PLAN

Applications de la Chromatographie d xclusion E Strique la caractrisation de systmes macromolculaires au sein de l unit mixte CNRS-bioMrieux CNRSCatherine Ladavire, Ladavire Bertrand de Lambert, Carole Chaix, Marie-Thrse Charreyre, Thierry Delair, Christian Pichot
Systme macromolculaire et Immuno-virologie Humaine UMR 2142 Ecole Normale Suprieure de Lyon 46, alle d'Italie 69364 Lyon
http://www.ens-lyon.fr/CNRS-bioMerieux

A propos de Polymres

Chromatographie d Exclusion Strique (CES)

Applications de la CES

Les Polymres
Dfinition : substances gnralement organiques ou semi-organiques, On distingue :
caractrises par la rptition d'un ou plusieurs types de motifs monomres. les homopolymres (linaires, ramifis) = polymres constitus par l'association d'un seul motif monomre
A A A A A A A A C A A A A A A

Les Polymres
Les proprits des polymres dpendent :
du type d'assemblage de ces monomres du degr de polymrisation ou longueur des chanes (A)n

de la distribution des longueurs de chanes : Polymrisation radicalaire :

Amorage
A
kd

2R
ka

R + M

R M
kp

les copolymres, la polymrisation s'effectue avec deux ou plusieurs monomres diffrents

B A B B A A

Propagation

R M + M n

R M

n+1
R M M R 1 2

distribution des longueurs de chanes Caractre alatoire

les polymres rticuls (gels), les macromolcules s'enchanent dans les trois directions de l'espace
B B A A A B A A B A B B

Terminaison R

+ R M

kt

R M H + R M 2 1

Transfert

R M

+ X

ktr

R M X + Y 1

Les Polymres
Comment caractriser la largeur de cette distribution ? ? A l aide de diffrentes moyennes ? en nombre : Mn = ? niMi/ ? ni ? Trs sensible la prsence de petite quantits de macromolcules de

Principales mthodes de dtermination des masses molaires, de Ip

Mthodes Analyse des extrmits de chanes (RMN) Osmomtrie Diffusion de la lumire Spectromtrie de masse MALDI-TOF CES 103 - 106 102 - 105 Mw Mn, Mw, Ip Domaines de masses molaires (g/mol) < 104 Mn Mn Valeurs moyennes

faible masse

? en masse : Mw = ? niMi2/ ? niMi ? Les macromolcules de forte masse ont une influence prpondrante ? Indice de polymolcularit (ou distribution) : Mn Ip = 1, chantillon isomolculaire Ip connatre : masses molaires moyennes, indice de Paramtres ?, htrognit en masse molaire ? polymolcularit Ip = Mw /

104 - 105

102 - 106

Mn, Mw, Ip

Chromatographie d Exclusion Strique - Intrts Chromatographie d Exclusion Strique (CES) ou Chromatographie par Permation de Gel (CPG)

Chromatographie d Exclusion Strique - Principe ?

Gel rticul ou phase stationnaire gonfl par la phase mobile Elution

Mesure des masses molaires moyennes, de Ip Fractionnement possible des chantillons de polymre Rcupration totale de l chantillon Simplicit, Rapidit

Gel = bille sphrique poreuse Colonne

Elution par ordre dcroissant de taille Ve

Essor considrable depuis les 1ers appareils commerciaux (1964 en France)

Fractionnement ou sparation selon le volume hydrodynamique des chanes en solution

Chromatographie d Exclusion Strique - Principe Volume total d une colonne chromatographique (VT)

Chromatographie d Exclusion Strique - Principe Exclusion strique d une macromolcule Vlution = Vo + Vaccessible = Vo + KVp
K=0 0<K<1 K=1

Volume intergranulaireVolume poreux total Volume Volume intersticiel du gel Volume mort Volume de solvant

V0

Vp

Vg

Signal

Pour un solut :

Vlution = Vo + Vaccessible = Vo + KVp

K = degr de pntration dans le volume poreux K = 0, pntration nulle, volume d exclusion totale K = 1, pntration totale, volume de permation K > 1, phnomne parasite d adsorption

