TRAVAUX PRATIQUES

DE
MICROBIOLOGIE
GENERALE

M.P. HAYETTE
P. HUYNEN
C. MEEX

SOMMAIRE
PREMIERE SANCE / THEORIE
A. Etude microbiologique dun prlvement pathologique
1. Quest-ce quune bactrie ?
2. Les bactries dans le monde vivant
3. Examen macroscopique dun prlvement biologique
4. Morphologie des bactries et levures: examen microscopique
5. Milieux de culture et isolement des bactries et levures
6. Conditions de culture
7. Manipulations bactriologiques de base
8. Morphologie de la croissance bactrienne
B . Classification des bactries dintrt mdical
Mthodes didentification
C . Agents anti-bactriens
CMI. Mthodes par dilution, Kirby-bauer, E-test, Vitek-2.
CMB. Dfinition
Exemple de mthode didentification : Streptocoques
PREMIERE SEANCE/ PARTIE PRATIQUE
Culture sur diffrents milieux
Coloration de Gram
Activits biochimiques
Etude de la coagulase du staphylocoque
Ralisation de galeries didentification
Ralisation dun antibiogramme

DEUXIEME SANCE/PARTIE PRATIQUE

o Lecture des galeries didentification
o Lecture des antibiogrammes
o Lecture des antifongigrammes
o Groupage srologique rapide des Streptocoques
DEUXIEME SANCE/PARTIE THEORIQUE
Srologie
TROISIEME SEANCE
a. BIOLOGIE MOLECULAIRE
b. Evaluation des connaissances

PREMIERE SEANCE
A. ETUDE MICROBIOLOGIQUE DUN PRELEVEMENT
PATHOLOGIQUE .

1. QUEST-CE QUUNE BACTERIE ?

Une bactrie est un organisme microscopique gnralement form dune seule
cellule. Celle-ci se distingue des cellules de la majorit des autres organismes tant
unicellulaires que pluricellulaires par son organisation simplifie : les cellules
bactriennes sont de type procaryote tandis que celles des autres organismes sont de
type eucaryote.

2. LES BACTERIES DANS LE MONDE VIVANT

Les bactries sont rencontres dans le sol, leau, chez les plantes, les animaux et lhomme (du
moins au niveau des rgions du corps en relation avec lextrieur : peau, nez, bouche,
pharynx, tube digestif et muqueuses gnitales). Les espces susceptibles dengendrer des
lsions tissulaires et de provoquer des maladies infectieuses intressent principalement la
Microbiologie Mdicale.

3. EXAMEN MACROSCOPIQUE DUN PRELEVEMENT BIOLOGIQUE

Toute infection bactrienne s'accompagne, outre la
prsence de bactries, de signes biologiques lis
l'inflammation avec l'ventuelle prsence de leucocytes,
notamment de polynuclaires. Ces lments peuvent
entraner au del d'un seuil, une modification visuelle,
clairement perceptible l'oeil nu, qui signe une anomalie
patente.

Exemple : liquides pathologiques.

Trouble : urine, LCR, liquide pleural ou articulaire

Hmaturique : urine, LCR, liquide pleural ou articulaire

Odeur : on notera celle caractristique

lors d'infections germes anarobies
dans un liquide pleural

4. MORPHOLOGIE

DES

Consistance : Exemple d'une selle

diarrhique.

BACTERIES

ET

LEVURES

EXAMEN

MICROSCOPIQUE.

Les bactries ont des tailles allant des cellules naines de 0,2 microns ou mme
moins des cellules gantes longues de 500 microns, mais la plupart ont une
dimension comprise entre 1 et 10 microns.
Elles peuvent le plus souvent tre observes au microscope ordinaire (grossissement
de 1000 fois environ) sans avoir subi de prparation particulire (examen ltat
frais, entre lame et lamelle, de bactries mises en suspension dans un liquide) ou
aprs coloration.

Les levures sont des champignons unicellulaires dont la taille varie de 2 20 m. La

taille des champignons est donc suprieure celle des bactries ce qui permet
facilement de les distinguer.
Les levures peuvent se prsenter sous plusieurs formes :

Forme ronde ou ovalaire : levures et spores.

Forme pseudofilamenteuse : chanes de levures formant des filaments (diffrentes

espces de Candida)
Forme filamenteuse : formation de vrai mycelium (C. albicans)

4.1. Microscope optique :

Souvent, on ne notera aucune anomalie macroscopique, d'o la
ncessit de rechercher des microorganismes (bactries, parasites,
levures) et des lments cellulaires (leucocytes) au microscope
optique.
Cet examen est galement utile pour prciser la nature des
anomalies macroscopiques observes.

Lexamen microscopique permet de distinguer diffrents types morphologiques des

bactries:
- Forme sphrique. La forme sphrique caractrise les coques ou cocci.
Ces bactries se subdivisent elles-mmes en :
diplocoques : cellules disposes par paires et prsentant parfois un
aspect effil ou rniforme plus ou moins accentu ;
streptocoques : cellules disposes en chanettes ;
ttrades : groupement de 4 cellules en carr sur un mme plan ;
sarcines : cubes rguliers de 8 cellules ou de multiples de 8 ;
staphylocoques : cellules runies en amas irrguliers ou grappes.

- Forme cylindrique, en btonnet . On distingue deux types :

bacilles : btonnets droits avec extrmits arrondies, carres, effiles,
fusiformes, ou prsentant un renflement un ou aux deux ples ;
vibrions : btonnets en forme de croissant ou de faucille.

- Forme hlicodale ou spirale. Ces bactries qui ont laspect de filaments spirals
peuvent tre diffrencies par leur longueur, le nombre et lamplitude de leurs
ondulations.

- Forme ramifie. Certaines bactries, comme les actinomyctes, peuvent prsenter

des ramifications.

4.1.1.Examen ltat frais :

Sans avoir subi de coloration particulire : une prparation est obtenue avec le dpt
d'une goutte du liquide biologique entre lame et lamelle, puis on observe au
microscope la prsence ventuelle de bactries (coque, diplocoque, coccobacille,
bacille...) ou de levures, ainsi que la prsence ou non de globules rouges et de
globules blancs.

ex. : sdiment urinaire

4.1.2Examen aprs coloration :

(Observer dabord au faible grossissement, ensuite passer au 1000x).

a- Prparation dun frottis.

Le liquide examiner est prlev au moyen dune oese ou dun autre instrument, et
dpos sur une lame de verre propre. La suspension est tendue avec la boucle sur
une surface dun deux centimtres carrs de faon obtenir un mince film de
cellules (suspension faiblement laiteuse) et ensuite sche. Le frottis est alors fix en
le passant dans une flamme, puis est refroidi.

b- Coloration :

Coloration simple: Le frottis fin est trait par un seul colorant basique (bleu de
mthylne). Cette technique est simple et rapide (ex : diplocoques en grain de
caf intracellulaires).

Coloration de Gram.

Les bactries non dcolores par lalcool sont dites Gram positif ; elles apparaissent
en violet tandis que les bactries Gram ngatif, dcolores par lalcool et recolores
par le colorant de contraste, apparaissent en rose.
Ces deux comportements rsultent dune diffrence fondamentale de composition et
de structure de la paroi. Contrairement la paroi des bactries Gram ngatif, celle
8

des bactries Gram positif interpose une barrire empchant la dcoloration par
lalcool du cytoplasme qui est le sige de la raction.
Remarque : les levures apparaissent galement en violet aprs une coloration de gram.

B Staphylocoque

Colorations acido-alcoolo-rsistantes :

Les colorations acido-alcoolo-rsistantes utilisent les proprits particulires de la

paroi des bactries :
Ziehl.
Les bacilles acido-alcoolo-rsistants (BAAR), compte tenu de la composition de leur
paroi, sont dtects spcifiquement. Il s'agit du groupe des mycobactries dont le
bacille tuberculeux (Bacille de KOCH/BK).
Mthode : coloration la fuschine phnique, dcoloration acido-alcoolique, contrecoloration au bleu.
Interprtation : les BAAR apparaissent colors en rouge, sur un fond bleu.

