Validation-Bio Analytique Thèse DR en Pharmacie

N° Série : ......
/FM/DP/2021
Mémoire de fin d’études

En vue de l’obtention du diplôme
De Docteur en Pharmacie
Thème
Mise au point et validation bioanalytique d’une méthode de

dosage des thiopurines en milieu intra-érythrocytaire par
HPLC-UV
Présenté et soutenu le 19/09/2021
Présenté par :
- BENYZA Souha
- NASRI Nada
Membres du jury :
Pr OUAHAB Ammar - MCA en Génie Pharmaceutique – université de Batna 2 Président
Dr. ACHACHI Nawel - MAHU en Pharmacologie – université de Batna 2 Rapporteur
Dr. ABERKANE Ahlem - MAHU en Pharmacie Galénique- université de Batna 2 Examinateur
Pr. ABDEDDAYEM Mohamed - Professeur en Toxicologie Alimentaire- université de Batna 1 Invité
Année universitaire : 2020-2021

LISTE DES RESPONSABLES DE LA FACULTE DE MEDECINE
LE DOYEN Professeur BENABBES Elmoncif
LE VICE DOYEN A LA GRADUATION Professeur LAHMAR Mourad
LE VICE DOYEN A LA POST GRADUATION Professeur DERDOUS Chawki
LE PRESIDENT DU CONSEIL SCIENTIFIQUE Professeur MAHDJOUB Houria
LISTE DES RESPONSABLES DU DEPARTEMENT DE PHARMACIE
CHEF DE DÉPARTEMENT Docteur OUAHAB Ammar
ADJOINT CHEF DÉPARTEMENT CHARGÉE DE LA Professeur GACEM Hocine

PÉDAGOGIE
ADJOINT CHEF DÉPARTEMENT CHARGÉ DE LA Docteur ZAITER Thamer

POST-GRADUATION ET DES LABORATOIRES
PRESIDENT DU COMITE SCIENTIFIQUE Professeur BEN MOUSSA Mohammed Tahar

LISTE DES ENSEIGNANTS DU DÉPARTEMENT DE PHARMACIE
N° Nom &Prénom Spécialité Module(s) enseigné(s)

PROFESSEUR
1 AYACHE Rachid Physique Physique pharmaceutique
2 BITAM Fatma Chimie organique Chimie pharmaceutique
générale
3 BOURAS Mourad Biochimie-Biologie Biochimie structurale
moléculaire
4 HARKAT Hassina Chimie organique Chimie pharmaceutique
organique
MCA HU
5 BEN MOUSSA Pharmacognosie Pharmacognosie
Mohamed Tahar
6 GACEM Hocine Pharmacologie Pharmacologie
MCA
7 MEGHCHICHE Chimie analytique Chimie analytique
Abdelhak
8 OUAHAB Ammar Génie Pharmaceutique Pharmacie industrielle
MCB HU
/ / /
MCB
9 BAZIZ Karim Biologie végétale Botanique pharmaceutique
10 BELAZOUI Abdelouahab Informatique Biomath-Info/Biostat
11 BELDJOUDI Mouna Biochimie-biologie Biochimie structurale
moléculaire
12 BENSEDDIK Khadidja Biologie moléculaire Génétique
13 CHENINI Halima Chimie analytique Chimie analytique
14 DJENIDI Habiba Biotechnologie Génétique
15 DJOUIMAA Mounir Electronique Biophysique
pharmaceutique
16 FETNI Samira Biochimie-biologie Génétique
moléculaire
17 GUENFOUD Fatiha Chimie organique Chimie minérale
pharmaceutique
18 HALOUI Meriem Neurosciences Biologie cellulaire
19 KHALED Meyada Pharmacologie Pharmacologie
20 MEZAACHE Rofia Chimie organique Chimie pharmaceutique
générale
21 SMAIL Hassen Electrotechnique Biophysique
pharmaceutique
22 ZAOUI Lilia Biologie animale Biologie animale
23 ZIDANI Ghania Electronique Biomath-Info/Biostat
MA HU
24 ABERKANE Ahlem Pharmacie Galénique Pharmacie galénique,
Pharmacie hospitalière
25 ACHACHI Nawel Pharmacologie Pharmacologie
26 AHMANE Amel Pharmacologie Pharmacologie
27 AISSAOUI Mdala Dalal Chimie thérapeutique Chimie thérapeutique
28 AMROUNE Abdelkader Botanique médicale Botanique pharmaceutique
29 BELAID Kaouther Pharmacognosie Pharmacognosie
30 BOUDJEMAA Soumia Toxicologie Toxicologie
31 BOUKHERBACHE Toxicologie Toxicologie
Samira
32 BOULESBIAAT Karim Pharmacologie Pharmacologie
33 BOULKROUNE Ines Toxicologie Toxicologie
34 DJOUAD Seifeddine Chimie thérapeutique Chimie thérapeutique
35 HADJI Aymen Chimie Minérale Hydro-bromatologie
pharmaceutique
36 HAMICI Abderrazek Pharmacie Galénique Pharmacie galénique
37 KHANFRI Yacine Immunologie Immunologie
38 LAICHE Rafika Toxicologie Toxicologie
39 LALAYMIA Youcef Chimie Minérale Chimie minérale
pharmaceutique pharmaceutique
40 MAKHLOUF Youcef Pharmacie Galénique Pharmacie galénique
41 MEZHOUD Ines Biochimie clinique Biochimie clinique
42 ZAITER Thamer Biochimie clinique Biochimie clinique
MAA
43 AMRANI Iman Pharmacie clinique Pharmacie clinique
44 AMRANI Nassima Biologie végétale Biologie végétale
45 BENMASSAOUDA Chimie organique Chimie pharmaceutique
Nadjet organique
46 BERRAK Hakima Biologie animale Biologie cellulaire
47 CHAIRA Safa Développement du Pharmacie industrielle
médicament
48 ELATECHE Zahia Physique Physique pharmaceutique
49 KADRI Keltoum Français Langues vivantes
50 MEZIANE Khadidja Mathématiques Biomath-Info/Biostat
MAB
51 GHECHAMI Naanaa Mathématiques Biomath-Info/Biostat
52 MANSOURI Sakina Physique Physique pharmaceutique
‫قسم الصيدلي‬
‫أقسم باهلل العظيم‬
‫أمام أساتذة الكلية‪ ،‬مستشاري نظام الصيادلة ‪ ،‬وأمام زمالئي‪.‬‬
‫أن أشرف الذين أطروني في هذا الميدان‪ ،‬وأن أشهد – مع‬
‫اعترافاتي ‪ -‬أ ن أبقى وفيا لمن علموني‪.‬‬
‫أن أمارس مهنتي خدمة للصحة العمومية و أال أحترم فقط التشريع‬
‫الساري المفعول بل حتى مبادئ الشرف و النزاهة و اإلستقامة‪.‬‬
‫أن ال أنسى مسؤولياتي و واجبي اتجاه المريض و كرامته‬
‫اإلنسانية‪.‬‬
‫أن ال أسمح في كل حال من األحوال استغالل عملي و معارفي و‬
‫مكانتي لإلخالل باألخالق الفاضلة‪.‬‬
‫فليمنحني الناس ثقتهم و تقديرهم ‪ -‬إن كنت وفيا بعهودي‪-‬‬
‫وليتجاوزوا عن خطئي إن أخللت بشيء منها‪.‬‬
‫" وهللا على ما أقول شهيد "‬
SERMENT DE GALIEN
JE JURE, EN PRÉSENCE DES MAÎTRES DE LA FACULTÉ, DES CONSEILLER

DE L’ORDRE DES PHARMACIENS ET DE MES CONDISCIPLES.
D'HONORER CEUX QUI M'ONT INSTRUIT DANS LES PRÉCEPTES DE MON

ART ET DE LEUR TÉMOIGNER MA RECONNAISSANCE EN RESTANT FIDÈLE
À LEUR ENSEIGNEMENT.
D'EXERCER, DANS L'INTÉRÊT DE LA SANTÉ PUBLIQUE, MA PROFESSION

AVEC CONSCIENCE ET DE RESPECTER NON SEULEMENT LA LÉGISLATION
EN VIGUEUR MAIS AUSSI LES RÈGLES DE L'HONNEUR DE LA PROBITÉ ET
DU DÉSINTÉRESSEMENT.
DE NE JAMAIS OUBLIER MA RESPONSABILITÉ ET MES DEVOIRS ENVERS LE

MALADE ET SA DIGNITÉ HUMAINE, DE RESPECTER LE
SECRET`PROFESSIONNEL
EN AUCUN CAS, JE NE CONSENTIRAI À UTILISER MES CONNAISSANCES ET

MON ÉTAT POUR CORROMPRE LES MŒURS ET FAVORISER DES ACTES
CRIMINELS.
QUE LES HOMMES M'ACCORDENT LEUR ESTIME SI JE SUIS FIDÈLE A MES

PROMESSES.
QUE JE SOIS COUVERT D'OPPROBRE ET MÉPRISE DE MES CONFRÈRES SI

J'Y MANQUE.
REMERCIEMENTS
Nos remerciements vont tout premièrement au bon dieu tout puissant de nous
avoir donné le courage, la volonté et la patience pour réaliser ce travail.
Nous tenons à remercier notre encadrante Dr. ACHACHI Nawel pour avoir
dirigé notre travail, pour son soutien et pour le temps qu’elle consacré au bon
déroulement de ce travail.
Nous exprimons aussi notre profonde gratitude à Pr ABDEDEYEM qui a

accepté de nous accueillir dans son laboratoire et qui nous a beaucoup aidé et
conseillé.
Nos vifs remerciements vont aussi à Mr KAHOUL pour son aide et ses effort
fournis.
Un grand merci à Pr CHERIF qui nous a communiqué son savoir durant ce

travail et même tout au long de notre cursus
Nous sommes très honorés que Pr OUAHAB ait accepté de présider ce jury.
Que Dr ABERKANE et Pr ABDEDDAIM trouvent ici le témoignage de notre
reconnaissance en tant qu’examinateurs du présent travail.
On souhaite remercier toute personne ayant contribuer de près ou de loin à

l’élaboration de ce mémoire.
DEDICACES
Je dédie ce modeste travail et ma profonde gratitude,
À tous celui qui a sacrifié pour m’offrir les conditions propices à ma réussite,
À ma chère mère,
À mon cher père,
À mes chers frères et ma petite sœur,
À toute ma famille
À tous mes amis et collègues
À ma binôme Nada
A tous ceux qui peuvent bénéficier de ce travail à l'avenir, je vous l’offre avec
plaisir
Souha
DEDICACES
Avec l’expression de ma reconnaissance, je dédie ce modeste travail
À mes très chers parents « Lamine et Ouanassa », je vous remercie pour tout le
soutien et l’amour exceptionnel que vous me portez, pour votre patience et vos
sacrifices pour ma réussite.
À mes adorables frères « Alaeddine et Zakaria »
À ma cousine et sœur « Sara » et ma nièce « Line » qui ont été là dans mes
moments de détresse.
À toute ma famille
À mes amies « Wafa, Rayene, Sabrine, Yasmine » et tant d’autres, pour votre
joie de vivre, votre bonne humeur et votre soutien
À ma précieuse binôme « Souha », et à tous nos souvenirs durant ces longues

