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Intrt de la PCR dans le diagnostic de laspergillose invasive chez les patients immunodprims
PCR-based methods avdantages in the diagnosis of invasive aspergillosis for immunocompromised patients
# S. Challier*, E. Abachin*

RSUM. Depuis la fin des annes 1990, des techniques de biologie molculaire ont t dveloppes afin damliorer le diagnostic de laspergillose invasive chez les patients immunodprims. Nous avons pass en revue les diffrentes techniques values, avec leurs contraintes, leurs avantages et leurs inconvnients. Les rsultats obtenus montrent quil nexiste pas actuellement de technique de rfrence suffisamment performante pour lutilisation diagnostique en routine au laboratoire. Cependant, la mise au point de techniques de PCR en temps rel, mthodologie fiable et rapide, associe aux techniques dextraction automatises, va probablement permettre doptimiser la sensibilit et la spcificit de ces tests. Mots-cls : Aspergillose invasive - Aspergillus sp - PCR - Test ELISA Platelia Aspergillus. ABSTRACT. Since the end of the 1990s, PCR-based methods have been developed to improve the diagnosis of invasive aspergillosis for immunocompromised patients. We reviewed the different methods evaluated including the technical aspects, advantages and disadvantages. Results show that there is currently no gold-standard method performant enough to be used for routine biological diagnosis. However, real-time PCR, reliable and fast technology, associated with automatic extraction will probably allow to have more sensitive and specific tests. Keywords: Invasive aspergillosis - Aspergillus sp - PCR - ELISA Platelia Aspergillus kit.

augmentation du nombre de patients immunodprims ainsi que la svrit des dficits immunitaires induits par de nouvelles thrapeutiques ont favoris, ces dernires annes, la progression des infections fongiques systmiques, notamment chez les patients traits en hmatologie, en cancrologie ou bnficiant dune transplantation. Laspergillose invasive, le plus souvent pulmonaire, arrive au second rang de ces infections. Son incidence aprs allogreffe de moelle osseuse est estime entre 5 et 25 % (1, 2). Cest la principale cause infectieuse de dcs dans cette situation. Lespce responsable est Aspergillus fumigatus dans plus de 90 % des cas (3, 4).

aspergillaires et/ou une culture mycologique positive Aspergillus partir dun site habituellement strile permettent daffirmer le caractre invasif de linfection. Cependant, les prlvements invasifs sont rarement disponibles, et les investigations mycologiques souvent dcevantes. Il est donc difficile de faire la preuve de cette infection svre dont le pronostic est conditionn par la prcocit de mise en place du traitement (1-6). Au cours des dix dernires annes, dautres mthodes de diagnostic ont t dveloppes pour dtecter prcocement des marqueurs de linfection circulant dans le sang : les antignes aspergillaires et lADN fongique. Actuellement, la technique commercialise la plus performante est la recherche par mthode ELISA dun antigne aspergillaire, le galactomannane, composant de la paroi cellulaire spcifique du genre Aspergillus (Platelia Aspergillus, Biorad, France). La sensibilit et la spcificit de ce test ont t values dans diffrentes tudes, mais, jusquen 2001, seules trois tudes prospectives ont port sur un grand nombre de patients dhmatologie (186 807 patients) comportant un nombre significatif de cas daspergillose invasive prouve ou probable (34 71 patients) (7-9). La spcificit du test tait dau moins 94 %. La sensibilit varie

DIAGNOSTIC ACTUEL DE LASPERGILLOSE INVASIVE Le diagnostic de cette infection repose sur un ensemble darguments cliniques et radiologiques souvent peu spcifiques, associs ou non des critres biologiques. Seuls lexamen histologique montrant un envahissement tissulaire par des filaments

* Laboratoire de microbiologie, hpital Necker-Enfants Malades, Paris.

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de 50 % (9) 92,6 % (7), mais nest que de 39,6 % si lon se place avant lapparition des signes cliniques et/ou radiologiques (8). Par ailleurs, cette technique pose galement des problmes de spcificit, avec des taux de faux positifs pouvant atteindre 10 % dans des populations risque de pdiatrie (10). Certains aliments (crales, lait) et certains antibiotiques produits partir de champignons (famille des pnicillines) ont t dcrits comme responsables de translocation digestive de galactomannanes (9, 11, 12). Plus rcemment, en 2003, plusieurs quipes franaises et italiennes (13-15) ont constat une augmentation des rsultats faux-positifs avec ce test. Lexpertise des dossiers des patients risque pour lesquels le suivi tait effectu de faon hebdomadaire a permis de mettre en vidence une corrlation entre ces rsultats et ladministration de pnicillines semi-synthtiques, telle lassociation pipracillinetazobactam. Des ractions croises ont galement t observes avec lassociation amoxicilline-acide clavulanique (16). Les tests ELISA pratiqus sur certains lots de ces antibiotiques ainsi que dautres pnicillines ont confirm la prsence de galactomannanes dans ces mdicaments drivs de molcules produites par le genre Penicillium (14, 15, 17).