4.2. Microscope fluorescence :

Il existe deux types de coloration en fluorescence :

Fluorescence directe : le micro-organisme est color directement avec un

fluorochrome

Exemple : coloration lauramine : lutilisation d'un colorant fluorescent,

lauramine, permet de colorer spcifiquement les mycobactries, qui apparaissent
alors fluorescentes.

Immunofluorescence : le micro-organisme est color indirectement, par

lintermdiaire dun anticorps, coupl un fluorochrome (voir plus loin).

Le fluorochrome absorbe la lumire ultraviolette et la rmet une longueur donde

suprieure, dans la partie visible du spectre. La couleur de la lumire rmise varie
selon la nature du fluorochrome utilis. Par exemple, la fluorescine absorbe la
lumire UV la longueur donde de 495 nm et la rmet sous forme dune lumire
visible jaune-vert (dune longueur donde de 525 nm).

10

4.3 . Microscopie fond noir (condenseur spcial) :

Il s'agit de rechercher des bactries trop fines pour tre visibles au microscope
optique. Cette recherche nest pas dusage courant.
Exemple : diagnostic microscopique de la syphilis : recherche de la prsence de
Treponema pallidum sur un prlvement de srosit de chancre (A).

---------------------------------------------------------------------------------------------------------------La classification la plus simple des bactries qui repose sur leur morphologie peut se
doubler dun critre de diffrenciation fond sur leur comportement aprs coloration
par les mthodes de Gram ou de Ziehl-Neelsen. Cependant, pour bien les identifier
et les dfinir, il est indispensable de les cultiver afin de rechercher dautres
caractres.

5. LES MILIEUX DE CULTURE ET LISOLEMENT DES BACTERIES ET LEVURES.

Dfinition : milieux nutritifs pour les bactries et levures, permettant leur croissance.
Il existe deux formes de milieux : liquides et solides.

A. Les milieux synthtiques.

Ce sont des milieux dont la composition qualitative et quantitative est connue
exactement. Ils permettent ltude prcise des besoins nutritifs des bactries.

11

B. Les milieux empiriques.

Ces milieux sont prpars partir de produits naturels dont on ne connat pas la
composition avec prcision.
Lexemple le plus simple est celui du bouillon nutritif ordinaire dont la formule est
la suivante : extrait de viande de buf 3 g, peptone 5 g, chlorure sodique 8 g et eau
distille ad 1.000 ml. Ce milieu, qui couvre les besoins nutritifs dun grand nombre
de bactries dintrt mdical, peut tre utilis directement ou servir la prparation
de milieux spciaux.

 Milieux enrichis :
Ils sont utiliss pour la culture des espces exigeantes sur le plan nutritionnel. Ils sont
enrichis par ladjonction dextraits dorganes (cur ou cervelle), de sang (cheval ou
mouton), etc.
Exemple :
glose enrichie au sang de mouton (5%) qui permet la croissance de la plupart des
bactries (Gram + et Gram -) y compris les plus exigeantes au point de vue
nutritionnel.

glose au sang

12

 Milieux slectifs :
Lincorporation dans un milieu dun produit dtermin permet quelquefois la
croissance dune ou plusieurs espces mais empche le dveloppement des autres : il
sagit alors dun milieu slectif.
Exemples :
1. lassociation acide nalidixique-colimycine (CNA) inhibe la flore
bactrienne Gram ngatif mais est sans effet sur les Gram positif.

Staphylococcus. aureus sur glose CNA

2. Le milieu de MacConkey renferme des sels biliaires et du crystal violet

qui inhibent le dveloppement des bactries Gram positif mais non
celui de nombreux Gram ngatifs, dont les entrobactries et les
Pseudomonas.

Klebsiella pneumoniae sur glose Mac Conkey

3. Le milieu Sabouraud + antibiotiques

Les champignons peuvent pousser sur la plupart des milieux utiliss en
bactriologie. Mais il existe des milieux dont la composition est spcifiquement
adapte leurs besoins nutritifs.
Milieux spcifiques slectifs :

13

o Sabouraud + antibiotiques : permet dinhiber la croissance des

bactries.
o Sabouraud + antibiotiques + anti-moisissures : inhibe en plus le
dveloppement de certaines moisissures. Utilis pour la recherche de
dermatophytes.

 Milieux didentification :
Ce sont des milieux qui sont employs pour la mise en vidence dune activit
enzymatique.
Exemple :
Le milieu de MacConkey contient du lactose et du rouge neutre qui permet de
distinguer les bactries qui utilisent le lactose car lassimilation du sucre entrane une
acidification (colonies roses).
Remarque : le milieu de MacConkey est la fois un milieu slectif et didentification

Exemples de milieux solides couls en bote de Ptri selon le produit pathologique et

la demande :

Pus, liquides de ponction : milieux enrichis au sang (frais, cuit=chocolat) et

milieux slectifs

Expectoration : milieux enrichis au sang (frais, cuit) et milieux slectifs

Urines : milieu polyvalent pour identifier les bactries gram positif et Gram
ngatif (CLED...).

Entrobactries sur glose CLED

14

6. CONDITIONS DE CULTURE
Certaines conditions denvironnement jouent un rle important pour la croissance.
La concentration en lments nutritifs du milieu de culture ne peut pas tre trop
leve car beaucoup de bactries sont inhibes dans un milieu hypertonique.
La plupart des bactries dintrt mdical croissent un pH compris entre 6,5 et 7,5
et une temprature voisine de 35C.
Enfin, les besoins gazeux sont importants satisfaire. Selon les cas, la culture devra
ou pourra tre ralise lair libre, dans une atmosphre enrichie en gaz carbonique
ou dans une enceinte appauvrie en oxygne. En effet, certains germes sont arobies
stricts ou anarobies stricts, tandis que dautres sont micro arophiles , arobiesanarobies facultatifs, anarobies arotolrants ou encore capnophiles.

ETUVE

Jarre CO2

7. MANIPULATIONS BACTERIOLOGIQUES DE BASE

Les outils du bactriologiste :
Le fil droit et la boucle de fil (encore appele anse ou oese) sont forms dun fil en
nickel-chrome, dune longueur de 5 8 cm, fix un manche mtallique. Ces
instruments permettent de transfrer des bactries partir dune colonie ou dun
milieu liquide vers une glose ou un bouillon. Ils sont striliss par la chaleur

15

immdiatement avant leur utilisation et refroidis en vitant tout contact avec des
objets non striles.
Ds la fin de la manipulation, ils doivent nouveau tre striliss afin de ne pas
contaminer la table de travail et le milieu ambiant.

oese

Les couvillons qui sont constitus par une petite boule douate ou de dacron fix
lextrmit dune tige de bois, de mtal ou de plastic, sont gnralement envelopps
dans du papier avant strilisation. Ils servent principalement raliser le
prlvement des chantillons et linoculation riche des milieux gloss.

Inoculation dun milieu glifi

Pour inoculer un milieu solide, on recourt des procds qui diffrent selon le but
poursuivi. La mthode des stries permet dobtenir des colonies distinctes partir
dun inoculum liquide ou solide. Une boucle de fil portant linoculum est dplace
selon un mouvement de va-et-vient la surface du milieu. Cinq sries de stries sont
habituellement effectues successivement en prenant soin aprs chaque trac de
flamber loese, puis de la laisser refroidir et de faire dbuter chaque nouvelle srie de
stries dans le trac de la prcdente.

16

La bote de Ptri est alors mise incuber couvercle dirig vers le bas afin dviter que
des gouttes de condensation ne tombent sur la glose.
Ce mode opratoire dilue progressivement linoculum par appauvrissement
mcanique de sorte que les colonies pourront tre trs nombreuses et confluentes au
niveau des premires stries, puis de moins en moins serres et finalement
parfaitement isoles.