V0

V0 + KVp

V0 + Vp

Signal

Ve

Chromatographie d Exclusion Strique - Remarques Colonne caractrise par : - un domaine de masses molaires, dfini par un mlange de diffrents gels de porosits diffrentes (10 106 ) - son efficacit, dfinie par son nombre de plateaux thoriques : Np = 16Ve (w : largeur du pic) (? 40 000/m) /w La granulomtrie des billes de gel est importante car la finesse accrot les rsolutions chromatographiques, densit plus importante (? particule de 10m pour les gels les plus performants) Superposition au phnomne d exclusion strique d effet un parasite : l adsorption sur les parois des pores (observe surtout
avec les gels minraux tels que la silice, tendance actuelle de modification des silanols)

Chromatographie d Exclusion Strique - Dispositif Phase mobile Rservoir de solvant

20l-200l

Pompe Colonne Dtecteur

Echantillon
1-4 g/l

Chromatogramme

Pompe haute pression 0/400bars (dbit ? 1ml/min), Temps d analyse de qq 10aines de minutes Billes sphriques poreuses : - minrales : silices greffes ou non ? solvants organiques ou eau, rigides, mais phnomnes d adsorption parasite - organiques : gel de polymre rticul styrne / divinyl benzne (gel semirigide) ? solvants organiques uniquement (THF, DMF, tolune, chlorure de mthylne) Dtecteurs les plus courants : - rfractomtre diffrentiel (diffrence d indice de rfraction de l luat et du solvant, ? C)

La phase mobile doit tre un bon solvant du polymre (affinit du polymre forte pour le solvant et trs faible pour le gel) et un bon agent gonflant du gel La temprature n affecte que trs peu le mcanisme de fractionnement

Chromatographie d Exclusion Strique - Etalonnage Correspondance Ve / Masse molaire

Chromatographie d Exclusion Strique - Etalonnage Correspondance Ve / Masse molaire

? Le plus simple : ? mesures dans les mmes conditions chromatog. (solvant, dbit) de Ve d talons trs isomolculaires et de masse molaire connue lnMi

? Etalonnage universel ? Bas sur le volume hydrodynamique des chanes en solution VH ? [? ].M (Flory-Fox) ln [? ].M

Etalons

Vo

Vo+ Vp

Ve (ml) Ve (ml) Indpendance de la nature chimique, de la forme et de la structure de l chantillon

Mais dpendance avec le systme solut / solvant / gel considr

(chantillons et talons doivent tre d une srie homologue). Masses molaires relatives VH ? ? Ve ? , mais MM ?

Chromatographie d Exclusion Strique - Etalonnage Etalonnage universel

Ncessit de connatre : ? Soit [? ]i, d un viscosimtre en srie o ? Soit K et a de la relation empirique de Mark-HouwinkSakurada pour un talon et l chantillon (relation valable
pour 1 Tre, 1 solvant)

Chromatographie d Exclusion Strique - Moyennes -

h (= k? n)

hi ? Ci = ni.Mi

MM ?

[? ] = K.Ma [? ].M = K.Ma+1

Ve : [? ].M = [? ]talon.Mtalon K.Ma+1 = K talon.(Ma+1)talon Donc :

M? K a? 1 .(M ) talon talon K
a? 1

Vi

Ve (ml)

Mn = ? niMi/ ? ni = ? hi/ ? (hi/Mi) Mw = ? niMi2/ ? niMi = ? hiMi/ ? hi Ip = Mw / Mn

Chromatographie d Exclusion Strique - Colonne Tube d acier inoxydable ? ext. 9,5mm, ? int. 7,2mm, Longueur. 30cm

Applications de la CES 2 systmes

POLYMERE CONJUGUES POLYMERE MOLECULES BIOLOGIQUES

Solvant

Nature Polystyrne rticul par du divinylbenzne Polystyrne sulfon Copolymre hydroxyl Poly(hydroxythylmthacryl ate) Silice pure Silice greffe Silice + polymre adsorb

Nom commercial (fabricant)

Ultrastyragel (Waters) Microstyragel (Waters) Shodex A 800 (Showa Denko) TSK gel (Toyo Soda) PL gel (Polymer Laboratories) Shodex OH-pak (Showa Denko) Shodex ion-pak (Showa Denko) TSK gel PW (Toyo Soda) PL aquagel (Polymer Laboratories) Ultrahydrogel (Waters) Lichrospher (Merck) Microbondagel (Waters) Synchropak catsec (Synchrom) Oligonuclotides (6000 g/mol) Peptides (2 500g/mol)

Organique

Aqueux

Tous

Protines (27 000 g/mol)

- Linaire - Porteur de fonctions ractives

Applications dans le diagnostic mdical

PLAN
? CES + spectromtre UV
? Rendements de greffage de molcules biologiques sur un polymre ? Suivi d une modification chimique de molcule biologique ? Stabilits d une molcule biologique et de son conjugu, volution d agrgats ? Effet parasite l exclusion strique

