Rapport sur les travaux effectus

I- Travaux de thse : tude des signaux impliqus dans le dcalage de phase programm de type -1.
La traduction des ARN messagers en protines est effectue avec rapidit et prcision par une machinerie complexe centre autour du ribosome. Chez la bactrie Escherichia coli, la lecture des messages seffectue une vitesse de 20 acides amins par seconde, avec une frquence d'erreur de l'ordre de 3x10-4. Parmi les erreurs possibles la moins frquente est le changement en cours de route du cadre de lecture du ribosome; il ne contribue en effet que pour un dixime du total des erreurs. Toutefois, dans certaines situations trs particulires, il peut devenir prpondrant, au point de se produire avec une frquence environ 105 fois plus forte. Dans ces situations, le changement de phase est qualifi de programm car il est caus par une courte squence existant dans l'ARN messager et parce qu'il a un rle biologique certain. Les exemples les mieux connus sont trouvs chez les rtrovirus et certains lments transposables bactriens (1, 2, 3). Dans ces deux cas, le dphasage se produit dans une rgion de chevauchement entre deux cadres de lecture conscutifs, le second tant dans la phase -1 par rapport celle du premier, avec pour consquence la synthse d'une protine de fusion des deux cadres. Chez les rtrovirus, la protine de fusion ainsi engendre (la polyprotine GagPol) s'associe avec la protine Gag pour former les particules nuclocapsidiques la base de l'assemblage des virions, et le dphasage est essentiel pour la production de particules virales infectieuses (4). Chez les lments transposables bactriens de la famille IS3, le produit de fusion entre les cadres orfA et orfB est la transposase OrfAB (2). Le dphasage 1 apparat alors comme un moyen de contrler la mobilit d'lments qui doivent vivre en relative bonne intelligence avec le gnome qui les hberge. Bien que le dcalage de phase programm de type 1 ait t dcouvert chez les procaryotes (5), son tude a t ralise principalement chez les eucaryotes avec lanalyse des rgions de dphasage des rtrovirus. Si de nombreux cas de dphasage programm existent probablement chez lsont supposs dans des squences dinsertion bactriennes etou dans des gnes phagiques, une analyse dtaille des squences impliques nen avaita t ralise que pour le gne dnaX dE. coli. (6). Lors de ma thse, jai essay de mieux comprendre la faon dont le ribosome assure une traduction fidle des ARN messagers travers ltude fine des signaux perturbateurs dune squence dinsertion bactrienne, IS911.
a)

Analyse de la rgion de dphasage dIS911.

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Jai tout dabord contribu la caractrisation de la rgion de dphasage programm 1 de la squence dinsertion IS911, dcouverte en 1991 (7). Le site de glissement est un motif heptamrique AAAAAAG entour de deux squences augmentant lefficacit du dphasage : une squence Shine-Dalgarno en amont et une tige-boucle en aval. Lorganisation et la squence de cette rgion sont trs proches de celles de dnaX, mais leurs niveaux de dphasage sont trs diffrents (de lordre de 50% pour dnaX et 106% pour IS911). Les stimulateurs ont t analyss par mutagnse dirige pour dterminer les raisonsdiffrences responsables de cette diffrence du niveau de dphasage. Le stimulateur aval de IS911 prsente une structure en tige-boucle particulire: une tige basale est surmonte. La boucle est elle-mme structure deen deux tigesboucles, l'ensemble formant une structure en Y (8). Des dltions des bras suprieurs du Ydans cette structure ont mis en vidence qu'il taite la prsence de cette grande boucle est responsable de lsa stimulation limite du dphasage. Enfin, lanalyse du stimulateur amont du dphasage a t ralise. En particulier, nous avons montr que la force de linteraction entre la SD et lARNr 16S module lefficacit du dphasage (9). Effet du contexte immdiat en 3 du motif AAAAAAG. Nous avons pu montrer que Dans le dphasage programm de type 1, pouvait tre modul par un autre facteur q'uneleffet stimulateur de la tige-boucle aval ou unede la bote SD amont a souvent t dcrit. Or il semble quun autre moyen de rguler lefficacit du dphasage existe. Lors dexpriences de mutagense systmatique du signal IS911, il m'est en effet apparu que la nature des six nuclotides qui suivent le motif glissant influe sur le niveau de changement de phase (jusqu une stimulation d'un facteur 3 4). Jai donc cherch tablir les rgles de l'effet des 6 nuclotides aval, notamment en relation avec les deux autres lments stimulateurs (rgion SD et tige-boucle) et avec le motif glissant pour essayer comprendre, l'aide du signal d'IS911, les mcanismes molculaires du dphasage programm 1 chez E. coli.chez IS911.

