces qualités humaines et
surhumaines. Merci pour son implication très régulière dans ce travail et pour ces idées
pertinentes. Un grand merci d’avoir cru en moi et de m’avoir impliqué dans les activités
scientifiques et pédagogiques de l’équipe, ce fut une expérience très enrichissante. Si tous les
chefs étaient comme lui…

Cette thèse n’aurait pourtant pas été possible sans l’aide précieuse de Thibaut De Meulemeester.
Je lui suis plus que reconnaissante de m’avoir initié à la morphométrie géométrique et de
m’avoir permis de comprendre les statistiques multivariées. Si travailler avec lui était parfois
incertain du fait de sa disponibilité réduite, je le remercie d’avoir trouvé toutes ces heures à me
consacrer pour partager son expérience, de passer des heures à réfléchir intensément sur une
analyse et de comprendre la taxonomie des Culicoides. Je remercie également ses parents M. et
Mme De Meulemeester, qui m’ont envoyé un échantillon de sang d’âne prélevé sur de leurs
propres animaux.
Je remercie vivement Menno Schilthuizen pour son travail sur l’analyse des données
moléculaires pour l’un de mes articles ainsi que pour sa critique très constructive et utile.
Je tiens aussi à remercier toute l’équipe du laboratoire EA4688, Hubert Ferté, Damien Jouet,
Cécile Patrelle, Christine Millot, Célia Lesage, Rim Bouchouicha, Mohamed Kasbari, mais
aussi Véronique Lehrter pour sa disponibilité et sa gentillesse, Mireille Cousinat pour son
éternel sourire, sa gentillesse et sa bonté.
Je remercie particulièrement Adeline Germain et Philippe Noel pour leur travail sur les repas
sanguins, merci pour leur dévouement et leur professionnalisme. J’espère que la dissection des
insectes ne vous empêchera pas un jour de retravailler dans le monde merveilleux de
l’entomologie.
Merci également à Yves Gourdain et André Dang pour leur gentillesse et leur soutien. Je tiens
à remercier aussi notre super informaticien Morad Belbagra pour son efficacité, son aide et sa
disponibilité et aussi Catherine Lantoine pour son dévouement, sa compétence et sa gentillesse.
Merci également au personnel de la bibliothèque de l’UFR de pharmacie pour leurs conseils
sur la rédaction et les références bibliographiques.
De même nous n’aurions pas pu collecter autant de spécimens dans les Ardennes sans l’aide de
Rémi Helder qui nous a si bien accueillis à Boult-aux-Bois. Merci aussi à toutes les personnes
qui ont participé aux collectes.
Merci également à Estelle Odinot de l’Ecole Doctorale pour les multiples renseignements que
j’ai pu réclamer et de m’avoir supporté pendant ces trois années, merci pour son soutien, ses
conseils et son accueil.
Merci à Bruno Mathieu qui a eu la gentillesse de mettre à ma disposition sa collection privée
ainsi que pour ses conseils et à Frank Sauvage pour son super boulot lors de mon premier
article.
Je tiens à remercier les membres de Jury de m’avoir fait l’honneur d’accepter d’examiner ce
travail.
A toutes les personnes que j’aurais pu oublier…
Cette thèse a bénéficié d’un co-financement CPER1 projet ‘‘Culichamp’’ et de l’ANSES2.

1
Un contrat de projets État-région
2
Agence nationale de sécurité sanitaire de l'alimentation, de l'environnement et du travail
Résumé
Plusieurs systématiques se côtoient aujourd’hui : la systématique typologique, d’inspiration
linnéenne, qui repose sur l’examen morphologique de types porte-nom et depuis plusieurs
années, une systématique phylogénétique conduit également à la création de taxons nouveaux,
de niveau spécifique, infra-spécifique et supra-spécifique.

Dans ce travail, nous avons cherché une approche globale, qualifiée de taxonomie intégrative
couplant les approches morphologiques traditionnelles, la systématique moléculaire et la
geomorphométrie alaire, dans le but d’éclairer la notion d’espèce chez les Culicoides avec ses
corollaires épidémiologiques, étant donnée l’importance de ces insectes dans des maladies
majeures d’intérêt vétérinaire telles que la fièvre catarrhale ovine et la maladie causée par le
virus de Schmallenberg.

Cette approche nous a permis de mettre en lumière la complexité systématique des espèces
affines (C. clastrieri/C. festivipennis, les groupes Obsoletus, Pulicaris et Vexans).

D’un point de vue biologique, nous nous sommes intéressés aux préférences trophiques des
Culicoides de la région Champagne-Ardenne qui montrent une forte attirance pour les Equidés.

Mots-Clefs : Taxonomie intégrative, Culicoides, préférence trophique

Abstract
Several systematic coexist today: typological systematic of Linnaean spirit, based on
morphological examination of type specimens. For several years, a phylogenetic systematics
also led to the creation of new taxa, at specific, sub-specific and supra-specific level.

In this study, we have sought a comprehensive approach i.e. an integrative taxonomy that
coupling traditional morphological approaches, molecular systematic and wing geometry
morphometric in order to clarify the concept of species in the Culicoides with epidemiological
corollaries, given the importance of these insects in major diseases of veterinary interest such
as bluetongue and the disease caused by the Schmallenberg virus .

This approach allowed us to highlight the systematic complexity of related species (C. clastrieri
/ C. festivipennis, the Obsoletus, Pulicaris and Vexans groups).

In addition, we investigated the host preference of Culicoides of the Champagne-Ardenne

region.

Keywords: Integrative taxonomy, Culicoides, host preference

 Table des matières

Chapitre I : Introduction et cadre général .................................................................................................. 1

Chapitre II : Le genre Culicoides ................................................................................................................. 5
1. Morphologie, fonctions et intérêt dans la taxonomie .......................................................................... 5
2. Cycle biologique ............................................................................................................................... 11
3. Ecologie ............................................................................................................................................ 12
Chapitre III : Rôle vecteur des Culicoides : les arboviroses .................................................................... 14
1. Introduction....................................................................................................................................... 14
2. Culicoides et biologie de la transmission d’arbovirus ...................................................................... 15
3. La fièvre catarrhale ovine ou Bluetongue (BT) en Europe ............................................................... 16
Structure du BTV .................................................................................................................................. 17
Transmission du BTV ........................................................................................................................... 19
Ecologie et transmission du BTV ......................................................................................................... 19
Distribution mondiale et activité du BTV avant 1998 .......................................................................... 23
Emergence de la Blue Tongue en Europe entre 1998 et 2006 .............................................................. 23
La Blue Tongue en Europe après 2006 ................................................................................................. 27
4. Virus de Schmallenberg (SBV) ........................................................................................................ 30
Introduction ........................................................................................................................................... 30
Le virus de Schmallenberg (SBV) ........................................................................................................ 30
Espèces sensibles .................................................................................................................................. 33
Virémie et durée d’incubation............................................................................................................... 34
Transmission ......................................................................................................................................... 36
Origine du SBV..................................................................................................................................... 38
Objectifs de la thèse..................................................................................................................................... 40
Chapitre IV : Matériels et méthodes ......................................................................................................... 41
1. Origine des Culicoides ...................................................................................................................... 41
2. Traitement des échantillons destinés aux analyses morphologiques, moléculaires et
morphométriques ....................................................................................................................................... 43
3. Identification des spécimens ............................................................................................................. 43
4. Morphométrie géométrique .............................................................................................................. 43
5. Analyses moléculaires ...................................................................................................................... 45
Chapitre V : Résultats................................................................................................................................. 48
Document I: Wing geometry as a tool for discrimination of Obsoletus group (Diptera: Ceratopogonidae:
Culicoides) in France ................................................................................................................................ 49
Document II: The relevance of wing geometry in entomological surveillance of Culicoides, vectors of
Bluetongue disease .................................................................................................................................... 59
 Document III: Complex pattern of phenotypic plasticity in the genus Culicoides: molecular evidence and
taxonomic problem.................................................................................................................................... 90
Document IV : Taxonomic assessment of Culicoides brunnicans, C. santonicus and C. vexans (Diptera:
Ceratopogonidae) in France: implications in systematics ...................................................................... 131
Document V: Molecular identification of blood meals in biting midges ................................................ 152
Chapitre VI : Discussion générale ........................................................................................................... 177
Chapitre VII : Conclusions générales et perspectives ............................................................................ 181
Bibliographie ............................................................................................................................................. 182
Annexe 1 Liste des espèces de Culicoides en France, classées selon leur sous-genre ou groupe
morphologique (27). .................................................................................................................................. 205
Annexe 2 : Liste des sous-genres composant le genre Culicoides (Extrait de « World species of biting
midges (Diptera : Ceratopogonidae) », Borkent, 2014) ......................................................................... 207
Liste des figures
Figure 1 : Culicoides pulicaris femelle.
Figure 2 : Dessin d’une tête de Culicoides femelle (à gauche) et de Culicoides mâle (à droite)
Figure 3 : Les 5 types de sensilles antennaires chez les Culicoides.
Figure 4 : Dessin des différents types d’ornementation de scutum et de scutellum du thorax de
Culicoides.
Figure 5 : Dessin d’une aile de Culicoides femelle.
Figure 6 : Dessin d’un appareil génital mâle de Culicoides.
Figure 7 : Dessin d’un appareil génital femelle de Culicoides.
Figure 8 : Cycle biologique des Culicoides.
Figure 9 : Cycle schématique de l’infection d’un Culicoides par un arbovirus.
Figure 10 : Estimation de la distribution mondiale du BTV avant 1998.
Figure 11 : Représentation schématique du BTV, de ses protéines structurales et segment
d’ARN doubles brins.
Figure 12 : Des signes cliniques modérés (à droite) et sévères (à gauche) de la fièvre catarrhale
ovine.
Figure 13 : La transmission du BTV en été (à gauche) et en hiver (à droite).
Figure 14 : Les différents mécanismes pouvant expliquer la persistance du BTV
(Overwintering) suggérés dans la littérature.
Figure 15 : les principales voies d’introduction du BTV en Europe.
Figure 16 : Carte de la distribution de la fièvre catarrhale ovine (FCO) en Europe au deuxième
semestre de l’année 2014.
Figure 17 : Structure des virus de la famille des Bunyaviridae d’après.
Figure 18 : Malformations congénitales associées au SBV.
Figure 19 : Distribution des foyers du SBV en Europe (A) et en France métropolitaine (B).
Figure 20 : Sites de l’étude (Louvois, Boult-aux-Bois).
Figure 21 : Position des landmarks sur une aile d’une femelle de C.obsoletus.
Liste des tableaux

Tableau I. Quelques récepteurs cutanés chez les arthropodes. (McFarland 2001).

Tableau II : Les virus du sérogroupe Simbu (d’après L’EFSA).

Tableau III : Les rapports publiés sur la détection du SBV dans les Culicoides capturés en
Belgique, Danemark, Pays-Bas, Italie, Pologne et France en utilisant des essais
de détection quantitative.

Tableau IV : Origine des Culicoides étudiés

Tableau V : Composition des mix de PCR.

Tableau VI : Amorces et protocoles utilisés pour amplifier les marqueurs moléculaires.

Liste des articles, publiés, sousmis pour publication ou avec des résultats
préliminaires inclus dans cette thèse

Document I: Wing geometry as a tool for discrimination of Obsoletus group (Diptera:

Ceratopogonidae: Culicoides) in France.

Document II: The relevance of wing geometry in entomological surveillance of Culicoides,

vectors of Bluetongue disease.

Document III: Complex pattern of phenotypic plasticity in the genus Culicoides: molecular
evidence and taxonomic problem.

Document IV: Taxonomic assessment of Culicoides brunnicans, C. santonicus and C. vexans

(Diptera: Ceratopogonidae) in France: implications in systematics.

Document V: Molecular identification of blood meal in biting midges.

Chapitre I : Introduction et cadre général

Le genre Culicoides appartient à la sous-famille des Ceratopogoninae et la tribu des

Culicoidini. La tribu des Culicoidini est composée également, de deux autres genres :
Paradasyhelea, et Washingtonhelea. Les liens entre ces trois genres restent à l’heure actuelle
non résolus. Le genre Culicoides fait partie des 125 genres qui composent la famille des
Ceratopogonidae (7). Entre 1758 et 2009, 1634 espèces ont été décrites mais grâce au
développement des techniques de la biologie moléculaire et grâce à l’évolution des outils
d’observations microscopiques et morphométriques, environ 324 sont depuis révisées et
tombées en synonymie. A ce jour, il existe un peu plus de 1400 espèces valides, auxquelles
s’ajoutent 42 espèces fossiles toutes datées du Crétacé supérieur (environ entre 65 et 100 Ma).
Actuellement, 31 sous-genres sont reconnus dans le genre Culicoides (8, 9) (Annexe 2). Au-
delà des sous-genres, plusieurs auteurs utilisent les « groupes d’espèces » dont les caractères
d’inclusion sont parfois discutables (10–14).

La taxonomie du genre Culicoides repose sur l’identification des femelles à cause de leur rôle
dans la transmission. Par conséquent, plusieurs clés d’indentifications subgénériques,
régionales ou ciblant certains groupes d’espèces ont été développées pour les femelles. Toutes
ces clés de détermination prennent en compte certains critères morphologiques tels que les
motifs alaires et thoraciques, la soudure et la pubescence des yeux, la morphologie de la fossette
sensorielle, le nombre et répartition des sensilles cœloconiques sur les articles des antennes, la
présence d’ornementations cibariales, pharyngées, la présence d’épines tarsales, le nombre et
morphologie des spermathèques pour la femelle, la morphologie de l’appareil génital mâle
(principalement celle de l’édéage et des paramères). Le caractère « aile » est très intéressant.
La disposition des nervures alaires est caractéristique du genre Culicoides. De plus, étant
souvent tachetées, les motifs qui les composent sont à la base de nombreuses clés
d’identification morphologique basées sur la photographie des ailes. Plusieurs ouvrages ont été
consacrés à l’identification morphologique des Culicoides présents dans différentes régions du
monde. C’est le cas pour les espèces d’Amérique du Nord (16, 17), d’Amérique centrale (18),
d’Amérique du Sud (19), d’Asie du Sud-est (20), d’Afrique (21, 22), et d’Europe (7, 23–25).
La majorité de ces clés de diagnose reposent sur des caractères dichotomiques très complexes
et abstraites pour un utilisateur inexpérimenté, en effet, il faut connaitre au préalable les groupes
et les sous genres auxquels, le spécimen à identifier est susceptible d’appartenir. D’autant plus,
que les Culicoides sont des insectes invasifs et la plupart de ces clés sont anciennes et ne

1
couvrent pas la totalité des régions biogéographiques. De manière courante, les espèces
nouvellement décrites ou introduites n’y sont pas inclues. En effet, en Europe, le nombre
d’espèces nouvellement introduites ne cesse d’augmenter, 120 espèces sont présentes en Europe
dont 90 ont été signalées en France (Annexe 1) et 61 espèces en Corse. En France continentale,
trois nouvelles espèces ont été récemment signalées : C. manchuriensis, C. abchazicus et
C. saevus (27). Tous ces éléments, rendent encore la systématique du genre très compliquée
(28) bien que son intérêt soit grandissant en Europe depuis les dernières années en raison de
leur implication dans la transmission des virus de la fièvre catarrhale ovine et de Schmallenberg.

La taxonomie est indispensable pour comprendre et analyser la biodiversité. C’est la science

qui caractérise, classifie, délimite et nomme les taxons. L’alpha taxonomie s’intéresse aux
espèces, la beta taxonomie, s’intéresse aux catégories supérieures. Pour la majorité des
biologistes la catégorie « espèce » est un taxon unique de la hiérarchie taxonomique, c’est le
seul niveau taxonomique qui représente une réalité objective et concrète (29–31). Il existe plus
de 150 concepts pour délimiter « une espèce » (32, 33) sans qu’aucun d’eux ne soit
scientifiquement acceptable. En réalité, on pourrait définir une espèce comme le taxon de base
de la systématique : une convention de language bien définie pour un groupe donné permettant
les échanges entre spécialistes. Dans le cadre des maladies à transmission vectorielle, la
délimitation et l'identification des espèces sont essentielles. Nommer une « espèce » est
fondamental pour comprendre les organismes car cela permet le lien entre toutes les autres
disciplines biologiques (34), mais force est de constater que face à un engouement vers la
biodiversité, il y a de moins au moins d’experts en taxonomie. Cette discipline souvent ingrate
est très peu « cotée » par rapport au reste de la biologie. L’espèce est « vivante », elle est en
quête d’évolution. Certaines peuvent se différencier, diverger des autres populations
conspécifiques3 ou rentrer dans un processus de spéciation4. Cela implique que la taxonomie
doit donc intégrer un contexte évolutif pour mieux comprendre l'évolution des espèces décrites,
les relations entre les espèces elles-mêmes, ainsi que les relations entre les niveaux
taxonomiques supérieurs. Aujourd’hui, la taxonomie est en grande partie basée sur la
nomenclature Linnéenne. Les espèces sont décrites à l’aide de critères morphologiques. Dans
le cas des Culicoides, les classifications sont anciennes et les liens phylogénétiques entre les
sous-genres et les groupes d’espèces existants non explorés. La classification actuelle repose
en grande partie sur l'ensemble de similitudes entre les espèces en fonction d'un simple critère

3 Deux taxons qui appartiennent à la même espèce.

4 Processus évolutif au cours duquel une seule espèce se sépare en deux ou plusieurs nouvelles espèces distinctes.

2
de ressemblance globale, sans objectivation phylogénétique. Khalaf (1954) fut le premier à
examiner les relations entre les sous-genres, mais ces relations étaient fondées sur des
similitudes phénétiques plutôt que synapomorphies5 cladistiques.

Un défi majeur de la taxonomie traditionnelle consiste à reconnaitre les espèces dites

« jumelles » ou difficilement distinguables par la morphologie, la raison pour laquelle,
aujourd’hui encore, la biodiversité compterait un nombre démesuré d’espèces non encore
découvertes (35). Pour standardiser la taxonomie et unifier le concept de l’espèce, une approche
globale est donc indispensable, une alternative est proposée, c’est « la taxonomie intégrative »
(36). Il s’agit d’une approche, multisources, collaboratives et multidisciplinaires. Ainsi, la
taxonomie intégrative est basée sur des caractères taxonomiques. Ces caractères, qui peuvent
être de nature quantitative ou qualitative, peuvent être classés en cinq grandes catégories :
biochimique, moléculaire, morphologique, comportementale et écologique.

Chez les Culicoides, en plus de la morphologie, des techniques de biochimie ont été utilisées
dans les années mille neuf cent quatre-vingt afin de caractériser certaines espèces (37). Par la
suite et depuis l’émergence de la fièvre catarrhale ovine (FCO) en Europe et plus récemment le
virus de Schmallenberg, beaucoup d’auteurs se sont intéressés et s’intéressent davantage aux
relations phylogénétiques entre espèces proches au sein des vecteurs (38), notamment aux
espèces appartennant aux sous-genres Culicoides et Avaritia. De récentes études mettent
l'accent sur les caractères moléculaires pour déduire les relations phylogénétiques, y compris
l'ADN mitochondrial (39–41) et de l'ADN nucléaire ribosomique (42–45). Plus récemment, de
nouvelles techniques émergeaient chez les Culicoides, telles que la morphométrie classique ou
traditionnelle (41, 46) ou encore, les techniques basées sur la géométrie alaire (47, 48). La
morphométrie traditionnelle fait référence aux méthodes d'analyses multivariées appliquées aux
mesures linéaires (49). Cependant, ces mesures sont fortement liées à la taille de la structure
étudiée et ne permettent pas d'évaluer sa forme dans sa globalité. Pour ces raisons, la
morphométrie traditionnelle, a un faible pouvoir discriminant dans les cas de taxons cryptiques
(50). Le développement de la morphométrie géométrique a permis d'améliorer
significativement les performances des analyses morphologiques dans la discrimination de
taxons cryptiques (34, 51). La forme n’est pas caractérisée par une combinaison de variables

5
La phylogénie est reconstruite à partir d’une analyse de caractères qui vise à identifier les états plésiomorphes
(primitifs) et apomorphes (dérivés). Les parentés entre les taxons étudiés sont fondées sur les seuls états dérivés
partagés (synapomorphies), hérités d’un ancêtre commun.

3
indépendantes, mais par des coordonnées cartésiennes de landmarks ou par le contour de la
forme (52).
Dans ce travail de thèse, nous avons appliqué une approche de taxonomie intégrative basée sur
la morphologie, la biologie moléculaire et la géométrie alaire. L’outil de géométrie alaire était
développé dans ces travaux de thèse pour l’étude et la discrimination des espèces jumelles
notamment celles appartenant aux espèces vectrices dans les sous-genres Avaritia, Culicoides
et Oecacta.

4
Chapitre II : Le genre Culicoides

1. Morphologie, fonctions et intérêt dans la taxonomie

Les Culicoides sont de petits diptères ne mesurant qu’un à trois mm de longueur (pour cette
raison, ils sont souvent qualifiés de « moucherons » alors qu’ils sont plus apparentés aux
moustiques qu’aux mouches). Ce sont des mandibulates, dotés d’une paire de mandibules. Ce
sont des hexapodes on retrouve donc les caractéristiques de ceux-ci. En effet ils portent des
antennes ainsi que trois paires de pattes et sont divisés en trois parties : la tête portant les organes
des sens (yeux, palpes, mandibules), le thorax portant les pattes et les ailes, et l’abdomen où
l’on trouve les fonctions reproductrices et viscérales mais pas d’appendice. Ce sont des diptères,
ils portent donc une seule paire d’ailes membraneuses et des nématocères, leurs antennes sont
longues (Figure 1).

Figure 1 : Culicoides pulicaris femelle (Seguy et Grassé, 1951).

La tête des Culicoides est arrondie et légèrement aplatie. Les deux yeux sont proéminents et
composés d’ommatidies. Les yeux peuvent être soudés entre eux ou non, pubescents ou non,
ces caractères peuvent être un critère de diagnose au niveau de l'espèce (Figure 2). En effet, la
séparation entre le front et le sommet formé par la soudure des yeux au niveau sus orbital
constitue un critère qui est absent chez d’autres espèces (Exemple : sous genre Avaritia) (17).

5
Les antennes s’insèrent en avant des yeux, chez les Culicoides, elles peuvent donner des
informations taxonomiques, phylogénétiques et écologiques très importantes. Les deux
premiers articles sont nommés «proscape» et « scape ». Les treize suivants forment le flagelle
antennaire avec cinq longs articles pour les femelles et trois pour les mâles. Dans le genre
Culicoides, les antennes soulignent le dimorphisme sexuel, en effet, elles sont composées de
quinze articles fortement poilues chez les mâles que chez les femelles, mais il existe des espèces
comme C. leechi Wirth, 1977, et C. utahensisi Fox, 1946, où les antennes des mâles sont
dépourvues de plumes et ressemblent ainsi aux celles des femelles (53, 54). Les arthropodes y
compris les Culicoides et contrairement à d’autres groupes, y compris les vertébrés, ont pu
développer une très grande variété de récepteurs appelés «sensilles» (55). Les antennes de
Culicoides en portent cinq types : sensilles chaetiformes, sensilles trichoïdes, sensilles
basiconiques, sensilles ampullacea et sensilles coeloconiques, on les retrouve chez les deux
sexes (56–58) (Figure 3). Le Tableau I donne un résumé des principaux types de sensilles chez
les arthropodes avec leurs fonctions « supposées ou prouvées ».

Tableau I. Quelques récepteurs cutanés chez les arthropodes (59).

La fonction des sensilles ampullacea est méconnue chez les Culicoides. Les sensilles
chaetiformes sont organisées en verticilles autour des segments antennaires, elles ont une
fonction de mécanorécepteurs et/ou chémorécepteurs (57). Les sensilles trichoïdes et

6
basiconiques sont probablement «chémorécepteurs» et sont très peu utilisées dans la
classification et la taxonomie des Culicoides, bien que dans certaines espèces leur présence/
absence et disposition peuvent être informatives (57). Enfin, les flagellomères avec leurs
sensilles coeloconiques ont une grande importance dans la taxonomie et la classification des
Culicoides. Ils peuvent également être des indicateurs sur les préférences trophiques de
l’insecte, en effet, en fonction de la disposition, la répartition ainsi que le nombre de ces
sensilles sur les segments antennaires, on pourrait qualifier l’insecte d’ornithophile ou
mammalophile (58, 60). Cependant, des études supplémentaires sont nécessaires afin de vérifier
la fonction exacte de ces sensilles et de relever le mystère sur leur rôle dans le comportement
des Culicoides ainsi que leur préférences trophiques.

Figure 2 : Dessin d’une tête de Culicoides femelle (à gauche) et de Culicoides mâle (à droite) (24).

7
 Figure 3 : Les 5 types de sensilles antennaires chez les Culicoides (JC Delécolle, 1985).

Les pièces buccales des Culicoides sont de type «piqueur» constituées d’une trompe vulnérante
elle-même composée de deux mandibules denticulées en dents de scie, elles supportent le labre
épipharynx et les deux maxilles qui sont munies de petites dents, la trompe est composée
également d’un hypopharynx présentant une fente étroite, le canal salivaire, le tout est entouré
d’une sorte de gaine: le labium (24).
La présence d’une ornementation sous forme d'épines ou de tubercules sur le cibarium ou le
pharynx possède un intérêt capital en systématique. Elle permet de séparer certaines espèces
voisines (61).
De chaque côté de la trompe se trouvent les palpes maxillaires, ils sont constitués de cinq
articles dont le troisième plus bombé que les autres porte quelques fossettes sensorielles. Le
labium forme une gaine autour de ces pièces buccales. La forme de la fossette a une grande
importance en systématique, en effet, en fonction des espèces, les fossettes peuvent être de
forme circulaire, semi-circulaire ou présentant de multiples dépressions. Elles peuvent avoir un
contour régulier ou être éparpillés sur le tiers distal de l’article (24).
D’une manière générale, en plus de l’intérêt de l’appareil buccal en systématique, ce dernier
pourrait également nous apporter des informations précieuses sur l’écologie des espèces. En
effet, des espèces de type non piqueur, ont tendance à être dépourvues de dents au niveau labial,
maxillaire, mandibulaire… (5). En outre, la forme des dents est un bon indicateur des
préférences trophiques (20,62).

8
Le thorax est formé de trois segments : le prothorax, le métathorax et le mésothorax, lui-même
se subdivise en pré-scutum (non visible dorsalement), un scutum et un scutellum (Figure 4).
L'ornementation du scutum et du scutellum peut être caractéristique d'une espèce (24), ce critère
est très peu utilisé dans la taxonomie des Culicoides mais la fosse pré-scrutale est considérée
comme un critère de diagnose du genre (63). Les caractères présents au niveau du thorax
peuvent présenter un grand intérêt et une grande valeur dans la taxonomie et la phylogénie des
Culicoides, des études restent à réaliser pour mieux les utiliser (64).

Figure 4 : Dessin des différents types d’ornementation de scutum et de scutellum du thorax

de Culicoides (24).

Les pattes composées de neufs articles sont relativement courtes mais faiblement poilues, les
ailes membraneuses sont repliées sur le dos au repos, dénuées d’écailles et généralement
constellées de tâches plus ou moins sombres (65). Cette dernière caractéristique est utilisée pour
l’identification morphologique et la détermination des espèces. Les ailes mesurent environ de
1 à 1,5 mm de long et de 0,05 à 0,08 mm de large. Elles sont constituées de nervures déterminant
des cellules et de phanères (Figure 5). Les nervures alaires sont appelées : costa, subcosta,
radiale, transverse, anale (An), médiane (M) et cubitale (Cu). Les cellules sont appelées : cellule
basale, les cellules radiales (r1, r2, r5), cellules médianes (m1, m2, m4), cellule cubitale (Cu)
(24). Une paire de balanciers est aussi insérée sur le thorax.

9
 Figure 5 : Dessin d’une aile de Culicoides femelle (24).

Pour finir, l’abdomen est composé de dix anneaux. On retrouve sur les derniers l’appareil
génital mâle (hypopygium) ou femelle (cerques).
L’hypopygium se compose d’un pénis (ou adeagus), de paramères, de cerques, des expansions
du 9ème article abdominal (9éme tergite avec la lamelle et 9ème sternite), du coxite, des
apodèmes, du style et d’une membrane basale (Figure 6) (24).

Figure 6 : Dessin d’un appareil génital mâle de Culicoides (24).

Les spermathèques, organes reproducteurs chez la femelle, sont au nombre de un à deux, avec
une troisième rudimentaire selon les espèces, cependant, il existe parfois des aberrations où l’on
trouve trois spermathèques fonctionnelles. Elles se regroupent en un conduit commun où se
remarque un anneau sclérifié. Il y en a généralement une qui est rudimentaire. Les cerques sont

10
enflées et fournies de longs poils et l’orifice génital est enserré de plaques chitineuses pour
certaines espèces telles que les espèces du sous genre Avaritia (Figure 7) (24).

Figure 7 : Dessin d’un appareil génital femelle de Culicoides (24).

2. Cycle biologique

Les Culicoides sont des insectes holométaboles. Leur cycle biologique est donc caractérisé par
plusieurs stades larvaires, une émergence de l’adulte ou imago à partir d’une nymphe et une
hémophagie restreinte aux adultes femelles (66).
En effet, on distingue quatre étapes dans le cycle biologique des Culicoides :
L’œuf : sont fusiformes et mesurent entre 200 et 500 μm. Ils sont très clairs à la ponte puis
brunissent à l’air. Au pôle antérieur on trouve un micropyle et des petites excroissances ou
organes de fixation sont observés sur le chorion.
Les quatre stades larvaires : les larves sont vermiformes et mesurent de 0,3 à 1 cm de long.
Elles sont apneustiques et eucéphales (67). Elles sont segmentées en trois parties : la capsule
céphalique brunâtre avec les yeux, les antennes et les pièces buccales de type broyeur ou suceur,
le thorax en trois segments et l’abdomen blanchâtre en neufs segments.
Et enfin, le stade nymphal et le stade adulte dit imaginal (68). (Figure 8)
L’identification spécifique des stades immatures est très délicate, elle nécessite, le plus souvent,
un montage et une observation au microscope. Néanmoins, il existe quelques clés
d’identification des stades pré-imaginaux de certaines espèces, comme celle de Jamnback
(1965) aux Etats-Unis et de Chaker (1984) (69) pour les larves en France. L’identification des
stades immatures peut constituer un outil très important pour séparer les espèces jumelles,
consolider les caractères phylogénétiques, améliorer les études écologiques et apporter ainsi
des moyens adaptés pour la gestion, la surveillance et la lutte contre les vecteurs.

11
 Figure 8 : Cycle biologique des Culicoides (117).

La majorité des femelles adultes sont hématophages ; elles prennent de ce fait un repas sanguin
tous les 3-4 jours environ (70). En effet, l’accouplement se fait lors d’un vol nuptial composé
de nombreux mâles et femelles, les spermatophores des mâles sont stockés dans une à trois
spermathèques de la femelle. Après l’accouplement, la femelle recherche un hôte pour un repas
sanguin indispensable à la maturation des œufs. Deux jours après leur repas sanguin, les
femelles vont pondre leurs œufs dans des conditions optimales de température soit environ
28°C. Ceux-ci vont être disposés en amas ou en rang les uns derrière les autres, dans des habitats
humides et riches en matières organiques d’origine végétale en décomposition tels que des eaux
stagnantes, des vieilles souches d’arbre ou des tas de fumier par exemple. Ils vont éclore deux
à huit jours après la ponte et donner de minuscules larves blanches. Le développement larvaire
dure de deux semaines à plusieurs mois en fonction de la saison. La larve se transforme ensuite
en nymphe, étape où l’insecte ne se nourrit pas. Elle donnera l’imago deux à dix jours plus tard.

3. Ecologie

L’écologie des Culicoides est liée aux conditions climatiques (température, humidité et
agitation de l’air) et dépend des espèces. Leur activité est flagrante entre 13 et 35°C (71). Les

12
adultes ont une espérance de vie relativement faible (10 à 20 jours), mais exceptionnellement
ils peuvent survivre jusqu’à trois mois en particulier à basse température (6 à 12°C), et ainsi
prendre de nombreux repas sanguins. La sècheresse tue les larves rapidement et est hostile aux
adultes tout comme la pluie qui les empêche de voler. Ces facteurs expliquent que dans les
régions tempérées, les Culicoides sont surtout abondants à la fin de l’été et au début de
l’automne (72).
On retrouve les Culicoides principalement au niveau du sol à proximité des animaux (73). Les
femelles hématophages sont parfois même très agressives. Certaines sont ornitophiles, d’autre
mammophiles selon les espèces. La plupart des espèces sont crépusculaires, elles piquent en
générale le matin à l’aube ou le soir avant le coucher du soleil mais il existe des espèces piquant
en plein jour et en plein soleil (Culicoides nubeculosus (Meigen 1830)), tandis que d’autres
préfèrent l’ombre (65). Seulement deux espèces sont connues être parthénogénétiques 6 et
autogènes7, à savoir, C. lutz et C. bermudensis respectivement.
Les femelles repèrent leur proie grâce à leurs palpes sensibles à la chaleur humide et au gaz
carbonique (66).
Les mâles sont en général floricoles, ils se nourrissent de nectar, de sucre, de pollen, de liquide
de matière organique en décomposition. Ainsi, nous les retrouvons surtout au sommet des
arbres, dans les feuillages. C’est leur gîte de repos, c’est à dire le lieu où les adultes se trouvent
en dehors de la période de chasse et des gîtes de ponte. De manière générale, les Culicoides
sont retrouvés aux alentours des exploitations de bétail, à proximité des eaux stagnantes et des
excréments. Toutefois la présence d’animaux à l’intérieur d’une étable peut attirer les
Culicoides.
Les larves quant à elles, se nourrissent principalement de débris organiques en tous genres.
Elles se développent dans des milieux semi-aquatiques comme dans les vases au bord des
rivières par exemple (72, 74). Il existe deux catégories de larves : une qui donnera la génération
d’été, et une qui entre en estivo-hibernation. Cette dernière constituera la génération du
printemps suivant, elle est même souvent plus abondante. La fin de l’hibernation s’effectue à
la fin de l’hiver (65). Cela permet d’assurer la continuité de l’espèce en cas de déficience de la
génération d’été (67).