années d’étude ainsi que toutes nos mésaventures durant la rédaction de ce
mémoire.
À tous ceux qui me sont chers.
Nada
Table des matières
LISTE DES RESPONSABLES DE LA FACULTE DE MEDECINE……………..Ⅱ
LISTE DES RESPONSABLES DU DEPARTEMENT DE PHARMACIE………..Ⅱ
LISTE DES ENSEIGNANTS DU DÉPARTEMENT DE PHARMACIE………….Ⅲ
SERMENT DE GALIEN……………………………………………………………Ⅵ
REMERCIEMENTS………………………………………………………………...Ⅶ
DEDICACES………………………………………………………………………...Ⅷ
Table des matières……………………………………………………………………Ⅹ
Liste des figures……………………………………………………………………XIV
Liste des tableaux…………………………………………………………………..XVI
Liste des abréviations……………………………………………………………...XVII
Introduction ................................................................................................................................ 1
Chapitre 1 : Rappel sur les thiopurines ...................................................................................... 3
1 Définition ........................................................................................................................... 3
2 Structure chimique ............................................................................................................. 3
3 Indications thérapeutiques .................................................................................................. 4
4 Propriétés pharmacocinétiques ........................................................................................... 4
4.1 Absorption des TP ....................................................................................................... 4
4.2 Distribution des TP ...................................................................................................... 4
4.3 Métabolisme des TP .................................................................................................... 5
5 Facteurs modifiant la pharmacocinétique .......................................................................... 6
5.1 Existence de la TPMT ................................................................................................. 6
5.2 Interactions médicamenteuses ..................................................................................... 7
6 Toxicité des thiopurines ..................................................................................................... 7
6.1 Manifestations générales ............................................................................................. 8
6.2 Toxicité hématologique ............................................................................................... 8
6.3 Toxicité hépatique ....................................................................................................... 8
6.4 Toxicité pancréatique .................................................................................................. 8
6.5 Néoplasies .................................................................................................................... 8
Chapitre 2 : Suivi thérapeutique pharmacologique des thiopurines ........................................... 9
1 Généralités sur le STP ........................................................................................................ 9
1.1 Définition de STP ........................................................................................................ 9
1.2 Intérêt de STP .............................................................................................................. 9
1.3 Historique du STP ....................................................................................................... 9
1.4 Types de STP ............................................................................................................. 10
1.4.1 Suivi thérapeutique "prospectif" (A priori) ........................................................ 10
1.4.2 Suivi thérapeutique "rétrospectif" (A posteriori) ............................................... 10
1.5 Modalités pratiques de dosage dans le STP............................................................... 10
1.6 Particularités des médicaments nécessitant une surveillance biologique des taux
sanguins circulants ............................................................................................................... 11
2 Suivi des thiopurines ........................................................................................................ 12
2.1 Suivi pharmacogénétique (Phénotypage / Génotypage) ............................................ 12
2.2 STP des thiopurines ................................................................................................... 14
2.2.1 Phase pré-analytique (prélèvement) ................................................................... 14
2.2.2 Phase analytique ................................................................................................. 14
2.2.3 Phase post-analytique (interprétation) ................................................................ 15
Chapitre 3 : Rappel sur les techniques chromatographiques .................................................... 17
1 Définition ......................................................................................................................... 17
2 La chromatographie en phase liquide............................................................................... 17
2.1 HPLC ......................................................................................................................... 18
2.1.1 Principe............................................................................................................... 18
2.1.2 Appareillage ....................................................................................................... 18
2.2 Types de chromatographie en phase liquide.............................................................. 19
2.2.1 Chromatographie en phase normale ................................................................... 19
2.2.2 Chromatographie en phase inverse .................................................................... 19
2.3 Phases stationnaires et mobiles utilisées en chromatographie en phase liquide........ 20
Chapitre 4 : Validation bio-analytique ..................................................................................... 21
1 Définition ......................................................................................................................... 21
2 Objectifs ........................................................................................................................... 21
3 Cycle de vie d’une méthode ............................................................................................. 22
3.1 Sélection de la méthode ............................................................................................. 22
3.2 Mise au point de la méthode ...................................................................................... 22
3.3 Validation de la méthode ........................................................................................... 23
3.4 Utilisation en routine ................................................................................................. 23
3.5 Revalidation ............................................................................................................... 23
4 Contexte réglementaire .................................................................................................... 24
4.1 Les guidelines de ICH (International Council for Harmonisation) ........................... 24
4.2 FDA (Food and Drug Administration) ...................................................................... 24
4.3 EMA (European Medicines Agency) ........................................................................ 24
5 Terminologie .................................................................................................................... 25
6 Le processus de validation selon l’EMA.......................................................................... 26
6.1 Normes de références ................................................................................................ 26
6.2 Les paramètres de validation ..................................................................................... 26
6.2.1 Sélectivité ........................................................................................................... 26
6.2.2 Spécificité ........................................................................................................... 27
6.2.3 Effet de matrice .................................................................................................. 27
6.2.4 Courbe et gamme d’étalonnage .......................................................................... 27
6.2.5 Exactitude et Précision ....................................................................................... 28
6.2.6 Contamination inter-échantillons (Carry-over) .................................................. 29
6.2.7 Stabilité............................................................................................................... 29
6.2.8 Reproductibilité de réinjection ........................................................................... 29
6.2.9 Rendement d’extraction ..................................................................................... 30
Problématique et objectif ......................................................................................................... 32
Matériel et méthodes ................................................................................................................ 33
1 Lieu et période de réalisation du travail ........................................................................... 33
Il s’agit d’une étude expérimentale, qui a été effectuer au niveau du laboratoire de
Toxicologie Alimentaire au niveau du département d’agronomie (Université de Batna 2), ce
travail nous a pris Six (06) mois « du mois de Février 2021 au mois de Juillet 2021 » entre
mise au point, validation et traitement statistique. ................................................................... 33
2 Matériels ........................................................................................................................... 33
2.1 Appareillage............................................................................................................... 33
2.2 Matières premières .................................................................................................... 34
2.3 Réactifs ...................................................................................................................... 34
2.4 Verreries, consommables et autres ............................................................................ 35
3 Méthode ............................................................................................................................ 35
3.1 Principe de la méthode .............................................................................................. 35
3.2 Mise au point de la méthode de dosage ..................................................................... 36
3.2.1 Préparation des échantillons cliniques ............................................................... 36
3.2.2 Préparation des standards d’étalonnage sans matrice ........................................ 36
3.2.2.1 Solutions mères ........................................................................................... 36
3.2.2.2 Dilution des solutions mères ....................................................................... 37
3.2.3 Préparation des standards de validation ............................................................. 37
3.2.4 Préparation des contrôles-qualité (CQ) .............................................................. 38
3.2.5 Traitement pré-analytique des échantillons........................................................ 38
3.2.6 Préparation de la phase mobile........................................................................... 38
3.2.6.1 Première phase mobile ................................................................................ 39
3.2.6.2 Deuxième phase mobile .............................................................................. 39
3.2.7 Essai chromatographique ................................................................................... 39
3.3 Validation de la méthode bio-analytique ................................................................... 39
3.3.1 Méthodes statistiques et analyse des données .................................................... 39
3.3.2 Procédure de validation ...................................................................................... 40
3.3.2.1 Spécificité et Sélectivité .............................................................................. 40
3.3.2.2 La linéarité .................................................................................................. 40
3.3.2.3 Limite de détection et de quantification...................................................... 40
3.3.2.4 Exactitude et précision ................................................................................ 40
3.3.2.5 Justesse........................................................................................................ 41
3.3.2.6 Rendement d’extraction et effet matrice ..................................................... 41
Résultats ................................................................................................................................... 42
1 Résultats de la mise au point ............................................................................................ 42
1.1 Chromatogrammes obtenus ....................................................................................... 42
1.2 Moyenne des temps de rétention obtenus .................................................................. 45
2 Résultats de validation ..................................................................................................... 45
2.1 Spécificité et Sélectivité ............................................................................................ 45
2.2 Courbes d’étalonnage et linéarité .............................................................................. 47
2.3 Linéarité ..................................................................................................................... 54
2.4 Limite de détection et de quantification .................................................................... 55
2.5 Exactitude et précision............................................................................................... 55
2.6 Justesse ...................................................................................................................... 56
2.7 Rendement d’extraction et effet matrice ................................................................... 56
Discussion ................................................................................................................................ 59
1 Mise au point de la méthode analytique ........................................................................... 59
2 Validation de la méthode bio-analytique ......................................................................... 60
3 Limites de l’étude ............................................................................................................. 62
Conclusion ................................................................................................................................ 63
Résumé ..................................................................................................................................... 76
Liste des figures
Figure 1. Structure chimique de la purine et des thiopurines………………………………….3
Figure 2. Métabolisme simplifié des thiopurines……………………………………………...6
Figure 3. Algorithme de prise en charge thérapeutique des patients sous
Thiopurine dans les MICI en fonction de la TPMT et des 6-TGN/6-MMP………………….13
Figure 4. Schématisation de l’instrumentation HPLC……………………………………….18
Figure 5. Cycle de vie d’une méthode d’analyse…………………………………………….23
Figure 6. Chromatogramme de la phase mobile utilisée……………………………………..42
Figure 7. Chromatogramme obtenu avec le standard d’étalonnage 6-MP sans matrice
à 322nm………………………………………………………………………………………42
Figure 8. Chromatogramme obtenu avec le standard d’étalonnage 6-TGN sans matrice
à 342nm………………………………………………………………………………………43
Figure 9. Chromatogramme obtenu avec le standard d’étalonnage 6-MMP sans matrice
à 303nm………………………………………………………………………………………43
Figure 10. Chromatogramme obtenu avec le DTT à 303nm……………………………...…44
Figure 11. Chromatogramme obtenu avec le DTT à 322nm………………………………...44
Figure 12. Chromatogramme obtenu avec le DTT à 342nm………………………………...45
Figure 13. Chromatogramme d’échantillon de matrice traités sans ajout d’un analyte
à 342nm………………………………………………………………………………………46
Figure 14. Chromatogramme d’échantillon de matrice traités avec ajout de 6-TGN
à 342nm……………………………………………………………………………………….46
Figure 15. Chromatogramme d’échantillon de matrice traités sans ajout d’un analyte
à 303nm………………………………………………………………………………………47
Figure 16. Chromatogramme d’échantillon de matrice traités avec ajout de 6-MMP
à 303nm……………………………………………………………………………………….47
Figure 17. Courbe d’étalonnage du 6-TGN obtenue avec la fonction y=ax+b (série 01)…....48
Figure 18. Courbe d’étalonnage du 6-TGN obtenue avec la fonction y=ax+b (série 02)……49
Figure 19. Courbe d’étalonnage du 6-TGN obtenue avec la fonction y=ax+b (série 03)……50
Figure 20. Courbe d’étalonnage du 6-MMP obtenue avec la fonction y=ax+b (série 01)…...51
Figure 23. Résultats de l’étude de linéarité des trois séries de 6-TGN…………………...….54
Figure 24. Résultats de l’étude de linéarité des trois séries de 6-MMP…………………...…54
Liste des tableaux
Tableau 1. Phases stationnaires et mobiles utilisées en chromatographie en phase
liquide…………………………………………………………………………………………20
Tableau 2. Appareillages utilisés dans le présent travail……………………………….........33
Tableau 3. Matières premières utilisées dans le présent travail ………………………..........34
Tableau 4. Réactifs utilisés dans le présent travail …………………………………….........34
Tableau 5. Verreries, consommables et autres utilisés dans le présent travail………..……..35
Tableau 6. Concentrations des standards d’étalonnage préparés……………………….........37
Tableau 7. Concentrations des standards de validation préparés……………………….........38
Tableau 8. Différentes façons du calcul de la justesse………………………………….........41
Tableau 9. Moyenne des temps de rétention obtenus…………………………...…………...45
Tableau 10. Résultats de dosage du 6-TGN de la première série ………………….………..48
Tableau 11. Résultats de dosage du 6-TGN de la deuxième série …………………………..49
Tableau 12. Résultats de dosage du 6-TGN de la troisième série ……………………..........50
Tableau 13. Résultats de dosage du 6-MMP de la première série …………………………..51
Tableau 14. Résultats de dosage du 6-MMP de la deuxième série ……………..……….…..52
Tableau 15. Résultats de dosage du 6-MMP de la troisième série ……………...…………..53
Tableau 16. Résultats de calculs du LOD et LOQ pour les métabolites 6-TGN et
6MMP………………………………………………………………………………………...55
Tableau 17. Exactitude et précision de dosage du 6-TGN et 6-MMP……………...………..55
Tableau 18. Justesse calculée pour chaque niveau de concentrations des standards de
validation pour le 6-TGN …………………………………………………………………….56
Tableau 19. Justesse calculée pour chaque niveau de concentrations des standards de
validation pour le 6-MMP ……………………………………………………………...…….56
Tableau 20. Résultats de calcul de rendement d’extraction pour 6-TGN……………..……..57
Tableau 21. Résultats de calcul de rendement d’extraction pour 6-MMP………….………..58
Liste des abréviations
ADN : Acide désoxyribonucléique
ARN : Acide ribonucléique
AZA : Azathioprine
B: Bas
BMV : Bioanalitical Method Validation
CC : Chromatography Assay
CCM : Chromatographie en couche mince
CoA : Certifictae of Analysis
CPG : Chromatographie en phase gazeuse
CPL : Chromatographie en phase liquide
CPS : Chromatographie en phase supercritique
CPV : Chromatographie en phase vapeur
CQ : Contrôle Qualité
CV : Coefficient de variation
DPK : Diphosphate kinase
DTT : Dithiothréitol
EDTA : L'acide éthylènediaminetétraacétique
EI : Etalon interne
EMA : European Medecine Agency
FDA : Food and Drug Administration
GC-MS : Chromatographie en phase gazeuse-spectrométrie de masse
GDP : Guanosine diphosphate
GMP : Guanosine monophosphate
GMPS : Guanosine monophosphate synthase
GR : Globule rouge
GTP : Guanosine triphosphate
H: Haut
HPLC: High Performance Liquid Chromatography
HPRT : Hypoxanthine phosphoribosyl transferase
I: Intermédiaire
IATDMCT : Association international de suivi thérapeutique pharmacologique et de
toxicologie clinique
ICH : International Council for Harmonisation
IMPDH : Inosine monophosphate déshydrogenase
IS : Internal Standard
ISO : Organisation internationale de normalisation
ISR : Incurred Sample Reanalysis
ITPA : Inosine triphosphatase
LBA : Ligand Binding Assays
LC-MS : Chromatographie en phase liquide-spectrométrie de masse
LLOQ : Lower Limit of Quantification
LOD : Limit of detection
LOQ : Limit of quantification
MICI : Maladies inflammatoires cryptogéniques de l’intestin
MPK : Monophosphate kinase
PCR : Polymerase Chain Reaction
R² : Coefficient de corrélation
RCH : Rectocolite hémorragique
RE : Erreur relative
STP : Suivi thérapeutique pharmacologique
TDM : Therapeutic drug monitoring
TP : Thiopurine
TPMT : Thiopurine méthyl transférase
ULOQ : Upper Limit of Quantification
VMB : Validation en milieu biologique
XDH : Xanthine oxydase
6-MMP : 6-Méthyl mercaptopurine
6-MP : 6-Mercaptopurine
6-MTGDP : 6-Méthyl thioguanine diphosphate
6-MTGMP : 6-Méthyl thioguanine monophosphate
6-MTGTP : 6-Méthyl thioguanine triphosphate
6-MTIDP : 6-Thiolnosione diphosphate
6-MTIMP : 6- Thiolnosione monophosphate
6-MTITP : 6-Thiolnosione Triphosphate
6-TG/6-TGN : 6-Thioguanine
6-TGMP : 6-Thioguanine monophosphate
6-TGN : 6-Thioguanine nucleotide
6-TGTP : 6-Thioguanine triphosphate
6-TIDP : 6-Thiolnosione diphosphate
6-TIMP : 6-Thiolnosione monophosphate
6-TITP : 6-Thiolnosione triphosphate
6-TUA : Acide 6- Thiourique
6-TX : 6-Thioxanthine
6-TXMP : 6-Thioxanthine monophosphate
INTRODUCTION GENERALE
Introduction
La variabilité de la réponse aux médicaments est à l’origine d’une importante iatrogénie, ainsi
d’une résistance au traitement qui n’est pas moins un problème majeur, parfois aussi coûteux
pour la société que les toxicités [1].
Le suivi thérapeutique pharmacologique de certains médicaments, surtout ceux dont la marge
thérapeutique est étroite, est donc de plus en plus appliqué dans la pratique clinique soit en
routine, soit dans des circonstances spécifiques liées au traitement. En raison des grandes
différences interindividuelles dans le métabolisme des thiopurines chez les patients recevant
des doses identiques de ces médicaments, la surveillance des concentrations de ces agents dans
les érythrocytes a été proposée comme un outil clinique utile pour évaluer l'efficacité et la
toxicité du traitement [2].
Pour quantifier ces médicaments et leurs métabolites dans les prélèvements biologiques, les
méthodes analytiques sont indispensables et de nombreuses méthodes HPLC ont été
développées pour ce but. Ainsi, pour pouvoir être utilisées, ces méthodes doivent être validées
et doivent produire des résultats fiables et reproductibles.
Nous décrivons dans ce travail une procédure de quantification basée sur les publications de
Dervieux et Boulieu[3]et Lennard et Singleton [4], qui permet le dosage rapide au niveau intra-
érythrocytaire de certains métabolites des thiopurines par HPLC, précédé par une validation
analytique selon les recommandations de l’EMA (European Medicines Agency).
Notre étude se compose de deux parties ; une partie théorique et une partie pratique.
➢ La première partie, est une synthèse bibliographique comprenant quatre chapitres.
• Le premier chapitre concerne le rappel pharmacologique sur les thiopurines.
• Le deuxième chapitre s’intéresse au suivi thérapeutique pharmacologique de
thiopurines.
• Le troisième chapitre est un rappel sur les techniques chromatographiques.
• Le quatrième chapitre porte sur la validation analytique d’une technique de dosage dans
un milieu biologique.
➢ La deuxième partie est un travail pratique expérimentale, consiste en une mise au point
d’une technique de dosage des principaux métabolites des thiopurines (6-TG, 6-MMP, et 6-
MP) par HPLC-UV en intra-érythrocytaire, puis en une procédure de validation analytique de
cette technique. Ensuite, nous expliquerons et discuterons les résultats obtenus selon les
recommandations de l'EMA et finalement nous aborderons les contraintes confrontées lors de
la réalisation de ce travail et les perspectives d’avenir.
1
Recherche
bibliographique
2
CHAPITRE 1 : RAPPEL SUR LES THIOPURINES
Chapitre 1 : Rappel sur les thiopurines
1 Définition
Les thiopurines (TP) sont des analogues puriniques dotés de propriétés cytotoxiques et
immunosuppressives. Ils sont très largement utilisés dans le maintien de la rémission des
maladies inflammatoires cryptogéniques de l’intestin (MICI). Cette classe pharmacologique est
représentée par l’Azathioprine et son dérivé la 6-Mercaptopurine (6-MP). Leur métabolisme est
complexe et soumis à un polymorphisme génétique. Il conduit aux 6-thioguanine nucléotides
(6-TGN), métabolites actifs dont les concentrations sont corrélées à la réponse clinique [1,5].
2 Structure chimique
Les thiopurines ont une structure chimique homogène dérivée de la purine qui est à l’origine
des bases puriques (guanine et adénine). Ils possèdent un groupement thiol (sulfhydryle (-SH)
fixé sur un carbone) (figure 1).
L’azathioprine est une pro-drogue de la 6-MP sur laquelle a été greffé un groupement méthyl-
nitro-imidazole sur la fonction thiol, en vue de la protéger d’une oxydation ou d’une hydrolyse.
Pour la 6-TG, elle correspond à la base qui sera directement transformée en nucléotide à
thioguanine [1,6].
Figure 1. Structures chimiques de la purine et des thiopurines. [1]
3
3 Indications thérapeutiques
L’azathioprine ; possédant une action immunosuppressive, a été mise sur le marché en 1968.
Elle a été utilisée dans le traitement des maladies auto-immunes (lupus, myosites, vascularites,
…) et elle a permis les premières transplantations d’organes solides dans les années 1950.
Actuellement, son emploi s’est généralisé dans l’induction, le traitement de fond et la rémission
des MICI, essentiellement représentées par la maladie de Crohn et la rectocolite hémorragique
(RCH).
La 6-MP est largement utilisée dans le traitement des leucémies aigues lymphatiques chez
l’enfant et la 6-TG dans les leucémies aigues myéloïdes, en phases d’entretien et de
consolidation. Elles sont également prescrites à visée palliative dans les leucémies myéloïdes
chroniques [1,5].
4 Propriétés pharmacocinétiques
4.1 Absorption des TP
L'absorption intestinale de l'azathioprine (AZA) varie de 50 à 72 % de la dose initiale

administré, une fois absorbée, 88 % de la dose est rapidement convertie en 6-MP et dérivé nitro-
imidazolé. Le pic de concentration plasmatique est observé après 1 à 2 heures [7].
Celle de La 6-Mercaptopurine (6-MP) est de 50% de la dose initiale administré. Le pic de
concentration plasmatique est observé en moyenne après 2,2 heures.
La 6-MP a une faible biodisponibilité d‘environ 16 % (variation de 5 à 37 %). Une grande partie
de la 6-MP est métabolisée dès son premier passage dans le foie [7,8].
Après une prise orale de 6-TG, le pic plasmatique est observé 4 h après l'ingestion. La
biodisponibilité de la 6-TG varie de 14 à 46 % [7].
4.2 Distribution des TP
Les données de distribution des TP proviennent d’expériences menées chez la souris avec de
l’AZA radiomarquée. Cette étude a montré une distribution relativement homogène du produit
dans l’ensemble du corps. Les TP passent peu dans le liquide céphalo-rachidien mais bien la
barrière placentaire. Par contre, la 6-MP n’a été dosée qu’en de très faibles quantités dans le lait
maternel après prise d’AZA ou de 6-MP, alors que les métabolites des TP se sont révélés
indosables chez les nouveau-nés allaités par des mères traitées par TP [7,9–11].
4
4.3 Métabolisme des TP
L’azathioprine est une prodrogue, rapidement hydrolysée dans le foie en 2 dérivés : la 6-MP
(métabolite actif résorbé à 80% par l’organisme) et le 1- méthyl-4-nitrothioimidazole
(métabolite inactif).
La 6-MP se transforme dans l’organisme selon 3 voies enzymatiques (figure 2) :
• La voie de synthèse de l’acide thiourique sous la dépendance de la xanthine oxydase,
enzyme présente dans de nombreux organes : intestin, foie, rein et leucocytes en particulier.
L’acide thiourique est éliminé dans les urines.
• La voie de synthèse des nucléotides purinergiques qui aboutit à la formation de 6-TGN,
sur lequel repose l’effet thérapeutique de l’azathioprine. Cette réaction est sous la dépendance
de l’hypoxanthine-guanine-phosphoribosyltransférase (HPRT). Les thionucléotides formés
sont des analogues soufrés des mono, di et tri-phosphate-guanosine (GMP, GDP et GTP)
endogènes intervenant dans la synthèse des acides nucléiques [ARN (acide ribonucléique) et
ADN (acide désoxyribonucléique)]. Ces analogues perturbent l’incorporation de ces
nucléotides endogènes en s’y substituant et, par conséquent, interfèrent avec la multiplication
des cellules ayant un cycle de renouvellement rapide. Les 6-TGN sont aussi susceptibles
d’interférer avec les autres fonctions cellulaires des GTP, GDP et GMP (production d’énergie,
signalisation).
• La voie de méthylation en position 6 de la 6-MP par l’intermédiaire de la thiopurine
méthyl transférase (TPMT) avec production de 6-méthylmercaptopurine (6-MMP) et des 6-
méthylthioinosine monophosphate (6-MTIMP), diphosphate (6- MTIDP), triphosphate (6-
MTITP)]. La TPMT est largement distribuée dans l’organisme : intestin, foie, reins, leucocytes,
érythrocytes. Elle fait l’objet d’un polymorphisme génétique susceptible d’influer sur
l’efficacité et la toxicité d’un traitement par l’azathioprine [5,12].
5
Figure 2. Métabolisme simplifié des thiopurines [12].
5 Facteurs modifiant la pharmacocinétique