(source de faux ngatifs). Il est galement ncessaire doprer dans des enceintes striles, afin dliminer la contamination exogne par les champignons prsents dans lenvironnement, et il faut limiter lutilisation de ractifs pouvant tre contamins lors de leur production comme la zymolyase, enzyme utilise dans certains protocoles dextraction (21). Enfin, les cibles amplifies sont trs varies. Elles sont le plus souvent localises sur les gnes ribosomaux rpts codant pour la sous-unit 18S (22-29) ou pour la sous-unit 28S (30, 31). Dautres cibles spcifiques du genre Aspergillus, comme lADN mitochondrial (20, 32) ou des gnes codant pour des protines spcifiques dAspergillus (33, 34), ont t utilises. Nous ne dvelopperons pas les techniques values sur le LBA, car les rsultats, souvent positifs mais non quantifis, ne permettent pas de diffrencier linfection fongique invasive de la colonisation ou de la contamination, aucun seuil pathologique nayant pu tre dtermin (22, 28, 32, 34). Au cours de laspergillose invasive, plusieurs quipes mettent lhypothse que lADN aspergillaire serait relargu dans la circulation partir des filaments fongiques prsents au niveau du site infectieux, en gnral pulmonaire. Cet ADN a t dtect par PCR partir du srum, du plasma et du sang total. La sensibilit de dtection semble meilleure dans le sang total que dans le plasma (35). En revanche, le srum et le sang total nont pas t compars chez les mmes patients. Les tudes sont gnralement des tudes rtrospectives, non randomises, qui portent sur des sries limites de cas daspergillose invasive documente (groupes de 3 36 patients prsentant une aspergillose invasive probable ou prouve). Peu de techniques ont t values chez de jeunes enfants. Il est donc difficile de comparer ces diffrentes techniques ainsi que les rsultats des valuations publies ce jour (tableau I, page 84).

DIAGNOSTIC FUTUR DE LASPERGILLOSE INVASIVE : CONTRIBUTIONS DE LA PCR Afin damliorer le diagnostic de laspergillose invasive, des techniques de dtection de lADN aspergillaire par PCR ont t dveloppes et values partir du LBA, du sang ou du srum. En labsence de kits commerciaux rfrencs, chaque quipe a dvelopp son propre test. Les techniques le plus souvent dcrites sont la technique de PCR conventionnelle, la PCR niche (nested-PCR) avec rvlation par Southern-Blot ou ELISA, et, depuis les annes 2000, la PCR en temps rel avec rvlation directe de lADN amplifi par des sondes fluorescentes de type Taqman [automates Lightcycler (Roche) ou 7700 (Applied Biosystem)] (18). La mthodologie est souvent discutable. Certaines quipes ont effectu des extractions manuelles, alors quil existe des kits commercialiss adapts (19). Parmi celles qui ont dvelopp des techniques par mthode conventionnelle, dont les techniques de PCR niche, quelques-unes seulement ont utilis systmatiquement des enzymes du type uracile-D-glycosylase pour prvenir les contaminations par des produits pralablement amplifis (principale source de faux positifs) (20). Ces enzymes font partie des ractifs composant les mlanges prts lemploi et commercialiss pour les techniques de PCR en temps rel. De mme, certaines quipes nont pas utilis de contrles internes dextraction et damplification permettant de valider leur technique et de vrifier labsence dinhibiteurs

DIFFRENTES TECHNIQUES DE PCR La spcificit de ces techniques de PCR vis--vis du genre Aspergillus varie de 65 98 % suivant la cible choisie et les modalits techniques. En effet, certaines amorces ou sondes, que ce soit sur les gnes 18S, 58S, 28S ou ITS, nont quun nuclotide de diffrence, ou mme parfois aucun, par rapport aux squences dautres champignons filamenteux appartenant aux genres Penicillium et Paecilomyces, champignons prsents dans lenvironnement ou dans les aliments, mais rarement identifis lors dinfections fongiques invasives. La translocation digestive de leurs galactomannanes est galement responsable de rsultats faussement positifs en antignmie (11). Ces lments rendent difficile le dveloppement dun test spcifique du genre Aspergillus, car la spcificit diagnostique dpend autant de la spcificit de la cible que de la mthodologie utilise. /
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Type Cible P/R prouve ARNr 18S R 121 13 35 601 Sang total 98 % 100 % possible probable dtude Nombre Aspergillose invasive tmoins nombre type Patients chantillons tests Spcificit Sensibilit ADN mitochondrial ARNr 18S R 140 14 7 47 250 Sang total 89 % 100 % R 41 4 18 281 Srum ND ND ARNr 18S P 97* 23 Sang total ND 41 % ARNr 18S P 118 5 17 34 1 193 Sang total 65 % 100 % ARNr 28S R 37 5 13 175 Srum 79 % 100 % ARNr 18S P 278 10 36 60 907 Sang total 81 % 92 % ARNr 18S R 122 33 89 323 Sang total Plasma ARNr 18S P 168 2 3 47 619 Sang total 96 % 75 % 92 % 79 % ADN mitochondrial ADN mitochondrial ARNr 28S R 70 15 26 29 245 Srum ND ND R 57 7 50 64 Sang total ND 43 % R 30 20 10 210 Srum ND ND