***

6
Mode de reproduction où l’ovule se développe sans fécondation. Il se présente à l’état naturel chez de
nombreux insectes et quelques crustacés.
7
Pondre une première fois sans avoir pris un repas de sang

13
Chapitre III : Rôle vecteur des Culicoides : les arboviroses

1. Introduction

Les arbovirus sont des virus habituellement transmis, dans les conditions naturelles, de Vertébré
à Vertébré, par un arthropode hématophage, qui en constitue le vecteur tels que les moustiques,
les tiques, et les Culicoides. Ces vecteurs peuvent transmettre une grande variété de d’arbovirus
appartenant aux familles des Flaviviridae, Bunyaviridae, Togaviridae, et Reoviridae.
Ces arbovirus sont capables de se répliquer à la fois chez leur arthropode vecteur et au sein de
l’hôte vertébré. À l'heure actuelle, les virus transmis par les moustiques sont probablement les
arbovirus les mieux étudiés car ils présentent un intérêt particulier pour la santé publique,
comme les virus de la dengue (DENV), Nil occidental (VNO), et de l'encéphalite japonaise
(JEV), tous membre de la famille des Flaviviridae, ou comme le virus du chikungunya
(CHIKV), un alphavirus de la famille des Togaviridae (75).
Concernant les virus transmis par les Culicoides, seul celui d’Oropouche (OROV) a un impact
sur la santé publique. La fièvre qu’il provoque chez l’Homme peut même causer une méningite.
Cette arbovirose est l’une des plus importantes en Amérique (principalement dans la région de
l'Amazone, du Panama et Caraïbes) (76, 77).
Parmi les Culicoides connus, 96% des espèces sont hématophages. En plus des nuisances
occasionnées, les Culicoides peuvent transmettre à l’hôte via leurs piqûres, divers pathogènes.
En effet, ils peuvent transmettre des parasites d’importance vétérinaire surtout, tels que des
parasites sanguins (Haemoproteus sp. chez les oiseaux ; Hepatocystis kochi chez les singes) ou
des filaires (Onchocerca sp. chez les chevaux ; Mansonella sp. chez l’Homme) (77). A ce jour,
plus de 50 virus appartenant à la famille des Bunyaviridae, Reoviridae, et Rhabdoviridae ont
été isolés à partir de différentes espèces de Culicoides. 45% des virus isolés sont spécifiques à
des espèces de Culicoides, y compris ceux qui sont connus pour avoir un intérêt majeur en santé
animale dans le monde entier, tels que le virus de la peste équine africaine (AHS), le virus de
la fièvre catarrhale (BTV) (Reoviridae) (77), et le virus de Schmallenberg récemment découvert
(SBV) (Bunyaviridae) (78). Ce sont des maladies à déclaration obligatoire auprès de
l’Organisation Mondiale de la Santé Animale. On peut citer également le virus d’Akabane qui
provoque des anomalies congénitales chez les ruminants, le virus de l’encéphalite équine, de la
fièvre bovine éphémère (Ephemeral bovine fever) et les virus de Palyam (77).

14
 2. Culicoides et biologie de la transmission d’arbovirus

A l’état sauvage, les Culicoides s’infectent par un arbovirus uniquement à l’occasion d’un repas
de sang sur un hôte vertébré, à l’heure actuelle et contrairement à d’autres groupes d’insectes
tels que les phlébotomes, les moustiques et les tiques (79), il n’existe pas de preuves
scientifiques suggérant une transmission verticale ou horizontale des virus chez les Culicoides
infectés (77) . Récemment, Larska et al. (2013) (80) suggérent une possible transmission trans-
ovarienne du SBV par des Culicoides (80). La période qui s’écoule de l’ingestion d'un virus à
l’occasion d’un repas sanguin infecté et la capacité de transmission est appelée « une période
d'incubation extrinsèque ». Pendant cette période, le virus se réplique dans les cellules
épithéliales de l'intestin moyen de l’insecte (Figure 9), puis il diffuse pour infecter les organes
cibles secondaires. Les virions ainsi produits, vont se disperser dans l'hémolymphe de
circulation. Une fois que le virus est présent dans les conduits salivaires, il peut être transmis à
un nouvel hôte vertébré lors d'un nouveau repas de sang (1).

Figure 9 : Cycle schématique de l’infection d’un Culicoides par un arbovirus (1).

Cependant, cette chronologie de réplication et d’infection au sein d’un Culicoides est

uniquement observée chez les espèces, voire les individus ayant une compétence vectorielle
élevée pour le virus en question, en effet, il existe un « système de barrière » sophistiqué chez
les éléments non vecteurs, le rôle de cette barrière est donc d’empêcher le passage et la diffusion
des virus au-delà des cellules intestinales (81, 82). Ceci pourrait expliquer les résultats obtenus

15
lors de l’étude de Carpenter et al., (2006) (220) sur les compétences vectorielles des espèces
appartenant au groupe Obsoletus, vecteurs connus du BTV, en effet, lors de cette étude,
seulement 4% des populations étudiées ont montré une compétence vectorielles élevée.
Bien que les mécanismes moléculaires exacts de ce système de barrières restent méconnus,
l’exposition des larves à des températures élevées, pendant leur élevage, semble perturber leur
développement et par conséquent, l’augmentation de la capacité de dissémination à l’âge adulte.
En effet, l’augmentation de la température durant les stades larvaires de C. sonorensis de l’ordre
de 5 à 10 C°, augmentera la capacité de réplication du virus de la peste équine (AHSV) au sein
des Culicoides adultes infectés par ce virus à plus de 10 fois par comparaison aux Culicoides
élevés à des températures moins élevées (83). Cependant, l’exposition des Culicoides à des
températures très élevées pourrait provoquer un taux de mortalité très importants, par
conséquent, le lien entre « température élevée » et « capacité vectorielle meilleure » dépendrait
de l’interaction entre les effets antagonistes du paramètre « température » (2).
La durée d'incubation extrinsèque dans un vecteur poïkilotherme 8 dépend aussi de la
température. Dans certaines limites, cette période est raccourcie par une température plus
élevée. La température chez les adultes semble jouer un rôle dans l’efficacité de la transmission
chez certaines espèces tel que C. sonorensis, en effet, il existe ce que qu’on appelle un « leaky
gut phenomenon » ou « le phénomène de l’intestin qui fuit » qui est particulièrement visible
lorsque ces derniers sont élevés à des températures plus élevées (83). Il en résulte des taux
d'infection plus élevés, cela indique également qu’une diffusion réussie et une transmission d'un
virus dépendent de la température (84).
Dans ce manuscrit de thèse, nous nous focalisons sur deux arboviroses (transmises par les
Culicoides) d’importance majeure en Europe : La fièvre catarrhale ovine (FCO ou BT) et la
maladie causée par le virus de Schmallenberg (SBV).

3. La fièvre catarrhale ovine ou Bluetongue (BT) en Europe

La fièvre catarrhale ovine (FCO) est une maladie des ruminants causée par le virus de la fièvre
catarrhale (BTV pour le virus de BlueTongue ou de la langue bleue), c’est une arbovirose non
contagieuse à transmission vectorielle. La clinique de cette pathologie fut publiée pour la
première fois par Spreull (1905) (85). Au cours du siècle suivant sa description, la distribution
s’est étendue à travers le monde pour atteindre une large bande comprise entre environ 40,8 N
et 35,8 S (Figure 10).

8
Des étres vivants ayant une température corporelle qui varie avec celle de leur milieu.

16
 Figure 10 : Estimation de la distribution mondiale du BTV avant 1998 (2).

Plus récemment, il y a eu une extension dramatique du BTV vers le nord de l’Europe. Un certain
nombre de mécanismes ont été impliqués dans le processus de disperssion, y compris le
mouvement du bétail infecté, le mouvement passif de Culicoides infectés transportés par les
vents, et une introduction en Europe de l'Ouest qui demeure inconnue (2).

Structure du BTV

Le virus de la fièvre catarrhale ovine (densité 1,337 g / cm) est un virus non enveloppé dont le
génome est d'environ 19 200 paires de bases composé de dix segments linéaires de l'ARN
double brin (ARN db), contenant 57% de UA et de 43% GC, avec des séquences conservées au
extrémités 5 ' et 3'terminal (GUUAAA à 5' et ACUUAC à l’extrémité 3' du brin positif) (86,
87). Les 10 segments d'ARN double brin sont emballés dans une capside composée de trois
couches de protéines icosaédriques (environ 90 nm de diamètre) à savoir : la coque interne,
composée de 120 copies de VP3 (100 kDa), sur cette couche également, on retrouve des
quantités mineures de trois protéines enzymatiques impliquées en transcription et la
réplication :
- L'ARN polymérase ARN-dépendante VP1 (149kDa) (88–90) ;
- l'enzyme de coiffage de l'ARN VP4 (76 kDa) ;
- l'hélicase de l’ARN-db VP6 (36 kDa) (90).

17
La coque centrale (au-dessus de la coque interne) est composée de 780 copies de VP7 (38 kDa)
qui sont disposées comme 260 trimères (90, 91).
Enfin, l'enveloppe extérieure est composée de deux protéines de structure VP2 (111 kDa),
responsables de la fixation du virus à la surface cellulaire, et VP5 (59 kDa) qui facilitent la
pénétration de la membrane cellulaire (92–94) (Figure 11). Cette protéine (V5) détermine
également le sérotype du BTV, il en existe au total 24 (2).

Figure 11 : Représentation schématique du BTV, de ses protéines structurales et segments

d’ARN doubles brins (3).

Le virus du BTV est composé également de protéines non structurales (NS1, NS2, NS3 et
NS3A), elles participent probablement au contrôle de la réplication du BTV, la maturation et
l'exportation de la cellule infectée. La protéine NS1 aurait un rôle dans la morphogénèse virale
(95, 96). La protéine NS2 est le principal composant des corps d'inclusion viraux (95–98), elle
est également impliquée dans le recrutement de l’ARNm pour la réplication du BTV (93, 99,
100). Les protéines NS3 agissent comme des viroporines, ce qui améliore la perméabilité de la
membrane cytoplasmique et donc facilite la libération du virus à partir de cellules de
mammifères ou d'insectes (91, 93, 101, 102). En outre, NS3 permet également aux particules
du BTV de quitter les cellules hôtes par un mécanisme de bourgeonnement (103). La nature
segmentée du génome du BTV permet le réassortiment de segments d’ARN-ds en cas de
surinfection de la cellule hôte par plusieurs sérotypes différents (104–108). Ce réassortiment
joue un rôle important dans le développement de la diversité virale (109) et la virulence du virus
(108, 110).

18
Transmission du BTV

Le virus de la fièvre catarrhale ovine est transmis par des espèces du genre Culicoides. Seuls
les ruminants sont sensibles à l’infection notamment les bovins, les ovins, les cervidés, les
caprins et les camélidés. Généralement, les signes cliniques de la maladie sont très peu visibles
(2) (Figure 12), mais dans certains cas et en fonction de l’espèce animale affectée, les signes
peuvent inclure : hyperthermie, abattement, boiterie, œdèmes des lèvres, de la langue et de la
tête, conjonctivite, salivation excessive, l'écoulement nasal, douleur au niveau des jonctions
cutanéo-muqueuses telles que la gencive et de la vulve, avortement chez les femelles gestantes
et enfin dans de rare cas, la mort. Le symptôme de la « langue bleue » dont la maladie doit son
nom, ne se voit que rarement et dans les cas cliniques les plus graves. La race peut aussi jouer
un rôle important dans la gravité des symptômes, en effet, des signes cliniques graves sont
souvent observés dans les races améliorées de moutons. Les animaux survivants, peuvent
également présenter un certain nombre de sequelles, telles que la baisse de la production laitière
et l’état d’embonpoint, mauvaise qualité de laine et une infertilité transitoire (111).

Figure 12 : Des signes cliniques modérés (à droite) et sévères (à gauche) de la fièvre

catarrhale ovine (4).

Ecologie et transmission du BTV

La gamme d'hôtes de Culicoides peut être très large, en effet, certaines espèces peuvent se
gorger sur les oiseaux, les mammifères ou les amphibiens, voire même sur des insectes gorgés
de sang. Toutes les espèces Culicoides ne sont pas vectrices de pathogènes à cause de

19
l’existence de la barrière d’infection, seulement environ 50 des 1400 espèces de Culicoides
connues se sont révélées être capables de développer entièrement une infection.
Pour qu’un Culicoides puisse possèder une bonne capacité vectorielle, il doit se gorger
exclusivement ou principalement sur les ruminants habituellement infectés par les virus et se
reproduire massivement. En pratique, beaucoup les Culicoides montrent des préférences
trophiques très larges et variées. Par conséquent, seule une poignée d’espèces sont capables de
transmettre le virus de BTV. Parmi les espèces vectrices du virus de la fièvre catarrhale ovine,
on retrouve C. imicola, le principal vecteur du virus en Afrique, au Moyen-Orient, en Asie du
sud-est et dans une grande partie de sud de l’Europe. C. sonorensis et C.brevetalis sont les
principaux vecteurs respectivement en Amérique du nord et en Australie.
Les espèces paléarctiques ont été incriminées dans la transmission du BTV suite à l’isolement
du sérotype BTV-4 chez des femelles du groupe Obsoletus lors de l’épidémie du BT en Chypre
en 1977 (112). Plus tard, un autre virus similaire à celui du BTV a été isolé chez les espèces
des groupes Obsoletus et Pulicaris en Espagne, il s’agit du virus de la peste équine ou AHSV
(113). Ces deux groupes de Culicoides mordent le bétail et ils sont également très abondants
dans les fermes, par conséquent, ils sont des vecteurs potentiels du virus.
La distribution de BTV en Europe avant 1998 correspondait étroitement à la répartition connue
de son vecteur, l'espèce afro-asiatique C. imicola. Il a donc été supposé que, malgré les
conclusions de de Mellor et Pitzolis (1979) (112), les espèces paléarctiques ne pouvaient pas
soutenir la transmission de BTV en Europe. Cette hypothèse n’a pas été validée depuis
l’apparition en 1998 de foyers de BTV dans des régions d’Europe où C.imicola est absent. Cette
nouvelle distribution du virus combinées aux résultats des études, précédemment citées (112,
113) suggérait qu’au moins une espèce appartenant au groupe Obsoletus et qu’une ou plusieurs
espèces appartenant au groupe Pulicaris participeraient activement à la multiplication et la
dissémination du virus de la Blue Tongue en Europe. Ces deux groupes de vecteurs sont
omniprésents en Europe. Parce que les femelles de nombreuses espèces au sein de ces deux
groupes ne peuvent pas être morphologiquement distinguées (114), il avait été longtemps
impossible d'incriminer explicitement des espèces stricto sensu au sein de ces groupes.
Cependant, le développement des outils moléculaires (40, 115, 116) et morphométriques (41,
46–48) ont permis de différencier les espèces au sein de ces deux groupes. Ces outils vont aussi
permettre d’identifier et d’étudier les compétences vectorielles à l’échelle de l’espèce (2) ainsi
que l’écologie, la distribution et l’abondance en prenant en compte d’autres paramètres telle
que la température et l’environnement. En effet, les tolérances environnementales et
températures varient en fonction des espèces de Culicoides.

20
Les niveaux optimaux de précipitations pour les populations d'espèces afro-asiatiques, tels que
C. imicola sont différentes de celles des espèces paléarctiques tels que les groupes Obsoletus et
Pulicaris. Ainsi, à long terme, les changements environnementaux et climatiques pourraient
altérer l'aptitude d'une région géographique donnée pour certaines espèces de Culicoides en
changeant sa faune de vecteurs et par conséquent le potentiel de transmission du BTV et d'autres
arbovirus (2). Ces dernières années, en Europe du Sud, la température élevée et les faibles
précipitations ont eu un impact direct sur la répartition et la distribution de C. imicola, ce
phénomène ne cesse d’augmenter (117). Il a également été suggéré que la répartition de
C. dewulfi en Belgique pourrait avoir augmenté au cours des dernières décennies (118).
Les Culicoides sont les vecteurs de la fièvre catarrhale ovine, mais il semble que certaines
souches de BTV puissent être directement transmises d'un hôte à l’autre par un ou plusieurs
mécanismes secondaires, y compris par voie transplacentaire, par transmission iatrogène et par
voie orale, ainsi que, potentiellement, une transmission mécanique entre les hôtes par les pièces
buccales des mouches piqueuses contaminées (2).
Plusieurs autres facteurs pourraient entretenir la présence du BTV durant l’hiver. Parmi eux on
peut citer une longévité prolongée des Culicoides infectés et la présence des ruminants infectés
de manière persistante. Ces mécanismes de persistance du virus ont été examinés et revus par
Wilson et al. (2008) (4) (Figure 13 et 14). En effet, comme décrit ci-dessus, le BTV semble
incapable de se répliquer à des températures au-dessous de 12 C°, température à laquelle
l'activité des Culicoides diminue avant de cesser complétement à de plus basses températures.
Par conséquent, dans de nombreuses régions tempérées, le cycle classique de transmission du
virus est presque complètement interrompu pendant plusieurs mois de l'année durant la saison
froide. Les épidémies reprennent souvent après des interruptions beaucoup plus longues que la
durée de vie typique d'un vecteur adulte ou de la durée habituelle de la virémie. Chez l’hôte, ce
phénomène est appelé «l'hivernage ou overwintering». Bien que ces mécanismes secondaires
décrits ci-dessus ne peuvent influencer que très peu l’épidémiologie de la maladie, ils peuvent
devenir d’une importance cruciale pour la survie du virus lorsque la transmission normale est
interrompue par le froid (4). Il n’empêche qu’un ou plusieurs de ces mécanismes sont
susceptibles d'être responsables des quelques événements de transmission du virus confirmé
avoir eu lieu au cours de l'hiver dans le nord-ouest de l’Europe (119–121).

21
 Figure 13 : La transmission du BTV en été (à gauche) et en hiver (à droite) (4)*.
*La transmission mécanique et vénérienne, ainsi que les autres vecteurs et espèces hôtes possibles ne sont pas montrés sur la
figure.

Figure 14 : Les différents mécanismes pouvant expliquer la persistance du BTV

(Overwintering) suggérés dans la littérature (4).

22
Distribution mondiale et activité du BTV avant 1998

Durant la première moitié du XXe siècle, le BTV n’a été rapporté que dans certaines régions
d’Afrique et de Chypre, mais en 1951 une épidémie de BT a également été confirmée en Israël.
La détection du virus l’année suivante aux Etats-Unis reflète une expansion encore plus
dramatique dans la distribution connue du virus. En effet, dans un premier temps aux
Etats- Unis, la survenue de la maladie était peu probable. Il a été donc supposé initialement que
cette épidémie représentait une maladie entièrement nouvelle, appelée «Soremuzzle» (122).
En Asie, le BTV était d'abord confirmé en 1961 quand une épidémie de la maladie a été détectée
en Inde (221), puis en Australie, où le virus a été isolé à partir de Culicoides recueillis près de
Darwin en 1975 (123).
En Europe, une épidémie majeure due au sérotype 10 de BTV (BTV-10) a ravagé les
populations de moutons de l'Espagne et du Portugal entre 1956 et 1960 causant la mort de près
de 180 000 animaux (124). D’autres épidémies moins dévastatrices dues au BTV-4 ont eu lieu
sur plusieurs îles grecques proches des régions côtières de l'Anatolie turque en 1979 (125). La
mortalité massive connue dans la péninsule ibérique a démontré que, bien que les incursions du
BTV en Europe étaient rares à cette époque, des parties de l'Europe du Sud étaient capables de
soutenir la transmission de BTV et que le bétail européen était très vulnérable au virus (2).
À la fin du XXe siècle, la répartition connue de BTV avait augmenté de façon spectaculaire et
le virus a été signalé dans la plupart des régions pour s’étendre, partout dans le monde, dans
une large bande comprise environ entre 35°S et 40°N (Figure 10). Dans certaines régions, le
BTV a été détecté jusqu’à la bande des 50°N (77, 126). Au début des années 1990 et afin de
comprendre cette nouvelle distribution du virus, une étude sur les conditions de températures
saisonnières dans ces endroits a suggéré que le virus avait le potentiel pour être
considérablement transmis plus au nord dans d'autres endroits, y compris en Europe et en
Amérique du Nord (127).

Emergence de la Blue Tongue en Europe entre 1998 et 2006

En 1998, le BTV a été détecté sur plusieurs îles grecques près de la côte d’Anatolie en Turquie
(128). Au cours des trois années suivantes, la souche virale a été identifiée, il s’agit du BTV-9,
cette souche, se propageait par la suite vers le nord et vers l'ouest par via et au-delà la Grèce
continentale, pour finalement atteindre le Kosovo en 2001 (129). En 1999, la propagation du
BTV-9 a été suivie par l’introduction de BTV4 et BTV-16 et celle du BTV-1 en 2001 en Grèce
continentale. Les introductions de BTV-1, 9 et 16 étaient probablement attribuables au moins

23
en partie à des mouvements d'animaux le long de « la route eurasienne des ruminants », il s’agit
d’une zone avec de fortes densités de ruminants qui s'étend depuis l'Inde et le Pakistan à travers
l'Afghanistan, la Turquie, l'Irak et l'Iran jusqu’au sud-est de l'Europe, qui est également
soupçonné de contribuer à la propagation d'autres maladies du bétail telle que la fièvre aphteuse
(130).
Le BTV-16 a été isolé également en Turquie en 2000 et se produit régulièrement en Israël, ce
qui suggère une origine « Moyen-Orientale », alors que la souche de BTV-1, détectée en 2001,
est semblable aux isolats de l'Inde et de la Malaisie. Bien que le BTV-4 ait également été détecté
en Grèce en 1999, le virus isolé est très étroitement liée à des souches isolées en Chypre et en
Turquie quelques décennies plus tôt, ce qui suggère que la souche avait circulé localement
depuis de nombreuses années. Coté vecteur, bien que C. imicola n'ait pas été identifié en Europe
jusqu'en 1982 (131, 132), des foyers de BTV (tel que décrit ci-dessus) et de la peste équine
(133) suggèrent qu'il avait été présent dans certaines parties du sud de l'Europe bien avant
l’apparition de ces foyers. L’activité du BTV en Europe avant 2001 aurait été limitée au rôle
vecteur de C. imicola (112, 131, 134–139). La propagation du BTV-9 aussi loin au nord
jusqu’au Kosovo où C. imicola est absent était donc une étape importante dans l'épidémiologie
de la BT en Europe. Le modèle de propagation du BTV dans la région Egéenne souligne
également l'importance des mécanismes par lesquels le BTV peut se propager autrement que
par le déplacement des animaux. En effet, les Culicoides sont généralement capables de voler
activement sur de courtes distances (1-2 km), ils peuvent également être soufflés passivement
par le vent sur de longues distances en raison de leur petite taille (2).
Le transport des Culicoides infectés par le vent, en particulier sur les plans d'eau, semble être
la source la plus probable d'un certain nombre d'introductions de BTV (140, 141), ainsi que
d'autres virus transmis par les Culicoides. En outre, la propagation du virus en l'absence de
mouvements corrélés de bétail suggère fortement que plusieurs de ces événements
d'introduction étaient attribuables à la circulation aérienne de Culicoides infectés (2). Il est
particulièrement important de comprendre l’épidémiologie la circulation des vecteurs du point
de vue réglementaire, car les restrictions aux mouvements d'animaux sensibles seules rendraient
la lutte beaucoup moins efficace pour limiter la propagation des épidémies. En conséquence,
grâce à l’hypothèse liée au transport de Culicoides par le vent, l'Union européenne (UE) exige
des restrictions de mouvement imposées sur un rayon minimum de 100 km (142). Pendant ce
temps, le BTV- 2 a été détecté en Tunisie en 2000, et s’est propagé encore en Afrique du Nord
au cours de l'année (en Algérie et au Maroc). Il s’est également disséminé dans le bassin
méditerranéen, en effet, le sérotype 4 a été isolé à partir d'animaux dans les îles Baléares, en

24
Espagne, en Corse, en Sardaigne, en Sicile et dans le sud de l'Italie en décembre de la même
année. Le BTV-2, quant à lui, est devenu endémique dans les régions sub-sahariennes d’Afrique
de l'Ouest (143). Il semble qu’il ait été introduit en Afrique du Nord à cause de mouvements
illégaux de bétail d'Afrique sub-saharienne et d’Afrique de l'Ouest vers le Maghreb, cette voie
d’introduction, explique l’apparition d’un foyer dû au BTV-2 en Algérie de la même année
(144). Egalement, une souche de BTV-4 a été isolée en Espagne, au Portugal, et en Corse entre
2003 et 2005, la propagation de cette souche en Europe a été expliquée soit par le mouvement
des animaux et/ou l’introduction des Culicoides infectés par le vent (2).
Avant 2001, seuls les vaccins vivants atténués ont été développés pour lutter contre le BTV,
l'utilisation de ce type de vaccin n’est pas sans risque, car potentiellement, une souche de vaccin
pourrait se réassortir avec une souche de type sauvage, il en résulterait par conséquent de
nouvelles diversités génétiques dans la virulence. Les vaccins atténués existants avant 2001 ont
été développés pour une utilisation dans les régions où plusieurs souches de BTV étaient déjà
endémiques et où les races des populations traitées sont relativement résistantes. Dans un
contexte européen, les risques associés à l'utilisation de ces vaccins étaient clairement d'une
plus grande préoccupation, car son usage sur des races très sensibles de ruminants pourrait
déclencher une maladie clinique très sévère. Cela avait suffi pour décourager l'utilisation de
vaccins vivants atténués dans plusieurs pays du continent Européen, en particulier les pays où
le BTV sévit depuis 1998 (2). La mise au point d’un vaccin alternatif inactivé était donc la
priorité en Europe, la raison pour laquelle l'UE mobilisait des fonds afin de financer un projet
pour développer ce type de vaccins inactivés pour des utilisations ultérieures dans la zone en
cas d’épidémie (145). Cependant, la stratégie Européenne de développer un vaccin atténué était
interrompue suite à l'arrivée de BTV-2, BTV-4, BTV-9 et BTV-16 en Italie dans un court laps
de temps. Cette nouvelle situation a conduit les autorités italiennes à considérer que les risques
liés aux vaccins vivants seraient contrebalancés par le coût de la non-vaccination. La
vaccination avec un vaccin vivant atténué a donc commencé et à grande échelle, au cours de
cette campagne de vaccination, la majorité de préoccupations sus-citées étaient donc
confirmées, y compris le réassortiment de souches vaccinales atténuées avec d'autres souches
dans des hôtes co-infectés (108) et la transmission des souches vaccinales aux animaux non
vaccinés (146, 147).
Ces observations sur le terrain, ont été confirmées après un travail expérimental sur des souches
vaccinales atténuées du BTV et la capacité de leur réplications chez des Culicoides dans des
conditions de laboratoire a été démontrée (148), de plus, le potentiel de ces vaccins à générer
des signes cliniques chez les races européennes de moutons a été vérifié (149).

25
En résumé :
D’après ce qu’il précède, pour expliquer l’introduction du BTV en Europe avant 2006 deux
scénarios sont possibles :
- La plupart des foyers européens sont survenus suite à l'introduction d'une nouvelle
souche de BTV soit en Anatolie turque ou en Maghreb par le mouvement du bétail
infecté, suivie par la propagation en Europe de l'Est ou du Sud par l'une des trois
«passerelles» (Figure 15) ou tout simplement, la propagation vers l'Europe de
Culicoides infectés par le vent ;
- bien que de précédentes études aient prédit une expansion spectaculaire du BTV et un
rôle majeur des Culicoides autochtones dans la transmission dans toute l’Europe,
l’absence d’une telle expansion avant 2006, à pousser les décideurs de penser que les
voies d’introduction du BTV en Europe sont inconnues.
Quelles que soient les voies d’introduction du BTV en Europe, les autorités ont donc pensé que
le BTV emprunterait l’une des portes d’entrée mentionnées sur la Figure 15 avec une
dissémination progressive à l’instar des précédentes épidémies et que celle-ci resterait confinée
dans les régions du sud et de l’ouest de l’Europe. Suite à ce raisonnement, le financement des
programmes préventifs tels que la surveillance entomologique et de lutte anti vectorielle a été
relativement négligé et le projet de développent d’un vaccin inactivé était favorisé. (D’après
Wilson et al, 2009) (2).

Figure 15 : les principales voies d’introduction du BTV en Europe. A : Maroc-Espagne,

B : Tunisie-Sicile, C : Turquie-Grèce/Bulgarie (26).

26
La Blue Tongue en Europe après 2006

Il existe au total 24 sérotypes distincts reconnus à l’heure actuelle. Le nouveau virus

« Toggenburg Orbivirus ou TOV» récemment décrit en Suisse est proposé comme étant un 25e
sérotype du BTV (150, 151). La répartition mondiale des sérotypes du BTV n’est pas homogène
et ne cesse de subir des modifications drastiques, ceci pourrait être une des conséquences
directes du changement climatique (117, 152, 153). Plusieurs sérotypes (sérotypes 1, 2, 4, 6, 8,
9, 11 et 16) ont envahi l'Europe depuis 1998 (154, 155).
La souche du sérotype 8 a été identifiée la première fois en Europe du Nord en 2006, ensuite ce
sérotype s’est répandu du bassin méditerranéen jusqu’à 50° de latitude Nord pour atteindre
certaines régions du Nord de la Scandinavie (156–159). À l'exception du sérotype 8, tous les
autres sérotypes qui ont envahi le bassin méditerranéen après 1998 ont eu tous pour origine les
régions Africaines ou Asiatiques (117).
Les Eespèces Culicoides vectrices du BTV dans les différentes régions du monde, sont
particulièrement mal caractérisées, notamment dans certaines localités en Asie où Culicoides
imicola, le vecteur traditionnelle afro-asiatique de BTV, est absent (153, 160, 161). Le BTV
s’est également propagé rapidement à travers de vastes portions d'Europe où C. imicola ne
circule pas, visiblement, en utilisant de nouvelles espèces de vecteurs, y compris les espèces
paléarctiques telles que Culicoides obsoletus sensu stricto, Culicoides pulicaris,
Culicoides dewulfi, Culicoides scoticus et Culicoides chiopterus (157, 159, 162–166). Ces
espèces autochtones sont abondantes en Europe bien avant l'émergence récente de plusieurs
sérotypes, ce qui suggère que les changements environnementaux pourraient être responsables
de leur récente capacité vectorielle et leur efficacité dans la transmission du virus (117, 153).
Après une accalmie hivernale due à l’inactivité vectorielle, une reprise épizootique massive a
été observée à partir du début du mois de juillet 2007. Plus de 50 000 foyers à BTV-8 ont été
recensés en 2007, dans neuf pays européens : Allemagne, Belgique, Danemark, France,
Luxembourg, Pays-Bas, Suisse, République tchèque et Royaume-Uni. En 2008 plus de 27 000
exploitations en L'Europe ont été touchées par le BTV-8 et plus de 6000 par BTV-1. En outre,
deux nouveaux sérotypes (BTV-6 et BTV-11) sont arrivés dans la région (2).
Parallèlement aux mesures sanitaires mises en place dans les pays infectés, des campagnes de
vaccination obligatoire, à l’aide de vaccins à virus inactivés dirigés contre les sérotypes 1 et 8,
ont été mise en œuvre jusqu’à l’automne 2010. L’impact positif de la vaccination, couplé à
l’acquisition d’une immunité protectrice à la suite d’une infection, s’est traduit par un
effondrement du nombre de foyers. La situation sanitaire s’est progressivement améliorée dans

27
toute l’Europe du Nord. Ainsi, le Royaume-Uni a recouvré son statut indemne de FCO en 2011,
suivi en 2012 par l’Allemagne, la Belgique et les Pays-Bas. En France, le dernier foyer de FCO
a été identifié en juin 2010, dans le département des Alpes-Maritimes (sérotype 1). En Europe
du Sud, le virus circulait encore en 2011 : des foyers ont été notifiés en Espagne (sérotype 1),
au Portugal (sérotype 1), en Italie (sérotypes 1, 2, 8 et 9), en Grèce (sérotypes 4 et 16) et à
Chypre (sérotypes 4 et 16) (167).
Enfin, la plupart des introductions de BTV en Europe durant la dernière décennie sont censées
avoir eu lieu par l'intermédiaire de l'une des trois «passerelles» illustrées dans la Figure 15, par
conséquent, toutes les ressources de surveillance ont ciblé les voies connues d’introduction du
virus en Europe. Cependant, l'arrivée en Europe de l'Ouest de BTV-8 en 2006, BTV-6 en 2008
et BTV-11 en 2009 suggère qu'au moins une autre voie ou mode d'introduction peuvent exister.
Bien que des tentatives aient été faites pour identifier la (les) voie (s) d'introduction du BTV en
traçant les importations d'animaux et en modélisant des conditions météorologiques, ces
mécanismes d'introduction en Europe de l'Ouest et notamment ceux qui consisteraient à
« l’introduction passive ou active par le vecteur » restent incertains et nécessitent clairement
d’être élucidés afin que des mesures appropriées puissent être mises en place pour éviter que
d'autres réémergences plus virulentes et non contrôlées aient lieu à l’avenir. La situation actuelle
des pays Européens vis-à-vis la fièvre catarrhale ovine est illustrée dans la Figure 16.

