Préface

deJean-François
Mattei 4
La structure
desgènes,
parPierre
Chambon 6
L'amplification
desgènes, Mullis 18
parKary
L'extrémité
deschromosomes,
parRobert
Moyzis 24
La cartographie
deschromosomes,
parR.White
etJ.-M.
Lalouel 32
JeanWeissenbach
:La cartographie
du génome 42
Le déchiffrage
du génome,
parDeborah
Erickson 44

La détermination
du sexe 50
Un chromosome
fragile 51
Lesanomalies
del'ADNmitochondrial 52
La trisomie
21,parDavid
Patterson 54
L'empreinte
parentale,
parCarmenSapienza 62
La mucoviscidose 70

L'hémophilie,
parRichard
La~netGordon
Vehar 72
La prédisposition
au diabète 79
Lesrisques
génétiques
d'infarctus 80
Lesgènes
de cancers,
parRobert
Weinberg 82
La thérapie
génique,
parInder
Verma 90
Un espoir
pourles
myopathes 98
Lesmini-cochons
donneurs
d'organes 99

Le contrôle
etl'expression
desgènes,
parC.Hélène Thuong 100
etN.T.
L'origine
del'homme,
parJ.Klein, N. Takahata
etF.
Ayala 110
M.-H.Cherpin
: Les génétiques
empreintes descriminels 116
Alberto
Piazza
: L'héritage génétique
del'Italie
antique 117
Desgènes
etdeslangues,
parLuigi Cavalli-Sforza 120
AndréLanganey
:La génétique
despopulations 127
PREFACE
Le
concept de la génétique est
ancien : il apparaît dans la Bible,
dans le récit de la Genèse, et il
s'impose à la réflexion dès lors
qu'un homme et une femme ont un
enfant. La génétique éclaire le
double aspect de la vie : la diversité
et la permanence. Elle définit la
diversité des espèces, puisque deux
individus appartiennent à la même
espèce s'ils sont interféconds ; elle
représente la permanence de la vie,
la frontière entre la biologie et la
métaphysique, la réponse de
l'homme à sa recherche d'une cer-
taine pérennité.
La génétique est longtemps res-
tée un concept philosophique, théo-
logique et métaphysique. Ce n'est
qu'au XIXe siècle, au travers de
l'observation de Darwin et des
expériences de Mendel, que la
génétique entre dans la réalité scien-
tifique. Les idées de Darwin sont
également à l'origine de l'antinomie
de l'inné et de l'acquis, au coeur du
débat génétique actuel. L'homme
est-il déterminé par son patrimoine
génétique, ou est-il façonné par le
milieu environnant ? Quelle est la
part respective de l'inné et de
l'acquis ? Et comment l'inné est-il
acquis ?
Au début du siècle, la génétique
a peu progressé : néanmoins, les lois
de l'hérédité de Mendel ont été
vérifiées sur diverses espèces, dont
l'espèce humaine, et les travaux de
Morgan ont révélé le rôle des chro-
mosomes dans la transmission des
caractères. Puis, au cours des
40 dernières années, la génétique a
connu un développement explosif :
en 1953, la découverte, par James
Watson et Francis Crick de la molé-
cule d'ADN révèle la nature du mes-
sage génétique, et donc l'identité
génétique du vivant ; en 1956, on
détermine le nombre exact de
chromosomes de l'espèce humaine
Jean-François Mattei
(23 paires) et, en 1959, on découvre
la première anomalie chromoso-
mique, la trisomie 21 ; le chapitre
des anomalies chromosomiques et
des malformations de l'enfant est
largement décrit dans les années
1960 ; nous assistons au développe-
ment du diagnostic prénatal dans les
années 1970 et de la biologie molé-
culaire dans les années 1980 (la
découverte de la structure morcelée
des gènes, puis l'invention de l'ampli-
fication des gènes et le début du
séquençage) ; les années 1990
seront probablement les années de
la thérapie génique.
La génétique médicale est une
discipline récente, originale et à
retentissements sociaux. Elle est
récente parce que les connaissances
sont nouvelles. Pasteur avait ouvert
le grand livre des maladies infec-
tieuses ; ces maladies ont été, pour
la plupart, éradiquées en un siècle
(toutefois, le SIDAremet en question
nos possibilités d'action).
Aujourd'hui les nouvelles priori-
tés médicales sont les malformations
et les maladies génétiques. Les men-
tantes ont changé : autrefois, les
couples se souciaient du nombre
d'enfants qu'ils engendraient ; I'avè-
nement de la contraception, assez
récent, a réglé le problème de la
quantité, auquel s'est substituée une
exigence de qualité.
La médecine génétique apparaît
originale puisque, au moins dans un
premier temps, elle ne soigne pas ;
elle tente de comprendre, de
conseiller et de prévenir, ce qui
bouscule l'image traditionnelle de la
médecine thérapeutique. En outre,
le médecin généticien engage son
diagnostic sur un être qui n'existe
pas. Il répond en effet à la question
suivante : « Si nous avons un enfant,
quel est son risque de malforma-
tion ?». Cet échange entre le méde-
cin et le couple constitue une autre
originalité de la génétique. La
médecine était autrefois indivi-
duelle, fondée sur ce que Duhamel
appelait le « colloque singulier »
entre un patient et un médecin.
Désormais, la médecine dépasse la
notion d'individu ; elle concerne un
couple, voire deux familles ou un
groupe de population donné.
La génétique, enfin, intéresse
l'homme dans sa dimension histo-
rique et sociale : historique, car la
génétique a plusieurs fois servi
d'alibi à des comportements poli-
tiques pervers, les comportements
des nazis et les errements de
Lyssenko en Union soviétique ;
social, car pour chacun d'entre nous,
avoir un enfant signifie continuer à
vivre à travers lui. Les couples qui se
tournent vers le généticien sont des
couples stériles ou des couples qui
ont eu un enfant handicapé et ne
veulent pas laisser cette seule image
d'eux-mêmes.
Ces divers aspects de la géné-
tique expliquent l'enthousiasme que
suscite le Programme génome. Pour
répondre aux questions des couples
sur les risques d'apparition des
maladies, les généticiens ne dispo-
saient que de statistiques de type
mendélien : 50 pour cent de risque
pour les maladies dominantes, 25
pour cent pour les maladies réces-
sives, quelques pour cent pour les
maladies polygéniques. En apprenant
à couper la molécule d'ADN en mor-
ceaux et à isoler, identifier, repérer
des gènes, nous nous sommes
donné les moyens de comprendre
et de corriger à terme les erreurs
de la nature ; telle est l'ambition du
Programme génome.
Toutefois,
ce Programme com-
porte une ambiguïté, une sorte de
réminiscence du mythe promé-
théen : Prométhée avait dérobé le
feu sacré et se prétendait l'égal des
Dieux ; aujourd'hui, le généticien
ayant découvert la molécule d'ADN
se croit détenteur du secret de la
vie. C'est pourquoi la génétique
navigue entre des espoirs fantas-
tiques et des craintes justifiées. Les
espoirs fantastiques correspondent
 à une réalité du diagnostic. Nous
connaissons désormais les causes
génétiques des myopathies (la myo-
pathie de Duchenne, de Becker,
scapulaire, etc.), alors que nous
savions à peine les différencier
autrefois. Nous identifions réguliè-
rement de nouveaux défauts géné-
tiques : I'hémophilie A, I'hémophilie
B, les différentes mutations respon-
sables de la neurofibromatose et,
récemment, le gène responsable de
la maladie de Hirschprung, une des
malformations digestives les plus
fréquentes de l'enfant.
Le diagnostic génétique ouvre la
voie à la médecine prédictive : nous
pouvons détecter des gènes dont
les effets se feront sentir plus tard
dans la vie (la chorée de Huntington
et certains oncogènes par exemple).
Le diagnostic prénatal est également
possible, permettant à un couple à
risque d'interrompre la grossesse si
l'enfant est atteint. Nous pouvons
également envisager une thérapie
génique : nous savons introduire un
gène connu dans un vecteur, un
virus par exemple, et remplacer un
gène déficient par un gène normal
dans les cellules atteintes. Nous
connaissons désormais 4 000 mala-
dies génétiques ; il en existe plu-
sieurs dizaines de milliers, puisque
nous avons environ 100 000 gènes ;
je pense que le siècle prochain sera
le siècle de l'identification et du trai-
tement des maladies génétiques. Les
espoirs sont donc considérables.
Puisque nous identifions les
gènes de maladies, pourquoi ne sau-
rions-nous pas déterminer les gènes
définissant des caractères physiolo-
giques tels que la taille ou l'intelli-
gence ? Si nous sommes capables de
changer le patrimoine génétique des
sujets malades, ne pourrions-nous
pas envisager de modifier des carac-
tères normaux ? Ces interrogations
sont chargées de craintes ; plus que
jamais, il apparaît que la connais-
sance biologique doit être accompa-
gnée de la notion de sagesse et
d'une réflexion philosophique. La
connaissance du patrimoine géné-
tique des personnes ne doit pas
être diffusée dans la collectivité, car
elle risquerait de s'imposer comme
un caractère discriminant. Nous
devons éviter que la société
retourne vers l'eugénisme et la dis-
crimination.
L'eugénisme scientifique, fondé à
la fin du siècle dernier par l'Anglais
Francis Galton, souhaite «entraver la
multiplication des inaptes et amélio-
rer la race». Je m'oppose complète-
ment à cette manière de penser
pour deux raisons :premièrement,
le but de la société n'est pas de hié-
rarchiser et d'institutionnaliser les
différences entre les hommes, mais,
au contraire, de les atténuer et de
protéger les faibles ; deuxièmement,
la personne humaine ne se réduit
pas à son seul patrimoine génétique.
Je comprends parfaitement la
démarche des parents d'un enfant
mongolien, qui demandent un dia-
gnostic prénatal pour leur deuxième
enfant ; je le comprends à titre indi-
viduel, mais je n'accepterais pas
qu'une société décide de mener une
politique de santé publique condui-
sant à l'élimination de tous les triso-
miques 21. Une chose est de régler
un problème de détresse person-
nelle, une autre chose est de définir
a priori des critères déterminant le
droit à la vie ou le droit à la condi-
tion d'être humain. Nous ne devons
pas oublier la notion de dignité
humaine, et ces malades ont certai-
nement la même dignité que tout
être humain.
Paradoxalement, le généticien
que je suis, au coeur des progrès
fantastiques de la génétique, ne croit
pas en la définition de l'homme par
son patrimoine génétique. Ce n'est
pas le code génétique qui fait de
nous des êtres de raison, car le
code génétique est universel : il est
le même chez les espèces végétales
et animales ; entre l'homme et la
souris, il y a plus de 90 pour cent
d'homologie. À mon sens, l'essence
de l'homme-l'intelligence, l'âme, la
conscience-ne peut être observée
au microscope et échappe à
l'homme lui-même.
Pour ces raisons, nous devons
prendre garde à ne pas sombrer
dans le scientisme. Il est vrai que
cette époque est passionnante :
après la révolution agraire et la
révolution industrielle, nous vivons
la révolution scientifique ; or, parallè-
lement à cette révolution, les réfé-
rences traditionnelles, religieuses,
philosophiques et politiques se sont
effondrées. Dans cette période de
doute, nous nous raccrochons aux
quelques certitudes qui perdurent :
les certitudes scientifiques. II est
urgent que les hommes publics, les
penseurs, les philosophes réfléchis-
sent à leur tour sur le monde pré-
sent et futur.
Le débat science et société se
résume à trois questions essentielles.
La première est : Toute nouvelle
connaissance est-elle un progrès ?
Ceci est une réflexion en soit sur la
définition du progrès. La deuxième
question est : Comment établir une
communication permanente et effi-
cace entre les scientifiques, les poli-
tiques et les citoyens ? L'information
scientifique contribue à réduire ce
fossé entre le monde des labora-
toires et le monde des citoyens, et
je suis heureux de présenter ce
recueil d'articles passionnant sur la
génétique humaine. La troisième
question est : La science est-elle une
recherche de la connaissance en
tant que telle, ou est-elle au service
de la société ? Je crois que les scien-
tifiques doivent rester en prise
directe avec les besoins de la
société.
La trilogie formée des scienti-
fiques, hommes politiques et philo-
sophes doit être, en outre, arbitrée
par le corps social. Ainsi l'utilisation
de la procréation médicalement
assistée, de la médecine prédictive,
du diagnostic prénatal, de la théra-
pie génique, doit-elle être décidée
avec les jeunes générations qui
affronteront ces techniques. Là est
le sens de la réflexion éthique, à
laquelle je suis heureux de contri-
buer
Jeon-François MATTEIest généticien
et député des Bouches-du-Rhône.
11vientde publierun rapport
ou Premierministre,
inttulé « La vie
en question)),
 La structure
Chez les organismes supérieurs,
morcelés : ils comportent des
dont les produits de la transcription
aboutir à l'ARN messager qui
LECONCEPTde gène, né
avec la biologie moderne,
s'est modifié, enrichi et
affiné tout au long de son
histoire. Gregor Mendel a
montré, dès le XIXe siècle, que les « fac-
teurs » héréditaires contenus dans les cel-
lules reproductrices sont responsables des
caractères des organismes. Le biologiste
danois Wilhelm Johannsen a donné à ces
facteurs le nom de gènes. Au début du
xx° siècle, on définissait les gènes
comme des éléments distincts, disposés
en chapelet dans les chromosomes. Il y a
seulement 45 ans que l'acide désoxyribo-
nucléique, l'ADN, a été identifié en tant
que support du matériel héréditaire ;
l'analyse de sa structure, en 1953, donna
une réalité physique au gène et expliqua
du même coup certains aspects de ses
fonctions. Au cours des 20 années qui
suivirent, les biologistes moléculaires et
les généticiens travaillant essentiellement
sur la bactérie Escherichia coli, apprirent
comment l'information héréditaire se
répartit dans les gènes et ils commencè-
rent à comprendre comment s'effectue la
traduction de ce message en protéines qui
déterminent les structures et les fonctions
des cellules et des organismes.
Il est maintenant évident, au moins
pour les bactéries, qu'un gène de «struc-
tures correspond à un segment continu et
bien défini d'ADN contenant l'information
génétique dirigeant la fabrication d'une
protéine unique ; dans le brin d'ADN, la
séquence linéaire des sous-unités, les
nucléotides, correspond directement à la
séquence linéaire des acides aminés dans
la protéine. On pensait que ce principe de
« colinéarité » s'appliquait non seulement
aux bactéries mais aussi aux cellules
supérieures. En 1977, on vit que cette
supposition était inexacte. L'organisation
des gènes des mammifères, des oiseaux
des gènes
la plupart des gènes sont
séquences non codantes
sont excisés pour
sera traduit en protéine.
et des amphibiens, diffère fondamentale-
ment de celle des bactéries : en réalité, la
plupart des gènes ne sont pas d'un seul
tenant. La découverte des gènes fragmen-
tés, morcelés ou en mosaïque (split genes
en anglais) et d'autres constatations
récentes ont montré que l'appareil géné-
tique de la cellule est plus complexe, plus
variable et plus dynamique qu'on ne
l'avait soupçonné.
La traduction de l'ADN
en protéines
Une molécule d'ADN est une longue
double hélice ; chaque brin est constitué
par une chaîne de nucléotides. Chaque
nucléotide est lui-même caractérisé par
un groupement chimique appelé base, et
quatre bases participent à l'élaboration
du message génétique : l'adénine (A), la
guanine (G), la thymine (T) et la cytosine
(C). L'information génétique est détermi-
née par la séquence de ces bases. Les
codons sont alors des enchaînements de
trois bases successives. À chaque codon
correspond l'un des 20 acides aminés
pouvant entrer dans la constitution d'une
chaîne protéique, et l'information géné-
tique passe de l'ADN aux protéines à
l'aide d'un intermédiaire, l'acide ribonu-
cléique, ou ARN.Celui-ci est une sorte de
copie de l'ADN puisque l'un des brins de
la double hélice est transcrit en un brin
complémentaire d'ARN selon les règles
d'appariement des bases : la base A de
l'ADN s'apparie avec U (l'uracile, qui se
substitue dans l'ARN à la thymine T de
l'ADN) et G s'apparie avec C. Chez les
bactéries, le résultat est un brin d'ARN
messager (mARN) qui est traduit en pro-
téines. Du codon d'initiation AUG près
de l'extrémité 5'de l'ARN messager, et
jusqu'au codon de terminaison près de
son extrémité 3', chaque codon de l'ARN
Pierre Chambon
dirige l'incorporation d'un acide aminé
particulier pour former une chaîne poly-
peptidique de longueur croissante.
Comme je l'ai indiqué, les codons de
l'ARN et les acides aminés correspondants
de la protéine sont colinéaires.
Chaque acide aminé étant déterminé
par un codon formé de trois nucléotides, il
est facile de calculer qu'un gène de struc-
ture codant une protéine moyenne (envi-
ron 300 acides aminés) comporte environ
900 paires de bases. Les cellules proca-
ryotes (les cellules dépourvues de noyau)
comme Escherichia coli possèdent un
seul chromosome sous forme d'une seule
molécule d'ADN de quelques trois millions
de paires de bases ; il y a donc assez de
bases pour coder un peu plus de 3 000
protéines. Ce nombre est en bon accord
avec le nombre de protéines différentes
que l'on s'attend à voir fabriquer par la
bactérie. Généralement, la taille du
génome, c'est-à-dire la quantité totale
d'ADN contenu dans une cellule, aug-
mente lorsque l'on gravit les échelons de
l'échelle évolutive et que les organismes
deviennent plus complexes. Dans les cel-
lules eucaryotes (les cellules qui possè-
dent un noyau), l'ADN se trouve dans le
noyau, limité par la membrane nucléaire ;
et chez les eucaryotes supérieurs comme
les mammifères, le génome comporte
jusqu'à trois ou quatre milliards de paires
de bases réparties dans un grand nombre
de chromosomes (46 chez l'homme).
Cette information suffit théorique-
ment pour coder plus de trois millions de
protéines. Or ce nombre est dispropor-
tionné par rapport au nombre de pro-
téines effectivement fabriquées par un
mammifère : entre 30 000 et 150 000.
Comment expliquer alors la présence de
cet excès d'ADN ?
L'étude des cellules eucaryotes nous
avait appris que leur machinerie géné-
tique différait notablement de celle des
cellules procaryotes. Chez les proca-
ryotes, la transcription et la traduction de
l'ADN s'effectuent en même temps et au
même endroit, tandis que ces deux pro-
cessus sont séparés dans l'espace et dans
le temps chez les eucaryotes. L'ADN est
d'abord transcrit dans le noyau en un pré-
curseur de l'ARN messager. Les molé-
 cules précurseurs subissent ensuite une
série d'opérations de maturation dans le
noyau (elles sont notablement raccour-
cies et leurs extrémités sont modifiées)
pour aboutir à l'ARN messager mature qui
est exporté à travers la membrane
nucléaire dans le cytoplasme de la cellule
où il est traduit en protéine.
Évidemment, cette opération de rac-
courcissement pouvait rendre compte, au
moins en partie, de la discordance obser-
vée chez les cellules supérieures entre la
quantité d'ADN et la quantité d'ARN mes-
sager, et par conséquent de protéines.
D'autres explications étaient possibles.
Ainsi, chez les eucaryotes, certaines
séquencesd'ADN hautement répétitives et
certaines séquencesintercalaires, ou spa-
cers, présentes entre des gènes répétés ne
sont pas du tout transcrites en ARN ; de
plus, l'ADN non codant doit fournir des
signaux de régulation pour la transcrip-
tion. Une question se posait : quels
étaient les segments d'ARN précurseur éli-
minés au cours des opérations de matura-
tion ? Des modèles impliquant un rac-
courcissement à l'une ou aux deux
extrémités de la molécule précurseur
furent proposés. Cependant, il était
impossible de tester la valeur de ces
modèles, car on ne savait pas détecter ni
isoler un gène particulier dans un génome
comportant plusieurs milliards de paires
de bases. Une percée technologique était
indispensable pour progresser : c'est la
découverte des techniques de recombi-
naison de l'ADN in vitro et de clonage
moléculaire qui rendit possible l'obten-
tion de grandes quantités de fragments
d'ADN pur ayant la taille d'un gène.

Le clonage moléculaire

Pour cloner un fragment d'ADN, on le

« recombine » avec un vecteur pouvant
être introduit dans une bactérie hôte et s'y
multiplier. Le vecteur peut être un plas-
mide (élément circulaire d'ADN bactérien
non chromosomique) ou un bactério-
phage (virus qui infecte une bactérie).
L'ADN vecteur est coupé en un site spéci-
fique par une enzyme appelée endonu-
cléase de restriction. Chacune de ces 1. L'ORGANISATIONMORCELÉEdu gène de l'ovalbumine est illustrée par cette photogra-
enzymes reconnaît une courte séquence phie en microscopieélectronique (en haut) et sa représentation schématique(au milieu). Le
nucléotidique spécifique et coupe l'ADN brin de l'ADN contenant le gène de l'ovalbumine (protéine du blanc d'oeuf) est hybridé avec
l'ARN messager(mARN)correspondant de l'ovalbumine. Ici l'hybride est agrandi 180 000
en ce site unique de clivage. Le fragment
à cloner est inséré dans la molécule fois. Certains segmentsd'ADN(ligne noire sur la carte) et d'ARN (en couleur), complémen-
d'ADN vecteur préalablement ouverte. taires l'un de l'autre, s'hybrident ; dans cesrégions, les séquencesd'ADNcorrespondentaux
huit exons, notésL (pour leader) et de 1 à 7. Certains segments d'ADN forment cependant
L'ADN recombinant est incubé avec une
des boucles à partir de l'hybride car ils n'ont pas, dans l'ARN, de séquencescomplémen-
culture de cellules bactériennes. Certaines
taires auxquelles ils puissent s'hybrider ; ce sont les septintrons, notés deA à G. Les deux
bactéries sont ainsi «transformées» (par extrémités du messager (5'et 3') sont indiquées,de mêmeque la courte queue de poly-A à
un plasmide) ou « transfectées » (par un l'extrémité 3'. La représentation schématique du gène(en bas) montre les sept introns (en
phage), c'est-à-dire qu'elles hébergent blanc), les huit exons (en couleur) et le nombre de paires de basesde chacun de cesexons ;
une molécule d'ADN recombinant. la taille des introns varie de 251 paires de bases(B) à environ 1600 (G).
 Il faut alors sélectionner les bactéries
qui véhiculent ces molécules. Si le vec-
teur est un plasmide, on lui incorpore un
gène conférant la résistance à un antibio-
tique ; seules les bactéries transformées
par un plasmide vivront et formeront des
colonies lorsqu'elles seront cultivées en
présence de l'antibiotique. Lorsque le
vecteur est un phage, le dépôt d'une cel-
lule transfectée sur un « gazon »de bacté-
ries en culture permettra d'obtenir une
plage de cellules bactériennes tuéespar le
phage recombinant qui s'est multiplié.
L'étape suivante de la purification
d'un fragment donné d'ADN est l'identifi-
cation des colonies bactériennes ou des
plages de phages qui contiennent le frag-
ment choisi. La technique la plus com-
mune se fonde sur le fait que deux brins
d'ADN de séquences nucléotidiques com-
plémentaires peuvent s'hybrider selon les
règles d'appariement des bases, pour for-
mer un double brin. Les colonies trans-
formées par un plasmide (ou les plages
de phages) sont d'abord transférées sur
du papier filtre. L'ADN des bactéries (ou
des particules de phage) est ensuite libéré
et dénaturé (ses deux brins sont séparés)
par traitement alcalin ; au cours de ce
processus,les brins dénaturés se fixent au
papier filtre.
Dans l'étape suivante, on expose
l'ADN à une sonde spécifique, un ADN
dénaturé ou un ARN, dont la séquence
s'apparie avec celle du fragment recher-
ché et qui a été marqué par un isotope
radioactif. Les molécules sondes s'hybri-
dent avec toutes les séquences complé-
mentaires présentes dans l'ADN recombi-
nant, formant ainsi des molécules
hybrides fixées au papier filtre, le restant
de la sonde étant éliminé par lavage.
On détecte les hybrides marqués
radioactivement par autoradiographie :
on met le papier filtre en contact avec
une émulsion photographique et après
exposition prolongée et développement
du cliché, la localisation de l'isotope
radioactif (et donc du clone recherché)
apparaît sous forme d'une tache noire sur
l'émulsion. Le processus d'hybridation
est extrêmement puissant ; grâce à lui, un
seul chercheur peut examiner plusieurs
centaines de milliers de clones bactériens
ou phagiques en une seule opération.
Lorsqu'on a identifié un clone, on peut le
cultiver et disposer ainsi d'une grande
quantité d'un fragment d'ADN purifié.
Lorsque mes collègues du laboratoire
de génétique moléculaire des eucaryotes
de Strasbourg et moi-même avons entre-
pris, au milieu des années 1970, les
recherches qui ont abouti à la découverte
des gènes en mosaïque, notre propos
n'était pas réellement d'étudier la struc-
ture d'un gène en tant que tel. Nous nous
intéressions surtout au phénomène de
différenciation cellulaire. En particulier,
nous espérions apprendre comment les
hormones sexuelles-oestrogènes et pro-
gestatifs-contrôlent la différenciation
des cellules de l'oviducte de la poule en
période de ponte et comment elles modu-
lent l'expression du gène de l'ovalbu-
mine, la protéine principale du blanc
d'oeuf.
Le gène de l'ovalbumine
Le génome complet de la poule est
présent dans le noyau de chacune de ses
cellules, mais seuls certains gènes sont
exprimés (transcrits en ARN messager)
dans une cellule donnée à un moment
donné. L'ovalbumine, une chaîne de 386
acides aminés, est synthétisée par des cel-
lules de l'oviducte en période de ponte.
La différenciation de ces cellules et
l'expression du gène de l'ovalbumine sont
contrôlées par les hormones sexuelles
femelles ; en l'absence de ces hormones,
le gène n'est pas transcrit en ARN et la
synthèse de la protéine n'a pas lieu.
Pour comprendre ces processus de
régulation au niveau moléculaire, nous
voulions isoler le gène de l'ovalbumine à
partir des cellules spécialisées de l'ovi-
ducte ainsi qu'à partir d'autres cellules,
comme les globules rouges du sang
(contrairement aux globules rouges des
mammifères, ceux des oiseaux ont un
noyau) dans lesquelles ce gène n'est pas
exprimé, et comparer sa structure dans
ces deux environnements différents. Le
recours aux techniques de recombinaison

2. L'INFORMATION GÉNÉTIQUE passe de l'ADN à l'ARN, et de
l'ARN à la protéine. Elle est stockée dans les gènes qui sont des
segments d'ADN en double hélice. L'information est codée dans
des séquencesparticulières de quatre bases qui caractérisent les
nucléotides constituant l'ADN : l'adénine (A), la guanine (G), la
thymine (T) et la cytosine (C). Les deux brins de l'hélice sont
reliés par des liaisons hydrogène entre paires de bases complé-
mentaires ; A s'apparie avec T, et G avec C. Chaque brin d'ADN
a une extrémité 5'et une extrémité 3' et les deux brins ont une
polarité opposée. Le brin codant de l'ADN (en bleu) est d'abord
transcrit en un brin complémentaire d'ARN, qui est ensuite tra-
duit en protéine. Chaque codon, formé de trois nucléotides,
dirige l'addition d'un acide aminé à la chaîne protéique (ici les
huit premiers acides aminés de l'ovalbumine).
de l'ADN in vitro permettait cette étude ;
nous nous sommes donc attaqués au clo-
nage du gènede l'ovalbumine de la poule.
Les premières recherches furent
effectuées par Peter Humphries,
Madeleine Cochet, Andrée Krust,
Marianne Le Meur et Pierre Gerlinger. Ils
utilisèrent, pour la purification de l'ARN
messager, le fait que l'ARN messager de
l'ovalbumine représente 50 pour cent de
l'ARN messager total dans les cellules de
l'oviducte de la poule lors de la ponte.
L'ARN messager de l'ovalbumine est une
chaîne de 1 872 nucléotides et 1 158
codent les 386 acides aminés de la pro-
téine ; la séquence de tête composée de
64 nucléotides à l'extrémité 5'de l'ARN
et un segment de 650 nucléotides à
l'extrémité 3'ne sont pas traduits. 11
fabriquèrent alors un gène artificiel de
l'ovalbumine, par une opération inverse
du sens courant ADN-ARN messager :
l'ARN messager de l'ovalbumine fut
transcrit (grâce à une enzyme virale, la
transcriptase inverse) pour former un brin
complémentaire d'ADN qui, à son tour, fut
copié (au moyen de l'ADN polymérase)
pour aboutir à un ADN double brin. Puis
ce gène artificiel de l'ovalbumine fut
recombiné avec un plasmide et cloné
dans une culture d'Escherichia coli.

3. LE CLONAGE MOLÉCULAIRE nécessite

l'insertion d'un fragment d'ADN dans un
vecteur (ici, un plasmide, petit anneau
d'ADN bactérien) Le plasmide et l'ADN
étranger sont coupés à un site spécifique
par une enzyme de restriction : chacun
des fragments (a et b) s'hybride avee un
plasmide, par appariement des bases au
niveau des extrémités libres complémen-
taires. Les plasmides recombinés sont
introduits dans des bactéries On identifie
les colonies renfermant le plasmide par
leur résistance à des antibiotiques (ici la
pénicilline). Puis, on transfère les eolo-
nies sur un papier filtre, on fait éclater
les cellules, on dénature leur ADN (on en
sépare les deux brins), et on le fixe sur
place. On ajoute une sonde moléculaire
spicifique : un brin DARN ou DADN com-
plémentaire du fragment désiré (ici a) et
marqué avec un isotope radioactif. En
s'hybridant aux séquences complémen-
taires, cette sonde se fixe au papier ; on
élimine le reste par lavage. On place
alors une émulsion photographique au
contact du papier, puis on la développe et
on voit apparaître une tache sombre à
1'emplacement desfragments clonis.
 Cette méthode produisit suffisam-
ment de matériel pour établir la carte de
l'enzyme de restriction de cet ADN,ce qui
fut une première étape vers la connais-
sance de sa structure. Pour établir une
telle carte, on soumet des échantillons de
l'ADN en question à une batterie
d'enzymes de restriction, on analyse les
fragments obtenus et on détermine, le
long de la molécule d'ADN, les localisa-
tions précises des sites de reconnaissance
spécifiques pour chacune des enzymes.
La connaissance de ces sites permet de
reconnaître un ADN particulier et de
constater des modifications éventuelles
de sa structure. En ce qui concerne l'ADN
complémentaire de l'ovalbumine, nous
apprîmes ainsi qu'il n'est pas coupé par
les deux enzymes de restriction appelées
EcoRI et HindIII, c'est-à-dire qu'il ne
comporte aucune des deux séquences
spécifiques reconnues par ces enzymes,
chacune contenant six paires de bases.
L'étape suivante consistait à compa-
rer la structure du gène de l'ovalbumine
dans le génome de la poule lui-même,
avec celle reflétée dans l'ADN complé-
mentaire de l'ARN messager et ceci, à la
fois pour l'ADN des cellules de l'oviducte
et des cellules non spécialisées dans la
production d'ovalbumine. Comme les
techniques de clonage pour isoler un
gène représentant un millionième du
génome complet étaient encore à leurs
débuts, nous décidâmes d'analyser
d'abord la structure du gène de l'ovalbu-
mine, sansl'isoler, en le caractérisant par
sa carte d'enzyme de restriction au sein
du génome complet de la poule. Aidés
par Richard Breathnach qui s'était joint à
nous après son doctorat, nous coupâmes
des échantillons d'ADN de cellules de
l'oviducte et de globules rouges avec les
enzymes EcoRI ou HindIII.
En nous fondant sur les résultats
antérieurs obtenus avec l'ADN complé-
mentaire qui n'est pas coupé par EcoRI
ou HindIII, nous pensions que, parmi les

4. LA TECHNIQUE DE SOUTHERNa mis en évidencela stucture mor- l'ARN messager de l'ovalbumine (en haut à gauche), composé de
celéedu gène de l'ovalbumine. Après coupure de l'ADN de la poule 1 872 nucléotides Selon nous, l'autoradiographie devait révéler une
par l'enzyme de restriction EcoRI (en bas à gauche), les quelque seule bande noire correspondant à un seul fragment hybridé :
500 000fragments sont séparés par électrophorèse selon leur taille puisque l'enzyme EcoRI ne coupe pas l'ADN complémentaire de l'ARN
(entre 1000 et 15 000paires de bases) : plus les fragments sont petits, messagerde l'ovalbumine, elle ne devait pasnon plus couper le gène.
plus ils migrent rapidementa travers le gel vers l'électrode positive. Nous avons pourtant observéquatre bandes noires (Eco a-d), que
Les fragments sont ensuite dénaturéssur place et transféréssur un l'ADN provienne de globules rouges (colonnes 1 et 2) ou de cellules
papier filtre. Puis les séquences spécifiques du gène de l'ovalbumine d'oviducte (colonnes 3 et 4). La longueur des quatres fragments
sont recherchéesà l'aide d'une sonde : l'ADN complémentaire de EcoRI du gène del'ovalbumine est indiquée enpaires de bases.
milliers de fragments obtenus, certains
devaient contenir le gène de l'ovalbu-
mine resté intact ; il nous aurait alors suf-
fit de l'identifier à l'aide de l'ADN com-
plémentaire cloné utilisé comme sonde.
Nous soumîmes les fragments EcoRI ou
HindIII d'ADN chromosomique à une
électrophorèse sur gel d'agarose, procédé
qui permet de séparer les fragments
d'ADN selon leur taille. L'ADN révélé par
un colorant fluorescent après l'électro-
phorèse s'étalait d'une façon continue sur
presque toute la longueur du gel ; bien
que les fragments se soient répartis selon
leur taille, celle-ci variait si continûment
qu'il était impossible de les séparer en
groupes distincts de fragments de même
longueur. Comment retrouver le gène de
l'ovalbumine dans cet étalement ?
L'observation du
morcèlement des gènes
Leproblème fut résolu en utilisant la
technique de fixation sur papier filtre
(blotting) élaborée par E. Southern de
l'Université d'Edimbourg. Cette tech-
nique consiste à dénaturer les fragments
d'ADN in situ dans le gel, à les transférer
sur du papier filtre et à les fixer sur celui-
ci. Puis on sonde les fragments d'ADN par
l'ADN complémentaire de l'ovalbumine
fortement marqué par un isotope radioac-
tif. L'autoradiographie révèle la localisa-
tion de la sonde radioactive, et ainsi, tout
ADN chromosomique spécifique de
l'ovalbumine avec lequel la molécule
sonde s'est hybridée.
Ainsi que je l'ai déjà dit, aucune des
deux enzymes EcoRI et Hindlll n'avait
coupé l'ADN complémentaire de l'ovalbu-
mine ; nous nous attendions donc à ce
que l'analyse par fixation sur papier filtre
des fragments chromosomiques obtenus
grâce à ces enzymes révèle une seule
bande radioactive correspondant au frag-
ment du génome contenant le gène com-
plet de l'ovalbumine. À notre grande sur-
prise, nous avons observé plusieurs
bandes radioactives, que les coupures
aient été réalisées par EcoRI ou HindIII.
Par ailleurs, la disposition de ces bandes
était la même, que les fragments chromo-
somiques proviennent de cellules d'ovi-
ducte ou de globules rouges.
Lorsque nous rapportâmes ces obser-
vations lors d'une réunion de
l'Organisation européenne de biologie
moléculaire, au printemps 1977, aucun
d'entre nous, ni personne d'autre
d'ailleurs, ne pensait que la multiplicité
des bandes signifiât la possibilité que le
gène de l'ovalbumine put être fragmenté
dans le génome de poule. La suggestion
la plus fréquente était qu'il s'agissait
d'un artefact survenant lors de la fixation
au papier filtre ou lors de l'hybridation.
Quelques mois plus tard, au cours d'un
symposium à Cold Spring Harbor dans
l'état de New York, il fut rapporté que
dans certaines molécules d'ADN viral, les
séquences de l'ADN codant un segment
non traduit situés au début de certaines
molécules d'ARN messager étaient sépa-
rées des séquences codant la partie prin-
cipale du messager. Cette découverte
nous encouragea à penser que nos résul-
tats concernant l'ovalbumine, loin d'être
des artefacts, pouvaient refléter une struc-
ture inattendue du gène de l'ovalbumine.
R. Breathnach, Jean-Louis Mandel et
moi-même avons alors établi une carte
d'enzyme de restriction du gène de
l'ovalbumine dans le génome de poule.
Nous avons analysé l'ADN chromoso-
mique en utilisant d'autres enzymes de
restriction, qui avaient des sites cibles
dans l'ADN complémentaire de l'ARN
messager. Nous pûmes alors relier un à
un les sites correspondants dans les deux
ADN. De cette façon, nous trouvâmes par
exemple que le fragment chromosomique
EcoRI que nous avions appelé b, com-
prend les séquences codant les 500 pre-
miers nucléotides de l'ARN messager,
alors que la séquence codant la fin de la
molécule messagère est située dans le
fragment a. Nous poursuivîmes ainsi
l'établissement de la carte détaillée du
gène tel qu'il existe dans le génome de
poule et nous la comparâmes avec la
carte de l'ADN complémentaire, qui
reflète la structure de l'ARN messager.
À la fin de l'été, il était devenu évi-
dent que les séquences d'ADN qui codent
l'ARN messager de l'ovalbumine dans le
génome de poule sont interrompues par
d'autres séquences d'ADN qui ne sont
absolument pas représentées dans cet ARN
messager.
Cette conclusion était d'autant plus
frappante qu'en contraste avec les pre-
miers rapports concernant des ADN
viraux, certaines interruptions se situaient
au milieu de séquencesd'ADN codant des
segments d'ARN messager traduit en pro-
téine. En d'autres termes, des séquences
du gène codant la protéine elle-même
apparaissaient discontinues. À peu près
au même moment, des équipes dirigées
par R. Flavell à l'Université d'Amsterdam,
et par Philip Leder, de l'Institut National
de la Santé de l'Enfant et du Dévelop-
pement Humain, aux États-Unis, abouti-
rent à la conclusion que chez le lapin et
chez la souris, les séquencescodant l'ARN
messager dans le gène de bêta globine
(un composant de la molécule d'hémo-
globine) sont interrompues de la même
façon. Susumu Tonegawa de l'Institut
d'immunologie de Bâle constata un phé-
nomène d'interruption génique analogue
dans certains gènes des immunoglobu-
lines (anticorps). Enfin, N. Carey des
Laboratoires de recherche Searle en
Angleterre et ses collègues rapportèrent
indépendamment des résultats suggérant
que le gène de l'ovalbumine pouvait être
interrompu. Dès lors, il apparaissait que
l'organisation morcelée des protéines
n'était pas exceptionnelle dans les
génomes eucaryotes.
Les introns les
et exons
Le pouvoir résolutif de la carte
d'enzyme de restriction, obtenue grâce à
la méthode de Southern, est trop faible
pour révéler l'organisation complète d'un
gène en mosaïque. Pour réaliser une ana-
lyse plus précise du gène chromosomique
de l'ovalbumine, il fallait l'isoler, ce qui
était devenu possible grâce à l'améliora-
tion des techniques de clonage molécu-
laire. En collaboration avec Philippe
Kourilsky, de l'Institut Pasteur, et ses
collègues, nous décidâmes de cloner les
fragments EcoRI de l'ADN de poule dans
le phage lambda ; un autre clonage fut
réalisé en parallèle à partir d'une
«banque» du génome de poule (c'est-à-
dire une collection de recombinants avec
le phage lambda contenant des fragments
représentant la totalité du génome de
poule) préparée par Jerry Dodgson de
l'Institut de Technologie de Californie,
Judith Strommer de l'Université de
Californie à Los Angeles, et James Engel
de l'Université Northwestern. En utili-
sant l'ADN complémentaire de l'ovalbu-
mine comme sonde moléculaire, on
obtint plusieurs clones, contenant soit le
gène complet de l'ovalbumine, soit cer-
tains de ses fragments EcoRI. Frank
Gannon, Jean-Paul le Pennec, M. Cochet
et Fabienne Perrin dénaturèrent l'ADN
recombinant contenant le gène complet
de l'ovalbumine ; ils le mélangèrent
ensuite au messager purifié de l'ovalbu-
mine dans des conditions qui facilitent
l'hybridation de l'ADN avec l'ARN, tout en
empêchant la réhybridation des deux
brins de l'ADN.
Les photographies de ces hybrides,
en microscopie électronique, révélèrent
de façon saisissante l'organisation des
gènes en mosaïque (voir la figure 1).
L'ADN du gène de l'ovalbumine
s'hybride seulement partiellement avec
l'ARN messager de l'ovalbumine. Sept
régions non hybridées de l'ADN se distin-
guent de la région hybride ADN-ARNen
formant des boucles car elles ne trouvent étaient également en excellent accord
pas de séquencescomplémentaires d'ARN avec la séquence du messager de l'oval-
avec lesquelles s'hybrider. Ces sept bumine établie indépendamment par Bert
boucles représentent donc sept séquences O'Malley de l'Ecole de médecine de
d'ADN qui interrompent l'ADN codant Baylor et George Brownlee, du
l'ARN messager de l'ovalbumine. Ces Laboratoire de biologie moléculaire du
séquences intercalaires, sans contre-par- conseil de la recherche scientifique en
tie dans l'ARN messager, sont appelées Angleterre ; cela montre que le clonage
des « introns » et ils fragmentent l'ADN moléculaire introduit peu, voire aucune
codant l'ARN messager en huit morceaux, erreur dans la séquencenucléotidique.
appelés « exons ».
Un intron d'une longueur inférieure à Le gène en mosaïque : lée du gène de l'ovalbumine, nous nous
une cinquantaine de paires de bases un concept général
n'aurait pas été détecté par l'examen des
molécules hybrides au microscope élec- Cristophe Benoist, Kevin O'Hare et
tronique. Pour s'assurer qu'il n'y avait R. Breathnach comparèrent ensuite la
pas d'interruptions supplémentaires dans séquence de l'ARN messager de l'ovalbu-
le gène de l'ovalbumine, il fallait compa- mine aux séquences d'ADN de tous les
rer la séquence nucléotidique complète exons de l'ovalbumine. Ils constatèrent
des exons avec celle de l'ARN messager que le premier nucléotide du messager
de l'ovalbumine. À l'aide de la méthode est codé à l'extrémité 5'du premier exon
d'Allan Maxam et de Walter Gilbert de (L) et que le dernier nucléotide du messa-
l'Université Harvard, nous avons ger est codé à l'extrémité 3'du dernier
séquencé l'ADN cloné complémentaire de exon (numéro 7). Ils ne trouvèrent
l'ARN messager de l'ovalbumine et nous aucune autre interruption dans aucun des
avons ainsi établi la séquence complète huit exons.
du messager de l'ovalbumine. Les Ces observations montraient que,
codons (les enchaînements de trois bases chez la poule, le gène de l'ovalbumine
consécutives) de cet ARN se révélèrent (c'est-à-dire la région de l'ADN renfer-
coder une chaîne d'acides aminés iden- mant toutes les séquences codant l'ARN
tique à la séquence d'acides aminés éta- messager de l'ovalbumine) se compose
blie pour l'ovalbumine par des cher- de huit exons, séparés les uns des autres
cheurs qui avaient séquencé directement par sept introns qui n'ont pas de contre-
la protéine, ce qui est beaucoup plus partie dans l'ARN messager. L'étude de la
laborieux. (Cette concordance souligne séquence a confirmé que l'ordre des
par ailleurs que lorsqu'un gène de struc- exons dans l'ADN est le même que celui
ture peut être cloné, le séquençagede son de leurs produits de transcription (trans-
ADNconstitue une méthode de choix pour crits) dans l'ARN messager (et par consé-
déterminer la séquence des acides aminés quent des acides aminés qu'ils codent ;
de la protéine qu'il code.) Nos résultats de ce point de vue, la colinéarité, bien
5. LA CARTED'ENZYMEDE RESTRICTION de l'ADN complémentaire fabriqué à partir de
l'ARN messager de l'albumine (en haut) est comparée à celle du gène correspondant
dans l'ADN chromosomique de poule (en bas). L'enzyme EcoRI coupe cette version
allélique du gène en troisfragments (a, b, c) mais elle ne scinde pas l'ADN complémen-
taire, ce qui indique que les séquences codant l'ARN messager doivent etre séparées
dans le gène chromosomique. Cette discontinuité est confirmée par l'absence de site
HindIII dans l'ADN complémentaire et par comparaison de l'emplacement des sites
correspondants (lignes en pointillé) dans les deux cartes.
qu'interrompue, est maintenue). La lon-
gueur totale du gène de l'ovalbumine, de
la région codant l'extrémité 5'de l'ARN
jusqu'à la région codant son extrémité 3',
se compose d'environ 7 700 paires de
bases. Cette longueur équivaut à quatre
fois celle de l'ARN messager final (1 872
paires de bases) et presque sept fois la
longueur du segment de messager traduit
en protéines (1 158 paires de bases).
Ayant découvert la structure morce-
sommes demandé si elle n'était pas
modifiée au cours de la différenciation
des cellules de l'oviducte, objet initial de
nos travaux. F. Gannon, F. Perrin et Jean-
Marc Jeltsch comparèrent le gène de
l'ovalbumine cloné à partir de l'ADN de
globules rouges de poule. Ils ne trouvè-
rent aucune indication de réarrangement
significatif du gène au cours de la diffé-
renciation, même au niveau le plus fin,
celui de la séquence de l'ADN. Ces résul-
tats sont en accord avec ceux obtenus
dans d'autres laboratoires pour d'autres
gènes exprimés dans des cellules haute-
ment spécialisées, comme ceux codant
les globines ou une protéine du ver à
soie, la fibroïne de la soie. S. Tonegawa,
P. Leder et d'autres chercheurs ont
cependant montré, de façon indubitable,
que les gènes en mosaïque des immuno-
globulines sont en fait réarrangées au
cours de la différenciation des lympho-
cytes (cellules du sang dans lesquelles ils
sont exprimés) et que ces réarrangements
jouent un rôle déterminant dans la diver-
sité infinie qui caractérise les immuno-
globulines.
La plupart des gènes codant des pro-
téines et analysés jusqu'à présent chez les
mammifères, les oiseaux et les amphi-
biens, possèdent une structure en
mosaïque. (Parmi les exceptions figurent
les gènes des histones, des protéines
étroitement associées à l'ADN dans les
chromosomes, et ceux des interférons.)
On a trouvé quelques gènes en mosaïque
chez les insectes et chez certains euca-
ryotes inférieurs comme les levures, mais
la fragmentation génique semble être
beaucoup plus fréquente chez les orga-
nismes supérieurs. Certains ont suggéré
que la structure en mosaïque pouvait être
propre aux gènes codant des protéines
synthétisées seulement dans les cellules
hautement spécialisées.
Pour des raisons essentiellement
techniques, ces gènes furent les premiers
à être analysés, mais on a montré depuis
que certains gènes «de ménage»-ceux
nécessairesà la vie quotidienne de la cel-
lule-sont également morcelés. En géné-
ral, les introns des gènes en mosaïque
 sont plus longs que les exons. Aucune
règle ne semble fixer de limite supérieure
à la longueur de l'intron ou au nombre
d'introns compatible avec une longueur
donnée de l'ARN messager.
On a découvert des introns d'une lon-
gueur de plusieurs milliers de paires de
bases ; nous avons dénombré 16 introns
dans le gène de la protéine ovotransfer-
rine de la poule, et Robert Schimke, de
l'Université Stanford, a rapporté que la
longueur d'un certain gène de la souris
est plus de 20 fois supérieure à celle de
son messager.
L'organisation des gènes en
mosaïque ne se limite pas aux gènes
codant les protéines. En réalité, elle a
d'abord été découverte par David
Hogness de l'École de médecine de
l'Université Stanford, dans les gènes
codant l'ARN ribosomique de la mouche
du vinaigre ou Drosophile. (L'ARN ribo-
somique est un composant du ribosome,
organite cellulaire sur lequel l'ARN mes-
sager est traduit en protéine.) Certains 6. L'ARN MESSAGER «MATURE»est obtenu après plusieurs étapes. Le gène de l'ovalbu-
gènes d'ARN de transfert, une troisième mine est d'abord transcrit en un ARN précurseur, le «transcrit» primaire. Ce transcrit
sorte d'ARN qui participe aussi à la tra- est «chapeauté» à l'extrémité 5' et une queue de poly-A est ajoutée à l'extrémité 3'. Les
duction, sont également discontinus mais transcrits d'exons adjacents sont ligaturés au cours d'une série d'étapes d'épissage ; on
leurs introns sont très petits. a représenté ici un intermédiaire dont cinq transcrits d'introns sur sept ont été éliminés.
Comment un ARNmessager unique et
continu est-il engendré à partir d'un gène
en mosaïque ? On pouvait imaginer plu-
sieurs mécanismes.

