Cours de Biologie molculaire de Licence

professionnelle 2016
Sommaire
1. Introduction
2.1. La structure de lADN
2.2. La structure de lARN

2.3. Du gne la protine

2.3.1. La rplication
2.3.2. La transcription
2.3.3. La traduction
3. Biotechnologie de lADN recombinant
3.1. Obtention de lADN recombinant
3.1.1. Isolation dADN et dARN
3.1.2. Synthse dADNc
3.1.3. La raction en chane en prsence de polymrase (PCR)
3.1.4. Analyse dADN sur gel dagarose et dacrylamide
3.1.5. Les vecteurs de clonage
3.1.6. Fragmentation de lADN (les Endonuclases)
3.1.7. La ligation
3.1.8. Amplification de lADN recombinant obtenu (Transformations de
bactries)
3.1.9. Vrification de la construction (carte de restriction, squenage)
3.2. Lutilisation de lADN recombinant

Introduction :
Les acides nucliques (ADN et ARN) sont connus comme les molcules de la vie, en effet leur
chimie contient les instructions, pour le bon dveloppement, le fonctionnement et la rparation
dun organisme.

On en distingue 2 types, selon le sucre :

ADN (acide nuclique double brin) : ou acide dsoxyribonuclique est le support de

linformation gntique.

ARN (acide nuclique simple brin) : ou acide ribonuclique joue un rle de support de
linformation (matrice) afin dtre traduit en protines (cest lARN messager), ou bien
un rle structurale (lARN ribosomiques, ARN de transferts et autres petits ARN).

Ce sont des macromolcules constitues par la polymrisation linaire dunits

similaires (diffrent didentique) connectes entre elle.
Chaque unit monomrique est compose de 3 constituant : sucre,
phosphate, bases azotes (AT / CG = ADN et AU/ CG = ARN).
La squence des bases azotes caractrise un acide nuclique et
reprsente une forme dinformation linaire.

LADN est situ dans le noyau mais il est galement mis en vidence dans la
mitochondrie, les ARN eux sont situs dans le noyau et dans le cytoplasme
(galement dans la mitochondrie). En effet lADN est transcrit en ARN dans le
noyau, lui-mme traduit en protines dans le cytoplasme pour les ARN messager.
LADN mitochondriale code pour 13 protines, 2 ARNr et 22 ARNt ; ces 13
protines servent toutes la synthse de lATP

La structure de lADN support de linformation gntique : La double hlice /acide

nuclique double brin

La molcule ADN, lacide dsoxyribonuclique est situ dans le noyau de la cellule et

aussi chez les mitochondries des eucaryotes.
Il se compose de deux brins (double macromolcule), formant une doubl hlice, le
support de linformation gntique
Macromolcule forme par la polymrisation dunits de base, les nuclotides composs de
lunion
D- dsoxyribose
Base azote : ATCG
Phosphate

1) La structure primaire de lADN :

a) Le nuclotide : lunit monomrique de lADN

Sucre : ce sont des pentoses, ils ont cinq atomes de carbones numrots, 1 2 3, 4 et 5.

 Le pentose de lARN : le ribose un groupement hydroxyle OH attach latome

de carbone 2 tandis que

Le sucre de lADN, le dsoxyribose un atome dhydrogne et donc un atome

doxygne de moins.
Cette diffrence chimique permet par toutes les enzymes cellulaires qui
interagissent avec lADN ou lARN, dfinissant ainsi les fonctions spcifiques
de deux acides nucliques
Latome doxygne supplmentaire rend lARN moins stable
chimiquement que lADN (augmentation de sa rsistance lhydrolyse)
LADN est mieux adapt la fonction de dpositaire long
terme de linformation gntique.