5.1 Existence de la TPMT
• Polymorphisme de la TPMT
La thiopurine méthyltransférase (TPMT) est une protéine dont la synthèse est sous la
dépendance d’un gène situé sur le bras court du chromosome 6. Ce gène comprend 9 exons. De
nombreuses mutations héréditaires sont identifiées sur ce gène et un certain nombre d’entre
elles entraînent une altération de l’activité enzymatique de la TPMT. Ces mutations peuvent
être transmises selon le mode autosomique récessif.
D’après plusieurs études indépendantes[13–19] , les patients présentant une déficience totale
en TPMT ont pratiquement 100 % de risque de développer une myélotoxicité dans les quelques
semaines qui suivent l’introduction du traitement. Il est à noter que la déficience en TPMT
conduit à un risque majeur de myélosuppression, le seul statut de la TPMT ne peut expliquer
toutes les hématotoxicités [5,20,21].
6
• Polymorphisme de l’ITPA
L’Inosine Triphosphate Pyrophosphatase (ITPA) est une enzyme qui se trouve dans plusieurs
tissus et des leucocytes. L’ITPA catalyse la transformation du 6-Thioinosine 5’-triphosphate
(6-TITP) [figure 1] en 6-Thioinosine 5’-monophosphate (6-TIMP). Un déficit en ITPA conduit
à une accumulation de 6-TITP (immunosuppresseur actif) qui serait également impliqué dans
la survenue de myélotoxicité. Les patients avec un allèle ITPA non fonctionnel présenteraient
un risque de neutropénie sévère fortement augmenté, même lorsque la dose de 6-MP est ajustée
en fonction du génotype TPMT et des concentrations de 6-TGN. Parmi les 5 polymorphismes
décrits pour cette enzyme, la mutation c.94C > A est la plus importante. Elle serait également
impliquée dans l’apparition de rashs cutanés et de pancréatites [5,22].
5.2 Interactions médicamenteuses
Certaines interactions médicamenteuses sont à risque et nécessitent une adaptation

thérapeutique : les aminosalicylates tel que : sulfasalazine, mésalazine, olsalazine, balsalazide,
provoquent une inhibition réversible de la TPMT ; la sulfasalazine est l’inhibiteur le plus
puissant (diminution de 50 % de l’activité de la TPMT), entraînant une augmentation de 50 %
de la fréquence des leucopénies en rapport avec de fortes concentrations de 6-TGN. Le
furosémide inhibe l’activité de la TPMT et son association nécessite une adaptation de
posologie de l’azathioprine. La co-prescription d’allopurinol doit également être envisagée avec
prudence avec division par 4 des posologies d’azathioprine pour limiter le risque de
pancytopénie, l’allopurinol bloque la voie métabolique de la xanthine oxydase (figure 2).
L’allopurinol est d’ailleurs parfois utilisé chez les non répondeurs pour augmenter
indirectement les concentrations de 6-TGN. L’infliximab provoque une augmentation des
concentrations de 6-TGN entre 1 et 3 semaines après le début de traitement [5,23–30].
6 Toxicité des thiopurines

Différents effets indésirables sont observés durant un traitement par les thiopurines. Ils peuvent
être doses dépendants ; liées aux concentrations intracellulaires en métabolites actifs, qui
peuvent se manifester durant toute la période du traitement, et parmi lesquelles la toxicité
hématologique est la plus importante, ou EI indépendants de la dose ; probablement liées à des
phénomènes immuno-allergiques et survenant surtout durant les premières semaines de
traitement, telles que les pancréatites [1].
7
6.1 Manifestations générales
La plus fréquente intolérance à l’AZA est digestive ; peut être remplacée avec succès par la
6MP dans 50-75 % des cas. Un syndrome pseudo grippal, une fièvre, des céphalées, une
réaction allergique cutanée, peuvent aussi être fréquemment rencontrés [31,32].
6.2 Toxicité hématologique
La myélotoxicité est l’effet indésirable des thiopurines le plus fréquent à l’origine de

leucopénies modérées et de neutropénies. Elle est généralement rapidement réversible après
l’arrêt du médicament ou une réduction de 50 % de la posologie [1,33].
6.3 Toxicité hépatique
Certains patients développent une élévation des tests hépatiques, une hépatite cholestatique,
une péliose, et la plupart répondent à une réduction de la dose. D’autres patients développent
des effets plus graves notamment l’hyperplasie nodulaire régénérative entraîne des dommages
progressifs du foie avec risque d’hypertension portale[34,35].
6.4 Toxicité pancréatique
La pancréatite aiguë est un effet indésirable qui peut parfois être très sévère contrindiquant pour
toujours la reprise du traitement [34].
6.5 Néoplasies
Après un traitement prolongé par les thiopurines, un risque de cancer peut survenir. Notamment
des lymphomes non hodgkiniens et des cancers cutanés [1].
8
CHAPITRE 2 : SUIVI THERAPEUTIQUE PHARMACOLOGIQUE DES THIOPURINE
Chapitre 2 : Suivi thérapeutique pharmacologique des

thiopurines
1 Généralités sur le STP

1.1 Définition de STP
Selon l’association internationale de suivi thérapeutique pharmacologique et de toxicologie

clinique (IATDMCT) , le suivi thérapeutique pharmacologique [STP] (therapeutic drug
monitoring [TDM] en anglais) est une spécialité clinique pluridisciplinaire visant à améliorer
la prise en charge du patient en ajustant individuellement la dose de certains médicaments (ceux
pour lesquels l’expérience clinique ou les essais cliniques ont démontré que cette pratique
apportait un bénéfice au patient) dans la population générale ou dans une population
particulière. Il repose a priori sur des informations pharmacogénétiques, démographiques et
cliniques et/ou a posteriori sur la mesure des concentrations sanguines du médicament (suivi
pharmacocinétique) ou de composés endogènes de substitution ou de paramètres biologiques
d’effet (suivi pharmacodynamique) [36].
1.2 Intérêt de STP
Le STP est un dosage de certains médicaments dans le milieu biologique du patient pour
optimiser son traitement curatif ou préventif. Il s'agit d'un outil de traitement personnalisé avec
un double objectif : minimiser les effets indésirables et/ou toxiques des médicaments liés au
surdosage, et réduire le taux d'échec du traitement lié à une mauvaise observance et/ou un sous-
dosage [37,38].
1.3 Historique du STP
L’histoire du STP a commencé avec le développement des concepts fondamentaux de la

pharmacocinétique, de la pharmacodynamique et avec l’essor de la pharmacologie clinique en
tant que discipline indépendante dans les années 1960. En 1960, Buchthal a montré l’existence
d’une relation entre les concentrations plasmatiques de la phénytoïne chez les patients traités
pour une épilepsie et l’efficacité de ce traitement.
Puis en 1967, Baastrup et Schou ont prouvé l’existence d’une relation entre la concentration
plasmatique et l’effet pharmacologique du lithium.
Dans les années 70, plusieurs publications sont apparues illustrant l’intérêt de l’ajustement de
la posologie dans la prise en charge de certaines pathologies [37].
9
1.4 Types de STP
1.4.1 Suivi thérapeutique "prospectif" (A priori)
D’après l’IATDMCT, le suivi thérapeutique prospectif comprend la détermination de la dose du

médicament qui doit être administrée en début de traitement, en se basant pour cela sur la relation
pharmacocinétique/pharmacodynamique prouvée au cours des essais cliniques déjà étudiés
1.4.2 Suivi thérapeutique "rétrospectif" (A posteriori)
D’après l’IATDMCT, le suivi thérapeutique rétrospectif correspond à la signification usuelle

du STP en pratique médicale, qui désigne essentiellement le réajustement de la dose du
médicament après avoir mesuré sa concentration circulante ou des biomarqueurs de son
efficacité. Il comprend l'étape de pré-analyse, l'étape d'analyse et l'étape de post-analyse, toutes
aussi importantes ; cette surveillance est généralement basée sur une mesure précise, sensible
et spécifique du médicament ou de son activité et/ou de ses dérivés toxiques, sur un échantillon
sanguin recueilli au moment approprié et dans des conditions adéquates ; la mesure peut
également faire intervenir un ou plusieurs biomarqueurs d'efficacité thérapeutique ou de toxicité
(concentration circulante de composés endogènes, activité enzymatique, expression génique,
etc.) ; il nécessite une interprétation prudente des résultats obtenus. En fonction des conditions
pré-analytiques, des informations cliniques sur le patient et de l'efficacité rapportée pour les
posologies administrées ; cette interprétation peut se fonder sur une modélisation des relations
pharmacocinétiques/pharmacodynamies du médicament ;il peut tirer parti d'une modélisation
pharmacocinétique /pharmacodynamie de population permettant le développement de
prédictions pharmacocinétiques individuelles, impliquant éventuellement des données
pharmacogénétiques spécifiques au patient [36].
1.5 Modalités pratiques de dosage dans le STP
Le dosage des médicaments se fait à l’aide de différentes méthodes. Les plus utilisées sont :
• Les méthodes chromatographiques couplées à une détection par spectrométrie de masse
(GC-MS ; LC-MS ; LCMS/ MS,).
• Les méthodes chromatographiques (chromatographie gazeuse – GC ; liquide à haute
performance – HPLC).
• Les dosages immunométriques (dosage immunoenzymatique EIA ; dosage enzyme-
multiplied – EMIT ; dosage par polarisation de fluorescence – FPIA).
10
Ces techniques se différent principalement par leur sensibilité, spécificité, complexité et le délai
d’obtention de résultat. Les méthodes chromatographiques couplées à la spectrométrie de masse
servent souvent de référence car ce sont les plus spécifiques et les plus sensibles.
Pour interpréter un taux de médicament correctement, il faut connaître la méthode utilisée,
l’intervalle de référence spécifique de cette dernière. Il est important de conserver la même
méthode analytique pour réaliser le STP des patients [39].
1.6 Particularités des médicaments nécessitant une surveillance biologique des taux
sanguins circulants
Le STP n’est pas appliqué à tous les médicaments. On prend en considération plusieurs
critères dans le choix du médicament :
• Relation dose-concentration du médicament : pour une même dose du médicament, la

concentration plasmatique se diffère d’un patient à un autre en rapport avec une variabilité
interindividuelle de la pharmacocinétique. L’origine de cette variabilité pourrait être en relation
avec des facteurs responsables d’un sous-dosage, on cite à titre d'exemple la mauvaise
absorption digestive, l’accélération du métabolisme, l’augmentation de l’élimination, la mal-
observance… ou d’un surdosage en cas d’insuffisance hépatique ou rénale.
• Relation concentration-effet du médicament : Une même dose ne produit pas les
mêmes effets thérapeutiques ou toxiques d’un individu à l’autre en raison de la variabilité
interindividuelle d’ordre pharmacodynamique, tel que les polymorphismes génétiques, les
interactions médicamenteuses et la sensibilité des récepteurs.
• Zone thérapeutique étroite : on fait un dosage plasmatique du médicament pour savoir
si on est dans une zone d’efficacité thérapeutique afin d’éviter les effets toxiques du
médicament ou l’échec thérapeutique.
• Absence d’outils cliniques ou biologiques de surveillance du traitement :
Le STP est utile pour les médicaments dont la surveillance clinique et biologique est difficile
(certains anticancéreux, antipsychotiques…) mais il est inutile si les effets pharmacologiques
(ou toxiques) sont directement mesurés.
• Disponibilité d’une méthode de dosage approprié à un coût supportable [37,40].
11
2 Suivi des thiopurines

2.1 Suivi pharmacogénétique (Phénotypage / Génotypage)
La variabilité inter-individuelle du métabolisme de thiopurines explique une part importante

de la variabilité dans la réponse clinique à ces médicaments. En particulier, une enzyme clé de
ce processus métabolique la thiopurine S-méthyltransférase (TPMT) présente des variations
d’activité importantes, en lien avec un polymorphisme génétique. Ainsi, la mesure de l’activité
TPMT (ou la prédiction de l’activité par le génotype TPMT) a priori permet de dépister les
patients méthyleurs déficitaires (homozygotes mutés ou hétérozygotes composites) et les
patients méthyleurs intermédiaires (hétérozygotes) qui sont, respectivement, à très haut risque
et à risque élevé de développer une toxicité hématologique sévère et précoce, en l'absence d'une
réduction posologique ou de l’arrêt du traitement.la détermination du statut TPMT par
phénotypage ou génotypage avant le traitement est fortement conseillée [1,41].
✓ Phénotypage
On mesure en ex-vivo l’activité enzymatique sur des cytosols érythrocytaires par dosage
chromatographique de la 6-MMP formée après ajout de 6-MP.
La mesure est réalisée dans les conditions suivantes :
✓ Avant l’initiation du traitement de manière à déterminer la posologie initiale ; l’activité
enzymatique est potentiellement modifiée par le traitement.
✓ Au cours du traitement pour expliquer l’apparition d’une toxicité.
✓ A distance d’au moins 3 mois d’un épisode transfusionnel car risque de phénocopie
(interférence avec l’activité TPMT des GR transfusés) [1,41].
✓ Génotypage
On recherche des variants alléliques TPMT*2, *3A, *3B et *3C par discrimination allélique
avec des sondes fluorescentes (PCR quantitative en point final) ou autre méthode de biologie
moléculaire (séquençage).
2.1.1.1.1 La mesure est réalisée dans les conditions suivantes :
• Avant l’initiation du traitement de manière à déterminer la posologie initiale.
• Au cours du traitement pour expliquer l’apparition d’une toxicité.
• Utile lorsque le phénotypage n’est pas réalisable ou difficile à interpréter (valeur
d’activité égale ou proche des valeurs-seuil décisionnelles) [1,41].
12
Figure 3. Algorithme de prise en charge thérapeutique des patients sous

Thiopurine dans les MICI en fonction de la TPMT et des 6-TGN/6-MMP [1].
13
2.2 STP des thiopurines
Le STP des thiopurines est important pour explorer des cas de résistance ou pour prévenir et
expliquer des toxicités hématologiques ou hépatiques. Il permet également de détecter les
surdosages, ainsi qu’une évaluation de l’observance du traitement par le patient. Ainsi, avant
d’envisager l’arrêt prématuré d’un traitement par thiopurine pour absence de réponse ou
toxicité, un dosage des métabolites est utile pour en confirmer l’étiologie et permettre une
éventuelle adaptation posologique [1,41].
Ce suivi comprend 3 phases :
2.2.1 Phase pré-analytique (prélèvement)
Le dosage des thiopurines s’effectue dans le culot globulaire. Un prélèvement de 5 ml est

effectué sur tube EDTA ou sur tube hépariné (selon le laboratoire et le protocole suivi). Il est
recommandé de le réaliser au cours du traitement en résiduelle, c’est à dire juste avant la prise
de l’azathioprine, à partir de 2 semaines de traitement si patient avec une activité TPMT
déficitaire/intermédiaire ou à partir de 4 semaines de traitement pour les patients avec une
activité TPMT normale.
L’acheminement de prélèvement doit être fait dans un délai de 48h et à une température de +2
à +8°C.
Au laboratoire , le prélèvement doit être conservé à une température de +2° à +8° et il est
strictement interdit de le congeler en vue de la préparation des globules rouges [41].
2.2.2 Phase analytique
L’analyse se base sur le dosage intra-érythrocytaires de 6-MP et ses métabolites

pharmacologiquement actifs 6-TG et 6-MMP dans le culot globulaire.
Les méthodes de référence pour la mesure des concentrations de 6-MP sont des méthodes de
chromatographie liquide couplées à la spectrophotométrie ultraviolet (HPLC-UV) ou à la
spectrométrie de masse (LC-MS).
Ces techniques sont sensibles, précises, fiables, rapides plus ou moins spécifiques et permettent
de doser simultanément le 6-MP et ses métabolites actifs.
Le dosage de le 6-MP par de telles techniques sera traité ultérieurement dans la partie pratique.
14
2.2.3 Phase post-analytique (interprétation)
Les résultats du dosage de 6-MP et ses métabolites 6-TG et 6-MMP permettent de classer les
patients selon leur profil métabolique, identifiant 5 groupes de patients pour lesquels des
recommandations thérapeutiques sont possibles (Figure 3).
• Groupe 1 : patients avec une faible observance au traitement
Des concentrations en 6-TG et en 6-MMP très faibles ou indétectables sont probablement en
lien avec une faible observance. Une éducation thérapeutique peut être proposée à ces patients.
• Groupe 2 : patients présentant un sous-dosage en thiopurine
Une concentration sub-thérapeutique en 6-TG < 235-260 pmol/8x108 GR, associée à des 6-
MMP faibles peut révéler un sous-dosage. Une augmentation de la posologie en thiopurine est
possible pour obtenir une rémission.
• Groupe 3 : patients pharmacologiquement résistants aux thiopurines
Une concentration sub-thérapeutique en 6-TG < 235-260 pmol/8x108 GR, associée à un ratio
[6-MMP/6-TG] élevé > 11 ou > 20, selon les auteurs, chez des patients recevant une posologie
standard en thiopurine signe un métabolisme défavorable. Ces patients peuvent être appelés
pharmacologiquement résistants aux thiopurines. Une augmentation de la posologie ne sera pas
en faveur de l’obtention d’une rémission mais majorera le risque de toxicité hépatique due à
des concentrations toxiques en 6-MMP > 5700 pmol/8x108 GR. Ces patients peuvent tirer
bénéfice d’une optimisation thérapeutique par l’ajout de 100 mg/jour d’allopurinol associé à
une diminution des doses de thiopurines à 25-50 % de la posologie initiale. Un suivi biologique
hématologique et hépatique étroit est préconisé. Un nouveau dosage des métabolites 4 semaines
après l’ajout d’allopurinol est recommandé pour vérifier l’efficacité de cette association
médicamenteuse.
• Groupe 4 : patients avec une activité TPMT basse ou intermédiaire
Une concentration élevée en 6-TG > 400 pmol/8x108 GR, ou plus, selon les auteurs, associée à
des concentrations basses en 6-MMP expose les patients à un risque de myélotoxicité et peut
révéler la présence d’un déficit d’activité TPMT. Une réponse clinique efficace est souvent
observée chez ces patients, mais si la concentration en 6-TG est trop élevée, une baisse de la
posologie est requise. Un nouveau dosage des métabolites 4 semaines après une modification
thérapeutique est recommandé. Ces patients sont théoriquement dépistés par une détermination
du statut TPMT avant le début du traitement.
15
• Groupe 5 : patients présentant un surdosage ou une maladie réfractaire