L'épissage : la structure
codante rétablie

La présence, à l'intérieur du noyau,

de molécules d'ARN plus longues que
leurs contreparties d'ARN messager cyto-
plasmique suggérait que l'enzyme ARN
polymérase fabrique d'abord un transcrit
primaire, continu, colinéaire du gène
complet, introns compris ; les transcrits
d'introns seraient ensuite excisés de cet
ARN précurseur, et les transcrits d'exons
ligaturés pour former l'ARN messager
définitif. L'existence d'un tel mécanisme,
appelé épissage de l'ARN (ou excision-
encollage, splicing en anglais) a d'abord
été étayée par l'analyse des transcrits pri-
maires du gène de la bêta globine de sou-
ris et de certains gènes des adénovirus
qui empruntent la machinerie de la cel-
lule hôte pour leur propre transcription.
En fait, il est très vraisemblable que le
mécanisme est le même pour tous les
7. UN INTERMÉDIAIRE D'ÉPISSAGE est agrandi 180 000 fois dans cette photographie de
gènes en mosaïque codant des protéines.
microscopie électronique. Cet hybride est formé d'un brin de l'ADN du gène cloné de
En ce qui concerne le transcrit pri-
l'ovalbumine (en noir) et d'une molécule d'ARN partiellement épissée (en couleur). Les
maire du gènede l'ovalbumine, on s'atten- boucles B, C, D et G sont des segments simple brin du gène, correspondant aux quatre
dait à ce que sa longueur soit d'environ 7 introns dont les transcrits ont été éliminés par épissagepartiel de l'ARN ; les segments
700 nucléotides, longueur totale des exons plus épais correspondent à l'hybridation de l'ADN aux transcrits d'exons et aux trans-
et des introns. B. O'Malley, ses collabora- crits des introns E et F non encore excisés. (Aucune boucle correspondant à l'intron A
teurs et nous-mêmesavons trouvé de telles excisé n'est visible, car l'hydration entre les segments L, très courts, est instable).
 molécules d'ARN (mais aucune plus
longue) dans le noyau : ainsi, le gène de
l'ovalbumine et son transcrit primaire sont
superposables. Nous avons également
observé, dans le noyau, nombre de molé-
cules d'ARN présentant des longueurs dif-
férentes, intermédiaires entre la longueur
du transcrit primaire et celle de l'ARN
messager final ; ceci suggère que l'épis-
sage se fait par étapes, chaque étape
engendrant progressivement des intermé-
diaires plus courts.
Nous avons examiné la structure de
ces intermédiaires du processus d'épis-
sage en hybridant l'ARN nucléaire avec le
gène cloné de l'ovalbumine. Dans une
photographie en microscopie électro-
nique prise à titre d'exemple (voir la
figure 7), la molécule intermédiaire appa-
raît nettement comme un ARN dont les
transcrits des introns A, B, C, D, et G ont
été éliminés, alors que ceux des introns E
et F sont encore présents. Par ailleurs, il
semble que l'épissage ne se produise
qu'après la modification du transcrit pri-
maire par addition d'un « chapeaux de
guanine méthylée à l'extrémité 5'et
d'une queue de nucléotides adényliques
(poly-A) à l'extrémité 3' ; ces modifica-
tions sont caractéristiques des molécules
d'ARN messager. Tous ces événements
semblent se dérouler exclusivement dans
le noyau et on ne trouve dans le cyto-
plasme ni le transcrit primaire, ni les
molécules de longueur intermédiaire.
Quelle est la nature de la machinerie
enzymatique responsable de l'épissage ?
II doit y avoir au moins une enzyme
capable de reconnaître les sites à couper.
La reconnaissance de ces sites doit être
très précise, car l'absence même d'un
seul nucléotide dans l'ARN messager final
lui ferait perdre son sens en décalant le
« cadrede lecture » et en changeant ainsi
la nature des codons. Supposant que
l'enzyme d'épissage reconnaissait cer-
taines séquences de bases situées aux
jonctions entre introns et exons, nous
avons comparé cesjonctions dans le gène
de l'ovalbumine, et nous avons trouvé
plusieurs ressemblances frappantes.
Chaque transcrit d'intron commence par
une séquenceGU (GT dans le brin d'ADN
correspondant) et se termine avec le
dinucléotide AG. Cette caractéristique est
valable non seulement pour l'ovalbu-
mine, mais également pour les 90 jonc-
tions exon-intron dont les séquences ont
été établies jusqu'ici dans des gènes
d'eucaryotes. D'autres séquences
« consensus » sont parfois présentes à
proximité des jonctions.
Les diverses fonctions
de l'épissage
J'ai déjà signalé que dans le cas du
gène de l'ovalbumine et dans celui
d'autres gènes, il n'y a aucune indication
suggérant que l'organisation en mosaïque
joue un rôle dans la différenciation, en
participant à des réarrangements
géniques, alors que de tels réarrange-
ments existent dans le cas des gènes des
immunoglobulines.

8. UN CROSSING-OVER INÉGAL peut engendrer des gènes morce-
lés par duplication génique. Le crossing-over est un processus
au cours duquel des segments d'ADN chromosomique sont
échangés entre deux chromatides d'une paire de chromosomes
lorsqu'ils sont réunis au stade de la méiose (maturation des cel-
lules reproductrices). Une duplication «discrète» (a) peut
engendrer deux gènes morcelés à partir d'un gène ancestral lui-
même morcelé et qui possède ici deux exons (1, 2) : un cros-
sing-over inégal survenant entre des séquences mal alignées à
l'extérieur du gène ancestral, conduit à un chromosome conte-
nant les gènes dupliqués et à un chromosome n'en contenant
aucun. Un gène morcelé formé de deux exons et d'un intron
peut être engendré (b) à partir d'un gène ancestral non inter-
rompu : un crossing-over inégal provoque d'abord la duplica-
tion du gène (1), puis les unités de transcription des deux gènes
dupliqués fusionnent (2) ; pour cela, des mutations doivent éli-
miner deux signaux de démarrage (AUG) et de terminaison
(UAA) de la traduction et engendrer les séquences consensus
d'épissage (GT et AG). Un gène morcelé possédant six exons et
cinq introns peut être engendré (c) par crossing-over inégal
entre les introns mal alignés d'un gène ancestral morcelé possé-
dant quatre exons (1-4) et trois introns (A-C) : les signaux
d'épissage sont déjà présents aux extrémités de tous les exons
du nouveau gène allongé.
 De quelles autres façons la présence
d'introns pourrait-elle intervenir dans la
régulation de l'expression génétique ? En
raison de la généralité de la règle GU-
AG, il semble improbable que l'expres-
sion d'un gène soit contrôlée par la pré-
sence ou l'absence d'une enzyme
d'épissage appropriée. Il est toutefois
possible que la machinerie d'épissage
soit plus complexe qu'elle n'en a l'air ; il
pourrait éventuellement exister une seule
enzyme d'épissage de base commune à
toutes les cellules et à toutes les espèces,
mais qui pourrait s'associer à un élément
complémentaire plus spécifique-une
protéine ou un petit ARN épisseur-qui
modifierait sélectivement la fréquence de
l'épissage. La purification du complexe
enzymatique responsable de l'épissage
sera nécessaire pour explorer plus avant
de telles possibilités.
En réalité, l'épissage semble faire
plus que la simple excision des transcrits
d'introns ; il se pourrait qu'il soit néces-
saire à la stabilisation de l'ARN et à son
transfert du noyau vers le cytoplasme.
Plusieurs équipes de recherche améri-
caines ont montré qu'il ne se forme pas
d'ARN messager stable lorsque l'intron
d'un gène du virus SV40 de singe est
exactement excisé du génome viral avant
l'infection. Cependant, il ne semble pas
que ce soit la présence de la totalité de
l'intron qui soit importante, mais seule-
ment celle des séquences aux jonctions
intron-exon et à leur voisinage.
Il apparaît donc que c'est le phéno-
mène d'épissage en tant que tel qui ait de
l'importance, plutôt que la séquencepar-
ticulière de l'intron. II se pourrait que la
machinerie de l'épissage soit située dans
la membrane nucléaire, de sorte que seuls
les ARN épissés soient transférés dans le
cytoplasme. Une sérieuse limitation de
cette hypothèse apparaît avec la constata-
tion suivante : certains gènes eucaryotes
codant des protéines ne sont pas morce-
lés. En outre, si un seul évènement
d'épissage suffisait à assurerla biogenèse
d'un ARN stable, il s'ensuivrait que la
plupart des introns n'auraient aucun rôle
dans ce processus.
Rien ne prouve que l'ARN transcrit
initialement à partir du gène de l'ovalbu-
mine ou de tout autre gène en mosaïque
étudié jusqu'ici (sauf éventuellement cer-
tains gènes d'immunoglobulines) soit
susceptible d'être épissé de différentes
façons pour produire des ARN messagers
codant différentes protéines. Cependant,
parmi les virus à ADN, il existe des cas
bien précis pour lesquels diverses pro-
téines sont codées, en partie au moins,
par une même région du génome, le
transcrit primaire étant épissé de diffé-
rentes manières. Certaines séquences
d'ARN qui sont éliminées lors de l'épis-
sage de l'un des ARN messagers, sont
conservées dans d'autres ARNmessagers ;
ainsi certaines séquences introniques
deviennent exoniques tandis que des
séquences exoniques deviennent intro-
niques lors de la redéfinition des jonc-
tions intron-exon. F. Crick de l'Institut
Salk d'études biologiques pense qu'un tel
épissage à choix multiples concerne sur-
tout les virus qui sont à court d'ADN, tan-
dis qu'il est probablement rare pour les
gènes chromosomiques des cellules euca-
ryotes dont la teneur en ADN n'est pas
limitée. De leur côté, W. Gilbert et
S. Tonegawa ont suggéré que l'épissage,
selon des modalités de choix multiple,
présente un intérêt évolutif, car il permet
la synthèse d'un nouveau produit à partir
d'un même gène, tout en conservant celle
de l'ancienne protéine.
Se pourrait-il qu'un intron soit par-
fois un gène à l'intérieur d'un gène ?
Cette éventualité n'a jamais été rapportée
dans le cas de gènes chromosomiques.
Cependant, Piotr Slonimski du Centre de
génétique moléculaire de Gif-sur-Yvette
et ses collègues ont découvert ce qui
pourrait bien être un tel intron dans les
mitochondries (organites cellulaires pos-
sédant leur propre appareil génétique) de
levures. Certaines mutations dans un des
introns du gène mitochondrial morcelé
du cytochrome b affectent l'épissage de
l'ARN transcrit à partir du même gène. Il
paraît vraisemblable qu'avant son exci-
sion, au moins une partie de ce transcrit
d'intron fabrique de l'ARN messager
codant une petite chaîne protéique qui
joue un rôle dans l'épissage du transcrit
entier. En d'autres termes, il se peut que
certains introns participent à la régulation
de l'épissage de leur propre transcrit. Il
reste à voir s'il s'agit ou non d'une parti-
cularité de certains gènes de mitochon-
dries, qui, comme les virus, ne possèdent
qu'un stock limité d'ADN.
La création des introns
crossing-over inégal
par
Comment les gènes morcelés et le
processus d'épissage ont-ils fait leur
apparition au cours de l'Évolution ? Le
mécanisme le plus vraisemblable semble
être l'un des phénomènes de brassage des
chromosomes nommé « crossing-over
inégal». La forme habituelle de crossing-
over « égal » constitue un événement fré-
quent pendant le déroulement de la
méiose, étape de la reproduction sexuée.
Les deux représentants d'une paire de
chromosomes s'alignent, se cassent en
des points correspondants et échangent
des segments homologues (segments qui
ont la même fonction génétique et à peu
près la même séquence d'ADN). Les seg-
ments homologues se « recombinent » par
appariement complémentaire des bases.
Le crossing-over homologue égal brasse
les allèles (les variants d'un même gène)
et par suite favorise la diversité géné-
tique. Dans le crossing-over inégal, phé-
nomène plus rare, l'alignement des chro-
mosomes n'est pas parfait ; des segments
non homologues sont échangés et se
recombinent grâce à des processus encore
mal compris de recombinaison « illégi-
time» qui entraînent des réarrangements
plus importants du génome, en particulier
des duplications de gènes.
La plupart de ceux qui étudient
l'Évolution au niveau moléculaire pen-
sent que la duplication des gènes par
crossing-over inégal a joué un rôle impor-
tant dans cette Évolution. Ils suggèrent
que la plupart des gènes actuels ont été
engendrés par duplications successives à
partir de quelques gènes ancestraux, de
sorte que la plupart des protéines
actuelles descendraient de quelques pro-
téines primordiales. Une duplication « dis-
crète » intergénique produira deux gènes
séparés mais identiques. Des mutations
dans l'une des copies pourront engendrer
une nouvelle protéine, alors que l'autre
copie continuera à coder la protéine ini-
tiale, augmentant ainsi le répertoire des
protéines de l'organisme. Dans la dupli-
cation-fusion, ou duplication contiguë, les
segments dupliqués correspondant à une
duplication complète ou partielle du gène
initial s'associent et produisent un gène
allongé unique qui détermine une nou-
velle protéine.
On ne peut évidemment pas affirmer
avec certitude que la plupart des gènes
morcelés actuels résultent de duplications
discrètes ou de duplications-fusions, mais
la fréquence des événements de crossing-
over inégal est suffisamment élevée pour
que cette hypothèse ne soit pas invrai-
semblable. II existe d'autres modèles de
création des introns au cours de
l'Évolution Ainsi, W. Gilbert proposé
a
qu'au moins certains gènes morcelés
aient été assembléspar brassage aléatoire
d'exons initialement dispersés dans le
génome, chacun d'eux ayant codé une
chaîne protéique fonctionnelle.
Finalement, on ne peut exclure la possi-
bilité que les introns aient des fonctions
très différentes, encore inconnues, qui
affecteraient l'organisation et l'expres-
sion de l'information génétique dans les
cellules eucaryotes.
 L'amplification
Cette méthode de synthèse
a été conçue sur une route de montagne,
par une nuit de printemps.
UNE BONNE idéesurgit
parfois quand on s'y
attend le moins ; c'est
ainsi que par une nuit
d'avril 1983, alors que
je conduisais sur une route sinueuse de
montagne, au Nord de la Californie, par
un beau clair de lune, une succession de
coïncidences, d'erreurs heureuses et de
naïveté me fit inventer une méthode qui
permet de synthétiser un nombre illimité
de copies de gènes : la méthode d'ampli-
fication de gènes (ou PCR, pour
Polymerase Chain Reaction, «réaction en
chaîne par l'ADN polymérase»).
La méthode d'amplification des
gènes synthétise jusqu'à 100 milliards de
molécules identiques à une molécule
d'ADN unique en une seule après-midi. La
réaction ne nécessite aucun appareillage
compliqué : on l'effectue dans un tube à
essai, avec quelques réactifs usuels et une
source de chaleur.
L'échantillon d'ADN que l'on copie
peut être pur, ou, au contraire, n'être que
l'un des nombreux constituants d'un
mélange complexe ; il peut provenir d'un
échantillon de tissu prélevé dans un hôpi-
tal, d'un cheveu, d'une goutte de sang
séchérecueillie sur le lieu d'un crime, du
cerveau d'une momie ou d'un mammouth
congelé depuis 40 000 ans dans un glacier.
Depuis cette nuit où j'inventai l'ampli-
fication des gènes, il y a plus de dix ans, la
méthode s'est introduite dans tous les sec-
teurs de la biologie. Pourquoi cette
méthode simple et utile n'a-t-elle pas été
inventée plus tôt ? Quand je l'ai conçue,
tous les éléments nécessairesà sa mise au
point existaient déjà depuis plus de 15 ans.
Automatisation
et chômage
La méthode d'amplification des
gènes simplifie considérablement le tra-
vail des biologistes : elle leur fournit
des
en masse de l'ADN
autant d'ADN qu'ils le souhaitent. On
croit souvent que les molécules d'ADN
sont faciles à obtenir, mais en pratique, il
est difficile-excepté pour les virus les
plus élémentaires-d'isoler des molé-
cules d'ADN intactes.
En effet, une molécule d'ADN est une
chaîne fragile, dont les maillons sont des
désoxynucléotides de quatre types, carac-
térisé par quatres bases : l'adénine (A), la
thymine (T), la cytosine ('Q et la guanine
(G) ; l'ordre de ces bases, nommé
séquence de l'ADN, code l'information
génétique. Les simples brins d'ADN
s'apparient par leurs bases complémen-
taires (A avec T, d'une part, et C avec G,
d'autre part) et ils forment des doubles
hélices (voir la figure 1).
Dans les cellules, ces doubles hélices
d'ADN sont entourées de protéines et
enroulées sur elles-mêmes. Quand les bio-
logistes tentent d'isoler les chaînes d'ADN,
longues et fines, débarrasséesde ces pro-
téines, des manipulations même délicates
les brisent en des sites quelconques, et
quand on extrait l'ADN de 1 000 cellules
identiques, on obtient 1 000 exemplaires
de chaque gène, mais tous sont dans des
fragments d'ADN différents.
Pendant de nombreuses années, cette
fragilité de l'ADN a compliqué l'étude des
gènes. Puis dans les années 1970, on
découvrit des enzymes qui coupent l'ADN
en des sites spécifiques ; ces « endonu-
cléases de restriction» ont permis de cou-
per l'ADN en petits morceaux plus faciles
à identifier. Progressivement on a appris
à isoler des segments d'ADN particuliers.
Vers la fin des années 1970, les bio-
logistes moléculaires ont beaucoup utilisé
les enzymes de restriction et d'autres
molécules, les sondes oligonucléoti-
diques, pour étudier l'ADN.
Un oligonucléotide est une courte
chaîne d'ADN composée de bases particu-
lières. Dans des conditions favorables, un
oligonucléotide se lie spécifiquement à sa
gènes
Kary Mullis
séquence complémentaire, sur un brin
d'ADN : un oligonucléotide de synthèse,
marqué radioactivement, sert de sonde,
car il révèle si une molécule d'ADN
contient une séquence nucléotidique ou
un gène particulier. En 1979, j'ai été
engagé par la Société Cetus, en
Californie, pour synthétiser de telles
sondes oligonucléotidiques.
Vers 1983, la synthèsede ces oligonu-
cléotides perdit de son attrait, au contente-
ment de la plupart des chimistes qui la
pratiquaient : une méthode automatique,
mais plaisante, supplanta l'art désuetde la
synthèse manuelle des oligonucléotides.
Ce fut un progrès considérable.
Cette petite révolution industrielle fit
chômer les chimistes spécialisés dans la
synthèse des oligonucléotides : les
machines automatiques synthétisaient
presque plus d'oligonucléotides que nous
ne pouvions en stocker ; les biologistes
moléculaires ne parvenaient pas à consom-
mer notre production. Nous eûmes beau-
coup de temps pour penser et rêvasser.
Personnellement je rêvais d'oligonu-
cléotides.
Des méthodes délicates
J'avais notamment identifié un des
handicaps des biologistes moléculaires :
ils n'avaient aucun moyen de repérer
facilement un nucléotide en un site parti-
culier d'une molécule d'ADN complexe
(comme celles du génome humain), pré-
sente en petites quantités. Pouvait-on uti-
liser l'enzyme ADN polymérase à cette
fin, en modifiant la technique du
« séquençage didésoxy »? J'avais imaginé
une expérience toute simple afin de tester
cette hypothèse.
Un brin d'ADN comporte une extré-
mité conventionnellement nommée trois
prime (3') et une extrémité cinq prime
(5'). Dans une double hélice d'ADN, les
brins complémentaires sont dits « antipa-
rallèles », car l'extrémité 3'd'un brin est
appariée à l'extrémité 5'de l'autre brin,
et inversement.
En 1955, Arthur Komberg et ses col-
lègues de l'Université Stanford découvri-
rent, dans les cellules, l'ADN polymérase,
une enzyme qui participe notamment à la
réparation et à la réplication de l'ADN. culaire du Conseil britannique de la
Cette enzyme peut allonger une courte recherche médicale ; cette technique uti-
« amorce » oligonucléotidique en ajoutant lise une ADN polymérase, des matrices,
des nucléotides supplémentaires à des amorces, des nucléotides triphos-
l'extrémité 3', à condition que l'amorce phate et des didésoxynucléotides tripos-
soit hybridée, c'est-à-dire liée à un brin phate (ddNTP) particuliers, afin de déter-
complémentaire d'ADN matrice. miner des séquences d'ADN. Comme tous
Naturellement la solution où a lieu la les nucléotides, les ddNTP sont ajoutés
réaction doit en outre contenir des molé- aux amorces par l'ADN polymérase, mais
cules de nucléotides triphosphates, qui ils ont la particularité de bloquer l'extré-
sont les «briques» ajoutées à l'amorce. mité 3', c'est-à-dire tout nouvel ajout de
Les nucléotides que l'ADN polymé- bases. La méthode de Sanger produit
rase fixe sur l'amorce sont complémen- ainsi des amorces de tailles variées, coif-
taires des bases présentes sur le brin fées par un ddNTP ; en classant ces
matrice. En ajoutant ainsi les bases les amorces en fonction de leur taille et en
unes après les autres, l'ADN polymérase déterminant leur ddNTPfinal, on peut en
peut allonger l'amorce, à partir de son déduire la séquence des bases d'une
extrémité 3', jusqu'à l'extrémité 5'de la matrice : par exemple, s'il s'agit d'une
matrice (voir la figure 2). Lors de la didésoxyadénine (ddA), la base complé-
réplication ou de la réparation d'une mentaire de la matrice est un T, une didé-
double hélice d'ADN dans une cellule, soxyguanine (ddG) correspond à C.
chaque brin sert ainsi de matrice pour la Dans la méthode que j'avais imagi-
restauration ou la synthèse du brin com- née, on devait utiliser des polymérases,
plémentaire. des ddNTP et des amorces, mais pas de
Le séquençage didésoxy est égale- nucléotides triphosphate ; ainsi les
ment appelé méthode de Sanger, du nom amorces seraient immédiatement coiffées
de l'un de ses inventeurs, Frederik par un ddNTP. Connaissant le ddNTP
Sanger, du Laboratoire de biologie molé- ajouté, on connaîtrait l'identité de la base
1. LES GÈNESSONTDESFRAGMENTS D'ADN, longue molécule for- séparéset des enzymesreconstituent la double hélice en puisant les
mie de deux brins appariés par leurs basescomplémentaires Dans compléments de chaque base dans la solution. Ainsi, le nombre de
la technique d'amplification de gènes, les deux brins d'ADN sont fragments d'ADN double à chaque étape.
correspondante sur la matrice, et on en
déduirait l'identité de la base de la
matrice adjacente au site de fixation de
l'amorce.
Malheureusement j'ignorais que ma
méthode ne pouvait fonctionner pour plu-
sieurs raisons. Notamment les oligonu-
cléotides s'hybrident parfois avec des
séquences d'ADN différentes de celles
dont ils sont complémentaires ; ces appa-
riements inévitables auraient empêché
toute interprétation valable des résultats.
Même les plus expérimentés dans l'art de
l'hybridation moléculaire n'auraient pu
lier des oligonucléotides à un ADN
humain complet avec une spécificité suf-
fisante pour que la méthode ait un sens.
Cette difficulté avait précisément
contraint les chercheurs à utiliser des
méthodes plus complexes pour étudier
l'ADN humain. Par exemple, on coupait
des échantillons d'ADN à l'aide
d'enzymes de restriction, puis on séparait
les fragments par électrophorèse avant
d'hybrider l'échantillon avec les sondes
oligonucléotidiques ; on débarrassait ainsi
partiellement l'échantillon des fragments
d'ADN qui n'étaient pas l'ADN cible.
 De cette façon, on réduisait le nombre
d'hybridations erronées et l'on obtenait
des donnéesplus précises,mais la méthode
restait délicate, fastidieuse, et elle n'aurait
donné aucun résultat sur des échantillons
d'ADN dénaturésou dégradés.
Une autre technique, bien trop com-
plexe pour des études de routine, reposait
sur un clonage d'ADN : on intégrait une
séquenced'ADN humain intéressante dans
un petit anneau d'ADN appelé plasmide,
et on faisait synthétiser par une bactérie
des copies de ce plasmide et de la
séquencecible ; puis on déterminait cette
dernière par hybridation oligonucléoti-
dique et séquençagedidésoxy. Au début
des années 1980, le séquençagedidésoxy
d'ADN cloné était la méthode avec
laquelle la plupart des informations sur
l'ADN humain avaient été obtenues.
En proposant ma méthode naïve,
j'oubliais que les segments d'ADN spéci-
fiques doivent être clonés ou préparés
pour qu'une hybridation oligonucléoti-
dique en révèle la séquence. A ma
décharge, je n'étais pas le seul à faire
fausse route : un groupe dirigé par Henry
Erlich, l'un des principaux chercheurs des
Laboratoires Cetus, étudiait une méthode
fondée sur l'hybridation d'un oligonucléo-
tide unique avec un ADN humain cible.
Personne ne se moquait de H. Erlich, et la
société nous rémunérait régulièrement ; en
fait, nous étions même si bien payés que
certains d'entre nous se croyaient à la
pointe de la biologie moléculaire.
Les rêves
d'un biochimiste

Le vendredi soir où j'inventai la PCR,

je roulais vers la région de Mendocino
avec une amie chimiste. Elle s'était
endormie, et la route était dégagée.
J'aime rouler de nuit et, chaque week-
end, je partais dans ma maison de cam-
pagne ; pendant trois heures de route,
j'étais tranquille, les mains occupées, la
tête libre. Cette nuit-là je pensais à mon
expérience de séquençagede l'ADN.
Mon programme était clair : d'abord
je sépareraisles deux brins de l'ADN cible
en chauffant ce dernier ; puis j'hybride-
rais un oligonucléotide à une séquence
complémentaire présente sur l'un des
brins ; je répartirais ce mélange dans
quatre tubes différents, qui contiendraient
les quatre types de ddNTP, dont un seul
serait marqué radioactivement dans
chaque tube. Puis j'ajouterais l'ADN poly-
mérase, qui fixerait un seul ddNTPà l'oli-
gonucléotide lié à l'ADN cible. Par électro-
phorèse, je séparerais les oligonucléotides
«allongés» des ddNTP résiduels et, en
identifiant le ddNTPmarqué fixé sur l'oti-
gonucléotide, je déterminerais la base
complémentaire sur le brin cible. Facile !
Aux environs de Cloverdale, à
l'endroit où la route tourne dans les hau-
teurs du bord de mer, je décidai que la
séquence serait déterminée avec plus de
précision si j'utilisais deux oligonucléo-
tides au lieu d'un seul. Les deux amorces
encadreraient la paire de base que j'espé-
rais identifier. En choisissant des oligo-
nucléotides de diverses tailles, je les dis-
tinguerais aisément les uns des autres. Je
ferais en sorte qu'un oligonucléotide se
fixe sur chacun des deux brins de l'ADN
et j'obtiendrais ainsi deux déterminations
de la paire de bases cible, lesquelles
devraient donner des résultats concor-
dants (voir la figure 3).
J'étais obnubilé par ces deux oligonu-
cléotides dont les extrémités 3', fixées
2. L'ADN POLYMÉRASEest une enzyme qui peut allonger un court brin d'ADN, appelé
les deux brins du gène cible, se fai-
amorce oligonucléotidique, quand il est lié à une «matrice» d'ADN plus longue, à partir de sur
l'extrémité 3' de l'amorce. L'ADN polymérase ajoute les nucléotides complémentaires à ceux saient face ; je n'avais pas conscience
de la matrice. Quand la solution contenant les réactifs renferme un didésoxynucléotide tri- d'être au bord de l'invention de la PCR.Je
phosphate (ddNTP), comme la didésoxyadénine (ddA), par exemple, l'allongement de ne voyais que le bord du précipice qui
l'amorce cesse,car l'extrémité 3'du ddA ne peut fixer d'autres nucléotides. longeait la route.
Eurêka ! ticiper à la réaction catalysée par l'ADN
Cette nuit-là, l'air, très humide, était
saturé du parfum des marronniers rouges
en fleur. Des tiges blanches s'envolaient
des bas-côtés éclairés par la lumière des
phares. Je pensais aux nouveaux bassins
que je devais creuser dans ma propriété,
tout en envisageant les difficultés que je
rencontrerais dans mon expérience de
séquençage.
Lors de mon séjour dans le labora-
toire de Wolfgang Sadee, à l'Université
de San Francisco, où John Maybaum
mettait au point des essais cliniques avec
des nucléotides, j'avais appris que les
échantillons d'ADN contenaient parfois
des traces de nucléotides triphosphate
isolés qui compliqueraient l'interpréta-
tion de l'expérience s'ils s'ajoutaient à
l'extrémité 3'des amorces avant les
ddNTPmarqués.
J'imaginais alors de détruire d'abord
les nucléotides triphosphate isolés avec
une enzyme bactérienne, la phosphatase
alcaline, qui empêche les groupes phos-
phate des nucléotides triphosphate de par-
polymérase. Comment éliminer ensuite la
phosphatase de l'échantillon ? Elle ris-
quait en effet de dégrader également les
ddNTPque j'ajouterais. Théoriquement on
peut inactiver des enzymes en les chauf-
fant, ce qui modifie leur forme. Cependant
je craignais que la phosphatase alcaline
bactérienne ne reprenne ultérieurement sa
forme fonctionnelle, et je conclus que la
phosphatasealcaline ne convenait pas.
En fait, je me trompais : bien après,
j'appris que la phosphatase alcaline est
irréversiblement dénaturée par la chaleur,
quand elle n'est pas en contact avec du
zinc. Mon erreur fut extraordinairement
heureuse : si j'avais mieux connu les pro-
priétés de la phosphatase alcaline, j'aurais
cessé de chercher d'autres solutions.
Chaque kilomètre que je parcourais
m'apportait une nouvelle idée, mais je les
rejetais toutes. Puis, quand je commençai
à descendre vers la vallée Anderson, j'eus
une idée qui satisfaisait mes goûts pour
l'esthétique et l'économie : j'utiliserais
deux fois la même enzyme, l'ADN poly-
mérase ; la première fois, elle éliminerait
les nucléotides triphosphate en excès dans
la solution et, la seconde fois, elle ajoute-
rait les ddNTPmarqués aux amorces.
Je pensais alors que si l'échantillon
contenait assez de nucléotides pour gêner
l'expérience, il y en aurait également
assez pour que l'ADN polymérase agisse :
au cours d'une réaction préliminaire, en
présence des amorces oligonucléoti-
diques et d'ADN polymérase, mais sans
ddNTP, l'enzyme attacherait les nucléo-
tides libres aux oligonucléotides et élimi-
nerait ainsi les nucléotides parasites ;
puis, en chauffant la solution, je sépare-
rais les oligonucléotides ainsi formés de
l'ADN cible. Evidemment les oligonucléo-
tides resteraient dans la solution, mais
comme il y aurait beaucoup plus
d'amorces intactes que d'amorces allon-
gées, les ADN cibles s'hybrideraient plus
probablement avec les amorces intactes,
lors du refroidissement. J'ajouterais alors
les ddNTP et de l'ADN polymérase afin
d'effectuer le séquençageproprement dit.
Tout n'était cependant pas résolu : les
oligonucléotides allongés lors de la réac-
tion préliminaire perturberaient-ils la réac-

3. LE SÉQUENÇAGE DIDÉSOXYest une méthode que l'auteur vou- une seule base se serait ajoutée à l'extrémité 3'de chaque amorce
lait adapter pour identifier une paire de baseparticulière, dans un et aurait révélé la nature de la base complémentaire. Cette méthode
segmentd'ADN. Après séparation des deux brins de l'ADN, il envisa- aurait donné le même résultat avec une seule amorce, mais l'utili-
geait de lier deux amorces aux brins opposés, de partet d'autre de sation de deux amorces aurait permis d'en obtenir une confirma-
fa paire de bases cible. Il aurait ensuite ajouté dans la solution de non. En mettant au point ce type de séquençage, l'auteur a décou-
l'ADN polymérase et des didésoxynucléotides triphosphate (ddNTP) : vert l'amplification de gènes.
 tion ultérieure ? Que se passerait-il s'ils
fixaient plus d'une base ou deux ? Que se
passerait-il s'ils gagnaient suffisamment
de basespour que leur séquencesoit com-
plémentaire de l'amorce opposée ? Le
séquençage ultérieur serait certainement
perturbé...
Non, au contraire ! Je compris sou-
dain que les brins d'ADN cible et les oli-
gonucléotides allongés auraient la même
séquence de bases. La réaction prélimi-
naire doublerait le nombre de brins d'ADN
cible dans l'échantillon !
Soudain je ne sentis plus le parfum
des marronniers.
Dans d'autres circonstances, je
n'aurais sans doute pas compris si rapide-
ment l'importance de cette duplication.
L'idée qu'il faudrait répéter la même pro-
cédure plusieurs fois m'aurait, peut-être
même, paru fastidieuse, mais j'avais
passébeaucoup de temps à écrire des pro-
grammes d'ordinateur et je m'étais fami-
liarisé avec les opérations d'itération, où
l'on applique plusieurs fois une opération
mathématique aux résultats de cette
même opération. Je savais ainsi que l'ité-
ration pouvait être à l'origine de crois-
sancesexponentielles et je compris que la
synthèse de l'ADN que j'avais conçue
pourrait bénéficier de cette propriété.
Stimulé par la découverte, je com-
mençai à calculer les puissancesde deux :
deux, quatre, huit, seize, trente-deux... Je
me souvenais vaguement que deux à la
puissance dix était environ égal à 1 000,
et que deux à la puissance vingt devait
être voisin de un million. J'arrêtai la voi-
ture dans un tournant qui dominait la val-
lée Anderson ; de la boîte à gants, je sor-
tis un crayon et du papier, car je voulais
vérifier mes calculs. Jennifer, ma passa-
gère endormie, maugréa contre ce retard
et contre la lumière, mais je lui dis que
j'avais découvert quelque chose d'extra-
ordinaire. Elle se rendormit tandis que je
vérifiais que deux à la puissance vingt
était égal à 1 068 576, puis je redémarrai.
Un kilomètre plus loin, je réalisai
qu'après quelques cycles d'élongation
des amorces, de dissociation des pro-
duits, de réhybridation des nouvelles
amorces et de leur élongation, la lon-
gueur des brins d'ADN formés à un
rythme exponentiel serait fixée, car leurs
extrêmités seraient précisément définies
par les extrêmités 5'des amorces oligo-
nucléotidiques. Je pourrais synthétiser
des segments plus longs de l'ADN origi-
nal, en utilisant des amorces qui s'hybri-
deraient plus loin. Les ADN formés
seraient toujours des molécules de lon-
gueur donnée.
J'arrêtai à nouveau la voiture et com-
mençai à dessiner des molécules d'ADN, à
représenter des hybridations et des élon-
gations, les produits d'un cycle devenant
les matrices de la réaction en chaîne sui-
vante. Dans son demi-sommeil, Jennifer
protesta, mais je lui répondis : « Tu n'y
croirais pas, c'est stupéfiant !» Elle
refusa de se réveiller tout à fait.
Je repris la route et ne m'arrêtai
qu'arrivé à la maison. Elle est au fond de
la vallée Anderson, à la limite de la forêt
de séquoias, qu'occupent depuis long-
temps des vagabonds, des clochards et
des bons à rien. Ma découverte me don-
nait le sentiment de détruire une vieille
tradition. J'eus le plus grand mal à
m'endormir : des bombes de désoxyribo-
nucléotides explosaient dans ma tête.

La première expérience

Au matin, j'étais épuisé et persuadé

4. L'AMPLIFICATION DE CÈNES OU PCR est une méthode très simple qui permet de reco-moindre enthousiasme. Auparavant mes
pier un segmentd'ADN en de nombreux exemplaires.
exponentiellement,ce qui permet d'en obtenir plus de 100 milliards en quelques heures.
que d'autres chercheurs avaient déjà eu la
même idée que moi : des milliers de bio-
chimistes avaient déjà allongé des oligo-
nucléotides avec de l'ADN polymérase, et
l'un d'entre eux avait certainement eu
l'idée d'une réaction en chaîne J'imagi-
nais aussi des impossibilités : si la réac-
tion avait donné des résultats, j'en aurais
certainement entendu parler, car on
l'aurait utilisée sans cesse pour multiplier
les molécules d'ADN.
De retour aux Laboratoires Cetus, le
lundi matin, je demandai à l'un des
bibliothécaires, George McGregor, de
réaliser une recherche bibliographique
sur l'ADN polymérase. Pas de trace.
Durant les semaines suivantes,
j'exposais mon idée à qui voulait
l'entendre, mais personne n'avait
connaissance d'une telle amplification
des gènes. Personne ne semblait douter
que cette technique soit envisageable,
mais personne non plus ne manifestait le
Le nombre d'exemplaires formés croît collègues avaient souvent trouvé mes
idées sur l'ADN farfelues et, de nom-
 breuses fois je m'étais rangé à leur avis,
mais là, je savais que j'avais trouvé un
résultat intéressant.
Les mois passèrent. Je préparais des
expériences pour vérifier si je parvien-
drais à amplifier des gènes : je cherchais
quelles étaient les solutions tampon
appropriées, les concentrations optimales
en réactifs, comment chauffer et refroidir
la solution, combien de temps laisser la
réaction se poursuivre... Je m'inspirais
des publications de A. Kornberg sur
l'ADN polymérase. Pour cette expérience,
je choisis une cible de 25 paires de bases
dans un plasmide et deux amorces oligo-
nucléotidiques comportant respective-
ment 11 et 13 bases.
Quand tout fut prêt, je fis une expé-
rience comme je les aime : celles où un
seul tube à essai suffit pour donner une
réponse sans ambiguïté, positive ou néga-
tive. La PCRamplifiait-elle l'ADN que
j'avais sélectionné ? La réponse fut affir-
mative.
Je quittai le laboratoire très tard, ce
soir-là, et je remarquai qu'Albert Halluin,
l'agent de brevets de Cetus, était encore
dans son bureau. J'allai le trouver et lui
dis que j'avais inventé une méthode
d'amplification des gènes : A. Halluin fut
le premier parmi les quelque 100 per-
sonnes auxquelles j'avais exposé mon
idée à la juger importante. Il voulut voir
l'autoradiogramme qui montrait les résul-
tats de l'amplification ; le film était
encore humide.
Une ADN polymérase
résistant à la chaleur
Certains biologistes se méfient des
expériences ne nécessitant qu'un seul
tube à essai, mais A. Halluin n'était pas
un sceptique : les agents de brevets n'ont-
ils pas intérêt à considérer avec respect
les inventions ? Dans son bureau, il avait
écouté calmement mes explications, les
trouvant logiques ; dans le laboratoire, il
était si enthousiasmé, qu'il me demanda
de décrire l'expérience pour déposer un
brevet. En partant, il me félicita.
Pendant les mois qui suivirent, je
continuais d'étudier et d'améliorer la
méthode, avec Fred Faloona, un mathé-
maticien jeune et brillant que j'avais ren-
contré grâce à ma fille. Fred m'aida à
réaliser la première PCR; ce fut son pre-
mier travail de biochimie, que nous
avons fêté avec quelques verres de bière.
Les mois suivants, nous avons
confirmé que la méthode amplifiait
même des fragments d'ADN plasmidique
beaucoup plus longs. Finalement, avec de
l'ADN humain donné par Henry Erlich,
5. CET APPAREIL effectue automatiquement l'amplification des gènes. On le charge avec
des échantillons d'ADN que l'on veut multiplier. Ce dispositif est devenu courant dans les
luborwoires de biologie
nous avons démontré que la méthode
pouvait amplifier un segment correspon-
dant à un gène isolé.
Aujourd'hui bien des défauts ou
insuffisances de la technique originale
ont été éliminés, et divers protocoles sont
appliqués, selon les cas. Je recommande
généralement d'effectuer les cycles entre
98 °C et 60 °C : chaque cycle dure moins
de deux minutes et, à chacun d'eux, le
nombre de molécules d'ADN cible double.
Les amorces comportent généralement 20
à 30 bases.
On a surtout amélioré la méthode
quand on a commencé à utiliser une ADN
polymérase initialement extraite de la
bactérie Thermus aquaticus, qui vit dans
les sources chaudes ; au contraire de
l'ADN polymérase que nous utilisions
dans les premières expériences, celle-ci
n'est pas détruite par la chaleur et il est
inutile d'en rajouter à chaque cycle.
L'ADN polymérase de Thermus aquaticus
est aujourd'hui produite en grandes quan-
tités par des bactéries modifiées par génie
génétique.
La PCRétait si puissante, qu'elle ne
fut pas acceptée facilement : personne
n'était prêt à admettre que l'ADN puisse
être produit en quantité illimitée. La réac-
tion ne semblait évidente qu'à Fred et à
moi : c'était notre jouet. 11fallait laisser
aux autres le temps de s'y accoutumer.
Au printemps 1984, alors que je pré-
parai le brevet, je présentai la PCRsur un
panneau, lors des journées scientifiques
de la Société Cetus. Ces rencontres
annuelles sont toujours passionnantes,
car Cetus travaille avec quelques
conseillers scientifiques de tout premier
ordre, et je me demandais ce qu'ils pen-
seraient de mon invention.
Personne ne sembla s'intéresser à
mon panneau, et l'anxiété me gagna.
Enfin je vis arriver Josuah Lederberg, le
président de l'Université Rockefeller : il
s'arrêta, regarda longuement mes résul-
tats, puis il tourna vers moi sa tête
énorme, celle d'un lauréat du prix Nobel,
qui avait trouvé en 1946 que les bactéries
présentaient une forme de reproduction
sexuée : « Est-ce que ça marche ?»
demanda-t-il amusé.
Flatté, je confirmai que la méthode
était efficace, et nous avons discuté pen-
dant un long moment. Au cours de la
conversation, il mentionna qu'il y a envi-
ron 20 ans, après la découverte de l'ADN
polymérase, A. Kornberg et lui avaient
imaginé d'utiliser cette enzyme afin de
produire de grandes quantités d'ADN.
Cependant ils n'étaient pas parvenus à
mettre une méthode au point ; je lui rap-
pelai que les oligonucléotides n'étaient
pas disponibles, à cette époque, et que les
séquences d'ADN étaient encore mal
connues.
Puis il regarda à nouveau mes résul-
tats : je pense que J. Lederberg, décou-
vrant l'extrême simplicité de la méthode
d'amplification des gènes, était la pre-
mière personne qui ressentit le sentiment
qu'éprouvent les biologistes moléculaires
quand on leur présente la PCR: « Pourquoi
n'y ai-je pas pensé ?» Et personne ne sait
pourquoi, pas même moi.
 L'extrémité
Les segments d'ADN qui coiffent
des chromosomes, les télomères,
aucun gène mais sont vitaux
leurs télomères, les chromosomes
IL Y A plus de 50 ans, alors que
l'on ignorait encore que l'ADN
des chromosomes est une
double hélice et porte les gènes,
Hermann Muller (prix Nobel de
médecine en 1946) avait compris le rôle
essentiel des segments situés aux extré-
mités des chromosomes : en coiffant les
chromosomes, ils préviennent leur dégra-
dation. Muller nomma ces extrémités les
télomères, du grec telos qui signifie «fin»
et meros, « partie ».
Pendant 40 ans, le télomère resta mys-
térieux, puis il y a environ dix ans, plu-
sieurs chercheurs découvrirent sa struc-
ture chez diverses espèces. Cependant
celle du télomère humain restait inconnue.
Cet épisode de la biologie est achevé :
il y a quelques années, avec mes col-
lègues du laboratoire de Los Alamos,
nous avons mis au point de nouveaux
outils de recherche qui nous ont permis
de cloner le télomère humain, d'identifier
la séquence de ses nucléotides (les
briques de l'ADN), et de mieux com-
prendre sa structure tridimensionnelle et
sa fonction dans les cellules.
Nous avons confirmé que le télomère,
qui ne porte aucun gène, est indispensable
à la stabilité des chromosomes. Ce résul-
tat est l'un de ceux qui nous font progres-
sivement comprendre que les régions des
chromosomes dépourvues de gènes, c'est-
à-dire qui ne codent pas de protéines
vitales, jouent un rôle souvent essentiel.
De ce fait, pour élucider le fonctionne-
ment des chromosomes et des gènes, les
biologistes devront identifier non seule-
ment les séquences d'ADN composant les
gènes, mais aussi celles des régions
dépourvues de gènes ; de surcroît, ils
devront comprendre comment les diverses
régions des chromosomes interagissent.
Le clonage du télomère humain est
une composante du Programme interna-
du chromosome
les extrémités
ne contiennent
: dépourvus de
sont dégradés.
tional de séquençage du génome humain,
qui vise à dresser une carte de tous les
gènes humains sur les chromosomes.
Comme dans un puzzle, où l'on est aidé
par la couleur des bordures, la descrip-
tion des extrémités des chromosomes
humains facilite ce travail de cartogra-
phie. La carte établie devrait révéler l'ori-
gine génétique de nombreuses maladies
et expliquer comment les chromosomes
commandent le développement des orga-
nismes et comment ils assurent le bon
fonctionnement des cellules.
Le premier télomère isolé
Quand nous avons commencé le clo-
nage du télomère humain, nous possé-
dions quelques informations sur sesfonc-
tions et sur sa structure. Les expériences
de Muller, sur la drosophile (la mouche
du vinaigre), et celles de Barbara
McClintock, réalisées à Cold Spring
Harbor, sur le maïs, avaient montré que,
contrairement aux extrémités intactes, les
extrémités chromosomiques endomma-
gées sont instables ; les extrémités cas-
sées s'associent rapidement à d'autres
chromosomes ou sont dégradées. Muller
en avait déduit que les télomères, d'une
façon ou d'une autre, permettent aux cel-
lules de conserver les chromosomes sous
forme d'entités intactes et distinctes.
De plus, les télomères empêcheraient
les raccourcissementsde chromosomes au
cours de la réplication : de telles coupures
qui élimineraient des gènes vitaux seraient
léthales, et l'étude de la machinerie de
duplication des ADN linéaires, tel l'ADN
humain, a révélé le rôle protecteur des
télomères. Les enzymes qui assurent la
réplication ont l'inconvénient d'oublier
quelques nucléotides à l'une des extrémi-
tés des nouveaux brins d'ADN qu'elles
synthétisent, et si les cellules n'avaient
Robert Moyzis
pas des protections draconiennes, les
chromosomes raccourciraient progressive-
ment à chaque division cellulaire. Un petit
raccourcissement pourrait être sansconsé-
quences pour les cellules somatiques
(celles qui ne participent pas à la repro-
duction) si tous les gènes et une partie du
télomère étaient conservés, mais un rac-
courcissement progressif aurait des consé-
quences désastreuses s'il se produisait
dans les cellules germinales (les ovules et
les spermatozoïdes) dont sont issus les
nouveaux membres de l'espèce. Puisque
l'ADN de l'Homme et des autres espèces
n'a pas raccourci, les segmentsterminaux
-les télomères-parent aux dangersenzy-
matiques qui menacent les extrémités.
Quand nous avons décidé de cloner le
télomère humain, nous avons supposé
qu'il était présent aux deux extrémités de
chaque chromosome, donc présent en
plusieurs exemplaires dans les cellules.
Toutes les cellules somatiques humaines
comptent 46 chromosomes : 22 sont héri-
tés de la mère ; 22 autres, homologues,
proviennent du père et une paire déter-
mine le sexe. Un chromosome X est
transmis par la mère, et si le père trans-
met un chromosome X, l'enfant est une
fille ; s'il transmet un chromosome Y,
c'est un garçon.
En outre, nous pensions que l'ADN
des télomères contenait plusieurs
séquences nucléotidiques identiques. En
effet, un quart environ de l'ADN humain
est composé de groupes de nucléotides
présents en plus d'un exemplaire dans
une même cellule. Certaines de ces
séquences répétées sont dispersées dans
l'ADN ; dans d'autres cas, l'ADN, avec
plusieurs séquences identiques accolées,
« bégaye ».Ces séquences répétées sont
généralement localisées dans des régions
essentielles, notamment dans le centro-
mère, qui répartit les chromosomes entre
les deux cellules filles, lors de la division
d'une cellule mère. De plus, les motifs
répétitifs ou les groupes de ces motifs
adoptent souvent une conformation tridi-
mensionnelle particulière, biologique-
ment efficace. Toutes ces observations
indiquaient que les motifs répétitifs assu-
raient des fonctions définies dans les
chromosomes, et que, peut-être, le télo-
mère devait ses propriétés protectrices à
des séquencesrépétées.
L'étude des télomères d'autres
espèces semblait conforter cette hypo-
thèse. Elizabeth Blackburn et Joseph
Gall, à l'Université Yale, furent les pre-
miers à isoler un télomère, celui du
micro-organisme Tetrahymena thermo-
phila. Ils avaient choisi cette bactérie
parce qu'à certaines périodes de son
cycle l'ADN télomérique représente une
proportion importante du génome.
Au cours de ces périodes, le micro-
organisme fragmente ses chromosomes,
puis les amplifie, créant ainsi quelque
10 000 copies de chaque « minichromo-
some» ; on isole aisément du reste de
l'ADN ces unités amplifiées, relativement
courtes et stabilisées par des télomères.
L'analyse de leur séquence nucléotidique
a révélé que les extrémités des minichro-
mosomes sont des répétitions de la
séquence TTGGGG. Ces lettres symboli-
sent les bases nucléotidiques : T pour thy-
mine, G pour guanine, A pour adénine et
C pour cytosine. Une séquence ne décrit
qu'un brin de la double hélice d'ADN, car
le deuxième brin lui est complémentaire :
les thymines sont liées à des adénines et
les guanines, à des cytosines.
La détermination de la structure du
télomère de Tetrahymena thermophila ne
nous aide hélas pas directement à bilité et la réplication des chromosomes,
connaître le télomère humain : les cel-
lules humaines contiennent 100 fois plus
d'ADN (six milliards de paires de nucléo-
tides) que ce micro-organisme, et les télo-
mères y sont moins nombreux (seulement
deux par chromosome). Il fallait imaginer
d'autres approches, et les recherches ont
piétiné pendant quelques années.
Entre-temps, plusieurs équipes mon-
trèrent que les télomères de divers orga-
nismes eucaryotes unicellulaires (des
micro-organismes qui ne sont ni des virus
ni des bactéries) ressemblent à ceux de
Tetrahymena thermophila : tous sont
composés de motifs répétitifs simples,
riches en guanine. En raison du rôle
essentiel que joue le télomère dans la sta-
nous avons supposéqu'une structure aussi
vitale n'avait pas changé notablement au
cours de l'Évolution : le télomère humain