? CES + Spectromtre UV - Raction de greffage Molcule biologique CH2 CH CH CH 0,5 0,5 O C C O O O CH3 H2 N CH2 CH CH CH 0,5 0,5 O C C O O CH3 OH NH

? CES + rfractomtre diffrentiel

? Suivi de polymrisation radicalaire contrle

5 - 40 min. 37C

Molcule biologique P(AMVE) CONJUGUE

? CES + spectromtre UV + rfractomtre diffrentiel + dtecteur de diffusion de la lumire

? Analyse de conjugus ? Analyse d une dsagrgation / dgradation de polymre

Conditions opratoires : ODN : 95% (v/v) de DMSO anhydre + 5% de tampon Borate 0,1M pH 9,3 ; NaCl 0,5M Peptides : 5% (v/v) de DMSO anhydre + 95% de tampon Tris 0,05M pH 7 Protines : 5% (v/v) de DMSO anhydre + 95% de tampon Phosphate 0,1M pH 6,8

? CES + rfractomtre diffrentiel + dtecteur de diffusion de la lumire + viscosimtre

? Suivi de l volution d une conformation macromolculaire

? CES + Spectromtre UV - Caractrisation des conjugus Colonne : UH 500 (Waters) Pompe et injecteur automatique Kontron Eluant : Tampon phosphate 0,1M pH 6,8
sel qd macromolcules charges pour ? f. i.et cranter les forces lectrostatiques

? CES + Spectromtre UV - Caractrisation des conjugus -

MM?

Influence de la nature, du pH, et de la force ionique du tampon de greffage

260nm

Conjugu
Signal (mV)

Molcule biologique libre

Dbit : 0,5 ml/min Filtration 0,45m (Millipore) Dtection UV : 260 nm Rdt =

Aire du conjugu Aire du + conjugu Aire de la molcule biologique libre

Suivi du rendement de greffage

Nombre de molcules biologiques par chane de polymre + Cintique de la raction de greffage (Rdt = f(tps))

Temps de rtention (min.)

C.Ladavire, L.Vron, T.Delair, A.Domard, C.Pichot, B.Mandrand, J.A.P.S., 65, 2567-2577, 1997.

? CES + Spectromtre UV - Influence de la MM du polymre -

? CES + Spectromtre UV - Evolution des agrgats t=0 t = 3j 37C

Mn = 20 000g/mol

Mn = 67 000g/mol Elution dans le volume mort, pas de sparation

Pic exclu = 20%

6%

Agrgation rversible : physique et non chimique

CES + Spectromtre UV - Suivi d une modification chimique de peptide

Ajout de 3 lysines en N-terminal
150 mAbs

? CES + Spectromtre UV - Effet parasite Adsorption de conjugus polymre - protine

150

mAbs

21.27:3

19.02:2

120

?? ?
9.65:1

NH2 CH2 4 N C C H H O

120

100

80

80

21.38:3

50.0

40.0

60

60

40

9.79:1

40

20

20

19.30:2

30.0

12.08:1

100

Colonne : UH500 (Waters) Pompe et injecteur automatique Kontron Eluant : Tampon phosphate 0,1M pH 6,8 Dbit : 0,5 ml/min Filtration 0,45m (Millipore) Dtection UV : 220 nm

75.0 mAbs

60.0

20.0

10.0

-20

-20
min 3.0 6.0 9.0 12.0 15.0 18.0 21.0 24.0 27.0 29.0

-50 0.0

min 3.0 6.0 9.0 12.0 15.0 18.0 21.0 24.0 27.0 29.0

-50 0.0

min 3.0 6.0 9.0 12.0 15.0 18.0 21.0 24.0 27.0 29.0

-5.0 0.0

? : Conjugu polymre-molcule biologique ? : Molcule biologique n ayant pas ragi ? : DMSO RdtS23G = 17% RdtK26G = 77%

? : Conjugu polymre-molcule biologique ? : Molcule biologique n ayant pas ragi

OH
C.Ladavire, T.Delair, A.Domard, C.Pichot, B.Mandrand, J.A.P.S., 71, 927-936, 1999. C.Ladavire, C.Lorenzo, A.Elassari, B.Mandrand, T.Delair Bioconjugate Chemistry, 9, 655-661, 1998. C.Ladavire, T.Delair, A.Domard, C.Pichot, B.Mandrand, J.A.P.S., 72, 1565-1572, 1999. C.Ladavire, T.Delair, A.Domard, A.Novelli-Rousseau, B.Mandrand, F.Mallet Bioconjugate Chemistry, 9, 655-661, 1998.