Le sucre dans la chaine dacides nucliques sont lie entre eux pars des liaisons
phosphodiester. Cela son fait entre un acide ici phosphorique et un alcool OH
Ici on a deux liaisons ester do le terme diester.
Le groupement 3OH dun sucre dun nuclotide est estrifi par un groupe
phosphate qui joint au groupe OH en 5 du sucre adjacent

La chaine des sucres

phosphodiester
lacide nuclique sont fix sur des bases azotes

lies par des liaison

reprsente le squelette de

Puriques : contient un cycle 6 atomes + un cycle 5 atomes

Adnine + guanine : diffre par la position de leur double liaison
Pyrimidiques : ne contient quun cycle 5 atomes
Cytosine + thymine+ uracile (ne se trouve que dans lARN) :
diffre par les groupements attachs aux atomes de carbones +
nombre de double liaison dans les cycles entraine une dlocalisation
des doubles liaison)
Les bases sont des htrocyclique aromatique
3 8 % des cytosine sont mthyles sur le C5 chez les eucaryotes = 5 mthyl
cytosine

La base azote forme toujours une liaison covalente avec le carbone

1 du sucre = forme le nucloside
Les nuclosides de lADN sont : dxosyadnosine (dAMP), dsoxyguaninosine,
dsoxycitidine et thymidine (forcement associ un dsoxyribose).
Les nuclosides de lARN sont adnosine (AMP), guanosine, cytidine, uridine

Un
nuclotide
est un

nucloside li
un ou
plusieurs
groupes
phosphate par une
liaison

ester :

Groupement phosphate se lie au carbone 5 du sucre par un estrification

Le groupement phosphate portent une charge ngative rendant acide la molcule dADN
et dARN. Les nuclotides de lADN sont alors des dsoxyribonuclotides 5monophosphate : ils en existent donc 4 diffrents
Dsoxyadnosine 5 monophosphate (dAMP)
Dsoxyguanosine 5 monophosphate (dGMP)
Dsoxythymidine 5 monophosphate
(dTMP)

Dsoxycytidine 5
monophosphate (dCMP)

Llment de
base de lADN
est le nuclotide
la formation dune liaison
ester entre le

issu de
nucloside et un acide phosphorique

b) La chaine polynulotidique : lacide nuclique

Les prcurseurs des acides nucliques monophosphate

sont les NTP comportant 2 groupements phosphate en
plus (ATP) qui leur permet de subir une estrification
avec le nuclotide suivant et obtenir une chaine
polynuclotide.
Cette liaison est catalyse et rgule par lADN polymrase
Catalyse lattaque nuclophile du 3-OH sur le carbone 3 du
nuclotide suivant
Les liaisons cres entre les nuclotides seront des liaisons
phosphodiester extrmement forte : chaine polynuclotidique
Elle porte une charge ngative qui repousse les espces
nuclophilique, comme les ions hydroxydes, susceptible dhydrolyser la
liaison = Ceci permet la protection de lintgralit de linformation
gntique

La polymrisation dunit lmentaire soriente de lextrmit phosphate libre attach

lextrmit 5 du sucre, vers extrmit 3 du sucre avec une groupement hydroxyle libre : polarit
de la chaine

 Cela veut dire que la squence de base est note de 5 vers 3. ACG veut donc dire
que 5-OH non lie est celui du dAMP, celui du 3OH non li sur le dGMP. A cause de
cette polarit ACG et GCA sont des composs diffrents

Convention : les polynuclotides sont trac et lus dans sens 5-3

2) La structure
nuclique

secondaire : lacide
double brin (hlice),
Phnomne

dhybridation molculaire
La structure covalente des acides nucliques rend compte de leur capacit porter une
information sous la forme dune squence de bases le long de la chaine dacide nuclique. La
possibilit de former des paires de bases spcifiques complmentaire de telle facon quune
structure secondaire en hlice se forme et facilite la rplication ( gnration de deux copie
parti dun matriel gntique originaux intact). Cela permet de transmettre linformation
gntique sans trop la modifier)