28
Figure 16 : Carte de la distribution de la fièvre catarrhale ovine (FCO) en Europe au deuxième
semestre de l’année 2014 Source : OIE (2014).

29
 4. Virus de Schmallenberg (SBV)

Introduction

En août 2011, les éleveurs et les vétérinaires de la ville de Schmallenberg en Allemagne

constatent une chute « anormalement » sévère de production laitière associée à de
l’hyperthermie, de la diarrhée sévère et parfois des avortements chez les bovins. Ainsi, des
échantillons sanguins prélevés dans les exploitations touchées, ont été envoyés au « Friedrich
Loeffler Institute » (FLI, Ile de Riems, Allemagne). En novembre 2011, suite aux analyses
métagénomiques d’un pool d’échantillons, un nouveau virus est découvert et baptisé « le virus
Schmallenberg » (SBV) (168).
Le SBV est transmis par les Culicoides. Il a été mis en évidence chez des ovins, des caprins et
des bovins en Allemagne, aux Pays-Bas, en Belgique, au Royaume-Uni et en France, chez une
chèvre en Italie, chez des agneaux et des veaux au Grande- Duché de Luxembourg et chez un
agneau en Espagne. (78, 168, 169). Bien que d’autres Orthobunyavirus aient été identifiés en
Europe par l’analyse de pools de moustiques (cas du virus Batai en Allemagne) (170), ou lié à
une présence endémique (cas du virus Tahyna) (171), il s’agit, dans le cas de SBV, de la
première occurrence de circulation autochtone d’un Orthobunyavirus du sérogroupe Simbu en
Europe occidentale (168).
Les manifestations cliniques chez les bovins adultes se caractérisent principalement par une
baisse de la production laitière, fièvre, diarrhées et parfois avortement. Chez les agneaux, les
veaux et les chevreaux, des malformations congénitales ont été rapportées, ces malformations
sont le plus souvent de type arthrogrypose/hydranencéphalie (172, 173).

Le virus de Schmallenberg (SBV)

Le sérogroupe Simbu inclut 23 virus qui se répartissent en huit espèces (Tableau III). Certains
virus sont associés à des maladies touchant les ruminants, alors que d’autres ont un intérêt en
santé publique tel que le virus Oropouche, qui provoque une maladie fébrile sévère chez
l'homme.

30
Tableau II : Les virus du sérogroupe Simbu (d’après L’EFSA, 20149).

Le SBV appartient à la famille des Bunyaviridae, genre Orthobunyavirus, sérogroupe Simbu.

Les virus de la famille des Bunyaviridae sont enveloppés et généralement sphériques. Leur
génome est constitué de trois segments d’ARN (S, M et L) adoptant une conformation circulaire
en association avec les protéines virales de nucléocapside N (Figure 17).

9
Autorité européenne de sécurité des aliments

31
Figure 17 : Structure des virus de la famille des Bunyaviridae (175).

Le segment S code la protéine de nucléocapside N et, pour la plupart des membres des genres
Orthobunyavirus, Tospovirus et Phlebovirus, également la protéine NSs, qui intervient dans la
modulation de la réponse antivirale des cellules infectées. Le segment M encode un précurseur
polyprotéique membranaire, qui sera clivé en glycoprotéines virales Gn et Gc ainsi que, chez
les Orthobunyavirus, Tospovirus et Phlebovirus, en une protéine NSm, impliquée dans la
morphogénèse virale. Pour tous les Bunyaviridae, le segment L code une unique protéine
complexe, constituant l’ARN polymérase virale dépendant de l’ARN (175).
Au départ, lors de l’apparition de la maladie et après isolement du SBV, les bases de données
contenant des séquences disponibles à l’époque, ont été interrogées afin de tenter d’identifier
le virus. Il l’en sort que la séquence du SBV montre 69% d’homologie avec le segment L du
virus Akabane, 71% d’homologie avec le segment M du virus Aino et de 97% d’homologie
avec le segment S du virus Shamonda (174). Par la suite, suite à la détermination de séquences
supplémentaires de plusieurs virus de groupe Simbu, il s’avère que le SBV affiche une
homologie plus élevée avec le segment M d’autres orthobunyavirus, tels que les virus Sathuperi
et Douglas et avec les segments S et L du virus Shamonda. Ces données ont suggéré que le
SBV proviendrait d’un réassortiment entre le virus Sathuperi et le virus Shamonda (176).

Plus tard, des séquences encore plus abouties et plus complètes ont été disponibles pour les
virus : Aino, Douglas, Peaton, Sabo, Sango, Sathuperi, Shamonda, Shuni, et Simbu. Cela a
permis de réaliser des analyses phylogénétiques plus pertinentes. Le résultat de ces analyses,

32
suggèrent que le SBV appartient au groupe des espèces du virus Sathuperi et que le SBV est un
ancêtre du virus Shamonda avec lequel il partage les segments S et L. Le segment M du virus
Shamonda est d’origine non déterminée (177).

Espèces sensibles

Selon l’OIE10, le virus de Schmallenberg est principalement rapporté chez les ruminants. Les
études sérologiques et épidémiologiques montrent qu’il ne s’agit pas d’un agent zoonotique.
Chez les animaux, le virus se transmet par des insectes vecteurs ainsi que verticalement in utero.

Hôtes
- Confirmation par la PCR ou l’isolement du virus : bovins, ovins et caprins et aussi
bisons, chevreuils d’Europe et enfin chiens.
- Confirmation sérologique uniquement : cerfs élaphes, alpagas, mouflons et sangliers.
Les chiens domestiques sont-ils infectés par SBV ? Trois publications contradictoires existent
à ce jour. En effet, la première publication décrit une séropositivité chez le chien sans signes
cliniques évidents (178). La deuxième étude, rapporte un cas clinique avec lésions
neurologiques associée à la mise en évidence de l’ARN viral par la technique RT-PCR dans le
cervelet (179). Quant à la dernière étude, il s’agissait des essais sur un groupe de chiens exposés
au SBV, mais seulement un seul essai était peu concluant pour les anticorps anti-SBV (180).
Avec les éléments disponibles, il est impossible de tirer des conclusions définitives en ce qui
concerne la sensibilité des chiens domestiques à l'infection par SBV.

Les résultats des infections expérimentales menées chez le porc (181) et la volaille (182)
indiquent que la réplication du virus ne se produit pas chez ces espèces. En outre, une étude
menée sur les camélidés sud-américains (SAC) en Allemagne a montré une forte séroprévalence
(62,4%) à l’échelle d’individu et de (92,4%) à l’échelle du troupeau, mais l’ARN viral n’a pas
été détecté, cela est peut être lié à la courte virémie chez cette espèce. Bien que trois SAC
malformés aient été signalés, l’infection au SBV ne pouvait pas être confirmée comme étant la
cause des malformations observées (183). Egalement, d’autres études ont montré que les
chevaux, les souris et les carnivores sauvages ne pourraient pas jouer un rôle de réservoir dans
l'épidémiologie du SBV (182).

10
Organisation Mondiale de la Santé Animale

33
Virémie et durée d’incubation

La maladie de Schmallenberg provoque des manifestations cliniques relativement frustes

durant la phase d'infection aiguë. Une courte virémie a été démontrée lors des premiers travaux
menés par les chercheurs du FLI11 sur le virus (174), la période d’incubation était comprise
entre 1 et 4 jours et la virémie a duré 1 à 5 jours. Egalement, 3 à 5 jours après une inoculation
expérimentale chez des bovins, les signes cliniques étaient absents à discrets (174, 181,184).
D’après les études précitées, les tissus dans lesquels le virus a été isolé sont le sang prélevé chez
des animaux adultes atteints et tissu encéphalique provenant de fœtus infectés. Egalement, les
tissus positifs à la PCR sont les organes et sang de fœtus infectés, méconium, liquide
amniotique, placenta. À la suite d’une infection aiguë, il est possible de déceler l’ARN du virus
de Schmallenberg pendant plusieurs semaines dans différents tissus tels que la semence, les
organes lymphatiques, en particulier les ganglions lymphatiques mésentériques, et la rate (OIE,
2013).
Des malformations dues au SBV ont été rapportées chez les agneaux, chevreaux et veaux telles
que l’arthrogrypose (Figure 18. a et b), les malformations de la colonne vertébrale (cyphose,
lordose, une scoliose, torticolis) et du crâne (déformation, une macrocéphalie, brachygnathie
inférieure (Figure 18. c) ainsi que malformations variables du cerveau (hydranencéphalie,
porencéphalie, hypoplasie cérébelleuse, une hypoplasie du tronc cérébral (Figure 18. d) et de la
moelle épinière (173). Cependant, les études d’inoculation expérimentale du SBV concluent
que le nombre des malformations congénitales est limité (1 sur 24 fœtus) (182).
Il a été rapporté aussi que d’autres Orthobunyavirus pourraient être associés à des
malformations congénitales chez les ruminants, tel que le virus de la vallée cache (CVV) avec
des malformations chez les agneaux en Amérique du Nord. Des cas cas humains dont un fatal
ont été aussi associés au CVV (185).

11
Friedrich Loeffler Institute

34
Figure 18 : Malformations congénitales associées au SBV. a) arthrogrypose chez un agneau et
un veau (b), c) malformations de la colonne vertébrale chez un veau et d) hydranencéphalie, et
hypoplasie cérébelleuse chez un veau (186).

35
Transmission

Les données épidémiologiques actuelles indiquent que le SBV est transmis par les arthropodes
du genre Culicoides. Le virus a été isolé à partir des Culicoides en Belgique, au Danemark, en
Italie et en Allemagne. Le Tableau III résume toutes les études qui ont été faites à ce jour pour
la recherche du SBV. Une étude récente sur les moustiques indique que ces derniers n’ont aucun
rôle dans la transmission du SBV (187).

Les études de terrain et de laboratoire indiquent que les Culicoides et notamment les espèces
du complexe Obsoletus (i.e. C. obsoletus s.s. C. dewulfi, C. scoticus and C. chiopterus) sont les
vecteurs compétents du SBV (78, 188–190). Le virus de Schmallenberg se transmet également
par voie placentaire (191). Quant à la transmission horizontale par contact direct entre les
animaux malades et sains, elle reste méconnue (192).

Balenghien et. al., (2014) (169) (Tableau IV), soulignent que les résultats obtenus pour
C. imicola, récoltés en Sardaigne, sont peu concluants (2 pools positifs sur 456). Les auteurs
sont très peu convaincus de la « non-implication » de C. imicola dans la transmission car en
effet : i) Le complexe Obsoletus et peu abondant dans la région, ii) C.imicola est l’espèce la
plus abondante sur l’ile et iii) le nombre élevé des pools négatifs au SBV pourrait être relié à la
date de l’échantillonnage. Les auteurs concluent, que des études supplémentaires dans le bassin
méditerranéen restent nécessaires pour mieux comprendre l’épidémiologie du SBV.

36
Tableau III : Les rapports publiés sur la détection du SBV dans les Culicoides capturés en Belgique, Danemark, Pays-Bas, l'Italie, la Pologne et
la France en utilisant des essais de détection quantitative (EFSA, 2014) .

37
Origine du SBV

L’origine historique et géographique du SBV suscite beaucoup de questions. En effet, tout

comme pour l’introduction du BTV-8 aux Pays-Bas et en Belgique en 2006, l’émergence du
SBV au Nord de l’Europe est incompréhensible. Les virus du sérogroupe Simbu précités,
auxquels le SBV est apparenté, sont absents en Europe, Cependant, ces virus sont présents dans
d’autres régions de monde (Tableau II) mais sont capables d’émerger en dehors de leurs aires
de distribution habituelles. En effet, les virus Akabane et Aino, endémiques en Australie et en
Extrême-Orient ont été retrouvés récemment en Israël et en Turquie. De même, le virus
Shamanda, détecté pour la première fois au Nigeria en 1960, a été retrouvé au Japon en 2005
(193). Bien que le SBV ait été découvert récemment, nos connaissances actuelles sur les virus
Simbu sont très pauvres. Cependant, les études phylogénétiques montrent que le SBV aurait
évolué en même temps que les autres virus du même sérogroupe et que ces derniers évoluent à
un rythme très soutenu. En effet, le virus Shamanda isolé au Japon en 2005, diffère de 3% de
celui isolé 40 ans auparavant en Nigeria (193).

L’émergence du SBV en Europe souligne que les Bunyavirus et en particulier les

Orthobunyavirus constituent une menace sérieuse pour le bétail Européen car les virus Akabane
et Aino sont désormais présents dans des régions méditerranéennes et risquent de s’introduire
en Europe. Par conséquent, la surveillance du bétail et la surveillance entomologique sont les
options les plus sures pour garantir une bonne prise en charge d’éventuelles émergences.

Le SBV s’est disséminé d’une manière spectaculaire en Europe (Figure 19), il est même
surprenant qu’il ait émergé dans les mêmes régions que le BTV-8, 6 et 11 en 2006. Cela suggère
que le SBV ait suivi les mêmes voies d’introduction et probablement utilisé les mêmes vecteurs.
Le SBV, pourrait exister dans d’autres régions du monde, même avant son émergence en
Europe mais son diagnostic difficile chez les populations natives asymptomatiques rend cette
recherche délicate. Compte tenu de l'augmentation du commerce international des animaux et
des produits d'origine animale ou végétale, l'Europe devra sans doute faire face à de plus en
plus d'émergences de ce type (194).

38
Figure 19 : Distribution des foyers du SBV en Europe (A) et en France métropolitaine (B)
(194).

***

39
Objectifs de la thèse

L'objectif principal de cette thèse est de développer et appliquer chez les Culicoides de
nouveaux outils méthodologiques dans l'étude de la systématique de taxons complexes par une
approche de taxonomie intégrative. Les études moléculaires ont été menées en utilisant un
marqueur mitochondrial (COI) et un marqueur ribosomique, le domaine D1D2 du 28S. Une
approche globale de discrimination de taxons cryptiques par morphométrie géométrique est
mise au point. Elle permet également la délimitation d’un ensemble de spécimens comme une
entité taxonomique sans à priori. Cette méthode permet de discriminer les taxons dans une
approche exploratoire. Les études réalisées lors de cette thèse sont focalisées sur la systématique
des Culicoides du sous-genre Avaritia (Documents I), ainsi que sur la systématique du sous-
genre Culicoides (Documents II). Cette approche de taxonomie intégrative était appliquée
également sur des espèces jumelles appartenant à un sous-genre problématique dans la
taxonomie des Culicoides, il s’agit du sous genre Oecacta, véritable groupe « fourre-tout ».
Dans le document III, nous avons étudié deux espèces sympatriques et très proches
morphologiquement, il s’agit de C. festivipennis et C. clastrieri. De même pour le document
IV, dans lequel nous nous sommes penchés sur trois espèces jumelles : C .brunnicans,
C. vexans et C. santonicus dont les statuts « d’espèces » ont été vérifiés et validés grâce à
l’approche de taxonomie intégrative. Egalement, et afin de vérifier la position de ces espèces
dans le sous-genre Oecacta nous avons ajouté aux études «l’espèce type» du sous-genre :
C. furens.

Deuxièmement, nous nous sommes intéressés aussi dans cette thèse aux comportements
trophiques des Culicoides, nous avons donc comparé deux marqueurs moléculaires utilisés à ce
jour dans ce genre d’études sur les Culicoides (Document V) et nous avons analysé les résultats
obtenus.

Enfin, même dans le cadre d'une approche de taxonomie intégrative, les analyses
morphologiques doivent permettre d’inclure les spécimens de collections entomologiques.
Ceux-ci sont cruciaux car ils permettent l’analyse des types (qui constituent le lien avec la
nomenclature établie). Ces analyses sont appliquées dans les Documents II, III, et IV.

40
Chapitre IV : Matériels et méthodes

1. Origine des Culicoides

Les spécimens analysés ont été collectés de novembre 2011 à Juin 2014, ils proviennent de
deux localités dans la région Champagne-Ardenne en France : Boult-aux-Bois dans les
Ardennes et la ferme de «Vertuelle» à Louvois dans la Marne (Figure 18). Ils ont été capturés
à l´aide de pièges lumineux miniatures à lampe UV (Model 512) de type CDC (Center for
Diseases Control). Ils ont été mis en route à la tombée du jour et arrêtés à l’aube, uniquement
dans de bonnes conditions météorologiques. Ensuite, ces insectes ont été conservés
immédiatement dans l’éthanol à 96% en vue de leur analyse moléculaire. L’origine des
échantillons est détaillée dans le Tableau II.

Tableau IV : Origine des Culicoides étudiés.

Site du
Localité coordonnés GPS Animaux à proximité
piégeage
Boult-aux-
bois 49° 25′ 55″ N, 4°
Dans la forêt Sangliers, chevreuils, cerfs.
50′ 35″ E
(Ardenne)
Chiens, chats, poules, oies, canards,
Pâture
Louvois porcs, lapins, vaches, chèvres.
49° 6′ 6″ N, 4° 7′
(Marne) Abri Mouton 0″ E Moutons
Abri âne Anes, Poneys

41
Figure 18 : Sites de l’étude (Louvois, Boult-aux-Bois).

42
 2. Traitement des échantillons destinés aux analyses morphologiques,

moléculaires et morphométriques

Les pièges nous ont permis de capturer toutes sortes d’insectes. Il a fallu procéder à un tri sous
une loupe binoculaire pour ne garder que des Culicoides. Après cette étape de tri suit une étape
de montage. Chaque Culicoides est déposé individuellement sur une lame en position latérale,
la tête, les ailes et les segments postérieurs des génitalia sont prélevés à l’aide de fines aiguilles
à usage uniques. Le thorax et une partie de l’abdomen sont conservés à sec dans un micro tube
de 1,5 ml stérile à -20°C. Ensuite la tête et les génitalia sont éclaircis dans la solution de Marc-
André (195) à chaud directement sur une lame avant d’être montés entre lame et lamelle dans
la gomme au chloral qui parfait l’éclaircissement des éléments nécessaires à l’identification et
permet les études morphologiques et morphométriques. Les ailes sont montées sans traitement
préalable.

3. Identification des spécimens

Tous les spécimens ont été identifiés avec les caractères décrits dans les clés d’identification
(Campbell et Pelham-Clinton 1960 ; Delécolle 1985 ; Mathieu et al. 2012) (23, 24, 196).

4. Morphométrie géométrique

Les ailes gauches et droites des Culicoides étudiés ont été digitalisées à l’aide d’un microscope
(Zeiss V20) couplé à une caméra (Sony DSC) et au logiciel tps-UTILS 1.56 (197). Selon les
études, des photos d’ailes de références (tirées de différents ouvrages ou des descriptions
originales) ainsi que des types ont été inclus.
Dans nos études, la forme des ailes est caractérisée par des coordonnées cartésiennes
«landmarks», correspondant aux points de jonctions des nervations alaires (Figure 19), les
landmarks sont digitalisés en deux dimensions à l’aide du logiciel tps-DIG v2.17 (197).

43
 Figure 19 : Position des landmarks sur une aile d’une femelle de C. obsoletus (24).

Ensuite, les coordonnées cartésiennes (landmarks) sont tout d'abord superimposées entre tous
les spécimens par la méthode de superimposition procrustéenne généralisée (GPA) afin
d’éliminer les variations dues aux effets de translation, de rotation, et d'échelle (198, 199), la
superimposition est réalisée à l’aide des fonctions du logiciel R (200).
Cette méthode (superimposition) fournit des coordonnées alignées de chaque landmark pour
chaque spécimen ainsi qu'une configuration moyenne (consensus) du jeu de données. Les
coordonnées alignées peuvent ensuite être analysées par des tests statistiques classiques comme
l'analyse multivariée de la variance (MANOVA), par des méthodes non-supervisées comme la
Relative Warps Analysis (qui est techniquement une analyse en composantes principales), ou
par des méthodes supervisées comme les analyses discriminantes (LDA).
Afin de valider la discrimination des espèces, deux approches sont suivies : une approche basée
sur l’a priori de la biologie moléculaire et une approche dite de «découverte» sans aucun à
priori, c’est cette dernière qui est la plus pertinente dans le cadre de la taxonomie intégrative.
En effet, (34) préconisent l'application d'une approche de découverte chaque fois que possible,
lorsque l'on compare différentes disciplines dans le cadre de la taxonomie intégrative (34).

44
 5. Analyses moléculaires

Extraction de l’ADN

L’ADN a été extrait à l'aide du QiampDNA minikit (QIAGEN®) selon le protocole du fabricant.
Le thorax et les pattes sont broyés dans un microtube stérile à l’aide d’un piston pellet (Treff,
Suisse) dans le tampon de lyse ATL contenu dans le Kit du QiampDNA. L’élution finale est
réalisée dans 120µl de tampon AE. Le même protocole d’extraction est appliqué pour extraire
l’ADN de l’abdomen des femelles gorgées lors de l’étude sur l’origine des repas de sang.

Les extraits d’ADN sont conservés à -20°C. Chaque extrait comporte un numéro unique qui est
le même que celui attribué aux lames de spécimens de référence.

Amplification de l’ADN

L’amplification par la technique PCR de l’ADN extrait est performée dans un volume final de
50µl, les concentrations des différents réactifs composant le MIX sont illustrées dans le Tableau
V.

Tableau V. Composition des mix de PCR.

Réactifs Concentration

Solution tampon 10 X
Sonde forward 50 mM
Sonde reverse 50 mM
dNTP ‘s 10 mM
Taq Polymerase 5 U/µl
Eau ultra pure -
ADN -

Deux marqueurs moléculaires sont utilisés pour l’identification des Culicoides et deux autres
marqueurs moléculaires sont utilisés pour l’étude de l’origine des repas sanguins des
Culicoides. Les différents protocoles d’amplification utilisés dans ce travail sont présentés dans
le Tableau IV pour chacun des marqueurs moléculaires considérés avec leurs amorces
correspondantes.

45
 Tableau VI : Amorces et protocoles utilisés pour amplifier les marqueurs moléculaires

Marqueur Amorce Séquence Conditions PCR Taille Références

(5’-3’) (pb) d’amorces
Origine des repas sanguins
Preprono- PNOC (R) TGCCTCA 200 (201).
ciceptin TAAACTC
(PNOC) ACTGAAC
C
PNOC (F) GCATCCT
TGAGTGT
GAAGAG
AA
Cytochrome Cytbvert1D CCATCCA 300 (202)
b (cyt b) (R) ACATYTC (Modifiés)
ADCATGA
Cytbvert2D GCHCCTC
(F) AGAATGA
TATTTGK

Identification des Culicoides

Cytochrome C1-N-2191 CAGGTAA 500 (203)
c oxydase 1 (R) AATTAAA
(COI) ATATAAA
CTTCTGG
C1-J-1718 GGAGGAT
(F) TTGGAAA
TTGATTA
GT

Domain C1’ ACCCGCT 850 (204)

ribosomiaux GAATTTA
(D1 et D2) AGCAT

D2 TCCGTGT
TTCAAGA
CGGG

Electrophorèse sur gel d’agarose

Une électrophorèse sur gel d’agarose à 2% est réalisée systématiquement après les étapes
d’extraction et d’amplification. La visualisation de l’ADN est possible grâce à l’utilisation d’un
produit intercalent, le Safe DNA Gel Stain (SYBR®), qui se loge entre les bases des acides
nucléiques et qui, sous UV, produit une fluorescence. Un marqueur de taille est utilisé pour
connaitre la taille du fragment amplifié.

46
 Séquençage et analyse des séquences

Les amplifiants ont été séquencés directement en double sens à l'aide des amorces utilisées pour
les PCRs. Le séquençage automatisé a été réalisé par la méthode de Sanger au laboratoire de la
société Beckman Coulter Genomics en Grande Bretagne.

Les séquences ont été corrigées manuellement à l’aide des logiciels inclus dans le Staden
package (205). L'alignement des séquences consensus a été réalisé à l’aide de l’algorithme
Clustal W (206) inclus dans l’éditeur de séquences BioEdit v7.2.3 (207) et corrigé
manuellement, les séquences dont les chromatogrammes (sens et antisens) présentaient un bruit
de fond important n’ont pas été analysées et les étapes amplification et séquençage ont été donc
recommencées.

Analyses phénétiques et phylogénétiques

Dans le cadre de l’étude des relations phénétiques et phylogénétiques au sein des Culicoides,
les analyses ont été réalisées à l’aide du logiciel MEGA 6 (208).

Les séquences ont été donc analysées avec une méthode phénétique représentée par le
Neighbor-Joining (NJ), une méthode cladistique représentée par le Maximum de Parcimonie
(MP) et une méthode probabiliste en Maximum de Vraisemblance (ML). L’option «Branch and
Bound» a été utilisée pour les deux dernières méthodes, c’est un algorithme exact qui permet
de trouver l’arbre le plus court.

A l’issue de ces méthodes, des arbres ont été générés. Pour les cladogrammes obtenus par la
méthode de Parcimonie, des indices ont été calculés tels que l’indice de Cohérence «IC» (209)
et de rétention «IR» (210). En effet, le «IC» est une mesure directe de l’homoplasie* tandis que
le «IR» mesure la similarité dans les caractères en terme de synapomorphies**. 12

12
* Etat convergent d'un état de caractère chez deux ou plusieurs espèces éloignées (qui ne sont pas issus d'un ancêtre commun). Un cas
d'homoplasie peut être dû par exemple à un phénomène de convergence évolutive ou de réversion évolutive.
** Les parentés entre les taxons étudiés sont fondées sur les seuls états dérivés, partagés et hérités d’un ancêtre commun.
Chapitre V : Résultats

Les résultats obtenus dans cette thèse sont présentés sous forme de cinq articles : un article
publié (Document I), deux soumis (Documents III et V) et deux en préparation (Document II,
IV).

48
Document I: Wing geometry as a tool for discrimination of Obsoletus group

(Diptera: Ceratopogonidae: Culicoides) in France

L. Hadj Henni a, F. Sauvage b, c, C. Ninio a, J. Depaquit a, D. Augot a

a
Usc-VECPAR, ANSES-LSA, EA 4688, SFR Cap Santé, Université de Reims Champagne-

Ardenne, F-51100 Reims, France

b
Université de Lyon, F-69000 Lyon, France

c
Université Lyon 1, CNRS, UMR5558, Laboratoire de Biométrie et Biologie Evolutive, F

69622 Villeurbanne, France

Publié dans: Journal of Infection Genetics and Evolution 21 (2014) 110–117.

49
Résumé :

En Europe, les espèces appartenant au sous-genre Avaritia et au groupe Obsoletus à savoir

Culicoides chiopterus, C. dewulfi, C. obsoletus et C. scoticus, sont vectrices de la fièvre
catarrhale du mouton et du virus de Schmallenberg. L’identification morphologique de ce
groupe est difficile. Une identification correcte est très importante afin d’évaluer le risque de
transmission. Le développement de nouveaux outils a révolutionné la taxonomie (à savoir,
morphométrie géométrique et biologie moléculaire). Les entomologistes systématiciens
accordent une grande importance à la morphologie de l'aile très particulière des Culicoides.
En se basant sur le caractère « aile », nous analysons dans ce travail, les modèles de
différenciations phénotypiques des espèces précitées en utilisant une double approche :
moléculaire et morphométrie géométrique basée sur des repères appelés « Landmarks », ce sont
les points de jonctions des nervations alaires. La géométrie alaire identifie C. chiopterus et
C. dewulfi. Les analyses montrent aussi que la forme de l’aile de C. scoticus est très variable.
Les résultats des analyses phylogénétiques (Maximum de parcimonie) et les analyses
morphométriques sont congruents. Nous suggérons que le groupe Obsoletus en Europe ne
devrait inclure que C. obsoletus et C. scoticus. Les espèces C. chiopterus et C. dewulfi en sont
clairement exclues. En outre, la concordance entre les clusters phénétiques et les données de la
phylogénie basée sur l’analyse d’un fragment du gène COI de l’ADNmt et le 28S de l’ADNr
suggère que le paramètre « forme d'aile » pourrait constituer une cible importante pour la
discrimination grâce à l’approche basée sur la géométrie alaire.
Ces premiers résultats nous ont encouragés à poursuivre dans cette approche appliquée à
d’autres groupes de Culicoides.
Pour ce travail, nous avons sélectionné des Culicoides collectés entre 2008 et 2011 dans trois
départements Français (tableau 1 du Document I). Les modalités de collecte, de dissection et
de montage, d’extraction, de séquençage et des analyses phylogénétiques sont indiquées dans
le chapitre IV.

Au total, 115 femelles ont été identifiées morphologiquement comme cela été indiqué dans le
chapitre IV, nos spécimens sont répartis comme suit : C. dewulfi n = 21, C. chiopterus n= 5,
C. obsoletus n=58 et C. scoticus n=16.

Pour l’analyse de l’ADNmt du gène COI et pour des raisons techniques, nous avons utilisé une
autre paire d’amorces adaptée aux Culicoides par Augot et al, (2010), il s’agit de l’amorce LepF
(5’-ATT CAA CCA ATC ATA AAG ATA TTG G-3’) et l’amorce LepR (5’-TAA ACT TCT

50
GGA TGT CCA AAA AAT CA-3’). Les conditions d’amplification d’ADN sont les mêmes
que pour les amorces C1-N-2191 et C1-J1718 mentionnées dans le tableau VI du chapitre IV.
Afin de réaliser les analyses par la méthode de Neighbour-Joining (NJ), nous avons inclus des
séquences de Genbank : C. chiopterus (HQ824412), C dewulfi (HQ824416), C. obsoletus
(HQ824371), C. scoticus (HQ824385) et enfin un extra groupe : C. nubeculosus (JQ620128).
Afin de réaliser l’étude morphométriques, nous avons également digitalisé les ailes des
Culicoides montées au préalable dans de la gomme au chloral entre lame et lamelle en utilisant
une caméra numérique reliée au microscope et une lame de calibrage pour l’échelle.
Pour l’étude morphométrique, nous avons effectué une double analyse, nous avons donc
sélectionné dans un premier temps 9 landmarks puis 10 landmarks (les 9 premier puis nous
avons rajouté un dixième point). Le but est de trouver lesquels des points sont plus discriminants
et également pour en profiter évaluer la reproductibilité. Les mesures de landmarks sont
réalisées manuellement par le même opérateur sur chaque aile (gauche et droite quand cela était
possible), à l’aide du logiciel CLIC13. Les analyses statistiques sont réalisées comme indiqué
dans le chapitre IV. Un potentiel effet de l’environnement sur la forme et la taille des ailes est
verifié en analysant de populations de C. obsoletus capturés dans deux régions différentes en
France (Tableau 1 du document I).

Les analyses moléculaires avec le marqueur mitochondrial (COI) fournissent une faible intra-
spécificité et une forte inter-spécificité au sein des quatre espèces qui composent le groupe
Obsoletus. La valeur interspécifique la plus faible est constatée entre C. obsoletus et C. scoticus
(0.133).
Les analyses moléculaires avec le marqueur ribosomique (domaine D1D2 du 28s) fournissent
une faible intra- spécificité (encore plus faible que le marqueur précédent). L’inter-spécificité
est un peu plus forte que l’intra-spécificité au sein des quatre espèces qui composent le groupe
Obsoletus. Ce marqueur est plus conservé que le précèdent, les valeurs de l’inter-spécificité
sont moins importantes. La valeur interspécifique la plus faible est constatée entre C. obsoletus
et C. scoticus (0.010).
L’identification morphologique et les analyses moléculaires et morphométriques sont
congruentes. Les résultats les plus marquants du présent article sont discutés dans le Chapitre
VI de cette thèse.
Mots clés : C. obsoletus, C. scoticus, C. chiopterus, C. dewulfi, géometrie alaire, ADN.