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La premire tape a consist modifier alatoirement les 6 nuclotides jouxtant le motif de glissement afin de gnrer une grande srie de mutants. Les diffrents mutants obtenus produisent de 41 6325% de protine de fusion alors que la squence sauvage en produit 160%. Ensuite, dans la squence de six nuclotides que nous avons modifie, il semble que seule la nature du premier nuclotide soit le dterminant primordial de l'effet sur le dphasageinfluence la quantit de protine de fusion : 3420% en moyenne de dphasage pour une pyrimidine et de, 1150% pour une purinepour une adnine, et 5% pour une guanine. Leffet du contextes 3 est toujours indpendant desobserv si lon dlte les stimulateurs SD et tige-boucle., et iIl nest pas du la consquence d'une variation selon les mutants de la stabilitune dstabilisation de lARNm ou des protines. Leffet du contexte 3 est donc trs vraisemblablement du un effet traductionnel vrai. Jai ensuite test si des proprits inhrentes lARNt (quantit, vitesse dentre au site A, ajustement avec le peptidyl-ARNt au site P,) dterminaient les variations de frquence de dphasage releves par leffet contexte 3. Jai surexprim les diffrents ARNt intervenant cette position, mais le niveau de dphasage nest pas modifi. Nous avons propos un modle pour expliquer cet effet du contexte 3 sur le dphasage. Le nuclotide suivant le motif, via son "stacking" sur l'hlice codon-anticodon, influerait directement sur le niveau du dphasage en stabilisant plus ou moins linteraction de lARNt lysine dcodantsur le codon AAG du le motif glissant (10). b) Etude systmatique des heptamres glissants de type XXXYYYZ. Llment indispensable au dphasage et pourtant peu tudi est le motif heptamrique. Il existe 64 motifs possibles de squence XXXYYYZ (X, Y, et Z pouvant tre identiques). Seul un nombre limit dentre eux est trouv dans les rgions de dphasage identifies ce jour. Jai donc tudi leffet sur la traduction des 64 motifs heptamriques dans un contexte identique. Une telle analyse na t ralise que partiellement (44 motifs tests sur 64) et uniquement en systme eucaryote (11). Ces expriences mont permis de rpondre deux questions. Tout dabord, la prsence dun heptamre XXXYYYZ est insuffisante pour gnrer un taux de dphasage lev. Seuls quelques motifs (souvent retrouv dans les sites de glissement des IS) produisent une augmentation du taux derreur du ribosome, et ces motifs sont caractriss par le fait que leur squence XXXYYY est homogne, c'est--dire constitue uniquement de purines ou uniquement de pyrimidines. Lorsque les heptamres sont en contexte IS911 (en prsence de deux stimulateurs), on retrouve les mmes rsultats avec seulement 13 motifs donnant un niveau de dphasage suprieur 1%. Ici encore, les heptamres efficaces pour le dphasage sont homognes sur leur squence XXXYYY. Une autre observation rvle que les motifs o la squence YYYZ est homogne sont sensibles la prsence des stimulateurs dIS911.

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Le fait que les motifs homognes soient plus efficaces promouvoir le dphasage dcoule de la nature mme du code gntique. En effet, un ARNt est capable le plus souvent de dcoder deux codcons synonymes de la forme NN(U/C) ou NN(A/G). Cela signifie que pour la majorit des heptamres homognes, lLes 2 ARNt entrant en phase 0 sur les codons XXY et YYZ sont galement utiliss pour la lecture des codons XXX et YYY. Ces rsultats permettent galement de mieux comprendre le dphasage programm chez les procaryotes. Chez IS911, le dcalage de phase lieu sur un motif X-XXY-YYZ, de sorte que le glissement en phase -1 conserve sur les 2 premires positions au moins l'appariement des deux ARNt ayant lu les codons XXY et YYZ (12). Le dphasage peut avoir lieu diffrents moments de llongation, soit quand les deux ARNt dcodent XXY-YYZ, soit quand un seul ARNt dcode YYZ. En contexte non stimul, cest le premier phnomne qui est prpondrant puisque les motifs les plus efficaces sont ceux qui sont homognes sur la partie XXXYYY. En prsence de stimulateurs, cest le deuxime phnomne qui est prpondrant. Cela nous montre galement que les stimulateurs du dphasage agissent seulement ce moment de la traduction o lARNt-peptidyl se trouve seul dans le ribosome (13)
c)