Si

OH

Adsorption de la protine ? +SDS

? CES + Spectromtre UV - Stabilit des protines et des conjugus

t=0
100 mAbs
15.66:1

? CES + Rfractomtre diffrentiel - Suivi de polymrisation Polymrisation radicalaire contrle par le procd RAFT
(Transfert Rversible par Addition Fragmentation)

7j 37C, milieu de greffage

100 mAbs

75

75
15.70:1

Protine seule

60

60

45

30

?
min 3.0 6.0 9.0 12.0 15.0 18.0 21.0 24.0 27.0 29.0

45

Pics lis la dgradation

30

Ajout dans le milieu ractionnel d agent de contrle qui permet une un diminution de la concentration en radicaux et une croissance simultane de toutes les chanes

15

15
16.81:2

min 21.0 24.0 27.0 29.0

17.84:2

Colonne : Shodex Protein KW-803 (Waters) Pompe et injecteur automatique Kontron Eluant : Tampon phosphate 0,1M pH 6,8, 0,5% SDS (en masse) Dbit : 0,5 ml/min Filtration 0,45m (Millipore) Dtection UV : 280 nm

DT DT DT DT

-10 0.0

-5 0.0

3.0

6.0

9.0

12.0

15.0

18.0

Conventionnelle

50.0

mAbs

50.0

mAbs

Protine greffe Protine

15.65:2

37.5

37.5

Protine greffe sur le polymre

30.0

30.0

22.5

?
min

22.5

Pics lis la dgradation de la protine non greffe

16.80:3

RAFT

11.22:1

11.11:1

15.70:2

? Distribution troite ? Prvision des masses molaires par le rapport [M]/[Agent de contrle] ? MM = f(conversion) linaire

15.0

Rdt = cst
7.5 -5.0 0.0 3.0 6.0 9.0 12.0 15.0

15.0

7.5

min 18.0 21.0 24.0 27.0 29.0

-5.0 0.0

3.0

6.0

9.0

12.0

15.0

18.0

21.0

24.0

27.0 29.0

A vrifier par CES

Stabilit protine greffe > seule

Rizzardo et col. (Macromolecules, 33, 243-245, (2000) ; 32, 6977-6980, (1999) ; 32, 5457-5459, (1999) ; 32, 2071-2074, (1999) ; 31, 5559-5562, (1998)) Macromolecular Symp., 143, 291-307, (1999))

? CES + Rfractomtre diffrentiel - Suivi de polymrisation Colonne : Styragel HR 4E (Waters), 35C Eluant : THF Calibration : Poly(N-acryloylmorpholine) Dbit : 1 ml/min Rfractomtre diffrentiel (2410 Waters)
Mn (g/mol)

? CES + Rfractomtre diffrentiel - Suivi de polymrisation -

50000

Mpic (g/mol)

Poly(N-acryloylmorpholine) ou P(NAM)
30000

40000 30000 20000 10000

Calibration P(NAM) Calibration P(St) Diffusion de la lumire

? ?
30 40 50 60
N O

?
n

MM? ???
10.00 Signal (mV) 5.00

20000

10000 70 80

0 10 30 50 70 90

Conversion (%)

Conversion (%)
0.00 6.00 6.20 6.40 6.60 6.80 7.00 7.20 7.40 7.60 Minutes 7.80 8.00 8.20 8.40 8.60 8.80 9.00

? ? ? ?

Mn = 15 600 g/mol, Mn = 25 950 g/mol, Mn = 30 700 g/mol, Mn = 31 200 g/mol,

Ip = 1,15 Ip = 1,20 Ip = 1,25 M Ip = 1,30 n tho. ?