8. MORPHOLOGIE DE LA CROISSANCE BACTERIENNE

Laspect de la croissance bactrienne est trs diffrent en milieu liquide ou sur milieu
solide :
- Croissance en milieu liquide. A la fin de la phase exponentielle, le nombre
de bactries est lev, de lordre de 108 109 cellules par ml de milieu et
parfois plus encore. Laccumulation des cellules peut troubler uniformment
le milieu, former des agglomrats, un sdiment, un voile superficiel ou
prsenter lune ou lautre combinaison de ces aspects morphologiques.

incubation
- Croissance sur milieu solide. A la surface des milieux de culture solides, les
descendants de chaque cellule restent groups et saccumulent en de petites

17

masses visibles lil nu, appeles colonies bactriennes. Celles-ci sont trs
rapproches au point de former un tapis ou plus ou moins spares les unes
des autres selon le nombre de germes dposs sur le milieu.
On notera l'aspect des colonies, la taille, la bordure, la surface (lisse,
rugueuse), la coloration (pigment jaune pour Staphylococcus aureus, pigment
violet pour Serratia marcescens), la prsence d'une hmolyse sur glose sang.

Types
dhmolyse :

Absence dhmolyse

18

Exemples d'isolement:
Prlvement de gorge : nombreuses
colonies -hmolytiques (glose au sang
frais)

Expectoration : nombreuses colonies alphahmolytiques et muqueuses voquant un

pneumocoque ; petites et brillantes voquant une
souche de Haemophilus influenzae (glose au sang
cuit ou glose chocolat)

Urine : nombreuses colonies de deux

types d'entrobactries : colonies
muqueuses et colonies irrgulires

Urine : colonies de plusieurs types diffrents

19

B. CLASSIFICATION DES BACTERIES DINTERET MEDICAL

Les principaux groupes de bactries dintrt mdical peuvent dj tre dfinis sur
base de quelques caractres seulement : morphologie, affinits tinctoriales, prsence
de spores, mobilit, croissance en arobiose et/ou en anarobiose, production de
catalase, test de la cytochrome-oxydase, utilisation du glucose par oxydation et/ou
par fermentation.
La recherche dautres proprits bactriennes, principalement la capacit de produire
des enzymes et de mtaboliser des substrats divers, permet de poursuivre
lidentification, de prciser le nom despce et mme parfois de distinguer certaines
particularits au sein de lespce.
A cette fin, on peut avoir recours des mthodes conventionnelles (exemple : mise
en vidence de lutilisation dun sucre par incorporation de ce sucre et dun
indicateur de pH dans un milieu de culture).
On peut aussi utiliser des systmes commercialiss prts lemploi. Par exemple :
bioMrieux s.a., Marcy lEtoile, France, proposent diffrents types de galeries
miniaturises adapts chacun un groupe de bactries pralablement dfini.

Les cultures pures

Les

prlvements

pathologiques

peuvent

contenir

diffrents

micro-

organismes quil faudra isoler avant den effectuer lidentification. La

mthode des stries permettant dobtenir des colonies distinctes partir dun
inoculum liquide ou solide, il sera ds lors trs facile de prlever une seule
colonie de chaque type pour procder lidentification.
L'identification de la majorit des bactries habituellement rencontres est alors
prcise dans un dlai de 24 48 h :

A l'aide de tests d'orientation rapide : oxydase, catalase,... (voir exercice

pratique )

20

Par ensemencement d'une galerie biochimique adapte :

Identification par un ensemble de ractions du mtabolisme intermdiaire
laide de galeries de caractres :

Recherches complmentaires : il peut tre ncessaire de dterminer les

proprits antigniques par des ractions d'agglutination sur lame l'aide
d'immun srums (streptocoques, ).

Il existe des automates, qui ralisent des identifications :

o Vitek-2 : Identification partir dune culture pure en ~5 15h

Identification automatise par tests colorimtriques bass sur les caractres

biochimiques du micro-organisme.

21

o MALDI-TOF : Identification partir dune culture pure en ~10 minutes

Identification par spectromtrie de masse : Ionisation du micro-organisme par un
laser, sparation des ions obtenus en fonction de leur masse et charge. Obtention
dun spectre de masse dont les pics correspondent des protines spcifiques de
chaque micro-organisme. Comparaison du spectre obtenu avec les spectres
prsents dans la librairie de spectres et identification du micro-organisme.

C. LES AGENTS ANTIBACTERIENS

Les agents antibactriens peuvent tre bactricides ou bactriostatiques. Chaque
agent peut tre caractris par un spectre dactivit plus ou moins large selon le
nombre despces bactriennes.
Certaines bactries sont naturellement sensibles ou rsistantes aux antibiotiques. Il
existe deux types de rsistance :
-

les rsistances naturelles,

les rsistances acquises par mutation ou par acquisition

dun gne de rsistance.

Cest pourquoi, il savre utile dvaluer in vitro la sensibilit dune bactrie isole
dans un prlvement pathologique certains antibiotiques.

Il existe plusieurs mthodes :

Dtermination de la concentration minimale inhibitrice : CMI

22

1- La mthode par dilution :

Elle

permet

de

dterminer

la

plus

petite

concentration

(exprime

en

microgrammes/ml) capable dinhiber la croissance de la bactrie considre

(concentration minimale inhibitrice ou CMI). Cette mthode de rfrence est une
technique lourde qui tend tre supplante par le systme Etest.

CMI

2- La mthode par diffusion en glose ou mthode de Kirby-Bauer:

Fonde sur des gradients de concentration, cest la mthode manuelle la plus
couramment utilise. Elle est fonde sur le fait quun disque imprgn dantibiotique
et dpos sur une glose nutritive pralablement inocule par la suspension
bactrienne tester, va diffuser suivant un gradient de concentration, et que la
bactrie ne se dveloppera pas en prsence de concentrations gales ou suprieures
la concentration minimale inhibitrice.
Le procd emploie des disques de 6 millimtres de diamtre dont le papier a t
imprgn dun antibiotique concentration connue.

Mthode :
A partir dune suspension de bactries, on inocule de manire standardise une
glose nutritive. On dpose ensuite sur cette glose des disques imprgns
dantibiotique, qui va librer un gradient progressivement dcroissant dantibiotique
au fur et mesure de lloignement du disque (diffusion centrifuge).

Aprs incubation et croissance, on peut observer une zone circulaire dinhibition

autour du disque dont le diamtre sera plus ou moins grand suivant la sensibilit de
la souche lantibiotique.

23

Une table de concordance entre les diamtres dinhibition et linterprtation de la

sensibilit (sensible intermdiaire rsistant) est alors utilise afin dinterprter les
rsultats.

TIC = Ticarcilline, PIP = Pipracilline ; FEP = Cfpime ; AMC = Amoxycilline-Ac.clavulanique ; CAZ

= Ceftazidime ; PTZ = Pipracilline-Tazobactam

3- Le systme Etest :
Celui-ci comprend une bandelette mince et inerte avec un gradient exponentiel
dantibiotique sur une face, le code de lantibiotique et une chelle de lecture sur
lautre face. Les bandelettes sont appliques sur la surface dune glose inocule.
Aprs la priode dincubation requise pour que la croissance de la bactrie devienne
visible ( 18 h), on peut lire une ellipse dinhibition. Au point dintersection de
lellipse et de la bandelette, la concentration de lantibiotique test interrompt la
croissance de la bactrie et cette valeur correspond la CMI.
Pnicilline

CMI

4- Automate : Vitek-2
Antibiogramme automatis : A laide de cartes antibiogramme adaptes chaque
type de bactries, VITEK-2 mesure la croissance bactrienne dans un puits de

24

contrle et dans les puits contenant des antibiotiques diffrentes concentrations.

Dtermination de la CMI.