La structure secondaire de lADN comporte deux chaines poly nuclotidique

entrelace qui forme une double hlice :
Squelette sucre phosphate sont lextrieur et porte les charges ngatives
Les bases sont empiles lintrieur de la molcule et perpendiculaire au squelette
Des liaisons hydrognes se forment entre les bases des brins opposs :
Une adnine ne sapparie normalement quavec une thymine par deux liaisons

hydrognes
La cytosine ne sapparie normalement quavec une guanine par 3 liaisons
hydrognes
Les deux chaines sont donc complmentaires lun de lautre

La liaison hydrogne tant de faible nergie offre la possibilit de facilit la

sparation des deux brins

Les deux chaines poly nuclotidiques sont antiparallle, direction oppose ( 5-3) / ( 35)

Des liaisons dempilement contribuent la stabilit de lADN, notamment en chassant

les molcules deau de lADN

La

double
hlice
facilit

la

transmission de linformation gntique et

immdiatement suggr la faon dont le
matriel gntique se rplique : de faon semi
conservative.

3) Proprit de la structure de la double hlice :

Grce aux liaisons de faible nergie la double hlice peut tre dnatur rversiblement :
Sparation des deux brins sans rupture des liaisons covalentes.
Dans la rplication de lADN, les deux brins de la double hlice doivent tre spar
lun de lautre au moins moins localement (hlicase + ATP)
Au laboratoire la sparation des deux brins peut tre possible
En chauffant : La temprature de dnaturation TM : est la t laquelle la
moiti de la structure hlicodale est perdue.
La courbe sigmode montre un phnomne coopratif
Le Tm est proportionnel au pourcentage de C/G mais est aussi
dmonstratif du type de torsion, denroulement, et dorientation du
type dADN (A, B ou C) qui offre une accessibilit plus ou moins
importante des bases
Traitement chimique : ex la soude
Cest une dnaturation mais celle-ci peut tre rversible et la
rassociation sappelle la renaturation ou lhybridation
Les bases dans les doubles hlices absorbent moins la lumire UV que ne le font les bases
quand lADN est simple brin : hyperchromie : absorbance maximale dans les deux cas est
260 nm

ultra-violette (260nm)

%G/C
40 : Tm = 87C

Lacide nuclique simple brin ARN

1) La structure de lARN

LARN comme lADN est un polymre de nuclotide joints par des liaisons
phosphodieste, cependant on denote une diffrence de structure importante entre lADN
et lARN

LARN est compos dun sucre le ribose au lieu du dsoxyribose.

A cause du groupe hydroxyle libre en 2 du ribose, lARN est rapidement

dgrad dans des conditions alcalines.

Labsence du groupement oxygne rend lADN beaucoup plus stable

La thymine dans lADN est remplace par luracile dans lARN

LARN existe sous forme monobrin tandis que la molcule dADN comporte
gnralement deux brins associs par des liaisons hydrognes entre bases
complmentaires.
Consquence de la structure monocatnaire de lARN est que de courtes
rgions complmentaires interne peuvent sapparier et former des
structures secondaires et tertiaire.

2) Les classes dARN :

LARNr : lARN ribosomiale : sassocie des protines pour former le ribosome qui
servira de support de la synthse des protines lors de la traduction
LARNm : lARN messager, il provient de la transcription de lADN. Il sert de matrice
pour la traduction des protines
LARNt : lARN de transfert il vhicule les acides amins vers les ribosomes au cours de
la traduction ( ARNt-aminoacyl) . Chaque acide amin fix sur lARNt est associ un
anticodon complmentaire du codon correspondant
Les petits ARNpn : nuclaires impliqus dans la maturation des pr-ARNm en ARNm,
peuvent pour cela sassocier des proteines pour former des petits ribonucloproteines
Les petits ARNpno : nuclolaire : impliqu dans les modifications et la maturation des
ARNr
Les microARNmi et les petits ARNpi, dinterfrence, : son responsable de linterfrence
des ARN, un processus dans lequel elles aident dclencher la dgradation de lARNm
ou inhibent sa traduction en protine.