13
Accessible à partir de l’URL (http://bioinfoprod.mpl.ird.fr/morphometrics/clic/index.html)

51
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57
58
 Document II: The relevance of wing geometry in entomological

surveillance of Culicoides, vectors of Bluetongue disease

Leila Hadj-Henni 1, Thibaut De Meulemeester2, Menno Schilthuizen2, Justine Lepoutre1,

Jérôme Depaquit 1, Denis Augot1

1
Usc Vecpar-ANSES LSA, EA4688, Université de Reims Champagne-Ardenne,, 51 rue Cognacq-Jay, 51096
Reims Cedex, France.

2
Naturalis Biodiversity Center, Darwinweg 2, PoBox 9517, 2300RA Leiden, the Netherlands.

(En cours de prépartion)

59
La pertinence de la géométrie alaire pour la surveillance entomologique des
Culicoides vecteurs de la fièvre catarrhale ovine

Résumé

Les Culicoides (Diptera : Ceratopogonidae) du sous-genre Culicoides sont des vecteurs de la

fièvre catarrhale ovine. La connaissance des espèces compétentes est essentielle en
épidémiologie. Actuellement, les clés d’identification sont morphologiques comme la
répartition des tâches alaires, les génitalia ou les différents organes au niveau de la tête. Les
outils moléculaires ont prouvé l’efficacité de certains marqueurs pour la diagnose d’espèces
mais aussi parfois leurs limites. Les techniques morphométriques se sont largement
développées depuis une dizaine d’années notamment avec la géométrie morphométrique.
L’étude utilise des Culicoides issus de collection de Muséum, de photographies d’articles pour
tester la performance de la géométrie alaire afin d’évaluer l’identification d’espèces collectées
in natura. Un total de 235 specimens appartenant à quatre espèces (87 C. lupicaris, 76
C. newsteadi, 41 C. pulicaris and 31 C. punctatus) sont analysés pour la géométrie alaire.
L’étude moléculaire a porté sur 221 specimens (mtDNA COI gene et rDNA 28S). Une
configuration de 14 landmarks a été utilisée. Nos résultats suggèrent que la géométrie des ailes
discrimine les Culicoides du groupe Pulicaris (C. lupicaris, C. pulicaris et C. punctatus) et
C. newsteadi. La pertinence de la géométrie alaire dans la surveillance entomologique des
Culicoides est discutée.
Dans ce travail, les méthodes de traitement d’échantillons, d’analyses morphologiques,
moléculaires, phylogénétique et morphométriques sont comme indiqué au chapitre IV de cette
thèse.
Les Culicoides inclus dans cette étude ont été capturé dans la région Champagne-Ardenne entre
2012 et 2013. Le tableau 1 du Document II fournit plus de détails sur notre échantillonnage.
Afin d’étudier les liens phylogénétiques (avec le marqueur COI de l’ADNmt) au sein de nos
quatre espèces, nous avons inclus des séquences tirées de Genbank, nous avons donc
sélectionné des séquences de C. lupicaris, C. punctatus, C. newsteadi (N1-N5), C. pulicaris
(P1, P2, P3) et C. paradoxalis. Nous avons également choisi un extra groupe C. nubeculosus.

60
Afin de mener l’analyse morphométrique par géométrie alaire, nous avons inclus des photos de
dessins de Delécolle (1985) afin de les comparer avec les photos d’ailes incluses dans notre
étude sur les quatre espèces du sous-genre Culicoides.

Dans le chapitre VI du présent manuscrit de thèse nous argumentons les raisons de notre choix
pour mener cette étude et nous discutons les principaux résultats.

.
Mots clés : Culicoides lupicaris, Culicoides newsteadi, Culicoides pulicaris,

Culicoides punctatus, Culicoides newsteadi, phylogénie, géométrie alaire, France

61
Abstract

Biting midges of the subgenus Culicoides (Diptera: Ceratopogonidae) are biological vectors of
Bluetongue virus. The knowledge of competent species is essential. Actually, identification
keys are morphology based on several items as pattern wings, genitalia or head organs.
Molecular tools develop species diagnostic assays using several genes. Morphometric
techniques underwent a revolution more than one decade ago in particularly with geometric
morphometrics. The present study used museum material, catalogs descriptions and others
publications to test the performance of wing geometry to assess the position of a valid species
collected. A total of 235 specimens belong to four species (87 C. lupicaris, 76 C. newsteadi, 41
C. pulicaris and 31 C. punctatus) are analyzed by wing geometric and 221 specimens by
molecular tools (mtDNA COI gene and rDNA 28S). A configuration of 14 landmarks was used.
The study demonstrated that over 90% of individuals could be separated correctly into species
by their wing. The relevance of wing geometry in entomological surveillance of Culicoides is
discussed.

Keywords: Culicoides lupicaris, Culicoides newsteadi, Culicoides pulicaris, Culicoides

punctatus, Culicoides newsteadi, phylogenetic analysis, wing geometric morphometrics,
France

62
 1. Introduction

Comparing the anatomical features of organisms has been a central element of biology for
centuries. The classification of organisms, and understanding the diversity of biological life,
were both historically based on descriptions of morphological forms. During the early twentieth
century however, biology began the transition from a descriptive field to a quantitative science,
and the analysis of morphology saw a similar ‘quantification revolution’ (Bookstein, 1998).
The development of statistical methods has advanced quantitative rigor. By the mid-twentieth
century, quantitative description of morphological shape was combined with statistical analyses
describing patterns of shape variation within and among groups, and the modern field of
morphometrics began (Adams et al., 2004). Morphometrics underwent a revolution more than
one decade ago. In the modern morphometrics, the estimate of size is now contained in a single
variable reflecting variation in many directions, as many as there are landmarks under study,
and shape is defined as their relative positions after correcting for size, position and orientation
(Dujardin, 2008). It has a neglected area for biting midges until the spread of bluetongue virus
(BTV) in Europe.
Europe harbours ecologically, morphologically and genetically diverse species of Culicoides
(Diptera, Ceratopogonidae), including a number of endemic and cryptic species (Mathieu et
al., 2012; Dik et al., 2014; Slama et al., 2014; Uslu et Dik; 2010). The Culicoides genus includes
1,400 formally recognized species divided among 31 subgenera and 38 species groups
(unplaced to subgenus) (Borkent, 2014). Many of the subgenera are subdivided hierarchically
into nested informal groups of morphologically similar species that are believed to represent
monophyletic lineages based on morphological similarity. The informal groupings proposed by
researchers include Groups, and Complexes, which are unlikely to be phylogenetically
equivalent categories among the various subgenera. BTV has been spread in Europe by
competent Culicoides, with important economic cost, belong to C. dewulfi, C. chiopterus,
Pulicaris complex (C. punctatus and C. pulicaris), Obsoletus complex (C. scoticus and
C. obsoletus) or C. obsoletus group (C. chiopterus, C. dewulfi, C. obsoletus and C. scoticus)
and C. imicola (Sperlova & Zendulkova., 2011)
During the last decades, molecular tools have rapidly and widely been developed by scientists
and brought new insights into taxonomy of vector insects. This new approach helps in
exploring, understanding, and clarifying biodiversity by demonstrating conspecificity of taxa
and/or revealing sibling and cryptic species using genes of ribosomal, mitochondrial and
nuclear DNA (Bellis et al., 2014; Augot et al., 2013; Bakhoum et al., 2013; Wenk et al., 2012;

63
Lassen et al., 2011, Pages et al., 2009; Nolan et al., 2007; Perrin et al., 2006; Gomulski et al.,
2005, 2006; Ritchie et al., 2004; Dallas et al., 2003). Morphological studies included
quantitative data for one or more measurable traits has been developed to clarify Culicoides
systematics by using (i) traditional morphometrics (Pagès et al., 2005, 2009; Augot et al., 2010;
Nielsen & Kristensen, 2011); (ii) geometric morphometrics (Muñoz-Muñoz et al., 2011, Hadj
Henni et al., 2014).
A huge confusion is present into those vector groups i.e. Obsoletus and Pulicaris group, indeed,
recent molecular studies report cryptic species within subgenus Culicoides (Meiswinkel et al.,
2004; Pagès et al., 2009; Muñoz-Muñoz et al., 2011) and subgenus Avaritia (Ander et al., 2012).
Culicoides pulicaris from France (Delécolle, 1985) could be similar to C. pulicaris P3 from
Spain (Pagès et al., 2009). In Newsteadi group (belong to subgenus Culicoides), three species
are moleculary characterized (Pagès et al., 2009). Culicoides species near newsteadi from the
Netherlands differs in wings pattern from C. newsteadi originally described from Palestine
(Meiswinkel et al. 2008) and could be similar to the Culicoides Kalix and Culicoides dk3
specimens found in Scandinavia or to the C. newsteadi N1 and C. newsteadi N2 specimens
identified on the Iberian Peninsula (Pagès et al. 2009). The wing pattern of C. paradoxalis (new
species of subgenus Culicoides) is very imilar to those of C. lupicaris and
C. newsteadi.C. paradoxalis belongs to the same molecular clade to C. punctatus (Ramilo et
al., 2013). The principal entomological questions are: i) among those cryptic Culicoides species,
which are competent vectors and ii) geometric morphometrics groups could be linked to
molecular haplotypes?
In this work, a wing geometric morphometrics is applied to: i) sympatric females species of
Pulicaris group (C. lupicaris, C. pulicaris, C. punctatus ) and C. newsteadi collected in France;
ii) wings from catalogs and original descriptions (Delécolle, 1985; Rawlings,1996 and Mathieu
et al.,2012); iii) wings from other published studies (Pagès et al., 2009; Muñoz-Muñoz et al.,
2011; Ramilo et al., 2012; Ramilo et al., 2013); iv) types specimens of Pulicaris .group and
C. newsteadi were included in our study in order to compare with original species descriptions.
Consequently, a second aim of this study is to evaluate the molecular similarity among the
species of this subgenus to compare the species from Genbank data.

64
2. Materials and methods

2.1. Sampling and identification of biting midges

Adults Culicoides were collected from June 2012 to July 2013 in Vertuelle (49° 06′ 06″ North,
4° 07′ 00″ East) using John W. Hock Company UV traps. 235 specimens (87 C. lupicaris, 76
C. newsteadi, 41 C. pulicaris and 31 C. punctatus) were morphologically identified under a
stereomicroscope using various keys (Campbell and Pelham-Clinton, 1960; Delecolle, 1985;
Mathieu et al., 2012). Detailed informations on the samples used in this study are given in
Table 1. In addition, 17 specimens of C. nubeculous, collected in the same area, were used as
outgroup for geometric morphometrics and molecular studies (Hadj-Henni et al., in
preparation). The head, last abdomen parts and wings of selected individuals were mounted on
slides to enable future geometric morphometric measurements or photographic documentation.
The thorax and the first abdomen of the individual biting midges were then used for DNA
isolation and molecular identification.

2.2. Molecular identification of biting midges

DNA isolated using QIAmp DNA Mini Kit (Qiagen, Germany) according to the manufacturer’s
recommendation. It served as a template in subsequent polymerase chain reactions (PCR),
which were performed according to the method by Augot et al. (2010). Purified PCR products
were shipped to Beckman Coulter (UK) for sequencing. Sequences alignments and
phylogenetic analyses were conducted with BioEdit and mega 5 (Tamura et al., 2011). The
phylogenetic relationships among taxa were resolved using maximum parsimony (MP) method
(using a Branch and Bound search option). The bootstrap probabilities of each node were
calculated using 1000 and 500 replicates to assess the robustness of the NJ and MP methods,
respectively. A Neighbor-Joining (NJ) tree was created to provide a graphic visualization of
clustering group among different species. The best model for NJ analysis, according to MEGA
5 was GTR+I+G (Saitou and Nei, 1987). Phylogenetic analyses were performed using
haplotypes obtained in this study (Table 1) and sequences obtained in Genbank for COI
sequences: C. lupicaris CQ338906 (Spain); C. lupicaris KF591648 (Czeck Republic);
C. lupicaris JQ620107 (Sweden) C. lupicaris JQ620103 (Sweden); C. newsteadi N1
CQ338915 (Spain); C. newsteadi N2 CQ338919 (Spain); C. newsteadi N3 JQ620112
(Sweden); C. newsteadi N4 JQ620124 (Sweden); C. newsteadi N5 JQ620126 (Sweden);
C. newsteadi AM236741 (Italy); C. paradoxalis KF591667 (Portugal), C. paradoxalis
KF591622 (France); C. pulicaris P3 CQ338911 (Spain); C. pulicaris P1 CQ338914 (Spain);

65
C. pulicaris KF591632 (France); C. pulicaris JQ620178 (Sweden); C. pulicaris JN657067
(Switzerland-larval); C. pulicaris KF591650 (Czeck Republic); C. pulicaris KF591653 (UK);
C. pulicaris KF591655 (UK); C. punctatus KF591612 (France); C. punctatus JQ620188
(Sweden); C. pulicaris JF766321-Dk1 (Sweden); C. pulicaris JF766346-Dk1 (Sweden), C.
pulicaris JF766296-Dk1 (Sweden); C. pulicaris JF766295-Dk1 (Sweden); C. pulicaris
JF766294-Dk1 (Sweden); C. pulicaris JF766293-Dk1 (Sweden); C. newsteadi JF766329-Kalix
(Sweden); C. newsteadi JF766330-Kalix (Sweden); C. newsteadi JF766324-Dk3 (Sweden); C.
newsteadi JF766320-Dk3 (Sweden) and C. nubeculosus KF178273 (France). C. nubeculosus
was selected as an aoutgroup according to Ander et al. (2012). Finally, D1D2 sequence of
C. nubeculosus (KF826483) is added in our analysis.
2.3. Geometric morphometric analysis

Where possible, the right and left wings of all IIIIIIIIIIIII specimens were photographed using
Zeiss V20 microscope coupled with a Sony DSC camera. Among the YYYYY wings, OOOO
were suitable for morphometrics analyses (accounting for OOOO wings of C. lupicaris, OOO
wings of C. pulicaris, OOOO wings of C. punctatus, OOOO wings of C. newsteadi and
OOOOC. nubeculosus). Additionally wings C. lupicaris, C. pulicaris, C. punctatus
C. newsteadi from catalogs and published studies (Delécolle, 1985; Rawlings, 1996; Pagès et
al., 2009; Muñoz-Muñoz et al., 2011; Mathieu et al., 2012; Ramilo et al., 2012; Ramilo et al.,
2013) were included in our study. Type specimens of C. lupicaris Downes et Kettle, 1952
(Type-locality: Glasgow, Lanarkshire –Great Britain), C. pulicaris Linné, 1758 (Type-locality:
Europe), C. punctatus Meigen, 1804 (Type-locality: Aachen, - Germany) and C. newsteadi
Austen, 1921 (Type-locality: Jerished –Israel) were included as reference specimens (Remm,
1988).C. deltus Edwards, 1939 is considered as a synonym of C. lupicaris Downes et Kettle,
1952 (Borkent, 2008) but a molecular study showed C. deltus as a valid species (Meiswinkel et
al., 2004). So in our study, C. deltus from type specimen and catalogs (Delécolle, 1985, Mathieu
et al., 2012) have be added.

The taxonomical status of the four species was confirmed by genotyping of mtCOI and D1D2
genes. Photographs and drawings were input to tps-UTILS 1.6 (Rohlf 2013a) and wing shape
was captured by digitizing two-dimensional Cartesian coordinates of 14 landmarks (Fig. 1) on
right and symmetrized-left wings with tps-DIG v2.17 (Rohlf 2013b).

The landmark configurations were scaled, translated and rotated against the consensus
configuration using the GLS Procrustes superimposition method to remove all non-shape

66
differences and to separate the size and shape components of the form (Rohlf and Slice 1990;
Bookstein, 1991). The superimposition was performed using R functions of the package
geomorph (Adams and Otárola-Castillo, 2013).

The aligned landmark configurations were projected into the Euclidean space tangent to the
curved Kendall’s shape space to aid further statistical analyses. The correlation coefficient
between the Procrustes distances in the shape space and the Euclidean distances in the tangent
space was close to 1 (0.9999). This means that the linear tangent space closely approximates
the curved shape space, thereby permitting us to be confident in the variation amplitude of our
dataset (Rohlf, 1999). The least-squares regression slope and the correlation coefficient
between the two distances were calculated with tps-SMALL v1.25 (Rohlf, 2013c).

Specimens were grouped a priori based on CLG composition. Following the molecular results,
five groups were identified: C. lupicaris, C. newsteadi, C. pulicaris-PU, C. pulicaris-P1 and
C. punctatus. We performed a homogeneity test to assess whether the a priori groups were
comprised of one or several morphologically distinct taxa. We used a pattern-recognition
technique based on kernel density estimates (KDE) (Parzen, 1962; Greblicki & Pawlak, 2008)
and a model-based unsupervised clustering procedure (Mclust) (Fraley & Raftery, 2002). Five
subdataset were computed, corresponding to the five chemical groups. A Procrustes
superimposition and a principal component analysis (RWA) were calculated for each
subdataset. Bi-dimensional KDE was performed on the projection of the specimens onto the
two first PC axes, which represent the global shape variation.

Following the results of the homogeneity tests, we identified five groups, corresponding to five
known species. Significance of shape differences among groups was tested using an analysis of
variance (pair-wise MANOVA Goodalls F-test; Zelditch et al., 2004). Shape variation was also
assessed by a relative warps analysis (RWA), which is actually a PCA based on the
superimposed landmark coordinates (Alibert et al., 2001). As group discrimination in the shape
space of the PCA (RWA) was insufficiently robust and did not reflect the shape differences
shown in the pair-wise MANOVA, we then used a linear discriminant analysis (LDA). The
effectiveness of discriminant analysis for separating groups was tested by an assignment
procedure based on Mahalanobis distances in the LDA space. Using their scores in the
discriminant space, each specimen was assigned to the group for which the centroid was nearest.
The performance of this assignment procedure was assessed by the rate of correct assignments
judged using a Jack-knife (leave-one-out) procedure. Phenetic relationships among groups were

67
assessed using cluster analysis. Because pair-wise MANOVA showed significant wing shape
differences among groups, we used the scores in the discriminant space of the centroid of each
group to perform an unrooted neighbour-joining clustering.According to the results of the
homogeneity tests, the group including C. pulicaris P1 and C. pulicaris PU (on the basis of the
GC/FID chromatograms) was found to be non-homogenous, suggesting the presence of two
morphologically distinct taxa.

3. Results

3.1. Molecular analyses

DNA barcodes of mtDNA COI (n=221) or rDNA 28S gene region were obtained from 235
females Culicoides specimens (Table 1). Sequences obtained are available in GenBank under
Accession Nos.xxxx (Table 1). Sequence alignments were 331 bp, with 236 sequences, for the
COI and 608 bp, with 130 sequences, for 28S including gaps. Both COI and D1D2, 14
specimens were disagreement with the morphological identification (Table 1) and they are
deleted on molecular and morphometric analysis.
Both ML and NJ COI trees showed the same topology (data not shown). Our molecular analysis
(Fig2), with COI, generated 7 supported clusters (boostrap values> 99). A total of 14
specimen’s disagreement with the morphological identification (Table 1) and they are deleted
from the analysis.
COI sequences for specimens of C. pulicaris were separated into two distinct clusters designed
C. pulicaris PU and C. pulicaris P1. DNA sequences showed that C. newsteadi specimens were
split into six subclusters representing C. newsteadi-AM236741 , C. newsteadi N1, C. newsteadi
N2, C. newsteadi N3, C. newsteadi N4 and C. newsteadi N5 (including our sample). Our
specimens of Culicoides punctatus clustered together with sequences in Genbank.
The specimen of C. pulicaris KF591632 (France) is included with C. lupicaris clade.
Low intraspecific divergences with COI sequences have been observed: C. newsteadi N5
(0.005); C. pulicaris P1 (0.0038); C. pulicaris PU (0.008); C. punctatus (0.001); C. lupicaris
(0.0).
Interspecific K2P values for different species and taxa (Table 2) ranged from 0.228 (between
C.lupicaris and C. newsteadi N1; C. lupicaris and C. lupicaris-GQ338911) to 0.08 (between
C.newsteadi-N5 and C. newsteadi-JQ620124).
Low intraspecific divergences with D1D2 sequences have been observed: C. newsteadi (0.00);
C. pulicaris P1 (0.00); C. pulicaris PU (0.00); C. punctatus (0.00); C. lupicaris (0.00). Both

68
ML and NJ D1D2 trees showed the same topology (data not shown). D1D2 sequences for
specimens morphologically identified as C. pulicaris were separated into two distinct clusters
designed C. pulicaris PU and C. pulicaris P1 according to COI sequences.
Interspecific K2P values for different species and taxa (Table 2) ranged from 0.050 (between
C.pulicaris-P1 and C. nubeculosus; C. punctatus and C. nubeculosus) to 0.006 (between
C. lupicaris and C. pulicaris-P1).

3.2. Geometric morphometric analysis

3.2 .1.Validation of shape discrimination

The four groups defined in our molecular analyses (C. lupicaris, C. pulicaris-PU, C. pulicaris-
P1, C. punctatus, C.newsteadi) are separated in the between-group PCA with almost any
overlap between groups (Fig3). The axes of the bgPCA explain 30.53 % of the total variance
(respectively 18.64%; 11.89%). In the morphometric space defined by the bgPCA, the reference
wings from Delécolle (1985), C. lupicaris and C. pulicaris, are not clustered with their
respective species (Fig4B) confirming the difficulty to species delimitation based on wing
shape. The three groups are well separated from each other in the LDA. At specimen level, a
total supported identification is given for 144 of the 223 specimens with 14 mistakes. 50 of 55
specimens of C. lupicaris, 11 of the 12 specimens of the C. pulicaris-PU, 47 of 50 specimens
of C. newsteadi and 4 of 6 wings of C. punctatus have a well-supported identification and are
assigned to the correct species (Table 3). The LDA of wing shape appears to be a clear and
accurate method for discrimination between Culicoides close species.

As observed in the bgPCA, the four reference wings from Delécolle (1985) are assigned to their
respective species (Table 2) ranging to 0.411 to 0.913 confirming the species delimitation based
on wing shape is not clearly defined.

3.2.2. Species delimitation

The three species defined for species delimitation analyses (i.e. C. lupicaris, C. newsteadi,
C. pulicaris-PU, C. pulicaris-P1 and C. punctatus) are separated in the between-group PCA,
even though clear overlap is observed between C. lupicaris, C. pulicaris-P1 and C.pulicaris-
PU (Fig3). The axes of the bgPCA explain 30.53% of the total variance. In the morphometric
space defined by the bgPCA, C. lupicaris and C. pulicaris reference wings from Delécolle
(1985) are clustered together (Fig4). C. lupicaris and C. newsteadi are also well separated from

69
each other in the LDA (Table 3). C. lupicaris, C. pulicaris-P1 and C. pulicaris-PU are not well
separated from each other in LDA (Table 3). At specimen level, a well-supported identification
is given for 88 of the 96 specimens, accounting for a global HR of 92% (Table 4). All
C. pulicaris-PU, 3 of the 8 specimens of C. pulicaris-P1 and 68 of the 71 specimens of
C. lupicaris are assigned to the correct species (Table 4).

As observed in the bgPCA, C. pulicaris reference wing from Delécolle (1985) is assigned to
C. pulicaris-P1 (Table 3). However, both C.pulicaris and C. lupicaris reference wings are
clustered with C. lupicaris and C.pulicaris-P1 specimens even though the assignment of the
C.pulicaris and C.lupicaris reference wings show non-supported posterior probabilities of
assignment.

4. Discussion

The results presented here for Culicoides reveal that both COI and D1D2 sequences data can
be used as a tool to identify unambiguously different species of the subgenus Culicoides,
showing a pattern of low intra-specific variation and high inter-specific variation, even when
cryptic species are present. Taking together the morphology data and the molecular biology
results, we have been able to detect 14 different specimens correctly (Table 1) because high
intraspecific variation on wing pattern.
The phylogenetic tree using the COI marker shows a tree approximately similar to Muñoz-
Muñoz et al., (2012). The disparities are due to missing sequences. The comparison is more
complex with the others primers – not considered as the gold standard. We used museum
material, catalogs descriptions and others publications to test the performance of wing geometry
to assess the position of a valid species collected. Geometric morphometric approach of wing
variation among species of the subgenus Culicoides indicated that significant differences exist
in the two components of form, namely, size and shape. In our study, the discriminant analysis
performed with all the species of the subgenus Culicoides allowed the correct classification of
almost 90% of specimens as reported by Muñoz-Muñoz et al. (2011) for subgenus Culicoides
and (Hadj Henni et al., 2014) for subgenus Avaritia and ranging 84.1% to 100% for Muñoz-
Muñoz et al. (2014). By introduction on wings reference, we detect that C. pulicaris (Délecolle,
1985) belongs to C. pulicaris-P1. Our study shows two populations of C. pulicaris
(C. pulicaris-P1 and C. pulicaris) by molecular and geometric tools. The species status of C.
pulicaris-PU is posed: a new species (as C. paradoxalis) or genetic variations of Culicoides
dk1 (= C. boyi?, Nieslen et al., 2011) ? A high percentage of specimens could be assigned

70
correctly to species according to wing (92%). But a high number specimens are not classified
indicating a high degree of homoplasy in wing shape of Culicoides (see Muñoz-Muñoz et al. ,
2011; 2014). The challenge now is to develop statistic tools in order to define a threshold by
cryptic species and/or population species.
Our study demonstrated the relevance of include wings collected in inventories studies. In
Europe, actually, the morphological identification of Culicoides was based on dichotomous
keys (Campbell and Pelham-Clinton 1960; Delécolle, 1985; Rawlings, 1996; Mathieu et al.
2012) or photographs (Mathieu et al. 2012) with helping by two international expert
taxonomists (Garros et al., 2014). Based on morphological, the Culicoides diversity was
presented in species or complex or group according to the studies objectives or for convenience
(see for example Becker et al., 2013; Del Rio et al., 2013; Venail et al., 2012; Mehlhorn et al.,
2009). Several molecular tools have been developed to identify Culicoides species and the
conclusions of team of the European MedReoNet project are “we emphasize the importance of
molecular identification assays, we stress that there remains an urgent need to sustain traditional
taxonomy based on morphology. Morphological identification expertise for arthropods of
medical importance needs to be maintained to strengthen the systematics and taxonomy of these
groups while new molecular tools are required to process large scale surveillance specimens
across countries” (Garros et al., 2014).The morphological identification is more reaction time
speed and more low cost/ specimen versus molecular tools but with specificity more low
(Deblauwe et al., 2012). Our study shows that the geometric morphometrics of the wing is a
tool to discriminate between species and cryptic species or population (C. pulicaris-P1 and
C. pulicaris-PU) of the genus Culicoides as reported by Pagès et al. (2009) for subgenus
Culicoides; Muñoz-Muñoz et al. ( 2011) and Hadj Henni et al. (2014) for subgenus Avaritia
and Hadj-Henni et al., in preparation for C. brunnicans, C. clastrieri, C. festivipennis,
C. furens, C. nubeculosus, C. pictipennis, C. santonicus and C. vexans. By introduction of
reference slides with an appropriate mathematic tool, we can exactly characterize a specimen.
The potential of morphometrics and multivariate statistics applied to medical entomology has
been highlighted (Dujardin 2008). The entomological surveillance networks could utilize the
geometric morphometrics of the wing with the creating a free access bank of reference images
(Muñoz-Muñoz et al., 2011; Hadj Henni et al., 2014). However, the reference wing species
must be based on valid species including type specimens e and molecular studies showing the
intra and inter specificity. For virus research, the wing geometry could help to create uniform
pools of Culicoides thus avoiding errors on atypical specimens. During the last decade, the
entomological monitoring programs report an increasing Culicoides fauna in several European

71
countries (Venail et al., 2012; Ramilo et al., 2012; Casati et al., 2009; Patakakis et al., 2009;
Fassotte et al., 2008). Then, species determination is more complex because the scientific must
include inside his country dichotomous key of the others species present in Europe. We propose
the abolition of determination key by country and we prefer develop a reference wing database.

Acknowledgments
This work is funded by the CPER project ‘‘Culichamp’’ and by ANSES. The authors thank
Sylvette Gobert for proofreading this manuscript.

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77
Figure 1. Female wing of C.pulicaris (drawing of Delécolle, 1985). Location of 14 landmarks
used in the morphometrical analysis of C.lupicaris, C.newsteadi, C.pulicaris, C.punctatus.

78
Figure 2. Trees obtained from nucleotide analysis of: (a) COI (with NJ method); (b) 28S rDNA (with NJ method) sequences of the C. lupicaris,
C. newsteadi, C. pulicaris and C. punctatus (boostrap values are shown in nodes with1000 replicates).

A B

99
Culicoides lupicaris
84
C. lupicaris
70 82

64
Culicoides Dk1 50 C. pulicaris-P1
7 99 88
Culicoides-PU
54
Culicoides newsteadi-N3-JQ620112-Sweden C. pulicaris-PU
19 86
Culicoides newsteadi-N2-GQ338919-Spain
L78
11 Culicoides pulicaris-GQ338911
3
L56
Culicoides pulicaris-GQ338914
68 D981
99 Culicoides pulicaris-P1
10 52 L69
Culicoides newsteadi-AM236741-Italy
D973
99
Culicoides newsteadi-Kalix
D974
D971
84
13 L74
Culicoides newsteadi-dk3-N5
98 D980
D977 C. newsteadi
99 95 L81
Culicoides paradoxalis
99 D979
Culicoides lupicaris-Sweden
60
D975
32
Culicoides punctatus D972
99
D983
Culicoides newsteadi-N1-GQ338915 L104
Culicoides nubeculosus- KF178273
D986
D984
0.02
D976
4 C. punctatus
64
C. nubeculosus-KF82648

0.005
Fig. 3 Ordination of between-group PCA on C. lupicaris, C. newsteadi, C. pulicaris-PU,
C. pulicaris-P1 and C. punctatus defined after biomolecular analyses. The three axes of the
bgPCA explain 30.53 % of the total variance (respectively 21.1%; 8.89%). Group means are
represented by stars. A) The three species (A) and the reference (B) wings (Delécolle, 1985)
were projected a posteriori in the computed bgPCA

80
A B

Fig. 4 Ordination of between-group PCA on C. pulicaris-PU, C. pulicaris-P1 and C. lupicaris

defined after biomolecular analyses. The axes of the bgPCA explain 30 % of the total variance
(respectively 21.1%; 8.89%). Group means are represented by stars. A) The three species (A)
and the reference (B) wings (Delécolle, 1985) were projected a posteriori in the computed
bgPCA.

81
Table 1. Female specimens and associated groups of Culicoides lupicaris, C. newsteadi,
C. pulicaris, and C. punctatus collected in the Region of Ardenne (France).