Des concentrations élevées en 6-TG > 400 pmol/8x108 GR, ou plus, et en 6-MMP > 5700
pmol/8x108 GR, selon les auteurs, révèlent un surdosage en thiopurine pouvant être à l’origine
d’effets indésirables, notamment hématologiques ou hépatiques. Les patients ne répondant pas
aux thiopurines après 2-3 mois malgré des concentrations en 6-TG > 400 pmol/8x108 GR sont
réfractaires aux thiopurines et une alternative thérapeutique doit être envisagée [1].
16
CHAPITRE 3 : RAPPEL SUR LES TECHNIQUES CHROMATOGRAPHIQUES
Chapitre 3 : Rappel sur les techniques chromatographiques
1 Définition
La chromatographie est une méthode physico-chimique qui permet la séparation des différentes
substances présentes dans un mélange (échantillon en phase homogène liquide ou gazeuse).
Elle repose sur l'entraînement d'un échantillon dissous par une phase mobile à travers une phase
stationnaire qui va retenir plus ou moins fortement les substances contenues dans l'échantillon.
Selon la technique chromatographique mise en jeu, la séparation des composants entraînés par
la phase mobile, résulte soit de leur adsorption et de leur désorption successive sur la phase
stationnaire, soit de leur solubilité différente dans chaque phase ; soit de leur affinité pour la
phase stationnaire.
Selon la nature de la phase mobile, on distingue les différents types de chromatographie
suivant :
• Chromatographie sur couche mince (CCM ou TLC en anglais).
• Chromatographie en phase gazeuse (CPG ou GC en anglais) également appelée CPV
(chromatographie en phase vapeur).
• Chromatographie en phase liquide (CPL ou LC en anglais).
• Chromatographie en phase liquide à haute performance (CLHP ou HPLC en anglais).
• Chromatographie en phase supercritique (CPS ou SFC en anglais).
Parmi ces nombreux types, on relève la chromatographie liquide, caractérisée par sa phase
mobile liquide [42–44].
2 La chromatographie en phase liquide

La chromatographie en phase liquide (CPL) est une technique d'analyse quantitative et
qualitative principalement utilisée dans des domaines variés tels que la biochimie.
Ce type de chromatographie repose sur la technique de chromatographie de partage ou la
séparation des solutés est fondée sur leur partage entre la phase stationnaire et la phase mobile
liquide.
Les solutés sont entraînés par un liquide à travers un solide divisé qui est soit placé dans une
colonne chromatographique, soit fixé sur une surface inerte.
La CPL recouvre la chromatographie sur couche mince (CCM), la chromatographie sur papier,
et la chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC) qu’on va utiliser pour notre
étude [42–44].
17
2.1 HPLC
2.1.1 Principe
Les composés à séparer sont mis en solution dans un solvant. Le mélange obtenu est introduit
dans la phase mobile liquide par injection dans le système chromatographique.
Selon leur nature, les molécules interagissent plus ou moins avec la phase stationnaire dans la
colonne chromatographique.
La phase mobile est pompée par une pompe sous haute pression, parcourt le système
chromatographique.
En sortie de colonne les différents solutés sont détectés par un détecteur approprié, elles sont
caractérisées chacune par un pic. L'ensemble de ces pics est appelé chromatogramme [42–44].
2.1.2 Appareillage
Figure 4. Schématisation de l’instrumentation HPLC [45].
La Figure 4 représente une schématisation simple de l’instrumentation HPLC, composée de :

• Réservoir de la phase mobile (solvant) :
Le plus souvent ce réservoir est une bouteille en verre dans lequel plonge un tube avec une
extrémité filtrante en téflon.
• Pompe :
Elle pompe en continu la phase mobile. Elle est définie par la pression qu'elle permet d'atteindre
dans la colonne, son débit, et la stabilité du flux.
18
• Injecteur :
Il peut être manuel (avec injecteur à seringue) ou automatisé, Le type d'injecteur le plus
couramment utilisé comporte une vanne à boucle d'échantillonnage d'une capacité fixe. Cette
boucle permet d'introduire l'échantillon sans modifier la pression dans la colonne.
• Colonne :
Généralement en acier et caractérisée par sa longueur, diamètre intérieur ainsi que la nature et
la taille des particules qui constituent la phase stationnaire.
• Détecteurs :
Le détecteur suit en continu l'apparition des solutés.
Pour détecter, on utilise différents phénomènes physico-chimiques. Le signal obtenu est
enregistré en fonction du temps. Généralement, on compare le signal obtenu pour la phase
mobile et le soluté à celui de la phase mobile seule.
Le détecteur le plus utilisé en HPLC est un spectrophotomètre d'absorption UV-visible relié à
la sortie de colonne [42–44].
2.2 Types de chromatographie en phase liquide
Il existe de nombreux types de chromatographie liquide dont nous mentionnons :
2.2.1 Chromatographie en phase normale
La chromatographie en phase normale est un type de chromatographie qui fait intervenir les
interactions polaires. Il s’agit d’un mécanisme de compétition entre la rétention d’un soluté
dans la phase stationnaire et l’élution du soluté dans la phase mobile. On fait donc passer un
solvant non polaire ou modérément polaire (phase mobile apolaire) dans la colonne (phase
stationnaire polaire).
Les solutés les plus retenus dans la phase stationnaire seront élués en dernier alors que les
solutés les moins retenus seront élués en premier.
2.2.2 Chromatographie en phase inverse
Contrairement à la chromatographie en phase normal, la chromatographie en phase inverse fait

intervenir les interactions hydrophobes
La base d'une phase inverse est une phase stationnaire composée de petites particules de silice
sur lesquelles on a greffé des fonctions chimiques, le plus souvent de chaines alkyles à 8 ou 18
atomes de carbones.
Selon le taux de greffage, on obtient une plus ou moins grande résolution.
19
Cette phase stationnaire est dite « inverse » car elle devient apolaire et hydrophobe après
greffage [42–44].
2.3 Phases stationnaires et mobiles utilisées en chromatographie en phase liquide
Les couples phases stationnaire-phase mobile les plus employés en chromatographie en phase
liquide sont indiqués dans le tableau -1- [42] :
Tableau 1. Phases stationnaires et mobile utilisées en chromatographie en phase liquide.
20
CHAPITRE 4 : VALIDATION BIO-ANALYTIQUE
Chapitre 4 : Validation bio-analytique
1 Définition
La détermination quantitative des médicaments et de leurs métabolites dans les matrices
biologiques constitue un aspect indispensable du développement des médicaments et de
l'évaluation et l'interprétation des données des études de biodisponibilité, de bioéquivalence, de
pharmacocinétique et de toxicocinétique. L’utilisation des méthodes analytiques bien
caractérisées, validées de manière appropriée et documentées est donc essentielle afin de
garantir des données fiables pour étayer les décisions réglementaires et pour pouvoir prendre
des décisions critiques soutenant la sécurité et l’efficacité des médicaments [46,47].
Une méthode bio-analytique est un ensemble de procédures impliquées dans la collecte, le
traitement, le stockage et l'analyse d'une matrice biologique pour un composé chimique. La
validation de la méthode bio-analytique (BMV) est le processus utilisé pour établir qu'une
méthode d'analyse quantitative est adaptée aux applications biomédicales. Elle comprend toutes
les procédures qui démontrent qu'une méthode particulière utilisée pour la mesure quantitative
d'analytes dans une matrice biologique donnée, comme le sang, le plasma, le sérum ou l'urine,
est fiable et reproductible pour l'utilisation prévue [48].
En général, un seul analyte doit être déterminé, mais il peut parfois être approprié d'en mesurer
plusieurs. Il peut s'agir de deux médicaments différents, d'un médicament mère avec ses
métabolites ou des énantiomères ou isomères d'un médicament. Dans ces cas, les principes de
validation et d'analyse s'appliquent à tous les analytes d'intérêt [46].
La caractérisation de la stabilité des analytes dans les échantillons biologiques prélevés au cours
des études cliniques, ainsi que celle des réactifs d'analyse critiques, y compris les solutions
mères d'analytes, est reconnue comme un élément important de la validation des analyses bio-
analytiques [48,49].
2 Objectifs
Les directives de la validation ont pour but de fournir des recommandations pour la
quantification chimique et biologique des médicaments et leur application dans l'analyse des
échantillons d'étude. L'adhésion aux principes présentés dans ces directives améliorera la
qualité et la cohérence des données bio-analytiques à l'appui du développement et de
l'approbation du marché des médicaments chimiques et biologiques [46].
21
L’objectif principal d’une validation analytique est de démontrer l’aptitude et la fiabilité d’une
méthode vis-à-vis des exigences réglementaire et normatives en vigueur. Elle permet de garantir
que chaque mesure qui doit être réalisée en routine est comprise dans une limite d’acceptation
appropriée au type de procédure analytique et au produit concerné [50].
La performance d’une méthode et la fiabilité des résultats sont particulièrement importantes
quand il s’agit des milieux biologiques.
Il convient de noter que la validation initiale n'est qu'un début, car une méthode doit être
surveillée en permanence pendant son application pour s'assurer qu'elle fonctionne comme elle
a été initialement validée [48,49].
3 Cycle de vie d’une méthode

Afin de comprendre clairement la place et le rôle de la validation, il est intéressant d’introduire
un concept qui est à la base de la norme ISO 17025, nommé « cycle de vie d’une méthode »
(figure 5) et qui comprend différentes étapes [51].
3.1 Sélection de la méthode
Elle va permettre de définir les objectifs de la méthode et les conditions opératoires initiales.
Parmi les diverses méthodes physico-chimiques, l’analyste va choisir la méthode la plus
pertinente pour le dosage de l’analyte à déterminer [50].
Pour cela ; il doit comprendre la substance à analyser (par exemple, déterminer les propriétés
physicochimiques du médicament, son métabolisme in vitro et in vivo et sa liaison aux
protéines) et prendre en compte les aspects de toute méthode analytique antérieure qui pourrait
être applicable [52].
3.2 Mise au point de la méthode
C’est une étape de développement de la méthode sélectionnée afin d’optimiser les procédures
et les conditions d’extraction et de détection de l’analyte. Elle peut inclure l’optimisation de
plusieurs paramètres pour s’assurer que la méthode est adaptée à la validation tels que : normes
de référence, réactifs critiques, courbe d’étalonnage, échantillons de contrôle qualité, sélectivité
et spécificité, sensibilité, précision …etc [46].
Afin de maitriser la programmation des essais, il est important de suivre un cheminement précis
et non pas réaliser des expériences aléatoires. Les informations recueillies sur les performances
de la procédure analytique, concernant la pertinence du modèle utilisé vont constituer une base
pour l’étape suivante, qui est la validation proprement dite [50].
22
3.3 Validation de la méthode
Cette étape prouve que la méthode optimisée est adaptée à l'analyse des échantillons de l'étude
[52].
Après l’établissement des critères de performance de la méthode, on les compare aux données
de référence dont on dispose (fournisseur, bibliographie, sociétés savantes, …) et conclut quant
à l’acceptabilité de la méthode en fonction de ses besoins vis-à-vis du critère testé [53].
3.4 Utilisation en routine
Le passage en routine de la méthode s’inscrit dans le cadre d’un système de contrôle de la

qualité qui a pour objectifs de valider les résultats obtenus sur des échantillons inconnus, et de
contrôler les performances de la méthode analytique au fil du temps [50].
3.5 Revalidation
La revue périodique de la méthode peut donner lieu à certaines améliorations. Ces modifications
peuvent avoir besoin de revalidation ou d’un nouveau développement [54].
Figure 5. Cycle de vie d’une méthode d’analyse. [51]
23
4 Contexte réglementaire
Diverses directives de validation des méthodes bio-analytiques ont été publiées dans le monde
entier par différents organismes de réglementation. Parmi lesquels :
4.1 Les guidelines de ICH (International Council for Harmonisation)
Elles sont les plus largement acceptés pour la VMB ; notamment ICH Q2 (R1), qui est utilisé à
la fois dans le domaine pharmaceutique et médical [48,55].
4.2 FDA (Food and Drug Administration)
Depuis le début des années 1980, elle joue un rôle de premier plan dans l’orientation de la bio-
analyse. En 2001, La FDA a publié le premier guide détaillé couvrant les recommandations de
validation et la conduite de l’analyse d’échantillons [48,56]. En 2013, Elle a publié le projet des
guidelines sur la validation des méthode bio-analytiques, qui couvre les derniers paramètres ou
sujets rencontrés dans la validation et s'approche de l'harmonisation de la validation des
méthodes bio-analytiques à travers le monde. Le champ d’application a été élargi et les
principales différences entre les lignes directrices de 2001 et de 2013 comprennent une
discussion détaillée sur les BLA, la spécification d'un nombre minimum de passages pour la
validation, et des sections ajoutées pour les composés endogènes, les biomarqueurs, les kits de
diagnostic, les recommandations sur la réanalyse des échantillons engagés (ISR), la surveillance
de la variation de l'étalon interne, et les méthodes de dosage des métabolites. En 2018, elle a
publié une mise à jour des orientations, qui comprenait une description comparative détaillée
des éléments d’analyse, c’est-à-dire des CC et des LBA, et des critères d’acceptation [52,57,58].
4.3 EMA (European Medicines Agency)
En 2009, le Comité des médicaments à usage humain de l’EMA a publié un projet de directive
sur la validation des méthodes bio-analytiques. Le deuxième Forum européen de bio-analyse,
qui s'est tenu en 2011, avait pour thème "Large Meets Small". La réunion visait à mettre en
relation les stratégies de bio-analyse quantitative des grandes molécules avec la technologie des
petites molécules, en particulier la LC-MS/MS. En 2012, l'EMA a publié la version finale de la
directive, qui comprenait deux sections détaillées, respectivement pour les CC et les LBA [57].
Bien que les guidelines de la FDA et de l’EMA soient les normes d’excellence pour la BMV,
d’autres lignes directrices nationales doivent être soulignées pour leur contribution au domaine
: celle du Brésilien ANVISA (Agência Nacional de Vigilância Sanitária) publiée en 2012 et
celle du Japonais MHLW (Ministry of Health, Labour and Welfare) publiée en 2013 [47].
24
Plusieurs groupes de travail se concentrent sur le développement et l'harmonisation de la bio-

analyse. Le développement de nouvelles technologies et la sélection de plateformes de bio-
analyse sont les sujets de discussion les plus fréquents. Il est donc important de garder à l'esprit
que les progrès continus de l'instrumentation et l'émergence de défis analytiques plus exigeants
font de la bio-analyse un domaine en évolution permanente, et que les réglementations peuvent
donc évoluer en conséquence. Bien qu'une vue sur l'avenir soit amusante, un regard rétrospectif
peut aider à mieux comprendre ce sujet complexe [47,57].
5 Terminologie
Avant de définir les différents paramètres de validation, il est important de préciser les termes
courants utilisés par la guideline de l’EMA [46] dans la validation des méthodes bio-
analytiques.
• Analyse : Une série de procédures analytiques allant du traitement/dilution de
l'échantillon à la mesure sur un instrument analytique.
• Analyte : Une fraction chimique spécifique à mesurer, y compris un médicament intact,
une biomolécule ou son dérivé ou un métabolite dans une matrice biologique.
• Blanc : Un échantillon d'une matrice biologique auquel aucun analyte et aucun EI n'a
été ajouté.
• Concentration nominale : Concentration théorique ou attendue
• Echantillon de contrôle qualité (CQ) : Un échantillon dopé avec une quantité connue
d'analyte qui est utilisé pour contrôler la performance d'une méthode bio-analytique et évaluer
l'intégrité et la validité des résultats des échantillons inconnus analysés dans un lot ou une série
individuelle.
• Echantillon zéro : Un échantillon blanc dopé avec un EI.
• Etalon interne : Analogue structurellement similaire ou composé marqué par un
isotope stable ajouté aux normes d'étalonnage, aux CQ et aux échantillons d'étude à une
concentration connue et constante pour faciliter la quantification de l'analyte cible.
• Gamme d’étalonnage : La plage d'étalonnage d'une méthode d'analyse est l'intervalle
entre la concentration (quantité) supérieure et inférieure de la substance à analyser dans
l'échantillon (y compris ces concentrations) pour lequel il a été démontré que la méthode
d'analyse répond aux exigences de précision, d'exactitude et de fonction de réponse.
25
• Limite inférieure de quantification (LLOQ) : La plus petite quantité d'un analyte dans
un échantillon qui peut être déterminée quantitativement avec précision et exactitude
prédéfinies.
• Limite supérieure de quantification (ULOQ) : La plus grande quantité d'analyte dans
un échantillon qui peut être déterminée quantitativement avec précision et exactitude
prédéfinies.
• Matrice biologique : Une matière biologique comprenant, sans s'y limiter, le sang, le
sérum, le plasma et l'urine.
• Procédure d’analyse : La procédure analytique fait référence à la manière de réaliser
l'analyse. Elle doit décrire en détail les étapes nécessaires à la réalisation de chaque analyse.
6 Le processus de validation selon l’EMA