Tableau I. Description des principales techniques de PCR values pour le diagnostic de laspergillose invasive.

Auteurs

Rf.

Technique PCR

I S E

Type

Spcificit

A U

Einsele et al.

(23)

Conventionnelle

A. fumigatus, A flavus,

A. versicolor

Bretagne et al.

(20)

Conventionnelle

A. fumigatus, A. flavus

Skladny et al.

(28)

Nested-PCR

P O I N T

Aspergillus sp.

Becker et al.

(37)

Conventionnelle (14)

A. fumigatus, A. flavus,

A. versicolor

Hebart et al.

(24)

Conventionnelle (14)

A. fumigatus, A flavus,

A. versicolor

Williamson et al. (31)

Nested-PCR

Aspergillus sp.

Buchheidt et al. (22)

Nested-PCR (19)

Aspergillus sp.

Kami et al.

(25)

PCR temps rel

Aspergillus sp.

Lass-Flrl et al. (27)

Conventionnelle (14)

A. fumigatus, A. flavus,

A. versicolor

Costa et al.

(39)

PCR temps rel (23)

A fumigatus, A. flavus

Spiess et al.

(29)

PCR temps rel

A. fumigatus, A. clavatus

Challier et al.

(30)

PCR temps rel

A. fumigatus

P : tude prospective ; R : tude rtrospective ; ND : non dtermine.

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* tude sur 97 rats.

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/ Le choix de certains des auteurs a t deffectuer une PCR fongique universelle, puis didentifier dans un second temps le produit amplifi avec des sondes spcifiques pour chaque espce (23). Cette approche diminue la spcificit diagnostique du test. De fait, certaines tudes utilisant cette mthode obtiennent une sensibilit diagnostique de 40 % chez les patients risque [infections non documentes par les critres cliniques et radiologiques dfinis par lEORTC (6)], rsultat largement suprieur lincidence de laspergillose invasive dans cette population (24). Dautres auteurs ont dcrit des techniques utilisant la PCR niche, qui comporte deux sries conscutives damplification. Les rsultats sont galement interprter avec prudence en raison dune possible contamination lors de la premire tape, source de faux positifs (22, 28, 31). Lquipe de Bretagne et al. utilise comme cible le gne de lADN mitochondrial, avec une excellente spcificit pour le genre Aspergillus. En revanche, ce gne linconvnient dtre peu rpt, avec environ dix copies, ce qui limite la sensibilit de la recherche (20). Devant ces contraintes, et sachant que les charges fongiques semblent faibles lors de laspergillose invasive, nous avons dvelopp une technique PCR restreinte lespce Aspergillus fumigatus, agent principal de laspergillose invasive, tout en choisissant une cible multicopies sur le gne de lARN ribosomal 28S, rpt environ cent fois (30). La sensibilit diagnostique de certaines des techniques a t value et peut atteindre 100 % lorsque les rsultats positifs sont interprts pour les patients prsentant une aspergillose invasive prouve ou probable, en gnral avec des effectifs limits (moins de 40 patients suivant ltude). Cependant, la sensibilit technique de la dtection de lADN montre que les charges fongiques sont faibles lors de laspergillose invasive. Les quantits dADN circulant dtectes dans le srum ou le sang total sont de lordre de 100 fg/ml 5 ng/ml correspondant moins de 100 UFC/ml (23, 28, 30, 36). Chez quelques patients pour lesquels on disposait dun suivi antrieur linfection fongique, certains tests ont donn des rsultats positifs avant lapparition des signes cliniques et/ou radiologiques (24, 25, 30). De mme, dautres observations montrent que le traitement antifongique peut entraner une ngativit rapide de la PCR (27). Certains auteurs ont aussi suggr que la persistance dune PCR positive aprs instauration du traitement antifongique tait un lment de mauvais pronostic (23, 31). Parmi celles de ces techniques qui ont t compares la technique de recherche dantignes aspergillaires, aucune ne semble pour linstant en mesure de remplacer la dtection du galactomannane par mthode ELISA Platelia Aspergillus. Dans ltude rtrospective de Bretagne et al. (PCR conventionnelle et cible localise sur lADN mitochondrial), lvaluation de