Molecular analysis Genbank accession

Specimens Morphological number
no. Identification
COI D1D2 Species name if different of COI D1D2
Species morphological identification
(COI/D1D2)
A4 C. lupicaris
D701 C. lupicaris Yes -
D702 C. lupicaris Yes -
D703 C. lupicaris Yes -
D704 C. lupicaris Yes -
D705 C. lupicaris Yes -
D781 C. lupicaris Yes -
D789 C. lupicaris Yes -
D791 C. lupicaris Yes -
D794 C. lupicaris Yes -
D795 C. lupicaris Yes -
D796 C. lupicaris Yes -
D797 C. lupicaris Yes -
D798 C. lupicaris Yes Yes
D799 C. lupicaris Yes Yes
D800 C. lupicaris Yes -
D805 C. lupicaris Yes Yes
D807 C. lupicaris Yes -
D809 C. lupicaris Yes -
D810 C. lupicaris Yes -
D811 C. lupicaris Yes Yes
D812 C. lupicaris Yes -
D813 C. lupicaris Yes -
D817 C. lupicaris Yes Yes
D818 C. lupicaris Yes -
D821 C. lupicaris Yes -
D822 C. lupicaris Yes -
D823 C. lupicaris Yes -
D826 C. lupicaris Yes -
D830 C. lupicaris Yes -
D835 C. lupicaris Yes -
D836 C. lupicaris Yes -
D838 C. lupicaris Yes -
D843 C. lupicaris Yes -
D862 C. lupicaris Yes -
D871 C. lupicaris Yes -
D872 C. lupicaris Yes -
D893 C. lupicaris Yes -
D895 C. lupicaris Yes -
D929 C. lupicaris - Yes
D965 C. lupicaris Yes Yes
D966 C. lupicaris Yes Yes
D970 C. lupicaris Yes Yes
D985 C. lupicaris - Yes
L10 C. lupicaris Yes Yes
L101 C. lupicaris Yes Yes
L102 C. lupicaris Yes Yes
L103 C. lupicaris Yes Yes

82
L11 C. lupicaris Yes Yes
L15 C. lupicaris Yes Yes
L16 C. lupicaris Yes -
L17 C. lupicaris Yes Yes
L18 C. lupicaris Yes Yes
Z8 C. lupicaris Yes -
L13 C. lupicaris - Yes
L106 C. lupicaris - Yes
L107 C. lupicaris - Yes
L108 C. lupicaris - Yes
L109 C. lupicaris - Yes
L110 C. lupicaris - Yes
L36 C. lupicaris Yes -
L20 C. lupicaris Yes Yes
L21 C. lupicaris Yes Yes
L22 C. lupicaris Yes -
L23 C. lupicaris Yes Yes
L24 C. lupicaris Yes Yes
L25 C. lupicaris Yes Yes
L26 C. lupicaris Yes Yes
L27 C. lupicaris Yes Yes
L28 C. lupicaris Yes Yes
L3 C. lupicaris Yes Yes
L4 C. lupicaris Yes Yes
L5 C. lupicaris Yes Yes
L6 C. lupicaris Yes Yes
L60 C. lupicaris Yes -
L62 C. lupicaris Yes Yes
L63 C. lupicaris Yes -
L65 C. lupicaris Yes Yes
L66 C. lupicaris Yes Yes
L7 C. lupicaris Yes Yes
L73 C. lupicaris Yes Yes
L8 C. lupicaris Yes Yes
L83 C. lupicaris Yes Yes
L9 C. lupicaris Yes Yes
L95 C. lupicaris Yes Yes C. lupicaris/C. punctatus
L96 C. lupicaris Yes Yes
L97 C. lupicaris Yes Yes
Z5 C. lupicaris Yes Yes C. lupicaris/C. punctatus
A102 C. newsteadi Yes -
A105 C. newsteadi Yes -
A125 C. newsteadi Yes -
A134 C. newsteadi Yes -
A135 C. newsteadi Yes -
A136 C. newsteadi Yes -
A141 C. newsteadi Yes -
A161 C. newsteadi Yes -
A30 C. newsteadi Yes -
A51 C. newsteadi Yes -
A55 C. newsteadi Yes -
A69 C. newsteadi Yes -
A73 C. newsteadi Yes -
A76 C. newsteadi Yes -
A78 C. newsteadi Yes -
A79 C. newsteadi Yes -
A81 C. newsteadi Yes -
A85 C. newsteadi Yes -

83
A90 C. newsteadi Yes -
A97 C. newsteadi Yes -
D875 C. newsteadi Yes -
D876 C. newsteadi Yes -
D888 C. newsteadi Yes -
D988 C. newsteadi Yes -
D989 C. newsteadi Yes -
L368 C. newsteadi Yes -
L104 C. newsteadi Yes Yes
L402 C. newsteadi Yes -
D842 C. newsteadi - Yes
D860 C. newsteadi - Yes
D971 C. newsteadi - Yes
D972 C. newsteadi - Yes
D973 C. newsteadi - Yes
D974 C. newsteadi - Yes
D975 C. newsteadi - Yes
D976 C. newsteadi - Yes
D977 C. newsteadi - Yes
D979 C. newsteadi - Yes
D980 C. newsteadi - Yes
D981 C. newsteadi - Yes
D983 C. newsteadi - Yes
D984 C. newsteadi - Yes
D986 C. newsteadi - Yes
L341 C. newsteadi Yes -
L382 C. newsteadi Yes -
L383 C. newsteadi Yes -
L385 C. newsteadi Yes -
L386 C. newsteadi Yes -
L388 C. newsteadi Yes -
L390 C. newsteadi Yes -
L392 C. newsteadi Yes -
L395 C. newsteadi Yes -
L396 C. newsteadi Yes -
L399 C. newsteadi Yes -
L69 C. newsteadi Yes Yes
D978 C. newsteadi Yes -
L56 C. newsteadi - Yes
L59 C. newsteadi Yes
L67 C. newsteadi Yes C. newsteadi/C. lupicaris
L70 C. newsteadi Yes C. newsteadi/C. lupicaris
71 C. newsteadi Yes
L72 C. newsteadi Yes
L74 C. newsteadi Yes
L75 C. newsteadi Yes
L76 C. newsteadi Yes
L77 C. newsteadi Yes C. newsteadi/C. punctatus
L78 C. newsteadi Yes
L80 C. newsteadi Yes C. newsteadi/C. lupicaris
L81 C. newsteadi Yes
L85 C. newsteadi Yes
L86 C. newsteadi Yes C. newsteadi/C.punctatus
L89 C. newsteadi Yes
L91 C. newsteadi Yes
L92 C. newsteadi Yes
L99 C. newsteadi Yes
D969 C. newsteadi Yes

84
D894 C. pulicaris Yes Yes C. pulicaris P1
D925 C. pulicaris - Yes C. pulicaris P1
D967 C. pulicaris Yes Yes C. pulicaris P1
L12 C. pulicaris Yes Yes C. pulicaris P1
L29 C. pulicaris Yes - C. pulicaris P1
L39 C. pulicaris Yes Yes C. pulicaris P1
L41 C. pulicaris Yes Yes C. pulicaris P1
L42 C. pulicaris Yes Yes C. pulicaris P1
L43 C. pulicaris Yes Yes C. pulicaris P1
H72 C. pulicaris Yes Yes C. pulicaris P1
H73 C. pulicaris Yes Yes C. pulicaris P1
L111 C. pulicaris - Yes C. pulicaris P1
L112 C. pulicaris - Yes C. pulicaris P1
L113 C. pulicaris - Yes C. pulicaris P1
L114 C. pulicaris - Yes C. pulicaris P1
L115 C. pulicaris - Yes C. pulicaris P1
L31 C. pulicaris Yes C. lupicaris/
L98 C. pulicaris Yes C. pulicaris P1/C. lupicaris
D803 C. pulicaris Yes Yes C. pulicaris PU
D854 C. pulicaris Yes Yes C. pulicaris PU
D861 C. pulicaris Yes Yes C. pulicaris PU
D868 C. pulicaris Yes Yes C. pulicaris PU
D869 C. pulicaris Yes Yes C. pulicaris PU
D873 C. pulicaris Yes Yes C. pulicaris PU
D878 C. pulicaris Yes Yes C. pulicaris PU
D879 C. pulicaris Yes Yes C. pulicaris PU
D880 C. pulicaris Yes Yes C. pulicaris PU
D881 C. pulicaris Yes Yes C. pulicaris PU
D884 C. pulicaris Yes Yes C. pulicaris PU
D887 C. pulicaris Yes - C. pulicaris PU
D907 C. pulicaris - Yes C. pulicaris PU
D914 C. pulicaris - Yes C. pulicaris PU
D920 C. pulicaris - Yes C. pulicaris PU
D927 C. pulicaris - Yes C. pulicaris PU
D928 C. pulicaris - Yes C. pulicaris PU
D962 C. pulicaris Yes Yes C. pulicaris PU
D963 C. pulicaris Yes Yes C. pulicaris PU
D968 C. pulicaris - Yes C. pulicaris PU
D982 C. pulicaris - Yes C. pulicaris PU
D987 C. pulicaris - Yes C. pulicaris PU
L19 C. pulicaris Yes Yes C. pulicaris PU
A101 C. punctatus Yes -
A119 C. punctatus Yes -
A133 C. punctatus Yes -
A138 C. punctatus Yes -
A28 C. punctatus Yes -
A77 C. punctatus Yes -
A99 C. punctatus Yes -
D707 C. punctatus Yes -
D708 C. punctatus Yes -
D801 C. punctatus Yes -
D814 C. punctatus Yes -
D841 C. punctatus Yes -
L364 C. punctatus Yes -
L32 C. punctatus Yes -
L33 C. punctatus Yes Yes
L34 C. punctatus Yes Yes

85
L35 C. punctatus Yes -
L37 C. punctatus Yes C.punctatus/ C.lupicaris
L38 C. punctatus Yes C.punctatus/C. pulicaris P1
L40 C. punctatus Yes Yes
L44 C. punctatus Yes Yes
L61 C. punctatus Yes Yes
L64 C. punctatus Yes Yes
L68 C. punctatus Yes C.punctatus/C. lupicaris
L79 C. punctatus Yes C.punctatus/C. lupicaris
L82 C. punctatus Yes Yes
L84 C. punctatus Yes Yes
L87 C. punctatus Yes C.punctatus/C. lupicaris
L88 C. punctatus Yes C.punctatus/C. lupicaris
L90 C. punctatus Yes Yes
L93 C. punctatus Yes -

86
 Table 2. Pairwise distances between Pulicaris group, C. newsteadi and outgroup (Genbank) based on COI (a) and D1D2 sequences (b). The groups
were formed according to the trees based on COI and D1D2 sequences.

mtDNA haplotypes 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
1 C. paradoxalis
2 Culicoides Kalix 0.191
3 C. newsteadi-N1 0.217 0.220
4 C. pulicaris-P1 0.225 0.176 0.220
5 C. pulicaris CQ338911 0.204 0.170 0.219 0.127
6 C. lupicaris 0.177 0.172 0.226 0.175 0.184
7 C. newsteadi- 0.176 0.158 0.184 0.190 0.204 0.166
AM236741
8 C. newsteadi-N3 0.219 0.171 0.234 0.164 0.228 0.192 0.177
9 C. newsteadi-N2 0.197 0.158 0.184 0.163 0.191 0.164 0.170 0.171
10 C. lupicaris-Sweden 0.145 0.164 0.219 0.215 0.184 0.210 0.199 0.191 0.207
11 C. punctatus 0.138 0.158 0.191 0.190 0.157 0.212 0.190 0.256 0.198 0.134
12 C. newsteadi-N5 0.217 0.079 0.198 0.170 0.196 0.172 0.152 0.186 0.185 0.183 0.168
13 C. nubeculosus 0.177 0.163 0.211 0.198 0.205 0.217 0.210 0.247 0.210 0.225 0.183 0.151
14 C. pulicaris-PU 0.184 0.181 0.192 0.201 0.221 0.131 0.163 0.203 0.224 0.175 0.184 0.194 0.188
15 Culicoides dk1 0.183 0.163 0.184 0.176 0.227 0.120 0.145 0.184 0.210 0.168 0.183 0.164 0.170 0.024
16 Culicoides dk3 0.225 0.078 0.184 0.182 0.190 0.171 0.151 0.184 0.191 0.177 0.177 0.013 0.163 0.194 0.163

rDNA haplotypes 1 2 3 4 5
1 C. lupicaris
2 C. pulicaris-PU 0.010
3 C. pulicaris-P1 0.006 0.010
4 C. punctatus 0.014 0.012 0.016
5 C. newsteadi 0.012 0.010 0.014 0.002
6 C. nubeculosus 0.048 0.046 0.050 0.050 0.048

87
 Table 3. Specimen identification based on the leave-one-out cross-validation procedure in the
LDA.

lup pulP1 pulPU newst punct NA HR%

C. lupicaris 50 2 3 32 96
C. pulicaris-P1 5 13 0
C.pulicaris-PU 11 1 7 91
C. newsteadi 2 1 47 26 94
C. punctatus 1 1 4 17 67
C. lupicaris (Delécolle, 1985) 0.411 0.588 0.00 0.001 0.000
C. newsteadi (Delécolle, 1985) 0.000 0.000 0.488 0.458 0.054
C. pulicaris (Delécolle, 1985) 0.0083 0.679 0.000 0.237 0.000
C. punctatus (Delécolle, 1985) 0.029 0.001 0.004 0.054 0.913

Original groups are along the rows, predicted groups along the columns. Assignment of the four reference wings
(Delécolle, 1985). Posterior probabilities of assignment of the reference wing from Delécolle (1985) are given for
each group. Lup, pulP1, pulPU, newst, punct; NA: dubious species identification

88
 Table 4. Specimen identification based on the leave-one-out cross-validation procedure in the
LDA.

lup pulP1 pulPU NA HR %

C. lupicaris 68 3 16 96
C. pulicaris-P1 5 3 10 60
C. pulicaris-PU 17 2 100
C. lupicaris (Delécolle, 1985) 0.368 0.632 0.000
C. pulicaris (Delécolle, 1985) 0.092 0.908 0.000

Original groups are along the rows, predicted groups along the columns. Assignment of the two reference wings
(Delécolle, 1985). Posterior probabilities of assignment of the reference wing from Delécolle (1985) are given for
each group. C. lupicaris, C. pulicaris-P1 and C. pulicaris-PU, NA: dubious species identification

89
Document III: Complex pattern of phenotypic plasticity in the genus

Culicoides: molecular evidence and taxonomic problem

Hadj-Henni L.1, De Meulemeester T.2, Schilthuizen M.2, Noel P.1, Helder R.3, Depaquit J.1,
Augot D.1

1Usc Vecpar-ANSES LSA, EA4688, UFR Cap Santé, Université de Reims Champagne-
Ardenne, 51 rue Cognacq-Jay, 51096 Reims Cedex, France.
2 Naturalis Biodiversity Center, Darwinweg 2, PoBox 9517, 2300RA Leiden, the Netherlands
3Université de Reims Champagne-Ardenne, EA 4689 Unité Interactions Animal-
Environnement, Moulin de la Housse, B.P. 1039, 51687 Reims, France; Université de Reims
Champagne-Ardenne, CERFE, 08240 Boult-aux-bois, France.

(Soumis pour publication Chez Plos One)

90
Plasticité phénotypique chez les Culicoides : évidence moléculaire et problèmes
taxonomiques

Les Culicoides sont très répandus dans le Monde et jouent un rôle essentiel dans
l’épidémiologie de plus d’une centaine de maladies vétérinaires. Pour les taxonomistes,
l’identification correcte des espèces est difficile à cause de la présence d’espèces jumelles et de
complexes d’espèces. Culicoides clastrieri se distingue de Culicoides festivipennis sur la base
de critères morphologiques comme les ailes, la distribution des sensilles et le nombre d’épines
cibariales. Toutefois, les motifs alaires sont connus pour présenter un niveau élevé de variation
intraspécifique. Pour déterminer si C. clastrieri est distinct de C. festivipennis, nous avons
effectué des analyses moléculaires sur deux gènes (COI of mtDNA et D1D2 of rDNA) et une
approche de géométrie morphométrique à partir de spécimens collectés dans le Nord de la
France, identifiés comme C. clastrieri et C. festivipennis sur la base des motifs alaires. Les
résultats montrent une incongruence entre l’identification morphologique classique, la
morphométrie géométrie alaire et les données de la biologie moléculaire. L’analyse de la
géométrie alaire montre que les lames de référence (dessins de Delécolle, 1985) de C. clastrieri
et C. festivipennis sont groupés avec nos spécimens de C. clastrieri. L’analyse moléculaire
montre une homologie des spécimens de ces deux espèces. Par conséquent, C. clastrieri n’est
qu’un variant morphologique que nous considérons comme un synonyme de C. festivipennis.
Afin de tenir compte de la plasticité phénotypique, nous proposons de retenir la nomenclature
suivante : C. festivipennis morphe festivipennis et C. festivipennis morphe clastrieri.

Dans cette étude, nous avons sélectionné des femelles de Culicoides collectées dans la région
Champagne-Ardenne. Les espèces sélectionnées sont bien représentées dans la région. Les
modalités de collecte, de dissection et de montage, d’extraction, d’analyses moléculaires de
séquençage et phylogénétiques sont indiquées dans le chapitre IV.

Au total, 93 femelles ont été identifiées morphologiquement comme cela été indiqué dans le
chapitre IV, nos spécimens sont répartis comme suit : C. festivipennis n = 22, C. clastrieri n=
23, C. brunnicans n=29 et C. pictipennis n=19 (voir les détails dans le tableau S1 du document
II)

Afin de réaliser les analyses phénétiques et phylogénétiques avec le marqueur (COI) nous avons
inclus 11 séquences de Culicoides dans Genbank. Nous avons choisi particulièrement des
espèces appartenant au sous-genre Oecacta et d’autres proches de C. festivipennis et

91
C. clastrieri. Telles que C. pictimargo qui ressemble étrangement à C. festivipennis (Delécolle,
1985). Des séquences de deux autres espèces sont incluses à l’étude : C. furcillatus et
C. alazanicus. Nous avons également séquences ces deux dernières espèces pour le marqueur
ribosomique (le domaine D1D2 du 28S de l’ADNr) afin de réaliser les mêmes analyses que le
marqueur mitochondrial (COI).

Les analyses morphométriques et statistiques sont effectuées comme indiqué au chapitre IV.
Nous avons inclus également des photos des dessins de référence de Delécolle (1985), afin
d’évaluer la variation spécifique et la position de nos échantillons par rapport à l’une des
anciennes descriptions.

Dans cette étude, les résultats de l’identification morphologiques sont non congruents avec les
analyses moléculaires et morphométriques. En effet, Les deux espèces morphologiquement
identifiées se groupent dans le même clade. Egalement nous avons obtenu 12 spécimens dont
l’attribution est douteuse, en effet ils sont soit classés avec d’autres espèces telles que
C. brunnicans, C. furcillatus, C. alazanicus ou non classés dans aucun clade. Les 12 spécimens
étaient attribués morphologiquement soit à C. festivipennis soit à C. clastrieri.

Les analyses moléculaires du marqueur mitochondrial (COI) montrent également une faible
valeur intra-spécifique au sein du clade C. festivipennis/C. clastrieri (0.008). Les valeurs
interspécifiques varient de 0.178 entre C. pictimargo et le clade C. festivipennis/C. clastrieri et
de 0.600 entre C. pictimargo et C. brunnicans.

Les analyses avec le marqueur ribosomique (domaine D1D2 du 28S) sont cohérents avec le
précèdent quant à la valeur faible de l’intra-spécificité au sein du clade
C. festivipennis/C. clastrieri (0.000) mais les valeurs interspécifiques sont plus faible que celles
obtenues avec le marqueur précédent.

Les résultats de l’analyse morphométrique basée sur la géométrie alaire sont congruents avec
les analyses moléculaires mais ces deux analyses sont non congruentes avec l’identification
morphologique. Les résultats sont détaillés dans la discussion de du document III. Dans la
discussion générale de cette thèse nous discutons les resultats les plus flagrants de ce document.

Mots clés : C. festivipennis, C. clastrieri, phylogénie, géométrie morphométrique, France.

92
 1 Abstract

2 Biting midges are widespread around the world and play an essential role in the epidemiology

3 of over a hundred veterinary diseases. For taxonomists, correct species identification is

4 difficult because of affinities among cryptic species and species complexes.

5 Culicoides clastrieri was distinguished from Culicoides festivipennis based on morphological

6 characters, namely the wing patterns, the sensilla distribution, and the number of cibarial

7 spines. However, the wing pattern has been known to present high level of intraspecific

8 variation. To determine whether C. clastrieri is distinct from C. festivipennis, we conducted

9 molecular analyses of two gene (COI of mtDNA and the D1D2 of rDNA) sequences and

10 landmark-based geometric morphometric approach obtained from specimens collected in

11 Northern France , that were identified as C. clastrieri and C. festivipennis based on wing

12 pattern. The results show incongruence between the classical morphological identification, the

13 geometric wing morphometry and the molecular data. The geometric morphometric analysis

14 shows that both C. clastrieri and C. festivipennis wing references from Delecolle (1985) are

15 both clustered with C. clastrieri specimens. Consequently, C. clatrieri is merely a

16 morphological variant of C. festivipennis and is a synonym of that nominal species. In order to

17 take into account the phenotypic plasticity, we propose the following nomenclature:

18 C. festivipennis morph festivipennis and C. festivipennis morph clatrieri.

19

20

21 Keywords: Culicoides clastrieri, Culicoides festivipennis, phylogenetic analysis, wing

22 geometric morphometrics, France

23

93
24 1. Introduction

25 Biting midges are abundant haematophagous insects widespread all over the world. They

26 transmit an important number of pathogens such as protozoa, filarial worms and many

27 different viruses affecting humans and domestic or wild animals [1]. Culicoides (Diptera:

28 Ceratopogonidae) are among the smallest of these hematophagous flies, and play an essential

29 role in the epidemiology of over a hundred veterinary diseases worldwide [2]. In Europe, they

30 are recognized as vectors of the bluetongue virus (BTV) and Schmallenberg (SBV) virus [3–

31 7]. In livestock, diseases caused by these viruses are of international significance, and have an

32 important impact on the economy and animal welfare.

33 Culicoides is a large and diverse genus, which includes 42 fossil species and over 1400 extant

34 species classified into 39 subgenera [8,9]. Morphological diagnostic characters that are

35 commonly used are often too subtle or difficult to observe to permit reliable species

36 identification (see Delecolle, 1985 for morphological patterns). Wing pattern is of primary

37 importance in species diagnose but often show high level of intraspecific variation that could

38 be more important than interspecific variation [10–16]. Despite its sanitary importance, most

39 systematics studies of the genus pointed out a general taxonomic and nomenclatural confusion

40 within the group with poorly defined delimitation of and affinities among cryptic species and

41 species complexes [11,17,18]. Reliable species identification, species evolution and ecology

42 (including their geographic distribution, biting rates and preferences, and larval ecology) are

43 still unknown for many species. Our lack of fundamental knowledge on this group, coupled

44 with their large diversity of microhabitats and potential larval sites have prevented mitigation

45 of vectors.

46 There have been attempts to clarify Culicoides systematics by using approaches other than

47 traditional morphological diagnostic characters, such as via (i) traditional morphometrics

48 [19,20]; (ii) geometric morphometrics [21,22] (iii) nuclear and mitochondrial DNA analyses

94
49 [18,19,23–30]. Recent taxonomic revisions based on these alternative characters (molecular

50 and morphometrics tools) have led to the description of new species within the genus [31–33].

51 However, few of these studies have been performed within the framework of integrative

52 taxonomy. Integrative taxonomy advocates combining evidence from several disciplines

53 when seeking to recognise species [34]. In this framework, species recognition is based on the

54 unified species concept [35,36]. Studies applying an integrative taxonomic approach are

55 therefore needed for a more thorough understanding of species recognition and diagnosis.

56 The rise of DNA barcoding and lack of taxonomic experts conducted Ander et al. (2013) [37]

57 to propose COI sequencing as a tool for rapid identification of Culicoides species. Our study

58 uses standardized samples to assess diagnostic characters within the biting midges species

59 complex of C. clastrieri Callot, Kremer & Deduit 1962 and C. festivipennis, Kieffer 1914. We

60 focus on different kinds of characters: (i) morphology; (ii) wing shape; (iii) mitochondrial

61 DNA; and (iv) ribosomal DNA.

62 C. festivipennis and C. clastrieri belong to the subgenus Oecacta. The less well known name

63 but required by the rule of precedence, of Culicoides festivipennis Kieffer, 1914, has been

64 used in Remm’s palaearctic catalogue names instead of Culicoides odibilis Austen, 1921 and

65 Culicoides winnertzi Edwards, 1926 [38]. In 1962, C. clastrieri has been described as a valid

66 species by Callot, Kremer and Deduit in France based on morphological patterns and are

67 classified therefore in the Odibilis subgroup (sensu stricto). Since this date, both species have

68 been reported in several faunistic inventories [37,39–44].

69 C. festivipennis can be distinguished from C. clastrieri by the lack of sensilla coeloconia in

70 the four latest segments (Kremer 1965). The male genitalia of C. clastrieri is almost identical

71 to C. festivipennis.

72 Few data are available to date on the biology and ecology of the latter species. Larvae and

73 pupae of C. festivipennis may often be found in muddy puddles in woodland; those of

95
74 C. clastrieri have been found in mud at the edges of small pools. Rieb & Kremer (1981) [45]

75 during his study on breeding sites noted that there were two generations, two peaks

76 corresponding to hatching, the first in spring and the second in summer. Finally,

77 C. festivipennis and C. clatrieri have the same breeding site [39]. Pettersson et al. (2013) [46]

78 in their study on host-preferences consider that the species of C. festivipennis and

79 C.pictipennis to be ornithophilic, same for C.clastrieri [47]. Both C.clastrieri and

80 C. festivipennis are widespread and usually common all over Europe, North Africa, Russia

81 and Middle East [48,49].

82 The identification of the two closely related species C. clastrieri and C. festivipennis is still

83 entirely based on morphological characters, namely the wing patterns, the sensilla

84 distribution, and the number of cibarial spines (Fig1). Although a former study based on

85 Immuno-enzymology assay have shown that C. clastrieri and C. festivipennis vary only by

86 one enzymatic character [50] although, they could not be distinguished by COI barcode in the

87 study of Ander et al. (2013) [37]. However, the authors of this study did not question their

88 specific status, and argued for possible ongoing hybridization without any statement on their

89 lineage divergence. Speciation processes in Culicoides have been poorly investigated, and

90 case of introgression phenomenon has been reported for C. impunctatus only [24].

91 To determine whether C. festivipennis is distinct from C. clastrieri, we conducted molecular

92 analyses of two gene sequences and geometric morphometric analyses obtained from biting

93 midges collected in France. Regarding the morphologic and morphometric studies,

94 C. pictipennis (Staeger, 1839) and Culicoides brunnicans Edwards, 1939 were added to the

95 analyses. In addition, for molecular analysis, sequences of other species belonging to the same

96 subgenus (i.e. subgenus Oecacta) such as C. alazanicus Dzhafarov, 1961, C. furcillatus

97 Callot, Kremer and Paradis, 1962 and C. pictimargo Tokunaga and Shogaki, 1953: were

96
 98 added to check their phylogenetic relationships. C. pictimargo presents a huge resemblance

99 with C. festivipennis [40].

100

97
101 2. Materials and methods

102 2.1. Specimens and identification

103 Our study was conducted on 93 specimens from four Culicoides species: C. festivipennis

104 (n=22), and C. clastrieri (n=23), C. brunnicans (n=29), and C. pictipennis (n=19). All

105 specimens were collected in the Ardennes Region (France) using John W. Hock Company

106 UV traps (see sampling details in Table S1). Insects were collected overnight into a plastic

107 beaker containing 70% ethanol. Wings, head and abdomen (with six segments) of individual

108 midges were mounted in Chloral gum after clarification (Marc-André) on microscope slides

109 for morphological identification whereas thorax and legs were used for DNA extraction [20].

110 Preliminary species identification of the specimens was based on morphological characters

111 and wing patterns described in identification key of Delecolle (1985) and IIKC ([51].

112 2.2. Molecular analysis

113 DNA extraction was extracted following QIAmp DNA Mini Kit (Qiagen, Germany) as

114 described by Augot et al. (2010) [20].

115 Polymerase chain reactions (PCR) for D1D2 and Cytochrome oxidase subunit I genes were

116 performed in a 50 µL volume using 5 µL of DNA solution and 50 pmol of primers C’1 (5’-

117 ACCCGCTGAATTTAAGCAT-3’) and D2 (5’-TCCGTGTTTCAAGACGGG-3’) for D1D2

118 (Depaquit et al., 1998) and C1J1718 (5’-GGAGGATTTGGAAATTGATTAGT-3’) and

119 C1N2191 (5’-CAGGTAAAATTAAAATATAAACTTCTGG- 3’) for COI [52].

120 Amplification conditions for D1D2 were as follows: after an initial denaturation step at 94°C

121 for 3 min, followed by 35 cycles of (denaturation at 94°C for 30 s, annealing at 58°C for 90 s,

122 and extension at 68°C for 60 s) and a final extension at 68°C for 10 min.

123 For COI, the initial denaturation step at 95°C for 15 min, then 5 cycles at 95°C for 40 sec,

124 45°C for 40 sec, 72°C for 1 min, followed by 45 cycles at 95°C for 40 sec, 50°C for 40 sec,

98
125 72°C for 1 min and a final extension step at 72°C for 20 min. Amplicons were analyzed by

126 electrophoresis in 1.5% agarose gel stained with 0.1% ethidium bromide.

127 Phylogenetic analysis was performed using maximum parsimony (MP) method (using a

128 Branch and Bound search option) with MEGA software version 6 [53]. The bootstrap

129 probabilities of each node were calculated using 1000 and 500 replicates to assess the

130 robustness of the NJ and MP methods, respectively. A Neighbor-Joining (NJ) tree was created

131 to provide a graphic visualization of clustering group among different species. The best model

132 for NJ analysis, according to MEGA 5 was GTR+I+G [54]. Specimens of Culicoides

133 nubeculosus (Meigen), 1830 from Genbank (JQ620128, KF826483) also were processed as

134 out-group for COI and 28S sequences respectively.

135 The sequences obtained in the present study were compared with 11 Culicoides sequences

136 (species closely related belonging to the subgenus Oecacta) for the COI regions extracted

137 from GenBank, especially, C. pictimargo from Japan, which was synonymized to

138 C. festivipennis in Remm’s palaearctic catalogue names [55]. Sequences of C. furcillatus and

139 C. alazanicus were added to the analysis.

140

141 2.3 Geometric morphometric analysis

142 Where possible, the right and left wings of all 93 specimens were photographed using a Zeiss

143 V20 microscope coupled with a Sony DSC camera. Among the 186 wings, 167 were suitable

144 for morphometrics analyses (accounting for 38 wings of C. festivipennis, 42 wings of

145 C. clastrieri, 52 wings of C. brunnicans, and 35 wings of C. pictipennis). Additionally, wing

146 drawings of the four species from Delecolle (1985) were included as reference specimens.

147 Photographs and drawings were input to tps-UTILS 1.56 [56] and wing shape was captured

148 by digitizing two-dimensional Cartesian coordinates of 14 landmarks (Fig2) on right and

149 symmetrized-left wings with tps-DIG v2.17 [56].

99
150 The 200 landmark configurations were scaled, translated and rotated against the consensus

151 configuration using the GLS Procrustes superimposition method to remove all non-shape

152 differences and to separate the size and shape components of the form [57,58]. The

153 superimposition was performed using R functions of the package geomorph [59].

154 The aligned landmark configurations were projected into the Euclidean space tangent to the

155 curved Kendall’s shape space to aid further statistical analyses. The correlation coefficient

156 between the Procrustes distances in the shape space and the Euclidean distances in the tangent

157 space was close to 1 (0.999). This means that the linear tangent space closely approximates

158 the curved shape space, thereby permitting to be confident in the variation amplitude of our

159 dataset [60]. The least-squares regression slope and the correlation coefficient between the

160 two distances were calculated with tps-SMALL v1.25 [56].

161 Validation of shape discrimination

162 To validate the species discrimination based on wing shape, we first followed a hypothesis-

163 driven approach. The biomolecular clades were used to build the hypotheses of species

164 diagnoses, which were then tested a posteriori by geometric morphometrics. Results of

165 biomolecular analyses delimitated two clades corresponding to C. brunnicans, C. pictipennis,

166 and a third clade corresponding to undistinguished C. clastrieri and C. festivipennis. The latter

167 is defined as a clastrieri/festivipennis clade. Seven specimens of C. clastrieri (L131; L137;

168 L138; L139; L145; L146; L153) and five specimens of C. festivipennis (L122; L128; L129;

169 L154; L162) did not cluster with their conspecific clade (i.e. out of the main

170 clastrieri/festivipennis clade). To prevent any bias from potential misidentification, these 12

171 specimens were considered as dubious and were disregarded of the dataset for the validation

172 of shape discrimination (Fig3). We also excluded the four reference wings from Delecolle

173 (1985) not to overfit the species discrimination from our specimens.

100
174 A between-group PCA (bgPCA) was performed to visualize shape variation between the three

175 groups defined based on the clades, namely C. brunnicans, C. pictipennis, and the

176 clastrieri/festivipennis clade (Fig4).Compared to traditional PCA, bgPCA tends to maximize

177 variation between groups by projecting the greatest variance between group means along the

178 first principal component, the second greatest variance on the second component, and so on.

179 Unlike discriminant analyses, scores of the specimens are projected in a Euclidean space that

180 does not affect relations or distances between specimens. We included a posteriori the four

181 reference wings from Delecolle (1985) and the 12 dubious specimens in the computed bgPCA

182 space of shapes and calculated their score. These specimens were not part of the bgPCA

183 calculation and allow us to (i) confirm the species delimitation based on Delecolle (1985)

184 reference wings, and (ii) assess morphological affinities between the dubious specimens and

185 the three clades.

186 Discrimination among the three different clades was also assessed by linear discriminant

187 analysis (LDA) of the aligned configuration of landmarks. The effectiveness of the LDA for

188 discriminating groups was assessed by the percentages of wings correctly classified to their

189 original group (i.e. hit-ratio, HR) in a leave-one-out cross-validation procedure based on the

190 posterior probabilities of assignment. Given the observed scores of a wing, the posterior

191 probability equals the probability of the wing to belong to one group compared to all others.

192 The wing is consequently assigned to the group for which the posterior probability is the

193 highest [61]. However, assignment of wings in predictive discriminant analyses should not be

194 considered as a unique qualitative identification. Value of the posterior probabilities could be

195 more informative for validating the assignment to a group. Low probabilities (<0.90) refer to

196 a non-supported assignment and should be considered as dubious classification. Identification

197 of the specimens was, therefore, redefined based on posterior probabilities of assignment of

198 both right and left wings of the same specimen. We applied the following rule of thumb for

101
199 specimen identification. A specimen was assigned to a group if both wings showed high

200 posterior probabilities of assignment (>0.90) for the same group. If one wing showed

201 supported assignment but the second wing showed low probabilities, the specimen was

202 assigned to the supported group. In case of divergent supported assignments, or when right

203 and left wings showed low probabilities both, the identification was stated as dubious, and the

204 specimen was not assigned to any group.

205 Morphological affinities of the four reference wings from Delecolle (1985) and the 12

206 dubious specimens were assessed based on their score in the predictive discriminant space of

207 shapes. We included a posteriori these specimens in the computed LDA space as "unknown"

208 specimens and calculated their score. Assignments of the specimen were estimated by

209 posterior probabilities of assignment, following the rule of thumb for specimen identification

210 described above.

211 Species delimitation of the two cryptic species C. clastrieri and C. festivipennis

212 The validation of shape discrimination in this study followed a hypothesis-driven approach.

213 However, Schlick-Steiner et al. (2010) [34] advocate applying a discovery approach whenever

214 feasible, when comparing different disciplines in the frame of integrative taxonomy. After

215 validation of an efficient Culicoides species discrimination by wing shape and after

216 confirming the identification of the 12 dubious specimens as part of the C. clastrieri and

217 C. festivipennis complex, species delimitation of these two cryptic species was assessed based

218 on adapted exploratory analyses.

219 A between-group PCA was performed between the morphologically identified species:

220 C. brunnicans, C. clastrieri, and C. festivipennis; including all 12 dubious specimens. As

221 described above, we projected a posteriori the four reference wings from Delecolle (1985)

222 after calculation of the bgPCA.