6.1 Normes de références
Pendant la validation de la méthode et l'analyse des échantillons de l'étude, une matrice

biologique vierge est dopée avec le ou les analytes d'intérêt en utilisant des solutions d'étalon(s)
de référence pour préparer les étalons de calibration et les CQ.
Les étalons doivent être préparés à partir de solutions mères distinctes. Cependant, elles peuvent
être préparés à partir de la même solution mère à condition que son exactitude et sa stabilité
aient été vérifiées.
Un certificat d'analyse (CoA) ou une alternative équivalente est nécessaire pour garantir la
qualité et fournir des informations sur la pureté, les conditions de stockage, la date de réanalyse/
expiration et le numéro de lot de l'étalon de référence. L’EMA ne recommande pas l’exigence
de CoA pour les étalons certifiés, tant que leur aptitude à l’emploi est démontrée [46,58].
6.2 Les paramètres de validation
Les paramètres de la validation bio-analytique pour les méthodes chromatographiques selon la

guideline de l’EMA [46] sont comme suit :
6.2.1 Sélectivité
La sélectivité est la capacité d'une méthode d'analyse à différencier et à mesurer l'analyte en

présence de substances interférentes potentielles dans la matrice biologique vierge. Elle est
évaluée à l'aide d'échantillons vierges (échantillons de matrice traités sans ajout d'un analyte ou
d'un IS) obtenus à partir d'au moins 6 sources/lots individuels (non hémolysés et non
lipémiques).
26
L'utilisation de moins de sources peut être acceptable dans le cas de matrices rares. La
sélectivité de l'EI doit également être évaluée.
L'évaluation de la sélectivité doit démontrer qu'aucune réponse significative attribuable à des
composants interférents n'est observée au(x) temps de rétention de l'analyte ou du SI dans les
échantillons blancs. Les réponses détectées et attribuables aux composants interférents ne
doivent pas représenter plus de 20 % de la réponse de l'analyte au LLOQ et pas plus de 5 % de
la réponse du EI dans l'échantillon LLOQ pour chaque matrice.
6.2.2 Spécificité
La spécificité est la capacité d'une méthode bio-analytique à détecter et à différencier l'analyte

des autres substances, y compris les substances apparentées (par exemple, les substances qui
sont structurellement similaires à l'analyte, les métabolites, les impuretés, les produits de
dégradation formés pendant la préparation de l'échantillon ou les médicaments concomitants
qui sont censés être utilisés dans le traitement des patients avec l'indication prévue)
Les réponses détectées et attribuables aux composants interférents ne doivent pas représenter
plus de 20 % de la réponse de l'analyte au LLOQ et pas plus de 5 % de la réponse du SI dans
l'échantillon LLOQ.
6.2.3 Effet de matrice
Un effet de matrice est défini comme une altération de la réponse de l'analyte due à un ou
plusieurs composants interférents et souvent non identifiés dans la matrice de l'échantillon.
L'effet de matrice doit être évalué en analysant au moins 3 reliquats de CQ faibles et élevés,
chacun étant préparé en utilisant une matrice provenant d'au moins 6 sources/lots différents.
L'exactitude doit se situer à ±15% de la concentration nominale et la précision (coefficient de
variation en pourcentage (%CV)) ne doit pas être supérieure à 15% pour toutes les sources/lots
de matrice individuels. L'utilisation de moins de sources/lots peut être acceptable dans le cas de
matrices rares.
6.2.4 Courbe et gamme d’étalonnage
La linéarité d'une méthode d'analyse désigne la capacité de la méthode à produire un signal, qui
est soit directement, soit par transformation mathématique, proportionnel à la concentration de
l'analyte présent dans l'échantillon.
Les étalons, préparées en dopant la matrice avec une quantité connue d'analyte, couvrent la
gamme d'étalonnage et constituent la courbe d'étalonnage. Ils doivent être préparées dans la
même matrice biologique que les échantillons de l'étude.
27
La gamme d'étalonnage est définie par le LLOQ, qui est le standard d'étalonnage le plus bas, et
le ULOQ, qui est le standard d'étalonnage le plus élevé. Il doit y avoir une courbe d'étalonnage
pour chaque analyte étudié pendant la validation de la méthode et pour chaque série d'analyses.
Une courbe d'étalonnage doit être générée avec un échantillon blanc, un échantillon zéro
(échantillon blanc dopé avec EI), et au moins 6 niveaux de concentration de normes
d'étalonnage, y compris le LLOQ et le ULOQ.
Les paramètres de la courbe d'étalonnage doivent être indiqués (pente et ordonnée à l'origine
dans le cas d'un modèle linéaire). Toutes les courbes acceptables obtenues pendant la validation,
sur la base d'un minimum de 3 essais indépendants sur plusieurs jours, doivent être indiquées.
Au moins 75 % des étalons d'étalonnage doivent répondre aux critères ci-dessus.
6.2.5 Exactitude et Précision
➢ Préparation des échantillons de contrôle qualité
Les CQ sont destinés à imiter les échantillons d'étude et doivent être préparés en dopant la
matrice avec une quantité connue d'analyte, en les stockant dans les conditions prévues pour les
échantillons d'étude et en les analysant pour évaluer la validité de la méthode d'analyse.
Les étalons et les CQ doivent être préparées à partir de solutions mères distinctes afin d'éviter
les estimations biaisées qui ne sont pas liées à la performance analytique de la méthode.
Toutefois, ils peuvent être préparés à partir de la même solution mère, à condition que
l'exactitude et la stabilité de cette dernière aient été vérifiées. Une seule source de matrice vierge
peut être utilisée, qui doit être exempte d'interférences ou d'effets de matrice.
Pendant la validation de la méthode, les CQ doivent être préparés à un minimum de 4 niveaux
de concentration dans l'intervalle de la courbe d'étalonnage : le LLOQ, trois fois le LLOQ (CQ
faible), environ 30 à 50% de l'intervalle de la courbe d'étalonnage (CQ moyen) et au moins 75%
du ULOQ (CQ élevé).
➢ Évaluation de l'exactitude et de la précision
L'exactitude et la précision doivent être déterminées en analysant les CQ dans chaque série
(intra-série) et dans différentes séries (inter-séries).
A l’intérieur de chaque série, L’exactitude et la précision doivent être évaluées en analysant au
moins 5 répliques à chaque niveau de concentration CQ dans chaque série d'analyses. Entre les
séries, elles doivent être évaluées en analysant chaque niveau de concentration CQ dans au
moins 3 séries d'analyses sur au moins deux jours.
28
Les données de validation de la méthode rapportées et la détermination de l'exactitude et de la

précision devraient inclure tous les résultats obtenus, y compris les CQ individuels en dehors
des critères d'acceptation, sauf dans les cas où les erreurs sont évidentes et documentées.
La précision globale à chaque niveau de concentration doit se situer dans une fourchette de ±
15 % de la concentration nominale, sauf à la LLOQ, où elle doit être de ± 20 %. La précision
(%CV) des concentrations déterminées à chaque niveau ne doit pas dépasser 15 %, sauf à la
LLOQ, où elle ne doit pas dépasser 20 %.
6.2.6 Contamination inter-échantillons (Carry-over)
C’est une altération d'une concentration mesurée due à un analyte résiduel d'un échantillon
précédent qui reste dans l'instrument d'analyse.
La contamination doit être évaluée et minimisée pendant le développement de la méthode. Au
cours de la validation, elle doit être évaluée en analysant des échantillons à blanc après l'étalon
de calibration à l'ULOQ. Elle ne doit pas être supérieur à 20 % de la réponse de l'analyte à la
LLOQ et à 5 % de la réponse pour l'EI.
6.2.7 Stabilité
L’objectif des tests de stabilité est de garantir que chaque étape de la préparation, du traitement
et de l'analyse des échantillons ainsi que les conditions de stockage utilisées n'affectent pas la
concentration de l'analyte.
La référence aux données publiées dans la littérature n'est pas considérée comme suffisante. La
validation des périodes de stockage doit être effectuée sur des CQ de stabilité qui ont été stockés
pendant une durée égale ou supérieure aux périodes de stockage des échantillons de l'étude.
La stabilité de l'analyte dans la matrice étudiée est évaluée en utilisant des CQ de stabilité à
faible et à forte concentration au temps zéro et après les conditions de stockage appliquées qui
doivent être évaluées. Un minimum de trois CQ de stabilité doit être préparé et analysé par
niveau de concentration/conditions de stockage/temps.
Les CQ de stabilité sont analysés par rapport à une courbe d'étalonnage, obtenue à partir des
étalons fraîchement dopés dans une série avec les CQ correspondants fraîchement préparés ou
les CQ pour lesquels la stabilité a été prouvée. La concentration moyenne à chaque niveau de
CQ doit se situer à ±15% de la concentration nominale.
6.2.8 Reproductibilité de réinjection
Elle est évaluée par des mesures répétées des CQ et est généralement incluse dans l'évaluation
de la précision et de l'exactitude. Toutefois, si des échantillons peuvent être réinjectés (par
29
exemple, en cas d'interruption des instruments ou une défaillance de l'équipement), la

reproductibilité de la réinjection doit être évaluée et incluse dans le rapport de validation ou
fournie dans le rapport bio-analytique de l'étude où elle a été réalisée.
6.2.9 Rendement d’extraction
Il est mesuré par le pourcentage de l'analyte retrouvé après pré-traitement de la matrice par
comparaison à la même concentration de l'analyte en solution du standard d’étalonnage.
Le rendement de l'extraction doit être étudié à trois niveaux de concentration (bas, moyen et
haut). Chaque concentration est analysée au moins 3 fois.
30
Partie pratique
31
PROBLEMATIQUE ET OBJECTIF
Problématique et objectif
Les globules rouges, qui ne synthétisent pas d'acides nucléiques, agissent comme des réservoirs
pour les métabolites les plus importants de la 6-MP : 6TGN et 6MMP. L’accumulation de ces
métabolites en milieu intra-érythrocytaire est reflétée par une concentration à l’état d’équilibre.
Cette concentration a été proposée comme paramètre de suivi de l'usage thérapeutique de
l'Azathioprine.
L’objectif de cette étude est de valider une méthode analytique simple, économique et réalisable
en routine de dosage rapide de la concentration intra-érythrocytaire de la 6-mercaptopurine (6-
MP) et de ses métabolites, les nucléotides 6-thioguanine (6-TGN) et la 6-méthylmercaptopurine
(6-MMP) par chromatographie liquide à haute performance (HPLC) avec un détecteur UV-
visible, en utilisant les différents paramètres de validation comme outils de décision.
Pour atteindre cet objectif, ce travail doit être réalisé selon une méthode HPLC améliorée pour
la quantification de la 6-mercaptopurine et ses métabolites [59], publié par la revue brésilienne
de recherche médicale et biologique (brazilian journal of medical and biological research) en
2004, et validé selon les recommandations de l’EMA (European medicines Agency).
32
MATERIEL ET METHODES
Matériel et méthodes
1 Lieu et période de réalisation du travail

Il s’agit d’une étude expérimentale, qui a été effectuer au niveau du laboratoire de Toxicologie
Alimentaire au niveau du département d’agronomie (Université de Batna 2), ce travail nous a
pris Six (06) mois « du mois de Février 2021 au mois de Juillet 2021 » entre mise au point,
validation et traitement statistique.
2 Matériels
2.1 Appareillage
Tableau 2. Appareillage utilisé dans le présent travail.
Désignation Spécification Usage

HPLC Pompe LC-10AT
(SHIMADZU Class VP)
Contrôleur SCL-10A
Compartiment de CTO-10AC Séparation et dosage

la colonne
Colonne NUCLEOSIL
100-5 C18
(125x4.6mm)
Dégazeur DGU-14A
Détecteur SPD-10AV
seringue 10µL
HAMILTON
#702
Logiciel SHIMADZU
d’exploitation Class VP
pH mètre PHS-38W BANTE-instrument Mesure de pH de phase
mobile
Balance analytique AS220R2 RADWAG Pesée
Pompe à vide KNF Filtration de la phase mobile
Vortex IKA MS3 digital Agitation des échantillons
Centrifugeuse BIOBASE BK-1032J Centrifuger
Thermomètre WT-1 Mesure de la température du

bain marie
Agitateur magnétique MC-8 BUNSEN Homogénéisation des
solutions
33
2.2 Matières premières
Tableau 3. Matières premières utilisées dans le présent travail.

Matières premières Provenance Données physicochimiques
6 mercaptopurines Alfa Aesar N° CAS :6112-76-1
LOT: C3651A
Formule brute: C5H4N4S-H2O
MM: 170.19 g/mol
Pureté : ≥ 98%
6 thioguanine Alfa Aesar N° CAS: 154-42-7
LOT: H9354A
Formule brute: C5H5N5S
MM :167.19 g/mol
Pureté : ≥ 98%
6 méthylthiopurine ACROS ORGANICS N° CAS: 50-66-8
LOT: A0407829
Formule brute: C6H6N4S
MM : 166.20 g/mol
Pureté : ≥ 98%
2.3 Réactifs
Tableau 4. Réactifs utilisés dans le présent travail.
Réactifs Provenance Données physicochimiques

N° CAS: 67-56-1
Méthanol Honeywell (Riedel-de Haen) LOT: #SZBG291BH
Formule brute: CH4O
MM: 32.04 g/mol
Pureté : > 99.9 %
ρ : 0.791 g / cm3
N° CAS : 7601-90-3
Acide perchlorique Honeywell (Fluka) LOT : I3470
Formule brute : HClO4
MM : 100.46 g/mol
Pureté : 70-72 %
ρ : 1.66 g / cm3
N° CAS :121-44-8
Triméthylamine SIGMA-ALDRICH LOT : #STBH2222
Formule brute : C6H15N
MM : 101.19 g/mol
Pureté : > 99%
ρ :0.726 g / cm3
N° CAS : 7664-38-2
Acide phosphorique BIOCHEM Chemopharma LOT :116042500-0618-011A
Formule brute : H3PO4
MM : 98 g/mol
Pureté : 85-88 %
ρ : 1,69 g / cm3
N° CAS : 7647-01-0
Acide chlorhydrique PanReac AppliChem LOT :0000983510
Formule brute :HCl
MM : 36.46 g/mol
Pureté : 37 %
ρ : 1.19 g / cm3
34
N° CAS: 7697-37-2
Acide nitrique Honeywell (Fluka) LOT: I345S
Formule brute: HNO3
MM: 63.01 g/mol
Pureté : >65 %
ρ : 1.48 g / cm3
N° CAS: 3483-12-3
1,4-Dithiothreitol (D.T.T) BIOCHEM Chemopharma LOT :321030001-1017-011A
Formule brute: C4H10O2S2
MM: 154.24 g/mol
Pureté : ≥ 99%
N° CAS :1310-73-2
Hydroxyde de sodium BIOCHEM Chemopharma LOT : B1310-73-2-0109-011
Formule brute : NaOH
MM : 40 g/mol
Pureté : 97%
Eau physiologique stérile MICROBIOLAB MALIM LOT : 003-10/2017
Eau bi-distillée
2.4 Verreries, consommables et autres
Tableau 5. Verreries, consommables et autres utilisés dans le présent travail.