Dtermination de la concentration minimale bactricide: CMB

Dfinition : La plus faible concentration dantibiotique capable dentraner la

mort dau moins 99,99% des bactries dun inoculum (< 0,01% de survivants)

Valeur indicatrice du pouvoir bactricide dun antibiotique

Sa dtermination consiste mesurer les survivants (%) dans les tubes sans
croissance visible (aux concentrations respectives de 2, 4 et 8 mg/l dans
l'exemple) et comparer semi-quantitativement la gamme tmoin obtenue
au temps 0 par dilution de base 10.

Notion importante, notamment dans les infections svres.

Lorsque la CMI est proche de la CMB, un antibiotique peut tre considr comme
bactricide.

25

EXEMPLE DE METHODE DIDENTIFICATION :

STREPTOCOQUES.
1. Les antignes bactriens de surface.
La mise en vidence dantignes bactriens de surface peut contribuer
lidentification de certaines espces bactriennes, et peut prsenter un intrt,
notamment pidmiologique.
Groupes srologiques
La classification de Lancefield permet de subdiviser les streptocoques en 20
groupes par la caractrisation immunologique dantignes de surface,
habituellement des polysaccharides (polyoside C). Les srogroupes A, B et D
sont les plus importants en mdecine.
Certaines espces ne sont pas typables.

2. Hmolyse
Sur glose au sang, les colonies peuvent tre entoures dune zone circulaire
dhmolyse. Celle-ci est de type lorsque lhmolyse des globules rouges est
complte, ce qui entrane lapparition dune zone incolore et transparente.
Lorsque lhmolyse des globules rouges est partielle, on parle dhmolyse de
type , la zone prsente alors une coloration verdtre.

3. Sensibilit loptochine
Loptochine

est

un

compos

antiseptique

action

slective

sur

Streptococcus pneumoniae. La sensibilit cet antibiotique est un test

dorientation, permettant de diffrencier les pneumocoques (S. pneumoniae)
qui sont sensibles, des autres streptocoques.

26

Streptococcus pneumoniae

4. Sensibilit la bacitracine
Les streptocoques du groupe A (S. pyogenes) se distinguent parmi les
streptocoques hmolytiques par leur sensibilit un antibiotique : la
bacitracine. En effet, 95 % des souches de Streptocoques A sont sensibles
la bacitracine alors que seulement 4 % des Streptocoques des autres groupes
le sont.
La recherche de la sensibilit la bacitracine, en prsence dun Streptocoque
- hmolytique, constitue ainsi un test dorientation vers S. pyogenes.

27

Tests permettant de diffrencier les principaux streptocoques dintrt

mdical :

Espce

Hmolyse

Groupe

Optochine

Bacitracine

srologique

- S. pyogenes

Rsistant

Sensible

- S. agalactiae

Rsistant

Rsistant

Variable

- S. bovis et

Rsistant

Rsistant

Rsistant

Entrocoques

- Strepto. viridans

Non groupable

Rsistant

Non groupable

Sensible

(diverses espces)

- S. pneumoniae

28

Rsistant

LEXERCICE PRATIQUE
Identification des bactries et des champignons prsents dans un
chantillon clinique :
Bien que la thorie expose dans ce syllabus ne porte que sur les bactries, vous
observerez galement sur les botes de Ptri qui vous seront distribues des colonies
de levures et de champignons filamenteux (dont la thorie vous aura t prsente en
cours) car cela correspond davantage la ralit des chantillons cliniques.
1. Culture sur diffrents milieux :
Glose au sang :
Avantage de ce milieu : permet la croissance de la plupart des bactries
Gram + et mme des plus exigeantes au point de vue nutritionnel.
Inconvnient de ce milieu: si plusieurs types de bactries sont prsents
dans lchantillon, il sera impossible dobtenir une culture pure pour
poursuivre lidentification.
Glose MacConkey :
Permet dobtenir la croissance des Gram uniquement (inhibition des
Gram+)
Permet de distinguer les colonies utilisant le lactose (roses) de celles qui ne
lutilisent pas (transparentes)
Glose acide nalidixique-colimycine :
Permet dobtenir la croissance des Gram + uniquement (inhibition des
Gram-)
Glose sabouraud-chloramphnicol-gentamicine:
Permet la croissance slective des levures et des champignons filamenteux.
Les bactries sont inhibes.

1.1.

Observer laspect des colonies (forme, taille, couleur,)

29

1.2.

Lutilisation de ces 4 milieux permet de prciser si lchantillon contient

uniquement des bactries Gram+ ou Gram- ou un mlange des deux ou si
lchantillon contient des levures.
2. Examen direct des colonies aprs coloration de Gram :

La ralisation dun frottis bactrien et fongique partir des diffrentes colonies

obtenues sur les diffrents milieux utiliss, et leur observation au microscope optique
aprs avoir ralis une coloration de Gram, confirmeront le type de bactries ou de
champignons contenus dans lchantillon.

2.1. Prparation du frottis :

- Dposer 1 goutte deau strile sur une lame en verre laide dune pipette strile
- Prlever une colonie bactrienne ou fongique laide dune oese strile, et la
mlanger la goutte deau
- Laisser scher lair ambiant.

2.2. Raliser une coloration de Gram :

- Le frottis fix est color pendant 1 minute avec une solution de violet de crystal.
- Il est ensuite rinc sous un filet deau claire
- On ajoute une solution iodo-iodure de Lugol agissant comme mordant , et le
frottis est maintenu dans ce milieu pendant 1 minute.
- Aprs lavage leau claire,
- on verse goutte goutte sur la lame incline un mlange alcool-actone (pendant 20
secondes).
- Ds que le solvant scoule clair, il faut sans tarder arrter son action par un grand
lavage leau et bien goutter.
- Le frottis est alors soumis une coloration de contraste en le traitant avec une
solution de safranine pendant 30 secondes,
- rinc soigneusement leau claire
- et sch lair libre ou dlicatement entre deux feuilles de papier buvard.

30

2.3. Observer le frottis color au microscope (40x puis 100x) :

Les bactries non dcolores par lalcool sont dites Gram positif ; elles apparaissent
en violet tandis que les bactries Gram ngatif, dcolores par lalcool et recolores
par le colorant de contraste, apparaissent en rose.
Les levures et filaments mycliens apparaissent Gram positif.

3. Activits biochimiques :
Recherche dactivit enzymatique permettant dorienter le diagnostic.
Raliser le test adquat (catalase ou cytochome-oxydase) en fonction du type de
bactrie que vous avez en culture : coque gram positif ou bacille gram ngatif :
3.1- Production de catalase.

Principe : mise en vidence

par une production doxygne (test positif)

lorsque la bactrie est mise en contact avec du peroxyde dhydrogne.

Utilit du test : diffrenciation des bactries de type coque Gram +

Mode opratoire : le test consiste transfrer au moyen dune oese un

fragment de colonie dans une goutte deau oxygne place sur une lame de
verre : la prsence de catalase donne lieu lapparition de bulles doxygne.

Interprtation : par exemple : les staphylocoques prsentent une raction

positives et sont dits catalase-positifs tandis que les streptocoques sont
catalase-ngatifs .

3.2- Production de cytochrome-oxydase.

Principe : ce test tablit si une bactrie contient un certain type de cytochrome

dans sa chane respiratoire. Loxydation de substrat chromogne comme la

31

ttramthyl-p-phnylnediamine entrane lapparition dune couleur violette

intense.

Utilit du test : identification phnotypique selon la production denzyme :

diffrenciation des bacilles Gram

Mode opratoire : on utilise une bandelette de papier imprgne du ractif , le

N dimthyl paraphnylne diamine, sur laquelle un fragment de colonie est
tal au moyen dune oese. Les espces contenant loxydase donnent en 30
secondes au maximum une raction positive, de coloration violette.