102
223 We performed a homogeneity test to assess whether a group including both C. clastrieri and

224 C. festivipennis (as suggested by the molecular analyses) were comprised of one or several

225 morphologically distinct taxa. Model-based unsupervised clustering procedure [62] was

226 applied to the superimposed landmark coordinates in order to classify specimens and

227 delineate clusters of unequal sample size. The most probable number of groups and the

228 clustering model (spherical model with equal (EII) or unequal (VII) volume, and an

229 ellipsoidal model with equal (EEE) or varying (VVV) volume, shape, and orientation) were

230 selected simultaneously using an approximation of the Bayesian information criterion (BIC)

231 [63]. The higher the BIC, the better the model fits to the data. The subgroup was considered

232 as homogeneous when the BIC values suggested a unique cluster for all models. In case the

233 homogeneity test suggested the presence of two morphologically distinct taxa, the group is

234 split in two homogeneous groups according to the best Mclust model.

235 Once the homogeneity of the groups has been validated, the morphological discrimination of

236 the groups was assessed by LDA as described above, and we included a posteriori the four

237 reference wings from Delecolle (1985) in the computed LDA space as "unknown" specimens

238 and calculated their score. Assignments of the specimen were estimated by posterior

239 probabilities of assignment.

240 Wing characterization

241 Wing pattern is one of the main traits still used in species diagnose but show high individual

242 variation. A consensual wing was calculated for C. clastrieri and C. festivipennis based on the

243 superimposition of the wing pictures. The pictures are superimposed according to landmark

244 alignment with tps-SUPER v1.14 [64].

245 3. Results

246 3.1. Molecular analyses

103
247 Interpretable sequences were obtained from 91 specimens of 93 and those with COI and 28S.

248 Sequences obtained are available in GenBank under Accession Nos.xxxx (Table S1).

249 Sequence alignments were 422 bp for the COI and 574 bp for 28S including gaps.

250 Analysis of COI and 28s sequences:

251 The base composition of the COI sequences had a mean AT content of 65.13%. The overall

252 transition/transversion bias was R = 4.636, indicating that transitions were more common with

253 G to A transition (38.25%) and C to T transition (15.46 %) of the total, which implies that

254 transitions may have reached saturation; this is adjusted for the K2P model.

255 The base composition of the 28S sequences had a mean AT content of 58.54%. The overall

256 transition/transversion bias was R = 6.123, indicating that transitions were more common with

257 G to A transition (20.67%) and C to T transition (30.87%) of the total, which implies that

258 transitions may have reached saturation; this is adjusted for the Tamura-Nei model.

259

260 Phylogenetic analysis

261 The MP tree was obtained using the Max-mini branch-and-bound algorithm (Purdom et al.,

262 2000). The consistency index/ retention index are 0.50/0.72 and 0.63 / 0.75 for COI and 28S

263 respectively.

264 Our molecular analysis with both markers generated 5 supported clusters, 4 of which were in

265 agreement with the morphological determination (i.e. C. brunnicans, C. pictipennis,

266 C. furcillatus and C. alazanicus). However, one cluster (i.e. two species) corresponding to

267 undistinguished C. clastrieri and C. festivipennis. In addition, Seven specimens identified

268 based on wing morphology as C. clastrieri (L131 ; L137 ; L138 ; L139 ; L145 ; L146 ; L153)

269 and five specimens of C. festivipennis (L122 ; L128 ; L129 ; L154 ; L162) did not cluster

270 with their conspecific clade (i.e. out of the main “clastrieri/festivipennis ” clade). Indeed,

271 analysis from COI show that five specimens were clustered with C. alazanicus clade (L128

104
272 identified as C. festivipennis; L131, L137, L139 and L145 identified as C. clastrieri), two

273 were clustered with C. furcillatus (L138 and L146, all identified as C. clastrieri), one

274 specimen (L154, identified as C. festivipennis) was included in the C. brunnicans clade.

275 Finally, two specimens did not group with any clade: L122 and L129, both identified as

276 C. festivipennis. Unlike COI, analyses from more conserved marker i.e. 28S DNA, show that:

277 i) more specimens were clustered with the main “clastrieri/festivipennis ” clade, ii) four

278 ungrouped specimens (L122; L129; L153; L162) and iii) the same specimens were clustered

279 with C. alazanicus as COI except L137, which was clustered with the main

280 festivipennis/clastrieri clade. Finally, one specimen of C. brunnicans (L643) was unclassified

281 with both analyses (Fig 5a and 5b).

282 Intra- and interspecific comparisons

283 Low intraspecific divergences with COI sequences have been observed: C. pictipennis

284 (0.012), C. brunnicans including L154 (specimen identified as C. festivipennis) (0.008),

285 C. alazanicus including L128; L131; L137; L139 and L145 (specimens identified as

286 C. clastrieri or as C. festivipennis) (0.027). A lack of variability has been observed in the

287 C. furcillatus clade excluding and including L138 and L146 specimens identified as

288 C. clastrieri (0.000). Finally, C. festivipennis and C. clastrieri grouped in the same main clade

289 showed low intraspecific distances (0.006); these were not identified as separate species based

290 on DNA barcodes. The overall mean genetic distance (K2P) computed for the different

291 species of Culicoides was found to be 0.349. Interspecific K2P values for different species

292 and taxa ranged from 0.178 (between C. pictimargo and species of main

293 “clastrieri/festivipennis” clade) to 0.600 (between C. pictimargo and C. brunnicans).

294 The interspecific difference between the main “clastrieri/festivipennis” clade and specimens

295 that classified out of the main clastrieri/festivipennis clade (specimens clustered with

105
296 C. furcillatus specimens clustered with C. alazanicus and unclassified specimens (L122;

297 L129) are as follow: 0.535, 0.429, 0.405, and 0.269 respectively.

298 Analysis from 28S rDNA sequences did not show any intraspecific divergence for all taxa

299 (0.000), except for the branch grouping C. alazanicus with the specimens L128, L131, L139

300 andL145 (0.002). The overall mean genetic distance (K2P) computed for the different species

301 of Culicoides was found to be 0.019. Interspecific K2P values for different species and taxa

302 ranged from 0.007 (between C. furcillatus and L643, unclassed specimen) to 0.600 (between

303 the main “clastrieri/festivipennis” clade and C. nubeculosus (Meigen, 1830)). Finally, the

304 interspecific difference between the main “clastrieri/festivipennis” clade and specimens,

305 which are classified out of the main clastrieri/festivipennis clade (12 dubious specimens), was

306 found to be 0.427 for COI and 0.017 for 28S.

307

308 3.2 Validation of shape discrimination

309 The three groups defined in our analyses (i.e. C. brunnicans, C. pictipennis, and the

310 clastrieri/festivipennis clade) are separated in the between-group PCA without almost any

311 overlap between groups (Fig6). The three axes of the bgPCA explain 50.1 % of the total

312 variance (respectively 32.9%, 14.0%, and 3.1%). In the morphometric space defined by the

313 bgPCA, the four reference wings from Delecolle (1985) are undoubtedly clustered with their

314 respective species (Fig6A) confirming the species delimitation based on wing shape. The 12

315 dubious specimens are clustered with the clastrieri/festivipennis clade (Fig6B) confirming

316 their original identification despite incongruent molecular results.

317 The same three groups are well separated from each other in the LDA. At specimen level, a

318 well-supported identification is given for 74 of the 78 specimens. All C. brunnicans and

319 C. pictipennis and 27 of the 28 specimens of the clastrieri/festivipennis clade have a well-

320 supported identification and are assigned to the correct species (Table I), accounting for a

106
321 global HR of 98%. The LDA of wing shape appears to be a clear and accurate method for

322 discrimination between Culicoides close species. Morphological affinities of the 4 reference

323 wings from Delecolle (1985) and the 12 dubious specimens are detailed in Appendix. As

324 observed in the bgPCA, the four reference wings from Delecolle (1985) are assigned to their

325 respective species (Table I) confirming the species delimitation based on wing shape. Eleven

326 of the 12 dubious specimens are assigned to the clastrieri/festivipennis clade (Fig5B)

327 confirming their original identification despite incongruent molecular results. The twelfth

328 shows non-supported posterior probabilities of assignment and is therefore not assigned to

329 any group. Original identification is therefore considered for species delimitation analyses.

330 3.3 Species delimitation

331 The three species defined for species delimitation analyses (i.e. C. brunnicans, C. clastrieri,

332 and C. festivipennis) are separated in the between-group PCA, even though clear overlap is

333 observed between C. clastrieri and C. festivipennis (Fig4).

334 The three axes of the bgPCA explain 35.3% of the total variance (respectively 25.1%, 9.2%,

335 and 0.9%). In the morphometric space defined by the bgPCA, C. brunnicans reference wings

336 from Delecolle (1985) is clustered with its respective species (Fig4). However, both

337 C. clastrieri and C. festivipennis reference wings from Delecolle (1985) are clustered with

338 C. clastrieri specimens.

339 The non-homogeneity of the group including both C. clastrieri and C. festivipennis (as

340 suggested by the biomolecular analyses) is indicated by the Mclust analysis. The highest BIC

341 value is obtained for the two and three clusters option, so we suggest that at least two groups

342 can be detected in the sub-dataset (Table II). A spherical model used with unequal volume

343 (VII) classifies the specimens as follows: the first group includes 12 C. clastrieri specimens

344 only; the second includes 5 C. clastrieri and 16 C. festivipennis specimens. Twelve specimens

107
345 show different group attribution based on their right and left wings, and are therefore not

346 assigned to any group.

347 C. clastrieri and C. festivipennis are also well separated from each other in the LDA (a priori

348 groups based on C. brunnicans, C. clastrieri, and C. festivipennis). At specimen level, a well-

349 supported identification is given for 59 of the 74 specimens, accounting for a global HR of

350 95% (Table III). All C. brunnicans, 16 of the 18 specimens of C. clastrieri and 13 of the 14

351 specimens of C. festivipennis are assigned to the correct species (Table III). As observed in

352 the bgPCA, C. brunnicans reference wing from Delecolle (1985) is assigned to its respective

353 species (Table III). However, both C. clastrieri and C. festivipennis reference wings are

354 clustered with C. clastrieri specimens even though the assignment of the C. clastrieri

355 reference wings show non-supported posterior probabilities of assignment.

356

357 3.4 Wing characterization

358 The consensual wing of C. clastrieri is calculated based on the superimposition of 24 wing

359 pictures according to landmark alignment. The 24 wings correspond to right and left wings of

360 the 12 specimens assigned to the first group of the homogeneity test using a spherical model

361 with unequal volume (VII) for two clusters (Table II). The consensual wing of C. festivipennis

362 is calculated based on the superimposition of 32 wing pictures that correspond to right and left

363 wings of the 16 C. festivipennis specimens assigned to the second group of the homogeneity

364 test (Table II). The patterns of the calculated consensual wings are compared to the

365 C. clastrieri and C. festivipennis reference wings from Delecolle (1985).

366 4. Discussion

367 The present integrative taxonomy study carried out on two closely related and sympatric

368 species C. festivipennis and C. clastrieri shows incongruence between the classical

369 morphological identification, the geometric wing morphometry and the molecular data.

108
370 The application of morphometric geometric approach has confirmed the separation of species

371 with HR of 100% for C. brunnicans and C. pictipennis and 96% for C clastrieri/festivipennis

372 clade, indicating that this technique is a powerful tool to discriminate closely related species

373 [21, 22]. It could be a tool to separate species still considered as cryptiC. The geometric

374 morphometric analyses show that both C. clastrieri and C. festivipennis wing references from

375 Delecolle (1985) are both clustered with C. clastrieri specimens.

376 DNA barcoding based on the COI and 28S sequences discriminated all morphologically

377 determined species except C. festivipennis and C. clastrieri that are not considered as separate

378 species using these analyses. The identical festivipennis/clastrieri sequences with both COI

379 and 28S, a supposed conserved marker to better separate the species [65], and a rare incidence

380 of overlap in wing markings may indicate ongoing hybridization [37]. Additionally,

381 mitochondrial DNA, of maternal inheritance only, is highly susceptible to changes due to the

382 presence of endosymbionts (e.g. Wolbachia), which could lead to male killing or mate

383 incompatibility [66] and interspecific hybridization [67]. These species have very close wing

384 patterns and may therefore be misidentified. However, although they are clearly separable

385 according to three morphological criteria (sensilla distribution, thoracic pigmentation and

386 wing marking in cell R5). Larval stage IV is also morphologically very close. However, they

387 can be distinguished by the size difference of the head capsule and the dorsal comb through

388 the hypo pharyngeal fringe and finally their pigmentation [48]. C. festivipennis larvae are

389 abundant in habitats similar to those of C. clastrieri [48,68]. Morphological divergence could

390 not be phenotypic plasticity of temperature or climatic-related traits because those species are

391 sympatric and share the same biotope; in addition, they coexist and share the same

392 distribution air around the world. However, one can hypothesize that C. festivipennis and

393 C. clastrieri to be the same entity, which probably suffered pressure and competition in the

394 larval level and those due to predation, in fact prey species respond to predation risk in a

109
395 multivariate manner, changing of morphological features are cited such as colors or shapes

396 are employed at key stages in development ([69,70]. Environment can influence significantly

397 genetic variations, in other insect groups. An adaptive introgression due to the environment

398 have been proven, such as the complex Anopheles gambiae that uses introgression of a

399 strongly selected insecticide-resistance mutation [71].

400 Regarding the taxonomic consequence of our DNA and morphometrics analyses, we consider

401 C. clastrieri as a junior synonym of C. festivipennis. However, in order to take into account of

402 the phenotypic plasticity, we propose the following nomenclature: C. festivipennis morph

403 festivipennis and C. festivipennis morph clatrieri.

404 This led to suspicions concerning the presence of gene flow among the taxa and the likelihood

405 that they are valid species. In previous studies in nature, genetic nor morphological

406 intermediates have been observed [72, 73] that can reflect a possible hybridization and genetic

407 introgression in nature. The evidence of possible genetic introgression and hybridization is

408 best examined by analyses of sympatric populations [74].

409 In our study, we observed that some festivipennis/clastrieri specimens were clustered with

410 another Culicoides species as C. brunnicans, C. furcilatus and C. alazanicus. In previous

411 study, Velten and Mullens (1997) [73] established a hybrid laboratory population by mating

412 wild female C. occidentalis with colonised males C. sonorensis (and vice versa) that produced

413 viable progeny for 6 generations. Wing length and numbers of serrations on the maxilla of

414 hybrid offspring overlapped and were allometric. In nature, this hybridization can occur, also

415 possible pre- and post-mating barriers that prevent introgression between taxa of some

416 Culicoides species complex are unknown [75].

417 We notice that there are many different forms of species which are well separated at the

418 molecular level, especially in the group of vectors involved in the transmission of serious

419 diseases of veterinary interest, such as Culicoides obsoletus (O1-O3), Culicoides pulicaris

110
420 (P1, P3, dark pulicaris), Culicoides newsteadi (N1-N5) [19,37,76]. Considering all these facts,

421 we can ask ourselves we may observe a phenomenon of speciation. These insects are vectors

422 of widespread and economically very important diseases affecting Animal Health, the

423 consequences of our observation could affect the vectorial competence and the vectorial

424 capacity of several species. How do we consider now the systematics of Culicoides? Wing

425 geometric, as a cheap tool to separate these species, could be an excellent candidate to review

426 the taxonomy of the genus.

427

111
428 Acknowledgments

429 This work is funded by the CPER project ‘‘Culichamp’’ and by ANSES. The authors thank

430 Sylvette Gobert for proofreading this manuscript.

431 Competing interests

432 The authors declare that they have no competing interests.

433 Authors’ contributions

434 L. Hadj-Henni, T. de Meulemeester, J. Depaquit and D. Augot designed this study, carried out

435 data collection, data analysis, data interpretation and composed the paper.

436 Schilthuizen M carried out data analysis, data interpretation and composed the paper.

437 P. Noël and R. Helder carried out data collection and data analysis.

438 .

439

440

441

442

443

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447

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686

118
 Figure 1. Morphological characters that distinguish C.clastrieri and C.festivipennis (drawing
of Delécolle, 1985). A: wing, B: antenna, C: palpus, D: cibarium with spines and consensual
wing computation of E) C.clastrieri and C.festivipennis.

Culicoides clastrieri Callot, Kremer & Deduit, 1962 Culicoides festivipennis Austen, 1921

119
Figure 2. Female wing of C.festivipennis(drawing of Delécolle, 1985). Location of 14 landmarks used
in the morphometrical analysis of C.clastrieri, C.festivipennis, C.brunnicans and C.pictipennis.

120
Figure 3. Molecular results of twelve specimens showing different group attribution according
to used primers. fecl: C.festivipennis, bru: C.brunnicans, fuc: C.furcillatus, pictim:
C.pictimargo and alaz: C.alazanicus

121
Figure 4. Ordination of C.brunnicans, C.clastrieri, and C.festivipennis in the space of group

PCA. The three axes of the bgPCA explain 35.3% of the total variance (respectively 25.1%,

9.2%, and 0.9%). Group means are represented by stars.

122
Figure 5: Trees obtained from nucleotide analysis of: (a) COI mtDNA; (b) 28S rDNA (with MP
metod) sequences of C.clastrieri, C.festivipennis, C.alazanicus, C.brunnicans, C.pictipennis
and C.furcillatus: boostrap values are shown in nodes (1000 replicates).

123
 A B

Figure 6. Ordination of between-group PCA on C.brunnicans, C.pictipennis, and the

clastrieri/festivipennis clade defined after biomolecular analyses. The three axes of the bgPCA
explain 50.1 % of the total variance (respectively 32.9%, 14.0%, and 3.1%). Group means are
represented by stars. A) The four reference wings (Delécolle, 1985) and B) the 12 dubious
specimens were projected a posteriori in the computed bgPCA.

124
Table I. Specimen identification based on the leave-one-out cross-validation procedure in the
LDA.

fecl bru pic NA HR%

clastrieri/festivipennis clade 27 1 - 2 96

C.brunnicans - 27 - 2 100

C.pictipennis - - 19 - 100

Dubious specimens 11 - - 1 -

C.clastrieri (Delécolle, 1985) 1.00 0.00 0.00 - -

C.festivipennis (Delécolle, 1985) 1.00 0.00 0.00 - -

C.brunnicans (Delécolle, 1985) 0.00 1.00 0.00 - -

C.pictipennis (Delécolle, 1985) 0.00 0.06 0.93 - -

Original groups are along the rows, predicted groups along the columns. Assignment of the four reference wings
(Delécolle, 1985) and the 12 dubious specimens are also represented in the table. Posterior probabilities of
assignment of the reference wing from Delécolle (1985) are given for each group. fecl: clastrieri/festivipennis
clade; bru: C.brunnicans; pic: C.pictipennis; NA:dubious species identification

125
 Table II. Homegeneity test. Mclust procedure on the group including both C.clastrieri and
C.festivipennis specimens (n=45).

G= number of mixture components (clusters); EII, VII, EEE, and VVV= BIC values for the
related model; Model= optimal model; Subgroups computed based on the optimal model.
Species names abbreviated (cla= C.clastrieri; fes= C.festivipennis).

126
Table III. Specimen identification based on the leave-one-out cross-validation procedure in

the LDA (n=74).

cla fes bru NA HR%

C.clastrieri 16 2 - 5 89

C.festivipennis 1 13 - 8 93

C.brunnicans - - 27 2 100

C.clastrieri (Delécolle, 1985) 0.00 0.00 1.00 - -

C.festivipennis (Delécolle, 1985) 0.75 0.25 0.00 - -

C.brunnicans (Delécolle, 1985) 0.98 0.02 0.00 - -

Original groups are along the rows, predicted groups along the columns. Posterior probabilities
of assignment of the reference wing from Delécolle (1985) are given for each group. cla:
C.clastrieri; fes: C.festivipennis clade; bru: C.brunnicans; NA:dubious species identification.

127
 Table S1. Specimens and associated groups of Culicoides clastrieri and C.festivipennis
collected in the Region of Ardenne (France).( Presence(yes)/ Absence (No) sensilla coeloconia
on flagellomeres 3-9)

Identifcation Genbank accession

Specimens Number molecular number
no. Wings of Yes/No morphological
Spines D1D2 COI D1D2 COI
L116 3 Yes C.festivipennis Group 1 Group 1

L116

L119 3 Yes C.festivipennis Group 1 Group 1

L119

L120 3 Yes C.festivipennis Group 1 Group 1

L120

L121 4 Yes C.festivipennis Group 1 Group 1

L121

L122 3 Yes C.festivipennis Group 3 Group 4

L122

L123 2 Yes C.festivipennis Group 1 Group 1

L123

L125 5 No C.clastrieri Group 1 Group 1

L125

L126 4 Yes C.festivipennis Group 1 Group 1

L126

L127 3 Yes C.festivipennis Group 1 Group 1

L127

L128 3 Yes C.festivipennis Group 6 Group 6

L128

L129 3 Yes C.festivipennis Group 2 Group 2

L129

L131 7 No C.clastrieri Group 6 Group 6

L131

L132 7 No C.clastrieri Group 1 Group 1

L132

128
L133 4 No C.festivipennis Group 1 Group 1

L133

L134 9 No C.clastrieri Group 1 Group 1

L134

L135 7 No C.clastrieri Group 1 Group 1

L135

L136 6 No C.clastrieri Group 1 Group 1

L136

L137 6 Yes C.clastrieri Group 6 Group 6

L137

L138 6 No C.clastrieri Group 1 Group3

L138

L139 6 No C.clastrieri Group 6 Group 6

L139

L140 7 No C.clastrieri Group 1 Group 1

L140

L141 5 No C.clastrieri Group 1 Group 1

L141

L142 6 No C.clastrieri Group 1 Group 1

L142

L143 7 No C.clastrieri Group 1 Group 1

L143

L144 5 No C.clastrieri Group 1 Group 1

L144

L145 7 No C.clastrieri Group 6 Group 6

L145

L146 7 No C.clastrieri Group 1 Group 3

L146

L147 5 No C.clastrieri Group 1 Group 1

L147

129
L148 5 Yes C.festivipennis Group 1 Group 1

L148

L149 2 No C. fest Group 1 Group 1

L149

L150 8 No C.clastrieri Group 1 Group 1

L150

L151 4 No C.clastrieri Group 1 Group 1

L151

L152 7 No C.clastrieri Group 1 Group 1

L152

L153 6 No C.clastrieri Group 4 Group 1

L153

L154 3 Yes C. fest Group 1 Group 5

L154

L155 2 Yes C.festivipennis Group 1 Group 1

L155

L157 5 Yes C.festivipennis Group 1 Group 1

L157

L158 4 Yes C.festivipennis Group 1 Group 1

L158

L159 4 Yes C.festivipennis Group 1 Group 1

L159

L160 5 Yes C.festivipennis Group 1 Group 1

L160

L161 4 Yes C.festivipennis Group 1 Group 1

L161

L162 4 Yes C.festivipennis Group 5 Group 1

L162

130
Document IV : Taxonomic assessment of Culicoides brunnicans,

C. santonicus and C. vexans (Diptera: Ceratopogonidae) in France:

implications in systematics

Leila Hadj-Henni 1, Thibaut De Meulemeester2, Bruno Mathieu 3, Menno Schilthuizen2,

Véronique Lerhter 1, Jérôme Depaquit 1, Denis Augot1

1Usc Vecpar-ANSES LSA, EA4688, UFR Cap Santé, Université de Reims Champagne-
Ardenne, 51 rue Cognacq-Jay, 51096 Reims Cedex, France.
2 Naturalis Biodiversity Center, Darwinweg 2, PoBox 9517, 2300RA Leiden, the Netherlands
3Institut de Parasitologie et de Pathologie Tropicale de Strasbourg, EA7292, Université de
Strasbourg, France

(En cours de préparation)

131
Évaluation taxonomique de Culicoides brunnicans, C. santonicus et C. vexans (diptères :

Ceratopogonidae) en France : Implications en systématique

Résumé et premiers résultats

Culicoides brunnicans Edwards, 1939 ; C. santonicus Callot, Kremer, Rault and Bach, 1966 et
C. vexans (Staeger), 1839 appartiennent au sous genre Oecacta (Borkent, 2008) et ces espèces
sont regroupées dans le groupe Vexans. Ces trois espèces ont été mentionnées de manière
sympatrique dans différents études : soit toutes les trois ensemble en France (Venail et al., 2012;
Viennet et al., 2012), soit C. brunnicans et C. vexans en Suède et en Allemagne (Ander et al.,
2012; Kiel et al., 2009), soit C. santonicus et C. vexans au Portugal (Ramilo et al., 2012). Au
Maroc, l’espèce C. santonicus au Maroc a été mentionnée seule (Bailly-Choumara & Kremer,
1970).
C. brunnicans et C. santonicus sont deux espèces jumelles avec de subtiles variations
morphologiques et le seul critère qui les différencie est la pigmentation alaire (Callot et al.,
1966). Le motif des ailes est un critère très important pour la diagnose d’espèces mais il peut
présenter un niveau de variation intraspécifique plus important qu’interspécifique (Wirth et al.,
1985, 1988; Felippe-Bauer et al., 2005, 2006, 2008, 2010; Chaker et al., 1980 ). Pour déterminer
si C. brunnicans est différent de C. santonicus, une étude moléculaire (COI de mtDNA et D1D2
du rDNA) et la géométrie morphométrie alaire est appliquée à des spécimens identifiés au
préalable comme C. brunnicans et C. santonicus. Par introduction de l’approche
morphométrique, le statut taxonomique de C. brunnicans et C. santonicus est ré-évalué avec
C. vexans, C. furens (espèce type du sous-genre Oecata) et C. nubeculosus (défini comme un
groupe extérieur). Les résultats moléculaires montrent que les spécimens des cinq espèces
forment des groupes distincts. Le degré de divergence moléculaire, des deux marqueurs
sélectionnés, est suffisant pour soutenir le statut spécifique de chaque groupe.

Les résultats des l’analyses moléculaires et les raisons de notre choix pour mener cette étude,
sont détaillés dans la discussion générale de cette thèse.

Mots clés : C. santonicus, C. brunnicans, C. vexans, géomorphométrie alaire, ADNr, ADNmt

132
Abstract

Culicoides brunnicans Edwards, 1939; C. santonicus Callot, Kremer, Rault and Bach, 1966
and C. vexans (Staeger), 1839 belong to subgenus Oecacta and Vexans group.The three
species have been reported in only morphological studies together, by twice or alone.
C. brunnicans and C. santonicus are two closely related species and the item separating to
them is the wing pattern. An integrative taxonomic approach was conducted on females
specimens that were identified as C. brunnicans and C. santonicus based on wing pattern. By
introduction morphometrics techniques, we also re-evaluated the taxonomic status of
C. brunnicans and C. santonicus with C. vexans, C. furens (type species of subgenus
Oecacta) and C. nubeculosus (defined as outgroup). In our study, both DNA sequences of the
D1D2 rDNA domains and COI of mtDNA domains discriminated perfectly the four species.

Keywords: C. santonicus, C. brunnicans, C. vexans, wing morphometry, rDNA, mtDNA

133
1. Introduction

Biting midges of genus Culicoides (Diptera, Ceratopogonidae) are hematophagous (0.5 to 3

mm) with more than 1,400 species (Borkent, 2012) described worldwide (Mellor et al., 2000).
Females of Culicoides are vectors of human and animal arboviruses and cause significant
socioeconomic injuries (Carpenter et al., 2013).
The morphological, morphometric and molecular diagnostic methods are used efficiently to
detect and identify Culicoides specimens in epidemiological field studies. To avoid
misidentification and to correct identification of vector species are epidemiologically
important implications. Therefore, the knowledge of which species could act as vector is
essential to assess for the disease control of epidemics (Perrin et al., 2006). The
morphological identification of Culicoides specimens can be difficult, and an expert is
essential (Dik et al., 2014).
Several molecular tools have been developed for identification and phylogenetic analysis
describing their genetic relationship. The first internal transcribed spacer (ITS-1) gene of
ribosomal DNA (rDNA) is suggested as good phylogenetic molecular marker useful for
phylogenetic studies (Cetre-Sossah et al. 2004; Kiehl et al. 2009; Perrin et al. 2006, Nielsen et
al., 2011, Deblauwe et al., 2012; Morag et al., 2012). The nuclear protein-coding gene CAD,
also known as rudimentary, which generally evolve more slowly than mitochondrial genes,
performed well both separately and in combination with other genes as evaluated by Bellis et
al. (2013; 2014). Because of unconstrained sites (high variability in third codon positions) in
genes such Cytochrome Oxidase submit I (COI) and Cytochrome Oxidase b (Cytb) of
mitochondrial DNA (mtDNA) , they usually fit well for studies of closely related species
(Pagès et al., 2009; Augot et al., 2010; Garros et al., 2010, Lassen et al., 2011; Ander et al.,
2012, Lehmann et al., 2012; Martinez de la Puente et al., 2012; Morag et al., 2012; Wenk et
al., 2012; Augot et al., 2013; Bakhoum et al., 2013; Pettersson et al., 2013). Ander et al.
(2012) propose COI sequencing as a tool for rapid identification of Culicoides species. The
domains (D1 and D2) gene of rDNA (28S) are useful for phylogenetic studies including
closely related species (Hadj-Henni et al., 2014; Slama et al., 2014).
Culicoides brunnicans Edwards, 1939; C. santonicus Callot, Kremer, Rault and Bach, 1966
and C. vexans (Staeger), 1839 belong to Oecacta subgenus (Borkent, 2008). However, this
last is considered as a catch fall subgenus for many species (Cornet et al. 1994; Jones et al.,
1985). C. vexans and C. brunnicans belong to Vexans group (sensu stricto) as defined by
Campbell & Pelham-Clinton (1960). The three species have been reported in only

134
morphological studies in France (Venail et al., 2012; Viennet et al., 2012) and C. brunnicans
reported as exophagic and collected on animal baits (Viennet et al., 2012). However,
C. brunnicans and C. vexans have been reported in morphological and molecular studies in
Sweeden and Germany respectively (Ander et al., 2012; Kiel et al., 2009). C. santonicus and
C. vexans were present in Portugal (Ramilo et al., 2012). C. santonicus has been reported
alone in Morocco (Bailly-Choumara & Kremer, 1970). Finally, in Interactive Identification
Key for Culicoides (IIKC), C. santonicus specimens were presented in material and method;
but strangely, C. santonicus slides were not identified by the IIKC. So the systematic status of
C. santonicus is not evaluated. C. brunnicans and C. santonicus are two closely related
species with subtitles morphological variants for example on wings. The alone item separating
to C. santonicus of C. brunnicans is the wing pattern (Callot et al., 1966). Wing pattern is of
primary importance in species diagnose but often show high level of intraspecific variation
that could be more important than interspecific variation (Wirth et al., 1985, 1988; Felippe-
Bauer et al., 2005, 2006, 2008, 2010; Chaker et al., 1980 ).
To determine whether C. brunnicans distinct from C. santonicus, an integrative taxonomic
approach was conducted on female specimens that were identified as C. brunnicans and
C. santonicus based on wing pattern (Fig1). We focus on different kinds of characters, from:
(i) morphology; (ii) wing shape; (iii) mitochondrial DNA; and (iv) ribosomal DNA. By
introduction morphometrics techniques, we also re-evaluated the taxonomic status of
C. brunnicans and C. santonicus with C. vexans, C. furens (type species of subgenus
Oecacta) and C. nubeculosus (defined as outgroup). Then, we used wings traits to test the
differences among conspecific populations and recognize phenotypic units within the species.

2. Materials and methods

2.1. Specimens and identification

A total of 93 females were collected in France and used in this study (Table 1). Specimens
were catched using John W. Hock Company UV traps. Insects were collected overnight into a
plastic beaker containing 70% ethanol. Wings, head and abdomen (with six segments) of
individual midges were mounted in Chloral gum after clarification (Marc-André) on
microscope slides for morphological identification whereas thorax and legs were used for
DNA extraction (Augot et al., 2010). Taxonomic identification was made using the keys and
description of Delécolle (1985); Mathieu et al. 2012) Wirth et al., 1988; Felippe-Bauer et al.,
2008; Forattini, 1957.

135
2.2. Molecular analysis

DNA extraction was extracted following QIAmp DNA Mini Kit (Qiagen, Germany) as
described by Augot et al. (2010). The DNAwas eluted in50 ml of the buffer provided.
Polymerase Chain Reaction was performed in a 50 ml volume using 5 ml of DNA and 50
pmol of each of the primers.
Ribosomal DNA: The D1D2 domains were amplified using C’1 (5’-ACC CGC TGA ATT
TAA GCAT-3’) and D2 (5’-TCC GTG TTT CAA GAC GGG-3’) according to Depaquit et al.
(1998).
Mitochondrial DNA: the domain COI1 was amplified using the primers C1J1718 (5’-GGA
GGA TTT GGA AAT TGA TTA GT-3’) and C1N2191 (5’ CAG GTA AAA TTA AAA TAT
AAA CTT CTGG- 3’) (Simon et al. 1994).
Phylogenetic analyses were performed using haplotypes obtained in this study (Table 1) and
sequences obtained in Genbank: C. brunnicans (HQ824458-HQ824459, JQ620033-
JQ620043); C. nubeculosus (JQ620127- JQ620129; JQ683275-JQ683283, KF178272,
KF178273); C. furens (KF186432-KF186435); C. vexans (JQ620245-JQ620250, JQ683362-
JQ683374) with COI sequences and C. nubeculosus (KF826483) with D1D2 sequence.