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41 patients dhmatologie, dont 18 avaient t classs en aspergillose invasive prouve ou probable, a montr que cette technique tait moins sensible que la recherche du galactomannane (50 % versus 78 %). Ces rsultats peuvent tre expliqus par un mtabolisme diffrent pour les rsidus de galactomannane et lADN fongique. Lauteur proposait dutiliser le test PCR en complmentarit pour confirmer la spcificit de lantignmie ELISA (20). De mme, dans un modle murin daspergillose invasive, Becker et al. ont compar une technique par PCR panfongique sur sang total (23) et la technique ELISA. Ils ont montr une supriorit de la technique ELISA en termes de sensibilit (100 % versus 50 %) ainsi quen termes de corrlation avec la progression de la maladie, avec augmentation significative de la concentration srique du galactomannane jusquau dcs des animaux (37). En revanche, dans une autre tude rtrospective valuant une technique de PCR niche cible sur le gne de lARNr 28S chez 37 patients ayant bnfici dune greffe de moelle, dont 13 avaient t classs en aspergillose invasive prouve ou probable, Williamson et al. montraient que la PCR tait plus sensible ( 81 %) et plus prcoce que la technique ELISA (31). Kami et al. ont compar une technique de PCR en temps rel cible sur le gne de lARNr 18S avec le test ELISA dans une premire tude rtrospective portant sur 33 patients prsentant une aspergillose invasive probable ou prouve. La sensibilit et la spcificit taient respectivement de 79 % versus 58 % et de 92 % versus 97 % (25). Lors de ltude prospective ultrieure valuant 96 patients risque, dont 11 avaient dvelopp une aspergillose invasive probable ou prouve, les auteurs ont montr cette fois une supriorit en sensibilit de la technique ELISA si son seuil tait abaiss (index de positivit 0,6 au lieu de 1) [100 % versus 55 %], la spcificit tant quivalente pour les deux techniques [93 %] (26). Ltude de Buchheidt et al. a compar, en prospectif, une technique de PCR niche (28) et le test ELISA sur 165 patients, dont 11 classs en aspergillose invasive probable ou prouve. La sensibilit et la spcificit de la PCR taient mdiocres (63,5 %) mais suprieures celles du test ELISA (sensibilit de 33,3 %) sur ce petit groupe de patients (38). La technique de PCR en temps rel dveloppe lhpital Necker, avec une cible localise sur le gne de lARNr 28S, a t rtrospectivement value en parallle avec le test ELISA chez 41 patients suspects daspergillose invasive, dont 26 classs en aspergillose invasive probable ou prouve. Cette tude a montr une complmentarit des deux tests avec, pour tous les patients prsentant une aspergillose invasive, prouve ou probable, un rsultat positif avec lune ou lautre des techniques et une supriorit du test PCR [84,6 %] sur le test ELISA [75,2 %] (30). Pour amliorer la sensibilit et la spcificit des techniques de PCR conventionnelles, il est important damplifier des fragments dADN de petite taille (< 200 pb), de limiter les risques

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de contamination et demployer des contrles internes (extraction, inhibiteurs). Parmi les diffrents travaux publis depuis lanne 2000, seule la PCR quantitative en temps rel merge comme outil diagnostique en biologie clinique. Mais, actuellement, elle ne semble ni plus sensible ni plus prcoce que la dtection de lantignmie, pour un cot au moins double. Son principal avantage est la diminution du risque de contamination, due labsence de manipulation de produits amplifis. La raction complte, lamplification et la dtection du produit par hydrolyse de la sonde Taqman ou de sondes dhybridation FRET seffectuent en tube ferm. Ces deux techniques donnent des rsultats similaires en termes de sensibilit pour une cible donne. Il est aussi possible de suivre la raction au cours de sa ralisation, ce qui permet de dtecter prcocement des anomalies damplification, problme parfois li la qualit de lextraction. De plus, lADN dtect dans lchantillon peut tre quantifi par comparaison dune gamme de concentration connue, avec la possibilit dtablir un seuil de pathognicit sur certains types de prlvement (LBA) ou de suivre lvolution de linfection aprs prise en charge thrapeutique (25, 29, 30, 33, 36).

F R E N C E S

B I B L I O G R A P H I Q U E S

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La Lettre de lInfectiologue - Tome XX - n 3 - mai-juin 2005

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