Interprtation : certaines bactries non fermentantes comme le Pseudomonas

aeruginosa (ou bacille pyocyanique) sont cytochrome- oxydase positive tandis
que les Entrobactries, ne ragissent pas (cytochrome- oxydase ngative)

Des tapes ralises prcdemment (observation des milieux de culture, lecture du

frottis bactrien aprs coloration, ralisation des tests oxydase OU cytochrome
oxydase), vous connaissez le type de bactrie en prsence :
- soit Staphylocoque
- Soit Streptocoque
- Soit entrobactrie
- Soit bacille gram ngatif non fermentant
- Soit levure

32

- Culture
- Examen direct + coloration de Gram

Bacilles Gram -

Coques Gram +

Cytochrome- oxydase

Catalase

Non- fermentant

Levures

Entrobactrie

Agglutination

Staphylocoque

Streptocoque C.albicans autreCandida

Coagulase

Staph. Dor

Autre Staph.

Galeries :
20 NE

20 E

Apistaph

Apistrep

32C
Non ralise
aux TP

33

4. Identification des Staphylocoques : coagulase.

Ce test, mettant en vidence laptitude des bactries coaguler le plasma, est le
principal test caractrisant S. aureus. Il permet donc de diffrencier le Staphylocoque
dor des Staphylocoques- coagulase ngative.
Le test de dtection consiste incuber pendant 4 heures 37C un mlange de
plasma de lapin et de la souche tester. Lapparition dun caillot est observe en
inclinant le tube 90C.

En pratique, la dtection de la coagulase est obtenue par un test dagglutination.

Plusieurs tests dagglutination dtectant un ou plusieurs antignes ou rcepteurs de
surface (rcepteur pour le fibrinogne, protineA, antignes capsulaires) sont
commercialiss.

Le test de la coagulase permet lidentification de 99% des souches de S. aureus mais

certaines souches ne produisent pas de coagulase. Lidentification de lespce est
dans ce cas ralise par dautres tests.

raliser un test de coagulase sur les deux souches de Staphylocoques.

5. Identification des bactries au moyen de galerie de caractres
Il est possible didentifier les bactries selon des caractres biochimiques lis la
production denzymes spcifiques de lespce. Le systme API consiste en une
galerie didentification comportant un certain nombre de tests biochimiques
standardiss et miniaturiss. Il existe diffrents types de galeries miniaturises
adapts chacun un groupe de bactries pralablement dfini, par exemple les

34

entrobactries, streptocoques, les staphylocoques, les bacilles Gram non

entrobactries et non fastidieux, etc.
Ces galeries permettent ainsi lidentification phnotypique des bactries, en
associant les diffrents caractres biochimiques.

Lors des TP, vous avez le choix entre 4 types de galeries didentification. Vous devez
choisir la galerie qui vous permettra didentifier prcisment la bactrie :
-

galerie pour lidentification des Streptocoques

galerie pour lidentification des Staphylocoques

galerie pour lidentification des Entrobactries

galerie pour lidentification de B- non fermentants.

Mthode : la galerie comporte des microtubes contenant des substrats dshydrats.

- Inoculer ces microtubes avec une suspension bactrienne, en respectant
scrupuleusement le mode demploi qui vous est fourni lors des TP.
- Incuber les galeries ltuve (37C) pendant 24 48 h selon le type de galerie.

Rvlation de la galerie (lors de la 2me sance de TP, voir plus loin).

6. Identification des levures
Levures : agglutination des antignes de Candida albicans, espce la plus frquemment isole
dans les levures dintrt mdical.
Dposer une goutte de diluant sur une lame puis raliser une suspension avec une fraction
dune colonie prleve lse puis dposer le latex sensibilis avec des anticorps
monoclonaux spcifiques de lespce C. albicans sur la suspension. Appliquer un mouvement
de rotation la suspension pendant deux trois minutes.
Agglutination =C. albicans
Absence dagglutination= C. non albicans (autre espce). Dans ce cas ltude est complte par
la ralisation dune galerie de type API 32C qui permet didentifier toutes les espces de
levures.
Les galeries 32c et dautres techniques didentification des levures seront dtailles au TP2.

35

7. Etude de la sensibilit aux agents antibactriens

A. Mthode de Kirby-Bauer.
La ralisation dun antibiogramme exige des conditions exprimentales
rigoureusement dfinies. Il faut :
utiliser un milieu de culture conforme standardis, tel le milieu de
Mueller-Hinton agar (ordinaire pour les gram ngatifs ou enrichi de
sang pour les gram positifs) qui doit tre rparti raison de 25 ml
pour la bote ronde de 90 mm et sch avant emploi (addition
ventuelle de 5 % de sang de cheval ou de mouton pour assurer la
croissance des bactries exigeantes);
prparer une suspension bactrienne dans leau distille strile partir
de quelques colonies isoles sur milieu glos de manire obtenir un
trouble peine visible (de densit gale au point 0,5 sur lchelle de
McFarland);
tremper un couvillon strile dans la suspension bactrienne, lessorer
par rotation contre la paroi du tube et le frotter doucement sur toute la
surface du milieu en tournant la bote trois fois de 60 afin dassurer
une bonne distribution de linoculum;
Rpartir le disque la pince en appuyant lgrement pour faciliter
ladhrence (les disques peuvent tre diffrencis grce limpression
sur chacun deux dun sigle et de la charge);
incuber la bote renverse dans un dlai raisonnable, en gnral
pendant 24 48 heures. Ensuite, lecture et interprtation des diamtres
dinhibition de la croissance bactrienne (Rsistant, Intermdiaire,
Sensible) lors de la prochaine sance de TP.

B. Systme E-test. Il faut :

prparer chacune des suspensions bactriennes (densit gale au point 0,5
sur lchelle de McFarland) dans une solution strile de NaCl 0,9 %;

36

 ensemencer les milieux : (Mueller Hinton ordinaire ou enrichi de sang) par

couvillonnage selon la technique prconise dans la mthode de KirbyBauer;
prendre chaque bandelette avec une pince (ne toucher que la partie haute
indique par le code de lantibiotique), appliquer laide dune pince et
incuber. Ensuite, lecture et interprtation lors de la prochaine sance de
TP.

8. Etude de la sensibilit aux antifongiques

Visualisation de fungitest et sensititre au TP2.

37

LEXERCICE PRATIQUE : SUITE

1. Identification de la bactrie.
Rvlation des caractres didentification
Les ractions produites pendant la priode dincubation se traduisent par des virages
colors spontans ou rvls par laddition de ractifs :
a. Galerie Entrobactries API 20E :
Aprs incubation 35-37C, rvler les tests ncessitant laddition de
ractifs :
o TDA (Tryptophane DAminase): ajouter une goutte de ractif
TDA ; une couleur marron rougetre indique une raction
positive
o IND (INDole production): ajouter une goutte de ractifs
Kovacs. Une couleur rose diffusant dans toute la cupule
indique une raction positive.
o VP (Voges Proskauer : production dActone): ajouter une
goutte des ractifs VP1 et VP2. Attendre au minimum 10
minutes. Une couleur rose ou rouge indique une raction
positive.
o noter toutes les ractions spontanes ou induites par laddition
de ractifs en se rfrant aux instructions du tableau.
b. Galerie non- Entrobactries API 20NE :
Aprs incubation 30C, rvler les tests ncessitant laddition de
ractifs :
o NO3 (rduction des Nitrates): ajouter une goutte de ractif NIT
1 et NIT 2 dans la cupule NO3 ;

aprs 5 minutes, une couleur rouge indique une raction

positive

38

une raction ngative peut tre due la production

dazote : ajouter 2-3 mg de ractif Zn dans la cupule NO3 :
une cupule reste INCOLORE aprs 5 minutes indique
une raction POSITIVE