Phylogenetic reconstruction using maximum parsimony (MP) method (using a Branch and
Bound search option) was performed with MEGA software version 5 (Tamura et al., 2011).
The bootstrap probabilities of each node were calculated using 1000 and 500 replicates to
assess the robustness of the NJ and MP methods, respectively. A Neighbor-Joining (NJ) tree
was created to provide a graphic visualization of clustering group among different species.
The best model for NJ analysis, according to MEGA 5 was GTR+I+G (Saitou and Nei, 1987).

2.3 Geometric morphometric analysis

Where possible, the right and left wings of all xxx specimens were photographed using Zeiss
V20 microscope coupled with a Sony DSC camera. Among the xxx wings, xxx were suitable
for morphometrics analyses (accounting for xxx wings of C. brunnicans, xxx wings of
C. furens, xxx wings of C. nubeculosus, xxx wings of C. santonicus and xxx C. vexans).
Additionally wings C. brunnicans, C. furens, C. nubeculocus, C. santonicus and C. vexans
from catalogs and published studies (Callot et al., 1966; Delécolle, 1985; Wirth et al., 1988;
Rawlings, 1996 Mathieu et al., 2012) were included in our study. Type slide of C. brunnicans
(Type locality: London distr. Great Britain), C. furens Poey 1851; C. nubeculocus (Meigen,
1830) (Type locality: not given (? Aachen), C. santonicus (Type locality: Breuillet Charente-

136
Maritime) and C. vexans (Staeger, 1839) (Type locality: Denmark) were included as reference
specimens (Remm, 1988).

The taxonomical status of the four species was confirmed by genotyping of mtCOI and D1D2
genes. Photographs and drawings were input to tps-UTILS 1.6 (Rohlf 2013a) and wing shape
was captured by digitizing two-dimensional Cartesian coordinates of 14 landmarks on right
and symmetrized-left wings with tps-DIG v2.17 (Rohlf 2013b).
The xxx landmark configurations were scaled, translated and rotated against the consensus
configuration using the GLS Procrustes superimposition method to remove all non-shape
differences and to separate the size and shape components of the form (Rohlf and Slice 1990;
Bookstein, 1991). The superimposition was performed using R functions of the package
geomorph (Adams and Otárola-Castillo, 2013).
The aligned landmark configurations were projected into the Euclidean space tangent to the
curved Kendall’s shape space to aid further statistical analyses. The correlation coefficient
between the Procrustes distances in the shape space and the Euclidean distances in the tangent
space was close to 1 (0.9999). This means that the linear tangent space closely approximates
the curved shape space, thereby permitting us to be confident in the variation amplitude of our
dataset (Rohlf, 1999). The least-squares regression slope and the correlation coefficient
between the two distances were calculated with tps-SMALL v1.25 (Rohlf, 2013c).
Specimens were grouped a priori based on CLG composition. Following the molecular
results, five groups were identified C. brunnicans, C. furens, C. nubeculosus, C. santonicus
and C. vexans. We performed a homogeneity test to assess whether the a priori groups were
comprised of one or several morphologically distinct taxa. We used a pattern-recognition
technique based on kernel density estimates (KDE) (Parzen, 1962; Greblicki & Pawlak, 2008)
and a model-based unsupervised clustering procedure (Mclust) (Fraley & Raftery, 2002). Five
subdataset were computed, corresponding to the five chemical groups. A Procrustes
superimposition and a principal component analysis (RWA) were calculated for each
subdataset. Bi-dimensional KDE was performed on the projection of the specimens onto the
two first PC axes, which represent the global shape variation.
Density patterns were visualized using pseudocolourization, surfacing or contouring
representations. Mclust was applied to the superimposed landmark coordinates in order to
classify specimens and delineate clusters of unequal sample size. The most probable number
of groups and the clustering model (spherical model with equal (EII) or unequal (VII) volume,
and an ellipsoidal model with equal (EEE) or varying (VVV) volume, shape, and orientation)

137
were selected simultaneously using an approximation of the Bayesian information criterion
(BIC) (Schwarz, 1978). When the homogeneity test suggested the presence of two
morphologically distinct taxa, the group was split in two homogeneous groups according to
the best Mclust model.
Following the results of the homogeneity tests, we identified five groups, corresponding to
five known species. Significance of shape differences among groups was tested using an
analysis of variance (pair-wise MANOVA Goodalls F-test; Zelditch et al., 2004). Shape
variation was also assessed by a relative warps analysis (RWA), which is actually a PCA
based on the superimposed landmark coordinates (Alibert et al., 2001). As group
discrimination in the shape space of the PCA (RWA) was insufficiently robust and did not
reflect the shape differences shown in the pair-wise MANOVA, we then used a linear
discriminant analysis (LDA). The effectiveness of discriminant analysis for separating groups
was tested by an assignment procedure based on Mahalanobis distances in the LDA space.
Using their scores in the discriminant space, each specimen was assigned to the group for
which the centroid was nearest. The performance of this assignment procedure was assessed
by the rate of correct assignments judged using a Jack-knife (leave-one-out) procedure.
Phenetic relationships among groups were assessed using cluster analysis. Because pair-wise
MANOVA showed significant wing shape differences among groups, we used the scores in
the discriminant space of the centroid of each group to perform an unrooted neighbour-joining
clustering.

3. Resultats
3.1. Molecular analyses
Sequences obtained are available in GenBank under Accession Nos.xxx (Table 1). Sequence
alignments were 429 bp for the COI and 658 bp for 28S including gaps.
Our molecular analysis with both markers (Fig3) generated five supported clusters with our
specimens and seven clusters with Genbank data and which are in agreement with the
morphological determination.
Low intraspecific divergences with COI sequences have been observed: C. brunnicans
(0.006), C. santonicus (0.002), C. furens (0.00), C. nubeculosus (0.002), C. furens-USA
(0.003), C. brunnicans-Switzerland (0.00) and C. vexans including several populations in
Europe (0.039). C. brunnicans and C. santonicus grouped in the same main clade showed low
interspecific distances (0.042). Interspecific K2P values for different species and taxa ranged

138
from 0.229 (between C.vexans and C. nubeculosus; C. nubeculosus and C. brunnicans-
Switzerland) to 0.042 (Table 2).
Analysis from 28S rDNA sequences shows low intraspecific divergences for all taxa:
C. brunnicans (0.0), C. santonicus (0.001), C. furens (0.001), C. nubeculosus (0.002) and
C. vexans (0.001). C. brunnicans, C. santonicus and C. vexans grouped in the same main
clade showed low interspecific distances (Table 2). C. vexans is the sister both group of
C. brunnicans and C. santonicus. Finally, C. furens presents a low intraspecific divergence for
C. brunnicans, C. santonicus and C. vexans compare to C. nubeculosus (Table 2).
Interspecific K2P values for different species and taxa ranged from 0.058 (between
C. santonicus and C. nubeculosus) to 0.005 (C. brunnicans and C. santonicus) (Table 2).

3.2. Geometric morphometrics analysis

En cours d’acquisition.
Discussion

In the present study, specimens of all species were found to form distinct clusters, and the
degree of molecular divergence of the two selected markers was sufficient to support the
specific status of each cluster. Among several genes of interest tested for species
characterization, mtDNA and rDNA have been selected and used to study molecular evolution
of Culicoides (Hadj-Henni et al., 20014; Slama et al., 2014).
In our study, both DNA sequences of the D1D2 rDNA domains and COI of mtDNA domains
discriminated perfectly the two closely related species (C. brunnicans and C. santonicus) as
morphological identified. The intraspecific D1D2 sequences comparisons ranging from 0.058
to 0.005 reinforce the potential interest of these domains for evolutionary systematic
concerning Culicoides.

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146
Figure 1. Morphological characters that supposedly distinguish Culicoides brunnicans
(Delécolle, 1985) and C. santonicus (Callot et al., 1966).

Culicoides brunnicans
Culicoides santonicus

147
Figure 2. Female wing of C. vexans (drawing of Delécolle, 1985). Location of 14 landmarks
used in the morphometrical analysis of C. brunnicans, C. furens, C. nubeculosus,
C. santonicus and C. vexans.

148
Figure 3. Phylogenetic trees based on the COI domain of the mtDNA (a) and D1D2 domains of the 28S rDNA (b) of Culicoides constructed
using the Neighbor-Joining (GTR+I+G). Sequences of Culicoides nubeculosus were set as outgroup.

a b

98
C. brunnicans 52
99 C. brunnicans
77
65 C. santonicus
99
99
C. brunnicans-Switzerland
99 C. santonicus
87
30 42
C. vexans C. vexans
99 86

C. furens-Guadeloupe
C. furens
99 99
C. furens-USA
99
C. nubeculosus
C. nubeculosus
99
99

0.02 0.005

149
 Table 1. Culicoides sample of collected in France.

Species Subgenus Wings Locality Sex Specimens GenBank accession

(group) number
Number Code COI D1D2
C. brunnicans D758, D767, D785, D825, D858, D859,
Vertuelle 29 D870, D877, D892, D901, D903, D924,
L603-606, L633-642, L644-646
Oecacta L592

C. santonicus
(Vexans group)
Figari, Corse 14 D1151-D1164

D1159

C. vexans Female
La Loge Bailly 17 D1134-D1150
D1147

C. furens Oecacta Grand-Bourg,

(type species) Guadeloupe 16 D1057-D1072
D1070

C. nubeculosus MonoCulicoides D768, D769, D771, D839, D840, D848,

Vertuelle 17 D853, D866, D885, D913, D930-934,
D769
D936, D938

150
Table 2 Estimation of pairwise distance between species C. brunnicans, C. furens,
C. nubeculocus, C. santonicus and C. vexans for the COI domain of the mtDNA and the
D1D2 region of the rDNA.

COI
1 2 3 4 5 6
1 C. vexans
2 C. furens-USA 0.205
3 C. nubeculosus 0.229 0.177
4 C. brunnicans 0.183 0.151 0.210
5 C. brunnicans-Switzerland 0.195 0.199 0.229 0.176
6 C. santonicus 0.161 0.159 0.204 0.042 0.181
7 C. furens 0.206 0.144 0.206 0.175 0.213 0.173

D1D2
1 2 3 4
1 C. brunnicans
2 C. vexans 0.006
3 C. santonicus 0.005 0.011
4 C. furens 0.031 0.034 0.033
5 C. nubeculosus 0.053 0.052 0.058 0.051

151
Document V: Molecular identification of blood meals in biting midges

Hadj-Henni Leila1, Germain Adeline1, Noël Philippe1, Helder Remi2, De Meulemeester

Thibaut3, Depaquit Jérôme1, Augot Denis1

1
Université de Reims Champagne-Ardenne, ANSES, SFR Cap santé, EA4688 – USC «
transmission vectorielle et épidémiosurveillance de maladies parasitaires (VECPAR) », 51, rue
Cognacq-Jay, 51096 Reims Cedex, France

2
Université de Reims Champagne-Ardenne, Station URCA-CERFE, Laboratoire IAE, 08240
Boult-aux-Bois, France

3
Naturalis Biodiversity Center, Darwinweg 2, Postbus 9517, 2300 RA Leiden, the Netherlands

(Soumis pour publication Chez Parasitology Research le 25 Octobre 2014)

152
L’identification moléculaire de l’origine des repas sanguins des Culicoides

Résumé :

En Europe, les Culicoides (Diptera : Ceratopogonidae) ont été longtemps négligés, L’intérêt
grandissant de recherches sur les Culicoides a commencé depuis 2006, avec l’arrivée et la
réémergence de la fièvre catarrhale ovine dans une grande partie de l’Europe, mais également
avec l’apparition d’autres arbovirus transmis par les Culicoides tel que le virus de
Schmallenberg (SBV) au début de l'été 2011. Ainsi, depuis 2006, les responsables européens
favorisent la surveillance entomologique et de lutte anti vectorielle. Tout comme les études
écologiques ou moléculaires pour identifier les vecteurs, les études visant à déterminer l'origine
des repas de sang chez ces vecteurs restent essentielles afin de comprendre leur comportement,
de pouvoir disposer d’une donnée essentielle pour déterminer leur capacité vectorielle afin
d’anticiper la prise en charge des maladies à transmission vectorielles d'origine.

Nous avons selecionné des femelles « entièrement » gorgées avec des abdomens de couleur
rouge ou marron, des abdomens contenant du sang digéré et enfin des femelles avec des
abdomens contenant uniquement des traces de sang. Les pièges ont été posés à proximité des
animaux comme cela été suggéré par Garros et al., 2011, mais aussi dans la forêt afin de cibler
la faune sauvage. Dans notre étude, nous n’avons trouvé aucun Culicoides gorgé sur animal
sauvage. Pour mieux connaitre les préférences trophiques des Culicoides, il serait intéressant
de piéger même en journée dans la forêt pour capturer les espèces diurnes et multiplier les
fréquences de piégeages. En effet, dans notre étude, nos pièges étaient posés au coucher de
soleil et prélevés le lendemain au lever de soleil.

Nous avons trouvé également que certains individus se sont gorgés sur des espèces animales se
trouvant loin des sites de piégeages, c’est le cas de certains C. punctatus capturés en forêt
trouvés gorgés sur âne sachant que l’âne le plus proche se trouvait à 1.3 Km. Lassen et al. 2012
ont trouvé également dans leur étude sur les repas sanguins un Culicoides qui se gorgeait sur
un hôte qui se trouvait à 800 m du piège. Cela montre que les Culicoides se transportent
aisement soit activement soit aidés par le vent.

Dans notre étude, très peu de Culicoides se gorgeaient sur le bétail, contrairement à d’autres
études durant lesquelles les Culicoides semblent nettement préférer se gorger sur les animaux
d’élevage.

153
Malgré la présence d’un large éventail d’espèces animales dans nos sites d’études, l’analyse
des repas sanguins met en évidence un étrange comportement trophique des Culicoides, en
effet, ces derniers semblent se nourrir majoritairement sur les Chevaux. D’autant plus que parmi
les espèces qui se gorgent sur chevaux dans notre études on retrouve des espèces des groupe
Obsoletus et Pulicaris, les vecteurs majeurs du virus de FCO et du SBV en Europe. De plus,
ces espèces sont des vecteurs connus du virus de la peste équine, une maladie redoutable pour
les chevaux qui peut causer de lourdes pertes économiques en cas de réémergence en Europe.
En effet, entre 1987 et 1990 la maladie avait déjà sévie en Espagne et en Portugal. Actuellement
le virus de la peste équine semble gagner de terrain en avançant vers le nord pour arriver
jusqu’au frontières Marocaine et Asiatiques (car la maladie est notifiée actuellement à Djibouti
et au Sénégal). Sachant que le virus de la peste équine partage les mêmes vecteurs que le virus
de FCO,.et que ce dernier, s’est dispersé en .Europe au-delà de ses frontières afro-asiatiques et
Nord-Africaines, il n’est pas à exclure que la peste equine puisse conquérir l’Europe par les
memes voies que le FCO et le SBV.

Nous avons également évalué deux différents marqueurs le PNOC et le Cytb pour identifier
l’origine des repas sanguins en fonction du stade de la digestion. Nous avons donc choisi des
femelles avec abdomens rouges, abdomens avec du sang en stade avancé de digestion et
abdomens avec seulement quelques traces de sang. Nous avons également séquencé le gène
PNOC pour l’âne « Equus asinus » car la séquence ce dernier n’était pas disponible sur
Genbank. Nous avons constaté que le PNOC ne distingue pas l’âne du cheval. Nous concluons
que le PNOC n’est pas un bon marqueur pour distinguer les espèces affines. Le Cytb a réussi à
identifier l’origine des repas sanguins sur les abdomens rouges et sur ceux contenant un sang
en stade avancé de digestion mais pas sur les abdomens avec de traces de sang.Quant au PNOC,
il a réussi à identifier l’origine du repas sanguin uniquement sur les abdomens avec du sang
rouge et très peu avec des abdomens contenant un sang plus ou moins digérés. Le Cyt b
différencie bien l’âne et le cheval mais aussi il identifie bien les oiseaux contrairement au
PNOC, exclusivement utilisé pour identifier l’origine des repas sanguins pris sur mammifères.
Le Cyt b est donc plus sensible et plus spécifique que le PNOC

Mots clés : Cyt b, PNOC, repas sanguin, Culicoides, Europe

154
 1 Abstract:

2 In Europe, Culicoides (Diptera: Ceratopogonidae) have been neglected for a long time, and

3 have only become a focus of research since 2006, with the unexpected outbreaks of Blue

4 tongue virus (BTV) and the spread across much of northern Europe of Schmallenberg virus

5 (SBV) during early summer 2011. Since 2006, European makers have favoured funding areas

6 such as entomological monitoring and vector control. Molecular and ecological studies are

7 essential to identify vectors but studies of blood meal origin must also be considered to

8 understand vector behaviour and anticipate borne-vector-diseases.

9 In our study, we have sequenced and disposed PNOC (prepronociceptine) sequence for

10 donkey (Equus asinus) because it was missing in genbank. We have underlined that PNOC

11 marker is not suitable to separate closely related Equid species such as horse and donkey. The

12 Cyt b marker was able to identify 202 samples more compared to PNOC (99.55% of

13 specimens). Cyt b appears to be better to detect the origin of blood meals from females having

14 start the blood digestion. Our findings about Culicoides host behaviour were discussed.

15

16 Keywords: Cyt b, PNOC, Blood meal, Culicoides, Europe

17

155
18 Introduction:

19 In Europe, Culicoides (Diptera: Ceratopogonidae) have been neglected for a long time, and

20 have only become a focus of research since 2006, with the unexpected outbreaks of Blue

21 tongue virus (BTV) and the spread across much of northern Europe of Schmallenberg virus

22 (SBV) during early summer 2011(Elbers et al 2013; Koenraadt et al 2014). More than 96% of

23 females are haematophagous. Females feed on a wide range of hosts including humans,

24 livestock and other mammals, amphibians, birds, and sometimes-engorged insect. They play

25 an important role in the epidemiology of disease transmission to humans and animals (Mellor

26 et al 2000; Ma et al 2013).

27 Since 2006, European policymakers have favoured funding areas such as entomological

28 monitoring and vector control. Several studies have emerged, such as: i) studies of the

29 ecology, phylogeny and taxonomy (Gomulski et al 2006; Conte et al 2007; Baldet et al 2008;

30 Pagès et al 2009; Augot et al 2010; Muñoz-Muñoz et al 2011; Ander et al 2013; Hadj Henni

31 et al 2014) ; ii) abundance of vectors, their modulation and impact of climatic changes

32 (Meiswinkel et al 2007; Ducheyne et al 2007; Conte et al 2007; Hendrickx et al 2008;

33 Clausen et al 2009; Agren et al 2010; Kirkeby et al 2013; Diarra et al 2014) ; iii) Studies on

34 behaviour and feeding preferences (Ninio et al 2011; Garros et al 2011; Martínez-de la Puente

35 et al 2012; Calvo et al 2012; Viennet et al 2013; Ayllón et al 2014). Host preference studies

36 are critical because it determines which host will be bitten and therefore potentially be

37 infected with transmitted pathogens by haematophagous arthropods including Culicoides

38 (Braverman et al 2012).

39 To date, many studies on host preferences have been conducted for Culicoides species using

40 serological assays (Murray 1970; Blackwell et al 1994; Blackwell et al 1995). However, these

41 techniques are time consuming and have limited sensitivity and specificity (Önder et al 2014).

156
42 Molecular-based methods were also used. PCR techniques to amplify only a fragment from

43 universal vertebrate mitochondrial genes as Cytochrome c oxidase subunit I (COI) or

44 Cytochrome b (Cyt b) or a species-specific multiplex PCR assay (Garros et al 2011; Martínez-

45 de la Puente et al 2012; Lassen et al 2012; Calvo et al 2012; Pettersson et al 2013; Santiago-

46 Alarcon et al 2013; Ayllón et al 2014) and finally the vertebrate’s prepronociceptin gene

47 (PNOC) (Ninio et al 2011).

48 In the context of epidemiological monitoring programs carried out in Europe, the

49 investigation of host preferences of haematophagous insects, including biting midges, is

50 critical for understanding the circulation of vector-borne diseases. We carried out a study in

51 the Champagne-Ardenne area (France). Our goal was to determine blood meal preferences of

52 Culicoides in two localities: i) on a farm offering a large diversity of potential hosts and ii) in

53 a forest area. Our strategy was to target both livestock and wildlife.

54 The second aim of the present study was to compare and test both molecular markers i.e.

55 PNOC and Cytb to identify blood meals origin taken from vertebrate hosts in 565 wild-caught

56 females of Culicoides spp. We compared also their ability to provide interpreted sequences

57 depending on blood digestion stage. The capacity of each marker to amplify bird DNA and to

58 separate related animal species were checked. Our findings showed a strange preference of

59 Culicoides to bite horses; those results and the potential risk of introduction of exotic

60 arboviruses on Europe as African Horse Sickness (AHS) are discussed.

61 Materials and Methods

62 Collection and morphological identification of biting midges

63 In this study, 565 engorged Culicoides females were collected using UV CDC miniature light

64 traps (John W. Hock Company, FL, USA) and morphologically identified. Under favorable

65 climatic conditions, light traps were operated indoor and outdoor from sunset to sunrise from

157
66 2012 to 2014. Traps were set on forest area at Boult-aux-Bois. Six horses were not very far

67 from the site of trapping (at 450 m). Traps were also set on pedagogical farm in Louvois (a

68 village close to Rheims), which offering a large animal diversity. All animal species cohabit

69 and move freely all over the farm (Table I).

70 All blood-fed females Culicoides were preserved in a 95% ethanol solution and kept until

71 their processing. Dissection was performed with single-use sterile equipment. Head, genitalia

72 and wings were mounted between slide and cover slip to identify the specimens

73 morphologically according to wing pattern (Delecolle 1985). C. obsoletus and C. scoticus

74 specimens were identified according to specific morphological and morphometrical characters

75 (Augot et al. 2010).

76 Blood meal molecular analysis

77 To detect the ability of the two markers to provide a positive result and detect the maximum

78 number of potential hosts, 565 females (91 females from Boult-aux-bois and 466 from

79 Louvois farm) were identified as blood-fed. After observation under microscope, we have

80 included randomly, fully engorged females (n=220) with red, brownish-red and dark-red

81 abdomens (the colour of the blood meal could be changed before the transfer of midges in

82 ethanol and the time of storage in ethanol before dissection). Female showing an advance sign

83 of digestion (n=264) and finally females showing no rest of blood in their abdomen (n=81).

84 To maximize host DNA concentrations, only abdomens for each individual were crushed

85 manually using sterilized, disposable pestles, mask and mop-cab. Whole DNA was extracted

86 using the QIamp DNA mini Kit (Qiagen, GmbH, Hilden,Germany) according to the

87 manufacturer's instructions after an initial manual crushing step. The DNA was eluted in a

88 final volume of 120 μl of AE buffer.

158
 89 Blood meal analyses were performed by sequencing both the vertebrate’s prepronociceptin

90 gene (PNOC) using the primers PNOC (F) and PNOC (R) (Haouas et al 2007) and the

91 degenerate and universal vertebrate primer from Cytochrome b (cyt b) gene modified from

92 (Kocher et al 1989) under different PCRs conditions (Table II). PCRs were performed in a 50

93 µl volume using 10 µl of extracted DNA solution and 50 pmol of the primers (Table II) by

94 using Taq polymerase (5’, Germany).

95 The lack of contamination was checked through the inclusion of a negative control in each

96 run. Moreover, two positive controls were also processed in each run: a DNA extracts from

97 cattle (Bos taurus), and from Mallard (Anas platyrhynchos). Mallar DNA was used to check

98 the capacity of each marker to amplify bird DNA. The PCR products were examined using

99 electrophoresis on a 2 % agarose gel with ethidium bromide staining. PCR products have been

100 sequenced bi-directionally using the primers used for PCR.

101 Sequences analyses

102 Sequences of at least 200 bp for PNOC and 300 bp for Cyt b were compared to homologous

103 sequences deposited in GenBank using BLAST. Blood meals were considered as identified to

104 the species level if their sequence showed ≥ 98% homology with a sequence deposited into

105 GenBank. Sequences editing and analyses were performed using BioEdit Sequence

106 Alignment Editor v7.2.3 software (Hall 1999). PNOC sequence for donkey (Equus asinus) is

107 missing in GenBank database. Consequently, we did it from donkey’s blood following the

108 protocol previously described.

109 Results

110 DNA sequences of 484 specimens were acquired from 565 blood-fed Culicoides specimens

111 collected (85.66%). Cyt b marker was able to identify 202 samples more compared to PNOC.

112 Eighty-nine (89) not interpretable sequences were found for both markers (Figure 1).

159
113 Analyses from PNOC and Cyt b genes detected blood meal origin of all 184 (83.63%) and

114 219 (99.55%) specimens respectively from 220 fully engorged females. Analyses from female

115 showing advanced sign of digestion (n=264) provided only seven available sequences for

116 PNOC (2.65%) and 176 identified blood meal for Cyt b (66.67%). A failed identification was

117 reported for both markers on abdomens containing only traces of blood (Figure 2).

118 Sequences of PNOC gene for donkey (Equus asinus) have been deposited into GenBank

119 under accession number KM521860. This sequence was compared both to our sequences

120 obtained from amplification of Equus caballus DNA using PNOC primers set and to

121 sequences originated from Equus caballus PNOC gene available in GenBank database using

122 BLAST. In Genbank database, we have observed two haplotypes of horse sequences with

123 PNOC gene. Our donkey’s sequence is identical to the first haplotype (e.g. haplotype from

124 sequence under the accession number XM_001493120) and differs by one base from the

125 second haplotype (e.g. sequence under the accession number AY011855). Consequently,

126 PNOC marker appear not able to differ a donkey’s blood meal from a horse’s one. This means

127 that PNOC gene is unable to distinguish Equus caballus sequences from those of Equus

128 asinus (99% of homology). Unlike Cyt b, that has well distinguished theme.

129 Equally, no sequences were reported from PNOC with Mallard DNA (Anas platyrhynchos)

130 and successful amplification was reported with Cyt b.

131 In our collection, the predominant species of Culicoides whose blood meals origin were

132 identified are represented by C. obsoletus (37.46%), C. achrayi (28.35%), C.punctatus

133 (12.91%) and C. scoticus (7.59%). These species showed a strange preference for horses

134 (Equus caballus), so did C. lupicaris, C.newsteadi, C.furcilltus, C.brunnicans, C.pulicaris,

135 C.subfascipennis and C. chiopterus, although they were less numerous in our sampling.

136 Analyses from Cyt b show that C.punctatus are the main specie took blood meal on donkeys

137 (63.15%), most of them were caught in Boult-aux-bois despite that the nearest donkeys in

160
138 this area were at 1.3 Km from trap. At least 11 different species of Culicoides were found to

139 have fed on horses (73.92% for Cytb and 95.28% for PNOC), five different species have fed

140 on donkeys, four different species have fed on cattle, only one have fed on cat (Felis

141 silvestris) and one have fed on chicken (Gallus gallus). Finally, Cyt b analyses show that

142 19.20% of Culicoides fed on Human (Homo sapiens) vs 4.81% with PNOC. Analyses from

143 PNOC show less variety of hosts (Figure 3). In Louvois farm, we did not observe difference

144 between traps located indoor and outdoor. No mixed blood meals were detected in the present

145 study.

146

147 Discussion

148 Study of host preferences of the native population of haematophagous Culicoides spp is

149 critical in order to assess and take action to prevent outbreaks of infectious diseases. A better

150 knowledge in this field could help to identify the animal reservoirs for arboviruses. In Europe,

151 Before BTV-8 experience, Bluetongue was considered as exotic disease that could be

152 controlled by animal movement restriction and vaccination (Bartsch et al 2009; Wilson and

153 Mellor 2009). Since the spread of BTV-8 in northern Europe, despite the absence of

154 C.imicola, the main African vector of BTV, some abundant autochthons Culicoides species

155 have been suspected and incriminated, mainly species from Obsoletus and Pulicaris groups

156 (Mellor and Wittmann 2002). More recently, in autumn 2011, an unidentified disease of

157 livestock was reported in Germany, the etiologic agent of this disease was identified as a

158 novel orthobunyavirus and named Schmallenberg virus (SBV) (Hoffmann et al 2012). It has

159 been demonstrated that the midges of Obsoletus group are natural vectors for this virus

160 (Rasmussen et al 2012).

161

161
162 In the present study, PCR technique method was selected for host identification considering

163 that a blood meal in fully engorged Culicoides, Culicoides showing an advanced sign of

164 digestion and finally females showing no rest of blood in their abdomen. The objective was to

165 determine the ability of each marker to detect DNA from vertebrate host into Culicoides

166 abdomens depending on stage of blood meal digestion. Results show that PNOC marker was

167 able to detect host DNA in only more than 3% of females with digested blood meal. Cytb

168 marker was more efficient (66%). Performance of Cyt b to detect origin of blood meals in

169 advanced stages of digestion unlike the PNOC could be explained by the fact that, in

170 abdomens of engorged arthropods, immature erythrocytes lose their mitochondria during the

171 final stages of maturation (Tyler 1992). Several studies have also highlighted that there is a

172 significant negative relationship between the time since ingestion and the success of analyses

173 (Mukabana et al 2002; Oshaghi et al 2006). The lack of identification of blood meal origin by

174 both markers in digested blood and in abdomens with some trace of blood can be explained

175 by the fact that host DNA was being extensively degraded during the digestion. Kirsten and

176 Gray (1996) in their study on engorged Ixodes ricinus ticks, vector of Lyme disease, explain

177 that Nested PCR amplification of PCR product could increase detection sensitivity and limit

178 of detection to 40 days post-digestion (Kirstein and Gray 1996).

179 In the present study, both markers were able to detect blood meal origin in fully engorged

180 abdomen, with high score. Equally, in our study, no interpretable sequences were reported

181 with both markers (Figure 2), maybe due to the presence of contamination although the

182 samples were prepared under sterile conditions. DNA purification prior to PCR would be

183 necessary for these samples; the use of specific-species primers could increase yield of

184 success identification (Garros et al 2011).

185 Although some studies on Culicoides report a very high percentage of blood feeding on Homo

186 sapiens (84%)(Santiago-Alarcon et al 2013), more than 19% of positive samples giving

162
187 sequences matching Homo sapiens were detected in our study; our findings must be analyzed

188 with caution. To check the lack of contamination on Culicoides provided sequences matching

189 Homo sapiens, it will be better to test them with human-specific primers that amplify a

190 segment of the hyper variable mitochondrial control region for e.g. (Morin et al 1994). It was

191 not expected that primers that amplified specific segments of human mitochondrial DNA

192 would amplify also the corresponding segments of mitochondrial DNA from other species

193 (Kocher et al 1989).

194 In all cases, to suppress the suspicion of contamination, it will be more judicious in the future

195 to work under sterile conditions from "trapping" to "sorting insects". Because in our field, on

196 the ground, we work often with bare hands, thus there is a risk of contaminating the samples.

197

198 In our study, no identification conflicts were reported between PNOC and Cytb markers

199 except blood meal origin from donkey and horse. In fact, we find that PNOC marker failed to

200 separate donkey and horse DNAs, the same findings were reported in the study of Ninio et al,

201 (2011), in which, no differentiation has been made with PNOC between wild boars (Sus

202 scrofa scrofa) or pigs (Sus scrofa). We conclude that PNOC is not suitable to separate closely

203 related species such as Equidae. We confirm also the findings of Haouas et al (2007), in with

204 PNOC is only suitable to detect blood meal origin from mammal but not from birds. In

205 addition, PNOC gene seems less sensible to detect blood meal origin especially from

206 abdomens with digest blood.

207 In this type of study, the gene of choice was cytochrome B gene (Cyt b), it is present in

208 numerous copies in each cell (Townzen et al 2008). It is also known that vertebrate

209 mitochondrial DNA can evolve faster than does nuclear DNA, thus they are more

210 polymorphic and more adapted to species identification (Kocher et al 1989). Cyt b marker has

211 been used successfully on ticks (Kirstein and Gray 1996; Wodecka et al 2014), mosquitos

163
212 (Lee et al 2002; Kent and Norris 2005), tsetse fly (Steuber et al 2005), sand-fly (Laskay et al

213 2012) and Culicoides (Pettersson et al 2013; Santiago-Alarcon et al 2013). However, in most

214 of these studies, the Cyt b has proven its discriminating power. Although, for some studies, no

215 differentiation has been made between domestic pigs and wild boars (Sus scrofa), sheep and

216 mouflon (Ovis gmelini musimon), and ibex (Capra ibex) and goat because of their close

217 phylogenetic proximity (Garros et al 2011). RFLP analysis based on Cyt b sequences, showed

218 a limit to discriminate animals of the same genus, namely, C. elaphus and C. nippon.

219 However, analyses of the available sequence data indicate that this problem could be resolved,

220 because sufficient variability exists in the cytochrome b sequence to design specific probes

221 which could distinguish between species (Kirstein and Gray 1996).