Verreries • Fioles de 25ml, 50ml, 250ml.
• Béchers
• Eprouvette de 10ml ;100ml
• Verres de montre
• Erlenmeyer de 500ml
Consommables • Tubes à essai en verre
• Embouts bleus et jaunes
• Papiers filtre millipores
• Tube Eppendorfs
• Seringue
• Outils de protection : Gants, bavettes.
Autres • Pissettes
• Spatules
• Portoirs
• Micropipettes de 1000μl, 500 μl, 100μl ,10μl
• Filtre à seringue 0.45µl
3 Méthode
3.1 Principe de la méthode
La méthode a consisté à séparer la 6-MP et ses métabolites, 6-TG et 6MMP présents dans les
globules rouges lavées avec l’eau physiologique par HPLC en phase inverse et les quantifier
par un détecteur UV-Visible.
35
La procédure de dosage a été basée sur les publications de Dervieux et Boulieu ainsi que
Lennard et Singleton qui permet la quantification rapide des niveaux intra-érythrocytaires de
6-MP, 6-TGN et 6- MMP.
Afin de valider cette technique de dosage ; les recommandations actuelles de l’EMA (2019)
sur la validation des méthodes bio-analytiques ont été suivies.
3.2 Mise au point de la méthode de dosage
3.2.1 Préparation des échantillons cliniques
Le sang total des patients prenant le 6-MP et des volontaires sains a été prélevé dans des tubes
EDTA et les globules rouges ont été séparés par centrifugation à 4000 tours/mn pendant 3 min.
Le plasma surnageant riche en plaquettes et la couche leucocytaire contenant les leucocytes et
les plaquettes ont été éliminés.
Le lavage du culot globulaire a été effectué par deux volumes de solution de Hanks dans le
premier essai et par l’eau physiologique dans les essais ultérieurs. Après une centrifugation à
4000 tours/mn pendant 3 min ; le surnageant obtenu a été jeté et les érythrocytes ont été mis en
suspension dans la solution de Hanks/ eau physiologique à une densité de 8×10 8 érythrocytes/
200µl. Cette suspension a été conservée dans des tubes Eppendorf à -20ºC jusqu'à ce qu'e soit
requise pour un traitement ultérieur.
3.2.2 Préparation des standards d’étalonnage sans matrice
3.2.2.1 Solutions mères
La solution mère de 6-MP à une concentration de 208.0 µg/ ml a été préparée. Dans une fiole
jaugée de 25 ml, 5.2 mg du métabolite pur 6-MP a été pesé et dissous dans 1 ml de NaOH à
0.1M. On complète par la suite au trait de jauge avec l’eau distillée.
Les solutions mères de 6-TG et 6-MMP aux concentrations de 185.6 et 242.5 µg/ml,
respectivement, ont été préparées en dissolvant 4.54 mg du métabolite pur 6-TG et 5.93 mg du
6-MMP dans 1 ml de NaOH à 0.1M, diluant avec 21 ml d’eau distillée et en acidifiant avec 2.5
ml de HCl à 0.1M.
36
3.2.2.2 Dilution des solutions mères
La dilution des solutions mères a été faite par une solution de DTT à une concentration de 154
mg/ ml pour préparer trois standards d’étalonnage de concentrations haute, intermédiaire et
basse.
Les différentes concentrations ainsi que les volumes de la solution de DTT nécessaires ont été
calculés.
Pour l’étape de la mise au point ; seulement la deuxième dilution pour chaque métabolite a été
préparée en mettant le volume approprié de la solution DTT à 154 mg/ml dans un tube à essai,
on enlève 10 µl de cette solution et on la remplace par 10 µl de la solution mère.
Les dilutions effectuées ainsi que le volume de DTT nécessaire pour chaque dilution sont
résumées dans le tableau 6.
Tableau 6. Concentrations des standards d’étalonnage préparés.

Métabolite Niveau de dilution nx Cx VDTT (ml)
(pmol) (µmol/l)
H 200 0.8 3.4
6-MP I 160 0.64 4.25
B 80 0.32 8.6
H 1230 4.92 0.45
6-TG I 410 1.64 1.354
B 164 0.656 3.384
H 24000 96 0.03
6-MMP I 6000 24 0.1215
B 1500 6 0.48613
3.2.3 Préparation des standards de validation
Une aliquote de 50 µl de chacun des standards d’étalonnage a été ajoutée à 200 µl des
suspensions érythrocytaires obtenues des volontaires sains (qui n’avaient pris aucun
médicament). Les concentrations finales des métabolites dans les standards de validation sont
présentés dans le tableau 7.
37
Tableau 7. Concentrations des standards de validation préparés.

Métabolites Niveau de dilution Csv (µmol/l)
H 4
6-MP I 3.2
B 1.6
H 24.6
6-TG I 8.2
B 3.28
H 480
6-MMP I 120
B 30
3.2.4 Préparation des contrôles-qualité (CQ)
Des contrôles qualité bas et hauts ont été préparés pour chacun des métabolites 6-MP, 6-TG et
6-MMP de la même manière que les standards d’étalonnage. Ils ont été inclus et analysés au
début et en fin de chaque série d’analyses. Les valeurs obtenues permettent d’accepter ou de
rejeter l’ensemble de la série.
3.2.5 Traitement pré-analytique des échantillons
Après analyse des données de la littérature, la procédure suivante a été employée.

200 µl de suspension érythrocytaire, 100 µl de solution de DTT à une concentration de 75 mg/
ml et 50 µl d’eau bi-distillée ont été ajoutés à un tube Eppendorf maintenu dans un bain de
glace.
Après homogénéisation, la suspension a été traitée avec 50 µl de l'acide perchlorique à 70%,
mélangée avec un mélangeur vortex pendant 30 s, et centrifugée à 1500 tours/ min pendant 10
min à température ambiante.
300 µl du surnageant a été transféré dans un autre tube Eppendorf bien fermés et chauffé à
100ºC pendant 45 min.
Les échantillons hydrolysés ont été conservés dans un bain de glace.
3.2.6 Préparation de la phase mobile
Deux phases mobiles différentes ont été préparées durant la mise au point pour ajuster la
sélectivité.
38
3.2.6.1 Première phase mobile
Elle a été effectuée avec du méthanol-eau (7,5 :92,5, v/v) contenant 100 mM de triéthylamine
et ajustée à un pH de 3,2 avec de l'acide phosphorique 0,1M.
3.2.6.2 Deuxième phase mobile
Pour un volume total de 100 ml :

- Une solution de KH2PO4 à 0.02M a été préparée en dissolvant 0.272 mg de KH 2PO4 dans 100
ml d’eau distillée, ajustée le pH à 2.25 par l’acide phosphorique (85%).
- 3 ml d’acétonitrile et 1 ml de méthanol ont été ajoutés à 96 ml de la solution précédente.
L’eau utilisée dans la préparation des deux phases mobiles a été filtrée.
3.2.7 Essai chromatographique
Les standards d’étalonnage et de validation filtrés à l’aide d’un filtre-seringue de porosité 0.22
µm, ainsi que les échantillons cliniques ont été injectés manuellement avec un volume
d’injection de 20 µl et analysés par un système HPLC Shimadzu précédemment décrit dans
« l’appareillage » avec un débit de la phase mobile de 1.4 ml/min et un détection UV-Visible à
des longueurs d’onde de : 303 nm pour le 6-MMP, 322 nm pour le 6-MP et 342 nm pour le 6-
TG.
Pour les autres paramètres, il a été fixé une température de colonne de 27ºC et un temps
d’analyse de 15 min pour chaque échantillon.
La solution de DTT a été injectée aussi afin de déterminer le pic de ce dernier.
3.3 Validation de la méthode bio-analytique
Les paramètre de validation n’ont été testés que sur les métabolites 6-TG et 6-MMP en raison
de la quantité insuffisante du DTT pour valider le dosage de 6-MP.
La validation a été effectuée sur trois jours successifs, chaque solution a été injectée trois fois
par jour.
3.3.1 Méthodes statistiques et analyse des données
Toutes les données HPLC ont été collectées et analysées sur le logiciel [Shimadzu Batna]. La
linéarité a été calculée à l'aide d'une analyse de régression linéaire. Moyennes, écarts types et
CV% ont été calculés à l'aide de Microsoft® Excel.
39
3.3.2 Procédure de validation
3.3.2.1 Spécificité et Sélectivité
La sélectivité de la méthode d’analyse HPLC a été démontrée en injectant des échantillons des
érythrocytes emballés vierges (des patients ne recevant pas le traitement) et en vérifiant
l’absence des pics.
3.3.2.2 La linéarité
Des courbes d'étalonnage ont été créées pour chaque métabolite 6-TG et 6-MMP
individuellement en préparant 3 niveaux de concentration (bas, intermédiaire et haut).
Chaque concentration a été injectée 3 fois.
Les courbes d’étalonnage ont été décrites par une fonction de réponse Y= aX+b, où Y est l’aire
du pic, X est la concentration de l’analyte.
Pour chaque point de la gamme d’étalonnage réalisé le même jour ou à des jours différents, et
à partir de la fonction de réponse, une concentration est recalculée (C’) ainsi que le coefficient
de variation correspondant.
La linéarité a été évaluée en calculant le coefficient de détermination R² qui doit être supérieur
à 0.99.
3.3.2.3 Limite de détection et de quantification
La limite de détection (LOD) est la concentration à laquelle le signal est égal à 3 fois le signal
de base, et la limite de quantification (LOQ) est la concentration à laquelle le signal est égal à
10 fois le signal de base. Elles ont été calculées selon les recommandations de l'International
Conférence on Harmonisation (ICH) en utilisant les équations suivantes :
LOD = 3,3 δ / S
LOQ = 10 δ / S
Où δ est l’écart-type de la réponse et S est la pente de la droite de calibration.
σ a été calculé en utilisant la fonction Steyx dans Excel.
3.3.2.4 Exactitude et précision
L'exactitude et la précision inter- et intra-journalières de la méthode développée ont été

calculées en analysant 3 niveaux des CQ.
40
L'exactitude a été exprimée en pourcentage d'erreur relative moyenne (RE%) :
RE% = [(C introduite – C calculée) / C introduite] × 100
La précision a été exprimée en pourcentage de coefficient de variation (CV%) :
CV% = (Ecart-type / Moyenne) × 100
3.3.2.5 Justesse
La justesse a été exprimée en termes de biais absolu, de biais relatif et de taux de recouvrement
pour 3 niveaux de concentration des standards de validation pour le 6-MMP et 6-TG. Les
formules utilisées pour le calcul de la justesse sont présentées dans le tableau 8.
Tableau 8. Différentes façons du calcul de la justesse.

Type de biais Formule de calcule
Biais absolu Biais j = ǖ j - 𝑥̅ j
Biais relatif ǖ j − 𝑥̅ j
Biais (%) j = × 100
𝑥̅ j
Taux de recouvrement ǖj
Recouvrement (%) j =
𝑥̅ j
3.3.2.6 Rendement d’extraction et effet matrice
Il a été calculé comme le rapport entre la réponse du détecteur pour une certaine concentration
de 6-TG et 6-MMP dans des globules rouges et la réponse du détecteur obtenue pour les
standards d’étalonnage contenant la même concentration des composés. Il a été testé sur 3
niveaux de concentration. Il doit être égal à +/- 15 % celui de l'analyte.
41
RESULTATS
Résultats
1 Résultats de la mise au point

1.1 Chromatogrammes obtenus
Les figures représentent les chromatogrammes obtenus avec :

✓ Phase mobile
Figure 6. Chromatogramme de la phase mobile utilisée

✓ DTT
Figure 7. Chromatogramme obtenu avec le DTT à 303nm
42
RESULTATS
43
RESULTATS
✓ 6-MP
Figure 10. Chromatogramme obtenu avec le standard d’étalonnage 6-MP sans matrice à
322nm
✓ 6-TGN
Figure 11. Chromatogramme obtenu avec le standard d’étalonnage 6-TGN sans

matrice à 342nm
44
RESULTATS
✓ 6-MMP
Figure 12. Chromatogramme obtenu avec le standard d’étalonnage 6-MMP sans matrice à
303nm
1.2 Moyenne des temps de rétention obtenus
Tableau 9. Moyenne des temps de rétention obtenus.
COMPOSE MOYENNE DES TEMPS DE RETENTION (min)

DTT 3.02
6-MP ----
6-TGN 1.4
6-MMP 1.6
2 Résultats de validation
2.1 Spécificité et Sélectivité
La spécificité et la sélectivité étaient évaluée telle que définie dans le chapitre « validation »
dans la partie théorique et les résultats sont les suivants :
45
RESULTATS
Figure 13. Chromatogramme d’échantillon de matrice traités sans ajout d'un analyte à 342 nm
Figure 14. Chromatogramme d’échantillon de matrice traités avec ajout de 6-TGN à 342 nm
46
RESULTATS
Figure 15. Chromatogramme d’échantillon de matrice traités sans ajout d'un analyte à 303 nm
Figure 16. Chromatogramme d’échantillon de matrice traités avec ajout de 6-MMP à 303 nm
2.2 Courbes d’étalonnage et linéarité
Les résultats sont obtenus en utilisant le modèle de régression linéaire simple y=ax+b sur le
logiciel Microsoft Excel.
47
RESULTATS
Tous les résultats sont présentés dans les tableaux 10, 11 et 12 pour 6-TGN et tableaux 13, 14
et 15 pour 6-MMP et les courbes dans les figures 17,18 et 19 pour 6-TGN et 20,21 et 22 pour
6-MMP.
➢ Courbes d’étalonnage de 6-TGN
Tableau 10. Résultats de dosage du 6-TGN de la première série.
REPETITIONS
NIVEAUX
SERIE01
QUANTITE REPONSE QUANTITE REPONSE
INTRODUITE INSTRUMENTALE CALCULEE CALCULEE
« X » (pmol) «Y» « X* » (pmol) « Y* »
B 01 164 9.56 183.815973 9.20604317
02 164 8.55 127.27198 9.20604317
03 164 8.17 105.998003 9.20604317
I 01 410 14.8 477.172926 13.6001439
02 410 13.92 427.906873 13.6001439
03 410 13.82 422.308458 13.6001439
H 01 1230 30.27 1343.24775 28.2471463
02 1230 26.92 1155.70084 28.2471463
03 1230 27.15 1168.5772 28.2471463
PENTE 0.01786
ORDONNE ORIGINE 6.277
ERREUR PENTE ± 0.0008862
ERREUR ORDONNE
ORIGINE ± 0.6687
R² 0.9839
EQUATION Y = 0.01786*X + 6.277
35 SERIE 01
30
Réponse (aires des pics)
25
20
15
y = 0.0179x + 6.2766
10
R² = 0.9831
5
0
0 200 400 600 800 1000 1200 1400
quantité introduite (pmol)
Figure 17. Courbe d’étalonnage du 6-TGN obtenue avec la fonction y=ax+b (série 01)
48
RESULTATS
NIVEAUX Tableau 11. Résultats de dosage du 6-TGN de la deuxième série.
SERIE 02
INTRODUITE « X » INSTRUMENTALE CALCULEE CALCULEE
(pmol) «Y» « X* » (pmol) «Y»
B 164 4.8 103.533753 5.22553957
I 410 7.51 488.606121 6.95679856
H 1230 12.6 1211.86013 12.7276619
PENTE 0.00704
ERREUR ORDONNE
ORIGINE ± 0.6782
R² 0.9839
EQUATION Y = 0.007038*X + 4.071
14
SERIE 02
12
Répoonse (aires des pics)
10
6
y = 0.007x + 4.0714
4 R² = 0.9839
0
0 200 400 600 800 1000 1200 1400
quantité introduite (pmol)
49
RESULTATS
Tableau 12. Résultats de dosage du 6-TGN de la troisième série
SERIE03
NIVEAUX
QUANTITE REPONSE QUANTITE

INTRODUITE « X » INSTRUMENTALE CALCULEE « X* » REPONSE
(pmol) «Y» (pmol) CALCULEE « Y »
B 164 4.36 159.811991 4.40964029
I 410 7.39 415.444412 7.32546763
H 1230 17.03 1228.7436 17.0448921
PENTE 0.01185
ERREUR ORDONNE
ORIGINE ± 0.07911
R² 0.9999
EQUATION Y = 0.01185*X + 2.466
20
18
SERIE 03
16
Réponse (aires des pics)
14
12
10
8
y = 0.0119x + 2.4658
6
R² = 0.9999
4
2
0
0 200 400 600 800 1000 1200 1400
Quantité introduite (pmol)
50
RESULTATS
➢ Courbes d’étalonnage de 6-MMP
Tableau 13. Résultats de dosage du 6-MMP de la première série.
SERIE 01
NIVEAUX
REPETITIONS
QUANTITE
REPONSE QUANTITE REPONSE
(pmol) «Y» « X* » (pmol) «Y»
B 1 1500 0.45 -791.2978 1.01142857
2 1500 0.64 -15.8713 1.01142857
3 1500 0.57 -301.5547 1.01142857
I 1 6000 2.09 5901.8571 2.11404762
2 6000 2.15 6146.7286 2.11404762
3 6000 3.82 12962.319 2.11404762
H 1 24000 5.79 21002.267 6.52452381
2 24000 6.25 22879.616 6.52452381
3 24000 7.19 26715.936 6.52452381
PENTE 0.000245
ERREUR ORDONNE
ORIGINE ± 0.3985
R² 0.9171
EQUATION Y = 0.0002450*X + 0.6439
SERIE 01
8
7
Réponse ( aires des pics)
6
5
4
3
2 y = 0.000245x + 0.643
R² = 0.917
1
0
0 5000 10000 15000 20000 25000 30000
Figure 20. Courbe d’étalonnage du 6-MMP obtenue avec la fonction y=ax+b (série 01)
51
RESULTATS
Tableau 14. Résultats de dosage du 6-MMP de la deuxième série.
SERIE 02
NIVEAUX