o TRP (TRYptophane): ajouter une goutte de ractifs Kovacs. Une

couleur rose

diffusant dans toute la cupule indique une

raction positive.
o Tests dassimilation : observer la croissance bactrienne : une
cupule trouble indique une raction positive
o noter toutes les ractions spontanes ou induites par laddition
de ractifs en se rfrant aux instructions du tableau.
c. Galerie Streptocoques API 20 STREP :
Aprs incubation 35-37C, rvler les tests ncessitant laddition de
ractifs :
o VP (Voges Proskauer : production dActone): ajouter une
goutte de ractif VP 1 et VP 2
o HIP (Acide HIPpurique): ajouter 2 gouttes de NIN
o De PYRA (PYRolidonyl Arylamidase) LAP (Leucine Amino
Peptidase) : ajouter une goutte de ZYM A et ZYM B
Attendre 10 minutes puis lire toutes les ractions en se rfrant au
tableau de lecture.
d. Galerie Staphylocoques ID 32 STAPH :
Aprs incubation 35-37C, rvler les tests ncessitant laddition de
ractifs :
o NIT : ajouter une goutte de ractif NIT 1 et NIT 2
o VP : ajouter une goutte de ractif VP 1 et VP 2
o De GAL PyrA : ajouter une goutte de FB
Attendre de 5 10 minutes puis lire toutes les ractions en se rfrant au
tableau de lecture.
La lecture de ces ractions se fait laide du tableau de lecture.

39

Exemple : fermentation des sucres : la bactrie ensemence dans la galerie ci-dessous

fermente le glucose (GLU), se traduisant par une raction positive en jaune, mais ne
fermente pas le xylitose (XLT) , se traduisant par une raction ngative en rouge.

Identification :
Dtermination du profil numrique :
Sur la fiche de rsultats, les tests sont spars par groupe de 3 et une
valeur 1,2 ou 4 est indique pour chacun. En additionnant lintrieur de
chaque groupe les valeurs correspondant des ractions positives, on
obtient un code numrique (ex. : 7 chiffres pour les galeries API 20E)
Identification :
Elle est obtenue laide du catalogue analytique correspondant la
galerie en recherchant le profil numrique dans la liste des profils.

2. Identification des levures

Les levures sont identifies sur diffrents critres :

Caractres culturaux ; dlai de croissance, TC optimale, aspect

macroscopique de la colonie en fonction du milieu de culture.

Morphologie cellulaire: forme, coloration de la paroi, prsence ou

absence dune capsule.

Structure antignique : dtection des antignes de paroi par des

anticorps monoclonaux (exemple: le BICHRO- LATEX ALBICANS est
un test au latex qui permet lidentification directe de Candida albicans
partir des colonies de levures).

Activits biochimiques : production denzymes.

40

- Milieux base de substrats chromognes inclus dans la glose. Ce type de milieux

permet a la fois lisolement et lidentification : exemple le milieu CHROMagar
Candida

Candida glabrata ( rose)

Candida kruzei ( rose pale)

Candida albicans ( vert)

Candida tropicalis ( bleu violet)

- Galerie didentification :
Identification par un ensemble de ractions du mtabolisme intermdiaire ou
utilisation de lassimilation des sucres (auxanogrammes) sous forme de galeries type
API (exemple : galerie Api candida ; ID 32 C).

Api Candida

Api 32 C

41

 Gnotypage; intrt uniquement en pidmiologie.

Biologie molculaire : la PCR et le squenage peuvent tre un recours
dans les cas o lidentification est rellement difficile mais ils ne
constituent en aucun cas une technique de routine.

La combinaison de tous les paramtres nest pas toujours ncessaire et lutilisation de

telle ou telle mthode varie en fonction des laboratoires.

3. Lecture et interprtation des tests de sensibilit :

3.1 Bactries
- Mthode de Kirby-Bauer.
En pratique, il faut mesurer le diamtre de la zone dinhibition pour
chaque antibiotique (en mm), et le comparer aux valeurs de rfrence
fixant la sensibilit de lespce bactrienne au type dantibiotique examin.
Sensible (S) : la souche peut tre atteinte par un traitement dose
habituelle par voie gnrale;
Rsistante (R) : la souche ne pourra probablement pas tre atteinte, quel
que soit le type de traitement;
Intermdiaire (I) : la souche peut tre atteinte par un traitement local,
par une augmentation des doses par voie gnrale ou par une
concentration physiologique particulire (urine, bile,...).
- Systme Etest.

42

Aprs la priode dincubation, lire directement la valeur de la CMI

correspondant lintersection des deux ellipses dinhibition.
Vrifier que la sensibilit obtenue laide des deux mthodes
correspondent pour un mme antibiotique.

3.2 Levures
- Lecture dun antifongigramme en milieu liquide.

Ce sont des tests en microdilution raliss dans des cupules ou plaques de

microtitration.
Ces tests sont pour certains des rpliques du test de rfrence.
Exemple :

Fungitest : test deux concentrations utilis pour les levures. Il permet

de dterminer des zones de sensibilit (cf. photo)

Sensititre : test 12 concentrations de 7 antifongiques utilis pour les

levures. Il permet de dterminer des CMI (concentration minimale inhibitrice).(cf.
photo).

43

Sensititre ralis sur une culture de Candida vis

vis de 6 antifongiques.

Dmonstration de la lecture dun antifongigramme (tests commercialis) applicable

aux levures par technique de microdilution (Fungitest et Sensititre).
Quelle information supplmentaire vous apporte le Sensititre par rapport au
Fungitest ?

4. Groupage srologique rapide des streptocoques au moyen de

ractifs commercialiss (Slidex Strepto-kit de bioMrieux)
Ce groupage est tabli laide dune raction dagglutination. Il va vous
permettra dorienter le diagnostic despce du Streptocoque que vous avez
en culture.
La technique comporte les tapes suivantes :
extraction enzymatique des antignes : une suspension de colonies dans
la solution dextraction (pronase) a t incube 1 heure 37C;
bien homogniser les suspensions de latex sensibilises par des
immunoglobulines de lapin spcifiques de groupes (A,B,C et D) ;
dposer une goutte de latex dans chacun des cercles de la carte de
raction ;
dposer une goutte de solution contenant les antigne du Streptocoque
extraits, ct de chaque suspension de latex ;
mlanger soigneusement le contenu de chaque cercle au moyen dun
btonnet ( ATTENTION : changer dembout chaque cercle !!!);

44

 donner la carte un lger mouvement de rotation pendant 2 minutes au

maximum ;
une agrgation visible des particules de latex indique une raction
positive.

- Quel est le srogroupe du Streptocoque que lon vous a distribu?

- Si le srogroupe obtenu ne vous permet pas didentifier lespce, en
fonction du type dhmolyse, vous est-il possible de prciser avec plus
dexactitude de quelle espce il sagit ?
- Si non, de quel(s) test(s) complmentaire(s) auriez- vous besoin pour
identifier prcisment lespce du Streptocoque ?

45

DEUXIEME PARTIE
RECHERCHE IMMUNOLOGIQUE DANTIGENES ET
DANTICORPS.

Objectifs: Connatre les diffrentes mthodes de diagnostic dune infection.

La prsence dune infection virale, bactrienne ou parasitaire repose sur la mise en
vidence de lagent infectieux, dantignes, du gnome, ou encore sur la mise en
vidence dune rponse srologique.

Le diagnostic srologique se base sur la mise en vidence dune production

d'anticorps la suite dune infection. La rponse immunitaire se dveloppe aprs un
dlai minimum de 8 10 jours. Par ailleurs certains tests gnrent des ractions
croises, et sont donc moins spcifiques (ex. : recherche dIgM dans le diagnostic
dune Toxoplasmose). La sensibilit varie selon le type de technique utilise.
Pour le diagnostic dune infection en cours, il est important d'analyser deux
prlvements conscutifs 10-15 jours dintervalle, pour observer une modification
significative du taux danticorps. En phase aigu, les IgM apparaissent aprs 7 jours
environ et disparaissent rapidement (quelques mois) ; les IgG sont dapparition plus
tardive, aprs quelques semaines, et peuvent persister trs longtemps, durant des
annes.
Rponse srologique :

46

Prlvements : Srum principalement, prlvements divers (respiratoires, urines,

LCR,).