222 In the present study, our degenerate primers discriminated Equus caballus and Equus asinus,

223 two related species from same genus (Equus). We evaluated also PNOC gene and showed that

224 it is not a good candidate to be used alone; it should be coupled to the other marker.

225 In the study of Pettersson et al, (2013), the addition of a second widely studied gene as COI

226 for blood meal analysis for samples that did not produce results with Cyt b primers, increases

227 the opportunity for host identification. Identification of Culicoides blood meals using Cyt b

228 gene coupled with COI gene for vertebrate, is a logical application as the COI and Cyt b DNA

229 barcode regions from more species is sequenced and submitted to public databases. The

230 capacity for identification of blood meals via both those marker will become more and more

231 precise.

232 In the present study, our sampling strategy was to use light traps close to livestock as was

233 suggested by Garros et al, (2011) to maximize the caught of blood-fed females on the hosts

234 present at study sites (wild fauna for Boult-aux-bois and domestic fauna for Louvois).

235 However, to our surprise, we found that more than two-thirds of blood-fed Culicoides, with

236 both markers, have fed on horses. We underline that in trapping site at Louvois farm, there

164
237 were two horses at 400 m from traps. In Boult-aux-Bois, in forest, the nearest horses from the

238 trap (n=6) were at 450m. Analyses from Cyt b show that some blood-fed females that were

239 caught on Boult-aux-bois, took blood meal on donkeys except that the nearest donkeys are at

240 1.3 Km from trap. Lassen et al (2010) collected Culicoides fed on cattle in forest area from

241 800m to nearest cattle. Results showed that the engorged females collected had not fed on the

242 nearest animals. These results indicate also, that blood-engorged Culicoides species may

243 engage in long-distance dispersal, engorged females were still able to cover a distance of

244 about 200 m (Bartsch et al 2009).This may have been caused by wind drift, indeed, it is

245 known that midges are easily carried by wind stream.

246 Unfortunately, no females fed on wild animals were found, the same observations were

247 reported by Bartsch et al (2009), Garros et al (2011) and Ninio et al (2011). It can be assumed

248 that biting midges prefer domestic livestock if available. In addition, as most species of

249 Culicoides are displaying crepuscular or nocturnal behavior (Mellor et al 2000), maybe they

250 prefer to bite domestics animals resting at night instead of wild animals whose in motion at

251 night.

252 We conclude, that results of trapping could not reflect necessarily host availability in the

253 vicinity of the traps as was reported by Garcia-Saenz et al (2011), Garros et al (2011) and

254 Pettersson et al (2013) (Garcia-Saenz et al 2011; Garros et al 2011; Pettersson et al 2013).

255 In addition, our findings on the strong behaviour of autochthonous Culicoides to bite horses

256 despite the existence of large diversity of potential host species, lead us to keep in mind that

257 the probability that outbreaks of African horse sickness virus (AHSV), a closely related BTV,

258 could follow (Mellor 1996; Tabachnick 1996). AHSV is transmitted by the same insect

259 vectors (Mellor and Pitzolis 1979; Hamblin et al 1992; Purse et al 2005; Thiry et al 2006;

260 Meiswinkel et al 2007; Mellor et al 2009; Van den Boom and Oldruitenborgh-Oosterbaan

261 2013). It was previously considered that C. imicola was the only proven Culicoides species

165
262 able to transmit AHSV, but other species have now been identified as potential vectors.

263 During the AHSV-4 outbreak occurring in Spain (Mellor et al 1990), AHSV has been isolated

264 from the northern European BTV vectors, C.obsoletus and C.pulicaris.

265 Since the AHS outbreaks in Spain and Portugal between 1987 and 1990 (Lubroth 1988;

266 Rodriguez et al 1992), the disease has not occurred in Europe. Currently, the disease is

267 gaining ground and advance remarkably northward, in June 2014, AHSV is reported to have

268 spread as far north as Morocco and the Middle East.

269 A spread in Europe could occur first via the transport of infected animals. Even though AHS

270 is a World Organization for Animal Health (OIE)-listed disease, which means that the

271 movement of horses from affected areas is tightly controlled, illegal animal movements could

272 still take place. Although, donkeys, mules or zebras are more likely to be the carrier than

273 horses because these equids that usually have a much longer viraemic period and a lower

274 mortality than horses (Van den Boom and Oldruitenborgh-Oosterbaan 2013). Spread could

275 also occur via the introduction of infected midges by the wind and as impact of climate

276 change (Purse et al 2008). For these reasons, several authors already evoked the threat and

277 warned against the possible introduction and the devastating consequences that could result

278 from such an event (Mellor and Pitzolis 1979; Mellor 1992; Purse et al 2005; Thiry et al 2006;

279 Meiswinkel et al 2007; MacLachlan and Guthrie 2010; Van den Boom and Oldruitenborgh-

280 Oosterbaan 2013). Currently, two European countries are taking seriously the imminent risk

281 of AHS, in fact, since 2007 in the Netherlands and since 2012 in UK a set of rules, regulations

282 and control strategies for AHS in the event that the disease is identified have been prescribed

283 (Defra 2012; Van den Boom and Oldruitenborgh-Oosterbaan 2013). Since the study of blood

284 meal is also an important component in understanding the pathogenic role of haematophagous

285 insects, especially Culicoides, it is more judicious to concentrate efforts to provide a single

286 homogeneous protocol to render studies comparable. Supplementary studies on the diurnal

166
287 activity of Culicoides and their breeding sites and capturing methods could contribute to the

288 understanding of their feeding behavior and provide additional information on their role in the

289 transmission of pathogens.

290 Acknowledgments
291 This work is funded by the CPER project ‘‘Culichamp’’ and by ANSES. The authors thank
292 Sylvette Gobert for proofreading this manuscript.
293 Competing interests

294 The authors declare that they have no competing interests.

295 Authors’ contributions

296 L. Hadj-Henni, J. Depaquit and D. Augot designed this study, carried out data collection, data

297 analysis, data interpretation and composed the paper.

298 P. Noël and A. Germain carried out data collection and data analysis.

299 R. Helder and T. de Meulemeester carried out data collection and data interpretation.
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171
Figure 1: Comparison of PCR results from Cytb and PNOC.

172
 Comparison between PNOC and Cytb by stage of digestion
and color of abdomen
450

400

350

300

250

200

150

100

50

0
Red, fully engorged Abdomens with digested Very digested blood, Totals
abdomens blood Trace of blood

Cytb PNOC

Figure 2: Comparison between sequencing of PNOC and Cytb markers from positive PCR
according to the stage of digestion and color of Culicoides abdomen.

173
 PNOC
70
60
50
40
30
20
10
0

Equus caballus Bos taurus Homo sapiens Totals

160
140 Cyt b
120
100
80
60
40
20
0

Equus caballus Equus asinus Bos taurus Gallus gallus

Felis silvestris Homo sapiens Totals

Figure 3: Origin of blood meals identified on wild-caught Culicoides with both marker.

174
Table I: Sample of blood-fed Culicoides in this study.
Location Trap site GPS trapping Predominant Number of
coordinates method animal species blood-fed
in the vicinity female
of the trap
Boult-aux-Bois In Forest 49° 25′ 55″ UV CDC light Wild boar, roe 91
(Ardenne) N, 4° 50′ 35″ traps deer, red deer
E
Louvois -In Pasture Dogs, cats, 375
(Marne) chickens,
geese, ducks,
49° 6′ 6″ N, UV CDC light pigs, rabbits,
4° 7′ 0″ E traps cattle, goats.
-In the Sheepfolds Sheep 55
-In donkey’s Donkeys, 51
shelter ponies

175
Table II: Primer sequences used in the molecular analysis of blood meals and Culicoides
species identification.
Primers 5’-3’ sequences PCR conditions (This sudy) Primer
references
Blood meal primers
PNOC (R) TGCCTCATAAACTC Haouas et al.,
ACTGAACC 2007.
PNOC (F) GCATCCTTGAGTGT
GAAGAGAA

Cytbvert1D CCATCCAACATYTC This study,

(R) ADCATGA modified from
Cytbvert2D GCHCCTCAGAATG Kocher et al.,
(F) ATATTTGK 1989.

Culicoides primers
C1-N-2191 CAGGTAAAATTAA Simon et
(R) AATATAAACTTCTG al.,1994.
G
C1-J-1718 GGAGGATTTGGAA
(F) ATTGATTAGT

***

176
Chapitre VI : Discussion générale

L'objectif principal de cette thèse était de développer et d’appliquer de nouveaux outils

méthodologiques dans l'étude de la systématique d’espèces proches par une approche de
taxonomie intégrative. Nous avons combiné une approche morphologique classique en utilisant
des clés de diagnose pour identifier nos spécimens et une approche moléculaire en utilisant un
marqueur mitochondrial (COI) et un marqueur ribosomique, le domaine D1D2 du 28S. Nous
avons couplé les approches précedentes par une approche de morphométrie géométrique alaire
très peu utilusée chez les Culcoides. Nous nous sommes intéressés également aux préférences
trophiques des Culicoides présents dans la région Champagne-Ardenne.

Dans le cadre de l’approche intégrative, 536 Culicoides ont été disséqués, montés entre lame et
lamelle et doublement analysés par deux différents marqueurs. Leurs ailes (gauche et droite
quand cela était possible) ont été digitalisées pour l’analyse morphométrique. Les Culicoides
étudiés sont répartis sur 18 espèces, à savoir les espèces appartenant au groupe Obsoletus
(C. obsoletus, C. chiopterus, C. dewulfi et C. scoticus), au sous-genre Culicoides (C. pulicaris,
C. punctatus, C. newsteadi et C. lupicaris) et des espèces du sous-genre Oecacta tels que le
groupe Vexans (C. vexans, C. brunnicans et C. santonicus) et les espèces du groupe
Festivipennis (C. festivipennis, C. clastrieri, C. pictipennis, C. furcillatus et C. alazanicus).
L’espèce type du sous-genre Oecacta, C. furens, était rajoutée à chaque fois aux analyses
incluant des espèces de ce sous-genre, C.nubeculosus était utilisé comme extra-groupe.

Dans une première étude menée sur quatre espèces du groupe Obsoletus et grâce aux analyses
de la géométrie alaire, nous avons détecté une différence significative entre les espèces en se
basant sur la forme et la taille de l’aile. Les valeurs de CS 14 montrent que C. scoticus se
distingue des trois autres espèces. D’après les analyses phylogénétiques et morphométriques,
C. obsoletus et C. scoticus sont plus proches l’un de l’autre que que de C. chiopterus et
C. dewulfi. Ces données suggèrent que le groupe Obsoletus devrait inclure uniquement deux
espèces, à savoir C. obsoletus et C. scoticus (= Obsoletus Complex), au lieu de quatre (si on
l’en se refere uniquement aux ressemblances morphologiques). C. chiopterus et C. dewulfi
devraient être considérés comme deux espèces indépendantes n’appartenant à aucun groupe.
Les résultats d’analyses morphométriques et moléculaires sont congruents. Des données
moléculaires non présentées dans ce travail (Augot, comuunication personelle) montrent en
outre la paraphylie solidement soutenue du groupe Obsoletus incluant 4 espèces.

14
Centroid Size

177
Nous nous sommes intéressés au sous-genre Culicoides en raison du rôle vecteur de certaines
de ces espèces d’une part et d’autre part car la systématique de ce sous-genre, reste à ce jour
très problématique, en effet, les C.pulicaris de France (24) pourraient être similaires aux
C.pulicaris P3 capturés en Espagne (41). Dans le groupe Newsteadi, les analyses moléculaires
identifient trois différentes populations dont la valeur spécifique peut être prpoposée ou discutée
(41). Les ailes des C.newsteadi capturés aux Pays-Bas sont différentes de celles du spécimen-
type de la description originale de l’espèce (211), mais elles sont similaires aux ailes des
C. newsteadi N1 ou N2 identifiés en Espagne (41). Les ailes de C. paradoxalis (une espèce
recemment décrite dans le sous-genre Culicoides), ressemblent aux ailes de C. lupicaris. Au
niveau moléculaire, cette nouvelle espèce est inclue dans le même clade que C. newsteadi et
C. punctatus (212). Notre approche de taxonomie intégrative inclue des espèces sympatriques
du groupe Pulicaris (C. lupicaris, C. pulicaris, C. punctatus) et C. newsteadi collectées en
France. Notre echantillonnage inclue également des ailes de référence (24, 196, 213), des ailes
digitalisées sur des types ou des dessins d’ailes provenant des études publiées (41, 47, 212,
214).

Les résultats de l’analyse par géométrie alaire montrent qu’au moins 90% des spécimens ont
été correctement attribués à leurs espèces respectives. Les résultats de l’approche moléculaire
sont congruents avec ceux de l’approche morphométrique. Tous nous échantillons de
C. newsteadi se classent avec les C. newsteadi N5 de Genbank. Nos échantillons de C. lupicaris
et C. punctatus sont bien groupés. Concernant l’espèce C. pulicaris, nous avons constaté que
dans notre échantillonnage il existe deux populations dont une que nous avons nommé
C. pulicaris P1 car nos séquences se groupent avec les séquences de C. pulicaris P1 de
Genbank. Notre deuxième population de C. pulicaris inclue uniquement nos échantillons et
pour lesquels nous n’avons trouvé aucune homologie dans Genbank et que nous avons nommé
C. pulicaris PU (pour Unkown= inconnu), car d’après nos résultats, le statut taxonomique des
C. pulicaris PU reste ambigu, en effet, s’agit-il d’une variance génétique de C. pulicaris ? Ou
s’agit-il d’une nouvelle espèce dans le sous-genre Culicoides comme C. paradoxalis ? Les
résultats de l’approche par géométrie alaire sont en accord avec ceux de l’étude moléculaire.
Cela suggère que la nervation des ailes serait un caractére phylogénétique interéssant. Des
études morphologiques et moléculaires supplémentaires restent donc nécessaires sur un plus
grand nombre d’individus avant de conclure.

Nos observations sur le sous-genre Culicoides nous ont poussés à explorer la systématique d’un
autre groupe problématique : le sous-genre Oecacta qualifié du sous-genre « fourre-tout ».

178
Nous avons échantillonné des espèces appartenant au groupe Festivipennis (sensu lato), elles
sont sympatriques et bien représentèes dans la région. Nous avons egalement eu acces à des
espèces très proches appartenant au groupe Vexans.

Nos résultats de taxonomie intégrative sur C. brunnicans, C.pictipennis, C. festivipennis et

C. clastrieri (groupe Festivipennis) sont non congruents car l’identification classique basée sur
des critères morphologiques, la géométrie alaire et l’identification moléculaires sont en
désaccord. En effet, l’application de la géométrie alaire et l’étude moléculaire sont en accords
pour séparer C. brunnicans et C.pictipennis. Cependant, les deux analyses mettent en évidence
un complexe d’espèces appartenant à un clade constitué de C. festivipennis/C. clastrieri.
L’analyse par géométrie alaire montre que le dessin de l’aile de référence pour C.festivipennis
de Delécolle (1985) se groupe avec les spécimens de C.clastrieri.
C. festivipennis et C. clastrieri peuvent être morphologiquement séparées grâce aux différents
critères tels que les motifs sur les ailes, la distribution des sensilles sur les antennes et le nombre
d’épines cibariales. Grâce à l’approche de taxonomie intégrative, nous avons donc pu mettre en
évidence l’existence d’une plasticité génétique chez ces Culicoides et nous proposons une
nouvelle nomenclature pour ces deux espèces : C. festivipennis morphe festivipennis et
C.festivipennis morphe clastrieri. Ce travail montre la difficulté de définir une espèce chez les
Culicoides.

Concernant le groupe Vexans (C. brunnicans, C. vexans et C. santonicus), les résultats

préliminaires de nos travaux confirment et valident leur statut d’espèce notamment pour
C. santonicus. Nous avons également constaté que ces trois espèces sont phylogénétiquement
proches (inclues dans le même clade).
L’inclusion d’un spécimen de C. furens, l’espèce type du sous-genre, indique que les deux
groupes étudiés, à savoir Festivipennis et Vexans sont chacun monophylétique et que C. furens
se positionne en dehors de ces clades. Néanmoins nous ne pourrons pas tirer de conclusions
quant à la position systématique de ces groupes au sein du sous-genre Oecacta malgré nos
resultats très encourageants.
Dans un volet comportemental, nous avons étudié les préférences trophiques des Culicoides
capturés dans deux localités dans la région Champagne-Ardenne avec une grande diversité
animale. Nous avons aussi comparé deux marqueurs utilisés dans ce genre d’étude, à savoir un
marqueur moléculaire, le PNOC (prepronociceptin gene) et un marqueur mitochondrial, le Cytb
(Cytochrome b gene) des vertébrés.

179
L’étude des préférences trophiques des Culicoides autochtones est essentielle afin d'évaluer le
risque de transmission et de prendre des mesures de luttes. Egalement, une meilleure
connaissance dans ce domaine pourrait aider à identifier les réservoirs d’animaux pour les
arbovirus le cas échéant.
Durant ces travaux de thèse nous avons piégé uniquement la nuit. Nous proposons pour mieux
connaitre les préférences trophiques des Culicoides de piéger même en journée dans la forêt
pour capturer les espèces diurnes et multiplier les fréquences de piégeages.

Nous avons trouvé également que certains individus se sont gorgés sur des espèces animales se
trouvant loin des sites de piégeages, cela indique que les Culicoides peuvent se transporter
aisément soit activement soit aidés par le vent.

Dans notre étude, très peu de Culicoides se gorgeaient sur le bétail, contrairement à d’autres
études (215–217) durant lesquelles les Culicoides semblent nettement préférer se gorger sur les
animaux d’élevage.

Malgré la présence d’un large éventail d’espèces animales dans nos sites d’études, les
Culicoides se gorgent étrangement sur les Chevaux. Parmi ces espèces qui se gorgent sur
chevaux on retrouve des espèces des groupes Obsoletus et Pulicaris, les vecteurs majeurs du
virus de FCO et du SBV en Europe.

Nous avons également évalué deux différents marqueurs le PNOC et le Cytb pour identifier
l’origine des repas sanguins en fonction du stade de la digestion. D’après notre étude, le PNOC
ne distingue pas les espèces affines, également c’est un marqueur moins sensible lorsque le
stade de digestion du sang est avancé. Le Cytb a réussi à identifier l’origine des repas sanguins
sur les deux premiers stades choisis pour cette étude mais non pas sur les abdomens avec un
stade de digestion très avancé. Le Cyt b différencie bien l’âne et le cheval mais aussi il identifie
bien les oiseaux contrairement au PNOC. Le Cyt b est donc plus sensible et plus spécifique que
le PNOC.

180
Chapitre VII : Conclusions générales et perspectives

La taxonomie intégrative semble être un très bon outil pour réviser la systématique du genre
Culicoides dans son ensemble, En effet, à titre d’exemple, plusieurs espèces montrent de
variations morphologiques telles que C. circumscriptus avec ses différentes configurations
alaires (218) ou encore C. salinarus et C. manchuriensis qui semble être une seule et unique
espèce, en plus ses trois espèces ne sont pas groupées dans le sous-genre Beltranmyia dans
l’étude moléculaire de Ander et al (2013) (116).

La géométrie alaire basée sur les landmarks se montre comme un bon outil pour séparer les
populations (C. pulicaris dans notre étude). En outre des photos de lames de références ou de
lame porte-type pourront être inclues dans ces analyses. Contrairement aux études moléulaires,
cet outil sera encore plus utile, si, les auteurs travaillant sur la taxonomie et l’identification des
Culicoides puissent inclure à leurs publications et d’une façon systématique, tout comme pour
les séquences moléculaires, des photos d’ailes des espèces étudiées et de pouvoir créer ainsi
une banque de photos en ligne accessible à l’image de « Genbank ». Cela permettrait à l’avenir
d’identifier une espèce seulement à partir d’une photographie de son aile. L’identification par
géométrie alaire pourrait constituer également une alternative plus rapide et moins couteuse
pour l’identification des espèces jumelles par exemple dans le cadre de l’entomosurveillance.
En effet, les études moléculaires mettent en évidence plusieurs espèces jumelles notamment au
sein des vecteurs tels que C. obsoletus avec ces formes (O1-O3), C. pulicaris (P1, P3, dark
pulicaris…) C. newsteadi (N1-N5) (41, 116, 219). L’identification fiable des espèces revêt une
importance primordiale pour étudier les compétences trophiques et les capacités vectorielles
des espèces jumelles.

181
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204
Annexe 1 Liste des espèces de Culicoides en France, classées selon leur sous-genre ou

groupe morphologique (27).

Sous-genre Espèces
Avaritia C. chiopterus, C. dewulfi, C. imicola, C. montanus,
C. obsoletus, C. scoticus, C. abchazicus
Beltranmyia C. circumscriptus, C. salinarius, C. sphagnumensis,
C. manchuriensis
Culicoides C. deltus, C. fagineus, C. flavipulicaris, C. grisescens,
C. impunctatus, C. lupicaris, C. newsteadi, C. pulicaris,
C. punctatus, C. subfagineus, C. paradoxalis
Monoculicoides C. parroti, C. puncticollis, C. nubeculosus, C. riethi,
C. stigma, C. helveticus
Pontoculicoides C. tauricus, C. saevus, C. ibericus
Silvaticulicoides C. achrayi, C. fascipennis, C. pallidicornis, C. picturatus,
C. subfasciipennis
Synhelea C. corsicus, C. semimaculatus
Wirthomyia C. cameroni, C. minutissimus, C. riouxi, C. segnis,
C. reconditus
Oecacta C. albihalteratus, C. cataneii, C. duddingstoni,
C. gejgelensis, C. comosioculatus, C. heliophilus,
C. alazanicus, C. simulator, C. vidourlensis, C. jumineri,
C. kurensis, C. kibunensis, C. paradisionensis, C. riebi,
C. jurensis, C. heteroclitus, C. begueti, C. haranti,
C. brunnicans, C. santonicus, C. vexans, C. albicans,
C. caucoliberensis, C. submaritimus, C. maritimus,
C. maritimus paucisensillatus, C. griseidorsum,
C. pictipennis, C. poperinghensis, C. univittatus,
C. clastrieri, C. festivipennis, C. paolae, C. shaklawensis,
C. dendriticus, C. furcillatus, C. derisor, C. dzhafarovi,
C. malevillei, C.indistinctus, C. odiatus, C. longipennis,
C. sahariensis, C. truncorum, C. clintoni, C. pseudopallidis,
C. tbilisicus

205
 Espèces incertae sedis d’après Delecolle 1985 (24).
Groupe Festivipennis (sl)
Sous-groupe Festivipennis
Sous-groupe Cataneii
Sous-groupe Simulator
Sous-groupe Kibunensis
Sous-groupe Pictipennis
Sous-groupe poperinghensis
Groupe Vexans (sl)
Sous-groupe Vexans (ss)
Sous-groupe Truncorum
Groupe Albihalteratus
Groupe Comosioculatus
Groupe Heliophilus
Groupe Kurensis
Groupe Begueti
Groupe Maritimus
Groupe Furcillatus
Groupe Derisor
Groupe Odiatus
Groupe Sahariensis
Groupe semimaculatus
*Sl = Sensu lato
*ss= Sensu stricto
C. clastrieri, C. festivipennis, C. paolae, C. shaklawensis
C. cataneii, C. duddingstoni, C. gejgelensis
C. alazanicus, C. simulator, C. vidourlensis
C. kibunensis, C. paradisionensis, C. riebi, C. jurensis,
C. heteroclitus
C. griseidorsum, C. pictipennis, C. univittatus
C. poperinghensis
C. vexans, C. albicans, C. brunnicans, C. santonicus
C. truncorum, C. clintoni
C. albihalteratus
C. comosioculatus
C. heliophilus
C. jumineri, C. kurensis
C. begueti, C. haranti
C. caucoliberensis, C. submaritimus, C. maritimus,
C. maritimus paucisensillatus
C. dendriticus, C. furcillatus
C. derisor, C. dzhafarovi, C. malevillei
C.indistinctus, C. odiatus
C. longipennis, C. sahariensis
C. semimaculatus
206
Annexe 2 : Liste des sous-genres composant le genre Culicoides (Extrait de « World species

of biting midges (Diptera : Ceratopogonidae) », Borkent, 2014)

Genus Culicoides Latreille

CULICOIDES Latreille, 1809: 251. Espèces Type : Culicoides punctatus Latreille (=

Ceratopogon punctatus Meigen), by monotypy.

1. AMOSSOVIA Glukhova, 1989 (as subgenus of Culicoides). Type species: Culicoides

dendrophilus Amosova, by original designation.

2. ANILOMYIA Vargas, 1960 (as subgenus of Culicoides).Type species: Culicoides

covagarciai Ortiz, by original designation.

3. AVARITIA Fox, 1955 (as subgenus of Culicoides). Type species: Ceratopogon

obsoletus Meigen, by original designation.

4. BELTRANMYIA Vargas, 1953 (as subgenus of Culicoides). Type species: Culicoides

crepuscularis Malloch, by original designation.

5. COTOCRIPUS Brèthes, 1912. Type species: Cotocripus caridei Brèthes, by

monotypy.

6. SILVICOLA Mirzaeva and Isaev, 1990 (as subgenus of Culicoides). Type species:
Culicoides grisescens Edwards, by original designation.

7. DIPHAOMYIA Vargas, 1960 (as subgenus of Culicoides). Type species: Culicoides

baueri Hoffman, by original designation.

8. DRYMODESMYIA Vargas, 1960 (as subgenus of Culicoides). Type species:

Culicoides copiosus Root and Hoffman, by original designation.

9. FASTUS Liu, in Yu et al., 2006 (as subgenus of Culicoides). Type species: Culicoides
alpigenus Yu and Liu, by original designation.

10. GLAPHIROMYIA Vargas, 1960: 41 (as subgenus of Culicoides). Type species:

Culicoides scopus Root and Hoffman, by original designation.

11. HAEMOPHORUCTUS Macfie, 1925. Type species: Haemophoructus maculipennis

Macfie, by monotypy.

207
12. HAEMATOMYIDIUM Goeldi, 1905. Type species: Haematomyidium paraensis
Goeldi, by original designation.

13. HOFFMANIA Fox, 1948 (as subgenus of Culicoides). Type species: Culicoides
inamollae Fox and Hoffman (= Culicoides insignis Lutz), by original designation.

14. JILINOCOIDES Chu, 1983 (as subgenus of Culicoides). Type species: Culicoides
dunhuaensis Chu, by original designation.

15. MACFIELLA Fox, 1955 (as subgenus of Culicoides). Type species: Ceratopogon
phlebotomus Williston, by original designation.

16. MARKSOMYIA Bellis and Dyce, 2011 (as subgenus of Culicoides). Type species:
Culicoides marksi Lee and Reye, by original designation.

17. MATAEMYIA Vargas, 1960 (as subgenus of Culicoides). Type species: Culicoides
mojingaensis Wirth and Blanton, by original designation.

18. MEIJEREHELEA Wirth and Hubert, 1961 (as subgenus of Culicoides). Type species:
Ceratopogon guttifer de Meijere, by original designation.

19. MONOCULICOIDES Khalaf, 1954 (as subgenus of Culicoides). Type species:

Ceratopogon nubeculosus Meigen, by original designation.

20. NULLICELLA Lee, 1982 (as subgenus of Culicoides). Type species: Culicoides
lasaensis Lee, by original designation.

21. OECACTA Poey, 1853. Type species: Oecacta furens Poey, by monotypy.

22. PONTOCULICOIDES Remm, in Remm and Zhogolev, 1968 (as subgenus of

Culicoides). Type species: Culicoides tauricus Gutsevich, by original designation.

23. PSYCHOPHAENA Philippi, 1865. Type species: Psychophaena pictipennis.

24. REMMIA Glukhova, 1977 (as subgenus of Culicoides). Type species: Ceratopogon
schultzei Enderlein, by original designation.

25. SELFIA Khalaf, 1954 (as subgenus of Culicoides). Type species: Culicoides
hieroglyphicus Malloch, by original designation.

26. SILVATICULICOIDES Glukhova, 1977 (as subgenus of Culicoides). Type species:

Ceratopogon fascipennis Staeger, by original designation.

208
 27. SINOCOIDES Chu, 1983: 26 (as subgenus of Culicoides). Type species: Culicoides
hamiensis Chu, Qian and Ma, by original designation.

28. SYNHELEA Kieffer, 1925. Type species: Culicoides tropicalis Kieffer, designation by
Wirth et al., 1980: 160.

29. TRITHECOIDES Wirth and Hubert, 1959 (as subgenus of Culicoides). Type species:
Culicoides flaviscutatus Wirth and Hubert, by original designation.

30. TOKUNAGAHELEA Dyce and Meiswinkel, 1995 (as subgenus of Culicoides). Type
species: Culicoides mikros Dyce and Meiswinkel, by original designation.

31. WIRTHOMYIA Vargas, 1973 (as subgenus of Culicoides). Type species: Culicoides
segnis Campbell and Pelham-Clinton, by original designation.

Les groupes d’espèces d’aprés Borkent 2014 :

1-Subgenus unplaced, acotylus species group

2-Subgenus unplaced, albovenosus species group

3-Subgenus unplaced, antennalis species group

4-Subgenus unplaced, bancrofti species group

5-Subgenus unplaced, carpenteri species group

6-Subgenus unplaced, chaetophthalmus species group

7-Subgenus unplaced, clavipalpis species group

8-Subgenus unplaced, coronalis species group

9-Subgenus unplaced, costalis species group

10-Subgenus unplaced, daedalus species group

11-Subgenus unplaced, dasyophrus species group

12-Subgenus unplaced, dekeyseri species group

13-Subgenus unplaced, eublepharus species group

14-Subgenus unplaced, fluvialis species group

209
15-Subgenus unplaced, immaculatus species group

16-Subgenus unplaced, inornatipennis species group

17-Subgenus unplaced, kusaiensis species group

18-Subgenus unplaced, leoni species group

19-Subgenus unplaced, limai species group

20-Subgenus unplaced, marksi species group

21-Subgenus unplaced, melanesiae species group

22-Subgenus unplaced, milnei species group

23-Subgenus unplaced, mohave species group

24-Subgenus unplaced, molestus species group

25-Subgenus unplaced, monticola species group

26-Subgenus unplaced, neavei species group

27-Subgenus unplaced, nigripennis species group

28-Subgenus unplaced, ornatus species group

29-Subgenus unplaced, pachymerus species group

30-Subgenus unplaced, palmerae species group

31-Subgenus unplaced, piliferus species group

32-Subgenus unplaced, purus species group

33-Subgenus unplaced, reticulatus species group

34-Subgenus unplaced, shermani species group

35-Subgenus unplaced, stigmalis species group

36-Subgenus unplaced, stonei species group

37-Subgenus unplaced, shortti species group

210
38-Subgenus unplaced, victoriae species group

39-Subgenus unplaced, williwilli species group

40-Miscellaneous unplaced species

211
 Taxonomie intégrative des Culicoides (Diptera : Ceratopogonidae) de la

région Champagne-Ardenne

Résumé

Plusieurs systématiques se côtoient aujourd’hui : la systématique typologique, d’inspiration

linnéenne, qui repose sur l’examen morphologique de types porte-nom.et depuis plusieurs
années, une systématique phylogénétique conduit également à la création de taxons nouveaux,
de niveau spécifique, infra-spécifique et supra-spécifique.
Dans ce travail, nous avons cherché une approche globale, qualifiée de taxonomie intégrative
couplant les approches morphologiques traditionnelles, la systématique moléculaire et la
geomorphométrie alaire, dans le but d’éclairer la notion d’espèce chez les Culicoides avec ses
corollaires épidémiologiques, étant donnée l’importance de ces insectes dans des maladies
majeures d’intérêt vétérinaire telles que la fièvre catarrhale ovine et la maladie causée par le
virus de Schmallenberg.
Cette approche nous a permis de mettre en lumière la complexité systématique des espèces
affines (C. clastrieri/C. festivipennis, les groupes Obsoletus, Pulicaris et Vexans).
D’un point de vue biologique, nous nous sommes intéressés aux préférences trophiques des
Culicoides de la région Champagne-Ardenne qui montrent une forte attirance pour les Equidés.

Mots-Clefs : Taxonomie intégrative, Culicoides, préférence trophique

Abstract
Several systematic coexist today: typological systematic of Linnaean spirit, based on
morphological examination of type specimens. For several years, a phylogenetic systematics
also led to the creation of new taxa, at specific, sub-specific and supra-specific level.
In this study, we have sought a comprehensive approach i.e. an integrative taxonomy that
coupling traditional morphological approaches, molecular systematic and wing geometry
morphometric in order to clarify the concept of species in the Culicoides with epidemiological
corollaries, given the importance of these insects in major diseases of veterinary interest such
as bluetongue and the disease caused by the Schmallenberg virus .
This approach allowed us to highlight the systematic complexity of related species (C. clastrieri
/ C. festivipennis, the Obsoletus, Pulicaris and Vexans groups).
In addition, we investigated the host preference of Culicoides of the Champagne-Ardenne
region.

Keywords: Integrative taxonomy, Culicoides, host preference

Adresse : Usc Vecpar-ANSES LSA, EA4688, UFR Cap Santé, Université de Reims
Champagne-Ardenne, 51 rue Cognacq-Jay, 51096 Reims Cedex, France.

212