(pmol) «Y» « X* » (pmol) «Y»
B 1500 1.27 -1586.14232 2.0547619
I 6000 4.18 9857.6779 3.19904762
H 24000 7.58 23228.4644 7.77619048
PENTE 0.000254286
ERREUR PENTE ±0.00007551
ERREUR ORDONNE
ORIGINE ± 1.081
R² 0.919
EQUATION Y = 0.0002543*X + 1.673
SERIE 02
9
8
7
6
5
4
y = 0.000254x + 1.673
3
R² = 0.919
2
1
0
0 5000 10000 15000 20000 25000 30000
52
RESULTATS
NIVEAUX Tableau 15. Résultats de dosage du 6-MMP de la troisième série.
SERIE 03
INTRODUITE INSTRUMENTALE CALCULEE CALCULEE
« X » (pmol) «Y» « X* » (pmol) «Y»
B 1500 0.71 2049.39759 0.63761905
I 6000 1.14 5313.25301 1.23047619
H 24000 3.62 24137.3494 3.60190476
PENTE 0.000131746
ERREUR PENTE ±0.000006965
ERREUR ORDONNE
ORIGINE ± 0.09966
R² 0.9972
EQUATION Y = 0.0001317*X + 0.4400
SERIE 03
4
3.5
3
2.5
2
1.5
y = 0.0001317x + 0.44
1
R² = 0.997
0.5
0
0 5000 10000 15000 20000 25000 30000
53
RESULTATS
2.3 Linéarité
L’étude de la linéarité nécessite le traçage des droites de régression linéaire de la

concentration prédite en fonction de la concentration introduite f(x) = x*.
Les résultats sont présentés dans les figures 23 et 24.
➢ Etude de linéarité des trois séries de 6-TGN
Linéarité aX+b Série01

y = x - 2E-14
1600 R² = 0.983
1400
Série02
Quantité calculée (pmol)
1200 y=x
1000 R² = 0.983
800 Série03
600 y=x
R² = 0.999
400
200 Q.calculée série 01
0 Q.calculée série 02
0 200 400 600 800 1000 1200 1400
Quantité introduite ( pmol) Q.calculée série 03
Figure 23. Résultats de l’étude de linéarité des trois séries de 6-TGN
➢ Etude de linéarité des trois séries de 6-MMP
30000 Série01
Linéarité ax+b y = x - 4E-12
25000 R² = 0.917
Quantité calculée (pmol)
Série02
20000 y = x + 8E-13
R² = 0.919
15000
Série03
10000 y=x
R² = 0.997
5000 Q.calculée 01
0 Q.calculée 02
0 5000 10000 15000 20000 25000 30000
-5000 Q.calculée 03
Figure 24. Résultats de l’étude de linéarité des trois séries de 6-MMP
54
RESULTATS
2.4 Limite de détection et de quantification
La LOD et la LOQ ont été calculées en utilisant les équations décrites précédemment et se
sont révélées être les suivantes pour les métabolites 6-TGN et 6-MMP en milieu intra-
érythrocytaire (tableau 16)
Tableau 16. Résultats de calcul du LOD et LOQ pour les métabolites 6-TGN et 6-MMP.
Série 6-TGN 6-MMP
LOD LOQ LOD LOQ

(pmol) (pmol) (pmol) (pmol)
01
223.846034 678.321316 10938.928 33148.2667
02
332.697357 1008.17381 16500.4027 50001.2204
03
23.0432606 69.8280625 2937.41524 8901.25831
MOYENNE
193.195551 585.441063 10125.582 30683.5818
ECART TYPE
157.085977 476.018111 6817.97669 20660.5354
CV %
81% 81% 67% 67%
2.5 Exactitude et précision
Les résultats d’étude de répétabilité et répétabilité intermédiaire pour les métabolites 6-TGN
et 6-MMP en intra-érythrocytaire sont résumées dans le tableau 17.
Tableau 17. Exactitude et précision de dosage du 6TGN et 6-MMP
Quantité introduite
Répétabilité (n=3) Répétabilité intermédiaire (n=3)

Métabolites
(pmol)
Exactitude Précision Exactitude Précision

Moyenne± écart
Moyenne ±écart type type
(pmol) RE% CV% (pmol) RE% CV%
164 139.028 ± 40.219 15 29 134.125 ± 28.458 18 21

6-TGN
410 442.463 ± 30.189 -8 7 448.838 ± 36.995 -9 8
1230 1222.508 ± 104.761 1 9 1221.037 ± 8.537 1 1
1500 369.574 ± 392.162 125 -106 31.227 ± 1850.613 98 5926

6-MMP
6000 8336.968 ± 4007.54 -39 48 7835.966 ± 2313 -31 30
24000 23532.606 ± 2912.267 2 12 23632.80 ± 462.653 2 2
55
RESULTATS
2.6 Justesse
Les résultats d’étude de justesse pour les métabolites 6-TGN et 6-MMP en intra-
érythrocytaire sont résumées dans les tableaux 18, 19 respectivement.
➢ Etude de justesse de 6-TGN
Tableau 18. Justesse calculée pour chaque niveau de concentration des standards de
validation pour le 6-TGN.
NIVEAUX B I H
MOYENNE DE QUANTITE
INTRODUITES (pmol) 164 410 1230
MOYENNE DE QUANTITE
CALCULEE (pmol) 134.124799 448.837762 1221.03744
BIAIS ABSOLU -29.8752013 38.8377617 -8.9625604
BIAIS RELATIF (%) -18% 9% -1%
TAUX DE RECOUVREMENT (%) 82% 109% 99%
➢ Etude de justesse de 6-MMP
Tableau 19. Justesse calculée pour chaque niveau de concentration des standards de
validation pour le 6-MMP.
NIVEAUX B I H
MOYENNE DE QUANTITE
INTRODUITES (pmol) 1500 6000 24000
MOYENNE DE QUANTITE
CALCULEE (pmol) 31.2268874 7835.96639 23632.8067
BIAIS ABSOLU -1468.77311 1835.96639 -367.193278
BIAIS RELATIF (%) -98% 31% -2%
TAUX DE RECOUVREMENT (%) 2% 131% 98%
2.7 Rendement d’extraction et effet matrice
Les résultats de calcul des rendements d’extraction dans l’intra-essai et l’inter-essai pour les
métabolites 6-TGN et 6-MMP sont résumés dans les tableaux 20 et 21 respectivement.
56
RESULTATS
Tableau 20. Résultats de calcul de rendement d’extraction pour 6-TGN.
INTRA-ESSAI (N=3)
REPETITION
NIVEAUX
REPONSE REPONSE RENDEMENT

INSTRUMENTALE INSTRUMENTALE D’EXTRACTION MOYENNE
AVEC MATRICE SANS MATRICE (%)
1 9.56 62.92 15%
2 8.55 41.87 20%
B 3 8.17 41.91 19% 18%
1 14.8 55.79 27%
2 13.92 55.6 25%
I 3 13.82 55.6 25% 25%
1 30.27 69.29 44%
2 26.92 58.99 46%
H 3 27.15 61.82 44% 44%
INTER-ESSAI (N=3)
NIVEAUX
SERIE

1 9.56 62.92 15%
2 4.8 16.36 29%
B 3 4.36 21.67 20% 22%
1 14.8 55.6 27%
2 7.51 17.23 44%
I 3 7.39 49.92 15% 28%
1 30.27 69.29 44%
2 12.6 28.79 44%
H 3 17.03 37.95 45% 44%
57
RESULTATS
Tableau 21. Résultats de calcul de rendement d’extraction pour 6-MMP.
INTRA-ESSAI (N=3)
REPONSE
REPETITION
NIVEAUX
INSTRUMENTALE REPONSE RENDEMENT

AVEC MATRICE INSTRUMENTALE D’EXTRACTION MOYENNE
SANS MATRICE (%)
1 0.45 1.98 23%
2 0.64 2.02 32%
B 3 0.57 2.21 26% 27%
1 2.09 4.87 43%
2 2.15 4.82 45%
I 3 3.82 5.06 75% 54%
1 5.79 16.22 36%
2 6.25 85.44 7%
H 3 7.19 87.85 8% 17%
INTER-ESSAI (N=3)
NIVEAUX
SERIE

1 0.45 1.98 23%
2 1.27 8.49 15%
B 3 0.71 2.08 34% 24%
1 2.09 4.87 43%
2 4.18 16.08 26%
I 3 1.14 5.22 22% 30%
1 5.79 16.22 36%
2 7.58 32.46 23%
H 3 3.62 13.7 26% 28%
58
DISCUSSION
Discussion
Le choix de la méthode d’analyse, de la matrice dans laquelle les métabolites seront dosés et
surtout le prétraitement de l’échantillon biologique sont des étapes clés qui précèdent la
validation proprement dite.
Plusieurs méthodes ont été rapportées pour la détermination de la 6-MP et de ses métabolites
dans les fluides biologiques. La méthode idéale devrait permettre d'évaluer la conformité du
patient au traitement, ainsi que de mesurer l'absorption, le transport et l'accumulation des
métabolites cytotoxiques.
Les érythrocytes ont été choisis comme matrice pour la quantification des métabolites car ils
sont plus appropriés pour l'évaluation de l'utilisation régulière du médicament lors d'un
traitement à long terme, en raison qu’un état d'équilibre est atteint et doit ensuite être maintenu.
Parmi les méthodes proposées, celle de Lennard et Singleton qui utilise l'acétate de phényl
mercurique et du toluène pour transformer le métabolite 6-MMP, non quantifiable par HPLC,
en un dérivé quantifiable. Mais qui présente comme inconvénient la haute toxicité du réactif.
Dans l’étude présente, on a donc suivi la procédure de pré-traitement de Dervieux et Boulieu
qui utilise l'acide perchlorique à 70 % pour la déprotéinisation combinée avec le protocole
d’HPLC décrit dans la partie « Méthode » pour l’analyse simultanée de 6-MP et ses métabolites
dans les échantillons sanguins [59].
1 Mise au point de la méthode analytique

Après avoir préparé les échantillons et les solutions nécessaires pour l’analyse, une mise au
point a été entamée en essayant d’abord d’avoir un début de séparation. Cette étape a pris
beaucoup de temps à cause d’un problème technique de détecteur qui a été découvert plus tard.
Ensuite, et dans le but d’ajuster la sélectivité de l’appareil, deux phases mobiles ont été testées,
l’une à base de méthanol et l’autre à base d’acétonitril. Vu que la différence des résultats n’était
pas considérable, on a fini par utiliser le méthanol.
L’optimisation de cette phase mobile a consisté à réaliser plusieurs injections d’une solution
contenant les métabolites en faisant varier le pourcentage d’eau. Une proportion d’une phase
mobile méthanol/eau (7.5 ; 92.5 v/v) a été choisie.
Un temps d’analyse de cinq minutes a été jugé suffisant pour chaque test après avoir analysé
les standards d’étalonnage et de validation pendant 15 minutes et après avoir observé que rien
n’était détecter après la cinquième minute.
59
DISCUSSION
Le dosage de la solution de DTT a été effectué pour identifier le pic de ce dernier.
Après cette longue étape de mise au point de la méthode analytique et d’optimisation des
conditions opératoires du protocole original, les pics des métabolites 6-TG et 6-MMP ont été
identifiés dans les standards d’étalonnage et de validation. Alors que celui du 6-MP n’était pas
détectable dans la longueur d’onde 322nm par manque de sélectivité de l’appareil pour ce
métabolite.
2 Validation de la méthode bio-analytique

L’acceptation d’une méthode bio-analytique, quant à sa fiabilité est généralement décédée sur
la base de calcul des limites de confiance des mesures d’exactitude et l’estimation de sa
précision au moyen du calcul des coefficients de variation. Cette approche est en fait, basée sur
l’outil statistique comme un moyen d’analyse et de prise de décision en même temps.
On a donc fait ces calculs et observations pour essayer de valider la méthode développée selon
les recommandations de l’EMA.
➢ Spécificité et Sélectivité
En comparant les chromatogrammes des blancs (matrice non chargée) avec les
chromatogrammes de matrice chargée, nous observons une bonne séparation des différents
composants de la matrice ainsi que l'absence d’une réponse au temps de rétention des
métabolites concernés par l’étude présente, ce qui confirme la spécificité et la sélectivité de la
méthode.
➢ Courbes d’étalonnage et linéarité
Les courbes d’étalonnages des 3 séries obtenus pour le 6-TGN ont données des coefficients de
corrélations R² ≥ 0.98 qui est une valeur importante (proche de 01). Cette dernière exprime la
présence d’une relation linéaire forte entre les variables.
Les courbes d’étalonnages des séries obtenus pour le 6-MMP ont données des coefficients de
corrélations R² ≥ 0.91 pour la série 01 et 02, et R² ≥ 0.99 pour la série 03. Ces valeurs sont
proches de 01 et donc ils expriment une relation linéaire entre les valeurs.
L’étude de linéarité pour les deux métabolites (6-TGN et 6-MMP) a révélé des pentes égales à
1 (statistiquement différent de zéro), des ordonnées à l'origine non statistiquement différente de
zéro et des R² supérieurs à 0,99 pour les trois séries. Cela démontre que la procédure est capable
de donner des résultats directement proportionnels à la concentration en 6-TGN et en 6-MMP
pour les échantillons à tester à l’avenir.
60
DISCUSSION
➢ Limite de détection et de quantification
Les valeurs moyennes du LOD pour les 3 séries du 6-TGN et 6-MMP sont 193 pmol/ 8x 108
érythrocytes (0.772 µmol/l) et 10125 pmol / 8x 108 érythrocytes (40.5 µmol/l) respectivement,
elles ne sont pas adéquates avec les valeurs d’exactitude fixés par l’EMEA (CV > 20%).
Les valeurs moyennes du LOQ pour le 6-TGN et le 6-MMP sont 585 pmol/ 8x 108 érythrocytes
(2.34 µmol/l) et 30683 pmol/ 8x 108 érythrocytes (122.732 µmol/l) respectivement, ces
concentrations se situent en dehors de l’intervalle d’exactitude imposé par l’EMA (CV > 20%).
Cette grande déviation de la fourchette autorisée est due principalement à la variation intra et
inter-série de la température de la colonne HPLC qui était élevée pour les 2 premières séries
(entre 39°C et 45°C), ces 2 séries ont donné des LOD et LOQ anormalement grandes, supérieur
au niveau de concentrations basse et de concentrations intermédiaires. Pour la série 03, la
température était fixée à 27°C et les valeurs de LOD et LOQ étaient très raisonnables.
➢ Exactitude et précision
La répétabilité est validée pour tous les niveaux de concentrations du 6-TGN (CV ≤15% et RE
≤ ±15%) et pour le niveau intermédiaire et le niveau haut du 6-MMP.
La répétabilité intermédiaire n’est validée que pour le niveau intermédiaire et haut du 6-TGN
et le niveau haut du 6-MMP (CV ≤15% et RE ≤ ±15%).
75% des points étudiés du 6-TGN se situent dans la fourchette autorisée par l’EMA ce qui nous
permet de conclure que la méthode est exacte et précise pour le dosage du 6-TGN en inter et
intra-essai.
➢ Justesse
L’accord entre la valeur de la quantité moyenne calculée obtenue à partir des trois séries de
validation et la valeur de la moyenne des quantités théoriques considérées comme étant la valeur
de référence est assez étroit pour tous les niveaux du 6-TGN (biais relatif < 10%).
Mais on remarque que pour le 6-MMP, la quantité moyenne calculé du premier et deuxième
niveau, s’éloigne de la valeur de référence (le biais relatif est supérieur à 10 %.) par contre, le
biais relatif est inférieur à10% pour le troisième niveau.
On peut conclure que la justesse de la méthode est validée pour le métabolite 6-TGN.
➢ Rendement d’extraction et effet matrice
Le rendement d’extraction varie du 15% à 46% pour le 6-TGN et du 7% à 75% pour le 6-MMP
en intra-essai. Il varie du 15% à 45% pour les deux métabolites en inter-essai.
61
DISCUSSION
Tous les taux d’extraction sont inférieurs à 100% ce qui nous permet de conclure que la matrice
utilisée a un effet sur l’extraction et le dosage des métabolites étudiés.
3 Limites de l’étude
La comparaison de notre étude avec les études précédentes n’était pas possible à cause des
obstacles liés aux appareillages et aux conditions opératoires. Dans le protocole suivi, ils ont
utilisé un détecteur SPD-M10A diode array UV et une colonne C18 (100 x 8 mm) pour leur
étude, par contre on a utilisé un détecteur SPD 10AV UV-Vis et une colonne C18 (125 x 4.6
mm).
La validation des méthodes analytique en milieux biologique présente des difficultés énormes
en termes d’application des protocoles de dosage, de la complexité des matrices et la nécessité
de matériel adéquat et adapté…etc. Et ceci sans parler du temps et d’effort qu’il faut pour
procéder à une validation.
On cite les problèmes techniques confrontés :
✓ Le mal fonctionnement du détecteur de la chaine HPLC au début de l’étude, ce problème

a été réglé, mais cela nous a pris beaucoup de temps avant d’entamer l’essai proprement
dit, ainsi que le dépôt de l’acide phosphorique au niveau de la colonne.
✓ A certain moment (au mois de Juin) la température au niveau du laboratoire était très
élevée (+ 37 °C), ce qui nous a causé des problèmes tel que l’évaporation de la phase
mobile.
✓ La quantité insuffisante du DTT, qui représente un réactif incontournable dans le dosage
de thiopurines.
✓ L’absence de l’auto-injecteur qui était parmi les cause de la perte du temps car nous
avions beaucoup d’échantillons à analyser.
Nous devons aussi mentionner que le dosage analytique des thiopurines en général est difficile
à cause du risque de dégradation des métabolites in vitro ce qui nécessite des conditions
opératoires rigoureuses et des manipulations délicates.
62
CONCLUSION GENERALE
Conclusion
En conclusion, les différentes étapes d’une méthode de dosage par HPLC avec un détecteur
UV/Visible du 6-MP et ses métabolites 6-TGN et 6-MMP en milieu inta-érythrocytaires ont été
mises au point et optimisées dans le but d’établir une validation selon les recommandations de
l’EMA 2019.
Les résultats obtenus des paramètres étudiés satisfont aux critères d’acceptation pour le
métabolite 6-TGN. Il est donc conclu que cette méthode est spécifique, sensible, exacte et
précise ce qui atteste sa validité pour ce métabolite.
Cependant, les contraintes confrontés – précédemment citées - pendant cette étude ne

permettaient pas de valider cette technique pour la 6-MP et la 6-MMP.
Les résultats non valides de ces deux métabolites nous laissent penser à proposer des
recommandations afin d’améliorer la méthode de dosage et d’obtenir de meilleurs résultats, à
savoir :
✓ La fixation de la température de la chaine à HPLC à 27°C.