Techniques :

1. Principe de la raction ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) :

 Permet de dtecter des antignes ou des anticorps, et de les quantifier.

1.1. Dtection des anticorps.

Lantigne, coupl avec un marqueur permettant de lidentifier, est mis en
prsence de lanticorps prsent dans le srum. On dose ensuite le marqueur, une
enzyme couple au complexe Antigne - Anticorps. Cest une raction dimmunoenzymologie .
Dans chaque cas se produit une raction colore dont lintensit est
proportionnelle la quantit danticorps prsent.

Ce type de dosage existe pour de nombreux virus (CMV, EBV,Influenza,), pour

des parasites (Toxoplasma gondii) ainsi que pour des bactries intracellulaires
(Chlamydia, Mycoplasma) ou non (Borrelia).

Formation dun complexe antigne - anticorps

- anticorps (Ac) prsents dans le srum
- antigne (Ag) adsorb sur un support
plastique

Dtection du complexe antigne-anticorps :

par fixation dun anticorps antiimmunoglobuline humaine marqu par une
enzyme

Ajout dun substrat chromogne, qui ragit

avec lenzyme, et production dune raction
colore si lAc est prsent dans le srum.

47

Anticorp

Antign

Exemple dappareils de distribution de srums et de gestion des mthodes ELISA :

Aspect dune plaque de raction ELISA en fin de manipulation : les

puits fortement colors correspondent des srums positifs pour la
raction ELISA, contenant donc les anticorps recherchs.
La lecture automatise des densits optiques est ralise sur un
spectrophotomtre.

Indication :
o

Mise en vidence danticorps apparaissant au cours dune infection

plus ou moins rcente par un virus , une bactrie ou un parasite ;

Dtermination de limmunit vis--vis dun pathogne ;

Etudes pidmiologiques.

Limites :
Sensibilit moindre chez certains patients : nourrissons, personnes
immunodprimes, femmes enceintes
Interprtation parfois dlicate.
1.2. Dtection des antignes.
La dtection des antignes se fait selon une mthode semblable celle reprise cidessus. Mais dans le cas prsent, cest un anticorps (et non plus un antigne),

48

coupl avec un marqueur permettant de lidentifier, qui est utilis pour dtecter
lantigne prsent dans le srum.

2. Les mthodes de diagnostic rapide des antignes:

Exemple : Recherche d'antigne soluble de Legionella pneumophila dans les
urines.
Ce test apporte un diagnostic tiologique en cas de prsomption d infection
Legionella en parallle avec la culture de prlvements respiratoires.
Les avantages de ce test sont : prcocit (ds le dbut des signes), simplicit
(sur urines), rapidit (en + 15 minutes).

Principe du test : immunochromatographie : Un anticorps, dirig contre

lantigne recherch dans le liquide biologique, est fix sur une bandelette.
Lors de la migration du liquide le long de la bandelette, les antignes prsents
dans le liquide vont se fixer sur les anticorps de la bandelette, donnant lieu
une raction colore.

Ex. Recherche dantigne de Legionella dans les urines

Autres tests fonds sur le mme principe: recherche dantigne de Plasmodium dans le
sang

49

3. Immunofluorescence :
Limmunofluorescence est applique :
 la dtection dantignes prsent dans les cellules : par ex. virus
Influenza dans les cellules respiratoires, virus Herpes dans les cellules
cutanes
 la dtection danticorps (Chlamydia, Legionella p.e.) circulant dans le
srum

3.1. Dtection dantignes.

Elle permet de visualiser directement la prsence dantignes dans les cellules
infectes laide dun anticorps spcifique du micro-organisme recherch. Ces
mthodes permettent d'obtenir un rsultat en quelques heures. La qualit du
prlvement conditionne le rsultat.
Des antisrums (mono ou polyclonaux) peuvent tre utiliss pour mettre en vidence
les antignes viraux dans les liquides biologiques, partir de cellules desquames ou
encore dans les leucocytes circulants. De telles mthodes sont souvent trs sensibles,
car elles dtectent les antignes des fractions virales qui ne sont plus cultivables. Elles
ont cependant linconvnient dtre spcifiques dun seul agent pathogne, cest-dire quil faut un examen spar pour chaque pathogne test. Les tests
immunologiques utiliss varient selon la mthode de dtection du complexe antigne
- anticorps utilise.
Le prlvement est dabord fix sur une lame en verre. Ensuite, on ajoute des
anticorps, coupls un compos fluorescent, dirigs contre lantigne recherch. On
procde ensuite la lecture de la lame, au microscope fluorescence.

Entre autres, elle fournit un diagnostic rapide et sensible des infections respiratoires
(ex. : RSV, Parainfluenzae, virus de la grippe et de la rougeole). Ces virus infectent
les cellules de tout larbre respiratoire. Ainsi, des cellules desquames obtenues par
aspirations nasopharynge sont-elles fixes sur des lames de microscope et colores

50

avec des antisrums marqus la fluorescine, spcifiques de chaque virus, raison

dun anti-srum par lame.

Immunofluorescence spcifique du HSV (virus

Herpes) sur un frottis vaginal : les cellules infectes
prsentent une fluorescence jaune - verte.

Antignmie du CMV positive : les leucocytes

marqus par l'anticorps (fluorescence jaune-verte)
contiennent une phosphoprotine du CMV. Le
patient, greff rnal, va bnficier d'un traitement
contre le CMV, mme s'il ne prsente pas encore de
signes cliniques.

Indications de la recherche dantignes par immunofluorescence:

Permettre une prise en charge spcifique et rapide du patient dans certaines
circonstances :
pr- partum (Herpes),
infections respiratoires (Grippe, Virus Respiratoire Syncytial, virus
Parainfluenza, Adnovirus),
diarrhes du nourrisson (Rotavirus, Adnovirus),
recherche dune infection CMV infra-clinique chez un patient
immunodprim (antignmie pp65).

Avantage :
rapidit dobtention du rsultat : 20 minutes 4 heures

Limites :
Manque de sensibilit + + +. Un rsultat ngatif n'exclut pas le diagnostic.
Immunofluorescence : lecture au microscope fonction de l'exprience de
l'observateur.

51

3.2. Dtection danticorps.

Lantigne correspondant lanticorps recherch est fix sur une lame en verre.
On y ajoute le srum du patient, et ensuite un anticorps marqu, dirig contre
lanticorps rechercher.

Si lanticorps recherch est prsent dans le srum, on

observera une fluorescence spcifique lors de lobservation au microscope.

Legionella pneumophilia : les anticorps

anti- Legionella prsents dans le srum se
fixent sur des bactries Legionella coats sur
une lame.
Aprs ajout dun anticorps marqu la
fluorescine, qui va se fixer sur les
anticorps du srum qui se sont fixs sur les
bactries, les bactries de la lame
apparaissent fluorescentes.

5. Agglutination de particules de latex :

Ces techniques sont utilises pour la recherche danticorps et dantignes.

On utilise de petites particules de latex recouvertes dun antisrum spcifique dun
virus ou dune bactrie. Si lantigne (ou lanticorps) est prsent dans lchantillon, il
se fixe aux particules recouvertes danticorps, dissociant la solution lactescente en
agrgats visibles lil nu.

Ces techniques sont en gnral moins spcifiques et moins sensibles que les dosages
ELISA.

52

Exemples de raction d'agglutination :

en tubes avec des dilutions du srum ou de LCR.

sur lame : srodiagnostic de Wright pour la brucellose, test pour la Syphilis

(VDRL-RPR)

Autre application : identification des espces de Streptocoques (voir exercice

pratique).