1. LES TÉLOMÈRES sont des segments d'ADN qui coiffent les chro- humain est constitué d'un enchaînementde plusieurs centaines de
mosomes; des chromosomes humains(en orange) ont été marqués copies de la séquenceTTAGGG. Sur cette figure, les chromosomes
par des sondes fluorescentes (en jaune) qui reconnaissent la sont en métaphase : chacun des chromosomes a dupliqué,
été mais
séquencenuléotidique TTAGGG On montre ainsi que le télomère les chromosomes jumeaux résultants ne sont pas encore séparés.
devrait contenir des unités répétitives ana- séquences répétées d'ADN provenant téristiques et que nous saurions distin-
logues à celles d'autres eucaryotes. d'autres mammifères, par exemple de guer des autres séquences d'ADN répéti-
Cette hypothèse pouvait servir de rongeurs, devaient s'apparier par liaison tives isolées par les sondes.
base à une stratégie de recherche du télo- des bases complémentaires aux segments
mère humain plus efficace qu'une explo- de même séquence nucléotidique-ou de La pêche télomères
aux
ration au hasard du génome : exposées à séquence voisine ; I'ADN télomérique
une banque-ou collection-de clones d'un rongeur «pêcherait» le télomère Cette méthode d'isolement d'une
d'ADN humain, des sondes constituées de humain dont nous connaissions les carac- séquence génétique dans une banque de
gènes est assez simple : les segments
d'ADN de la banque sont placés dans une
solution qui dissocie leurs deux brins ; on
ajoute alors la sonde, sous forme de
simples brins, et lorsque ces brins décou-
vrent un brin complémentaire, ils s'y
lient ; ce mécanisme d'hybridation molé-
culaire procure des segments d'ADN
double brin que diverses techniques per-
mettent de purifier et d'identifier.
Diverses études faisaient penser
qu'une telle stratégie était possible.
Notamment d'autres équipes avaient
montré que des cellules de rongeurs
incorporaient, sans les détruire, des chro-
mosomes humains, et que l'ADN humain
se répliquait lorsque les cellules-hôtes se
divisaient. Ces observations montraient,
de surcroît, que le télomère humain
n'était pas très différent de celui des ron-
geurs : dans le cas contraire, les molé-
cules responsables de la réplication, dans
2. LES SEGMENTS D'UN CHROMOSOME HUMAIN sont regroupés sur les cellules de rongeur, ne l'auraient pas
ESSENTIELS ce schéma:
chaque boucle contient un ou plusieurs gènes (les segments d'ADN qui codent les protéines). reconnu et n'auraient probablement pas
Les cylindres représentent des régions d'ADN qui ne codent pas de protéines, mais qui sont recopié fidèlement l'ADN humain.
indispensablesà la stabilité des chromosomes et à leur activité
; il s'agit notamment des télo- Si notre stratégie semblait raison-
mères,des sitesd'ancrage a la matrice (qui seraient les origines de la réplication où la syn- nable, les banques d'ADN dont nous dis-
thèsede l'ADN commence), et le centromère. Au coursde la division cellulaire, les centro- posions semblaient, en revanche, insuffi-
mèresassurent la répartition deschromosomesdupliqués entre les deux cellules filles. santes. En effet, les chercheurs
construisent la plupart de ces banques en
coupant des fragments d'ADN par des
« enzymesde restriction» et en les incor-
porant dans des plasmides (des anneaux
d'ADN bactérien) préalablement ouverts
par la première enzyme de restriction : les
séquencesprésentes aux extrémités libres
des segments et des anneaux ouverts se
correspondent et s'associent facilement.
Ensuite ces anneaux génétiquement
modifiés, ou vecteurs, sont introduits
dans des bactéries (généralement
Escherichia coli) qui les multiplient.
Chaque bactérie produit de nombreuses
copies identiques-des clones-du vec-
teur et, par conséquent, de l'ADN humain
qui y a été inséré. L'ensemble des clones
d'ADN humain purifiés à partir des cel-
lules bactériennes constitue une banque.
Malheureusement, lorsque les
enzymes de restriction découpent les
3. L'ADN HUMAIN(en jaune) qui a été cloné dans un chromosome artificiel de levure s'est chromosomes, les segments terminaux,
lié à une région proche du télomère qui coiffe le bras long de chaque chromosome7 ; cette n'ont qu'une extrémité susceptible de se
cellule humaine est en métaphase,c'est-à-dire que les chromosomesont été dupliqués mais lier à un vecteur ; l'extrémité intacte du
ne sont pas encore répartis entre les cellules filles. Les généticiens localisent désormais chromosome ne s'associe à aucune des
divers marqueurs génétiques sur le chromosome7 en mesurant leur distance par rapport à extrémités d'un plasmide ouvert et ne
ce fragment d'ADN marqué (les deux sphères oranges sont les noyaux d'autres cellules). reforme pas un vecteur que l'on peut
ensuite cloner. De ce fait, les segments
contenant le télomère sont absents des
banques.
Manifestement, pour trouver le télo-
mère humain dans une banque d'ADN
humain, nous devions en construire une
qui contienne cet ADN particulier ! Nous
avons donc abandonné les enzymes de
restriction... au profit d'une méthode
mécanique : nous faisions passerles chro-
mosomes à travers une seringue munie
d'une aiguille calibrée, qui déchirait l'ADN
en petits morceaux ; le télomère devait
être réparti sur certains de ces segments.
Nous aurions pu constituer une
banque en insérant les segments obtenus
dans des plasmides, puis en introduisant
ces plasmides dans des bactéries, mais,
afin de simplifier la détection ultérieure
des ADN télomériques, nous avons intro-
duit une étape supplémentaire entre le
découpage et l'insertion dans les plas-
mides : comme nous supposions que
l'unité de base du télomère se répétait un
grand nombre de fois dans toutes les cel-
lules, nous avons éliminé les segments
qui ne contenaient pas d'ADN répétitif,
fragments inutiles pour notre collection.
Cette élimination fut assez simple :
nous avons séparé les brins des segments
que nous avions obtenus, puis, pendant
quelques instants, nous avons laissé les
segments complémentaires se réapparier.
Les séquencesrépétées, présentesen plu-
sieurs exemplaires, trouvaient un parte-
naire plus rapidement que les séquences

Construction d'une banque d'ADN contenant de l'ADN télomérique

télomère
Unebanque d'ADNcontenant de l'ADNtélomérique (à droite), construite par l'auteur et ses collègues, leur a permis d'identifier le
humain (les banques d'ADNusuelles ont permis l'identification de nombreux gènes, mais dépourvues
elles sont d'ADN
télomérique, comme on le voit à gauche). Supposant que le télomère comportait une même unité de base répétée plusieurs fois,
ils ont éliminé de leur banque toutes les
séquences d'ADN qui ne contenaient pas de motifs répétés.
 uniques, qui devaient chercher le leur dans
une immense soupe d'ADN. Enfin nous
avons éliminé, à l'aide d'enzymes, tous les
segmentsd'ADN qui n'étaient pas hybridés,
c'est-à-dire tous les segments non répétés.
Notre banque constituée, nous avons
cherché les séquences répétées conser-
vées. Nous avons exposé les clones
d'ADN de la banque à des séquences répé-
tées marquées d'ADN de hamster et avons
ainsi isolé deux segments, parmi des mil-
liers qui pouvaient contenir des
séquences télomériques. Ces deux clones
étaient constitués de répétitions de la
séquence TTAGGG dont la formule cor-
respondait à celle qui avait été établie
pour les télomères d'autres espèces.
Mieux encore, cette séquence était exac-
tement celle du télomère du parasite
microscopique Trypanosoma brucei.
Était-ce l'unité élémentaire du télo-
mère humain ? Plusieurs expériences sem-
blaient le confirmer. Par cytofluorimétrie
(une technique qui utilise des lasers pour
identifier et séparer les chromosomes),
nous avons d'abord montré que tous les
chromosomes contiennent des répétitions
de la séquence TTAGGG ; en revanche,
cette méthode n'indiquait pas où, sur le
chromosome, se trouvaient ces séquences.
Puis avec mes collègues Julianne
Meyne et Robert Ratliff, nous avons mon-
tré en utilisant l'hybridation in situ, que de
longs segments de cet ADNrépétitif étaient
présents aux deux extrémités de tous les
chromosomes humains. Ces séquences
terminales sont représentées par la for-
mule (TTAGGG)n, où n est un nombre-
non précisé-des motifs répétitifs.
Pour effectuer cette hybridation, nous
avons isolé les chromosomes de cellules
humaines, nous les avons placés sur des
lames de microscope, et nous avons
séparé les brins de la double hélice.
Ensuite nous avons couplé un composé,
la biotine, à une sonde fabriquée pour
s'hybrider avec TTAGGG, nous avons
déposé la sonde marquée à la biotine sur
les lames, puis nous avons ajouté de
l'avidine fluorescente, qui se lie à la bio-
tine. Enfin nous avons amplifié le signal
de l'avidine en introduisant des anticorps
fluorescents qui se lient à l'avidine.
Les images obtenues au microscope à
fluorescence étaient révélatrices (voir la
figure 1) : les deux extrémités de tous les
chromosomes, et elles seules, étaient fluo-
rescentes. Cependant nous ne pouvions
affirmer que la sonde s'était fixée sur les
derniers nucléotides des chromosomes.
Pour nous en assurer, nous avons
exposé l'ADN des chromosomes à une
enzyme appelée Bal 31, qui raccourcit
progressivement les molécules d'ADN en
gobant les nucléotides à partir des extré-
mités. Les groupes TTAGGG étant les
premiers à disparaître, ces séquences
étaient effectivement localisées aux
extrémités. Nous avons ainsi découvert
que chaque télomère humaid est composé
de 250 à 1 500 séquences TTAGGG
enchaînées ; le nombre dépend du type de
cellules, les chromosomes des spermato-
zoïdes ayant les télomères les plus longs.
Code
: TTAGGG
La science ne se contente pas d'indi-
cations ; elle veut des preuves. Aussi
avons-nous cherché si la séquence
TTAGGG, commune aux hamsters, à un
parasite et à l'Homme, était également
conservée chez d'autres espèces. Nous
avons appliqué la technique d'hybridation
in situ à l'ADN de plus de 100 espèces de
vertébrés : des mammiferes, des oiseaux,
des reptiles et des poissons osseux, qui
n'ont pas eu d'ancêtre commun depuis
plus de 400 millions d'années.
Nous avons conçu nos expériences de
telle sorte que l'hybridation ne se produise
que si la sonde rencontre la séquence
TTAGGG, à l'exclusion de toutes les
séquences très proches, telle TAAGGG.
Nous avons retrouvé la séquencedu télo-
mère humain dans les télomères de toutes
les espèces analysées-une découverte
remarquable étant donné que l'ordre des
nucléotides change rapidement au cours
du temps, en plusieurs régions du
génome. La séquence (TTAGGG) n serait
apparue longtemps avant les dinosaures,
qui devaient avoir des télomères iden-
tiques à ceux de l'Homme.
Comment prouver de façon irréfu-
table que (TTAGGG) est bien le télo-
mère humain ? En montrant que cette
séquence fonctionne effectivement
comme un télomère dans les cellules
humaines. L'expérience idéale consiste-
rait à insérer cette séquence dans un chro-
mosome artificiel qui contiendrait unique-
ment le télomère supposé et les segments
d'ADN humain indispensables à la réplica-
tion des chromosomes, c'est-à-dire une
origine de réplication (le site où la syn-
thèse d'ADN commence) et un centromère.
Si ce chromosome restait intact dans des
cellules humaines et se répliquait sans
raccourcir, nous pourrions affirmer que
(TTAGGG) n est responsable de sa stabi-
lité et que c'est bien le télomère.
Malheureusement aucun chromosome
artificiel humain n'a encore été synthétisé,
parce que les généticiens n'ont pas encore
identifié les séquences indispensables au
fonctionnement du centromère humain. À
défaut, on peut réaliser une telle expé-
rience avec des chromosomes artificiels
de levure. Harold Riethman, David Burke
et Maynard Olson, de l'Université de
Saint Louis, ont fabriqué de tels chromo-
someset placé la séquence(TTAGGG)nà
la place du télomère de levure. Introduit
dans des cellules de levure, ce chromo-
some «chimérique» a survécu et s'est cor-
rectement répliqué, ce qui prouve que la
séquencehumaine TTAGGG se comporte
bien comme un télomère.
Comme l'ancêtre commun de
l'Homme et des levures a plus d'un mil-
liard d'années, on considère qu'ils n'ont
aucun lien de parenté, et l'expérience pré-
cédente aurait pu échouer sans remettre
en cause notre hypothèse. A l'inverse,
puisque l'expérience a été un succès,
malgré la variabilité des télomères dans
les cellules de levure, c'est que le seg-
ment d'ADN isolé de notre banque est
vraisemblablement le télomère humain.
Les chromosomes
artificiels de levure
Une fois l'identité du télomère
humain établie, plusieurs groupes ont
continué l'étude des chromosomes artifi-
ciels de levure contenant des télomères
humains, afin d'identifier les séquences
adjacentes aux télomères sur les chromo-
somes. Les chromosomes artificiels de
levure sont très précieux, car on peut y
introduire des segments étrangers de plus
de 500 000 nucléotides, alors que les
plasmides n'acceptent guère plus de
40 000 nucléotides étrangers.
Ces travaux permettent de compléter
certaines parties de la carte des chromo-
somes humains. Les chercheurs localisent
les gènes en estimant leur distance par
rapport à des marqueurs, séquences de
nucléotides spécifiques souvent trans-
mises à la descendance en même temps
qu'un gène particulier. On déduit la dis-
tance qui sépare un gène d'un marqueur,
de la fréquence avec laquelle ils sont
transmis simultanément : on estime qu'ils
sont d'autant plus proches qu'on les
retrouve plus fréquemment ensemble sur
un chromosome après sa réplication. En
comparant la fréquence avec laquelle cer-
tains marqueurs sont transmis, on les loca-
lise approximativement et on déduit la
position des gènes qui leur sont associés.
Naguère, on a souvent cru trouver le
marqueur le plus proche de l'extrémité
d'un chromosome, mais on isolait peu
après un nouveau marqueur situé
quelques millions de nucléotides plus
loin. Aujourd'hui les chercheurs détermi-
nent la distance entre un marqueur et
l'extrémité d'un chromosome en clonant
 4. UNE SONDE FLUORESCENTE reconnaissant la séquenee TTAGGG
du télomère humain (les points jaunes sur les photographies) s'est liée aux extrémités
de tous les chromosomes des animaux représentés ici ainsi que de tous les poissons
osseux, amphibiens, reptiles, oiseaux et mammifères testés (plus de 100 espèces en
tout). Ainsi les télomères de ces cinq groupes sont identiques, bien que le dernier
ancêtrecommun à toutes ces espèces ait vécu il y a plus de 400 millions d'années. Il est
remarquable qu'une séquenced'ADNait été si bien conservéeau cours de l'Évolution.

le télomère et l'ADN adjacent dans un
chromosome artificiel de levure et en
mesurant la distance entre une région du
domaine cloné et le marqueur. On pourrait
ainsi localiser tous les marqueurs d'ADN
en mesurant leur distance à un télomère.
Ces recherches éclairent également le
rôle de l'ADN adjacent aux télomères, ou
domaines subtélomériques. Ces régions
sont a priori des emplacements dange-
reux pour des gènes, et ils devraient y
être peu nombreux : si un télomère était
accidentellement éliminé, les gènes situés
à proximité seraient rapidement perdus.
Les expériences ont vérifié l'hypothèse :
chez la plupart des organismes unicellu-
laires, les domaines subtélomériques ne
contiennent pas de gènes ; il servent de
tampons entre les télomères et les régions
qui codent les protéines.
Les chromosomes humains semblent
présenter également cette structure : de
nombreux domaines étudiés sont des
régions tampons composées d'ADN
d'«espacement». Comme les régions sub-
télomériques des organismes unicellu-
laires, ils contiennent beaucoup de
séquences répétées,mais, contrairement à
l'ADN du télomère, le nombre et la
séquence des motifs répétitifs varient
beaucoup d'un chromosome à l'autre, et
même d'une personne à l'autre.
En étudiant l'ADN subtélomérique, on
espère découvrir de nouveaux marqueurs
associés à des gènes responsables de
maladies et localiser et identifier les
quelques gènes proches des télomères.
Ainsi le gène responsable de la chorée de
Huntington (une dégénérescence de cer-
tains neurones) est proche de l'extrémité
du bras court du chromosome 4, mais,
pour les généticiens dépourvus d'un mar-
queur télomérique de ce gène, sa locali-
sation restait imprécise. En fait, on igno-
rait même où se terminait exactement le
chromosome 4, mais, le télomère humain
identifié, on a réussi à localiser ce gène
dans un domaine précis : les deux der-
niers millions de nucléotides de ce chro-
mosome. Quand on aura trouvé des mar-
queurs dans ce domaine, on pourra
chercher à identifier le gène lui-même.
La découverte du télomère humain a
même fait progresser l'étude du vieillis-
sement cellulaire. On suppose que seules
Les chromosomes artificiels de levure
incorporés
e télomère humain et l'ADN qui le borde sur un chromosome peuvent être
et multipliés dans un chromosome artificiel de levure ; la levure, en
multipliant ce chromosome, multiplie également les segments humains qui y ont été
placés. Les généticiens isolent ensuite les multiples exemplaires du segment cloné
et en déterminent la séquence. On découvre ainsi la composition de l'ADNchromo-
somique, à proximité des télomères.
les cellules germinales sont capables ment, ce segment d'ADN stabilise-t-il les
d'éviter le raccourcissement des chromo- chromosomes et empêche-t-il leur rac-
somes au cours de la réplication, et qu'au courcissement au cours de la réplication ?
contraire les cellules somatiques perdent Quelques découvertes surprenantes
des sous-unités télomériques lorsqu'elles ont apporté des éléments de réponse. Ainsi
se divisent. Lorsque les télomères on a observé que les extrémités de beau-
deviennent trop courts, les chromosomes coup de télomères ne sont pas en double
sont dégradés et les cellules meurent. hélice ; les brins riches en guanine se pro-
Connaissant le télomère humain, les longent après la fin de leurs chaînes com-
chercheurs testeront cette hypothèse. plémentaires, riches en cytosine. Greg
Si le télomère humain est utilisé dans Morin, à Yale, a montré que, dans des cel-
plusieurs types d'études, son fonctionne- lules humaines cancéreuses, une enzyme
ment reste mystérieux. Comment, notam- nommée télomérase ajoute parfois des uni-
tés TTAGGG à ce prolongement, comme
le fait la première télomérase isolée, qui
avait été découverte chez Tetrahymena
servent à cloner l'ADN humain thermophila par E. Blackburn et Carol
Grieder, à Cold Spring Harbor.
Contrairement à l'enzyme humaine, la
télomérase de Tetr ahymena thermophila a
été étudiée en détail : elle contient des
acides aminés et de l'ARN (une molécule
proche de l'ADN, mais généralement for-
mée d'une molécule simple brin où la
base uracile remplace la thymine). L'ARN
de l'enzyme contient la séquencecomplé-
mentaire du brin riche en guanine de la
sous-unité télomérique de Tetrahymena
thermophila : TTGGGG. L'hybride pro-
téine-ARN s'aligne sous le brin qui
dépasse,de sorte que le segment d'ARN est
juste sous le groupe TTGGGG terminal.
Ainsi localisé, l'ARN attire les nucléotides
complémentaires qu'il ajoute au prolonge-
ment, sous la forme de groupes TTGGGG.
De même, la télomérase humaine
ajouterait des unités TTAGGG à l'ADN
humain. Plusieurs chercheurs ont proposé
des mécanismes pour expliquer comment
de telles unités supplémentaires prévien-
draient le raccourcissement des chromo-
somes lors de la réplication, mais aucun
n'a encore été démontré.
Comment les télomères stabilisent-ils
les chromosomes ? On l'ignore, mais on
sait que tous les segments télomériques
connus ont des structures singulières : les
guanines de l'un des brins d'ADN semblent
capables de s'apparier entre elles sur ce
même brin, bien que, dans les gènes, la
guanine s'associe uniquement avecla cyto-
sine. Cette structure inhabituelle empêche-
rait les enzymes qui dégradent l'ADN de se
fixer sur le télomère et de l'éliminer.
Plusieurs questions restent en suspens,
mais la découverte de la composition du
télomère humain, (TTAGGG)n, a conforté
notre première hypothèse : les séquences
répétéesqui ne participent pas directement
à la synthèse des protéines renferment des
informations essentielles à la survie et au
fonctionnement des chromosomes.Il nous
reste à comprendre comment elles trans-
mettent leurs messagesaux cellules.
 La cartographie
des chromosomes
Les chromosomes humains
variables d'ADN constituant
À l'aide de ces marqueurs,
on
et on établit la carte génétique
MAGINONSune maladie hérédi-
taire, transmise selon les lois de
la génétique mendélienne clas-
sique ; cette maladie est due à
une anomalie d'un seul des
100 000 gènes portés par les 23 paires de
chromosomes humains ; les symptômes et
l'évolution de la maladie sont parfaite-
ment connus, mais on ignore les méca-
nismes biochimiques, et l'on est incapable
de prévoir quels individus seront malades.
Cette description n'est pas celle de
quelques maladies seulement : elle
s'applique à la plupart des 3 000 maladies
génétiques connues, par exemple la cho-
rée de Huntington ou la mucoviscidose.
Dans tous les cas, le médecin cherche à
répondre aux trois questions suivantes.
Comment déterminer le mécanisme
pathologique ? Comment dépister la
maladie ? Comment traiter les malades ?
On étudie désormais ces questions en
s'intéressant directement au gène défi-
cient, mais le territoire à explorer est
immense : les chromosomes humains sont
des molécules d'ADN àdeux brins, formées
par l'enchaînement linéaire d'environ trois
milliards de paires de bases (les sous-uni-
tés chimiques de l'ADN, dont l'enchaîne-
ment code l'information génétique), et les
gènes,avec leurs quelque 10 000 paires de
bases, sont des unités d'information géné-
tique complexes. Cependant, en détermi-
nant des corrélations entre la transmission
d'une maladie et la transmission d'un seg-
ment d'ADN particulier-un « marqueur »-,
on peut localiser le gèneresponsabled'une
maladie à un ou deux millions de paires de
bases près, soit à moins d'un millième du
génome humain (l'ensemble de l'ADN).
Après cette première localisation, on peut
Ray
contiennent des séquences
des marqueurs génétiques.
repère les gènes
anormaux
des chromosomes.
cloner le gèneet examiner son activité bio-
logique par des méthodes de biologie
moléculaire. Les marqueurs génétiques
associés à des maladies permettent égale-
ment de suivre la transmission des gènes
déficients et de dépister simplement les
porteurs et les futurs malades.
Ce type de travail est fondé sur un outil
vénérable de la génétique classique-
l'analyse de liaison-, mais cet outil est
devenu bien plus efficace depuis qu'on l'a
associé aux techniques de la biologie
moléculaire, car celles-ci ont fourni de très
nombreux marqueurs : les RFLP (de
l'anglais restriction-fragment length poly-
morphism, ou « polymorphisme de lon-
gueur des fragments de restriction »). Grâce
aux analyses de liaison, on dispose
aujourd'hui de marqueurs génétiques pour
de nombreux gènes déficients et l'on en
découvre encore. Les analyses de liaison
servent également à d'autres fins : en sui-
vant la transmission simultanée de nom-
breux marqueurs, dans des familles saines,
on les localise les uns par rapport aux
autres et l'on détermine leur emplacement
sur les chromosomes.On vise aujourd'hui
l'établissement d'une carte complète de
marqueurs, c'est-à-dire d'un ensemble de
points de référence recouvrant la totalité du
génome et permettant de localiser le gène
de n'importe quelle maladie beaucoup plus
précisément qu'avec des marqueursisolés.
Recombinaison et
transmission des gènes
L'analyse de liaison est fondée sur la
nature particulière de la transmission
génétique. Une cellule humaine contient
23 paires de chromosomes et, dans chaque
White et Jean-Marc Lalouel
paire de chromosomes «homologues», un
chromosome provient du père, l'autre de
la mère. Au cours de la méiose (la série de
divisions cellulaires produisant les cellules
germinales que sont les spermatozoïdeset
les ovules), les deux chromosomes de
chaque paire de la cellule mère sont dupli-
qués, puis répartis dans les quatre cellules
germinales produites, chacune recevant
23 chromosomes non appariés.
Les chromosomes ne sont pas trans-
mis tels quels, car les chromosomes
homologues se recombinent plusieurs
fois pendant la méiose : ils échangent des
segments de même longueur (voir la
figure 3), de sorte que les chromosomes
des cellules germinales sont également
des mosaïques de segments provenant
des deux chromosomes parentaux.
Le phénomène de recombinaison
génétique permet de reconnaître une liai-
son entre un marqueur et le gène d'une
maladie. On détecte les recombinaisons
et on les utilise dans les analyses de liai-
son en se fondant sur les nombreuses dif-
férences existant entre les chromosomes
homologues : ceux-ci portent souvent des
allèles différents, c'est-à-dire des ver-
sions différentes, de plusieurs de leurs
gènes ainsi que des séquences d'ADN
apparemment dépourvues de sens, dans
et entre les gènes. Les chromosomes
recombinés présents dans les cellules
germinales, après la méiose, comportent
de nouvelles combinaisons d'allèles : un
allèle d'un locus, sur un chromosome, et
un allèle d'un autre locus, sur le chromo-
some homologue, peuvent être réunis,
puis transmis ensemble, et des allèles
présents sur deux loci d'un même chro-
mosome peuvent se trouver séparés.
Plus les loci sont proches sur un
même chromosome parental, moins la
probabilité que les allèles soient séparés,
lors de la méiose, est importante, et l'on
détermine la distance entre un marqueur
et un gène particulier-un gène dont un
allèle mutant est responsable d'une mala-
die, par exemple-en étudiant la trans-
mission de leurs allèles : dans une famille
où la maladie est transmise, quand la plu-
part des individus atteints possèdent une
même version du marqueur, le gène
mutant est nécessairement situé très près
du marqueur ; on dit que le marqueur et le
gène responsable de la maladie sont liés.
Les recombinaisons entre le gène
pathogène et d'autres marqueurs situés
plus loin sont plus fréquentes, et la proba-
bilité que la maladie soit transmise avec un
allèle d'un marqueur plus éloigné est infé-
rieure. Lorsque le gène de la maladie et le
marqueur sont très éloignés l'un de l'autre,
sur le chromosome, la fréquence de
recombinaison est égale à 50 pour cent ; le
gène et le marqueur ne sont alors pas liés.
De même, la probabilité qu'un marqueur
et un allèle mutant initialement portés par
des chromosomes différents soient trans-
mis ensembleest égale à 50 pour cent.
Analyse de liaison et
marqueurs polymorphes
Pour établir une corrélation entre la
transmission d'un marqueur et d'une
maladie, il faut naturellement détecter
facilement le marqueur, mais il faut égale-
ment que ce dernier comporte un certain
nombre d'allèles distincts dans la popula-
tion. En effet, on ne détectera une liaison
que si un individu portant l'allèle normal
et un allèle mutant d'un gène associé à
une maladie porte également deux ver-
sions différentes du marqueur : quand les
deux allèles du marqueur sont indiscer-
nables, on ne peut mettre en évidence les
échangesde segmentsentre le marqueur et
le gènedéficient, lors des recombinaisons.
Avant le milieu des années 1970, les
marqueurs satisfaisants étaient rares : il
s'agissait de gènes à plusieurs allèles
codant notamment certaines enzymes, les
antigènes des groupes sanguins, et diverses
protéines ; les différents allèles de ces
gènes produisent des protéines différentes,
dont la détection permet de remonter aux
allèles. Cependant on ne connaissait que
25 ou 30 marqueurs utilisables de ce type,
ne couvrant que quelques courtes portions
de certains chromosomes,et, faute de mar-
queurs, l'analyse de liaison renseignait
bien peu sur le génome humain.
Une grande mutation des méthodes de
biologie moléculaire a débuté en avril
1978, lors d'un séminaire de génétique à
l'Université de l'Utah : David Botstein,
de l'Institut de technologie du
Massachusetts, Ronald Davis, de
l'Université Stanford, et Mark Skolnick,
de l'Université de l'Utah, proposèrent
d'utiliser des séquences d'ADN comme
marqueurs. Intéressépar cette proposition,
l'un d'entre nous (R. White) entreprit de
tester cette hypothèse et chercha à pro-
duire, directement à partir de l'ADN, des
marqueurs capables de révéler une liaison
génétique n'importe où dans le génome
humain. En 1980, D. Botstein, R. White,
M. Skolnick et R. Davis publiaient le pre-
mier article décrivant cette approche. À la
même époque, de nombreux chercheurs
découvraient de nouveaux marqueurs,
dans l'ADN humain, et réfléchissaient à la
manière de les utiliser. L'idée était mûre.
L'analyse de liaison est une méthode
très puissante en raison de l'important
polymorphisme des séquences nucléoti-
diques de l'ADN : entre deux chromo-
somes homologues, on observe une diffé-
rence toutes les 200 à 500 paires de
bases, en moyenne, et l'identification de
toutes ces variations alléliques procurerait
un nombre quasi illimité de marqueurs,
répartis sur la totalité des chromosomes.
Les outils moléculaires qui ont révolu-
tionné l'analyse génétique, en mettant en

1. LES FAMILLES NOMBREUSES, avec des grands-parents vivants,enfants. En observant la transmission d'une maladie et de mar-
sont indispensables aux études de liaison génétique. Dans ces queurs génétiques,on localise le gène decettemaladie sur les chro-
études,on détermine les positions relatives de différents sites sur le mosomes; de même,en suivant la transmission de nombreux mar-
chromosome,à partir de la fréquence aveclaquelle des variations queurs dans les familles nombreuses dont les individusne sont pas
génétiques de ces sites sont transmises ensemble, de parents à malades,on dressedes cartes chromosomiques.
 évidence les variations de séquence, sont
les « enzymesde restriction » : chacune de
ces enzymes, produites par une espèce
particulière de bactéries, se fixe sur l'ADN
ta où elle rencontre la séquence de
quelques paires de basesqui lui est spéci-
fique ; puis elle coupe l'ADN en un point
précis de cette séquence: le site de restric-
tion. Quand un nouveau site de restriction
apparaît ou qu'un site disparaît, en raison
d'une variation de séquence de l'ADN, les
segments d'ADN obtenus par action de
l'enzyme de restriction sont modifiés :
c'est le polymorphisme de longueur des
fragments de restriction, ou RFLP.
Chaque RFLPcorrespond à un mar-
queur potentiel, mais chaque enzyme de
restriction produit des millions de frag-
ments à partir de l'ADN humain.
Comment détecter le ou les quelques
fragments variants intéressants parmi
cette multitude ? On commence par sépa-
rer les fragments par électrophorèse,
c'est-à-dire que l'on fait migrer les frag-
ments dans un gel auquel on applique un
champ électrique, et l'on classe ainsi les
fragments par ordre de taille : celle-ci est
inversement proportionnelle à la vitesse
de migration des fragments dans le gel.
Puis on identifie les fragments intéres-
sants par la technique d'hybridation de
Southern, une technique extrêmement
sensible conçue par Edward Southern, de
l'Université d'Edimbourg.
La technique d'hybridation de
Southern est fondée sur la complémentarité
des deux brins de l'ADN : toute molécule
d'ADN à un seul brin cherche à se lier à la
séquencequi lui est complémentaire ; elle
constitue donc une sonde spécifique dans
un échantillon d'ADN «dénaturé», c'est-à-
dire dont on a séparé les deux brins par
chauffage ou en milieu basique. La tech-
nique d'hybridation de Southern consiste
ainsi à dénaturer les fragments d'ADN sépa-
rés par l'électrophorèse, puis à les transfé-
rer sur une membrane de nylon ; on les
fixe à ce support, puis on dépose la sonde
d'ADN marquée par un isotope radioactif.
Celle-ci s'hybride, c'est-à-dire qu'elle ne
s'associe qu'aux fragments portant la
séquencede bases complémentaires, et le
marquage radioactif de la sonde révèle la
position des fragments de restriction, donc
leur taille : des bandes apparaissentsur un
film photographique mis en contact de la
2. LA CARTEDU CHROMOSOME 12 : on l'établie en étudiant la transmission de marqueurs membrane de nylon portant l'ADN.
d'ADN, c'est-à-dire de sites où les deux chromosomes homologues portent souvent des
Pour détecter un RFLP, il faut donc
séquencesd'ADN différentes. Les distances indiquées correspondent aux fréquences de
une sonde complémentaire d'une
recombinaison, c'est-à-dire aux fréquences de séparation d'allèles de marqueurs portés par
le mêmechromosome parental lors de la formation des spermatozoïdes ou des ovules : cette séquence d'ADN située à proximité du site
fréquence augmente avec la distance qui sépare les marqueurs sur le chromosome. de l'enzyme de restriction. A cette fin, on
D'autres facteurs, comme le sexe, jouent un rôle important. Par exemple, la fréquence de choisit, souvent au hasard, un segment
recombinaison est supérieure chez la femme, de sorte que leur carte génétique est plus d'ADN dans une collection (une banque)
longue. Au centre, on a indiqué la position approximative de quelques marqueurs. de fragments clonés, représentant la tota-
 lité du génome humain. On dénature ce allèle (parfois, cependant, deux sites de L'origine de ces « séquences répé-
segment, on le marque avec un isotope restriction sont si proches que l'on peut les tées» est mystérieuse, mais les séquences
radioactif, puis on lui fait sonder des détecter avec la même sonde ; on dispose elles-mêmes sont fort utiles, car leur
fragments de restriction provenant de dif- alors d'un marqueur à quatre allèles). nombre, en un locus particulier, peut
férents individus. Une autre forme de polymorphisme varier de un à plusieurs centaines ; la
Quand les bandes correspondant aux de l'ADN est à l'origine de nombreuses taille des fragments de restriction obtenus
séquences détectées par la sonde appa- versions différentes d'un RFLP. Certaines par coupure, à proximité de ces séquences
raissent à des positions différentes selon séquences ne codant aucune protéine sont répétées, varie ainsi considérablement
les individus, c'est que l'ADN sondé pré- présentes en de nombreux exemplaires en selon les cas (voir la figure 5), et le poly-
sente un polymorphisme de site de restric- certains sites du génome. morphisme est bien supérieur à celui dû
tion. La sonde et le RFLP qu'elle détecte
constituent alors un système de marquage
génétique très spécifique, qui définit un
point de référence dans le génome : un
court segment d'ADN polymorphe dont on
peut suivre la transmission.
Ce marqueur défini par le RFLP se
trouve sous l'une ou l'autre forme chez
tous les individus, qu'ils soient sains ou
malades. En revanche, lorsque dans une
famille, l'affection se transmet systémati-
quement en même temps qu'un allèle par-
ticulier du marqueur, on peut admettre que
le gène de la maladie et le marqueur sont
situés dans la même région chromoso-
mique. Dans une autre famille atteinte, on
trouvera également une liaison avec le
même marqueur, bien que sa forme spéci-
fique puisse être, cette fois, différente. La
liaison d'une maladie et d'un marqueur ne
nous apprend naturellement rien sur la
position physique du gène sur le chromo-
some, mais cette localisation n'est pas tou-
jours nécessaire (pour les dépistages, par
exemple, on n'a pas besoin de connaître la
position du gène déficient). Néanmoins la
sonde peut servir à déterminer quel est le
chromosome portant le marqueur et le
gène de la maladie : quand on sonde
l'ensemble des chromosomes, on
n'observe d'hybridation qu'avec le chro-
mosome portant la séquence du marqueur.

Les séquences répétées

L'intérêt d'un marqueur dépend beau-

coup du nombre de ses différentes ver-
sions parmi l'ensemble de la population :
plus ce nombre est grand, plus il est pro-
bable qu'un individu porteur du gène
d'une maladie porte aussi deux allèles dif-
férents du marqueur ; on pourra alors
détecter des recombinaisons entre le gène
de la maladie et les marqueurs chez ses
descendants. De nombreux RFLP résultent
du changement d'une seule paire de bases
ou de l'adjonction ou de la délétion de
quelques paires de bases, à un site de res-
triction. Dans ce cas, le site de restriction
est soit présent, soit absent : il n'existe que
deux formes polymorphes du marqueur, et
la moitié de la population au moins est
homozygote pour celui-ci, les deux chro-
mosomes homologues portant le même
3. LE PHÉNOMÈNE DE RECOMBINAISON entre chromosomes homologues a lieu pendant la
méiose, la division cellulaire aboutissant à la production de cellules germinales (spermato-
zoïdes ou ovules). Sur ce schéma, les chromosomes portent des allèles différents de deux mar-
queurs A et B ; un des chromosomes porte également un allèle mutant du gène responsable
d'une maladie (m), l'autre porte l'allèle normal du même gène (+) ; dans la cellule ances-
trale, le gène de la maladie est associé à d'allèle 1 de chacun des marqueurs A et B. Au cours
de la première phase de la méiose, les chromosomes sont répliqués ; puis les chromosomes
homologues s'échangent des segments de même longueur (par «crossing-over», ici entre B 1
et B 2). La méiose produit deux cellules germinales (a, d) portant la combinaison allélique
parentale et deux cellules germinales (b, c) contenant des chromosomes recombinés. Dans la
cellule b, le gène mutant (m) reste associé à l'allèle I du locus A, mais il est voisin de l'allèle
2 du locus B. Si la fréquence de recombinaison, calculée sur de nombreuses méioses, entre le
gène de la maladie et le marqueur A est faible, on déduit que les deux gènes sont liés.
aux mutations ponctuelles. En raison de
cette variabilité importante, la probabilité
qu'un individu donné porte deux versions
différentes de RFLP sur deux chromo-
somes homologues est notable ; par une
hybridation de Southern, on détectera
deux fragments de restriction de tailles
différentes, pour les deux chromosomes.
Il est plus facile de réaliser systémati-
quement des sondes associées à des
séquences répétées que des sondes asso-
ciées à des mutations ponctuelles. Alec
Jeffreys, de l'Université de Leicester, a
découvert des ressemblances entre les
séquences répétées présentes en de nom-
breux loci du génome. La signification
évolutive de ces ressemblances reste obs-
cure, mais les homologies de séquence,
sur ces loci, permettent dans certaines
conditions d'utiliser une sonde complé-
mentaire d'un locus portant des
séquences répétées pour isoler des sondes
d'autres loci à partir d'une banque d'ADN
cloné. Sur les quelque 600 marqueurs
déterminés dans notre laboratoire, par
exemple, 300 correspondent à des varia-
tions du nombre de séquences répétées.
La cartographie
du génome
De tels marqueurs servent aussi bien à
la cartographie générale des chromosomes
qu'au repérage des gènes de maladies par-
ticulières. Sans carte chromosomique, la
recherche d'un marqueur corrélé avec une
maladie est parfois très hasardeuse
quand on ne connaît rien de la localisation
chromosomique du gène responsable
d'une maladie et que l'on ignore la posi-
tion des marqueurs transmis en même
temps que ce gène dans les familles
atteintes, il arrive que l'on étudie des
dizaines de marqueurs éloignés du gène
mutant et que l'on néglige une région
située à proximité. Cependant l'analyse de
liaison a de beaux succès à son actif.
Quand on sait sur quel chromosome
se trouve le gène visé, le nombre de mar-
queurs à utiliser diminue de plusieurs
centaines à une demi-douzaine. Les
maladies génétiques qui frappent presque
exclusivement les hommes et qui sont
transmises par la mère, par exemple, sont
généralement dues à des gènes récessifs
portés par le chromosome sexuel X (la
mère, qui possède deux chromosomes X,
peut posséder un gène sain dominant et
être en parfaite santé ; si son fils hérite du
chromosome X portant la mutation, il
sera malade, car il ne possède, lui, qu'un
seul chromosome X) ; pour localiser le
gène déficient, il suffit d'utiliser des mar-
: queurs du chromosome X.
Les gènes de maladies liées au chro-
mosome X furent les premiers localisés
par analyse de RFLP. Le tout premier fut le
gène de la myopathie de Duchenne et,
probablement aussi, de la myopathie de
Becker : ce travail fut l'oeuvre de Kay
Davies, de l'Université d'Oxford, et de
Robert Williamson, de l'Hôpital St. Mary,
à Londres. Aujourd'hui un nombre crois-
sant de maladies autosomiques (liées aux
22 paires de chromosomes non sexuels)
sont étudiées par analyse de liaison.
La maladie de Huntington fut la pre-
mière maladie autosomique pour laquelle
on trouva une liaison avec un marqueur :
James Gusella et ses collaborateurs de
l'Ecole de médecine de Harvard ont étudié
des familles atteintes par la maladie, qui

4. LA LIAISON entre le gène d'une maladie et un marqueur apparaît (en rouge) ; l'autre parent est en bonne santé et a porte deux copies
quand on étudie l'histoire familiale de la maladie. On a représenté ici du gène normal. Les enfants qui possèdent le gène de la maladie héri-
les caractéristiques génétiques d'un couple et de leurs enfants. Un de tent généralement aussi de l'allèle du marqueur (en violet) provenant
parents souffre d'une maladie génétique causée par un allèle mutant du parent malade, car le gène de la maladie et le marqueur sont liés.
5. LES MARQUEURS sont les sites où la séquence en paires de bases fragments de restriction issus de chaque chromosome est différente.
de l'ADN diffère souvent entre deux chromosomes homologues ; ils Une sonde d'ADN, dont la séquence est complémentaire de celle du
correspondent à des RFLP (polymorphismes de longueur des frag- marqueur, permet de détecter les fragments préalablement séparés
ments de restriction). Pourles détecter, on coupe l'ADNpar électrophorèse
avec une (en haut à droite). Une autre catégorie de mar-
enzyme de restriction qui agit partout où elle trouve la séquence qui queurs est caractérisée par une variation du nombre des «séquences
lui est spécifique (ici la séquence TCGA). Pour certains marqueurs, répétées» du génome (VNTR) : la distance entre deux sites de restric-
une différence de séquence fait disparaître un site de restriction sur tion est différente entre les deux chromosomes homologues, et la taille
l'un des chromosomes homologues (en haut à gauche) ; les tailles des des fragments séparés par électrophorèse diffère (en bas à droite).