Eluant pour diff. de la lumire : Tpn acide borique / NaOH 0,05M pH 10

35 000g/mol

Calibration P(NAM) ? Diffusion de la la lumire (MM absolue) Calibration P(NAM) ? Calibration P(St) (VH ? )

CES + Rfractomtre diffrentiel + Diffusion de la lumire - Dispositif CES + Rfractomtre diffrentiel + Diffusion de la lumire - Conjugus Polymre/ODN
C, dn/dc, n Rservoir d luant Pomp e Dgazeur
AUX, 90 Detector
0,12 0,1 0,08 0,06 0,04 0,02

Injecteu r Colonnes
0,14

Exclusion de UH 2000 : 7 000 000g/mol

conjugus agrgats UV 260nm ODN libre

Rfractomtre Diffrentiel Poubell e Informatiqu e

Diffusion de la lumire

Dtecte ur UV

Dtecteur 90 RI

Mn, Mw, Ip, Rg

Colonnes : UH 500 + UH 2000 (Waters) Eluant : Tampon acide borique / NaOH 0,05M pH 10 (n = 1,338) Diffusion : 45, 90, 135 (miniDawn, Wyatt) Dbit : 0,5 ml/min Rfractomtre diffrentiel (410 Waters) Spectromtre UV (484 Waters) Filtration 0,45m (Millipore)

0 5 7 9 11 13 15 17

Volume d'lution (ml)

Rponses diffrentes des dtecteurs Trs mauvaise sparation entre les trois espces, pas de mesure possible de masses molaires

CES + Rfractomtre diffrentiel + Diffusion de la lumire - Agrgation de polymreCES + Rfractomtre diffrentiel + Diffusion de la lumire - Dgradation de polymre

Masse molaire du polymre observe trs leve par rapport celle attendue ? Variation de la rponse du dtecteur de diffusion de la lumire en
f(Tre)
Agrgat s

? Variation de la rponse du rfractomtre diffrentiel en fonction du

temps, 130C
0,8 0,7

MM ?
10h 5h

1j

1,2

MM ?
37C

0,6

Dtecteur 45

1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 7 9 11 13 15

Rponse RI

P(AMVE)

0,5 0,4 0,3 0,2

100C 130C
17 19 21 23 25

1h

Tpn acide borique / NaOH 0,05M pH 10

0,1 0 10 12 14 16 18 20 22 24

Volume d'lution (ml)

Volume d'lution (ml)

Tpn acide borique / NaOH 0,05M pH 10

La temprature abaisse la quantit d'agrgats mais...

il y a galement une dgradation du polymre

? CES + RD + Diffusion de la lumire + Viscosimtre - Suivi de l volution d une conformation macromolculaire Colonnes : UH 500 + UH 2000 (Waters) Eluant : Tampon acide borique / NaOH 0,05M pH 10 (n = 1,338) Diffusion : 90 (Dawn, Wyatt) Rfractomtre diffrentiel (modle 410 Waters) Dtecteur de viscosit diffrentielle (H 502B Viscotek) Dbit : 0,5 ml/min Filtration 0,45m (Millipore)

? CES + RD + Diffusion de la lumire + Viscosimtre - Suivi de l volution d une conformation macromolculaire Mark-Houwink-Sakurada : [? ] = K.Ma
a = facteur de forme reflte la conformation des macromolcules en solution : - 0,3 ? a ? 0,8 : les chanes sont replies sur elles-mmes, en pelote - 0,8 ? a ? 1 : les chanes sont plus rigides et moins aptes se mettre en pelote - 1 ? a ? 1,8 : les chanes sont sous forme de btonnets rigides

Exemple de chromatogramme
? P ? 8 . l4 .Q.? ? r

?? ? ?

? ? P / ? P ? 1? 0 ? ?? ? ? ? ? ? C ? ?C ?

? ? / ? 0 ? 1? ? ? ? ? C ? ?C ?

Rfractomtre Viscosimtr Diffusion de e la lumire 90

C.Ladavire, T.Delair, A.Domard, C.Pichot, B.Mandrand, Polymer Degradation and Stability, 65, 231-241, 1999.

compacte expanse

Paramtre x

Conclusion
CES = Technique rapide et simple qui permet d analyser : ? le greffage de molcules biologiques sur polymre, les conjugus obtenus, des stabilits ? la modification chimique de molcule biologique ? le suivi cintique d une polymrisation radicalaire contrle ? la dsagrgation ou la dgradation d polymre un ? les changements de conformation macromolculaire

Bibliographie

? Initiation la Chimie et la physico-Chimie Macromolculaires, volume 1, Physico-Chimie des polymres , Groupe Franais d Etudes et d applications des Polymres.

? Techniques de l Ingnieur, Trait Analyse et Caractrisation, Chromatographie d exclusion strique , par James Lesec.

? Chomatography of polymers , characterisation by SEC and FFF, Theodore Provder, ACS Symposium Series 521, New York, 1991.

? HPLC of polymers , H.Pasch, B.Trathnigg, Springer, Berlin, 1999.