53

TROISIEME PARTIE
BIOLOGIE MOLECULAIRE

Objectifs: Introduction lapplication de lamplification gnique la Microbiologie.

Le principe consiste amplifier un gne entier ou non avec des amorces spcifiques
(PCR) qui peut tre ultrieurement rvl par lectrophorse sur gel, ou par
hybridation (hybridation) ou encore squenc et compar avec ceux dposs dans
des banques (squenage nuclotidique). Les applications quantitatives deviennent
courantes.
Gnralits :
La biologie molculaire regroupe un ensemble de techniques bases sur ltude,
la dtection et la modification des acides nucliques.
Le rle du laboratoire de microbiologie mdicale repose sur lisolement et
lidentification de lagent pathogne ainsi que ltude de la rsistance aux
agents anti-bactriens. Les mthodes dites traditionnelles comprennent
lexamen direct, la mise en culture et lidentification. Selon le germe en cause, le
dlai de rponse peut prendre plusieurs jours, ce qui nest pas le cas avec les
techniques de biologie molculaire comme la polymerase chain reaction (PCR)
qui permettent une rponse beaucoup plus rapide.

A - Raction de polymrisation en chane (PCR)

La technique de ractions de polymrisation en chane permet damplifier
spcifiquement

une

squence

dfinie

dADN

en

plusieurs

millions

dexemplaires, grce des amorces et laction dune ADN polymrase.

Principe :
A partir dun prlvement, lADN (ou lARN) est extrait.
La mthode damplification dADN consiste tout dabord en la sparation par la
chaleur des deux brins dADN contenant la rgion amplifier. Lchantillon est

54

alors mlang avec des amorces complmentaires des squences nuclotidiques

encadrant la rgion amplifier. Lorsque lADN se refroidit, les amorces, en
excs, se fixent leur squence complmentaire sur lADN cible, puis des
nuclotides sont incorpors squentiellement par une ADN polymrase
thermostable, la Taq polymrase ; deux copies de lADN cible sont alors
produites. Les brins no synthtiss servent ensuite eux-mmes de matrice pour
initier ltape de polymrisation du cycle suivant. La rptition des trois tapes
(dnaturation, hybridation, polymrisation) aboutit une amplification
exponentielle de la squence cible considre ( titre indicatif, une amplification
thorique est de 106 fois pour 20 cycles).

Pour amplifier lARN, une tape prliminaire de transcription inverse en ADN

est indispensable avant la PCR ; elle est ralise in vitro grce laction dune
transcriptase inverse (dorigine aviaire ou murine).

55

B - PCR classiques
Aprs lamplification gnique, il est ncessaire de dtecter les acides nucliques
amplifis. Plusieurs techniques sont disponibles, fournissant un rsultat qualitatif :
1) Dtection sur gel dagarose

Un appareil de PCR (thermocycleur) et la rvlation UV d'un produit amplifi aprs

lectrophorse sur gel.

Gel dagarose aprs PCR et electrophorse. Le gel est photographi sous lumire UV. Les
signaux positifs apparaissent sous laspect de bandes claires nettes (flche). Le rsultat n'est
interprtable que s'il existe des tmoins positifs (la raction a fonctionn) et un tmoin ngatif
(il n'existe pas de contamination).

56

2) Dtection par hybridation molculaire

Une fois amplifi, l'ADN marqu va shybrider spcifiquement avec des sondes
oligonuclotidiques immobilises en lignes parallles sur une bandelette. Aprs
incubation et rvlation avec un substrat chromogne, les rsultats peuvent tre
visuellement interprts.

C- PCR en temps rel

Les mthodes de PCR en temps rel mesurent la quantit de molcules dADN
fabriques pendant le dbut de la phase exponentielle de la raction de PCR.
Schmatiquement, l'ADN fabriqu pendant la PCR est quantifi par incorporation
dune molcule fluorescente ou hybridation de deux sondes spcifiques mettant une
fluorescence. Ces thermocycleurs particuliers sont quips pour la lecture continue
(en temps rel) de la fluorescence mise.

57

D- Squenage
Aprs PCR, il est possible de squencer le produit amplifi afin dobtenir la squence
nuclotidique de celui-ci et dterminer la prsence ventuelle de mutations.

Indications des mthodes de diagnostic molculaire :

Techniques qualitatives : montrer la prsence dun virus ou dune bactrie,
en particulier lorsque ceux-ci ne sont pas cultivables (HVC), ou que le liquide
biologique se prte mal la culture (LCR).
Techniques quantitatives : suivi des patients sous traitement anti-viral (HIV,
HVC, CMV, HVB).
Squenage : dtection de mutations nuclotidiques
- associes la rsistance aux anti-viraux (HIV, HVB),
- caractristiques des gnotypes des virus (HVC, HVB).

Intrts :
o Sensibilit remarquable
o Automatisation possible
o Gain de temps important, notamment pour l'identification des
mycobactries partir de la culture.

58

Limites :

Risques de contamination pour les techniques de PCR.

Absence de preuve du caractre infectieux du virus dtect.
Caractrisation phnotypique de la souche impossible.
Cot encore relativement lev.
La simplicit et la rapidit d'excution de la plupart de ces techniques justifient une
utilisation de plus en plus routinire dans les laboratoires de biologie.

Applications au laboratoire de Microbiologie Mdicale :

Les techniques de biologie molculaire permettent de mettre en vidence la plupart

des bactries, des virus, parasites ou champignons :

Exemples :
Dtection qualitative:
Bactries:

Mycobacterium tuberculosis
Neisseria gonorrhoeae
Chlamydia trachomatis

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Virus:

Enterovirus
Herpes simplex
Influenza A

Parasites:

Plasmodium falciparum
Toxoplasma gondii

Champignons : Aspergillus fumigatus

Dtection quantitative :
Virus :

Cytomgalovirus
Epstein-barr virus

Les techniques de biologie molculaire permettent galement de mettre en vidence

des gnes de rsistance prsents chez les micro-organismes :
Exemples :
Dtection de la prsence de beta-lactamases spectre largi chez les
entrobactries par PCR classique suivie dun squenage du gne.

CONCLUSIONS
Un aspect encourageant des progrs accomplis est sans conteste l'approche
molculaire avec l'amplification gnique (PCR) et le squenage de certains gnes.
D'autres progrs essentiels sont attendre dans ce domaine, en particulier pour les
diagnostics directement sur produits pathologiques.

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BIOLOGIE MOLECULAIRE : Partie pratique

1) Dpts sur gel dagarose :

Matriel ncessaire :


Gel dagarose 2% prcoul

Gnrateur

Marqueur de poids molculaire

Tmoin ngatif

Mode opratoire :
Cette manipulation sera ralise par un lve-moniteur :

Brancher le gnrateur

Fixer le gel sur le gnrateur

Faire un pr-run du gel

Retirer le peigne protgeant les puits

Dposer 10 l deau strile dans tous les puits

La suite des manipulations sera ralise par un reprsentant de chaque groupe :

Dposer 10 l de marqueur de poids molculaire dans un premier puits

et 10 l de tmoin ngatif dans un second puits.

Quand chaque groupe a ralis son dpt, un lve-moniteur va :

Complter les puits vides avec 10 l deau strile

Brancher le gnrateur et laisser migrer le gel durant 30 minutes.

Visualisation des rsultats :

Retirer le gel dagarose du gnrateur

Placer le gel sur la plaque du trans-illuminateur

Recouvrir du verre protecteur

Brancher les UV

Observer les bandes rsultant de la migration du marqueur de poids

molculaire. Le tmoin ngatif nengendre aucune bande.

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2) Interprtation des rsultats dune PCR classique

Observation des photos de gel qui vous sont proposes. Interprtation des rsultats
pour la PCR Aspergillus et la PCR Plasmodium sp.

3) Interprtation des rsultats dune PCR temps rel

Observation des donnes brutes dune PCR temps rel. Interprtation des rsultats
pour la PCR cytomgalovirus.

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