vivaient aux Etats-Unis et près du lac
Maracaibo, au Vénézuéla ; ils ont eu la
chance de ne tester que huit marqueurs
avant d'en trouver un qui soit lié à la mala-
die. Puis plusieurs équipes ont découvert
des marqueurs génétiques de la mucovisci-
dose, de la neurofibromatose (également
appelée maladie de von Recklinghausen,
la neurofibromatose est caractérisée par
des taches « café au lait » sur la peau et
l'apparition de tumeurs osseuses et ner-
veuses) et de la polypose colique familiale
(caractérisée par l'apparition de nombreux
polypes du côlon dégénérant en cancers).
On dispose même de résultats encoura-
geants pour certaines formes familiales de
la maladie d'Alzheimer et de psychoses
maniaco-dépressives.
Du gène
marqueur au
L'analyse de liaison conduit parfois à
l'identification du gène lui-même, ce qui
constitue le point de départ de l'étude du
mécanisme moléculaire de la maladie. En
clonant le gène et en déterminant sa
séquence nucléotidique (la séquence en
paires de bases), on peut déduire la compo-
sition chimique de la protéine codée par le
gène et l'on parvient parfois à caractériser
l'anomalie biochimique responsable de la
maladie. En effet, si l'on synthétise la pro-
téine, on peut réaliser des anticorps spéci-
fiques de cette protéine en l'injectant à des
animaux ; après un marquage, ces anti-
corps révèlent la répartition de la protéine
dans l'organisme. Cette approche conduit
parfois à la mise au point d'un traitement.
Cependant la localisation initiale du
gène étudié est souvent trop imprécise
pour que l'on isole le gène par des tech-
niques courantes de biologie moléculaire.
Ainsi la fréquence de recombinaison
entre le gène de la chorée de Huntington
et le premier marqueur qui lui a été attri-
bué était égale à cinq pour cent, ce qui
indique que ce marqueur se trouve à
environ cinq millions de paires de bases
du gène de la maladie ; or pour identifier
et pour cloner le gène déficient, on doit
localiser le gène à moins d'un million de
paires de bases près. On peut donc cloner
un gène quand on a trouvé des marqueurs
dont la fréquence de recombinaison avec
ce gène est inférieure à un pour cent,
mais l'idéal est naturellement de trouver
un marqueur adjacent au gène étudié.
On connaît aujourd'hui de tels mar-
queurs pour la mucoviscidose, pour la
neurofibromatose, pour la polypose
colique familiale et pour la chorée de
Huntington. La recherche des gènes défi-
cients est l'étape suivante, et la tactique
générale consiste à cribler une banque
d'ADN, c'est-à-dire à rechercher dans une
collection de segments de chromosomes
clonés un segment d'ADN reconnu par la
sonde spécifique de chaque marqueur ;
les segments que l'on détecte de cette
façon-en principe, ils renferment le
marqueur et le gène recherché-sont
ensuite coupés en morceaux plus petits,
clonés, et l'on teste leur activité biolo-
gique : on les utilise pour détecter des
ARN messagers (dont la présence dans une
cellule indique que le gène est exprimé)
dans les tissus atteints par la maladie. Si
l'une de ces sondes détecte de l'ARN mes-
sager propre aux tissus malades, c'est que
cette sonde renferme vraisemblablement
une partie ou la totalité du gène déficient.
On a utilisé une stratégie différente
pour identifier le gène responsable de la
myopathie de Duchenne. Chez de nom-
breuses personnes atteintes de cette mala-
die, on observe des délétions-des seg-
ments manquants-dans la région du
chromosome X déterminée par K. Davies
et R. Williamson ; la maladie peut ainsi
résulter de l'absence d'une partie ou de la
totalité d'un gène normal. En identifiant
une délétion commune chez tous les indi-
vidus souffrant de la maladie, Louis
Kunkel et ses collègues de l'Ecole de
médecine de Harvard ont isolé et cloné le
gène correspondant.
 Parfois l'analyse de liaison indique le
mécanisme pathologique d'une maladie
avant que le gène déficient soit identifié :
quand le marqueur est proche d'un gène
dont on connaît la fonction, on peut soup-
çonner celui-ci d'être responsable de la
maladie. Le marqueur de la neurofibro-
matose, par exemple, se trouve sur le
chromosome 17, qui porte également le
gène du récepteur du facteur de crois-
sance du nerf (ce facteur est une sub-
stance indispensable au développement
des cellules nerveuses) ; on a d'abord
soupçonné qu'une mutation de ce gène
soit à l'origine de la maladie, mais on a
ultérieurement découvert qu'il se trouvait
assez loin du locus de la maladie.
Aujourd'hui l'attention s'est portée sur
d'autres gènes du chromosome 17.
Quand un marqueur est étroitement
lié au gène d'une maladie, on peut envi-
sager un test de dépistage pré-ou postna-
tal. Du fait de la fréquence et du caractère
inéluctable de nombreuses maladies
génétiques, ces tests sont très importants.
Dans les descendants des populations
d'Europe du Nord, par exemple, un indi-
vidu sur 20 porte le gène de la mucovis-
cidose ; comme la mutation est récessive,
le porteur n'est pas malade, mais quand
deux porteurs font un enfant, la probabi-
lité que ce dernier hérite simultanément
des deux gènes déficients-et qu'il soit
malade-est égale à un quart. La chorée
de Huntington est due à un gène domi-
nant (la maladie apparaît même quand le
gène homologue est normal), mais les
symptômes n'apparaissent qu'entre 30 et
45 ans, après que la victime a incons-
ciemment transmis la maladie à la moitié
de ses enfants.
Avant d'établir la présence d'un gène
anormal chez un sujet à risque, il faut
étudier l'ADN des membres de la famille,
6. UNE ANALYSE DE RFLP est effectuée sur
un échantillon de sang. On extrait l'ADN des
globules blancs et on le découpe à l'aide
d'une enzyme de restriction. Une électropho-
rèse sur gel permet de classer les fragments
de restriction par ordre de taille. Puis on
détecte le RFLP par une hybridation de
Southern : on sépare les deux brins d'ADN et
on les fixe sur une membrane de nylon ; on
dépose alors une sonde complémentaire du
RFLP marquée radioactivement. La sonde
s'hybride au fragment issu du locus corres-
pondant, et un film radiographique placé sur
la membrane révèle les fragments radioactifs.
On détecte ainsi les différentes versions du
marqueur RFLP présentes dans l'échantillon.
sains ou malades : on recherche quel est
l'allèle du marqueur associé à la maladie
(ou les allèles, dans le cas des maladies
récessives, qui n'apparaissent qu'en pré-
sence de deux copies du gène anormal) :
quand l'allèle révélateur est présent dans
l'ADN d'un des parents, ce dernier risque
de transmettre la maladie. On peut
notamment prélever de l'ADN chez un
foetus peu après la conception et détermi-
ner s'il porte la maladie, afin que les
parents décident éventuellement l'arrêt
de la grossesse. A ce propos, on observe
que le développement du diagnostic pré-
natal, chez les familles à risques, contri-
bue à une augmentation du nombre des
naissances, car beaucoup de couples ne
font d'enfants que s'ils sont certains que
ceux-ci mèneront une vie normale.
L'intérêt de la carte
génétique
En même temps que l'on cherchait des
marqueurs associés aux maladies, on a
dressé des cartes chromosomiques locali-
sant à la fois des marqueurs arbitraires et
des gènes ordinaires caractérisés. La carto-
graphie par analyse de liaison constitue un
programme systématique de recherche des
gènes mutants. Une carte de liaison com-
plète permettra de localiser le gène d'une
maladie en testant un ensemble de mar-
queurs présents à intervalles réguliers sur
les chromosomes ; après avoir découvert
une liaison localisant le gène recherché à
un segment chromosomique particulier, on
testera des lots de marqueurs plus précis.
Par cette méthode, on caractérisera
plus rapidement les déficits monogé-
niques, et l'on déterminera les bases
génétiques de maladies dues à plusieurs
gènes déficients. Ces cartes aideront à
étudier simultanément la transmission de
nombreux marqueurs et la génétique de
maladies dont la prédisposition semble
héréditaire, comme le diabète, les mala-
dies cardiovasculaires et certains cancers ;
on espère ainsi isoler les gènes prédispo-
sant à ces maladies.
L'établissement de cartes détaillées
reste fondé sur l'analyse de liaison : la
différence, c'est que l'on étudie non seu-
lement les liaisons entre marqueurs et
maladies, mais aussi les liaisons entre
couples de marqueurs. Quand des allèles
de marqueurs différents se transmettent
généralement ensemble, ils sont souvent
situés sur le même chromosome, et la fré-
quence de leur recombinaison indique
leur « distance génétique ».
Le concept de cartographie chromo-
somique par analyse de liaison est
simple, mais la gestion et l'analyse des
données sont laborieuses. Pour localiser Au début de notre programme de car- observe les allèles correspondants de A et
un gène quelconque à 10 ou 20 millions tographie, J.-M. Lalouel, à Paris, a souli- C, mais un nouvel allèle de B, et chez un
de paires de bases près, il faut utiliser une gné l'importance des méthodes statistiques autre enfant, I'allèle initial de B est accom-
carte du génome fondée sur 100 à 200 d'analyse des résultats et des programmes pagné de deux allèles différents de A et C.
marqueurs régulièrement espacés ; et informatiques ; avec Mark Lathrop, il a On conclut que l'ordre A-B-C est
pour trouver des marqueurs régulière- créé des algorithmes et des programmes improbable, car il résulte, dans les deux
ment espacés, il faut initialement tester gérant le nombre considérable de résultats exceptions observées, d'une double
un nombre bien supérieur de marqueurs, expérimentaux et analysant les observa- recombinaison : entre A et B, et entre B et
choisis au hasard : il faut analyser l'ADN tions relatives à plusieurs marqueurs. C ; or une seule recombinaison permet
de centaines d'individus issus de plu- d'expliquer les observations si l'ordre est
sieurs dizaines de grandes familles et étu- Vers carte complète soit A-C-B, soit B-A-C.
une
dier la transmission de chaque marqueur. Nos programmes informatiques utili-
L'analyse des résultats est d'autant Identifier des marqueurs liés n'est pas sent cette stratégie pour calculer l'ordre le
plus compliquée que deux tiers des mar- le but ultime ; il faut également détermi- plus probable d'un ensemble de marqueurs
queurs choisis ne sont pas informatifs : les ner leur ordre sur le chromosome. En prin- liés. Connaissant l'ordre probable de plu-
individus étudiés possèdent souvent deux cipe, on pourrait calculer la probabilité de sieurs marqueurs liés, nous déterminons la
allèles identiques d'un marqueur, et tous les arrangements possibles et ne rete- localisation chromosomique de ces mar-
aucune liaison n'est repérable chez la des- nir que le plus probable, mais avec seule- queurs en hybridant l'un des marqueurs
cendance. De surcroît, même quand deux ment 15 marqueurs liés, il existe 6, 5 x 10" avec l'ensemble des chromosomes intacts.
marqueurs sont liés, on ne peut souvent arrangements ! En pratique, on élimine Progressivement on réunit entre eux
pas connaître leur « phase », c'est-à-dire la d'emblée des groupes d'arrangements les différents groupes de liaison et l'on
répartition de leurs allèles entre les deux improbables en considérant des groupes dresse la carte d'un chromosome. Sur les
chromosomes homologues ; or si l'on de loci, trois par trois, par exemple. cartes chromosomiques, la distance géné-
ignore quels allèles sont sur le même chro- Examinons le raisonnement utilisé en tique varie comme la distance physique (le
mosome d'un parent, on ne peut détermi- supposant que des allèles particuliers de nombre de paires de bases), mais les deux
ner les recombinaisons entre les mar- trois marqueurs liés (A, B et C) dans une distances ne sont pas égales. Nous avons
queurs, chez l'enfant. Ces obstacles sont famille nombreuse, sont souvent transmis notamment montré que la fréquence de
réduits quand on étudie des familles nom- ensemble : soit les enfants les possèdent recombinaison entre deux marqueurs dif-
breuses. Nous avons eu la chance que plus tous les trois, soit ils n'en possèdent aucun. fere souvent selon le sexe : la probabilité
de 50 familles de l'Utah d'au moins huit Chez un enfant donné, cependant, on que deux marqueurs se recombinent, lors
enfants nous aient donné leur sang, à par-
tir duquel nous avons cultivé des lignées
cellulaires permanentes et extrait l'ADN.
Grâce au grand nombre d'enfants,
dans ces familles, on a suivi les chromo-
somes parentaux à travers un grand
nombre de méioses et augmenté la préci-
sion des calculs de fréquences de recom-
binaison. En outre, comme les quatre
grands-parents de la plupart des familles
étudiées étaient vivants, on a souvent
déterminé la phase des marqueurs chez
les parents : sachant, par exemple, que
l'allèle 1 du marqueur A et l'allèle 3 du
marqueur B provenaient d'un même
grand-père, on a déduit que son enfant-
un des parents-porte vraisemblablement
ces deux allèles sur le même chromo-
some si les marqueurs sont liés.
Même avec ces familles nombreuses,
la quantité de données est limitée, et les
cartes sont établies à partir de calculs de
probabilités. Des méthodes statistiques
permettent de déterminer la fréquence de
recombinaison la plus probable-et la
distance génétique-entre deux mar-
queurs, à partir de l'analyse des profils de
transmission. Lorsque la fréquence de
recombinaison entre deux marqueurs est
égale à 50 pour cent, ces marqueurs ne 7. LA TRANSMISSION D'UN MARQUEUR RFLP est étudiée sur cette famille de trois généra-
sont pas liés, mais lorsque la fréquence tions. Le marqueur possède de nombreux allèles, caractérisés chacun par un fragment de
est statistiquement inférieure (dix pour restriction d'une taille particulière. Chaque individu (les carrés représentent des hommes,
cent par exemple), la probabilité qu'ils les cercles, les femmes) porte deux allèles différents du marqueur, un sur chaque chromo-
soient liés augmente. some homologue ; les enfants reçoivent un allèle de chaque parent.
de la méiose, peut être différente selon
qu'ils se trouvent sur le chromosome
maternel ou sur le chromosome paternel.
Sur le chromosome 13, par exemple,
les fréquences de recombinaison sont plu-
sieurs fois supérieureschez la femme ; sur
le chromosome 11, c'est l'inverse sur une
petite région, tandis que les fréquences de
recombinaison sont égales pour les deux
sexes, sur un segment adjacent au pre-
mier. On ignore le mécanisme molécu-
laire de ces différences, et nous avons dû
réaliser deux cartes chromosomiques, une
pour chaque sexe ; sur ces deux cartes,
l'ordre des marqueurs est le même, mais
les distances génétiques sont différentes.
La cartographie chromosomique par
analyse de liaison doit être une collabora-
tion : tout le monde cherche des repères
« géographiques » surle même « terrain ».
Les marqueurs étudiés dans un labora-
toire complètent en général ceux des
autres laboratoires et permettent parfois
de réaliser la jonction entre plusieurs
groupes de liaison. En fondant le Centre
d'étude du polymorphisme humain
(CEPH) à Paris, Jean Dausset a créé un
cadre de coopération intemationale : le
CEPHréunit, stocke et distribue l'ADN de
40 familles ; la banque du CEPHest prin-
cipalement fondée sur nos échantillons
de l'Utah, mais elle contient également
l'ADN provenant d'autres laboratoires.
Les chercheurs du monde entier peu-
vent obtenir des collections complètes
d'ADN par le CEPH; en contrepartie, ils
communiquent leurs résultats et font par-
venir leurs marqueurs au CEPH,qui les
met à la disposition de tous.
Grâce à cette collaboration internatio-
nale, une carte génomique de haute réso-
lution sera bientôt disponible, et le
génome humain, qui était encore récem-
ment un territoire inconnu, sera bientôt
une « province » bien administrée ; la
majorité des gènes de maladie qui ne sont
pas encore localisés le seront. Cette carte
est également un outil indispensable pour
l'entreprise extraordinaire que sera le
séquençagecomplet du génome humain ;
on séquencerad'abord de petits segments
répartis sur les chromosomes, puis on
localisera ces segments grâce aux mar-
queurs qu'ils contiennent.
 CARTOGRAPHIE
LA
GÉNOME
DU
Nous
avons besoin de cartes pour
localiser les gènes, en particulier les
gènes défectueux. Les Programmes
génome ont un double objectif : définir
l'inventaire complet des gènes d'un
génome, y compris ceux des petits
génomes (bactéries et levures), et procu-
rer un outil de travail aux médecins
généticiens. Le Généthon, financé à plus
de 90 pour cent par le Téléthon, s'inté-
resse exclusivement à la cartographie du
génome humain, dans l'intention de
comprendre les maladies humaines.
Durant nombre d'années, nous
sommes restés impuissants devant les
maladies génétiques, car nous ne savions
pas analyser !'ADN. Il a fallu attendre les
années 1980 et les progrès de la géné-
tique moléculaire pour commencer à
identifier des gènes de maladies : la myo-
pathie de Duchenne, vers 1986, le réti-
noblastome, à la même époque, et
quelques autres maladies. Néanmoins,
nous progressions avec lenteur et nos
cartes restaient imprécises. Aujourd'hui
le rythme des identifications et des locali-
sations des gènes s'accélère : les tech-
niques se sont améliorées et de nou-
veaux outils ont été créés. II existe deux
types de cartes : la carte génétique et la
carte physique.
La
carte génétique est un ensemble
de repères qui permettent d'observer la
transmission du génome de génération
en génération. Une copie de notre
génome, formée de portions reçues de
nos parents, est transmise à nos enfants.
Pour délimiter les portions qui sont
transmises de notre mère ou de notre
père vers nos enfants, nous avons
recours à des marqueurs polymorphes :
ces marqueurs sont des caractères héré-
ditaires qui existent sous des formes
multiples dans la population humaine. Ils
permettent de baliser le génome, de
repérer les régions du génome qui sont
liées (transmises ensemble).
Les maladies génétiques sont des
caractères polymorphes : des études sta-
tistiques sur des familles où se transmet
une maladie génétique permettent de
déterminer la région d'un chromosome
qui contient le gène défectueux. Les
Le deuxième
type de carte, la carte
physique, permet de reconstituer un
chromosome entier : il s'agit d'une collec-
HUMAIN
tion de segments d'ADN humain, qui se
chevauchent et qui sont introduits dans
des chromosomes artificiels de levures ou
Jean Weissenbach YAC (Yeast Artipciol Chromosomes). Le
groupe de Daniel Cohen a reconstitué
l'enchaînement de ces fragments par dif-
férentes techniques, notamment en
s'appuyant sur la carte génétique : ces
groupes sanguins et les groupes tissu-
laires HLA constituent d'autres mar- chercheurs ont reconnu les YAC conte-
queurs. Toutefois, ces marqueurs sont nant des repères de la carte génétique et
peu nombreux, et leur variabilité selon ils les ont mis en correspondance.
les individus est faible. Aujourd'hui la carte physique couvre
Au début des années ! 980. ! a décou- environ 90 pour cent du génome humain.
verte de séquences nucléotidiques de Ces cartes sont précieuses pour
meilleure spécificité individuelle a contri- rechercher le gène d'une maladie géné-
bué à un meilleur marquage du génome. tique. On commence par définir un
On met en évidence la variation de ces intervalle autour de ce gène, de plus en
séquences d'un individu à un autre en plus étroit, puis on identifie les segments
découpant la molécule d'ADN sur des d'ADN qu'il contient, à l'aide des frag-
sites reconnus par une enzyme de res- ments d'ADN chevauchant des YAC utili-
triction ; une variation dans la séquence sés comme sonde : ces fragments sont
supprime ou crée un site de restriction, dénaturés, puis marqués par un élément
ce qui change la longueur du fragment radioactif, et ils ne s'hybrident qu'aux
qui la contient (d'où le nom de RFLP, brins de séquences complémentaires, ce
pour polymorphisme de longueur des qui permet de les repérer. La région du
fragments de restriction). génome qui comporte un gène défec-
Ces marqueurs ont ensuite été com- tueux est ainsi passée au peigne fin. Au
plétés par les «minisatellites», des cours de l'année 1993, le Généthon a
séquences constituées de répétitions contribué à l'identification, par cette
d'un même motif de plusieurs nucléo- méthode, d'une vingtaine de gènes res-
tides (jusqu'à une centaine). Hélas, ces ponsables de maladies.
minisatellites sont surtout regroupés aux
extrémités des chromosomes ; ils ne Les généticiens projettent d'inven-
permettent donc pas une identification torier les gènes existant tout le long de
sur la totalité du génome. Au Généthon, la molécule d'ADN. L'une des méthodes
nous avons beaucoup augmenté la préci- utilisées consiste à séquencer les ADN
sion de la localisation des gènes à l'aide complémentaires qui correspondent aux
d'un nouveau type de marqueurs : les fractions exprimées du génome : il s'agit
microsatellites, formés de la répétition
d'un à cinq nucléotides en 10 à 30
exemplaires et répartis en grand nombre
sur l'ensemble du génome.
Les positions et les distances relatives
entre deux repères sont évaluées par
une analyse de la transmission des carac-
tères dans une famille : lors de la pro-
duction des gamètes (spermatozoïdes
ou ovules), deux chromosomes homo-
logues échangent certains de leurs seg-
ments ; ces recombinaisons sont fré-
quentes entre deux repères éloignés l'un
de l'autre, et rares lorsque les deux
repères sont très proches sur le chro-
mosome (on dit que ces repères sont
liés). Un non-généticien appréhende
avec quelque difficulté le concept de
carte génétique ; il est vrai que nous
déterminons des positions relatives, et
non absolues, à partir de statistiques
conduisant à l'estimation des fréquences
de recombinaison.
 de déterminer, base par base, l'ordre des
nucléotides de segments d'ADN copiés à
partir de l'ARN messager, qui porte
l'information nécessaire à la fabrication
d'une protéine. Puis, ces fragments
séquencés sont cartographiés (repérés
dans le génome) et intégrés aux chro-
mosomes artificiels de levure. Pour l'ins-
tant, on progresse peu. Le séquençage
est rapide (des dizaines de milliers de
fragments d'ADN complémentaire ont
été séquencés), mais la cartographie est
lente : seules quelques centaines, voire
quelques milliers de ces séquences ont
été localisées. II reste un travail énorme
de cartographie de ces ADN complémen-
taires, qui occupera nombre de cher-
cheurs durant les prochaines années.
Malheureusement, nous ne connais-
sons pas la fraction des gènes qui pour-
ront être identifiés et localisés de cette
manière. Représentera-t-elle 50 pour
cent du génome ? 80 pour cent ? Moins ?
Plus ? Nous n'en avons pas la moindre
idée. 11est certain que les gènes non
exprimés ou faiblement exprimés dans
les tissus étudiés ne pourront pas être
séquencés par cette approche. II existe
ainsi différents obstacles à la réalisation
d'un inventaire exhaustif des gènes à par-
tir des ADNcomplémentaires.
Le but de la cartographie est la
création d'outils de travail à l'usage des
généticiens ; ceux-ci n'ont nullement la
prétention de comprendre comment
l'homme fonctionne. Leur démarche
consiste à explorer un domaine inconnu,
par l'identification des gènes anormaux
et par leur comparaison avec les gènes
normaux. En outre, lorsqu'un gène res-
ponsable d'une maladie est identifié, il
n'est pas toujours nécessaire de
connaître sa fonction pour imaginer une
thérapie génique : si un gène fait défaut,
l'introduction d'une copie fonctionnelle
de ce gène dans les cellules du patient,
devrait leur permettre de synthétiser à
nouveau la protéine manquante.
La cartographie du génome humain
représente toutefois une étape importante
vers une meilleure compréhension des
fonctions biologiques. C'est ainsi que de
nouvelles protéines ont été découvertes,
dont il faudra déterminer les fonctions. On
a également trouvé de nouveaux méca-
nismes de mutation : il y a trois ans, on a
décelé un phénomène d'amplification de
séquences contenant trois nucléotides,
répétées dans certains gènes ; ces répéti-
tions trinucléotidiques interviennent, par
exemple, dans le syndrome du chromo-
some X fragile, la myotonie de Steinert, la
chorée de Huntington, le syndrome de
Kennedy ; ce sont presque toujours des
maladies neurologiques, et ce sont tou-
jours des maladies dominantes (une muta-
tion sur une seule copie du gène suffit à
provoquer la maladie). Cette relation de
cause à effets constitue sûrement une dé
pour appréhender le vivant.
Les cartes du génome humain permet-
tent, par ailleurs,de reconnaître des gènes
identiques à ceux de l'espèce humaine
dans le génome d'organismes apparentés
tels que la souris. Ces organismes subis-
sent alors des expériences de génie géné-
tique : transgenèse, inactivation ciblée des
gènes par recombinaison homologue ; on
examine ainsi le phénotype d'un gène
inactivé ou surexprimé, et on se forge une
idée sur la fonction de ce gène.
La
toute première application
sociale de ces techniques de criblage du
génome sera le diagnostic, qui permet
une classification des maladies : des
symptômes proches peuvent corres-
pondre à des dysfonctionnements de
gènes distincts. Bien sûr, les maladies
mendéliennes (qui sont dues au défaut
d'un seul gène et dont l'hérédité suit les
lois de Mendel) sont assez rares. Outre
ces maladies, il existe les maladies dites
multifactorielles (de causes génétiques et
environnementales) : ce sont les maladies
communes telles que le diabète, l'artério-
sclérose, les maladies cardio-vasculaires,
les maladies neuropsychiatriques. Pour
ces maladies, qui concement une grande
partie de la population, on découvre des
mutations de gènes qui sont des facteurs
à risques : leur diagnostic ouvrira la voie à
de possibles actions préventives.
Nous devons d'ailleurs être vigilants
quant aux risques d'utilisations plus ou
moins honnêtes de ces connaissances: je
pense en particulier aux compagnies
d'assurances, qui aimeraient connaître le
génotype de leurs assurés,afin de modu-
ler leurs tarifs en fonction d'éventuelles
prédispositions à une maladie. Il faut rap-
peler que les compagnies d'assurances
pratiquent d'ores et déjà des tests de
phénotype, à mon sens, abusifs : les exa-
mens médicaux, les électrocardio-
grammes sélectionnent les individus. La
génétique leur procurera un outil plus
précis encore. Il est donc urgent de légi-
férer ces pratiques pernicieuses.
Jean WEISSENBACH est
directeurde rechercheou CNRS
et responsabledu projet de cartographie
génétique au Généthon.
Les différentes cartes du génome. La
carte cytogénétique (a) montre les
bandes que l'on observe au micro-
scope, le long du chromosome, après
l'avoir coloré. La carte génétique (b)
est fondée sur l'analyse de la transmis-
sion des marqueurs au sein de familles.
Les traits horizontaux représentent les
positions des marqueurs polymorphes
d'ADN (de séquences variant d'un indi-
vidu à l'autre). La carte physique (c)
est une collection de segments d'ADN
isolés physiquement (les traits verti-
caux), et introduits dans des micro-
organismes (bactéries ou levures). Ces
segments se chevauchent et permet-
tent ainsi de reconstituer la totalité du
génome. Enfin, la séquence (d) permet
de connaître l'enchaînement des
nucléotides des deux brins de l'ADN.
 Le déchiffrage du génome
L'information du génome humain, déchiffrée
dans le cadre d'un projet international, est stockée
dans les banques de données informatiques.
Le choix des méthodes de stockage détermine
les retombées du colossal travail entrepris.
L'ADNdes chromosomes deux problèmes : sous quelle forme stoc-
humains est un immense ker les informations ? Comment les gérer
document dont le texte et les consulter ? Tel un oracle, le
n'est rédigé qu'à l'aide de génome humain ne livrera ses secrets que
quatre lettres C, G, A et T : si on l'interroge astucieusement.
chaque brin d'ADN est un enchaînementde
nucléotides contenant les bases cytosine, Les objectifs du
guanine, adénineet thymine. Les informa- génome
programme
tions génétiques tiennent facilement dans
le noyau des cellules, mais, si elles for- Ce programme a plusieurs objectifs :
maient un livre, on mettrait près de 25 ans établir les cartes génétique et physique de
pour lire ses 3,5 milliards de caractères. chaque chromosome, rechercher de nou-
On connaît aujourd'hui moins de veaux marqueurs génétiques et améliorer
10 pour cent des 50 000 à 100 000 gènes les séquenceursautomatiques de l'ADN.
du génome humain, mais les participants Cartographier les chromosomes, tout
du Programme international d'étude du d'abord, consiste à déterminer l'ordre des
génome (Programme génome) espèrent gènes et des marqueurs génétiques (des
achever le décodage de tous ces gènes séquences d'ADN connues, situées toutes
vers l'an 2005. Les gènes, qui sont les les 100 000 paires de bases en moyenne)
segments d'ADN codant des protéines, ne le long de ces chromosomes. Pour dresser
constituent qu'un à deux pour cent du les cartes génétiques, on étudie les recom-
génome humain ; le reste est de l'ADN binaisons (les échanges de fragments
non codant. d'ADN) entre deux séquences d'ADN, au
Le déchiffrage coûtera cher : sur cours de la transmission héréditaire : deux
15 ans, le gouvernement américain y séquences d'ADN sont d'autant plus
consacrera près de trois milliards de dol- proches qu'elles se recombinent rarement.
lars, et la France (l'État et les entreprises Les cartes physiques sont des suites de
privées) environ quatre milliards de francs ; courts segmentsd'ADN précisémentordon-
les États-Unis et la France sont les deux nés. Pour mesurer la distance qui sépare
pays les plus engagés financièrement dans ces segments(exprimée en kilobases), une
le programme. Toutefois les institutions de des méthodes les plus rapides consiste à
financement ont des gagesde succès : plus cloner (à reproduire à l'infini) des seg-
de 70 millions de nucléotides ont déjà été ments d'ADN suffisamment longs pour
séquencés,et la longueur des séquences qu'ils se chevauchent, puis à comparer, à
déchiffrées double tous les deux ans. l'aide d'un ordinateur, le contenu partiel de
Ces données pléthoriques resteront leur séquence-pour connaître ce contenu
cependant muettes si les biologistes ne partiel, nommé «empreinte génomique»,
peuvent les consulter, les comparer aux on coupe chaque segment d'ADN par des
autres connaissances génétiques, les enzymes de restriction : la taille des diffé-
interpréter, les tester et les analyser en rents fragments ainsi obtenus dépend de la
détail. Les informaticiens qui ont la séquence du segment. Deux segments se
charge de classer ces informations dans chevauchent d'autant plus que leurs
des banques de données doivent résoudre empreintes génomiques se ressemblent.
Deborah Erickson
L'objectif ultime est l'établissement
d'un troisième type de carte : la carte bio-
chimique, c'est-à-dire la séquence com-
plète des bases C, G, A, T des chromo-
somes. Cet objectif ne sera accessible
que lorsque les techniques d'analyse du
génome auront considérablement pro-
gressé,c'est-à-dire pas avant dix ans.
On ne se limitera pas à l'étude du
génome humain : on séquenceraaussi le
génome d'organismes modèles comme la
bactérie Escherichia coli, la levure, la dro-
sophile (la mouche du vinaigre), la souris
et certains nématodes. La connaissancede
ces génomesfacilitera l'analyse biologique
de ces organismes et, surtout, permettra de
rechercher les homologies parfois surpre-
nantes entre les différentes espèces. Par
exemple, le locus ubx, ou ultrabithorax,
regroupe un ensemble de gènes qui gou-
vernent le développement du plan corporel
de la drosophile ; or un groupe de gènes
très semblable, chez l'Homme et chez la
souris, commande l'organisation du sys-
tème nerveux durant l'embryogenèse.
Grâce aux organismes modèles, on
identifiera la fonction des gènes en indui-
sant des mutations (des modifications de
la structure des gènes) et en observant les
conséquencesde ces mutations, ce qu'on
ne peut évidemment pas faire chez
l'Homme. Cependant les recherches de
nouvelles homologies entre espèces ne
seront possibles que si l'ensemble des
données génétiques est accessible à tous
les chercheurs, malgré les distances entre
laboratoires et malgré la disparité des
ordinateurs.
La construction des banques de don-
nées génétiques incombe souvent à des
chercheurs originaux, ni biologistes ni
informaticiens, et dont les formations ini-
tiales sont très variées : certains travaillè-
rent en physique théorique, d'autres en
zoologie ; peu de biologistes ont accepté
de se consacrer à l'aspect informatique
du programme, auquel 30 pour cent du
budget sera pourtant consacré.
Aujourd'hui les informaticiens du
Programme génome mettent au point et
apprennent à gérer les banques de don-
nées concernant les génomes. Sous quelle
forme doit-on stocker ces données ?
Comment interrogera-t-on les banques de
données : par des menus prédéterminés
ou par des protocoles plus lents mais plus
souples ? L'accès aux banques de don-
nées doit-il être possible par les réseaux
publics ou réservé aux utilisateurs de
réseaux spécialisés ?
La sélection des données
stockées
Même le choix des données à stocker
est difficile. Habituellement les biolo-
gistes consignent relativement peu de
faits dans leurs cahiers de laboratoire ;
les marges sont couvertes de gribouillis
illisibles et les taches de café signalent
parfois les pages importantes.
En revanche, les ordinateurs, linéaires
et rigides, tolèrent mal les fioritures et les
fantaisies de notation. Par ailleurs, les
MOLÉCULESD'ADN GÉNOMIQUE
précipitéesdans une solution alcoolisée.
données sont souvent disparates, elles
évoluent rapidement, et les constructeurs
de ces banques de données ne compren-
nent pas toujours ce qu'ils doivent stoc-
ker, parce qu'ils ignorent souvent ce que
les biologistes en attendent.
Pour faire face aux besoins variés des
chercheurs, les informations devront être
simultanément stockées dans plusieurs
banques de donnéesdifférentes. Un biolo-
giste moléculaire étudiant le cancer du
poumon, par exemple, recherchera dans
une petite région chromosomique des
oncogènes (c'est-à-dire des gènes
capables de déclencher des cancers), tan-
dis que d'autres chercheurs s'intéresse-
ront plutôt aux méthodes utilisées pour
localiser et séquencerces gènes. Anticiper
les besoins des chercheurs est difficile,
car les recherches progressent rapidement.
C'est pourquoi Elbert Branscomb et
ses collègues du laboratoire Lawrence
Livermore, en Californie, stockent le
maximum de données, même si elles sont
préliminaires. La banque de données
qu'ils consacrent aujourd'hui au chromo-
some 19 est détaillée, constamment mise
à jour et connue pour contenir des
erreurs, mais n'importe qui, n'importe
où, peut la consulter.
D'autres banques rassemblent, dans
un fichier central, des données impec-
cables, très fiables et présentées sous une
forme standardisée, facile à interroger.
Ainsi la banque de données de
l'Université Johns Hopkins pourra être
comparée à d'autres banques de données,
notamment au répertoire américain
Genbank des séquences d'ADN et de pro-
téines de plus de 3 000 espèces diffé-
 rentes, créé en 1982. La banque de don-
nées de l'Université Johns Hopkins est
avant tout un moyen de fournir rapide-
ment des informations nouvelles aux
chercheurs : ainsi les résultats présentés
lors d'un congrès auquel participaient plus
de 600 chercheurs,en août dernier, ont été
rentrés dans cette banque de données cinq
jours seulement après la fin du congrès.
Certaines banques de données n'enre-
gistrent que des informations génétiques
très particulières, telle la présence de
gènes codant des protéines en « doigts de
zinc »-ces protéines forment une poche
liant un atome métallique et commandent
l'expression d'autres gènes. D'autres sys-
tèmes encore, telle la banque de données
des généticiens étudiant le nématode
Caenorhabditis elegans, recensent les tra-
vaux des différentes équipes qui s'intéres-
sent à ce sujet : les chercheurs la consul-
tent pour éventuellement s'en inspirer.
Les banques de données
relationnelles
Pour faciliter la diffusion des don-
nées, les informaticiens du Programme
génome stockent généralement les résul-
tats des biologistes dans des banques de
données relationnelles, initialement
conçues pour des applications financières
et commerciales. Stockées sous une
forme standard, les données d'origine et
de nature variées peuvent être propagées
à travers les réseaux électroniques sans
autre traitement supplémentaire.
Les programmes des systèmes rela-
tionnels stockent les données dans des
tableaux analogues à ceux des feuilles de
calcul ; à mesure que les cases se remplis-
sent, on note leurs relations avec les autres
cases. Par exemple, une séquence d'ADN
stockée dans une case peut être reliée aux
méthodes de déchiffrage utilisées, à
l'espèce biologique dont elle provient, à
sa localisation sur les chromosomes ou,
éventuellement, au gène qu'elle contient.
Ces banques de données doivent être aussi
souples que possible et ne doivent exclure
aucun type de données, car on ignore
comment les chercheurs les exploiteront.
Toutefois la construction des systèmes
relationnels risque de devenir imprati-
cable : à mesure que les données s'accu-
mulent, les cases et leurs connexions se
multiplient. Aussi étudie-t-on également
d'autres systèmes, plus simples et plus
puissants, telles les banques de données
de type objet, où les données sont classées
en types d'objets, selon leurs relations
avec les objets des autres types et selon le
traitement qu'on peut leur faire subir ; les
nouvelles données sont décrites comme
des variations autour d'un objet déjà
stocké. On pense que ces systèmes sui-
vront plus facilement l'évolution de la
biologie.
Certains chercheurs estiment que la
standardisation des banques de données
sera la méthode la plus efficace et la plus
économique pour la gestion des données
du Programme génome. Ainsi le groupe de
David Lipman, au Centre américain
d'information biotechnologique, a stocké
dans une même banque les séquences
d'ADN,les séquencesprotéiques et les réfé-
rencesde nombreuses publications scienti-
fiques ; une série de questions permet
l'accès aux données de cette banque : on
peut connaître la liste de toutes les publica-
tions concernant une séquenced'ADN don-
née, ou obtenir des informations détaillées
sur la protéine codée par un gène.
D. Lipman espèrecréer prochainement
une banque de données beaucoup plus
étendue,qui serait mise à jour et distribuée
sur disque optique tous les deux mois. Les
chercheurs qui n'ont pas de gros centre
informatique ou qui ne sont pas connectés
en permanence aux réseaux informatiques
pourraient accéder à cette banque, qui
stockerait à la fois les cartes génétiques,
les cartes physiques et les structures tridi-
mensionnelles des protéines.
De nombreuses banques de données
s'organisent à travers le monde. En
octobre 1992, le Centre américain de
l'information biotechnologique a pris en
charge Genbank ; en 1993, la Fondation
américaine pour la recherche biologique,
à Washington, a créé une banque com-
mune sur les protéines ; le Laboratoire
européen de biologie moléculaire (EMBL),
à Heidelberg, diffuse déjà depuis 1982
une banque de séquencesgénétiques dont
le langage est compatible avec celui de
Genbank (ces deux banques peuvent
ainsi échanger leurs données) ; enfin il
existe aussi au Japon une banque de don-
nées sur l'ADN.
Le Centre américain de l'information
biotechnologique utilise un langage de
description standard des données, nommé
ASN-1 (c'est-à-dire « notation à syntaxe
abstraite», un langage qui obéit aux
normes internationales de l'iso). Rien
n'est stocké dans Genbank sans avoir été
préalablement traduit dans ce langage,
qui détermine aussi les modalités
d'échange entre les « agents », c'est-à-dire
les utilisateurs, les programmes, etc.
Avec ce langage, l'ordinateur stocke les
données dans des «valises», qu'il recon-
naît et place ensuite aux endroits appro-
priés-les valises vertes d'un côté, les
bleues de l'autre-sans connaître leur
contenu. La standardisation des données
facilitera la coopération avec des sociétés
informatiques.
Le Centre américain de l'information
biotechnologique a récemment émis un
appel d'offres pour la création de banques
de données qui seraient dérivées de la
Genbank et seraient spécialement adap-
tées à l'usage des immunologistes ou de
médecins d'autres disciplines. La Société
Hitachi a notamment semblé intéressée.
Toutefois l'utilisation d'un langage de
description standard semble prématurée à
beaucoup, qui pensent qu'un tel langage
n'est pas assez souple pour permettre de
nouveaux traitements des données : il ne
pourrait décrire l'ensemble des résultats
du Programme génome.
Le langage d'interrogation
standard
À la place de ce langage de descrip-
tion standard, certains laboratoires utili-
sent un langage d'interrogation standard,
nommé SQL, pour exploiter des banques
de données relationnelles. Dans un tel
langage, on peut formuler n'importe
quelle question, même si elle ne figure
pas dans un menu préétabli, et l'on
accède même aux données brutes des
laboratoires, en économisant le temps de
mise en forme et de publication.
L'efficacité du langage SQL a été
démontrée publiquement à l'occasion
d'une conférence qui s'est tenue à
l'automne 1991 : à partir d'une salle de
conférence, dans un hôtel, des terminaux
informatiques ont recherché en temps
réel, dans trois banques de données indé-
pendantes, des informations sur une
région chromosomique associée à la dys-
trophie musculaire ; les marqueurs géné-
tiques de cette région, leurs séquences et
les cartes physiques de cette région ont été
regroupés en un tournemain. En février
1992, des chercheurs ayant assisté à cette
conférence ont identifié le défaut géné-
tique à l'origine de la dystrophie myoto-
nique (la forme la plus fréquente de dys-
trophie musculaire) : la maladie résulte
des mutations successives d'un gène rare
transmis de génération en génération.
La standardisation des langages
d'interrogation est assez facile : il suffit
que les banques de données soient acces-
sibles par un réseau et qu'elles utilisent
les mêmes symboles pour désigner les
données (par exemple, les mêmes noms
de marqueurs et les mêmes numéros de
séquences). En revanche, ces banques de
données génétiques posent de nouveaux
problèmes : rapidement les chercheurs
risquent d'être dépassés par le nombre et
la variété de ces banques. C'est pourquoi
les principaux utilisateurs de ces banques
de données seront probablement des ordi-
nateurs, et non des chercheurs. Si l'on
demandait aujourd'hui la liste des gènes
connus sur le chromosome 21, on obtien-
drait déjà 220 réponses, mais dans
quelques années, la liste ne sera plus
manipulable à la main. Les banques
devront prévenir les utilisateurs lorsque
la réponse à une de leurs questions sera
trop longue pour être transmise en une
seule fois.
Pour que ces banques de données
génétiques soient accessibles à de nom-
breux utilisateurs, elles devront être gérées
par des serveurs puissants. Des systèmes
trop faibles constitueraient une fausse éco-
nomie, car, limitant le nombre d'accès, ils
ralentiraient les progrès de la biologie.
Parallèlement à ces problèmes
d'accessibilité, on étudie les outils de
gestion des données. Les programmes
classiques de gestion et de stockage de
l'information sont-ils appropriés ?
Certains jugent que les tableaux des
banques de données relationnelles sont
inadaptés aux données biologiques.
Les banques de type objet
Selon Nathan Goodman, de l'Institut
Whitehead, les données biologiques
seraient mieux représentéessi on les clas-
sait en types d'objets. Par exemple, les
marqueurs chromosomiques sont variés :
ce sont parfois de courtes séquences

LES MARQUEURS CHROMOSOMIQUES

Regardez les choses sous un autre angle» Ce conseil de sage
est certainement plus facile à donner qu'à mettre en pratique
-surtout lorsque les objets observés sont des chromosomes.
Les longs enchaînements de nucléotides qui forment l'ADNsont
si lassants que les chercheurs doivent apprendreaux ordinateurs
à y repérer les éléments intéressants. Certains programmes
savent notamment reconnaître des séquences d'ADN particu-
lières et les afficher sous la forme de symboles clairs.
On découvre de nouveaux concepts en repérant les gènes
avec des marqueurs de position : les sites de fixation de pro-
téines ou d'enzymes, par exemple, encadrent les gènes sur les
chromosomes. Ainsi les deux groupes de gènes, dans les rec-
tangles grisés ci-dessous, proviendraient d'un gène ancestral
commun : leur symétrie résulterait de l'inversion d'un fragment
d'ADN,au cours de l'Évolution, ou de l'insertion d'un rétrovirus
dans le chromosome.
De même, les bandes chromosomiques-qui correspondent
aux éléments caractéristiques des chromosomes-révèlent les
modifications subies par les chromosomes au cours de la
méiose. En comparant les bandes chromosomiques des per-
sonnes apparentées, on identifie les inversions, les délétions,
les insertions et les remaniements importants subis par l'ADN.
 LA REPRÉSENTATION DU GÉNOME
Par vocation, les chercheurs posent toujours les problèmes
en termes nouveaux. Leurs résultats, parfois inattendus,
sont inclassables dans les banques de données classiques, qui
ne stockent que certains types de résultats sous des formes
déterminées. Des banques de données plus souples s'adapte-
SOUS FORME D'OBJETS
soient les caractéristiques génétiques décrites : chaque carte
contiendrait des objets de taille et de position données. La
distance entre deux de ces objets indiquerait leur ordre relatif
sur le chromosome et le prochain objet rencontré dans un sens
donné. Dans une carte cytogénétique, comme celle d'une partie
proches des gènes, et parfois des frag- sagentun système où le chercheur listerait riens avec une précision qu'ils ne pou-
ments de restriction de taille polymorphe simplement les entrées et les sorties atten- vaient obtenir lorsque les séquencesd'ADN
(RFLP),c'est-à-dire des fragments dont la dues, et commanderait ensuite la construc- étaient isolées : en termes géographiques,
taille varie considérablement selon les tion d'une banque de donnéessur mesure. les contigs permettent de dire que Paris est
individus, après coupure de l'ADN par des entre Lille et Marseille. Les généticiens
enzymes spécifiques. Seules certaines La localisation des gènes localisent ainsi les gènes sur les chromo-
parties de programme informatique dis- somespar rapport à des marqueursconnus.
tinguent les types de marqueurs ; le plus Un autre problème est le manque de Ils étudient aussi des séquencesparti-
souvent, il suffit de savoir qu'un mar- puissance des banques de données, clas- culières, qui, bien que n'étant pas des
queur est un marqueur. siques ou personnalisées.Les ordinateurs gènes, jouent un rôle important dans
Les particularités des divers mar- devront pallier ces insuffisances, comme l'expression des gènes : ces « courtesuni-
queurs, comme la souche de souris dont ils l'ont fait pour la banque de données sur tés fonctionnelles» semblent gouverner la
ils proviennent ou le nom des labora- Escherichia coli, une bactérie de l'estomac structure des protéines et le moment de
toires qui les ont isolés, seraient fixées humain à qui l'on fait aujourd'hui synthé- leur production. On en découvre de plus
sur ces marqueurs comme en plus à mesure que l'on
les branches sur un arbre. séquence de plus longs
Modifier un objet déjà fragments d'ADN.
stocké n'est pas simple, Comment, enfin,
mais c'est plus facile que représenter les nouveaux
modifier toute une concepts biologiques sur
banque de données rela- les cartes physiques des
tionnelles. De ce fait, les chromosomes ? Avec
banques de type objet quelques collègues, Ray
seront utiles, car elles Hagstrom et Ross
pourront être reprises sur Overbeek, du Laboratoire
les ordinateurs-périodi- américain Argonne, ont
quement changés-des réalisé un programme qui
centres informatiques du affiche sur l'écran d'un
programme génome. ordinateur, sous une
Hélas, les banques de forme symbolique, les
données de type objet divers types de segments
présentent l'inconvénient du génome d'Escherichia
de ne pas être associées à coli et d'autres orga-
un bon langage d'interro- nismes. Ces représenta-
gation. Pour les compul- tions sont encore som-
ser, on doit utiliser des maires-elles sont
programmes spéciaux. La composées de triangles et
mise au point d'un nou- de rectangles grisés-,
veau langage résoudrait mais elles révèlent les
ce problème partielle- principaux éléments géné-
ment, mais les demandes tiques (comme les introns,
sont trop variées. En les exons, les promoteurs,
outre, on a moins besoin MATRICE DESDEGRÉS DE RECOUVREMENT entre deux clones DADN pris au
les codons stop, etc.) et
d'un nouveau langage hasard dans une banque de chromosomes artificiels de levure (une banque leur position par rapport à
que d'outils de visualisa- de «YAC»). Les différents clones sont classés en abcisse des gènes connus.
enet
ordonnée, et les
tion des résultats. couleurs indiquent le degré derecouvrement (valeurs croissantes du bleu au Les banques de don-
La mise au point des vert, puis au rouge et au jaune). L'analyse de cette matrice facilite l'étude nées ont déjà mis les bio-
nouveaux systèmes sera des régions génomiquesassociéesà une maladie génétique : on séquencera logistes sur la voie de
difficile, car les chercheurs plus rapidement ces régions si l'on connaît le sous-ensemble minimal de découvertes importantes.
qui étudient le génome ont clones qui la recouvrent. Elles combleront peut-
besoin de logiciels qui être le fossé culturel entre
évoluent en même temps les biologistes et les
que leurs recherches propres. Ainsi le tiser les protéines les plus variées en y informaticiens, qui demeure un des pro-
Laboratoire Lawrence Berkeley, aux États- introduisant les gènescodant cesprotéines. blèmes les plus délicats du programme
Unis, comporte trois groupes de cartogra- On connaît davantage le génome génome. Alors que les biologistes sont
phie et un de séquençage,qui recherchent d'Escherichia coli que celui de tout autre des expérimentateurs (on leur enseigne à
tous des informations différentes ; la mise organisme vivant, mais on n'avait aucun modifier leurs expériences en fonction de
en commun de programmes étant difficile, moyen d'ordonner ces informations leurs résultats), les informaticiens traitent
même entre ces équipes, comment imagi- jusqu'à ce qu'un chercheur de l'Institut généralement les problèmes par toutes les
ner que tous les groupes soient satisfaits américain de la santé, Kenn Rudd, ait mis méthodes linéaires et logiques possibles.
d'un unique produit ? bout à bout toutes les séquences d'ADN Biologistes et informaticiens raisonnent
Pour faciliter les échanges des don- connues d'E. coli. Ces séquences conti- différemment, mais leurs deux logiques
nées, Suzanna Lewis et ses collègues de guës, nommées contigs, permettent aux seront précieuses pour élucider les mys-
l'Institut de technologie de Californie envi- chercheurs de localiser les gènes bacté- tères du génome.
 GÈNE
LE QUI
DÉTERMINE
pourquoi naît-on fille ou garçon ?
Cette loterie équitable suscite admiration
et curiosité : 450 ans avant notre ère,
Anaxagore pensait que le sperme du tes-
ticule droit donnait des garçons alors que
celui du testicule gauche engendrait des
filles : Démocrite incriminait l'utérus, et
Aristote avançait que les couples âgés ou
très jeunes avaient plus fréquemment
des filles.
La détermination du sexe est géné-
tique : les femmes possèdent deux chro-
mosomes X et les hommes un chromo-
some X et un chromosome Y. En 1959,
on découvrit que le sexe mâle est déter-
miné par le chromosome Y quel que soit
le nombre de chromosomes X : certains
hommes possèdent deux X et un Y et
certaines femmes n'ont qu'un seul X.
Depuis près de 30 ans, la recherche du
ou des gènes qui déterminent le sexe
mâle, sur le chromosome Y, a fait l'objet
d'une compétition internationale.
Cependant les faux candidats, comme
l'antigène d'histocompatibilité H-Y, ont
été nombreux. Cette quête semble enfin
terminée : une équipe londonienne a pro-
bablement identifié le gène qui déclenche
la différenciation masculine, chez
l'Homme et chez les autres mammifères.
La détermination du sexe corres-
pond, chez l'embryon, au développe-
ment des glandes sexuelles en testicules
ou en ovaires, à partir d'ébauches indiffé-
renciées. Certaines cellules du testicule
embryonnaire sécrètent des hormones
mâles. Dans les années 1940, Alfred Jost
montra que ces hormones mâles indui-
sent le développement de l'appareil géni-
tal mâle. Inversement, l'absence de l'hor-
mone mâle provoque la différenciation
de l'appareil génital femelle. Ainsi la
Le gène SRYest localisé sur le fragment 1A1 du chromosome Y.
LE SEXE
détermation du sexe dépend de la pré-
sence ou de l'absence de testicule
embryonnaire, qui résulte de la présence
ou de l'absence du chromosome Y dans
les cellules : c'est pourquoi les cher-
cheurs ont nommé TDF (« facteur de
détermination testiculaire», ou testis
determining factor, en anglais) le gène
hypothétique du chromosome Y qui
commande la différenciation mâle.
En 1966, les biologistes ont décou-
vert que le gène TDF était situé sur le
bras court du chromosome Y. Pour le
localiser plus précisément, ils ont exa-
miné des cas d'inversion sexuelle : un
individu mâle sur 20 000 possède deux
chromosomes X mais n'a pas de chro-
mosome Y (mâle XX), et une femme sur
50 000 possède un chromosome X et
un chromosome Y (femme XY). Dès
1966, on supposa que ces inversions
sexuelles résultaient d'une recombinai-
son (d'un échange de fragments) anor-
male entre les chromosomes sexuels X
et Y paternels, lors de la méiose mâle.
Cette recombinaison anormale devrait
produire, d'une part, des spermatozoïdes
avec un chromosome X ayant acquis le
gène TDF, qui donneront des hommes
XX, et, d'autre part, des spermatozoïdes
avec un chromosome Y ayant perdu le
gène TDF,qui donneront des femmes XY.
On confirma cette hypothèse 20 ans
plus tard, à l'aide de sondes spécifiques
de fragments de chromosome Y. En
1986, Jean Weissenbach, de l'Institut
Pasteur, découvrit que les chromosomes
X et Y comportent une région homo-
logue, la «région pseudo-autosomique»,
située à l'extrémité de leur bras court.
Lors de chaque méiose mâle, les régions
pseudo-autosomiques des chromosomes
X et Y s'associent et se recombinent.
Normalement cette recombinaison
concerne exclusivement les régions
pseudo-autosomiques, mais elle s'étend
parfois au-delà, en englobant le gène TDF
du chromosome Y : elle donne alors des
spermatozoïdes anormaux qui engendre-
ront des embryons au sexe inversé.
De son extrémité au centromère, le
bras court du chromosome Y est consti-
tué de la région pseudo-autosomale, des
régions 1A1, 1A2, 1B, 1C, 2, 3 et 4A,
toutes bien délimitées. En 1987, David
Page crut localiser le gène TDF dans la
région 1A2 en analysant des inversions
sexuelles : un mâle XX possédait un
chromosome X qui contenait les régions
I A I et I A2 du chromosome Y et une
femme XY avait un chromosome Y
dépourvu de la région IA2. En séquen-
çant la région 1A2, il découvrit un gène
parfaitement conservé chez les mammi-
fères placentaires, qui codait une pro-
téine nucléaire avec des séquences « en
doigt de zinc» ; ces séquences forment
des boucles capables de piéger le zinc,
caractéristiques de certaines protéines
activant les gènes. Ce gène fut nommé
ZFY(pour Zinc finger Y).
Malheureusement on dut éliminer ce
nouveau candidat à la fonction de gène
TDF: en effet, le
gène ZFY n'est pas spéci-
fique du chromosome Y car il possède
un homologue sur le chromosome X ;
chez les marsupiaux, il ne peut pas
déterminer le sexe, car il est présent sur
les autosomes ; chez des embryons de
souris, il est actif dans les cellules germi-
nales, qui ne participent pas à la différen-
ciation testiculaire ; enfin Philippe Berta
et ses collègues de l'équipe de Peter
Goodfellow, de l'Imperial Cancer
Reseorch Fund à Londres, ont découvert
quatre hommes XX qui ne possédaient
pas la région IA2 du chromosome Y où
se trouve ZFY.
En revanche, ces hommes XX
avaient acquis une séquence de 35 kilo-
bases de la région 1A1 qui, chez les
hommes normaux, est accolée à la
région pseudo-autosomale du chromo-
some Y. Dans cette séquence, l'équipe
de P. Goodfellow a découvert un gène
hautement conservé chez les mammi-
fères, et qui semble spécifique du chro-
mosome Y. Ce gène, nommé SRY(pour
Sex determining Region ouf the Y chromo-
some) code en particulier une séquence
de 80 acides aminés, qui présente des
analogies avec plusieurs protéines
capables de se lier à l'ADN et d'activer les
gènes. Par ailleurs, le gène SRYest trans-
crit en ARN messager et traduit en pro-
téine dans le testicule de l'homme adulte.
 D. Page reconnut son erreur : chez la
femme XY qu'il avait étudiée, le chromo-
some Y avait aussi perdu sa région I A I,
ce qui renforçait l'idée que le gène SRY,
situé dans cette région, est un gène TDF.
Enfin l'équipe de P. Goodfellow four-
nit un argument majeur en faveur du
gène SRY: les chercheurs ont découvert
une femme XY dont le chromosome Y
ne présente aucune délétion, mais pos-
sède une mutation ponctuelle (une sub-
stitution d'une base de l'ADN par une
autre) ; cette mutation porte précisé-
ment sur le fragment du gène SRYqui
code un acide aminé parfaitement
conservé de la protéine capable de se
lier à l'ADN. En outre, cette mutation
n'est pas héritée du père (ni le père, ni le
frère de cette femme ne présentent la
même mutation) : elle est donc bien
associée à l'inversion sexuelle observée.
Le gène SRYsemble un excellent candi-
dat à la fonction de déterminant primaire
du sexe mâle.