Fonction biologique du dphasage chez IS911 : rgulation de la transposition. Le dphasage programm permet dans la majorit des cas de produire 2 espces protiques

avec un ratio dtermin. Ce ratio est en gnral ajust pour que les protines accomplissent au mieux leur fonction., ce qui signifie pPour une IS, il s'agit d'assurer son maintien et sa propagation sans pour autant nuire son hte. La variation de ce ratio par modulation du dphasage permettrait donc de rguler cette fonction. Bien que le mcanisme de la transposition (14) et celui du dphasage aient t trs tudis sparment, la relation entre ces deux vnements na pas t regarde.

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Nous avons observ que la squence dinsertion IS911, initialement isoletrouve d'une souche dechez Shigella dysenteriae, est prsente sans changement notable de squence chez toutes lesdans plusieurs autres souches de Sshigella testes.es Par contre, ellemais nest retrouve que dans une proportion limite chezd'isolats clinique d' Escherichia coli et en gnral sous forme mute ou dlte que sous forme mute. Trois de ces variants dIS911 trouvs dans des isolats cliniques dE. coli ont tnt t squencs et leur rgion de dphasage analyse. Ils possdent tous au moins une mutation dans la rgion de dphasage programm. Le premier variant est mut dans la squence de l'heptamrique glissant, le second dans la squence Shine-Dalgarno, et le dernier prsente une insertion de 3 nuclotides dun acide amin aprs le motif glissant. Lanalyse du niveau de dphasage et de la prsence dintermdiaire de la transposition pour chacun de ces mutants a permis de montrer que tous prsentent un niveau de transposition infrieur celui de lIS911 d'originesauvage. Laccumulation de mutations dltres pour lactivit transpositionnelle dIS911 chez E. coli laisse supposer que cetteette squence dinsertion, dans sa forme originelle, serait mal supporte par la bactrie. L'altrationAinsi le contrle prcis par mutation du niveau de dphasage pourrait ainsi permet aussi de avoir permis d'ajustercontrler la mobilit de lIS, et son effet sur la plasticit chromosomique, au seuil de tolrance de l'hte E. coli (15).

d) Rfrences bibliographiques 1 - Chandler M, Fayet O. 1993, Mol. Microbiol., 7 : 497-503. 2 - Mahillon J, Chandler M. 1998, Microbiol Mol Biol Rev., 62 : 725-774. 3 - Gesteland R, Atkins J. 1996, Ann. Rev. Biochem., 65 : 741-768. 4 - Shehu-Xhilaga M, Crowe SM, Mak J. 2001, J Virol, 75(4):1834-1841 5 Dunn JJ and Studier FW. 1983, J Mol Biol. 166(4): 477-535 6 Larsen B, Wills NM, Gesteland RF, Atkins JF. 1994, J Bacteriol. 176(22):6842-6851 7 - Polard P, Prre MF, Chandler M, Fayet O. 1991, J. Mol. Biol., 222(3) : 465-77 8 - Rettberg C, Prre M-F, Gesteland R, Atkins J, Fayet O. 1999, J. Mol. Biol., 286: 1365-1378 9 - Prre MF, Bertrand C, Gesteland R, Atkins J, Fayet O. FunctionnalFunctional analysis of the region of the bacterial transposable element IS911 required for -1 frameshifting and initiation at AUU codon. En prparation 10 - Bertrand C, Prre MF, Gesteland RF, Atkins JF, Fayet O. 2002, Programmed -1 frameshifting on the AAAAAAG sequence is modulated in E. coli by the immediate 3 context. RNA, 8:1-13. 11 - Brierley I, Jenner A. 1992, J. Mol. Biol., 227 : 463-479 12 Jacks T, Madhani HD, Masiarz FR, Varmus HE. 1988, Cell, 55(3) : 447-458 13 Bertrand C, ? Prre MF, Gesteland RF, Atkins JF, Fayet O. Comparative analysis of programmed and non-programmed 1 frameshifting on the 64 X XXY YYZpotential frameshifting heptamers. En prparation
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14 Polard P, Prre MF, Fayet O, Chandler M. 1992, EMBO J. 11: 5079-5090 15 - Licznar P, Bertrand C, Canal I, Prre MF, Fayet O. 2003, Genetic variability of the frameshift region in IS911 transposable elements from Escherichia coli clinical isolates. FEMS Microbiology Letters, 218: 231-237.