✓ La manipulation dans une salle climatisée à température de 25 à 30°C.
✓ Avoir les quantités suffisantes des réactifs.
✓ Utiliser de l’eau Ultra pure destinée au HPLC.
✓ Optimiser la filtration de toutes les solutions à injecter.
✓ Nettoyage de la colonne avec le méthanol après chaque jour d’utilisation.
✓ L’utilisation d’une pré-colonne qui permet d’éliminer les interférences dues à la
complexité de la matrice.
✓ L’essai d’un plan d’expérience qui permet d’optimiser le protocole opératoire.
✓ Procéder à une étape de pré validation pour améliorer le mieux le protocole de
validation.
✓ Essayer de vérifier encore plus de paramètres surtout la stabilité et la répétabilité de la
méthode.
L’application de cette technique dans le suivi thérapeutique des thiopurines devrait faire
l’objet d’un autre projet afin de pour exploiter son intérêt clinique et déceler des éventuelles
toxicités, bien sûr en revalidant les méthodes de dosage des autres métabolites.
63
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68
ANNEXES
Liste des Annexes

Annexe Ⅰ. Préparation de solution de Hanks……………………………………………….70
Annexe Ⅱ. Préparation de solution d’acide nitrique 30%......................................................70
Annexe Ⅲ. Préparation de solution de NaOH à 0.1M………………………………………70
Annexe Ⅳ. Préparation de solution de HCl à 0.1M…………………………………………71
Annexe Ⅴ. Préparation de solution de DTT à 154 mg/ml…………………………………..71
Annexe Ⅵ. Préparation de solution de DTT à 75 mg/ml……………………………………71
Annexe Ⅶ. Formule de calcul de VDTT nécessaire pour chaque solution fille…………….71
Annexe Ⅷ. Formule de calcul de CX………………………………………………………..72
Annexe Ⅸ. Le protocole suivi dans cette étude………………………………………..........74
Annexe Ⅹ. Lla guideline de l’EMA suivi dans cette validation…………………………….75
69
ANNEXES
AnnexeⅠ. Préparation de solution de Hanks.
Pour VTotal = 1000 ml, on prend :
● 8 g de NaCl [C= 0.14 M ; MM= 58.44g/mol]

● 400 mg de KCl [C = 0.005 M ; MM = 74.55g/mol]
● 140 mg de CaCl2 [C = 0.001M ; MM = 110.98 g/mol]
● 100 mg de MgSO4-7H2O [C = 0.0004M ; MM = 246.47 g/mol]
● 100 mg de MgCl2-6H2O [C = 0.0005M ; MM = 203.303 g/mol]
● 60 mg de Na2HPO4-2H2O [C = 0.0003M ; MM = 177.99 g/mol]
● 60 mg de KH2PO4 [C = 0.0004M ; MM = 136.086 g/mol]
● 1 g de D-Glucose (Dextrose) [C = 0.006M ; MM = 180.156 g/mol]
● 350 mg de NaHCO3 [C = 0.004M ; MM = 84.01 g/mol]
● 1000 ml d’eau distillé
Dans un Becher de 1L, on ajoute les composants un par un dans l’H2O distillé en mélangeant
simultanément par un agitateur magnétique.
Annexe Ⅱ. Préparation de solution d’acide nitrique à 30%.
On prépare V= 100 ml de solution d’acide nitrique (HNO3) à 30% (C = 5.6M) par dilution
d’une solution commerciale d’acide nitrique à 70% (C0 = 15.8 M et MHNO3 = 63.01g/mol) :
Selon la loi de « conservation de la Quantité de Matière », on a :
C0V0=CfVf donc V0 = CfVf / C0 = 5.6*100/15.8 = 35.44 ml
Pour V = 100 ml :
● On prend V0 = 35.44 ml de solution HNO3 commerciale à 70%

● On ajoute de l’H2O jusqu’à avoir V = 100 ml
AnnexeⅢ. Préparation de solution de NaOH à 0.1 M.
On a: CM = 0.1 mol/L; MMNaOH = 39.997 g/mol

Alors : Cm = CM*MM = 0.1*39.997 = 3.9997 g/l
mNaOH= Cm*VT = 3.9997*1 = 3.9997 g
Pour VT = 1000ml :
● Prendre 3.9997g de NaOH
● Ajouter 1000ml d’H2O
70
ANNEXES
AnnexeⅣ. Préparation de solution de HCl à 0.1 M.
On prépare V= 250 ml de solution d’acide chlorhydrique (HCl) à C = 0.1M par dilution

d’une solution commerciale de densité d = 1,19 ; le pourcentage en masse est P = 37% et
MHCl = 36.5g/mol :
On applique la relation ci-dessus pour avoir le V0 d’HCl à prendre :
Pour V = 250 ml :
● On prend V0 = 2.07 ml de solution HCl commerciale à 37%

● On ajoute de l’H2O jusqu’à avoir V = 250 ml
AnnexeⅤ. Préparation de solution de DTT à 154 mg/ml.
On a: VT = 100ml, Cm = 154mg/mL, MMDTT = 154.253g/mol
Alors : mDTT= Cm*VT = 154*100 = 15400mg= 15.4g
● On met 20 ml d’H2O dans une fiole de 100ml

● On ajoute 15.4g de DTT
● Ajouter 0.86 ml d’HCl à 37%
● Compléter avec l’H2O au trait de jaugé
AnnexeⅥ. Préparation de solution de DTT à 75 mg/ml.
On a: VT = 1ml, Cm = 75 mg/mL, MMDTT = 154.253g/mol
Alors : mDTT= Cm*VT = 75 *1 = 75 mg= 0.075 g
● On met 1 ml d’H2O
● On ajoute 0.075 g de DTT
AnnexeⅦ. Formule de calcul de VDTT nécessaire pour chaque solution fille.
On a: VSM=10µl; VSF=250 µl; V’SI =50 µl; VDTT= VSI
Tant que : nSM = nSI et n’SI = nSF on a :
71
ANNEXES
● CSI*VSI = CSM*VSM ………………….1
● CSI*V’SI = CSF*VSF………………………….2
De l’équation 1 et 2 on a :
● VSI = CSM*VSM / CSI…………………3
● CSI = CSF*VSF / V’SI………………………4
On remplace l’équation 4 en 3
● VSI = CSM * VSM * V’SI / CSF*VSF = CSM * VSM * V’SI / nSF
VSI = VDTT = 500 CSM / nSF
6MP 1 2 3 4 5 6
nSF (pmol) 200 160 120 80 40 20
VDTT(ml) 3.4 4.25 5.6 8.5 17 34
6TG 1 2 3 4 5 6
nSF (pmol) 1230 820 410 246 164 82
VDTT (ml) 0.45 0.676 1.354 2.256 3.384 6.768
6MMP 1 2 3 4 5 6
nSF(pmol) 24000 12000 6000 3000 1500 750
VDTT( ml) 0.03 0.06 0.1215 0.243 0.48613 0.97226
AnnexeⅧ. Formule de calcul de Cx.
Cx = nx / Vx
72
ANNEXES
Vx : volume de solution en µl (250µl pour notre étude)
nx : la quantité du métabolite X en pmol
Cx : la concentration du métabolite en µmol/l
Tableaux de conversion des quantités trouvées :
N(pmol) C(µmol/l) N(pmol) C(µmol/l)

103.5338 0.414135 -1586.14 -6.34457
105.998 0.423992 -791.298 -3.16519
127.272 0.509088 -301.555 -1.20622
159.812 0.639248 -15.8713 -0.06349
164 0.656 1500 6
183.816 0.735264 2049.398 8.19759
410 1.64 5313.253 21.25301
6MMP
415.4444 1.661778 5901.857 23.60743

6TGN
422.3085 1.689234 6000 24

427.9069 1.711627 6146.729 24.58691
477.1729 1.908692 9857.678 39.43071
488.6061 1.954424 12962.32 51.84928
1155.701 4.622803 21002.27 84.00907
1168.577 4.674309 22879.62 91.51846
1211.86 4.847441 23228.46 92.91386
1228.744 4.914974 24000 96
1230 4.92 24137.35 96.5494
1343.248 5.372991 26715.94 106.8637
73
ANNEXES
Annexe Ⅸ. Le protocole suivi dans cette étude.
74
ANNEXES
Annexe Ⅹ. La guideline de l’EMA suivi dans cette validation.
75
RESUME
Résumé
Objectif : Mise au point et validation d’une méthode de dosage par HPLC pour quantifier
simultanément les concentrations intra-érythrocytaires de la 6-Mercaptopurine et ses
métabolites ; 6-thioguanine nucléotides et la 6-méthylmercaptopurine en utilisant la détection
par spectroscopie UV-visible. Matériels et méthode : La mise au point de la méthode a
consisté à identifier les pics des métabolites en choisissant les longueurs d’onde
correspondant à l’absorbance maximale et à choisir la phase mobile permettant d’obtenir une
séparation optimale des métabolites. La validation de la méthode a fait appel au protocole
basé sur les publications de Dervieux et Boulieu, Lennard et Singleton ainsi qu’à la guideline
de l’EMA 2019. Résultat et discussion : Les courbes d’étalonnage étaient linéaires pour les
deux métabolites 6-TGN et 6-MMP. L’évaluation de la précision, d’exactitude et de justesse a
donné des résultats qui se situent dans les fourchettes autorisées par l’EMA pour le 6-TGN
mais pas pour le 6-MMP. La méthode est suffisamment spécifique et sensible pour les deux
métabolites. Conclusion : D’après la présente étude, les résultats obtenus satisfont aux
critères d’acceptation pour le 6-TGN. Cette méthode permet donc le dosage de ce dernier.
Alors qu’elle n’est pas validée pour 6-MP et 6-MMP.
Mots clés : Validation bio-analytique, EMA, HPLC, thiopurines, STP.
Abstract
Aim: Development and validation of an HPLC assay method to simultaneously quantify the
intra-erythrocyte concentrations of 6-Mercaptopurine and its metabolites; 6-thioguanine
nucleotides and 6-methylmercaptopurine using UV-visible spectroscopy detection. Materials
and method: The development of the method consisted in identifying the peaks of the
metabolites by choosing the wavelengths corresponding to the maximum absorbance and to
choose the mobile phase allowing to obtain an optimal separation of the metabolites. The
validation of the method used the protocol based on the publications of Dervieux and Boulieu,
Lennard and Singleton and the EMA 2019 guideline. Result and Discussion: The calibration
curves were linear for both metabolites 6-TGN and 6-MMP. Evaluation of precision, accuracy,
and trueness yielded results that were within the ranges allowed by the EMA for 6-TGN but
not for 6-MMP. The method is sufficiently specific and sensitive for both metabolites.
Conclusion: According to the present study, the results obtained meet the acceptance criteria
for 6-TGN. This method therefore allows the determination of 6-TGN. Whereas it is not
validated for 6-MP and 6-MMP.
Keywords: Bio-analitycal validation, EMA, HPLC, thiopurines, STP
‫الملخص‬
6-MMP ‫ و‬6-TGN ، 6-MP ‫ لتحديد تركيز كل من المركبات‬HPLC ‫ تطوير و اثبات فعالية طريقة معايرة بآلة‬:‫الهدف‬
‫ يتمثل تطوير الطريقة في‬:‫ الوسائل والطرق‬.‫في كريات الدم الحمراء باستخدام الكشف الطيفي المرئي لألشعة فوق البنفسجية‬
‫ و في اختيار الطور‬،‫تحديد قمم المركبات على الكروماتوجرام عن طريق اختيار األطوال الموجية المقابلة ألقصى امتصاص‬
‫ اثبات فعالية الطريقة تم باالعتماد على‬.‫المتحرك المناسب الذي يجعل من الممكن الحصول على فصل مثالي للمركبات‬
‫ باإلضافة إلى القواعد اإلرشادية ل‬Singleton ‫ و‬Lennard ، Boulieu ‫ و‬Dervieux ‫البروتوكول المبني علي منشورات‬
‫ أسفر تقييم‬.6-MMP‫ و‬6-TGN ‫ كانت منحنيات المعايرة خطية بالنسبة إلى المركبين‬:‫ النتيجة والمناقشة‬. EMA 2019
‫ الطريقة محددة‬.6-MMP ‫ ولكن ليس ل‬6-TGN ‫ ل‬EMA ‫الدقة والصحة عن نتائج تقع ضمن النطاقات التي يسمح بها‬
‫ فإن النتائج التي تم الحصول عليها تفي‬، ‫ بنا ًء على الدراسة الحالية‬:‫ الخالصة‬.‫وحساسة بما فيه الكفاية لكل من المركبين‬
‫ بينما لم يتم التحقق من صحتها‬.‫وبالتالي تسمح هذه الطريقة بمعايرة وتحديد تركيزات هذا األخير‬. 6-TGN ‫بمعايير القبول لـ‬
.6-MMP ‫ و‬6-MP ‫ل‬
.STP ، ‫ ثيوبورين‬، HPLC ،EMA ، ‫ التحقق التحليلي الحيوي‬: ‫الكلمات المفتاحية‬
76

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N° Série : ......

Mémoire de fin d’études

Mise au point et validation bioanalytique d’une méthode de

Année universitaire : 2020-2021

LE DOYEN Professeur BENABBES Elmoncif

LE VICE DOYEN A LA GRADUATION Professeur LAHMAR Mourad

LE VICE DOYEN A LA POST GRADUATION Professeur DERDOUS Chawki

LE PRESIDENT DU CONSEIL SCIENTIFIQUE Professeur MAHDJOUB Houria

LISTE DES RESPONSABLES DU DEPARTEMENT DE PHARMACIE

CHEF DE DÉPARTEMENT Docteur OUAHAB Ammar

ADJOINT CHEF DÉPARTEMENT CHARGÉE DE LA Professeur GACEM Hocine

ADJOINT CHEF DÉPARTEMENT CHARGÉ DE LA Docteur ZAITER Thamer

PRESIDENT DU COMITE SCIENTIFIQUE Professeur BEN MOUSSA Mohammed Tahar

N° Nom &Prénom Spécialité Module(s) enseigné(s)

JE JURE, EN PRÉSENCE DES MAÎTRES DE LA FACULTÉ, DES CONSEILLER

D'HONORER CEUX QUI M'ONT INSTRUIT DANS LES PRÉCEPTES DE MON

D'EXERCER, DANS L'INTÉRÊT DE LA SANTÉ PUBLIQUE, MA PROFESSION

DE NE JAMAIS OUBLIER MA RESPONSABILITÉ ET MES DEVOIRS ENVERS LE

EN AUCUN CAS, JE NE CONSENTIRAI À UTILISER MES CONNAISSANCES ET

QUE LES HOMMES M'ACCORDENT LEUR ESTIME SI JE SUIS FIDÈLE A MES

QUE JE SOIS COUVERT D'OPPROBRE ET MÉPRISE DE MES CONFRÈRES SI

Nous exprimons aussi notre profonde gratitude à Pr ABDEDEYEM qui a

Un grand merci à Pr CHERIF qui nous a communiqué son savoir durant ce

On souhaite remercier toute personne ayant contribuer de près ou de loin à

Je dédie ce modeste travail et ma profonde gratitude,

À mon cher père,

À mes chers frères et ma petite sœur,

À tous mes amis et collègues

Avec l’expression de ma reconnaissance, je dédie ce modeste travail

À mes adorables frères « Alaeddine et Zakaria »

À ma précieuse binôme « Souha », et à tous nos souvenirs durant ces longues

À tous ceux qui me sont chers.

Chapitre 1 : Rappel sur les thiopurines

Figure 1. Structures chimiques de la purine et des thiopurines. [1]

L'absorption intestinale de l'azathioprine (AZA) varie de 50 à 72 % de la dose initiale

4.2 Distribution des TP

4.3 Métabolisme des TP

Figure 2. Métabolisme simplifié des thiopurines [12].

5 Facteurs modifiant la pharmacocinétique

5.2 Interactions médicamenteuses

Certaines interactions médicamenteuses sont à risque et nécessitent une adaptation

6 Toxicité des thiopurines

6.1 Manifestations générales

6.2 Toxicité hématologique

La myélotoxicité est l’effet indésirable des thiopurines le plus fréquent à l’origine de

6.3 Toxicité hépatique

6.4 Toxicité pancréatique

Chapitre 2 : Suivi thérapeutique pharmacologique des

1 Généralités sur le STP

Selon l’association internationale de suivi thérapeutique pharmacologique et de toxicologie

1.2 Intérêt de STP

1.3 Historique du STP

L’histoire du STP a commencé avec le développement des concepts fondamentaux de la

1.4 Types de STP

1.4.1 Suivi thérapeutique "prospectif" (A priori)

D’après l’IATDMCT, le suivi thérapeutique prospectif comprend la détermination de la dose du

1.4.2 Suivi thérapeutique "rétrospectif" (A posteriori)

D’après l’IATDMCT, le suivi thérapeutique rétrospectif correspond à la signification usuelle

1.5 Modalités pratiques de dosage dans le STP

• Relation dose-concentration du médicament : pour une même dose du médicament, la

2 Suivi des thiopurines

La variabilité inter-individuelle du métabolisme de thiopurines explique une part importante

Figure 3. Algorithme de prise en charge thérapeutique des patients sous