UN CHROMOSOME chromosome X muté de leur père, sont

elles-mêmes rarement malades, mais
leurs enfants (garçons ou filles) ont un
FRAGILE
risque important d'avoir un retard mental.
Pour expliquer cet étrange mode de
transmission,on avançadeux hypothèses :
la première proposait l'existence chez les
Le «retard mental
avec X fragile» est fréquence de la maladie grâce à la mise mâles normaux transmetteurs,d'une «pré-
une des maladies génétiques les plus fré- au point d'une technique d'analyse chro- mutation » sans expression clinique, mais
quentes, puisqu'elle frappe environ un mosomique reproductible, mais lourde et ayant une forte probabilité de se transfor-
homme sur 1 500 et une femme sur parfois inefficace. En étudiant l'arbre mer en « pleine mutation » lors de la for-
2 500 ; en outre, c'est une maladie fami- généalogique des familles atteintes, on mation des cellules sexuelles (les ovules)
liale, contrairement à la trisomie 21, qui découvrit que la maladie avait un mode chez les filles de ces mâles normaux trans-
atteint environ un enfant sur I 000 mais de transmission qui n'avait jamais été metteurs ; l'autre hypothèse, avancée par
reste sporadique. La Bible mentionnait observé dans les autres maladies liées au Chartes Laird en 1987 faisait intervenir le
déjà l'hémophilie, une maladie familiale chromosome X : certains hommes (les phénomène de l'« empreinte parentale » lié
cinq fois moins fréquente que le syndrome «mâles normaux transmetteurs») n'ont ni à l'inactivation, lors de l'embryogenèse,de
X fragile, mais l'identification de ce demier retard mental ni site fragile décelable, l'un des deux chromosomes X dans les
ne date que de 1969 : cette découverte mais ils transmettent lamaladie à certains cellules des filles. Les résultats de J. L.
tardive résulte de la multiplicité des causes de leurs petits-enfants vio leurs filles ; Mandel suggèrent que ces deux hypo-
(génétiques ou non) des retards mentaux celles-ci, qui héritent obligatoirement du thèses seraientcomplémentaires.
et de la complexité du mode de transmis-
sion génétique de la maladie.
L'équipe CNRS-INSERM animée par
Jean-Louis Mandel et Isabelle Oberlé, à la
Faculté de médecine de Strasbourg, a
montré que deux aspects des méca-
nismes moléculaires de la transmission et
de l'expression du syndrome X fragile
étaient originaux : la maladie résulte
d'une mutation précisément localisée,
dans une région de !'ADN qui commande
l'activité des gènes voisins (alors que de
nombreuses autres maladies, comme la
myopathie de Duchenne, résultent de
mutations dont la localisation varie beau-
coup au sein d'un gène) ; en outre, cette
mutation se produit en deux étapes,
dans les cellules sexuelles des généra-
tions successivesd'une même famille. Les
chercheurs strasbourgeois ont également
mis au point un test de diagnostic molé-
culaire de la maladie, plus fiable et plus
rapide que les tests fondés sur l'observa-
tion des chromosomes au microscope.
En 1969, H. Lubs décrivit pour la pre-
mière fois une famille frappée de la mala- La transmission génétique du retard mental avec X fragile est originale : les
«mâles normaux transmetteurs», qui ne sont jamais malades, sont porteurs d'une
die et découvrit que le retard mental
prémutation : ils ont acquis, sur le chromosome X, un fragment d'ADN supplémen-
était lié à une anomalie du chromosome
taire de 200 à 400 paires de bases. Chez leurs filles, elles-mêmes rarement
X : chez les sujets atteints, ce chromo-
malades, cette prémutation se transforme en «pleine mutation» lors de la forma-
some comporte un fragment «fragile» qui tion des cellules sexuelles, qui acquièrent ainsi un fragment d'ADN supplémentaire
semble se détacher de l'extrémité de son de 1 000 à 3 000 paires de bases. Les fils et certaines filles de ces femmes qui
bras long. En 1977, on put déterminer la héritent de la pleine mutation sont atteints de la maladie.
 Comme la fonction du gène de la
maladie était inconnue, les chercheurs ne
pouvaient isoler ce gène à partir de la pro-
téine codée par celui-ci. Ils ont donc utilisé
la stratégie de « génétique inverse »: ils ont
d'abord identifié plusieurs«sondes d'ADN»
complémentaires de fragments d'ADN très
polymorphes (très variables selon les indi-
vidus) et très proches du gène de la mala-
die. Puis, en hybridant une de ces sondes
avec de très grands fragments d'ADN
humain, séparés par la technique d'élec-
trophorèse en champ pulsé, ils ont décou-
vert que le site X fragile des maladescom-
porte une méthylation de l'ADN, qui est
absente chez les sujets normaux.
La méthylation de l'ADN est associée
à une inhibition des gènes : ainsi l'ADN du
chromosome X inactif, chez les femmes,
porte des groupes méthyle sur la cyto-
sine (une des quatre bases de l'ADN),
principalement dans des régions chro-
mosomiques riches en séquences cyto-
sine-guanine (une autre base de l'ADN)
nommées «îlots CG». Aussi la méthyla-
LES ANOMALIES
L'ADN MITOCHONDRIAL
Wn embryon hérite du matériel
génétique contenu dans le noyau du sper-
matozoide et dans le noyau de l'ovule,
mais également du matériel génétique des
mitochondries, des micro-organites pré-
sents dans le cytoplasme de l'ovule. Ces
mitochondries, du grec mitos, filament, et
khondros, grains, ont été décrites pour la
première fois vers 1880, comme des cor-
puscules présents dans le cytoplasme cel-
lulaire et ayant la taille d'une bactérie.
En raison des dimensions et de la
structure des mitochondries, de l'autono-
mie de ces corpuscules et de la forme de
leur ADN, on pense qu'au cours de
l'Évolution, des cellules ancestrales
auraient « avalé »des bactéries aérobies
qui, loin de détruire leurs cellules-hôtes,
y auraient vécu en une symbiose mutuel-
lement bénéfique. Les descendants de
ces bactéries auraient survécu sous la
forme des mitochondries intégrées dans
les cellules-hôtes.
La membrane inteme des mitochon-
dries est le coeur de la fabrique de l'éner-
gie cellulaire, et elle contient la totalité
de la chaîne respiratoire des cellules. On
a dénombré environ 70 protéines qui
composent la chaîne respiratoire mito-
tion observée dans un liot CG du site X
fragile, chez les malades, pouvait-elle cor-
respondre à une inactivation localisée du
chromosome X
En collaboration avec le Centre
d'étude du polymorphisme humain, à
l'hôpital Saint-Louis, les chercheurs ont
isolé le fragment d'ADN correspondant
au site fragile sous forme de « chromo-
some artificiel» dans la levure : le clonage
dans des chromosomes de levure,
capables d'intégrer jusqu'à un million de
nucléotides, permet de localiser rapide-
ment les grands fragments d'ADN conte-
nant le gène recherché. Avec ce frag-
ment, J. L. Mandelet ses collègues ont
fabriqué une sonde d'ADN qu'ils ont
hybridée au génome des familles à
risque. Ils ont ainsi découvert que les
sujets qui transmettent la maladie sans
l'exprimer possèdent, dans la région du
site fragile du chromosome X, un frag-
ment d'ADN supplémentaire de 200 à
400 paires de bases de long, alors que
les malades atteints de retard mental
DE
chondriale et qui se répartissent en cinq
groupes, cinq complexes multi-enzyma-
tiques. La majeure partie de ces enzymes
(une soixantaine) est codée de façon
classique par le génome du noyau, syn-
thétisée dans le cytoplasme et ensuite
importée dans les mitochondries ; les
autres protéines (13) de la chaîne respi-
ratoire sont codées directement par
l'ADN présent dans les mitochondries.
Les différents gènes qui composent
l'ADN mitochondrial ont été identifiés
entre 1983 et 1986. Cet ADN est une
molécule circulaire, composée de deux
brins, un lourd et un léger. Treize pro-
téines de la chaîne respiratoire sont
codées par les mitochondries : le brin
lourd en code 12, le brin léger n'en code
qu'une. Cet ADN code également diffé-
rents ARN,deux ARN ribosomiques et 20
ARNde transfert qui participent tous à la
synthèse des protéines. Le génome mito-
chondrial, de petite taille, est caractérisé
par une très grande « efficacités, puisque,
contrairement à l'ADN nucléaire, les deux
brins sont codants, et les gènes y sont
contigus ; I'ADN mitochondrial est
dépourvu d'introns (de parties non
codantes).
ont, dans le site X fragile, un fragment de
taille encore supérieure, comportant
I 000 à 3 000 paires de bases.
L'acquisition du petit fragment, sur le
chromosome X correspondrait à une
prémutation sans expression clinique,
alors que l'acquisition du grand fragment
correspondrait au passage à la pleine
mutation qui provoque la maladie. Le
passage à la pleine mutation se produit
lors de l'ovogenèse chez les femmes
portant la prémutation ; on ignore si la
méthylation anormale du chromosome
X en est la cause ou la conséquence. On
suppose que le retard mental résulte de
l'inactivation d'un ou deux gènes situés
en amont ou en aval de l'îlot CG
méthylé, dans le site X fragile.
Cette nouvelle sonde foumit un outil,
précis pour le diagnostic moléculaire de la
maladie, qui pose un problème éthique :
doit-on signaler qu'un individu apparem-
ment normal peut transmettre la maladie,
alors que seuls certains de ses petits-
enfants courront le risque d'être atteints ?
Au cours des divisions cellulaires, les
mitochondries sont réparties au hasard
entre les cellules filles (c'est la ségréga-
tion mitotique). Or, une cellule mère
contient parfois deux types de mito-
chondries, les mitochondries normales et
d'autres qui contiennent un ADN muté.
Lors de la mitose, certaines cellules
filles peuvent « hériter » d'un seul type de
mitochondries-les normales ou les
mutées tandis que d'autres conservent un
mélange des deux types. Chez l'Homme,
lors de la fécondation, il n'y a pas trans-
mission paternelle des mitochondries :
seul le noyau du spermatozoïde est
conservé dans l'ovule. Les mitochondries
ne sont transmises que par la mère et ne
suivent pas les lois de Mendel.
Lorsque des cellules contiennent des
mitochondries mutées, leur chaîne respi-
ratoire est perturbée, et un déficit enzy-
matique de cette chaîne se traduit par
des maladiesd'origine mitochondriale. On
connart ces maladies depuis une vingtaine
d'années ; la première identifiée était une
myopathie, et l'on a longtemps considéré
que les maladies mitochondriales se can-
tonnaient aux atteintes musculaires. On a
ensuite identifié d'autres maladies asso-
ciant des troubles musculaireset neurolo-
giques et l'atteinte de divers organes.
Ainsi, après avoir désigné l'ensemble des
maladies mtochondnales par le terme de
myopathies mitochondriales, on les
nomme aujourd'hui cytopathies mito-
chondriales, maladies d'origine mitochon-
 driale pouvant affecter n'importe quel Le mode de transmission de ces diaques rénales métaboliques qui s'expri-
tissu. Les signes cliniques des maladies maladies associées à des mutations de ment à des âges variables de la vie,
mitochondriales sont variés, et nous l'ADN mitochondrial varie : la plupart des depuis la période néonatale jusqu'à l'âge
avons par exemple montré qu'un déficit remaniements de grande taille-les délé- adutte. Nous cherchons à comprendre
de la chaîne respiratoire se traduit parfois tions correspondent à des mutations l'origine enzymatique et moléculaire de
par une association de symptômes, tels acquises par un individu, mais certaines ces maladies, et nous essayons de les rat-
une atteinte rénale, un retard de crois- maladies associées à des mutations tacher à des mutations (délétions ou
sance, une rétinopathie, une myopathie, ponctuelles de l'ADN mitochondrial sont mutations ponctuelles) de l'ADN mito-
une surdité, une épilepsie et un diabète. transmises par la mère. chondrial ou de l'ADN nucléaire. II nous
Les exemples foisonnent, et, parmi En outre, Massimo Zeviani et ses col- reste à découvrir le mécanisme à l'ori-
eux, le syndrome de Pearson : chez les lègues de l'Université de Milan ont étu- gine des délétions de l'ADN mitochon-
nourrissons atteints de ce syndrome, dié plusieurs familles présentant des drial, pourquoi un même remaniement
tous les éléments du sang sont en maladies ophtalmiques transmises suivant moléculaire peut-être à l'origine de mala-
concentration insuffisante et nécessitent les lois de Mendel donc correspondant à dies très différentes et comment le
des transfusions régulières, puis de nom- une anomalie d'un gène du noyau ; ces génome nucléaire et le génome mito-
breux troubles digestifs apparaissent et le chercheurs ont constaté que l'ADN mito- chondrial interagissent.
décès survient avant l'âge de trois ans. La chondrial de ces patients était également Quand on comprendra mieux ces
diversité clinique des cytopathies mito- muté et présentait des délétions mul- mécanismes, on pourra envisager de
chondriales s'accompagne d'une variabi- tiples. Ils en ont déduit qu'un facteur compenser les déficits cellulaires en
lité dans l'âge du début de la maladie : codé par le noyau favorisait lorsqu'il était fournissant à l'organisme les enzymes qui
elles peuvent se déclarer au cours de la muté, les remaniements de l'ADN mito- lui font défaut, ou en inhibant celles qui
période néonatale, à tous les âges de chondrial responsables des maladies ont des conséquences délétères pour
l'enfance ou seulement à l'âge adulte. ophtalmiques observées. l'organisme.
L'origine de ces maladies peut être Ainsi le champ des maladies mito-
soit mitochondriale soit nucléaire, car le chondriales s'est récemment élargi : aux AgnèsROTIG,
ValérieCORMIER, Amold MUNICH,
noyau participe aussi à la machinerie pathologies neuromusculaires se sont Hôpital des EnfantsMalades, Paris.
mitochondriale. Des remaniements de ajoutées des maladies digestives, car-
l'ADN mitochondrial ont été mis en évi-
dence dans certaines cytopathies : il s'agit
généralement de délétions de grande
taille qui suppriment un ou plusieurs
gènes mitochondriaux. Tous les remanie-
ments de l'ADN mitochondrial constatés à
ce jour chez l'Homme respectent les oH-
gines de la réplication et de la transcrip-
tion de sorte que les molécules rema-
niées se perpétuent dans les cellules filles.
Nous avons relevé quelques caracté-
ristiques des maladies mitochondriales :
certaines délétions sont présentes uni-
quement dans les cellules des tissus
atteints, où les mitochondries anormales
s'accumulent ; d'autres réarrangements
sont présents dans tous les tissus étudiés
d'un même individu, conduisant à des
atteintes de plusieurs organes. Toutefois,
si les délétions sont différentes d'un indi-
vidu à l'autre, un même individu a tou-
jours le même type de délétion.
Nous avons étudié les points de
jonction des délétions et y avons mis en
évidence la présence de séquences répé-
tées (de courtes séquences nucléoti-
diques présentes en plusieurs exem-
plaires) ; nous pensons qu'au cours de la
réplication de l'ADN mitochondrial, des
appariements homologues illégitimes se
produisent entre ces séquences répé-
tées. Paradoxalement, nous avons
découvert qu'une même délétion de
l'ADN mitochondrial se retrouvait dans ADN mitochondrial et ses délétions : le brin lourd normal (à l'extérieur) code
des maladies totalement différentes, mais 12 protéines (dont les gènes sont figurés en violet), le brin léger code une pro-
qu'inversement, une même maladie peut téine (en mauve). On a représenté les délétions responsables de diverses mala-
résulter de délétions de tailles différentes. dies mitochondriales. Les flèches indiquent les mutations à hérédité maternelle.
La trisomie 2 1
On identifie les gènes responsables de nombreuses
anomalies associées à cette maladie, et on les localise
précisément sur le chromosome 21.
LESYNDROMEde Down, biochimiques : environ 40 pour cent
appelé également trisomie d'entre eux naissent avec des déficits car-
21 (ou mongolisme selon diaques congénitaux et la plupart ont un
l'ancienne terminologie), petit cerveau et des anomalies du cristallin,
est une anomalie géné- qui augmentent les risques de cataracte et
tique dont les conséquences sont souvent de troubles visuels. D'un point de vue bio-
dramatiques. Il atteint un nouveau-né sur chimique, ils présentent une augmentation
700 et constitue la cause la plus fréquente de la concentration sanguine en purines
de retard de développement mental ; les (deux des basesazotéesqui entrent dans la
enfants atteints de trisomie 21 présentent composition de l'ADN et de l'ARN), ce qui
un ensemble d'anomalies physiques et causedes troubles neurologiques, un retard
mentales, parfois très graves. mental et des déficiences du système
En outre, on pense que les gènes res- immunitaire. À cela s'ajoutent d'autres
ponsables de certains symptômes asso- complications : une sensibilité particulière
ciés à la trisomie 21 sont ceux-là mêmes aux infections et un risque de leucémie
qui, modifiés ou dérégulés, provoquent 20 à 50 fois supérieur àla normale.
des maladies comme la leucémie ou la Tout ceci explique que les individus
maladie d'Alzheimer chez des personnes atteints de trisomie 21 meurent jeunes : en
apparemment saines. L'impact de la tri- 1928, on estimait leur espérancede vie à
somie 21 est tel que cette maladie fait neuf ans ; en 1980, les progrès de la méde-
l'objet de nombreuses recherches dont on cine avaient porté cette espérancede vie à
attend des résultats importants sur la 30 ans et, aujourd'hui, plus de 25 pour
régulation génétique et les mécanismes cent de ces malades vivent jusqu'à 50 ans.
moléculaires de cette pathologie. À mesure que l'espérance de vie aug-
La trisomie 21 n'est pas une maladie mentait, on découvrait de nouveaux
nouvelle : on a retrouvé le crâne d'un aspects de la maladie. On a mis en évi-
Saxon datant du IXe siècle et dont les dence, au cours des dix dernières années,
dimensions sont celles d'un crâne de triso- grâce aux autopsies pratiquées sur des
mique moderne, et de nombreuses pein- cerveaux de trisomiques âgés de plus de
tures du xv"siècle représentent des enfants 35 ans, qu'ils ont tous-comme les per-
atteints de ce syndrome. Toutefois, cette sonnes qui meurent de la maladie
affection n'a été décrite par l'Anglais John d'Alzheimer, la forme la plus fréquente
Langdon Down, de l'Asile de Surrey, de démence présénile-des plaques
qu'en 1866 ; l'Organisation mondiale de séniles microscopiques et des faisceaux
la santéemploie la désignation « syndrome neurofibrillaires anormaux. Les individus
de Down ». trisomiques présentent souvent des symp-
J. Down avait observé que certains tômes de la maladie d'Alzheimer.
patients attardés mentaux présentaient des
symptômes physiques caractéristiques : Trois copies
un épicanthus, c'est-à-dire un repli de la au lieu de deux
peau qui recouvre la commissure interne
de l'oeil, un faciès aplati, des anomalies Pendant de nombreuses années, l'ori-
des plis des paumes des mains, une hypo- gine du syndrome de Down est restée
tonie musculaire et une petite taille. mystérieuse et la maladie semblait être le
On sait aujourd'hui que les sujets fait du hasard. On proposa de nom-
atteints de trisomie 21 présentent de nom- breuses théories : ce syndrome était-
breuses anomalies tant anatomiques que pensait-on-lié à un mauvais fonctionne-
David Patterson
ment des glandes endocrines ou à une
tuberculose ou à une syphilis parentale.
En 1909, G. Shuttleworth, de l'Asile de
Lancaster, en Angleterre, déclara que
cette maladie résultait d'un « épuisement
de l'utérus » de la mère. Selon lui, beau-
coup d'enfants présentant un syndrome
de Down étaient les derniers nés des
familles nombreuses. G. Shuttleworth
n'avait pas tout à fait tort, puisque ces
enfants sont souvent les derniers nés de
grandes familles, mais on sait maintenant
que la cause est l'âge de la mère plutôt
que le nombre d'enfants qu'elle a eu.
Au début des années 1930, Adrian
Bleyer, de l'Université de Saint Louis, et
P. Waardenburg proposèrent que le syn-
drome de Down pourrait être associé à
une non-disjonction, c'est-à-dire une
absence de séparation des chromosomes
pendant la méiose (le processus de la
division cellulaire qui produit les cellules
germinales, spermatozoïdeset ovules).
Comment avaient-ils élaboré cette
hypothèse ? En observant le comportement
anormal des chromosomes d'une plante,
l'onagre : quand les chromosomes ne se
séparent pas correctement, on obtient des
plantes stériles possédant15 chromosomes
au lieu de 14. Si une non-disjonction pro-
voquait des anomalies chez l'onagre, ne
pouvait-elle également être associée au
syndrome de Down ? L'hypothèse fut
pourtant abandonnée car, à l'époque, per-
sonne n'avait fait le décompte exact des
chromosomes humains.
Il fallut attendre 1956 pour que Joe
Hin Tjio et Albert Levan, de l'Institut de
génétique de Lund, en Suède, détermi-
nent le nombre de chromosomes chez
l'Homme (46) et pour qu'on prouve que
la trisomie 21 et la non-disjonction sont
bien liées. Jérôme Lejeune, Marthe
Gautier et Raymond Turpin, de l'Institut
de Progenèse à Paris, comptèrent les
chromosomes de trisomiques : ils possé-
daient trois copies du chromosome 21 (au
lieu de deux), de sorte que leur patri-
moine génétique était composé de
47 chromosomes et non de 46.
Une non-disjonction chromosomique
résulte d'une division cellulaire défec-
tueuse et a souvent, quel que soit le chro-
mosome atteint, de graves conséquences.
Lors d'une non-disjonction, les chromo-
somes appariés, qui se séparent au cours
d'une méiose normale, ne se divisent pas
correctement, de sorte que chaque cellule
fille intègre soit les deux chromosomes,
soit aucun. En général, les cellules dépour-
vues de chromosome meurent, tandis que
celles qui possèdent deux chromosomes
en acquièrent un troisième lors de la
fécondation : c'est l'origine des trisomies.
Les foetus trisomiques survivent rarement,
et ceux qui arrivent à terme présentent des
anomalies biochimiques et physiques. La
trisomie 21 est la plus fréquente des triso-
mies humaines à la naissance, sans doute
parce que le chromosome 21 est le plus
petit des chromosomes humains.
La trisomie d'une partie au moins du
chromosome 21 est un marqueur
infaillible du syndrome de Down, car tous
les individus qui en présentent les symp-
tômes ont une trisomie plus ou moins
étendue du chromosome 21 et, inverse-
ment, on ne connaît pas d'individu pré-
sentant une trisomie 21 sanssyndrome de
Down. L'anomalie ne résulte cependant
pas toujours d'une non-disjonction : chez
5 pour cent des trisomiques, il s'agit
d'une autre sorte de mutation chromoso-
mique appelée translocation, où une partie
seulement du chromosome est présent en
trois exemplaires ; cela se produit quand
un fragment du chromosome 21 se fixe
sur un autre chromosome, le plus souvent
le chromosome 13, 14, 15, 21 ou 22.
On observe alors des problèmes
d'appariement lors de la méiose et le frag-
ment de chromosome 21 se retrouve dans
une des cellules filles avec un chromosome
21 normal. Comme dans le cas d'une non-
disjonction, le fragment est présenten trois
exemplaires dès la fécondation et, d'après
les études cliniques effectuées sur un petit
groupe de patients atteints d'un syndrome
de Down résultant d'une translocation, la
trisomie du tiers inférieur du chromosome
21 suffit pour provoquer cette pathologie.
Le chromosome 21 ne contient que
45 millions de paires de bases d'ADN (sur
un total de trois milliards de paires de
bases dans le noyau cellulaire de
l'Homme), soit 1,5 pour cent du matériel
génétique. On estime que l'Homme pos-
sède environ 100 000 gènes fonctionnels
et, si l'on suppose que le nombre de
gènes est approximativement proportion-
nel au nombre de paires de bases, le

1. CETTE FILLETTE TRISOMIQUEprésente les traits earactéris- ment : certaines anomaliesde la trisomie 21, notamment la bouche
tiques du syndromede Down : un repli vertical de la paupière, près ouverte, la langue pendante et le maintien relâché, dus à une toni-
du nez (épicanthus), un visagelarge et un nez aplati. Cette enfant cité musculaire déficiente, sont moins visibles chez cettefillette. Ces
de quatre ansa suivi des traitements qui ont favorisé son développe- traitements ont augmentél'espérancede vie destrisomiques.
chromosome 21 comporte environ 1 500
gènes : on en a identifié moins de 20.
Les chromosomes sont constitués de
deux moitiés identiques, appelées chro-
matides-soeurs,reliées en un point appelé
centromère. Le bras le plus court du
chromosome est noté p et le bras le plus
long q. La coloration des chromosomes
met en évidence des régions (ou bandes)
sombres qui alternent avec des régions
claires. On désigne les bandes en indi-
quant la lettre p ou q, selon leur position
sur le chromosome considéré et un
nombre correspondant à la distance au
centromère (plus la bande est éloignée,
plus ce nombre est élevé). La largeur des
bandes varie et chaque chromosome a
une structure de bandes particulière.
Ainsi, le gène qui code les enzymes
nécessaires à la synthèse des purines se
trouve dans la bande q22. 1 duchromo-
some 21, sur la moitié inférieure du bras
q. Les plus petites bandes que l'on décèle
au microscope contiennent entre deux et
cinq millions de paires de bases, ce qui
correspond à de nombreux gènes.
Les chercheurs qui étudient le chro-
mosome 21 se sont posé quatre questions.
Quels sont les gènes situés dans la région
du chromosome responsable du syn-
drome de Down ? Lesquels de ces gènes
sont-ils responsables de la pathogenèse
de ce syndrome ? Quelles protéines
codent-ils ? Pourquoi la présence de trois
exemplaires de ces gènes (au lieu de
deux) induit-elle un syndrome de Down ?
Les cartes génétiques
Il était indispensable, pour répondre à
ces questions, de localiser et d'identifier
les différents gènes du chromosome 21,
c'est-à-dire d'établir une carte génétique.
Les cartes génétiques les plus perfor-
mantes localisent les gènes dans des
régions précises des chromosomes, parfois
même sur des segmentsd'ADN particuliers.
On réalise de telles cartes par étapes,
en combinant les informations obtenues
par des méthodes biochimiques et cyto-
génétiques ; on parvient parfois à locali-
ser indirectement un gène sur un chromo-
some en dosant son activité ; le principe
de cette méthode est simple : comme les
individus trisomiques possèdent trois
exemplaires de chaque gène au lieu de
deux, ils produisent une fois et demie la
quantité de protéine codée par le gène.
Par conséquent, si l'on détecte une
concentration en protéine ou une activité
enzymatique environ une fois et demie
supérieure à la normale, on en déduit que
la protéine ou l'enzyme est vraisemblable-
ment codée par le gène d'un chromosome
trisomique. Cette méthode est particuliè-
rement intéressante dans les cas de triso-
mie partielle, où l'on peut associer une
activité accrue à la présence d'une région
bien définie du chromosome et on réussit
même, dans certains cas, à localiser un
gène dans une bande bien déterminée.
Néanmoins, la corrélation d'un produit
codé par un gène particulier et de la pré-
sence d'un chromosome surnuméraire
n'est pas toujours précise : les concentra-
tions en protéine varient d'un individu à un
autre ou d'un tissu à un autre, et les mul-
tiples copies d'un même gène ne sont pas
toutes également fonctionnelles (une réac-
tion d'auto-régulation, appelée compensa-
tion, limite la production protéique). Il est
donc important de confirmer par d'autres
méthodes la localisation d'un gène identi-
fié par cette méthode de dosage.

La génétique moléculaire

Une autre technique de cartographie

utilise des marqueurs génétiques ; les mar-
queurs sont des variations génétiques qui
s'expriment soit dans la composition pro-
téique soit dans le phénotype (apparence
physique), et que l'on peut suivre de géné-
ration en génération. Si un marqueur géné-
tique codé par l'ADN du chromosome 21
apparaît quasiment toujours en même
temps qu'un caractèrephénotypique, on en
déduit que ce caractère est également codé
par un gène du chromosome 21 ; lorsque
deux gènes sont localisés sur le même
chromosome, on évalue leur distance sur
le chromosome en déterminant leur fré-
quence de recombinaison génétique, lors
de la méiose. Les gènes liés (c'est-à-dire
les gènes qui sont transmis ensemble) sont
généralementproches l'un de l'autre sur le
chromosome : les gènes qui ne sont pas
liés (ceux qui sont transmis indépendam-
ment) sont généralement éloignés sur le
chromosome, voire situés sur des chromo-
2. UN CARYOTYPE représentel'ensembledes chromosomesd'un organisme. Chaque chro- somes différents. Les fréquences de
été extrait d'une photographie agrandie, prise durant la métaphase. Les chromo- recombinaison servent ainsi de mesure des
mosomea
distancesgénétiques entre gènes.
somessont présentéspar paires. Grâce à cette technique, on compte les chromosomesdans
une cellules et on identifie les défauts visibles. Un être humain possède normalement On utilise une classe de marqueurs
46 chromosomes(23 paires), etce nombre varie en casde non-disjonction. Dans le caspré- génétiques efficaces appelés polymor-
sent, les trois copies du chromosome 21 révèlent que le sujet est atteint du syndrome de Down.
phismes de longueur des fragments de
3. UNE MÉIOSE NORMALE (à gauche) produit des cellules germi-
nales (ovules et spermatozoides) haploïdes (qui ont moitié moins de
chromosomes que les autres cellules). Lors de la méiose 1, les paires
de chromosomes homologues échangent l'information génétique
(prophase) et migrent vers les extrémités opposées de la cellule (ana-
phase), puis la cellule se divise (télophase). Lors de la méiose 2, ce
sont les deux chromatides soeurs qui se séparent et chaque cellule se
divise a nouveau pour former quatre cellules filles. La non-disjonc-
tion se produit lors de l'anaphase de la méiose 1 ou de la méiose 2 :
des chromosomes normalement tirés par les faisceaux fibrillaires
vers les extrémités de la cellule restent ensemble et deux chromo-
somes homologues (dans la méiose 1) ou deux chromalides swurs
(dans la méiose 2) sont tirés du même côté de la cellule. Les cellules
filles ont alors un nombre anormal de chromosomes. Quand la non-
disjonction porte sur le chromosome 21, les individus nés avec trois
copies de ce chromosome sont atteints du syndrome de Down.
restriction ; les fragments de restriction
sont des morceaux d'ADN coupés en des
points précis par des enzymes de restric-
tion. Si l'ADN a subi des mutations, les
points de clivage sont modifiés et on
obtient des fragments de restriction dont
les longueurs diffèrent des longueurs
habituelles. On détecte, grâce à ces chan-
gements de longueur, des modifications
dans des régions précises des brins
d'ADN. Ces changements de longueur des
fragments de restriction ne se produisent
pas toujours dans les régions correspon-
dant à un gène, mais ils constituent des
marqueurs très fiables des gènes ou des
autres marqueurs génétiques auxquels ils
sont liés. Cette méthode a été très utilisée
pour cartographier le chromosome 21.
On localise un gène spécifique sur le
chromosome par la méthode d'hybrida-
tion in situ : des séquences spécifiques
d'ADN marquées par un isotope radioactif
cherchent, sur les chromosomes auxquels
on les applique, les segments d'ADN qui
leur sont complémentaires et s'y lient. On
recouvre ensuite les préparations chromo-
somiques d'une émulsion photographique
et on détermine ainsi précisément les
endroits des chromosomes où se sont
liées les sondes radioactives. La résolu-
tion de cette méthode est bonne puisque
l'on réussit à savoir sur quel tiers du chro-
mosome 21 est situé un fragment d'ADN.
Une autre méthode de cartographie
génétique très efficace-l'hybridation
somatique interspécifique-a contribué
aux progrès de la génétique moléculaire.
Les généticiens ont mis au point des tech-
niques de fusion de cellules humaines
avec des cellules de rongeurs (générale-
ment des cellules de souris ou de hamster)
afin de créer des hybrides qui conservent
les chromosomes des deux espèces. On
ignore encore pourquoi les hybrides per-
dent ensuite la plupart des chromosomes
humains alors qu'ils conservent les chro-
mosomes de rongeurs : on peut ainsi obte-
nir une cellule hybride ne conservant
qu'un seul chromosome humain. Comme
le chromosome humain conservé dans
l'hybride est au moins partiellement fonc-
tionnel, on peut souvent distinguer les pro-
téines codées par ce chromosome de celles
codées par les chromosomes de rongeurs.
Francis Ruddle et ses collègues de
l'Université Yale ont été les premiers à
réaliser une cellule hybride ne conser-
vant, du génome humain, que le chromo-
some 21 ; les autres chromosomes étaient
ceux d'une lignée spéciale de cellules
mutines, appelées A9. Depuis, plusieurs
laboratoires ont obtenu (en utilisant la
même méthode) des hybrides contenant
seulement le chromosome 21.
Au Centre Eleanor Roosevelt de
recherches sur le cancer, à Denver, nous
avons remplacé les cellules A9 par une
souche particulière de cellules ovariennes
de hamster (CHO). Ces cellules cno sont
adaptées aux études d'hybridation cellu-
laire du chromosome 21, car elles portent
une mutation qui inactive le gène Gart
situé, chez l'Homme, sur le chromosome
21 et codant une enzyme appelée phos-
phoribosylglycinamide synthétase. Sans
cette enzyme, les cellules CHO doivent
être cultivées dans un milieu qui contient
des purines, sinon elles meurent.
4. CINQ GÈNES, sans doute associés au
phénotype de la trisomie 21, ont été locali-
sés dans une petite région du bras long (q)
du chromosome 21. Les gènes qui codent
les protéines superoxyde dismutase (soD-1)
et alpha-A-cristalline sont situés sur les
bandes 21q22.1 et 21q22.3 ; les gènes Gart
et ets-2 sont situés dans les bandes 21q22.1
et 21q22.2. Un gène qui code la phospho-
fructokinase (pfkl) est également présent
sur la bande 21q22. 3.
Quand on hybride des cellules CHO
avec des cellules humaines, toute cellule
hybride contenant le chromosome 21 sur-
vit dans un milieu sans purines, car elle a
acquis le gène Gart humain. On sélec-
tionne de cette façon les cellules hybrides
contenant le chromosome humain 21.
En hybridant les cellules CHOavec des
cellules humaines contenant un chromo-
some 21 ayant subi une translocation, on a
localisé le gène Gart dans une petite
région du chromosome 21 notée 21q22.
Par des analyses cytogénétiques des chro-
mosomes ayant subi une translocation, et
présents dans les cellules hybrides, nous
avons fractionné le chromosome 21 en
plusieurs sous-régions et nous avons iden-
tifié des marqueurs génétiques de la sous-
région contenant le gène Gart. Hélas cette
méthode de cartographie dépend du
nombre de translocations spontanées inté-
ressant les différents segments du chromo-
some 21 et ces translocations sont rares :
c'est le seul inconvénient de la méthode.
Comment y remédier ? En exposant le
chromosome 21 à des doses élevées de
radiations : le chromosome se fragmente.
On hybride alors les fragments avec des
cellules de hamster et on les manipule
comme s'il s'agissait de fragments natu-
rels. On recherche la présence de gènes ou
de séquences d'ADN spécifiques et l'on étu-
die les liaisons obtenues avec le gène Gart.
La région 21q22
Enfin, pour obtenir une carte précise
du chromosome 21, il faut mesurer les
distances entre les divers gènes et les
marqueurs (exprimées en nombre de
paires de bases). On utilise pour cela
l'électrophorèse : on soumet les frag-
ments d'ADN à l'action d'un champ élec-
trique ; comme l'ADN porte une charge
négative (proportionnelle à sa longueur),
les fragments se déplacent vers l'élec-
trode positive. Les plus petits se dépla-
cent rapidement, tandis que les plus gros
vont moins vite : on détermine ainsi la
taille des fragments, en nombre de paires
de bases, grâce à leurs positions sur le
support, à la fin de l'électrophorèse.
David Schwartz et Charles Cantor, de
l'Université Columbia, ont modifié cette
méthode en utilisant des champs élec-
triques diagonaux. On sépare ainsi (sans
que l'on comprenne exactement pour-
quoi) de très gros fragments d'ADN (com-
portant entre 50 000 et plus de 5 millions
de paires de bases). L'électrophorèse clas-
sique sépare des fragments ne dépassant
pas 50 000 paires de bases. Or les gènes
sont de tailles très variées : ils comportent
souvent plus de 50 000 paires de bases et
parfois sans doute un million de paires de
bases, ou même davantage. Grâce à cette
méthode de champ pulsé on analyse donc
des gènes complets-et non plus des frag-
ments de gènes-ainsi que des segments
d'ADN contenant plusieurs gènes.
Les cartes génétiques obtenues par
ces différentes méthodes sont compa-
tibles, du moing en ce qui concerne
l'ordre des fragments d'ADN et des mar-
queurs du chromosome 21. Ainsi les
chercheurs ont rassemblé les informa-
tions tirées de ces cartes génétiques et de
différentes études cliniques et cytogéné-
tiques ; ils ont identifié un certain nombre
de gènes de la région 21q22 du chromo-
some 21 : c'est cette région qui semble ont montré qu'il existe effectivement un mosome 21, ce qui expliquerait que les
responsable du syndrome de Down. oncogène sur le chromosome 21, l'onco- individus présentant une trisomie 21 ont
Différentes questions restent posées : gène ets-2, et il l'ont localisé sur la région une concentration en purines supérieure à
comment relier ces gènes à la pathologie qui participe à la translocation entre les la normale. Or des concentrations élevées
associée à la trisomie 21 ? Sachant que chromosomes 8 et 21. On compare actuel- en purines sont à l'origine de divers pro-
les gènes codent les protéines qui déter- lement l'expression du gène ets-2 dans les blèmes-notamment un retard mental-
minent le phénotype de l'individu, cellules normales et dans les cellules triso- et l'on suppose que la trisomie de ce seul
quelles sont les protéines qui jouent un miques ou ayant subi une translocation. gène du chromosome 21 suffit à expli-
rôle dans cette pathologie ? Une fois que Le gène Gart, qui code trois enzymes quer de nombreuses anomalies associées
l'on aura identifié les protéines et leurs intervenant dans la synthèse des purines, au syndrome de Down. On espère atté-
effets, on pourra envisager de s'opposer est situé dans la région 21q22 du chro- nuer un jour les symptômes de la triso-
aux effets pathogènes de ces protéines.

Trisomie 21 et leucémie

Parmi les gènes de la région 21q22,

on trouve le gène Gart, le gène ets-2 et
les gènes codant la protéine alpha-A-cris-
talline, la superoxyde dismutase et la pro-
téine amyloïde bêta qui illustrent la com-
plexité des relations entre les gènes (et
les protéines qu'ils codent), le développe-
ment de l'être humain et la maladie. Par
exemple, grâce aux progrès récents de la
biologie moléculaire, on a découvert une
relation entre le gène ets-2 du chromo-
some 21 et l'apparition d'une leucémie.
Les médecins savaient que les per-
sonnes atteintes de trisomie 21 deve-
naient souvent leucémiques, mais ils
ignoraient le mécanisme sous-jacent de
cette corrélation. Puis les cancérologues
découvrirent qu'il existe un type particu-
lier de leucémie, la leucémie myélogène
aiguë de type M2, dans laquelle 18 pour
cent des personnes atteintes présentent
une translocation réciproque entre des
fragments des chromosomes 8 et 21. Ces
personnes ne sont pas atteintes de triso-
mie 21 et seules leurs cellules leucé-
miques sont modifiées : les chromosomes
des autres cellules sont normaux.
En utilisant les méthodes cytogéné-
tiques de cartographie, les chercheurs ont
localisé le point de cassure du chromo-
some 21 dans la région q22. Ils ont en
outre découvert que la trisomie 21 est
l'anomalie chromosomique la plus fré-
quente des cellules leucémiques, surtout
chez les enfants. En 1985, Janet Rowley
et ses collègues de l'Université de
Chicago, avec qui nous travaillions, ont
émis deux hypothèses : la leucémie serait
provoquée par une modification de l'acti-
vité d'un ou de plusieurs oncogènes (les
gènes qui engendrent le cancer) portés
par le chromosome 21 ; la trisomie du 5. L'HYBRIDATION SOMATIQUE entre cellules humaines et cellules d'ovaires de hamster
chromosome 21 ou une translocation de
(CHO)produit des hybrides qui contiennent des chromosomes des deux espèces. On ajoute,
matériel génétique du chromosome 21 dans le milieu de culture, un agent de fusion, comme le virus Sendai ou le polyéthylène gly-
sur le chromosome 8 serait responsable col, afin de promouvoir la fusion. On hybride ainsi des cellules humaines avec des cellules
de cette modification.
CHOincapables de synthétiser les purines, car le gène Gart est déficient. Les chromosomes
Quelques indices semblent valider ces humains qui ne sont pas essentiels à la croissance de l'hybride sont perdus lorsque les cellules
hypothèses. Takis Papas, de l'Institut amé- se divisent. Dans un milieu dépourvu de purines, seules survivent les cellules qui possèdent le
ricain du cancer, et d'autres chercheurs, gène humain Gart du chromosome 21, car elles peuvent synthétiser leurs propres purines.
 mie 21 en contrôlant l'expression du
gène Gart (éventuellement au début de la
vie foetale), ce qui ramènerait les concen-
trations en purines à la normale.
D'autre part, les cataractes et les
défauts du cristallin que présentent les
trisomiques seraient dus à l'expression
anormale d'une protéine particulière : on
a découvert que le gène codant la pro-
téine alpha-A-cristalline, un composant
structurel du cristallin de l'oeil. se trouve
dans la région 21q22 du chromosome 21.
Un autre gène identifié sur le chro-
mosome 21 code la forme soluble de
l'enzyme superoxyde dismutase (SOD-1).
Cette enzyme intervient dans un système
complexe qui protège les cellules des
mammifères contre les radicaux libres
oxygénés : ce sont des molécules très
réactives libérées lors de l'oxydation et
qui jouent sans doute un rôle dans le
vieillissement. Les modifications de la
concentration en SOD-1 ont peut-être une
part dans le retard mental des personnes
atteintes de trisomie 21 ainsi que dans
leur vieillissement accéléré. L'enzyme
est exprimée en proportion du nombre de
gènes qui la codent et le gène de la SOD-1
a été localisé sur la région q22 du chro-
mosome 21. Lorsque les chercheurs
auront compris comment fonctionne ce
gène, ils auront en partie élucidé les pro-
cessus du vieillissement chez l'Homme.
Citons enfin une découverte récente
très étonnante : il existe une relation
génétique entre la maladie d'Alzheimer
et la trisomie 21. George Glenner et ses
collègues de l'Université de San Diego,
en Califomie, ont montré que la protéine
amyloïde bêta (un des principaux consti-
tuants des plaques neurofibrillaires qui
s'accumulent dans le cerveau des per-
sonnes atteintes de la maladie
d'Alzheimer) est identique à la protéine
qui s'accumule dans des lésions céré-
brales apparemment semblables, dans le
cerveau de tous les trisomiques âgés de
plus de 35 ans. Différents chercheurs ont
localisé le gène codant la protéine amy-
loïde bêta, sur le chromosome 21. De
plus, ils ont trouvé que le gène apparem-
ment responsable d'une forme familiale
de maladie d'Alzheimer se trouve égale-
ment sur le chromosome 21. On ignore si
ces deux gènes sont ou non identiques.
Les cartes génétiques du chromo-
some 21 se sont perfectionnées au cours
de ces dernières années et on prévoit que
leur précision ira croissant. Pourtant nous
n'avons encore aucune preuve absolue
que la trisomie d'une partie du chromo-
some 21 est bien la cause directe du syn-
drome de Down. Les progrès du génie
génétique permettent de manipuler des
modèles animaux, ce qui devrait per-
mettre d'obtenir cette preuve.
Les généticiens ont déjà découvert
qu'une partie du chromosome 16 de la
souris contient les gènes ets-2, Gart et
SOD-1, ainsi qu'un certain nombre de
séquences d'ADN dont on connaît les
homologues sur le chromosome 21
humain. John Gearhart, de l'Université
Johns Hopkins, et Charles Epstein et
David Cox, de l'Université de San
Francisco, essayent actuellement de croi-
ser des souris présentant des trisomies
partielles du chromosome 16 afin de voir
si elles présentent certaines des anomalies
associées à la trisomie 21. Les souris obte-
nues par cette méthode ne présenteront
bien sûr pas les mêmes anomalies qu'un
être humain, mais les mécanismes de
l'expression des gènes étant les mêmes,
l'étude des souris fournira aux généticiens
des informations de toute première impor-
tance sur la pathologie de la trisomie 21.
Une autre technique très intéressante
est une méthode de génie génétique qui
produit des souris transgéniques ; ce sont
des souris qui portent un gène ou des
groupes de gènes humains. Cette
méthode a déjà été utilisée avec des onco-
gènes, des gènes de facteur de croissance
et des gènes codant des enzymes métabo-
liques. On va maintenant l'appliquer aux
gènes du chromosome 21, sans doute res-
ponsables du syndrome de Down.
Dans les prochaines expériences, on
introduira des gènes du chromosome 21
comme ets-2, SOD-1 ou Gart dans des
cellules d'embryons de souris et l'on étu-
diera l'expression de ces gènes dans les
portées. On étudiera de cette façon les
effets de la trisomie d'un seul gène ou
d'un petit groupe de gènes, ce qui illus-
trera les multiples effets d'un gène isolé.
À plus long terme, on pourrait tester, sur
ces animaux, des traitements mis au point
pour prévenir ou guérir les différentes
pathologies associées à la trisomie 21.

6. L'ANALYSE MOLÉCULAIRE du chromosome 21 a été schématisée à
différentes résolutions, de la localisation d'un gène sur le chromo-
some (ici le gène Gart), jusqu'à la détermination de sa séquence de
paires de bases. Les analyses cytogénétiques utilisent deux méthodes :
la coloration du chromosome (a) et l'étude des translocations ne por-
tant que sur une région du chromosome (b). On obtient une
meilleure résolution en utilisant des méthodes plus élaborées, notam-
ment la création d'hybrides interspécifiques après irradiation et
l'électrophorèse en champ pulsé (c). Les méthodes de clonage molé-
culaire et d'électrophorèse classique ont une résolution encore supé-
rieure (d). Enfin on détermine la séquence de paires de bases d'un
gène particulier par des méthodes de séquençage de l'ADN (e).
 L'empreinte parentale
Même lorsque les parents
des gènes identiques, ceux-ci
différents. Certains gènes
perturbent parfois le développement normal
et déclenchent des maladies.
LORS DE sestoutes pre-
mières expériences avec
des pois, vers 1860,
Gregor Mendel fit une
observation qui allait
devenir un axiome de la génétique :
quand il croisait des lignées pures de pois
ronds avec des lignées pures de pois
ridés, tous les descendants étaient ronds,
que le pois rond ait été le pois mâle ou le
pois femelle. Mendel avait découvert le
principe d'équivalence des croisements
réciproques : les combinaisons d'un gène
normal et d'un gène pathologique sont
identiques que le gène anormal ait été
transmis par le père ou par la mère.
Cette observation de Mendel a eu une
importance considérable dans l'histoire et
dans la pratique de la génétique, car
l'équivalence des gènes est vraie pour de
nombreux caractères génétiques, non
seulement chez le Pois, mais aussi chez
la Mouche, la Souris, l'Homme et
d'innombrables organismes.
Cependant, les généticiens et les
embryologistes ont observé que certains
caractères n'obéissent pas à ces règles et
sont contrôlés par l'empreinte parentale :
les gènes transmis par les femelles et par
les mâles sont «marqués», c'est-à-dire
qu'ils portent une empreinte temporaire.
Les descendants qui reçoivent des gènes
portant l'empreinte de leur mère sont dif-
férents de ceux qui héritent des gènes
paternels. En bref, le sexe du parent qui a
transmis tel gène a parfois son importance.
De nombreux chercheurs de par le
monde tentent de découvrir la nature
moléculaire de cette modification épigé-
nétique, c'est-à-dire réversible et transi-
toire, son mécanisme, le nombre et le type
des gènes qui sont ainsi marqués. Cette
recherche est particulièrement ardue, mais
transmettent à leurs enfants
peuvent avoir des effets
spécifiques du sexe du géniteur
nous avons fait quelques découvertes
étonnantes qui éclairent notamment cer-
tains mécanismes du cancer, des maladies
génétiques et de diverses pathologies.
L'empreinte parentale pourrait même être
responsable de certains aspects, insoup-
çonnés jusqu'alors, de la transmission
mendélienne des caractères.
On connaît depuis plusieurs années
des exceptions à la règle de l'équivalence
des croisements réciproques, mais elles
se limitent à deux catégories de carac-
tères : ceux qui sont liés aux gènes portés
par les chromosomes sexuels, X et Y, et
ceux qui sont commandés par des gènes
localisés à l'extérieur du noyau cellulaire.
Toutes les cellules somatiques de
femelles mammifères contiennent deux
chromosomes X, alors que les mâles ont
un chromosome X et un chromosome Y.
Le daltonisme et l'hémophilie sont deux
des nombreux caractères déterminés par
les gènes du chromosome X et la trans-
mission de ces caractères liés au sexe
s'effectue sans que le principe d'équiva-
lence des croisements réciproques soit
respecté.
Ainsi quand un père est daltonien et
la mère normale, aucun de leurs fils n'est
daltonien ; quand la mère est daltonienne
et le père normal, tous les fils sont dalto-
niens ; dans les deux cas, les filles por-
tent le gène du daltonisme, mais elles ne
sont pas elles-mêmes daltoniennes.
L'hérédité et la manifestation du carac-
tère lié au sexe, dépendent du sexe du
descendant, et de la transmission d'un
gène muté porté par le chromosome X.
La pathologie sera la même que le chro-
mosome X anormal ait été transmis par le
père ou par la mère : le sexe du parent
qui a transmis le gène défectueux n'inter-
vient pas directement.
Carmen Sapienza
La deuxième exception bien connue
au principe d'équivalence des croisements
réciproques concerne des caractèrestrans-
mis par l'ADN mitochondrial ; certains
organites subcellulaires, les mitochondries
des cellules animales, et les mitochondries
et les chloroplastes des cellules végétales,
portent une information génétique propre,
indépendante de celle des chromosomes
du noyau. Ces organites se transmettent
de génération en génération par le cyto-
plasme des ovules, et sont transmis uni-
quement par la mère. La couleur des
feuilles de certaines plantes résulte de ce
type d'hérédité, de même qu'une maladie
neuromusculaire de l'Homme : I'encépha-
lomyopathie mitochondriale.
L'empreinte parentale, la troisième
exception, découverte récemment, differe
des deux autres. Les caractères qu'elle
modifie ne sont pas nécessairement por-
tés par les chromosomes sexuels (ils peu-
vent toutefois l'être) et ils ne sont pas
non plus associés aux mitochondries
transmises par la mère : en principe, tous
les gènes peuvent la subir. Alors que les
maladies transmises par les gènes liés au
sexe ou aux organites maternels résultent
d'une contribution génétique inégale des
deux parents, dans le cas de l'empreinte
parentale, les contributions sont iden-
tiques, mais des modifications épigéné-
tiques différentes ont des conséquences
différentes ; cette caractéristique a attiré
l'attention des biologistes. Nous allons
voir que l'empreinte parentale est une
modification épigénétique (temporaire et
réversible) du génome sous l'action de
gènes « modificateurs » qui influencent
l'expression de certains gènes.
1. LES CHROMOSOMES des spermatozoides
et des ovules portent des empreintes paren-
tales : les deux sexes héritent de certains
gènes marquésde l'empreinte paternelle et
d'autres de l'empreinte maternelle. Quand
un individu produit des spermatozoidesou
des ovules, les anciennes empreintes sont
effacéeset de nouvelles, spécifiquesdu sexe
de l'individu, sont apposées sur tous les
chromosomes des gamètes
2. LES CROISEMENTS RÉCIPROQUES sont des expériences où le
gène d'un caractère est apporté par la mère dans un cas, et par le
père dans l'autre. Pour la plupart des caractères, tel l'aspect ridé ou
lisse des pois, le sexedu parent qui a transmis le gène n'intervient
pas (à gauche). Cependantcertains caractères,telle la couleur des
feuilles de quelques plantes, ne sont transmis quepar la mère (au
centre) par l'intermédiaire de l'ADN mitochondrial. La transmission
est plus complexe dans le cas des divers caractères liés au chromo-
some sexuel, commela couleur des ailes chez les papillons Abraxas
(à droite).

Les études de l'empreinte parentale
résultent des travaux de James McGrath
et de Davor Solter, de l'Institut Wistar
d'anatomie et de biologie à Philadelphie,
et d'Azim Surani et de ses collègues de
l'Institut de physiologie animale de
Cambridge. J. McGrath et D. Solter ont
mis au point une méthode microchirurgi-
cale, le transfert de noyaux, pour échan-
ger l'information génétique entre deux
embryons de souris. Cette technique
exploite le fait que, quand un spermato-
zoïde féconde un ovule, le noyau de
l'oeuf et celui du spermatozoïde restent
séparés quelques instants dans le cyto-
plasme de l'oeuf, avant que les cellules de
l'embryon ne commencent à se diviser :
on peut alors distinguer les deux noyaux
au microscope optique, car ils ont une
taille et une position caractéristiques.
Le transfert de noyaux
A l'aide d'un capillaire de verre très
fin, J. McGrath et D. Solter ont retiré soit
le noyau provenant de l'ovule, soit le
noyau du spermatozoïde (ou les deux) de
l'oeuf fécondé, puis ont remplacé le noyau
enlevé par celui d'un autre oeuf fécondé.
Quand ils remplacèrent un noyau du sper-
matozoïde par le noyau d'un autre sper-
matozoïde, ou un noyau d'ovule par un
autre noyau d'ovule, les embryons se
développèrent normalement, et les souris
formées étaient identiques aux autres sou-
ris normales de la même lignée.
Par transferts de noyaux, ils ont éga-
lement créé des embryons ayant des
patrimoines génétiques anormaux : des
embryons possédant deux jeux de chro-
mosomes maternels ou deux jeux de
chromosomes paternels, J. McGrath,
D. Solter et A. Surani ont étudié le déve-
loppement de ces embryons gynogénotes
(contenant deux ensembles complets de
chromosomes maternels) et androgénotes
(contenant deux jeux complets de chro-
mosomes paternels), et ils les ont compa-
rés à des embryons normaux (ayant un
chromosome de chaque parent).
Il est important de noter que les souris
utilisées avaient été sélectionnéespendant
de nombreuses générations, et que les
mâles et les femelles avaient donc des jeux
identiques de chromosomes(naturellement
les femelles portaient deux chromosomes
X, et les mâles un chromosome X et un
chromosome Y). Si le développement d'un
embryon de souris ne dépendait que de ses
gèneset pas du sexedu parent qui les avait
transmis, les gynogénotes, les androgé-
notes et les souris normales auraient dû se
développer de la même façon.
Gènes mâles,
genes femelles
Or les trois catégories d'embryons
évoluent différemment. Les embryons à
deux jeux de chromosomes maternels ou
paternels ne sont pas viables : leur déve-
loppement cesse généralement après
quelques divisions cellulaires, et quand le
développement se poursuit, les gynogé-
notes et les androgénotes présentent des
anomalies très différentes.
3. LE DALTONISME fait exception à la loi de l'équivalence des croisements réciproques : ce
caractère estdéterminé par les gènes du chromosome X. Lorsque le père (X*Y) est daltonien
(il porte un gène X* muté)
normale,
et que
lesne
la
filssont
mère
(XY) est atteints; les
pas
filles (X*X) portent un chromosome anormal mais ne sont pas elles-mêmes daltoniennes
puisque le second chromosomeest normal (à gauche). Inversement lorsque le père(XY) est
normal, mais la mère (X*X*), daltonienne, tous les fils (X*Y) sont daltoniens, et les filles
portent encore le gène du daltonisme sans être atteintes (à droite)
Chez les gynogénotes qui se dévelop- tiques chez les gynogénotes, les androgé-
pent le plus, les embryons ont peu d'ano- notes et les embryons normaux,
malies, mais le placenta et le sac vitellin J. McGrath, D. Solter et A. Surani ont
(les structures essentiellesà l'alimentation conclu que les gènes devaient être modi-
de l'embryon) sont gravement endomma- fiés ou avaient reçu une empreinte diffé-
gés. On observe des anomalies inverses rente en fonction de leur origine mater-
avec les androgénotes : les sacs vitellins nelle ou paternelle. Cette modification
et les placentas sont quasi normaux, mais épigénétique semblait inactiver sélective-
les embryons sont déformés et atrophiés. ment certains gènes qui auraient dû agir
Comme les séquences d'ADN des au début du développement embryon-
chromosomes sont censées être iden- naire. Parmi les gènes transmis par le
père, ceux qui contribuaient au dévelop-
pement de l'embryon semblaient avoir
été inactivés, et des gènes indispensables
à la formation du sac vitellin et du pla-
centa semblaient inactivés lorsqu'ils
étaient transmis par la mère.
Bruce Cattanach, du Conseil de la
recherche médicale d'Oxford, a observé
une autre manifestation de l'empreinte
parentale. Depuis plusieurs années, il
s'intéresse au phénomène de non-équiva-
lence des croisements réciproques et il a
créé un outil pour étudier ces caractères :
des lignées de souris avec une ou plu-
sieurs paires de chromosomes fusionnés.
Chez ces souris, certains chromosomes
sont liés physiquement, de sorte qu'ils ne
se séparent pas lors de la méiose ; ainsi,
une cellule qui se divise reçoit parfois
deux exemplaires d'un chromosome, et
une autre cellule n'en reçoit aucun.
Quand un ovule qui contient deux exem-
plaires d'un chromosome est fécondé par
un spermatozoïde dépourvu de ce chro-
mosome, l'embryon résultant contient le
nombre normal de chromosomes, mais
les deux exemplaires du chromosome
proviennent de la mère. De même, les
deux exemplaires proviennent du père
quand le spermatozoïde porte les deux
 chromosomes et que l'ovule n'en porte
aucun. Si des hybrides réciproques
étaient équivalents, tous les animaux
résultant de ces fécondations seraient
identiques ; or les expériences de
B. Cattanach ont montré que cette équi-
valence était mise en défaut pour plu-
sieurs chromosomes de souris.
Ainsi les souris ayant hérité leurs
deux chromosomes I I d'un même parent
ont des tailles et des poids très différents
de ceux des souris normales. Élevées
dans les mêmes conditions que d'autres
souris au patrimoine génétique normal,
les souris à deux chromosomes 11 mater-
nels étaient anormalement petites, tandis
que les souris à deux chromosomes 11
paternels étaient géantes. Des expé-
riences analogues réalisées avec d'autres
paires de chromosomes fusionnés font
apparaître des anomalies caractéristiques,
anatomiques, physiologiques et compor-
tementales ; elles sont parfois fatales.
Ces expériences ont également révélé
que les effets de l'empreinte parentale ne
persistent pas dans les générations ulté-
rieures ; elle n'est pas une modification
permanente des chromosomes. Une petite
souris mâle qui a reçu ses deux chromo-
somes 11 de sa mère engendre générale-
ment des descendants de taille normale.
Ainsi les gènes reçus de la mère ont-ils
été débarrassés de l'empreinte mater-
nelle, pour être « reconvertis » en gènes
mâles. Après les découvertes de
J. McGrath, D. Solter, A. Surani et
B. Cattanach, les chercheurs de plusieurs
laboratoires (dont le nôtre) se sont
demandé si l'empreinte parentale résul-
tait de modifications directes de l'ADN.
4. L'EMPREINTE parentale portée par les
gènes suppresseursde tumeurs (tel Rd) peut
augmenterle risque d'apparition de certains
cancers. Chez les individus modifiés épigé-
nétiquement, un seul accident génétique,
comme une mutation ponctuelle ou une
délétion chromosomique,suffit à rendre une
cellule cancéreuse.Sans cette empreinte, de
tels événementsdoivent se produire deux
fois avant que la tumeur apparaisse.
Nous avons notamment étudié le rôle
de la méthylation de I'ADN, un méca-
nisme où de petits groupes méthyle se
lient à l'ADN. Nous avons alors observé
que certains gènes sont méthylés diffé-
remment selon le sexe du parent et que
cette modification épigénétique est réver-
sible. Cependant personne n'a encore
prouvé que ces modifications sont les
mécanismes responsables de l'empreinte
parentale ou si elles ne sont que des
conséquences d'un phénomène biochi-
mique plus fondamental encore inconnu.
Tous mes collègues ne sont pas de
mon avis, mais je parierais que la méthy-
lation de l'ADN n'est qu'une conséquence
d'un autre mécanisme plus fondamental.
Heureusement nous pouvons continuer à
étudier les empreintes parentales sans
connaître leur cause ; quelle que soit leur
origine, elles se manifestent de façon
étrange, parfois tragique.
L'empreinte parentale peut être à
l'origine de diverses maladies : la nature
fait parfois apparaître chez l'Homme les
anomalies que B. Cattanach a observées
chez la Souris. Robert Nicholls et ses
collègues de l'École de médecine de
Harvard l'ont récemment découvert chez
des patients souffrant du syndrome de
Willi-Prader, une maladie qui associe un
retard mental, une obésité importante,
une petite taille et une atrophie des mains
et des pieds. Après avoir analysé le
génome des patients atteints du syn-
drome de Willi-Prader et celui de leurs
parents, R. Nicholls a conclu que de
nombreux patients avaient hérité leurs
deux exemplaires du chromosome 15 de
leur mère.
Empreinte parentale
et cancers
Avec sa collègue Joan Knoll et Charles
Williams, de l'Université de Floride,
R. Nicholls a étudié le génome de patients
atteints du syndrome d'Angelman ; ceux-ci
rient de façon intempestive, font des mou-
vements saccadéset présentent un retard
moteur et intellectuel. Ces patients mon-
trent souvent une délétion partielle du
chromosome 15 hérité de leur mère, seul le
chromosome 15 du pèreest entier.
Il est étonnant que deux maladies
caractérisées par des signes cliniques si
différents, soient liées à une empreinte
parentale des mêmes gènes, portés par le
même chromosome. Cependant, contraire-
ment aux souris anormalement petites ou
grandes de B. Cattanach, les syndromes de
Willi-Prader et d'Angelman ne sont pas
les côtés pile et face d'une même pièce de
monnaie, ils ne résultent pas d'un excès ou
d'un défaut des produits d'un même gène.
Ces études soulignent la difficulté de pré-
voir les conséquences physiologiques de
l'empreinte parentale et l'on devrait sans
doute rechercher des anomalies de cette
modification épigénétique dans de nom-
breusesmaladies génétiqueshumaines.
L'empreinte parentale pourrait même
avoir des conséquences importantes : on
soupçonnequ'elle intervient dans plusieurs
cancers infantiles, notamment le rhabdo-
myosarcome embryonnaire (une tumeur
des muscles), les tumeurs de Wilms (une
forme de cancer du rein) et l'ostéosarcome
(une forme de cancer des os).
Comment l'empreinte parentale agit-
elle dans ces maladies ? Avant de l'expli-
quer, rappelons que de nombreux cancers
semblent résulter de l'accumulation de
mutations successives dans des gènes
spécifiques d'une même cellule. Le chro-
mosome 11, par exemple, porte un gène
Rd qui appartient à une famille d'onco-
gènes récessifs, les anti-oncogènes, des
gènes qui s'opposent à la formation de
tumeurs et qui doivent être présents sur
les deux chromosomes d'une paire pour
se manifester (voir Les gènes de cancers,
par Robert Weinberg, dans ce dossier).
Sans le produit engendré par l'anti-onco-
gène Rd, les cellules musculaires se trans-
forment en cellules cancéreuseset engen-
drent finalement un rhabdomyosarcome.
Comme chaque noyau cellulaire
contient deux chromosomes 11, les deux
exemplaires de l'anti-oncogène Rd doivent
être inactivés pour qu'une cellule se trans-
forme. Un des deux gènes Rd peut être
inactivé de plusieurs façons, notamment
par une mutation de la séquence d'ADN.
En présence d'une telle mutation, tout
mécanisme génétique qui inactive l'autre
exemplaire du gèneRd risque de rendre la
cellule cancéreuse : l'accident génétique
qui inactive le second anti-oncogène Rd
détruit, soit le chromosome tout entier,
soit la partie qui contient le gène.
Avec mes collègues Heidi Scrable et
Webster Cavenee, de l'Institut Ludwig à
Montréal, nous avons proposé un nouveau
mécanisme pour certains cancers infan-
tiles. Nous pensons que l'événement qui
inactive le premier exemplaire d'un anti-
oncogène n'est pas une mutation vraie,
mais plutôt une modification épigéné-
tique, qui activerait ou inhiberait différem-
ment les gènes des mâles et des femelles
(le second événement,qui déclencherait le
cancer, serait une délétion chromoso-
mique ou tout autre accident génétique).
Ainsi, les cellules tumorales de rhabdo-
myosarcome auraient sur leur chromo-
some 11 subsistant un exemplaire du gène
Rd inactif et qui porterait une empreinte
parentale ; ce chromosome proviendrait
du même parent dans la plupart des cas de
rhabdomyosarcome embryonnaire.
Les équipes de Grady Saunders, du
Centre cancérologique de Houston, de
Manfred Mannens, à l'Université
d'Amsterdam, et de Masao Sasaki, à
l'Université de Kyoto, ont confirmé notre
hypothèse. Dans les rhabdomyosarcomes
embryonnaires, les tumeurs de Wilms et
les ostéosarcomes, la première inactiva-
tion touche presque toujours un anti-onco-
gène porté par un chromosome paternel.
L'empreinte parentale interviendrait dans
la genèse de ces tumeurs, bien que tout le
mécanisme ne soit pas encore démonté.
La chorée de Huntington
Une difficulté théorique importante
demeure : quelle est l'origine de
l'empreinte parentale ? La plupart de ceux
qui l'ont étudiée ont cru qu'elle résultait
des différences physiologiques et biochi-
miques fondamentales entre la formation
des gamètes mâles (les spermatozoïdes)et
femelles (les ovules). Les mâles adultes
produisent des milliards de spermato-
zoïdes issus d'une population de cellules
souches qui se divisent en permanence.
Au contraire les femelles naissent avec
tous les ovules qu'elles libéreront lors de
leur période reproductive ; les ovules
matures sont libérés un par un à intervalles
réguliers. Pour beaucoup, ces différences
physiologique étaient également respon-
sablesdes modifications épigénétiques.
Cependant si les différences
d'empreintes parentales ne résultaient
que des différences entre la production
des gamètes, tous les mâles devraient
apposer sur leur génome une empreinte
particulière, et toutes les femelles, une
autre. En l'absence d'indices contraires,
nous avions supposé que tous les indivi-
dus d'un même sexe marquaient leur
génome de la même façon.
Manifestement cette hypothèse était
fausse, et l'étude des cancers infantiles
imputant les anti-oncogènes hérités du
père l'a réfutée : si tous les individus
mâles marquaient et inactivaient le gène
Rd, par exemple, le rhabdomyosarcome
embryonnaire serait très fréquent : une
seule modification génétique du gène Rd
transmis par la mère transformerait les
cellules d'un individu. Comme ces
tumeurs sont très rares (un enfant sur
20 000 est atteint), il est peu probable
que chacun de nous possède un anti-
oncogène inactif hérité du père.
Toutefois, chez les personnes atteintes,
l'explication précédente semble la bonne.
On serait tenté d'expliquer cet écart
entre la théorie et la réalité en disant que
tous les mâles (ou toutes les femelles) ne
modifient pas et n'inactivent pas les
mêmes gènes. Comment, dès lors, expli-
quer ces différences entre individus ?
Pour un vrai généticien, la génétique
a réponse à tout : plusieurs gènes-diffé-
rents de ceux qui subissent l'empreinte
seraient responsables de l'empreinte
parentale, c'est-à-dire que l'empreinte
résulterait de l'action de plusieurs gènes
agissant différemment chez les mâles et
chez les femelles. Les individus du même
sexe imprimeraient des marques diffé-
rentes puisque les gènes responsables de
l'empreinte ne sont pas identiques. Ainsi
la plupart des mâles auraient un gène Rd
actif, mais chez quelques-uns, les gènes
responsables de l'empreinte parentale
seraient anormaux et le gène Rd, inactivé.
On sait depuis longtemps que
l'expression et l'inactivation d'un gène
sont commandées par d'autres gènes :
c'est le vieux phénomène génétique de
modification de dominance. De nom-
breux caractères réagissent à l'activité
d'autres gènes, qui « modifient leur
expression», et l'empreinte parentale ne
serait qu'un cas particulier de modifica-
tion de dominance. Ces gènes modifica-
teurs qui commanderaient l'empreinte
parentale auraient pourtant une caractéris-
tique inhabituelle : leur action serait diffé-
rente chez les mâles et chez les femelles.
La chorée de Huntington est
l'exemple d'un caractère modifié par une
empreinte dépendant du sexe. Cette mala-
die neurologique fatale, d'origine géné-
tique, est transmise selon le mode domi-
nant : il suffit que l'enfant hérite d'un seul
gène de la chorée (transmis par l'un ou
l'autre des parents) pour qu'il soit atteint.
Cette maladie se manifeste vers 38 ans en
moyenne, mais dix pour cent environ des
cas apparaissent chez des jeunes enfants,
dès l'âge de deux ans et demi.
Les médecins ont observé que dans
90 pour cent des cas infantiles, c'est le
père qui est également atteint : le père et
l'enfant portent le même gène, mais des
modifications liées à la transmission par
le père révèlent la maladie beaucoup plus
tôt chez l'enfant. On a proposé diverses
hypothèses pour expliquer la génétique
de la chorée de Huntington, mais celle de
Charles Laird, de l'Université de
Washington, semble la meilleure ; il a
transposé à cette maladie une particula-
rité génétique de la drosophile : les effets
de positions variables responsables de
l'expression variable de certains carac-
tères. Cependant ces caractères sont inha-
bituels, car, contrairement à la plupart des
autres mutations, ils ne sont pas exprimés
dans toutes les cellules des tissus atteints.
Les tissus pathologiques constituent des
mosaïques de cellules mutées et de cel-
lules qui semblent parfaitement normales.
La proportion de cellules qui expriment
la mutation est déterminée par des gènes
modificateurs dont l'action se traduit par
des modifications variables ; les tissus
peuvent être parfaitement normaux ou
totalement pathologiques.
Selon C. Laird, si la variabilité de
l'âge d'apparition de la chorée de
Huntington résulte de celle de l'expres-
sion en mosaïque du gène de la maladie,
des gènes modificateurs de l'expression
en sont probablement la cause. Un gène
modificateur qui déplacerait l'équilibre
vers davantage de tissu mutant corres-
pondrait à une apparition précoce de la
chorée, tandis qu'un gène qui favoriserait
le tissu normal retarderait son apparition
(dans certains cas, les patients ne sont pas
atteints avant 70 ans ou plus).
Afin d'expliquer la prépondérance des
formes juvéniles transmises par le père,
C. Laird a émis l'hypothèse que le gène
modificateur était localisé sur le chromo-
someX. Comme les hommes n'ont qu'un
seul chromosome X, toute anomalie du
gène modificateur porté par ce chromo-
some ne peut être compensée, contraire-
ment à ce qui se passe chez les femmes,
de sorte que les hommes ont davantagede
risques d'avoir des enfants où la propor-
tion de cellules mutantes est élevée et qui
souffrent très tôt de la chorée de
Huntington. Pourtant dix pour cent des cas
infantiles appartiennent à des familles où
la mère-et non plus le père-est atteinte :
il n'est en effet pas impossible que des
femmes aient des gènes modificateurs
anormaux sur leurs deux chromosomes X,
toutefois cette situation devait être rare.
Ce modèle semble bien expliquer la
génétique de cette maladie compliquée.
J'ai un peu précisé la théorie de C. Laird
afin d'éclairer le comportement des gènes
modificateurs, et cette petite modification
permet de mieux appréhender la véritable
génétique de la chorée de Huntington.
Le modèle de C. Laird nous ramène
aux origines de l'empreinte parentale : à
ma connaissance, les premières études
approfondies de ces empreintes ont été
réalisées chez la drosophile, par Janice
Spofford, de l'Université de Chicago, qui
a étudié des effets de position variable.
Publié en 1959, ce travail passa presque
inaperçu. Depuis, quelques études sur les
caractères génétiques déterminés par le
parent qui les a transmis ont paru. Chez
des organismes aussi différents que la
drosophile, les levures, le maïs, la Souris
et l'Homme, certains caractères semblent
modifiés par l'empreinte parentale.
Néanmoins l'empreinte parentale est
généralement considérée par de nombreux
biologistes comme une curiosité qui ne
concerne que quelques caractères. On me
demande souvent pourquoi je perds mon
temps (sous-entendu : pourquoi je le fais
perdre à mes interlocuteurs) à étudier un
phénomène aussi futile. Je réponds tou-
jours que l'on ignore le nombre de carac-
tères subissant l'empreinte, mais que je
suis convaincue qu'il est probablement
élevé. Ma réponse suscite généralement
étonnement et incrédulité, puis un long
exposé des principes mendéliens, et enfin
une affirmation péremptoire que l'héré-
dité de la plupart des caractères ne fonc-
tionne pas de cette façon.
Jusqu'à un certain point, ces critiques
sont fondées. Si la plupart des caractères
dépendaient complètement du sexe du
parent qui les avait transmis, les généti-
ciens l'auraient certainement observé plus
tôt. Cependant tout dépend peut-être de la
précision avec laquelle on étudie l'héré-
dité. Quand J. Spofford étudia l'expression
en mosaïque des caractères mutants de la
drosophile, elle observa les mêmes carac-
tères chez tous les descendantsde croise-
ments réciproques, conformément aux
observationsde Mendel. Pourtant les diffé-
rences dans l'expression de ces caractères
étaient suffisantes pour qu'elle distingue le
sexe du parent qui les avait transmis.
Nos travaux et ceux de Alan Peterson,
à l'Institut Ludwig de Montréal, ont mon-
tré que plusieurs caractères de la Souris
sont en mosaïque Quand on s'interroge
simplement sur la présence de ces carac-
tères, on peut répondre sans ambiguïté
qu'ils existent, mais lorsque l'on cherche
comment ces caractères sont exprimés,
l'effet de l'empreinte parentale apparaît.
Pour certains caractères, l'expression est
discrète, mais pour d'autres, elle peut être
critique : selon le degré de l'expression, les
malades manifesteront la chorée de
Huntington à 5 ou à 70 ans,d'autres auront
ou n'auront pas de tumeur de Wilms.
L'une des directions de recherche les
plus prometteuses de l'empreinte paren-
tale est peut-être l'étude de la transmis-
sion des maladies génétiques complexes.
On ignore encore si ces études permet-
tront de mieux comprendre ces maladies,
mais les succès théoriques, sinon pra-
tiques, que nous avons obtenus pour la
chorée de Huntington et certains cancers
infantiles sont porteurs d'espoir.
 MÉCANISMES
LES On diagnostique la mucoviscidose en
observant des concentrations anormale-
GÉNÉTIQUES ment élevées en sodium et en chlore,
dans la sueur. La maladie provoque en
effet une diminution du transport des
DE LA MUCOVISCIDOSE ions chlorures à travers la membrane des
cellules des muqueuses : ces cellules
sécrètent alors un mucus déshydraté et
visqueux qui obture les voies aériennes et
digestives. Les malades souffrent d'infec-
La
mucoviscidose est la maladie déclare si les deux chromosomes por- tions répétées (leur épithélium respira-
génétique la plus fréquente : en France, tent la mutation). Quand les deux toire ne pouvant évacuer les poussières
un enfant atteint naît chaque jour. Cette parents sont porteurs, un enfant sur et les agents pathogènes), d'une insuff-
maladie est autosomatique (elle atteint quatre risque de contracter la maladie, et sance respiratoire et de troubles digestifs.
les cellules qui ne sont pas les cellules la moitié de la descendance sera à son On les soulage par une kinésithérapie
sexuelles) et récessive (la maladie se tour porteuse du gène muté. respiratoire, des antibiotiques, des extraits
pancréatiques et certaines drogues (on
tente exceptionnellement une greffe de
poumon). Ces traitements ont augmenté
l'espérance de vie d'un enfant atteint de
mucoviscidose de quelques mois, à 20 ou
25 ans. Toutefois, ces soins restent pallia-
tifs : ils n'agissent pas sur la molécule res-
ponsable de la maladie
Récemment des progrès décisifs ont
été accomplis dans la compréhension
des mécanismes moléculaires à l'origine
de la mucoviscidose, ouvrant de nou-
velles voies thérapeutiques. En 1989,
l'équipe canadienne de Lap Chee Tsui
identifia et clona le gène dont certaines
mutations déclenchent la maladie : situé
sur le chromosome 7, ce gène code une
protéine membranaire nommée CFTR
(régulateur de la conductance membra-
naire de la mucoviscidose). On crut
d'abord que cette protéine était un régu-
lateur du transport des ions chlorures,
mais des résultats récents suggèrent que
la protéine CFTR forme un canal trans-
membranaire qui laisse passer ces ions.
Puis on identifia plusieurs mutations
du gène CFTRet leurs effets sur le trans-
port ionique. Ainsi l'équipe américaine
d'A. Smith montra que la principale
mutation responsable de la maladie,
nommée AF508, semble empêcher la
maturation de la protéine CFTRet sa
migration vers la membrane plasmique :
celle-ci, dépourvue de canaux chlorures,
ne pourrait pas transporter ces ions.
Cependant les travaux réalisés par
Pascal Barbry et Guy Champigny, dans
l'équipe CNRS de Michel Lazdunski, à
Sophia-Antipolis, en collaboration avec
Wilfried Dalemans, de la Société
Tronsgène, révèlent qu'une partie des
protéines CFTR portant la mutation
AF508 atteignent la membrane plas-
1. La mucoviscidose est la plus fréquente des maladies autosomatiques récessives mique où elles transportent les ions
graves dans la population blanche. L'analyse post mortem du pancréas d'un chlorures, avec une efficacité toutefois
malade révèle la présence de kystes et de fibroses :canaux
les pancréatiques sont réduite. Par conséquent, les défauts asso-
dilatés et bloqués ciés à cette mutation pourraient être
des mucus ; les glandes pancréatiques sont atrophiées
par et
remplacées par un tissu fibreux. corrigés en rétablissant la maturation de
 la protéine CFTR ou encore en activant
les canaux membranaires.
La protéine CFTR,qui est formée de
1480 acides aminés, comporte deux
régions symétriques : chacune d'elles
contient six segments transmembranaires
(TM1 ou TM2)et un site de fixation de l'ATP
(NBD1 ou NBD2), qui est cytoplasmique. Les
deux régions symétriques sont reliées par
le domaine R, situé dans le cytoplasme, qui
comporte plusieurs sites de phosphoryla-
tion par la protéine kinase A. L'ouverture
du canal CFTRnécessiterait la phosphoryla-
tion du domaine R (c'est-à-dire la fixation
de groupements phosphates sur certains
acides aminés, les sérines), elle- mêmeacti-
vée par l'AMPcyclique, ainsi que la fixation
d'ATP sur les sitesNBDI et NBD2.
En Europe, une personne sur 20 pos-
sède un allèle muté du gène CFTR: ces
personnes ne sont pas malades, car elles
conservent un allèle normal qui est fonc-
tionnel, mais elles transmettent la mala-
die lorsque leurs descendants héritent de 2 La mucoviscidose se caractérise par une diminution du transport des ions chio-
deux allèles mutés. On connaît plus de rures à trovers la protéine CFTR, située dans la membrane des cellules épithéliales.
120 mutations de la protéine CFTR qui Chez les malades portant la mutation #F508, on pourrait corriger ce défaut en
déclenchent la mucoviscidose ; la plupart rétablissant la migration de la protéine CFTRvers la membrane plasmique (1) ou
d'entre elles ne modifient qu'un acide en activant l'ouverture des canaux chlorures présents dans la membrane (2).
aminé et portent sur un des deux sites
de fixation de l'ATP.En Europe du Nord,
lisé la technique du patch-clamp, qui per- La thérapie génique, qui consiste à
70 pour cent des cas de mucoviscidose
résultent de la délétion d'une phénylala- met d'analyser le fonctionnement d'un introduire dans l'organisme les gènes
nine en position 508, dans le site NBD1. seul canal : on isole un fragment de mem- normaux correspondant aux gènes défi-
Selon l'équipe d'A. Smith, la protéine brane du reste de la cellule, à l'aide d'une cients, afin de rétablir la synthèse des
ainsi mutée, la AF508, présenterait un micropipette en verre reliée à une élec- protéines normafes, constitue le traite-
défaut de maturation : alors que la pro- trode et à un amplificateur, et on enre- ment idéal des maladies génétiques.
téine CFTRnormale subit une glycosyla- gistre les variations de courant associéesà Dans le domaine de la mucoviscidose,
tion (le greffage d'un sucre), au cours de l'ouverture ou à la fermeture des canaux une première étape vers une thérapie
sa migration entre le réticulum endoplas- situés dans ce fragment de membrane. génique a été franchie par l'équipe CNRS
mique et la membrane plasmique, la pro- Grâce à cette technique, qui valut le de Michel Perricaudet, à l'Institut Gustave
téine AF508 ne subirait pas cette glyco- prix Nobel à ses inventeurs, Erwin Neher Roussy, en collaboration avec Transgène
sylation et ne migrerait pas vers la et Bert Sakmann, les chercheurs niçois et avec le groupe de Ronald Crystal, au
membrane plasmique. ont montré que le canal muté et le canal NIH. Ces chercheurs ont rétabli le trans-
normal présentent la même conductance port des ions chlorures dans des cellules
L'équipe ionique, la même sélectivité à l'égard des pancréatiques provenant de malades
de M. Lazdunski a com-
paré l'activité de la protéine CFTR nor- anions bromures et iodures et le même atteints de mucoviscidose et cultivées in
male et celle de laprotéine #F508, temps moyen d'ouverture. Cependant les vitro, en infectant ces cellules avec un adé-
après avoir infecté des fibroblastes par le canaux mutés sont quatre fois moins novirus portant le gène CFTR, que celles-ci
virus de la vaccine portant le gène CFTR nombreux que les canaux normaux à la ont alors exprimé. Puis, les mêmes cher-
normal ou le gène muté-pour faire surface des cellules, et ils restent fermés cheurs ont fait produire in vivo la protéine
produire à ces cellules les protéines cor- trois fois plus longtemps que ces demiers. CFTRhumaine à des cellules pulmonaires
respondantes. Les chercheurs niçois ont Ainsi la diminution du transport des de rats, durant plus de six semaines, en
confirmé le défaut de maturation de la ions chlorures, dans les cellules portant la introduisant dans la trachée des animaux
protéine AF508, mais ils ont observé mutation AF508, résulterait de la un adénovirus portant le gène CFTR.
une activité résiduelle de la protéine conjonction de deux phénomènes : un Plus récemment encore, l'équipe
mutée. Ainsi l'addition d'AMP cyclique, défaut de migration de la protéine vers la américaine d'A. Smith a rapporté des
dans les cellules qui synthétisent la pro- membrane plasmique et une ouverture résultats encourageants d'essais de théra-
téine AF508, stimule un efflux d'ions des canaux moins fréquente. La persis- pie génique chez l'homme.
iodiures radioactifs (125|-); cet efflux est tance d'une activité réduite, dans les La recherche de traitements contre
cependant trois fois plus faible que dans canaux mutés, laisse espérer que l'on la mucoviscidose progresse ainsi sur plu-
les cellules qui synthétisent la protéine pourrait rétablir leur activité normale à sieurs fronts, laissant espérer que les
CFTRnormale. l'aide d'un activateur des canaux chlo- malades pourraient disposer à l'avenir
Pour connaître l'origine de cette acti- rures-on connaît déjà de tels activa- d'une pharmacothérapie ou d'une théra-
vité réduite, les chercheurs niçois ont uti- teurs pour d'autres canaux ioniques. pie génique efficaces.
 L'hémophilie

Richard Lawn et Gordon Vehar

Le sang des personnes hémophiles ne coagule pas vail, on ne connaissait ni sa structure, ni

parce qu'une anomalie génétique
d'une protéine clef de la coagulation.
le gène normal codant cette
UNEANOMALIE minime
d'un seul gène humain
suffit parfois à provo-
quer une maladie
grave, parce que la
protéine codée par le gène modifié est
elle-même anormale ou absente. L'hémo-
philie est une des maladies dues à une
cause de ce type : les personnes hémo-
philes manquent d'une protéine sanguine
qui joue un rôle très important dans la
suite de réactions enzymatiques permet-
tant au sang de coaguler, à l'endroit d'une
blessure. Quand un individu atteint d'une
forme grave d'hémophilie n'est pas traité,
il peut présenter une hémorragie inteme à
la suite d'un choc même très faible et la
probabilité qu'il décède, très jeune, d'une
telle hémorragie est importante.
Aujourd'hui on traite les personnes
hémophiles en leur injectant périodique-
ment une solution concentrée de la pro-
téine de coagulation dont ils manquent et,
par rapport au début des années 1960-
date à laquelle ce traitement est apparu-
la vie des personnes hémophiles traitées
s'est considérablement améliorée : I'espé-
rance de vie des individus hémophiles,
autrefois d'environ 20 ans seulement, est
aujourd'hui quasi normale. Toutefois le
traitement n'est pas idéal, car on prépare
la solution concentrée de protéine à partir
d'un mélange de sang provenant de nom-
breux donneurs. Cette méthode présente
plusieurs inconvénients. Premièrement le
produit peut propager des maladies
virales : de nombreuses personnes hémo-
philes sont infectées de façon chronique
par les virus de l'hépatite et on se sou-
vient de l'affaire du sang contaminé par
le virus du syndrome d'immuno-défi-
cience acquise (SIDA). Deuxièmement,
dans les pays pauvres, il est souvent diffi-
cile de trouver une solution concentrée de
protéine de coagulation. Troisièmement
les prive
On a isolé
protéine.
son coût est élevé : le traitement annuel
d'une personne hémophile coûte entre
40 000 et 70 000 francs.
Pour toutes ces raisons, il importait de
rechercher une méthode de synthèse de la
protéine anti-hémophilique par génie géné-
tique. Dans la majorité des cas, l'hémophi-
lie est due à un défaut de l'ADN codant la
protéine de coagulation appeléele facteur
VIII. Deux équipes de recherche ont
récemment isolé le gène du facteur VIII à
partir de cellules de personnes saines et
elles l'ont recombiné à de l'ADN de cel-
lules en culture. Par multiplication des cel-
lules «recombinantes», on a obtenu un très
grand nombre de cellules contenant le
gène du facteur VIII ; chacune de ces cel-
lules recombinantes exprime les instruc-
tions du gène, de sorte que l'on récupère
une quantité importante de facteur VIII.
Le facteur VIII produit par biosyn-
thèse est fonctionnel : il déclenche la
coagulation d'échantillons de sang prove-
nant de personnes hémophiles et s'est
avéré efficace dans le traitement de
chiens hémophiles. Dans notre labora-
toire de la Société Genentech, à San
Francisco, et dans celui de la Société
Genetics Institute, des chercheurs mettent
au point des méthodes industrielles de
synthèse du facteur VIII. La protéine de
synthèse doit encore faire l'objet de tests
sur des animaux et des patients humains,
mais il est probable que, dans quelques
années, on produira des quantités impor-
tantes de facteur VIII non contaminé.
Le clonage du gène du facteur VIII a
déjà eu des conséquences notables : il a
bouleversé l'étude de l'hémophilie,
jusqu'alors très ardue, car le facteur VIII
était extrêmement difficile à purifier à
partir du sang. Assez rare dans l'orga-
nisme, le facteur VIII est une protéine de
grande taille, très instable ; de plus,
lorsque nous avons commencé notre tra-
l'endroit de l'organisme où il est synthé-
tisé. Aujourd'hui, on synthétise le facteur
VIII en laboratoire et l'on peut en utiliser
des quantités bien supérieures pour les
études sur l'hémophilie. On a déterminé
la structure fondamentale de la protéine à
partir de sa «matrice génétique» et, dans
certains cas, on a découvert les mutations
génétiques responsables de l'hémophilie.
La génétique
de l'hémophilie
On sait depuis fort longtemps que
l'hémophilie est héréditaire : le Talmud
indiquait déjà que les garçons dont les
frères plus âgés ou les cousins étaient
morts d'hémorragie à la suite d'une circon-
cision ne devaient pas subir cette opéra-
tion. Le mode de transmission de la mala-
die (en général, les mâles sont atteints,
mais les femelles peuvent être « conduc-
trices ») fut décrit avec précision au début
du XIXesiècle. La plus célèbre des conduc-
trices était peut-être la reine Victoria, dont
un fils était hémophile, et au moins deux
filles étaient conductrices ; en se mariant,
ces dernières disséminèrent le gène mutant
de Victoria dans les familles royales
d'Allemagne, de Russie et d'Espagne.
L'hémophilie est une maladie hérédi-
taire liée au sexe car le gène du facteur
VIII se trouve sur le chromosome X ;
puisqu'un homme ne possède qu'un gène
codant le facteur VIII (sur le chromosome
X hérité de sa mère), il est hémophile si ce
gène est anormal. Au contraire, une
femme possèdedeux gènes du facteur Vin
(un reçu du père et un reçu de la mère) et
elle peut donc posséder un gène anormal
sansêtre hémophile : le gène normal porté
par l'autre chromosome X la protège ;
comme il est rare que les gènes soient tous
deux anormaux, peu de femmes sont
hémophiles. Les femmes conductrices
transmettent leur gène mutant à la moitié
de leurs filles, qui sont conductrices, et à
la moitié de leurs fils, qui sont hémophiles.
On connaît dans les grandes lignes les
anomalies biochimiques de coagulation
sanguine des personnes hémophiles. La
coagulation débute par le rassemblement
des plaquettes au site de la blessure ; les
plaquettes sont retenues sur la blessure
par un polymère insoluble, la fibrine, qui
forme un réseau à partir d'un précurseur
soluble, le fibrinogène. Cette réticulation
de la fibrine est un événement fondamen-
tal de la coagulation : c'est l'aboutisse-
ment d'une séquence complexe d'interac-
tions protéiques déclenchée lors de la
lésion d'un vaisseau sanguin. A chaque
étape de cette «cascade», la coupure d'un
précurseur protéique produit une enzyme
active, appelée protéase ; cette dernière
coupe une autre protéine et forme une
autre protéase, qui répète l'opération. La
plupart des coupures enzymatiques font
intervenir des cofacteurs qui, dans cer-
tains cas, sont eux-mêmes des protéines
présentes à la fois sous forme active et
inactive. Le facteur VIII, en dépit de son
nom, est l'un de ces cofacteurs : il permet
à une protéase, le facteur IX, d'activer le
facteur X en cours de cascade.
Cette voie d'activations en cascade
comporte des rétroactions positives, qui
accélèrent la coagulation, et des rétroac-
tions négatives qui favorisent l'arrêt du
processus. Ainsi la thrombine, la protéase
qui convertit le fibrinogène en fibrine,
active le facteur VIII et, simultanément,
une protéase, appelée protéine C, qui
inhibe ce facteur VIII. Comme la concen-
tration normale en facteur VIII dans le
sang est extrêmement faible (pour chaque
molécule de facteur VIII, il y a environ
un million de molécules d'albumine, la
protéine sanguine la plus importante), on
pense qu'il existe un facteur limitant
l'ensemble des réactions. En d'autres
termes, la facilité d'activation et d'inhibi-
tion du facteur VIII est sans doute en par-
tie responsable de la précarité de l'équi-
libre qui existe entre la formation des
caillots et le libre écoulement du sang,
chez les personnes saines.
Chez les individus hémophiles, cet
équilibre est rompu : environ 85 pour
cent d'entre eux, soit à peu près un
homme sur 10 000, souffre d'hémophilie
classique (ou hémophilie A) : l'absence
de facteur VIII fonctionnel bloque la cas-
cade de réactions avant la formation de
fibrine. Les autres personnes hémophiles
sont atteintes d'hémophilie B, due à une
déficience en facteur IX. On a cloné le
gène du facteur IX et plusieurs équipes
recherchent des méthodes de biosynthèse
du facteur IX, mais la synthèse du facteur
VIII est d'un enjeu plus important,
puisque l'hémophilie A atteint plus de
personnes que l'hémophilie B.
La synthèse
du facteur Vlll
La synthèsed'une protéine aussi volu-
mineuse et aussi rare que le facteur VIII
était un défi technique sansprécédent. En
fait, les difficultés techniques nous ont
obligés à modifier la méthode standardpar
laquelle on clone les gènes et on leur fait
commander la synthèse des protéines.
Comme toutes les protéines, le facteur VIII
est une chaîne d'acides aminés, et le gène
qui code cette chaîne est un segment
d'ADN, c'est-à-dire une chaîne de nucléo-
tides. La séquence en acides aminés est
déterminée par la séquenceen nucléotides.
Chaque nucléotide comporte une des
quatre bases suivantes : l'adénine (A), la
thymine (T), la guanine (G) ou la cytosine
(C), et les groupes de trois bases, les
codons, codent chacun un acide aminé. Les
bases s'apparient par paires complémen-
taires et réunissent les deux brins d'ADN en

1. LES BRINS DE FIBRINE stabilisent un caillot sanguin à l'endroit
d'une blessureen piégeant les plaquettes qui forment le caillot. Sur
cette micrographie électronique réalisée par Jon Lewis, de
l'Université WakeForest, on voit un caillot constituéd'une suspen-
sion de plaquettes et de fibrine. La formation d'un caillot dans le
sang résulte d'une séquencecomplexe de réactions enzymatiques
aboutissantà la conversiondu fibrinogène, une protéine soluble,en
brins insolubles de fibrine. Chez les personnes atteintes d'hémophi-
lie, une protéine qui joue un rôle fondamental dans la coagulation
estabsenteou anormale.
 une double hélice ; cet appariement com- On commence donc par fabriquer des les conditions étaient défavorables : le
mande d'autre part la transcription du gène copies d'ADN à partir des ARNmessagers,à facteur VIII est rare et, lorsque nous
en ARNmessager (mARN), puis la traduc- l'aide d'une enzyme transcriptase inverse. avons commencé notre travail personne
tion de cet ARNmessageren protéine. On intègre ensuite différents segments ne savait quels organes le produisaient ;
Pour synthétiser une protéine in vitro, d'ADN copie dans le matériel génétique si nous avions tenté de constituer une
il faut trouver le gène codant la protéine d'un vecteur, souvent le bactériophage banque d'ADN copie nous aurions pu
parmi les milliers de gènes présents dans lambda (un virus qui infecte les bactéries) ; choisir un mauvais type de cellules et
une cellule. Le phénomène d'appariement puis on introduit les bactériophages dans constituer un banque qui n'aurait pas
des bases permet de résoudre ce pro- les bactéries de telle sorte que chaque bac- contenu le gène du facteur VHI.
blème : on utilise un petit fragment d'ADN tériophage se multiplie indépendamment Nous avons donc décidé de chercher le
ou d'ARN dont la séquence de bases est des autres dans une boîte de Pétri et forme gène du facteur VIII là où nous étions sûrs
complémentaire du gène recherché, on une plage de lyse, c'est-à-dire une zone de le trouver : dans un ensemble de frag-
marque cette sonde avec un nucléotide contenant des bactériophages et des bacté- ments d'ADN représentant tout le génome
radioactif, et quand on la mélange à l'ADN ries mortes. L'ensemble des plages consti- (l'ensemble des gènes).Pour fabriquer une
d'une «banque» de gènes, elle s'hybride tue une banque d'ADN copie. L'une des telle banque génomique, on extrait les
avec le gène désiré, qui est alors marqué. plages au moins contient le segment d'ADN chromosomes des cellules, on découpe
Plus la banque de gènes est petite, plus copie désiré ; par hybridation avec la l'ADN en segmentset on lie ces segmentsà
il est facile d'isoler un gène particulier. Le sonde, on identifie cette plage. l'ADN d'un bactériophage lambda. Comme
clonage de l'ADN copie, permet de dimi- La méthode de clonage par les ADN une banque génomique contient des cen-
nuer la taille de la banque, car il utilise le copies n'est utilisable que quand on sait taines de fois plus d'ADN qu'une banque
fait que les gènes ne sont pas tous actifs quelles cellules de l'organisme produisent d'ADN copie, il est plus difficile de détecter
dans toutes les cellules : dans une cellule la protéine désirée. De plus la probabilité le gènedésiré avec une sonde.
donnée, seuls certains gènes sont transcrits de réussir un clonage par cette méthode
en ARN messager, puis traduits en pro- est supérieure quand la protéine est abon- Le criblage de la banque
téines. Quand on connaît les cellules qui dante : les cellules contiendront alors de
synthétisent la protéine désirée, on n'ana- nombreux ARNmessagers, de sorte que de Pour réaliser une sonde, il nous fallait
lyse que les molécules d'ARN messager nombreuses plages de la banque d'ADN connaître au moins une partie de la
présentesdans ces cellules ; ces molécules copie posséderont une copie du gène. Le séquence en acides aminés du facteur
sont la transcription du gène désiré. clonage du facteur VIII fut difficile, car VIII. Ce ne fut pas une mince affaire ! A
l'époque, le facteur VIII n'avait même
pas été purifié et c'est seulement en 1980,
que l'un d'entre nous (G. Vehar), réussit à
purifier quelques milligrammes de facteur
VIII à partir de 25 000 litres de sang de
vaches. Par la suite, Edward Tuddenham
et ses collègues, à Londres, obtinrent suf-
fisamment de facteur VIII humain pour
permettre aux chercheurs de la Société
Genentech de séquencerun court segment
de la protéine. Une équipe de la Société
Genetics Institute réalisa le même travail
avec du facteur VIII de porc, purifié par
David Fassà la Clinique Mayo.
II fallait ensuite former une molécule
d'ADN à partir de la séquence en acides
aminés de la protéine. Ce type de réalisa-
tion est difficile, car le code génétique est
«dégénéré», c'est-à-dire redondant : un
acide aminé peut être codé par six codons
différents (il existe 64 codons distincts
pour seulement 20 acides aminés), mais
on ignore souvent lequel de ces codons est
présent dans le gène naturel. Une solution,
pour trouver la séquencedu gène, consiste
à synthétiser de courtes sondes d'ADN
comportant environ 17 bases,afin de cou-
vrir toutes les possibilités. Cette solution
2. LA COAGULATION commencelorsqu'une cellule lésée,à l'endroit d'une blessure,active n'est
pas satisfaisante, car plus une sonde
une enzyme,le facteur VIII ; la coagulation s'achève par la transformation du fibrinogène plus elle risque de s'hybrider au
est courte,
enfibrine par la thrombine. À chaque étape, une protéine inactive est transformée en une
protéase, une enzymequi coupe les protéines ; chaque protéase active la protéine suivante hasard avec un segment d'ADN différent du
dans la «cascade» de réactions. Certaines étapes nécessitent la présence de cofacteurs, tels gène recherché ; quand on utilise un grand
que le facteur VIII et le facteur V. Il existe plusieurs rétroactions négatives et positives nombre de courtes sondespour cribler une
(flèchesen couleur) : la thrombine active le facteur VIII et le facteur V ; elle inactive égale- grosse banque génomique, le problème
ment (en activant la protéine C) cesdeuxfacteurs, ce qui metfin ti la coagulafion. des « faux positifs »devient préoccupant.
 Pour l'éviter, nous avons choisi de en culture, tandis que John Toole et ses Pour produire des protéines comme
synthétiser une seule sonde, relativement collègues de la Société Genetics Institute l'insuline ou l'interféron, qui sont des
longue (36 bases), formée à partir d'une identifièrent une source de facteur VIII : molécules relativement petites, on utilise
séquencede 12 acides aminés du facteur les cellules du foie. Aujourd'hui on sait des bactéries comme Escherichia coli où
VIII. existait 147 456 codages possibles que l'ARN messager du facteur VIII est l'on place un ADN recombinant.
de cette séquence, mais nous avons éli- également présent dans d'autres tissus, Cependant les bactéries n'ont générale-
miné un grand nombre d'entre eux en nous notamment dans le rein, la rate et les ment pas la capacité de produire des pro-
fondant sur le fait que certains codons sont lymphocytes, mais le foie semble être la téines aussi volumineuses et aussi com-
plus fréquents que d'autres dans les gènes source principale. Chez les personnes en plexes que le facteur VIII ; en particulier,
de mammifères. En fait, 30 des 36 bases bonne santé, le facteur VIII est surtout elles ne possèdent pas toujours les
se sont avérées correctes, ce qui nous a synthétisé par les cellules hépatiques, qui enzymes nécessaires à la modification ou
permis d'obtenir une hybridation assez libèrent la protéine dans le sang. au repliement des grandes protéines après
étroite. Lorsque nous avons sondé la Connaissant la source d'ARN messa- leur synthèse. Pour cette raison, nous
banque génomique, nous avons observé ger du facteur VIII, les chercheurs des avons décidé d'introduire le gène du fac-
que la sonde s'hybridait avec plusieurs des Sociétés Genentech et Genetics Institute teur VIII dans des cellules de Hamster,
segments d'ADN codant le facteur VIII ; constituèrent des banques d'ADN copie ; à que l'on cultive assez facilement. Nous
nous avons ainsi identifié les plages de nouveau, on utilisa des segments du gène avons alors observé que les cellules
lyse contenant des parties du gène. cloné afin de détecter les rares ADNcopie recombinantes de Hamster sécrétaient le
Le gène complet du facteur VIII est du facteur VIII présents parmi les mil- facteur VIII humain dans le milieu de
trop long pour être présent, en totalité, lions de clones de bactériophages de la culture. En fait, nous espérions que ce
dans le génome d'un seul bactériophage. banque. En fait, il fallut reconstituer qu'elles sécrétaient était bien du facteur
Pour déterminer le reste du gène, l'ADN copie du facteur VIII à partir de VIII, mais pour savoir si la protéine pro-
William Wood, Jane Gitschier et d'autres plusieurs segments ayant des parties duite était fonctionnelle, il nous restait à
chercheurs de notre laboratoire, ont criblé communes : l'ARN messager comporte montrer qu'elle faisait coaguler normale-
la même banque une seconde fois, mais environ 9 000 bases et nous ne savions ment le sang de personnes hémophiles. Il
ils ont utilisé comme sonde les segments pas copier une aussi longue molécule en était en effet possible que la protéine syn-
de gène identifiés ; en répétant ce pro- un seul segment. Enfin on a fixé à l'ADN thétisée ne constitue qu'une partie du
cédé, que l'on appelle la « marche sur le copie des séquences qui commandent, complexe protéique absent chez les
chromosome», ils ont obtenu une série de dans les cellules recombinantes, les hémophiles ou que, compte tenu des dif-
segments ayant deux à deux une extré- enzymes responsables de l'initiation et de ficultés de purification du facteur VIII,
mité commune, ce qui leur a permis de l'arrêt de la transcription du gène. nous ayons cloné un gène codant une
reconstituer la séquencetotale du gène.
Le gène du facteur VIII mesure
186 000 bases de long, mais le codage de
la structure du facteur VIII est réparti
dans 26 exons, ou séquencescodantes, ce
qui représente moins d'un vingtième de
la longueur totale du gène ; en effet, les
exons sont séparés par des introns, ou
séquencesnon codantes. Dans une cellule
vivante, le gène est d'abord complète-
ment transcrit en ARN, puis les introns
sont excisés ; les exons sont alors épissés
en un ARN messager fonctionnel, qui est
traduit en protéines. Pour faire produire
du facteur VIII à des cellules en culture,
il nous fallait un gène sans introns ; il fal-
lait donc isoler l'ARN messagerdu facteur
VIII et le transformer en ADNcopie.
En utilisant comme sonde des frag-
ments du gène complet du facteur VIII,
nous avons déterminé quelles cellules
produisent le facteur VIII et son ARN
messager : lorsqu'un ARN messager pro-
venant d'un type cellulaire donné ne
s'hybridait pas avec la sonde, nous pou-
vions affirmer que cela n'était pas dû à la
sonde, alors qu'avec une sonde de syn-
3. L'HÉRÉDITÉ de l'hémophilie est liée au sexe,car le gène du facteur VIII est localisé sur
thèse, une incertitude aurait toujours sub-
le chromosomeX. Un homme porteur d'un gène mutant du facteur Vlll ne possède pas de
sisté. Une équipe dirigée par Daniel facteur VIII normal et il est atteint d'hémophilie. Une femme conductrice est protégée par le
Capon, dans les laboratoires de la Société gène normal de son autre chromosome X, mais la moitié de ses filles sont conductrices et la
Genentech, découvrit de très faibles moitié de ses fils sont hémophiles. Lorsqu'un père est hémophile(ce casn'est pas représenté
quantités d'ARN messager hybridé parmi sur la figure), lesfls ne sontpas hémoph¿les,car ils reçoivent de leurpère son chromosome
l'ARN messager d'une lignée de cellules Y (et non le chromosomeX) ; en revanche, les filles sont conductrices de l'hémophilie.
 impureté de la préparation. Aucune de
ces hypothèses malencontreuses ne
s'avéra exacte : le facteur synthétisé par
génie génétique faisait coaguler le sang
des personnes hémophiles et il était abso-
lument conforme au facteur VIII naturel.
La structure
du facteur VIII
Quelle est la structure du facteur VIII ?
Grâce aux techniques de clonage, on déter-
mine, indirectement, les séquences en
acides aminés des protéines à partir de la
séquence en nucléotides des gènes. Nous
avons utilisé cette méthode avec le facteur
VIII, qui est trop rare et volumineux pour
être séquencédirectement, en totalité.
Avant que le gène du facteur VIII soit
cloné, les biologistes ne s'accordaient
même pas sur sa taille approximative :
les estimations différaient d'un facteur
100 ! Aujourd'hui on sait que l'ADN
copie du facteur VIII mesure 9 000
nucléotides de long et code une protéine
de 2 351 acides aminés (il existe environ
2 000 bases, à chaque extrémité du gène,
qui sont transcrites en ARN messager,
mais ne sont pas traduites en acides ami-
nés). Les 19 premiers acides aminés for-
ment une séquence hydrophobe typique
des protéines de sécrétion, un « peptide
signal »qui est en général éliminé lors de
la sécrétion de la protéine, et la molécule
du facteur VIII présente dans le sang doit
être constituée des 2 332 acides aminés
restants. La masse moléculaire du facteur
VIII est d'environ 330 000, ce qui est
considérable ; à titre de comparaison,
indiquons qu'une molécule d'interféron
ne comporte que 166 acides aminés, et
possèdeune masse moléculaire de 19 000
environ. Le gène du facteur VIII est de
loin le plus long des gènes clonés et
exprimés dans des cellules étrangères.
Une analyse de la séquenceen acides
aminés du facteur VIII a révélé que la
protéine est formée de plusieurs seg-
ments homologues. Trois de ces seg-
ments sont appelés segmentsA, et sur les
350 acides aminés environ de chaque
segment A, un tiers est commun aux trois
segments. Un degré d'homologie du
même ordre existe entre les deux seg-
ments C, composés de 150 acides ami-
nés, et qui ne sont pas homologues aux
segments A. Comme les protéines sont
formées à partir de 20 acides aminés dif-
férents seulement, une homologie d'un
tiers parmi des séquences aussi longues
n'est probablement pas due au hasard et
nous avons pensé qu'il existait une rela-
tion entre les segmentshomologues.
On a découvert une indication surpre-
nante sur l'évolution du facteur VIII
quand on a comparé sa séquence à celles
d'autres protéines : les trois segments A
présentaient la même homologie avec les
trois domaines de la céruléoplasmine
(une protéine qui transporte le cuivre
dans le sang) que celle qui existait entre
eux. Jusqu'alors, on n'avait aucune rai-
son de suspecter une relation entre le fac-
teur VIII et la céruléoplasmine, mais
l'homologie découverte entre leurs
domaines est telle que ces gènes semblent
être issus d'un ancêtre commun. La pro-
téine ancestrale était peut-être constituée
de trois domaines identiques, précurseurs
des domaines A actuels. Dans la céruléo-
plasmine, les trois domaines A sont conti-
gus, et forment la totalité de la molécule,
alors que dans le facteur VIII, le
deuxième et le troisième domaines sont
séparéspar environ 1 000 acides aminés.
Dans le gène du facteur VIII, cette région
intermédiaire est codée par un seul gros
exon qui s'est peut-être introduit dans le
gène ancestral ; les régions codant les
segments C du facteur VIII ont également
été ajoutées à l'extrémité du gène.
Le facteur VIII purifié à partir du sang
humain est rarement identique à la molé-
cule complète codée par le gène dont la
masse moléculaire est de 330 000 daltons.
On pense que le facteur VIII est coupé
plusieurs fois dans le sang lorsqu'il est
activé ; la région B, située entre le
deuxième et le troisième domaines A,
serait alors supprimée. Cette hypothèse est
fondée sur les résultats de séquençages
directs de courts fragments de la protéine
active ; quand on a comparé les résultats
obtenus avec la séquence du gène cloné,
on a observé que le facteur VIII actif

4. LA «MARCHE SUR LE CHROMOSOME» est une technique de clo-
nage utilisée par les chercheurs pour les très longs gènes, tel le
gène du facteur VIII. Ce gène est un des plus longs gènes clonés
jusqu'à présent : il mesure 186000 basesde long ; à titre de compa-
raison, le gène de l'interféron, cloné en 1980, ne mesure que 600
basesde long environ. Le gènedu facteur Vlll étant trop long pour
être introduit dans le génome d'un seul bactériophage, on a déter-
miné plusieurs fragments de ce gène dans différentes plages de la
banque génomique.Lorsqu'on a sondé une banque avec une sonde
d'ADNde synthèse,la sonde s'est hybridée avec des segmentsayant
une partie commune. On a alors utilisé des morceaux de ces seg-
ments comme sonde afin de recribler la banque et d'identifier des
nouveaux segments; en répétant cette opération, on a identifié la
quasi-totalité du gène. Moins d'un vingtième du gène est constitué
d'exons, c'est-à-dire de séquences codantes (barres noires) ;
26 exons sont séparés par 25 introns.
 semble constitué d'une sous-unité de
90 000 daltons, liée à une autre sous-unité
de 73 000 daltons. La première sous-unité
comporte les deux premiers domaines A :
il n'existe pas de liaison peptidique entre
eux, mais les deux domaines restent liés.
La deuxième sous-unité est constituée du
troisième domaine A et des deux
domaines C. De la même façon que le fac-
teur VIII est activé par des coupures enzy-
matiques, il est inhibé par des coupures
ultérieures entre les sous-unités ; c'est
probablement grâce à ces réactions que la
coagulation s'arrête quand il le faut.
Le mode d'action précis du facteur
VIII, lors de la coagulation, est loin d'être
clair. On sait néanmoins que le facteur se
lie à une protéine, le facteur de von
Willebrand, qui transporte le facteur dans
le sang et pourrait jouer un rôle dans son
positionnement à la surface des pla-
quettes, au site de la blessure. Une fois
placé sur une plaquette, le facteur VIII se
sépare probablement du facteur de von
Willebrand et forme un complexe avec
les facteurs IX et X. On ne connaît pas les
sites de liaison sur ces protéines, mais on
sait que sans le facteur VIII, l'activation
du facteur X par le facteur IX n'a pas lieu.
Une méthode courante pour étudier le
mode d'action d'une protéine consiste à
étudier les formes anormales de la protéine
résultant de mutations génétiques.
Plusieurs équipes effectuent une telle étude
avec le facteur VIII et, simultanément, on
a identifié des mutations responsables de
l'hémophilie. Ces travaux nous permettent
de mieux connaître la maladie et de mieux
traiter les personneshémophiles.
Comme prévu, il n'existe pas qu'une
seule mutation responsable de l'hémophi-
lie. Il y a 50 ans, le généticien britan-
nique J. Haldane avait remarqué que les
maladies graves liées au chromosome X
résultent nécessairement de mutations
spontanées, survenant au hasard et à un
rythme régulier : si de nouvelles muta-
tions n'apparaissaient pas, les maladies
héréditaires disparaîtraient. Environ un
tiers des cas d'hémophilie observés sur-
viennent chez des personnes sansantécé-
dents familiaux particuliers. Les gènes de
l'hémophilie se transmettent à la descen-
dance, mais avant la découverte d'un
traitement efficace, une mutation donnée
disparaissait rapidement parce qu'il y
avait moins d'enfants survivants dans les
familles d'hémophiles. Le cas aurait été
très différent si l'hémophilie avait été
produite par des mutations récessives
portant sur les chromosomes autoso-
miques, c'est-à-dire non sexuels : comme
chaque cellule possède deux exemplaires
de chacun de ces chromosomes, les
5. LA SÉQUENCE DESACIDESAMINÉSDU FACTEURVlll ressembleà celle d'une protéine
sanguine : la céruléoplasmine. Les trois domaines
A dufacteur Vlll ont environ un tiers de
leurs acides aminés en commun et sont également homologues aux trois domaines de la
céruléoplasmine. Il est probable que les deux protéines dérivent d'un ancêtre commun. Le
facteur Vlll a ensuite divergé dela céruléoplasmine : un gros exon (numéro 14) codant le
segment intermédiaire B s'est introduit dans le gène ancestral ; des exons codant les seg-
ments C se sont placés à une extrémité. Au cours de l'activation du facteur VIII, le segment
B est éliminé par desprotéases et les deux sous-unités sont réunies par un ion calcium. Une
autre coupure intervient entre les deux premiers domaines A.
mutations auraient pu se disséminer dans rus. Le plus facile à observer est une
la population, car seuls auraient été importante délétion d'une partie du gène
atteints les rares individus ayant hérité de du facteur VIII : une partie des fragments
deux gènes anormaux. hybridés manquent ou sont de taille anor-
En principe, on peut identifier la male. Dans certains cas, on a même mis en
mutation responsable de l'hémophilie, évidence une modification d'une seule
chez un individu donné, en isolant et en base de l'ADN ! Une telle observation est
séquençant le gène de son facteur VIII, possible quand la mutation porte sur une
mais pour ce gène qui comporte 186 000 séquencecible de l'enzyme de restriction,
bases, le séquençage durerait plusieurs car une telle modification empêche
mois. II existe un autre procédé, plus l'enzyme de couper le gène ; deux frag-
rapide, mais utilisable dans un petit ments d'hybridation sont alors remplacés
nombre de cas seulement ; ce procédé est par un seul fragment plus long (inverse-
fondé sur une technique d'hybridation ment, une mutation peut également modi-
moléculaire mise au point par E. Southern. fier un résultat d'hybridation en créant un
Dans une première étape, on extrait nouveau site de restriction).
l'ADN des cellules sanguines d'une per- Un exemple de mutation ponctuelle
sonne hémophile, puis on coupe l'ADN en illustre ce type d'événement. On avait
un million de fragments environ grâce à découpé l'ADN d'un sujet atteint d'une
une enzyme de restriction, qui coupe forme grave d'hémophilie, l'ADN de ses
l'ADN quand elle rencontre une séquence parents et celui de sestrois enfants à l'aide
spécifique de quatre à six bases. On de l'enzyme de restriction Taql, qui recon-
sépare ensuite les fragments en fonction naît la séquencede base : TCGA. Pour les
de leur taille par électrophorèse, puis on parents et les enfants du malade (tous en
dénature l'ADN (on sépare les deux brins bonne santé), on observait deux fragments
de la double hélice) et on transfère les d'hybridation : l'un constitué de 1 400
fragments sur un papier filtre spécial, de nucléotides et l'autre de 2 800 nucléotides,
telle sorte que les fragments conservent mais pour le patient hémophile les deux
les positions relatives qu'ils occupaient fragments étaient remplacés par un seul
sur le gel après l'électrophorèse ; enfin, fragment de 4 200 nucléotides de long.
on plonge le filtre dans un bain contenant Comme nous connaissions la séquencedu
de l'ADN copie radioactif de facteur VIII. gène normal du facteur VIII, nous avons
L'ADN copie s'hybride avec les fragments déterminé la position du site Taql qui était
du gène du facteur VIII et sert à détecter modifié ; en clonant et en séquençantcette
les fragments ; on déduit leur taille de partie du gène, nous avons trouvé que la
leur position sur le papier filtre. séquence d'ADN atteinte n'était plus
Afin de déterminer les mutations du TCGA, mais TTGA. Cette seule mutation
facteur VIII, on a comparé les résultats empêchait l'enzyme de restriction Taql de
d'hybridation d'ADN provenant de per- couper le gène correctement.
sonnessaineset de personneshémophiles : Cette mutation était grave parce
deux types d'anomalies du gène sont appa- qu'elle transformait le codon CGA de
l'acide aminé arginine en un codon TGA,
qui indique la fin de la traduction : la pro-
téine produite était donc tronquée et, soit
inactive, soit trop instable pour subsister
dans le sang. Comme les parents de ce
patient hémophile ne possèdent pas cette
mutation, il ne l'a pas hérité d'eux ; il
s'agit probablement d'une mutation nou-
velle, survenue dans un précurseur des
spermatozoïdesou des ovules parentaux.
Pour l'instant, on a étudié environ
200 gènes de facteur VIII de personnes
hémophiles. Sept mutations différentes
ont été observées, mais aucune n'était
présente dans plus d'une famille ; quatre
des mutations étaient ponctuelles, avec,
pour trois d'entre elles, un facteur VIII
tronqué et une hémophilie grave ; la qua-
trième mutation ponctuelle était à l'ori-
gine de la substitution d'un acide aminé
et d'une forme relativement bénigne de la
maladie. Les trois autres mutations
étaient des délétions de plusieurs milliers
de nucléotides du gène et conduisaient
toutes à une hémophilie grave.
Les biologistes disposeront probable-
ment bientôt de techniques plus efficaces
pour déterminer des mutations ponc-
tuelles. L'analyse d'un grand nombre de
mutations permettra d'établir une relation
entre une mutation donnée et la gravité
clinique de la maladie. II serait d'un inté-
rêt considérable de comprendre par
exemple pourquoi dix pour cent des per-
sonnes hémophiles présentent des réac-
tions immunitaires lorsqu'elles sont
exposées à du facteur VIII exogène, ce
qui rend leur traitement problématique.
En principe, on pourrait traiter les
personnes hémophiles en introduisant des
gènes fonctionnels du facteur VIII dans
leurs cellules, mais le traitement des
maladies par génie génétique ne sera sans
doute pas au point avant plusieurs
années. L'une des principales difficultés
de l'introduction de gènes dans les cel-
lules est la régulation de l'expression des
gènes introduits : la présence dans le
sang de facteur VIII en trop grande quan-
tité est peut-être aussi dangereuse que
l'absence de ce facteur.
Le gène cloné du facteur VIII est déjà
à la base de méthodes plus sûres permet-
tant le diagnostic des femmes conduc-
trices et la détection de l'hémophilie chez
le foetus. Les méthodes de détection sont
fondées sur les techniques d'hybridation :
le gène cloné sert de sonde pour détecter
la présence d'un gène anormal. Environ
70 centres médicaux, dans le monde
entier, effectuent déjà le diagnostic pré-
natal de l'hémophilie. La méthode n'est
pas encore applicable dans tous les cas,
mais elle est plus fiable que l'ancienne
méthode, qui consistait à mesurer la
concentration en facteur VIII dans le sang
foetal ; elle est en outre moins invasive,
car elle ne nécessite pas la ponction d'une
veine foetale. Enfin, alors que l'étude du
sang foetal ne peut avoir lieu qu'après la
vingtième semaine de la grossesse,le dia-
gnostic fondé sur l'étude de l'ADN est
praticable dès la huitième semaine.
La conséquence la plus importante du
clonage du gène du facteur VIII est natu-
rellement la possibilité de produire du
facteur VHI pur en très grandes quantités.
Dans un an ou deux, on commencera à
étudier l'intérêt clinique de la protéine de
synthèse ; ce programme devrait durer
plusieurs années et, lorsque le facteur
sera disponible commercialement, les
personnes hémophiles ne seront plus
menacées par les virus présents dans le
sang des donneurs. Beaucoup de per-
sonnes hémophiles qui vivent dans des
pays en voie de développement décèdent
encore précocement ; demain les indivi-
dus hémophiles, dans ces pays recevront
enfin un traitement efficace.

6. ON DÉTECTEDESMUTATIONSdu gène du facteur Vlll respon-
sable de l'hémophilie par la technique d'hybridation de
E. Southern (en haut), lorsque ces mutations modifient la façon
dont le gène estdécoupé par une enzyme de restriction : on découpe
l'ADN de cellules sanguinesen plusieurs millions de fragments (ici,
on a utilisé l'enzyme Taql), puis on sépare les fragments en fonc-
tion de leur taille, par électrophorèse; on dénature les fragments en
simples brins et on les transfère sur du papier filtre. Le filtre est
ensuite plongé dans une solution contenant de l'ADN copie radioac-
tif du facteur VIII, qui s'hybride seulement avec desfragments du
gène du facteur VIII. On détermine la taille des fragments hybridés
en plaçant le filtre contre un film sensible aux rayons X. Dans
notre exemple, une mutation ponctuelle du gène du facteur VIII
d'une personne hémophile (H) a fait disparaître un site de coupure
de l'enzyme Taql. Les fragments de 2 800 et 1 400 bases de long
obtenus par analyse des parents par la même méthode (1 à 5) sont
remplacéspar un seul fragment continu de 4 200 bases.On a déjà
mis en évidencesept mutations différentes du gène du facteur VIII
chez despersonnes hémophiles (en bas) : quatre d'entre elles sont
des mutations ponctuelles, c'est-à-dire des changements d'une
seule base (points noirs) ; les trois autres sont des délétions impor-
tantes (barres noires).
 PRÉDISPOSITION
savaient que lors de maladies auto-
immunes, le fonctionnement de certaines
DIABÈTE glandes exocrines, les glandes salivaires
AU
et lacrymales notamment, est perturbé,
ils ont observé, en collaboration avec
Pierre Bédossa, du Service d'anatomie
pathologique de l'Hôpital Antoine
Le diabète insulino-dépendant est générée. II existe plusieurs allèles (un des Béclère, des coupes histologiques de
une maladie auto-immune, mais on deux gènes homologues portés par pancréas et de glandes salivaires des ani-
ignore encore quel est l'auto-antigène chaque paire de chromosomes) à haut maux issus de ces croisements. Ils ont
qui le déclenche. Les ilôts de Langerhans, risque et si un sujet a plus d'un tel allèle, trouvé une parfaite coïncidence histolo-
des cellules du pancréas, sécrètent l'insu- les risques de diabète juvénile sont multi- gique entre l'inflammation des glandes
line, ('hormone qui normalise la concen- pliés par dix. Inversement d'autres allèles salivaires ou sialite (une accumulation
tration sanguine en glucose ; lorsqu'elles HLA diminuent l'incidence de la maladie : locale des lymphocytes T autour des
n'assurent plus leur fonction les sujets ce sont des gènes protecteurs. vaisseaux et des canaux sécrétoires), et
sont atteints d'un diabète qui se mani- Le complexe majeur d'histocompatibi- un stade du diabète très précoce et
feste d'abord par une soif intense, puis lité n'est pas le seul responsable du dia- dépourvu de signescliniques, la péri-insu-
par un amaigrissement qui peut entraîner bète : quand on intègre les gènesdu com- lite ; au cours de la péri-insulite, les lym-
un coma, voire la mort On distingue ce plexe majeur d'histocompatibilité de phocytes T sont localisés en dehors des
type de diabète, dit diabète juvénile, car souris NOD-le modèle animal du diabète ilôts de Langerhans,tandis qu'ils y pénè-
il touche surtout les personnes jeunes, et -dans le génome de souris normales, trent à un stade ultérieur, l'insulite ; cette
le diabète de l'âge adulte ou diabète celles-ci ne deviennent pas diabétiques ; dernière étape précède elle-même la
gras, plus répandu, mais moins grave. inversement on peut obtenir des souris destruction des cellules productrices
Cette pathologie pose encore diabétiques avec un complexe majeur d'insuline, et le diabète proprement dit.
diverses questions sur l'origine de la d'histocompatibilité normal. Ainsi les gènes Ainsi ces deux inflammations asso-
maladie. On sait que plusieurs gènes sont codant ces antigènes d'histocompatibilité ciées-la sialite et la péri-insulite-sont
responsables de son apparition, mais ne sont-ils pas grossièrement anormaux, placées sous un contrôle génétique par-
combien existe-t-il de gènes de prédis- puisque pris séparément, ils ne déclen- tiellement commun : cependant comme
position ? Lorsque la maladie est dia- chent pas de diabète ; seule la conjonction la sialite est souvent présente sans péri-
gnostiquée, la quasi totalité des ilôts de de plusieursgènes entraîne la maladie. insulite, tandis que la p6H-insulke est tou-
Langerhans sont détruits : pourrait-on Afin d'évaluer la composante géné- jours associée à une sialite, les gènes qui
diagnostiquer la maladie à un stade pré- tique de la maladie, les chercheurs de codent la sialite participent nécessaire-
clinique surtout chez les sujets dont les l'Hôpital Necker ont croisé des souris ment à la survenue de la péri-insulite. Ces
parents ou la fratrie sont déjà atteints ? diabétiques (NOD) et des souris normales chercheurs ont donc découvert un signe
Les études menées par Henri-Jean (C57) sur deux générations. Comme ils préclinique du diabète, l'inflammation des
Garchon et ses collègues de l'Unité
INSERM 25 dirigée par Jean-François Bach
ont répondu partiellement à quelques
unes de ces interrogations : ces cher-
cheurs ont analysé, chez la souris, un
signe histologique associé à un stade très
précoce du diabète et ont localisé un
gène de prédisposition associé à ce signe.
Parallèlement John Todd et ses collègues
de l'Université d'Oxford ont découvert
deux autres gènes de prédisposition, ce
qui renforce l'hypothèse muitigénique de
la maladie dont l'apparition serait égale-
ment soumise à des facteurs environne-
mentaux, notamment infectieux.
On connaît déjà une classe de gènes
qui participent à l'apparition de la maladie,
les gènesdu complexe majeur d'histocom-
patibilité qui codent les antigènes d'histo-
compatibilité : ceux-ci, localisésà la surface
de toutes les cellules, sont responsables
des réactions de rejet des greffes ; les
généticiens ont montré que la probabilité
de développer un diabète était supérieure
chez les sujets porteurs de certains anti-
gènes d'histocompatibilité : les antigènes 1. Coupes histologiques d'un pancréas normal (en haut, à gauche) et atteint
HLA DR3 et DR4 sont trois fois plus fré- d'une péri-insulite (en haut, à droite) et d'une glande salivaire normale (en bas,
quents chez les sujets atteints de diabète à gauche) et atteinte d'une sialite (en bas, à droite). Les points violet foncé
insuline-dépendant que dans la population représentent les lymphocites qui ont colonisé ces tissus.

2. Plusieurs gènes sont associés au diabète
glandes salivaires,aisément identifiable et
qui permettrait de suivre indirectement le
fonctionnement du pancréas chez des
sujets prédisposés au diabète. Cependant
l'analyse histologique des glandes sali-
vaires nécessite une biopsie ; comme il
ne serait pas envisageable de pratiquer
régulièrement des biopsies pour suivre
les sujets à risques, des méthodes non
invasivesdevraient être utilisées.
H. J. Garchonet ses collègues ont
séparé les souris analysées en trois
groupes : celles qui ne présentaient
aucun signe inflammatoire, celles qui pré-
sentaient une sialite et celles qui présen-
taient à la fois une sialite et une péri-
insulite, puis ils ont cherché si ces
diverses anomalies histologiques étaient
liées à la présence de marqueurs chro-
mosomiques spécifiques des souches des
souris étudiées ; en d'autres termes, ils
ont comparé la ségrégation des anoma-
lies histologiques et de marqueurs qui
RISQUES GÉNÉTIQUES
D'INFARCTUS
Dans les
pays occidentaux, l'infarctus
du myocarde est un problème de santé
publique majeur, puisqu'il constitue la prin-
cipale cause de morbidité et de mortalité
(plus de 100 000 cas annuels en France).
Les sujets jeunes ne sont pas épargnés :
42 pour cent des infarctus surviennent
avant l'âge de 65 ans ; en France, cette
maladie tue chaque année 4 000 per-
jalonnent les chromosomes. Il existe dif-
férents marqueurs, mais H.J. Garchon a
utilisé des séquences microsatellites : il
en existe environ 50 000 dans tout le
génome. Ce sont des séquences de deux
ou trois nucléotides qui se répètent :
ainsi la s6quence cA (cytosine-ad6nine)
peut être répétée une quinzaine de fois.
La longueur de ces séquences varie d'un
individu à l'autre car le nombre de répé-
titions change, mais elles sont hérédi-
taires. Les séquences microsatellites sont
flanquées de séquences uniques qui sont
caractéristiques des différentes régions
chromosomiques et que l'on reconnaît
aisément après les avoir amplifiées par
réaction en chaîne de la polymérase
(PCR).Ainsi les séquences microsatellites
permettent de baliser les chromosomes,
de repérer les régions du génome qui
leur sont associées et d'identifier celles
que l'on présume contenir le ou les
gènes mutés recherchés.
sonnes de moins de 45 ans. Si les méca-
nismes physiologiques à l'originede l'infarc-
tus sont à peu près connus, ses détermi-
nants environnementaux et génétiques ne
sont pas entièrement élucidés. Un gène
prédisposant à l'infarctus a été découvert
par les équipes INSERM de François
Cambien et de Florent Soubrier, à Paris :
ce gène gouveme la synthèse d'une pro-
L'équipe de l'Hôpital Necker a ana-
lysé de cette manière le génome des sou-
ris diabétiques et identifié, après l'avoir
amplifié, un segment du chromosome I
qui est associé à une fréquence élevée de
sialites et de péri-insulites. Ils en ont
déduit que la péri-insulite est associée à
un gène de prédisposition localisé sur le
chromosome 1. Cependant, 36 pour cent
seulement de leurs souris diabétiques
porteuses de mutations sur le locus de
prédisposition localisé sur le chromo-
some I avaient une péri-insulite, ce qui
signifie que d'autres gènes de prédisposi-
tion participent à l'apparition de cette
inflammation précoce.
Les deux autres gènes de susceptibi-
lité identifiés par l'équipe anglaise (un sur
le chromosome 3 et un sur le chromo-
some 11) correspondent d des phases
ultérieures de la maladie, l'étape de
l'insulite ou infiltration par les lympho-
cytes des ilôts de Langerhans et l'étape
de déclenchement du diabète lui-même,
c'est-à-dire de destruction des ilôts.
Selon H. J. Garchon, environ six gènes
participeraient à l'apparition et au déve-
loppement du diabète : chaque étape de
la maladie serait contrôlée par un gène-
ou un groupe de gènes-spécifique. Son
équipe étudie si le locus identifié chez la
souris est transposable à l'Homme et s'il
est localisé sur chromosome
le 18, l'équi-
valent de cette région du chromosome I
de la souris.
Si tel est le cas, on disposera d'un
marqueur très précoce de la maladie et
l'on pourrait prévenir son apparition en
intervenant avant que les iiôts de
Langerhans ne soient détruits, peut-être
en réduisant l'activité du système de
défense immunitaire, afin que l'organisme
n'attaque pas ses propres usines de pro-
duction d'insuline.
téine, l'enzyme de conversion de l'angio-
tensine, qui provoque une vasoconstric-
tion (un rétrécissement des artères).
L'infarctus du myocarde résulte de
l'obstruction totale d'une des artères
coronaires : le tissu cardiaque qui n'est
plus irrigué, en aval de l'artère bouchée,
meurt si la circulation n'est pas rétablie
rapidement. La cause première de
l'infarctus est une maladie chronique des
artères, l'athérosclérose, due au dépôt
(la plaque d'athérosclérose) de lipides,
de fibres et de cellules sur les parois des
artères. L'infarctus survient brusquement
lorsqu'une plaque d'athérosclérose se fis-
sure, entraînant la formation d'un caillot
 sanguin (la thrombose) qui obstrue une
artère coronaire. Une deuxième compli-
cation de l'athérosclérose, la vasocons-
triction, semble favoriser l'infarctus : dans
une artère coronaire au diamètre réduit
par une vasoconstriction chronique ou
par un spasme, l'accident cardiaque
pourrait survenir sur une plaque d'athé-
rosclérose moins volumineuse que dans
une artère au diamètre normal.
L'infarctus est une maladie multifacto-
rielle, due à la conjonction de facteurs
environnementaux et de facteurs géné-
tiques. Certains modes de vie prédispo-
sent à l'infarctus : le stress, la sédentarité,
le tabagisme et les erreurs diététiques
sont les mieux connus. Ainsi l'alimenta-
tion des pays industrialisés, trop riche en
graissesanimales, explique en grande par-
tie l'endémie des infarctus dans ces pays :
elle favorise l'athérosclérose en augmen-
tant la concentration en lipides et en cho-
lestérol dans le sang. Toutefois certains
individus sont plus exposés que d'autres
au risque d'infarctus : c'est principalement
le cas des sujets qui sont génétiquement
prédisposés au diabète, à l'obésité, à
l'hypertension artérielle, à l'hypercholes-
térolémie et aux hyperlipidémies (des
élévations anormales de la concentration
en cholestérol et en lipides dans le sang).
Parmi les nombreux gènes de prédis-
position à l'infarctus, le gène de l'enzyme
de conversion de l'angiotensine (ECA)
semblait un bon candidat : cette enzyme
favorise la vasoconstriction en assurant à la
fois la synthèse de l'angiotensine 11,qui est
un puissant vasoconstricteur, et la dégra-
dation de la bradykinine, un vasodilatateur
très actif. La concentration en ECAdans le
sang, très stable dans le temps chez un
même individu, varie beaucoup d'un indi-
vidu à l'autre ; 50 pour cent de cette varia-
bilité dépendent du gène qui code l'ECA.
Le clonage et le séquençage de ce
gène par l'équipe INSERM de F. Soubrier,
en 1988, a révélé l'existence de deux
formes différentes du gène de l'ECA,à peu
près aussi fréquentes l'une que l'autre
dans la population : une forme courte, la
forme D (qui présente une délétion d'un
fragment d'ADN), et une forme longue, la
forme I (qui présente une insertion d'un
fragment d'ADN). La délétion de la forme
D-qui se trouve dans une région non
codante du gène de l'ECA-ne modifie
pas la structure de l'enzyme, mais elle aug-
mente sa concentration dans le sang, par
un mécanisme indirect encore inconnu :
chez les sujets porteurs du génotype DD
(environ 25 pour cent de la population),
la concentration moyenne en ECA dans le
sang est égale à 500 microgrammes par
litre ; chez les sujets porteurs du génotype
L'athérosclérose est une maladie chronique due au dépôt de lipides, de cellules et
de fibres sur les parois des artères, qui réduit la lumière artérielle. L'infarctus sur-
vient lorsqu'une ploque d'athérosclérose se rompt, formant un calllot (thrombus)
qui obstrue une artère irriguant le coeur.
DI (50 pour cent de la population), elle l'effet délétère du génotype DD, on évite-
vaut 400 microgrammes par litre ; et chez rait 8 pour cent des infarctus dans la
les sujets porteurs du génotype 11 population générale, et jusqu'à 30 pour
(25 pour cent de la population), elle n'est cent dans la sous-population peu expo-
que de 300 microgrammes par litre. Plus sée. Par ailleurs, l'effet du génotype DD
l'enzyme est abondante dans le sang,plus sur la survenue de l'infarctus semble
elle est susceptible de provoquer une indépendant des facteurs de risques tra-
vasoconstriction importante. ditionnels, comme l'hypertension, le dia-
Pour analyser l'effet du polymor- bète et l'hyperlipidémie.
phisme du gène de l'ECA sur le risque Toutefois, avant d'envisager une stra-
d'infarctus, les épidémiologistes de l'INSERM tégie de dépistage et de prévention des
ont comparé !'ADN de 610 patients ayant sujets à risque pour le gène de l'ECA,on
fait un infarctus au cours des 3 à 9 mois devra confirmer ces résultats par des
précédents, avec celui de 733 témoins, études réalisées sur d'autres populations.
tous âgés de 25 à 64 ans ; pour éviter le D'autre part, les chercheurs entrepren-
biais de variations régionales, les sujets nent une étude prospective qui portera
étudiés ont été recrutés dans quatre sur 10 000 sujets suivis durant cinq ans.
centres : Lille, Strasbourg, Toulouse et afin d'évaluer l'effet du polymorphisme
Belfast (qui détient le record mondial de du gène de l'ECA en fonction des autres
fréquence des maladiescardiovasculaires); facteurs de risque. Enfin l'on effectuera
dans ces quatre villes, les nouveaux cas des essais thérapeutiques pour détermi-
d'infarctus sont systématiquement réper- ner si l'on peut prévenir le risque lié au
toriés dans les registres MONICA de gène de l'ECA à l'aide de médicaments
l'Organisation mondiale de la santé. comme les inhibiteurs de l'enzyme de
Cette étude révèle que le génotype conversion. Actuellement, il serait
DD est plus fréquent chez les sujets qui absurde de dépister tous les sujets por-
ont fait un infarctus que chez les témoins ; teurs du génotype DD (soit le quart de la
cette différence est encore plus marquée population) parce qu'ils ne présentent
dans la sous-population d'individus qui qu'un faible risque absolu de faire un
sont a priori peu exposés au risque infarctus.
d'infarctus-c'est-à-dire les sujets peu On n'envisagera le dépistage des
corpulents et avec un faible taux de sujets à risque que si l'on identifie, parmi
lipides dans le sang. Au sein de la popula- les individus DD, un sous-groupe de
tion générale, le génotype DD augmente sujets particulièrement exposés. De
de 30 pour cent le risque d'infarctus ; même, on ne mettra en oeuvre une stra-
dans la sous-population peu exposée, il tégie de prévention de l'infarctus ou de
multiplie ce risque par trois. sa récidive que si l'on démontre une effi-
Compte tenu de la fréquence du cacité supérieure des inhibiteurs de
génotype DD dans la population, on l'enzyme de conversion chez les sujets
estime que, si l'on parvenait à supprimer porteurs du génotype DD.
 Les gènes
Des mutations de gènes
cellulaire prédisposent aux
On a isolé un gène dont
le développement de tumeurs
LESCANCERStrouvent leur
origine dans nos gènes :
souvent les cancers appa-
raissent parce qu'un agent
carcinogène-un rayonne-
ment ou un produit chimique-endom-
d'une cel-
mage l'ADN d'un gène critique
lule qui commence à se diviser sans
contrôle ; sa descendance finit par former
un gros agrégat de cellules que l'on
appelle tumeur.
Au cours des quinze dernières
années, on a identifié certains gènes,
cibles des agents carcinogènes : les onco-
gènes, ou gènes de cancers. Lorsqu'ils
sont « activés » par une mutation, les
oncogènes déclenchent une prolifération
cellulaire anormale. L'activation d'un
oncogène est ainsi une étape essentielle,
à l'origine de nombreux types de cancers.
Plus récemment on a découvert des
« gènes cancérogènes » d'untype très dif-
férent : dans les cellules normales, ces
gènes ne stimulent pas la prolifération
cellulaire ; au contraire, ils l'inhiberaient.
Ainsi, lorsque les cellules perdent ces
gènes inhibiteurs de la multiplication cel-
lulaire (ou lorsque ces gènes ne sont plus
fonctionnels), elles risquent de proliférer
et de former des tumeurs cancéreuses.
Depuis la découverte des gènes inhibi-
teurs de la multiplication cellulaire, on
comprend mieux les mécanismes géné-
tiques à l'origine des cancers, et la régu-
lation de la multiplication, dans les cel-
lules normales.
Les gènes inhibiteurs de
la multiplication cellulaire
Ces gènes inhibiteurs exercent un
effet contraire à celui des oncogènes, qui
stimulent généralement la multiplication.
Lorsque l'on transfere dans une cellule
normale des oncogènes extraits d'une
de
cancers
qui inhibent la multiplication
cancers.
la disparition provoque
de l'oeil.
tumeur, la cellule acquiert plusieurs
caractéristiques des cellules cancéreuses.
Les expériences de transfert de gènes ont
montré que de nombreux oncogènes per-
turbent la multiplication cellulaire et
qu'ils sont en partie responsables du
comportement aberrant des cellules
tumorales qui les contiennent. On réalisa
bientôt que les oncogènes sont des ver-
sions altérées des gènes cellulaires nor-
maux, les proto-oncogènes, qui jouent un
rôle essentiel dans la régulation de la
multiplication des cellules. Au cours
d'une vie humaine, nombreuses sont les
mutations risquant de transformer un pai-
sible proto-oncogène normal en un onco-
gène agressif.
L'activation d'un oncogène est néces-
saire à la formation d'un cancer, mais cet
événement n'est pas suffisant : la cancé-
rogenèse est un processus composé de
plusieurs étapes, et l'acquisition d'un
caractère malin dépend probablement de
l'accumulation de mutations endomma-
geant plusieurs gènes-notamment des
oncogènes-dont l'expression simultanée
aboutit à une croissance maligne.
Jusqu'à présent, on n'a détecté des
oncogènes que dans 15 à 20 pour cent
des tumeurs humaines : il existe proba-
blement d'autres oncogènes stimulant la
croissance cellulaire, mais nos méthodes
de détection de ces gènes ne sont pas
encore assez sensibles. En outre, il existe
sans doute d'autres catégories de gènes
cancérogènes que l'on n'a pas encore
mises en évidence, parce qu'elles fonc-
tionnent tout à fait différemment (et que
nos méthodes de détection sont inadap-
tées) ; certaines tumeurs, par exemple, se
développeraient lorsqu'un gène inhibant
la multiplication cellulaire disparaît : ce
gène est difficile à détecter, puisqu'il ne
se manifeste qu'à partir du moment où il
a disparu !
Robert Weinberg
Il existe une autre différence fonda-
mentale entre les oncogènes et les gènes
inhibiteurs de la multiplication cellulaire :
les oncogènes étudiés jusqu'à présent
sont toujours activés par des mutations
somatiques, c'est-à-dire des modifications
génétiques s'effectuant dans les tissus ou
les organes, et non dans les cellules ger-
minales, si bien que les oncogènes acti-
vés, ou mutants, ne se transmettent pas à
la descendance. Au contraire, les formes
mutantes des gènes inhibiteurs de la mul-
tiplication cellulaire pourraient être pré-
sentes dans les cellules germinales-les
ovules ou les spermatozoïdes-et se
transmettre de génération en génération.
Un enfant qui hériterait, à sa conception,
de la forme mutante d'un gène inhibiteur
de la multiplication cellulaire risquerait
plus qu'un autre de souffrir d'un cancer.
En étudiant les rétinoblastomes-des
tumeurs de l'oeil-on a récemment com-
pris, du moins en partie, comment fonc-
tionnent les gènes inhibiteurs de la multi-
plication cellulaire. Les rétinoblastomes
sont des tumeurs assez rares : un nou-
veau-né ou un enfant en bas âge sur
20 000 environ en est atteint. La maladie
sert de modèle pour d'autres types de
cancer, sans lien apparent : les connais-
sances acquises sur le gène responsable
de cette maladie ont déjà permis d'éluci-
der partiellement l'origine génétique de
certains cancers.
L'origine
des rétinoblastomes
Les rétinoblastes sont les précurseurs
des cellules de la rétine, l'écran qui
tapisse le fond de l'oeil et détecte les
signaux lumineux ; les cellules d'un réti-
noblastome sont apparemment celles qui
se seraient différenciées normalement en
cônes, une des deux classes de cellules
photoréceptrices. Après qu'un rétinoblaste
s'est différencié en une cellule rétinienne
spécialisée, il cesse de se diviser et ne
peut pratiquement plus former de tumeur,
ce qui expliquerait que seuls les jeunes
enfants sont atteints de rétinoblastomes.
Jusqu'au milieu du XIXesiècle, le réti-
noblastome était une maladie mortelle,
car la tumeur envahissait rapidement le
 cerveau et provoquait la mort. Avec
l'invention de l'ophtalmoscope, par
Hermann von Helmholtz en 1850, on put
enfin observer l'intérieur du globe ocu-
laire et détecter les tumeurs longtemps
avant qu'elles n'envahissent les tissus
adjacents ; lorsque le diagnostic était suf-
fisamment précoce, on retirait le globe
oculaire atteint. Les enfants malades
furent épargnés et les premiers cas « fami-
liaux » de rétinoblastome apparurent : de
nombreux enfants traités survécurent
jusqu'à l'âge adulte et ils eurent des
enfants, dont la moitié environ présen-
taient une tumeur oculaire normalement
exceptionnelle. Parallèlement on obser-
vait toujours les cas de rétinoblastomes
sporadiques, chez des enfants dont les
parents n'étaient pas atteints.
Vers 1950, on comprit que ces deux
types de rétinoblastomes sont deux mani-
festations différentes d'une même mala-
die. Nombre de généticiens furent
confondus, car dans la forme familiale de
la maladie, un gène semblait se trans-
mettre d'un des parents aux enfants ;
mais quel était le rôle des gènes dans les
cas sporadiques ? Si des gènes interve-
naient également, étaient-ils identiques à
ceux impliqués dans la forme familiale ?
En 1971, Alfred Knudson, de
l'Institut de recherche sur le cancer, à
Philadelphie, supposa que l'on peut
acquérir un gène mutant soit en l'héritant
de l'un des deux parents, soit à la suite
d'une mutation accidentelle, et il proposa
que les deux types de rétinoblastome sont
dus à des modifications du même
ensemble de gènes.
Après avoir étudié les statistiques
d'apparition des rétinoblastomes,
A. Knudson conclut que les cellules
tumorales ne portent pas un gène mutant
unique, mais deux gènes mutants. Dans
la forme familiale, la première des deux
mutations est présente dans un gène clé
dès la conception de l'individu et on la
retrouve dans toutes les cellules de
l'organisme, notamment dans celles de la
rétine ; ce gène mutant, qui prédispose le
sujet au rétinoblastome, est hérité d'un
des deux parents, lui-même porteur, ou
résulte d'un accident génétique qui s'est
produit au cours de la formation de
l'ovule ou du spermatozoïde. La seconde
mutation nécessaire atteint des rétino-
blastes véhiculant déjà la mutation
1. LA DISPARITION D'UNE PARTIE DU CHROMOSOME 13 provoque les rétinoblastomes. En
congénitale. Pour expliquer la forme spo-
colorant les chromosomesde cellules tumorales de rétinoblastomes, afin d'en observer les
radique, non familiale, du rétinoblas-
bandes caractéristiques, Jorge Yunis, de l'Université du Minnesota, découvrit qu'un seg-
tome, A. Knudson supposa que les deux ment du bras long de l'un des deux chromosomes 13 était souvent absent. Cette image réali-
mutations nécessaires sont aléatoires : sée sur ordinateur par Yunis représenteun chromosome 13 normal (à gauche) et l'exem-
elles se produisent dans une même cel- plaire anormal (à droite). Une large bandejoune clair et la sous-bande orange voisine ont
lule rétinienne, dont les descendantes se disparu dans le chromosome anormal (les formes ovales, en haut, représentent les télo-
multiplient pour former la tumeur. mères,qui semblent séparéesdeschromosomeslorsqu'on les observe au microscope).
 On sait aujourd'hui que les hypo-
thèses de A. Knudson étaient correctes ;
elles furent généralement acceptées mal-
gré deux questions importantes restées
sans réponse : quel est le gène mutant (en
admettant qu'il soit unique) hérité d'un
des deux parents ou modifié par une
mutation somatique ? Quelle est la muta-
tion qui engendre ces allèles (les diffé-
rentes versions d'un gène) responsables
du cancer ? S'agit-il de mutations qui, en
activant un proto-oncogène, le transfor-
ment en oncogène ? Ou au contraire, de
mutations qui en inactivant un gène, en
suppriment la fonction ?
Le chromosome 13
La clef du problème apparut quand on
examina au microscope des chromosomes
de cellules normales et de cellules de réti-
noblastome. Lorsque la division d'une
cellule commence, on voit nettement les
chromosomes ; dans les cas favorables,
un spécialiste distingue même la disposi-
tion de leurs bandes transversales.
L'aspect des chromosomes d'une cel-
lule tumorale diffère souvent de celui des
cellules humaines normales, car le pas-
sage de l'état normal à l'état malin,
appelé transformation, produit générale-
ment un chaos génétique. Parfois les
généticiens observent des altérations
chromosomiques spécifiques dans de
nombreuses tumeurs d'un type donné.
Ce fut le cas lorsque Jeorge Yunis, de
l'Université de médecine du Minnesota,
étudia des cellules provenant de plusieurs
rétinoblastomes : le plus long des deux
bras du chromosome 13 (le bras q) pré-
sentait souvent une délétion, c'est-à-dire
que l'une des bandes habituellement pré-
sentes sur le chromosome avait disparu.
Généralement c'était une partie de la
bande 14 qui manquait, et cette altération
13ql4 était trop souvent associée au réti-
noblastome pour être le fruit du hasard
génétique.
Cette délétion semblait au contraire
permettre aux cellules tumorales de se
multiplier. Ces observations résolvaient
l'une des deux questions soulevées par
A. Knudson : une des mutations asso-
ciées au rétinoblastome est une délétion
qui pourrait provoquer la perte d'un gène
et la disparition de certaines fonctions
essentielles. D'autres analyses chromoso-
miques ont montré que les délétions du
chromosome 13 atteignaient non seule-
ment les cellules tumorales, mais égale-
ment des cellules normales d'enfants
atteints de rétinoblastome et les cellules
d'un de leurs parents. En revanche,
lorsqu'il s'agissait de cas sporadiques, les
délétions chromosomiques ne portaient
que sur les cellules tumorales. Au total,
on trouvait précisément les chromosomes
anormaux des deux formes de rétinoblas-
tome dans les cellules que A. Knudson
avait indiquées.
On appelle Rb le gène du chromo-
some 13 qui intervient dans la formation
des rétinoblastomes ; on l'a identifié
grâce à une délétion visible au micro-
scope et qui, à l'échelle moléculaire, cor-
respond à la perte d'un segment d'ADN
long de plusieurs centaines de milliers de
bases. Cependant cette importante lésion
chromosomique ne représente que l'un
des mécanismes possibles d'inactivation
du gène Rb. Des délétions beaucoup plus
petites, invisibles au microscope, peuvent
ainsi inactiver le gène, et l'on a récem-
ment observé que des « mutations ponc-
tuelles», portant sur une seule base sont
également capables de l'inactiver.

Les deux mutations

nécessaires

On avait ainsi associé à l'un des

gènes cibles prévus par A. Knudson, un
site du chromosome 13, mais l'identité
de la seconde cible restait mystérieuse :
ce pouvait être soit n'importe quel autre
gène porté par l'un quelconque des 23
chromosomes de la cellule (présents en
deux exemplaires dans chaque cellule, à
l'exception de deux d'entre eux), soit
l'autre exemplaire du gène Rb, sur le
chromosome 13 apparié.
Grâce à une technique génétique
astucieuse, on découvrit en 1983 que la
seconde hypothèse était la bonne : la
cible génétique de la seconde mutation se
trouve sur l'autre chromosome 13. La
méthode d'analyse qui fut utilisée est
indirecte : on sait le devenir d'un gène en
étudiant un gène voisin du même chro-
mosome ; en l'occurrence on s'est inté-
ressé à un gène du chromosome 13, tout
près du gène Rb. En pistant un tel gène
2. DES MICROGRAPHIES d'un chromosome13 normal et d'un chromosome 3 anormal « marqueur », on suit indirectement un
gène très voisin.
sont disposéesde part et d'autre d'un schéma du chromosome normal Le chromosome À l'Université de Los Angeles,
anormal (à droite) a subi une délétion repérée par les traits bleus. Une autre délétion,
observéesur un chromosomeprovenant d'un autre rétinoblastome, est délimitée par les Robert Sparkes a découvert ce marqueur :
traits noirs. Les deux délétions se chevauchent le gène qui code l'enzyme estérase D.
; on peut donc supposerque le gène respon-
sable des rétinoblastomes est localisé dans une petite région de la sous-bande 13q14,1, Puis Rosalind Godbout, Brenda Gallie et
proche de la sous-bande13q14,2. La lettre q désigne le grand bras d'un chromosome.(Le Robert Phillips, de l'Hôpital des enfants
petit bras du chromosome13, au-dessusdu rétrécissement, est minuscule). malades de Toronto, ont découvert que
3. L'ARBRE GÉNÉALOGIQUE d'une famille présentant des cas fami- les femmes et des carrés pour les hommes. Dans la première géné-
liaux de rétinoblastome a été publié par T. Dryja et ses collègues. ration, un des fils est indemne, mais a hérité du chromosome 13
Les sujets atteints sont représentés en rouge, par des cercles pour mutant : deux de ses filles sont atteintes.
les cellules normales de certains malades
atteints de rétinoblastome contiennent
deux versions différentes du gène de
l'estérase D : les deux chromosomes
appariés de la treizième paire portent une
version différente ; en revanche, dans les
cellules tumorales, les deux exemplaires
du gène de l'estérase D sont souvent
identiques. L'un des deux allèles a été
perdu et remplacé par une copie de
l'autre allèle. Le gène de l'estérase D
n'intervient pas directement dans le réti-
noblastome, mais il a servi de traceur du
gène Rb, tout proche : on a admis que
quand l'une des deux versions du gène de
l'estérase D disparaissait au profit de
l'autre version, le gène Rb voisin était
également perdu. On découvrit ainsi
qu'une cellule rétinienne pouvait initiale-
ment posséder une version normale et
une version mutante du gène Rb, et
acquérir ultérieurement deux exemplaires
mutants. D'autres expériences ont
confirmé que les cellules tumorales por-
tent souvent deux exemplaires de l'allèle
défectueux du gène Rb. Cette découverte
donnait la clé de la deuxième étape de la
carcinogenèse du rétinoblastome : la
perte de l'exemplaire intact du gène Rb.
On a ainsi précisé la théorie de
A. Knudson : un rétinoblastome apparaît
quand les deux exemplaires du gène Rb
sont endommagés. Dans un premier
temps, un exemplaire du gène est inac-
tivé, et dans un deuxième temps, le
second allèle est abîmé. Les enfants nés
avec un allèle intact et un allèle défec-
tueux du gène Rb risquent de perdre la
version intacte lors d'une mutation soma-
tique localisée dans une cellule réti-
nienne, et donc de souffrir de rétinoblas-
tome. Les autres enfants, nés avec deux
allèles corrects, ont rarement l'infortune
de perdre, au début de leur vie, les deux
exemplaires du gène Rb d'une cellule
rétinienne.
Les enfants porteurs d'une anomalie
congénitale du gène Rb sont parfaitement
normaux, mais sont prédisposés au réti-
noblastome. Bien que chacune de leurs
cellules ne contienne qu'un seul exem-
plaire normal du gène Rb, le développe-
ment foetal de ces enfants ne pose pas de
problèmes particuliers, car l'unique allèle
Rb normal suffit à assurer la fonction du
gène ; la présence d'un allèle Rb anormal
dans toutes les cellules ne perturbe pas le
développement du foetus. Autrement dit,
la mutation est « récessive »; comme un
seul exemplaire du gène normal suffit au
fonctionnement de la cellule, les altéra-
tions ne se manifestent qu'à partir du
moment où l'une des cellules rétiniennes
perd l'exemplaire normal-le gène
«dominant» qu'elle possédait encore.
Si l'inactivation du gène Rb favorise
la croissance cancéreuse, il s'ensuit que
dans sa version normale, ce gène doit
inhiber la multiplication cellulaire. Cette
étude de la prédisposition génétique au
rétinoblastome avait fait apparaître une
classe de gènes impliqués dans la multi-
plication cellulaire et inconnue
jusqu'alors ; puisque l'inactivation de ces
gènes aboutit à la formation d'une
tumeur, on les appelle aussi anti-onco-
gènes par opposition aux oncogènes qui
doivent être activés pour provoquer une
tumeur. Cette terminologie a été adoptée
par la communauté scientifique mais elle
n'est pas parfaite : si le gèneRb intervient
probablement en inhibant la multiplica-
tion cellulaire, son rôle dans le développe-
ment des cancers resteencore mal connu.
Imprécis ou non, le terme d'anti-
oncogène indique bien qu'un gène
comme Rb, lorsqu'il est intact, fonc-
tionne en s'opposant aux oncogènes. Par
exemple, une cellule cancéreuse dont la
multiplication serait due à l'activation
d'oncogènes, proliférerait plus facilement
si, outre cette activation, elle perdait les
gènes qui freinent ou bloquent sa multi-
plication. Ce mécanisme de cancéroge-
nèse est sans doute fréquent, car l'inacti-
vation d'un gène paraît beaucoup plus
vraisemblable qu'une activation oncogé-
nique résultant de subtiles mutations
ponctuelles.
La perte d'anti-oncogènes est peut-être
un événement fréquent. Les chromosomes
de divers types de tumeurs portent fré-
quemment des aberrationscaractéristiques;
dans certains cas, on observe directement,
au microscope, la perte de segmentschro-
mosomiques caractéristiques, mais dans
d'autres cas, on doit pratiquer des analyses
génétiquesplus fines afin de mettre en évi-
dence ces délétions.
Webster Cavenee, de l'Institut de
recherche sur le cancer de Montréal fut le
premier à étudier ces pertes de régions
chromosomiques. La méthode utilisée
aujourd'hui ressemble à celle grâce à
laquelle on a détecté le gène Rb : on a
pisté un gène voisin de la région soup-
çonnée, celui de l'estérase D. Pour sa
part, W. Cavenee choisit la méthode des
polymorphismes génétiques : il s'est
servi de séquences d'ADN que l'on trouve
sous deux versions distinctes (hétérozy-
gotes) dans les tissus normaux et sous la
même forme (homozygotes) dans le tissu
tumoral. Le passage de ces segments
d'ADN de l'état hétérozygote à l'état
homozygote est un bon témoin de la dis-
parition d'anti-oncogènes voisins.
On connaît déjà plusieurs gènes dont
les deux allèles disparaissent lors de la
formation de tumeurs. Le cancer cana-
laire du sein, par exemple, est souvent
associé à la délétion d'un gène normale-
ment localisé sur le grand bras du chro-
mosome 13. la tumeur rénale de Wilms
serait due à la disparition d'un gène du
chromosome 11, et le cancer du poumon
à petites cellules résulterait de délétions
géniques sur le chromosome 3. Dans cha-
cun de ces cas, les deux exemplaires d'un
gène essentiel disparaissent ou sont inac-
tivés au cours de l'évolution du clone
tumoral. Cette spécificité tissulaire
(l'association de tumeurs particulières à
la perte de certains gènes) indique que les
anti-oncogènes fonctionneraient spécifi-
quement dans certaines cellules.
On a d'abord cru que l'action du gène
Rb se limitait à la genèse des tumeurs
rétiniennes, mais en suivant attentive-
ment les enfants atteints de rétinoblas-
tome familial, on a constaté qu'ils souf-
fraient ensuite, plus que d'autres, de can-
cers du tissu conjonctif, notamment
d'ostéosarcomes (des tumeurs des cel-
lules qui élaborent le tissu osseux). Il
semble ainsi que les allèles mutants du
« gène du rétinoblastome» ne prédispo-
sent pas seulement au rétinoblastome, et
l'on pense même que les altérations de ce
gène sont aussi fréquentes dans les cas
d'ostéosarcomes que dans les cas de réti-
noblastomes, même quand un ostéosar-
come survient chez un sujet sans antécé-
dent de rétinoblastome. Dans de
nombreux cas d'ostéosarcomes, la
tumeur résulterait uniquement de muta-
tions somatiques portant sur le gène Rb.
Cette conclusion suscite un nouveau
problème, car la rétine et les tissus où
apparaissent ces autres types de tumeurs
ont peu de points communs, tant par leur
4. LA FORMATION d'un rétinoblastome
familial a été schématisée, à l'échelle de la
cellule. À la suite d'un accident génétique
se produisant à la première génération, la
région portant le gène Rb-le «gène du
rétinoblastome»-de l'unique chromosome
13 d'un ovule est détruite. Le chromosome
(en noir) qui porte la délétion est transmis à
un fils et se retrouve dans toutes les cellules
de son organisme, notamment celles de la
rétine. Il suffit alors qu'une mutation
somatique, lors de ta petite enfance, inac-
tive le second exemplaire du gène Rb d'une
seule des cellules rétiniennes (indiquée par
la flèche rouge) pour qu'une tumeur appa-
raisse. Si l'on retire la tumeur à temps, le
patient atteint l'âge adulte et, statistique-
ment, la moitié environ de ses enfants
seront prédisposés au rétinoblastome.
origine évolutive que par leur développe-
ment embryonnaire. On imagine qu'il y a
un milliard d'années ou plus, au cours de
l'évolution de nos premiers ancêtres plu-
ricellulaires, un précurseur du gène Rb
contrôlait la multiplication de deux types
de cellules tout à fait différents, et des
tissus qui en dérivaient.
La « réparation »
des cellules tumorales
D'autres études de nature très diffé-
rente semblent confirmer que certaines
cellules tumorales seraient anormales
parce qu'elles ont perdu des informations
génétiques essentielles. Henry Harris, de
l'Université d'Oxford a notamment utilisé
des méthodes qui permettent de fabriquer
un hybride cellulaire en fusionnant deux
cellules génétiquement distinctes : on uti-
lise un agent qui fusionne les membranes
cellulaires de deux cellules très proches,
ce qui aboutit à la formation d'une mem-
brane unique autour des noyaux des deux
partenaires. Les deux jeux de chromo-
somes fusionnent, et la cellule hybride
contient deux fois plus d'information
génétique que les cellules normales.
Grâce à ces « mariages forcés », on observe
comment les caractéristiques des deux
partenaires évoluent après la fusion. Les
gènes de l'une des deux cellules paren-
tales sont souvent dominants et imposent
le comportement de la cellule hybride.
Au cours des 20 dernières années, on
a ainsi observé que les hybrides de cel-
lules tumorales malignes et de cellules
normales se comportent souvent comme
le parent normal, c'est-à-dire qu'elles ne
forment pas de tumeur. Avant la décou-
verte des anti-oncogènes, cette observa-
tion surprenait, car on pensait que le
caractère tumoral devait dominer le
caractère normal.
La découverte des anti-oncogènes
éclaire en partie ce mystère : la cellule
tumorale fusionnée à une cellule nor-
male, retrouve le gène qui inhibe la mul-
tiplication, et qu'elle avait perdu en deve-
nant maligne ; dans ces conditions, le
gène de la cellule normale contrôle à
nouveau la multiplication de la cellule
qui avait depuis longtemps échappé à
toute régulation.
Eric Stanbridge et ses collègues de la
Faculté de médecine d'Irvine, qui étu-
dient diverses tumeurs dont celle de
Wilms, ont observé ce phénomène : ils
ont montré qu'un hybride formé par
fusion d'une cellule de Wilms et d'une
cellule normale perd son caractère tumo-
ral (la cellule normale reprend le contrôle
de la cellule maligne).
Ils ont ensuite franchi une nouvelle essentiellement lorsqu'il est absent ;
étape en introduisant seulement un chro- concevoir des expériences montrant
mosome 11 humain normal dans les cel- directement que tel ou tel fragment d'ADN
lules d'une tumeur de Wilms : les cellules correspond bien au gène recherché fut
cancéreuses sont corrigées et redevien- une tâche très délicate.
nent normales en présence d'un chromo- Thaddeus Dryja, de l'Institut d'oph-
some 11 normal. On a ainsi la preuve que talmologie et d'otorhinolaryngologie du
la dégénérescencemaligne de ces cellules Massachusetts, s'est lancé à la recherche
tumorales dépend de l'absence d'un ou du gène Rb en 1983, en s'intéressant sur-
de plusieurs gènes normalement présents tout au chromosome 13 humain. Marc
sur le chromosome 11. Lalande et Samuel Latt, à Boston, avaient
Tous ces résultats semblent confirmer obtenu, de leur côté, une collection de
que la perte d'une information génétique clones d'ADN représentant chacun une
est tout aussi importante que l'activation petite partie du chromosome 13 normal.
d'oncogènes promoteurs de la multiplica- T. Dryja a utilisé au hasard des clones de
tion cellulaire, lors de la formation de cette banque d'ADN en espérant que l'un
tumeurs. Dans l'avenir, on pourra sans de ces fragments correspondait à la
doute introduire dans les cellules tumo- séquence d'ADN constituant le gène Rb.
rales certains gènes dont elles sont Son entreprise était risquée, puisque l'on
dépourvues, afin de bloquer le dévelop- sait aujourd'hui que le gène Rb ne repré-
pement d'une tumeur. sente que la millième partie de l'ADN du
chromosome 13.
Sur la trace du gène Rb T. Dryja a utilisé successivement
chacun de ces fragments du chromosome
En dépit de ces découvertes fonda- 13 et a recherché lors de tests d'hybrida-
mentales, le gène Rb n'était, il y a peu de tion de l'ADN si ces sondes ne détecte-
temps encore, qu'une entité théorique raient pas des anomalies dans l'informa-
imaginée à partir d'observations géné- tion génétique contenue dans toute une
tiques indirectes. En outre, le but ultime série de cellules de rétinoblastome.
des biologistes et des biochimistes est de Ce jeu de hasard fut payant : T. Dryja
comprendre comment un gène comme Rb trouva effectivement qu'un fragment
inhibe ou bloque la croissance cellulaire. dérivé du chromosome 13 normal était
Pour ce faire il était nécessaire d'isoler et absent de l'ADN de 2 des 50 rétinoblas-
de cloner ce gène Rb, ce qui fut particu- tomes examinés. Cela ne prouvait naturel-
lièrement difficile puisqu'il se manifeste lement pas que ce fragment faisait partie
5. LA RECHERCHE DU GÈNE Rb consiste à reconnaître les fragments manquant dans l'ADN
de chromosomes13 responsablesde rétinoblastomes.Sur cettephotographie, lesfragments
d'ADNde cellules tumorales ont été séparéspar électrophorèsesur gel ; les fragments H242
et 7D2, marquéspar un traceur radioactif, se sont hybridés aux fragments homologues d'ADN
de 13 tumeurs différentes (les nombres, au-dessusde la photographie, sont les numéros des
13 tumeurs) : ils apparaissent sur le gel sous forme de taches sombres.
Le troisième fragment,
H3-8, n'a pas trouvé d'homologue dans l'ADN de la tumeur numéro 9: le segmentdu chro-
mosome 13 recherché par la sonde H3-8 n'existe plus dans l'ADN de cette tumeur numéro 9.
 du gène Rb, mais on pouvait postuler qu'il bases. Utilisant alors des techniques effectivement la cible commune de toutes
se situait à proximité du gène Rb et qu'au d'hybridation des acides nucléiques, nous ces délétions aléatoires.
cours des accidents génétiquesqui avaient avons étudié la configuration de ce vaste La découverte de deux délétions com-
provoqué les deux rétinoblastomes, il domaine chromosomique dans l'ADN de mençant et finissant dans les limites du
avait disparu en même temps que lui. 60 rétinoblastomes et ostéosarcomes. gène cloné apporta la preuve finale : les
Il restait à préciser la relation existant Dans 30 pour cent environ de ces ADN, délétions aléatoires trouvées dans l'ADN
entre le fragment dérivé du chromosome l'un-et parfois les deux-des allèles du des cellules de rétinoblastomesinactivaient
13 normal et le gène Rb. T. Dryja et ses gène analogue au gène cloné présentait le gène cloné et non un gène adjacent.
collègues, et Stephen Friend et quelques- d'importantes délétions ; cette technique Wen-Hwa Lee, de la Faculté de
uns de mes collègues ont d'abord décou- d'analyse ne permet pas de détecter des médecine de San Diego, et Yuen-Kai
vert que le fragment de l'ADN du chromo- modifications moins étendues ou plus Fung et William Benedict, de la Faculté
some 13 normal détectait des molécules subtiles (comme les mutations de médecine de Californie du Sud ont
ponc-
d'ARN messager présentes dans les cel- tuelles) de la structure de ce gène qui reproduit et poursuivi nos recherches,
lules rétiniennes normales (l'ARN messa- peuvent pourtant l'inactiver totalement. confirmant que le gène cloné est effecti-
ger est l'acide nucléique qui véhicule Les expériences ont ainsi prouvé que vement le gène Rb ; ils ont notamment
l'information génétique portée par les le gène cloné était souvent endommagé montré que ce segment particulier d'ADN
gènes actifs, du noyau cellulaire jusqu'au dans le cas de rétinoblastomes. Le gène est endommagé par d'importantes délé-
cytoplasme, où la cellule traduit cette cloné était-il réellement le gène Rb ? tions dans de nombreuses tumeurs.
information en protéines). La mise en Nous avons eu la preuve que le segment Plusieurs chercheurs tentent
évidence d'un ARNmessager dans la cel- cloné contenait bien le gène Rb et non un aujourd'hui de prouver, directement et
lule rétinienne par le fragment d'ADN gène sans rapport avec lui, situé simple- définitivement, que le gène cloné est le
cloné, signifiait que ce fragment faisait ment à proximité, sur le chromosome, en gène Rb : ils essaient de transférer une
partie d'un gène qui s'exprime dans les précisant la localisation des diverses copie normale du gène Rb présumé dans
cellules rétiniennes normales. Or dans délétions dans le segment cloné (voir la des cellules tumorales dépourvues de
aucun de nos rétinoblastomes nous ne figure 7). gènes Rb normal. Si les cellules cancé-
détectâmes cet ARNmessager,même dans Dans certains cas, le gène cloné avait reusescessent de proliférer, on saura avec
les rétinoblastomes où notre sonde ne totalement disparu. Ces délétions certitude que l'ADN cloné contient l'infor-
détectait aucune anomalie de l'ADN cellu- n'apportaient aucun renseignement inté- mation génétique essentielle dont la perte
laire. Nous en avons conclu que le gène ressant puisqu'elles ne permettaient pas a déclenché la formation de la tumeur.
dont nous détections l'ARN messager dans de savoir si le gène cloné avait disparu
les cellules normales était inactif ou seul, ou avec d'autres fragments de la Des gènes aux protéines
absent des cellules tumorales, comme région contenant le gène cible recherché,
devait l'être le gène Rb. c'est-à-dire le gène Rb. Les applications potentielles de la
II restait à confirmer que ce gène était Trois autres délétions touchant découverte de gènes inhibiteurs de la mul-
bien Rb. S. Friend réalisa une molécule l'extrémité droite de la région clonée tiplication cellulaire, comme Rb, sont
d'ADN complémentaire de l'ARN messa- indiquaient que le gène responsable des nombreuses.Lorsque de tels gènes seront
ger en utilisant le procédé de transcrip- rétinoblastomes se trouvait à la droite de clonés, ils serviront en clinique et en
tion inverse, et l'ADN ainsi obtenu servit la région clonée, ou était cette région clo- recherche fondamentale : les segments
de sonde pour repérer et cloner la région née elle-même. D'autres mutations au d'ADN clonés serviront à analyser la struc-
du chromosome normal correspondant à contraire touchaient l'extrémité gauche ture des séquences homologues dans des
cet ARN messager, c'est-à-dire au gène du gène cloné ou des séquences situées échantillons de tissu normal ou tumoral, et
présumé. Le gène ainsi cloné s'avéra très en amont de cette région. Tout ceci sem- à détecter les versions anormalesdes gènes
long, puisque formé de quelque 200 000 blait confirmer que le gène cloné était inhibiteurs de la multiplication cellulaire.
Comme une personne portant un allèle
mutant du gèneRb le transmeten moyenne
à la moitié de ses enfants, le clonage du
gène permettrait les diagnostics anténataux
de cancer : en utilisant une sonde, on pour-
rait détecter un gène Rb anormal dès le
début de la vie foetale, et apprécier le
risque de rétinoblastome chez cet enfant.
La découverte de ces gènes ouvre plu-
sieurs voies de recherche en biologie fon-
damentale. Le gène Rb est le premier
gène inhibiteur de la multiplication cellu-
laire isolé, mais on peut vraisemblable-
ment généraliser ses propriétés à toute
6. UNE SÉRIED'EXPÉRIENCES a conduit au clonage et à l'identification du gène Rb. On a une gamme de gènes inhibant la multipli-
mis en contact les molécules d'ADN de cellules rétiniennes normales avec une sonde appelée
cation de différentes sortes de cellules.
H3-8 et correspondantau fragment d'ADN détruit dans plusieurs rétinoblastomes ; la sonde Les quelques gènes, soupçonnés
s'est hybridée avec un ARN messager (a), ce qui signifiait que H3-8 faisait partie d'un gène
actif dans aujourd'hui parce qu'ils sont absents dans
lescellules normales. On a ensuite effectué une transcription inverse (b) de cet
ARNmessageret réalisé une molécule d'ADN avec laquelle on a sondé le génome.On a alors certaines tumeurs, ne représentent peut-
détecté un longfragment DADN (200 000 pairesde bases) formant le gène dont l'ARN messa- être que la partie émergée de l'iceberg des
ger était une copie ; on a cloné ce gène qui doit être le gène Rb. anti-oncogènes. On connaît plus de 50
 oncogènes ; combien existe-t-il de gènes
régulateurs, s'opposant à leurs effets ?
On ignore par quels mécanismes ces
gènes limitent ou inhibent la multiplica-
tion cellulaire normale. Le groupe de
W. a montré que le gène Rb code
H. Lee
une protéine de masse moléculaire égale
à 105 000, et présente dans le noyau cel-
lulaire (les protéines du noyau jouent
souvent un rôle dans la régulation de
l'expression des gènes).
En étudiant comment des virus cancé-
rogènes transforment une cellule, des cher-
cheurs ont indirectement montré que le
gène Rb code effectivement une protéine
régulatrice. Un de ces virus, un adénovirus,
transporte un oncogène appelé EIA dans
les cellules qu'il infecte ; cet oncogène
code une protéine qui modifie le métabo-
lisme de la cellule hôte et lui confère un
comportement malin. Comment cette
« oncoprotéine »agit-elle exactement ? 7. LE GÈNECLONÉà l'issue des expériencesavecla sonde H3-8 est bien le gène du rétino-
Des collègues d'Ed Harlow, au blastome : c'est ce gène-et non un gène voisin-qui est la cible des délétions chromoso-
Laboratoire de Cold Spring Harbor, et de miques à l'origine du rétinoblastome. Des fragments du gène cloné ont permis de repérer
Philip Branton, à l'Université de méde- les délétionsdans les ADNtumoraux. Ces sondes ont d'abord misen évidencecertaines délé
cine MacMaster, ont montré que, dans tions du gène tout entier et des séquences adjacentes(1) ; ces premières expériences ne
prouvaient pas que le gène cloné était confondu avec le gène du rétinoblastome. Dans
une cellule transformée par ce virus,
l'oncoprotéine virale forme des com- d'autres tumeurs, les délétionsportaient sur l'extrémité gauche du gène et sur les séquences
adjacentesa gauche (2) : le gène du rétinoblastomepouvait donc être soit le gène cloné, soit
plexes avec certaines protéines de la cel-
lule hôte ; elle modifie sans doute ainsi un autre gène situé plus à gauche. D'autres délétions (3) portaient sur la partie droite du
gène et sur les séquences adjacentes à droite, et dans quelques tumeurs, (4,5) enfin, seule
l'action de ces protéines et fait fonction- la zone centrale du gène cloné était endommagée. Ces dernières délétions montraient que le
ner les « interrupteurs » cellulaires qui gène cloné est bien le gène Rb, dont l'inactivation engendreles rétinoblastomes.
déclenchent le processus de cancérisation.
L'une des protéines cellulaires aux-
quelles l'oncoprotéine virale se complexe
est une molécule de masse moléculaire l'adénovirus transformerait les cellules faudra encore plusieurs annéespour com-
égale à 105 000 ! Peter Whyte et Karen en se complexant avec la protéine qui est prendre le mécanisme d'action de ces
Buchkovitch avaient remarqué que cette codée par le gène Rb et qui est absente gènes et de ceux qui déclenchent et arrê-
oncoprotéine a des propriétés semblables des cellules des rétinoblastes ; comme la tent la multiplication cellulaire. On com-
à celles de la protéine Rb ; avec Jonathan protéine EIA contrôle l'expression de prendra alors mieux pourquoi une tumeur
Horowitz, de mon laboratoire, ils ont certains gènes, la protéine Rb intervient apparaît et comment un oeuf fécondé se
prouvé que ces deux protéines sont iden- sans doute directement dans la modula- transforme en un organisme aussi élaboré
tiques. Autrement dit, la protéine E1A de tion de l'expression génétique. Il nous qu'un être humain.

8. LE GÈNERb code une protéine présente dans le noyau des cel- lule infectée ; cette protéine cellulaire est la protéine codée par le
lules rétiniennes normales (à gauche), mais absentedes cellules du gène Rb (à droite). Comme la protéine du gène Rb déclenche la
rétinoblastome (au milieu). La protéine E1A produite par l'onco- formation d'une tumeur lorsqu'elle est absentedes cellules réti-
gène introduit dans le génome cellulaire par un adénovirus, trans- niennes, et qu'elle est impliquée dans la transformation par l'adé-
forme les cellules infectées en se liant à une protéine cible de la cel- novirus, on pense qu'elle contrôle la multiplication cellulaire.
 La thérapie génique
On commence à traiter des
des gènes normaux dans leur
mais cette méthode ne sera
l'on parviendra à conserver
fonctionnels suffisamment
UNENFANTsur 100 naît
avec une anomalie
génétique grave. En
général, cette anomalie
provoque dès l'enfance
des troubles physiques et mentaux, et
conduit à la mort. On connaît plus de
4 000 maladies héréditaires, et l'on
manque d'un traitement efficace pour la
plupart d'entre elles.
De nombreux chercheurs rêvent
depuis longtemps de soigner les maladies
héréditaires en introduisant des gènes
normaux dans l'organisme des patients.
Grâce aux progrès des techniques de
recombinaison de l'ADN, qui permettent
d'isoler de nombreux gènes, et grâce à
l'exploration des systèmes de régulation
génétique, on commence à pratiquer ces
traitements naguère utopiques.
La première étude clinique d'une thé-
rapie génique d'une maladie génétique a
commencé au mois de septembre 1990 :
Michael Blaese, French Anderson et
leurs collègues de l'Institut américain de
la santé (NIH) ont introduit le gène de
l'enzyme adénosine désaminase dans le
génome d'enfants souffrant d'une mala-
die rare, l'immunodéficience combinée
sévère. Des anomalies du gène codant
l'adénosine désaminase perturbent le sys-
tème immunitaire des enfants et sont res-
ponsables de 25 pour cent de ces immu-
nodéficiences.
Ce « traitement »devra être poursuivi
pendant toute la vie des malades : ceux-ci
seront soignés, mais non guéris.
Toutefois cette étude inaugure une nou-
velle ère de la médecine. Les progrès
sont si rapides que des thérapies géniques
de nombreuses maladies, héréditaires ou
non, seront en phase d'essais cliniques
dès le début du xxr siècle.
patients en introduisant
organisme,
efficace que lorsque
les gènes
longtemps.
On sait transférer des gènes aussi
bien dans les cellules germinales (les
spermatozoïdes, les ovules ou les jeunes
embryons), que dans les cellules soma-
tiques (les autres cellules), mais la théra-
pie des cellules germinales n'est pas
envisageable dans un futur proche, parce
que les nouveaux gènes seraient transmis
de génération en génération, ce qui sou-
lève de graves problèmes éthiques.
Avons-nous le droit d'utiliser la thé-
rapie génique pour « améliorer »le patri-
moine génétique de nos descendants ? À
qui revient la responsabilité de telles
décisions ? La société peut-elle prendre
le risque de modifier le patrimoine géné-
tique de l'espèce humaine sans en
connaître les conséquences-éventuelle-
ment néfastes-à long terme ? Avons-
nous le droit de perturber l'Évolution
naturelle ? La thérapie génique des cel-
lules somatiques soulève moins de ques-
tions parce qu'elle agit uniquement sur
l'individu traité, pas sur sesenfants.
Stimuler gène
un
Les premiers bénéficiaires de la thé-
rapie génique des cellules somatiques
seront les personnes souffrant de mala-
dies causées par l'anomalie d'un gène
que l'on a déjà isolé et cloné, de sorte
qu'il reste seulement à maîtriser les tech-
niques de transplantation. Ces maladies
seront sansdoute plus aiséesà traiter que
celles qui résultent de plusieurs anoma-
lies génétiques, de la perte d'un chromo-
some entier ou de la présence d'un chro-
mosome surnuméraire.
L'objectif à long terme est le traite-
ment définitif des maladies, par une seule
intervention dépourvue d'effets secon-
daires. On cherche notamment à intro-
Inder Verma
duire un gène sain à la place exacte du
gène déficient ou manquant, dans les
chromosomes des cellules somatiques
cibles, par une recombinaison homo-
logue, le gène sain, ou « thérapeutique ».
Cette insertion dirigée augmenterait la
probabilité que le gène thérapeutique
fonctionne correctement, et réduirait les
risques que l'insertion aléatoire active un
oncogène inactif (un inducteur du cancer)
ou inactive un anti-oncogène (un sup-
presseur du cancer).
Aujourd'hui les généticiens maîtri-
sent encore mal la destination de l'ADN
qu'ils introduisent dans les cellules. Pour
un exemplaire du gène intégré à sa place,
plus de 1 000 autres exemplaires sont
aléatoirement dispersés dans le génome
(l'ensemble de l'ADN). Les travaux effec-
tués par Mario Capecchi à l'Université de
l'Utah indiquent toutefois que les obs-
tacles à l'insertion spécifique ne sont pas
insurmontables. Simultanément de nom-
breuses équipes, notamment la nôtre à
l'Institut Salk, étudient des traitements
par augmentation génique, où un gène
sain synthétise les protéines manquantes
ou présentesen quantité insuffisante, sans
remplacer physiquement le gène anormal.
Ces augmentations génétiques peu-
vent pallier les déficiences génétiques
résultant de la production insuffisante,
voire de l'absence de production d'une
protéine vitale (chaque gène code une
protéine : il contient les instructions
nécessaires à sa synthèse, elle-même
effectuée par des organites nommés ribo-
somes). La production d'une protéine est
insuffisante lorsque des mutations rédui-
sent l'activité des deux exemplaires
maternel et paternel du gène codant cette
protéine, ou lorsque l'individu ne pos-
sède qu'un seul exemplaire d'un gène
défectueux : ainsi les individus de sexe
masculin ont un chromosome X et un
chromosome Y ; si le gène muté est sur le
chromosome X, la mutation s'exprime.
La thérapie d'augmentation est ineffi-
cace contre les surproductions de protéines
ou contre la synthèse de substances
nocives, comme dans le cas de l'anémie
falciforme. Pour corriger ces perturbations,
il faudrait introduire à la fois un gène sain
et un gène inactivant le gène muté.
 Aujourd'hui la plupart des chercheurs
qui s'intéressent à la thérapie d'augmenta-
tion prévoient de prélever des cellules aux
patients, d'y introduire le gène thérapeu-
tique et de réintroduire les cellules mani-
pulées dans l'organisme. Ultérieurement
on injecterait directement les gènes, liés à
des substances qui les conduiraient vers
les cellules cibles spécifiques.
La thérapie génique peut être efficace
même si toutes les cellules de l'organisme
ne sont pas corrigées. Premièrement, bien
que toutes les cellules somatiques d'un
individu contiennent les mêmes chromo-
somes,seulscertains gènes sont actifs dans
certaines cellules : il suffira de traiter ces
cellules précises. Deuxièmement même
quand un défaut génétique est responsable
d'une synthèse insuffisante d'une protéine
dans toutes les cellules, nombre d'entre
elles pallient cette insuffisance : une défi-
cience du gène de l'adénosine désaminase
atteint toutes les cellules somatiques, par
exemple, mais elle n'a d'effets graves que
dans certainescellules immunitaires.
Les virus,
des ennemis utiles
L'introduction aléatoire de gènes dans
les cellules s'effectue au moyen soit de
procédéschimiques ou physiques (la trans-
fection), soit de virus (la transduction).
Dans la transfection chimique, on mélange
des molécules d'ADN portant le gène sain
avec une substance électriquement char-
gée, tels le phosphatede calcium, le DEAE-
dextran ou certains lipides ; puis on dépose
le mélange au contact des cellules que l'on
veut traiter : les composés chimiques altè-
rent la membrane cellulaire et font péné-
trer l'ADN à l'intérieur de la cellule.
La méthode est simple, mais peu effi-
cace : généralement le gène thérapeutique
s'introduit dans le génome d'une cellule
sur 1 000 à 100 000 seulement. On
devrait prélever beaucoup trop de cel-
lules aux patients pour en produire les
millions nécessairesau traitement.
De surcroît, l'intégration du gène sain
au génome n'est pas toujours indispen-
sable à son expression, c'est-à-dire à la
production de la protéine qu'il code, mais
un gène intégré reste fonctionnel plus
longtemps dans les cellules ; il peut se
répliquer avec l'ADN cellulaire, quand la
cellule se divise, et être transmis aux cel-
lules filles, de sorte qu'il reste actif pen-
dant toute la vie du patient.
Une deuxième façon d'introduire le
gène consiste à effectuer des micro-injec-
tions à l'aide de fines pipettes en verre,
ou par électroporation, en appliquant une
décharge électrique aux cellules, afin de
les rendre perméables à l'ADN extérieur.
L'électroporation endommage parfois
gravement les cellules ; elle est très effi-
cace puisqu'elle permet d'introduire le
gène thérapeutique dans une cellule sur
cinq, mais comme on ne peut traiter
qu'une cellule à la fois, elle est fasti-
dieuse et inutilisable en thérapie génique.
La transduction est fondée sur la
capacité de certains virus à introduire
leur propre matériel génétique dans celui
des cellules qu'ils infectent. Nombre de

1. CETTE BULLE STÉRILE protégeait David, atteint d'une maladie traités, et ils bénéficieront peut-être bientôt de thérapiesgéniques :
héréditaire du système immunitaire : l'immunodéficience combinée le premier traitement génétique que viennent d'autoriser les ser-
sévère. Les patients souffrant de cette maladie commencent à être vices sanitaires vise à soulager uneforme de cette maladie.
 ces virus, modifiés, servent aujourd'hui
de vecteurs de transfert de gènes.
Certains ont un génome présent sous
forme d'ARN, d'autres, sous forme d'ADN.
Ces deux types d'acides nucléiques pré-
sentent des différences chimiques impor-
tantes, mais ils sont tous deux constitués
par l'enchaînement de nucléotides.
Certaines de leurs séquences codent les
protéines, d'autres commandent l'expres-
sion des gènes.
De nombreux virus à ADNn'acceptent
qu'un nombre limité de séquences étran-
gères et ils n'infectent que des cellules
particulières. On a trouvé d'autres virus à
ADN plus hospitaliers, mais ils étaient
inutilisables pour diverses raisons. En
outre, les virus à ADN n'introduisent pas
toujours leur ADN dans le génome des
cellules qu'ils infectent.
De même, la plupart des virus à ARN
sont inutilisables en thérapie génique
parce que leur ARN ne s'introduit pas
dans l'ADN humain et est rapidement
dégradé. Les rétrovirus font exception :
ils transforment leur ARNen ADNdans les
cellules qu'ils infectent et insèrent cet
ADN dans les chromosomes ; l'ADN viral
intégré commande alors la synthèse des
protéines virales. Les rétrovirus intègrent
plus de séquences génétiques étrangères
que les virus à ADN, et ils infectent des
types de cellules très variés. Ce sont les
vecteurs de la thérapie génique les plus
prometteurs et, sauf mention contraire,
toutes les méthodes de thérapie génique
considérées dans cet article sont fondées
sur leur utilisation.
Les rétrovirus ont cependant des
inconvénients évidents : par exemple, ils
ne fusionnent leur ADN qu'aux chromo-
somes qui se répliquent, dans les cellules
qui se divisent ; or de nombreuses cel-
lules, tels les neurones parvenus à matu-
rité, ne se divisent pas et ne peuvent être
traitées par les rétrovirus. En outre, les
rétrovirus peuvent provoquer des can-
cers. Le risque est extrêmement faible
pour les rétrovirus étudiés, mais il aug-
mente si les virus se multiplient dans
l'organisme et se transmettent de cellule
en cellule. On étudie activement com-
ment bloquer la prolifération virale.
Les efforts conjugués de plusieurs
laboratoires ont abouti à la mise au point
d'au moins une technique qui semble effi-
cace (voir la figure 3) : on utilise des par-
ticules dont l'enveloppe externe est nor-
male et qui contiennent toutes les
protéines virales normales ; en revanche,
leur ARN rétroviral est dépourvu des
séquencesqui déclenchent la synthèse des
protéines virales ; le gène thérapeutique
prend la place de ces séquenceséliminées.
L'enveloppe permet aux virus Les globules rouges des patients
d'entrer dans les cellules et de délivrer atteints de bêta thalassémie présentent
leur contenu dans le cytoplasme cellu- des anomalies de la chaîne bêta de la glo-
laire ; les enzymes virales transforment bine, molécule qui, chez les individus
l'ARN en ADN, et aident cet ADN à s'inté- sains, forme l'hémoglobine en se combi-
grer dans le génome de la cellule infec- nant avec la chaîne alpha de la globine et
tée. Le virus cesse alors de jouer son rôle. le groupe hème (contenant du fer). Dans
S'il n'était pas modifié, l'ADN rétroviral les cellules saines, le gène de la chaîne
intégré, ou provirus, commanderait la syn- alpha de la globine s'exprime au même
thèsede l'ARN et des protéines virales, les- rythme que le gène de la chaîne bêta de
quelles s'assembleraienten nouvelles parti- la globine : les deux protéines sont syn-
cules virales. Au contraire, les rétrovirus thétisées en quantités égales. L'absence
modifiés, privés des instructions qui de chaîne bêta de la globine réduit la
déclenchent la fabrication des protéines quantité d'hémoglobine assemblée et
virales, ne se « reproduisent » pas. Ils dispa- engendre un excès de la chaîne alpha ;
raissent de la cellule, n'y laissant que le cet excès détruit les globules rouges et
gène thérapeutiqueet les séquencesnucléo-
tidiques qui en facilitent l'expression.
Bien que les rétrovirus puissent infec-
ter de nombreux types de cellules, seules
certaines cellules constituent des cibles
susceptibles de transférer un gène par
transduction : elles doivent être assez
résistantes pour supporter les diverses
manipulations, à commencer par l'extrac-
tion temporaire de l'organisme ; elles doi-
vent en outre vivre assez longtemps-des
mois, des années ou, mieux, toute la vie
des patients-ou donner naissance à une
lignée cellulaire stable. On pourra traiter
les maladies de la moelle osseuse, de la
peau et du foie parce que les cellules de
ces organes vérifient ces conditions.
Les cellules de la moelle osseuse, où
le sang se forme, seraient utilisées pour
corriger des maladies résultant d'anoma-
lies génétiques des globules rouges et des
globules blancs (qui jouent un rôle essen-
tiel dans l'immunité). L'immunodéfi-
cience combinée sévèredue à l'expression
anormale de l'adénosine désaminase n'est
que l'une des nombreuses maladies héré-
2. LE CYCLEDE VIE d'un rétrovirus com-
ditaires du système immunitaire suscep-
tibles d'une thérapie génique ; on pourrait mencequand le virus se lie (en haut) à une
également corriger le déficit d'adhésion cellule et y entre (à droite) ; il libère alors
leucocytaire, caractérisé par une mobilité son matériel génétique (de l'ARN) et ses pro-
téines dans le cytoplasme de la cellule.
insuffisante des lymphocytes, entraînant
L'ARN rétroviral comporte trois régions
des infections à répétition. En agissant sur
codantes: la région gag (en vert), la région
les globules rouges, on traiterait les tha- pol (en bleu) et la région env (en violet), qui
lassémies, dues aux anomalies des gènes codentlesprotéines du noyau viral, la trans-
codant les sous-unités de la molécules criptase inverseet les constituants de l'enve-
d'hémoglobine (la molécule des globules loppe. L'ARN comporte aussi trois domaines
rouges qui fixe l'oxygène). non codants : deux aux extrémités (en
orange clair) et un autre, nommé v (psi, en
La manipulation des rouge). La transcriptase inverse transforme
l'ARN en ADN, dont les extrémités, les langues
cellules de moelle osseuse répétitions terminales (en orange foncé),
commandent l'activité des gènes viraux et
On pensait naguère que la bêta tha-
facilitent l'insertion de l'ADN viral dans
lassémie serait la première maladie à être
l'ADN cellulaire. L'ADN inséré (ou provirus)
traitée par thérapie génique, mais les
commande la synthèsede l'ARN et des pro-
généticiens se sont heurtés à des difficul- téines virales. Les protéines se regroupent
tés inhérentes soit à la thérapie génique alors autour de l'ARN transcrit forment
et de
en général, soit à la modification des cel- nouvelles particules virales, qui quittent la
lules de moelle osseuse. cellule et vont en infecter d'autres.
peut provoquer de graves anémies : géné-
ralement les patients succombent à la
maladie vers l'âge de 20 ans, après des
annéesde souffrances.
On pourrait sans doute traiter effica-
cement cette maladie et d'autres troubles
sanguins héréditaires en introduisant des
gènes sains dans les cellules souches, ces
cellules de la moelle qui, pendant toute la
vie des individus, engendrent les diverses
cellules sanguines et remplacent les cel-
lules mortes. Si l'on réussissait à intro-
duire un gène approprié, stable, dans les
cellules souches, on pourrait normaliser
la production de cellules sanguines
durant toute la vie des patients.
Malheureusement les cellules
souches humaines étant peu nombreuses
et presque impossibles à isoler, les géné-
ticiens ont dû se contenter d'une stratégie
moins efficace : ils transfectent un
nombre considérable de cellules de
moelle osseuse avec un rétrovirus théra-
peutique, en espérant qu'un nombre suffi-
sant de cellules souches fera partie du lot.
Cette tactique s'est révélée assezeffi-
cace : ainsi plusieurs laboratoires ont
montré que le gène de la chaîne bêta de la
globine intégré dans des cellules de
moelle osseuse de souris par des rétrovi-
rus y restait ; puis Richard Mulligan et ses
collègues de l'Institut Whitehead, à
Cambridge, ont observé que le gène
humain était exprimé quand les cellules
traitées étaient implantées dans des souris.
En revanche, les chercheurs ont été déçus
d'observer que les cellules synthétisaient
très peu de globine, mais Frank Grosveld
et ses collègues de l'Institut britannique
de recherche médicale, à Londres, ont fait
une découverte encourageante.
Ils ont identifié des segments d'ADN
éloignés du gène de la chaîne bêta de la
globine de plusieurs milliers de nucléo-
tides, qui stimulent la production de
l'ARN messager de la globine, dans les
globules rouges normaux. L'expression
d'un gène s'effectue en effet en deux
 étapes : d'abord un ARNmessager est cal-
qué sur l'ADN-il est transcrit-puis des
organites intracellulaires nommés ribo-
somes assemblent la protéine codée par
le gène en utilisant les informations por-
tées, sous forme codée, par l'ARN messa-
ger. Quand l'ARN messager est abondant,
la protéine l'est également. On suppose
que si l'on ajoutait des séquencesactiva-
trices spécifiques du gène de la globine
dans le rétrovirus contenant le gène, la
synthèse de la globine, dans l'organisme,
devrait être améliorée après la transduc-
tion. Ces études sont en cours.
Le cas de la globine n'est pas isolé :
les cellules de moelle osseuse modifiées
génétiquement expriment peu les gènes
qu'on leur a communiqués, in vivo, et
cette difficulté devra être résolue pour
que la thérapie génique des cellules de
moelle osseusedevienne une réalité.
L'expression des gènes doit être, non
seulement intense, mais aussi durable.
Des études récentes de la globine indi-
quent que l'on parviendra plus facilement
à faire exprimer longtemps le gène de la
globine qu'à en obtenir une expression
intense : mes collègues Chung Li et
V. Dwarki ont obtenu des cellules où le
gène de la chaîne bêta de la globine
humaine s'exprimait pendant longtemps
chez des souris. L'expression, bien que
faible, s'est prolongée durant cinq mois,
l'équivalent de 15 à 20 ans de vie
humaine ; le gène de la chaîne alpha de la
globine, d'autre part, est resté fonctionnel
pendant plus de 10 mois.

3. LES VECTEURS RÉTROVIRAUX servent à

introduire des gènes thérapeutiques dans
des cellules. Les généticiens substituent un
gène thérapeutique à certains gènes viraux
d'un provirus (a) et introduisent ce provirus
dans une première cellule (b). L'ADN viral
commande la synthèse d'ARN viral, mais,
dépourvu des gènes viraux appropriés, cet
ADNne conduit pas à la synthèsedes pro-
téines indispensables à la formation de
nouvelles particules virales. L'ARN viral
n'est donc pas propagé vers d'autres cel-
lules. Les protéines virales manquantes
sont apportées par un provirus auxiliaire,
dont on a éliminé la région # (psi) indis-
pensable à l'empaquetage de l'ARN viral
dans les particules virales : sans la région
#, aucun virus comportant l'ARN auxiliaire
ne peut se former. Ainsi les particules
virales qui quittent la cellule transfectée
contiennent l'ARN thérapeutique, mais pas
de gènes viraux. Ces particules virales
pénètrent dans d'autres cellules (c) et intro-
duisent le gène thirapeutique dans I'ADN
ceSulaire, mais ellesne se multiplient pas.
 L'étude de la bêta thalassémie a en
outre révélé combien la régulation de
l'expression d'un gène thérapeutique était
difficile. Pour de nombreuses maladies,
comme l'immunodéficience combinée
sévère, la production-même limitée-
d'une protéine absente améliore l'état du
patient. Au contraire, dans le cas de la
thalassémie, tout excès relatif de chaîne
alpha de la globine ou de chaîne bêta de
la globine endommage les cellules ; l'acti-
vité du gène thérapeutique doit reproduire
exactement celle du gène normal. On
connaît encore mal les mécanismes de
régulation des gènes, tant pour le gène de
la chaîne bêta de la globine que pour la
plupart des autres gènes, mais les études
de la régulation génétique progressent
régulièrement ; elles permettent d'amélio-
rer les vecteurs de thérapie génique.
Ne parvenant pas à faire exprimer
davantageles gènes dans les cellules de la
moelle osseuse,les chercheurs qui étudient
l'immunodéficience combinée sévère à
l'Institut américain de la santéont limité la
thérapie génique à une classe particulière
de globules blancs essentiels pour l'immu-
nité, décimés par l'absence d'adénosine
désaminase : les lymphocytes T circulants.
Les lymphocytes modifiés par les
rétrovirus seront injectés aux enfants que
l'on traite aujourd'hui par des mélanges
d'adénosine désaminase et de polyéthy-
lène glycol (qui stabilise l'enzyme dans
l'organisme). On considérera que ce trai-
tement est plus efficace si les défenses
immunitaires sont renforcées davantage
que par les injections d'enzyme seule.
Malheureusement le traitement. ne sera
pas définitif, car les lymphocytes T ont
une durée de vie plus courte (quelques
mois) que les cellules souches.
Cette thérapie génique, encore très
expérimentale, se justifie-t-elle quand
d'autres méthodes existent ? Par des
greffes de moelle osseuse, par exemple,
on pourrait traiter l'immunodéficience
combinée sévère. En général, les méde-
cins considèrent que l'expérience peut
être tentée si les risques sont faibles, si la
thérapie génique promet d'être beaucoup
plus efficace que les autres méthodes, et
si les patients ne peuvent être traités
autrement. Dans le cas de l'immunodéfi-
cience sévère, par exemple, la moelle
osseuse d'un donneur compatible n'est
pas disponible pour tous les patients.
Au contraire, les cellules de peau pour-
raient servir à combler des déficits
d'organes divers dans l'organisme : malement pas cette protéine (ce résultat
diverses protéines sont normalement fabri-
quées par certaines cellules, puis transpor-
tées par le sangjusqu'aux cellules qui les
utilisent. En principe, les cellules de peau
pourraient ainsi être utilisées pour traiter
de nombreuses maladies, telle l'hémophi-
lie, causée par l'absence de facteurs de
coagulation normalement synthétisés dans
le foie, et diverses maladies dues à une
production insuffisante d'hormones,
notamment d'hormone de croissance.
Certaines maladies dues à une pro-
duction insuffisante de protéines peu spé-
cifiques pourraient également être soi-
gnées de cette façon si les tissus les plus
endommagés pouvaient capter les pro-
téines de remplacement dans le sang.
Les fibroblastes du derme (la couche
inférieure de la peau) sont les cellules les
plus appropriées à la thérapie génique :
ils sont facilement accessibles, résistants,
et ils se multiplient en culture. Après leur
manipulation, les fibroblastes seraient
réinjectés dans le derme où ils libére-
raient dans le sang diverses substances,et
on pourrait facilement les retirer de
l'organisme, si nécessaire.
Avec mes collègues, nous avons
beaucoup étudié les fibroblastes dans le
traitement de l'hémophilie résultant de
l'absence du facteur IX de coagulation
(normalement produit par le foie) ; nos
résultats sont très encourageants.
Avec George Brownlee et Don
Anson, de l'Université d'Oxford, Dusty
Miller a d'abord montré que les fibro-
blastes pouvaient synthétiser et sécréter le
facteur IX, bien qu'ils ne fabriquent nor-
ne prouve cependant pas que l'on obtien-
dra le même succès avec toutes les pro-
téines). Puis Daniel Saint Louis, Jonathan
Axelrod et Raphael Scharfmann ont uti-
lisé des rétrovirus pour introduire le gène
du facteur IX humain dans des fibro-
blastes, qu'ils ont placés dans le derme de
souris : les implants se vascularisaient et
libéraient du facteur IX dans le sang.
Si cesétudes ont montré que l'expres-
sion du gène du facteur IX humain était
possible chez l'animal, elles nous ont
aussi donné une éclatante leçon : 15 jours
après la greffe, le facteur humain disparut
du sang des souris. À l'analyse, nous
avons découvert que leur système immu-
nitaire avait rejeté la protéine humaine.
Nous avons ainsi appris que la thérapie
génique sera surtout efficace avec les
patients qui synthétisent déjà la protéine
en faible quantité, de sorte que le système
immunitaire ne réagira pas contre le pro-
duit du gène thérapeutique introduit.
Nous avons également observé que,
contrairement aux cellules de moelle
osseuse,les fibroblastes produisaient suf-
fisamment de protéines pour compenser
les déficits : en extrapolant les résultats
d'expériences faites sur des souris, nous
avons calculé qu'un implant de la taille
d'une pièce de deux francs synthétiserait
assez de protéine pour compenser une
production insuffisante de facteur IX
chez l'Homme. Avec Kenneth Brinkhous,
de l'Université de Chapel Hill, nous pré-
voyons de traiter l'hémophilie chez des

Une peau à tout faire

La modification génétique des lym-
phocytes ou des cellules de moelle
osseusevise à corriger des défauts de ces
mêmes cellules ou de leurs cellules filles.
4. DES CELLULESDE FOIE prélevéesà des lapins, qu'une déficience génétique empêche de
produire les récepteursdes lipoprotéines de faible densité (LDL), ont commencé à fabriquer
le récepteur manquant (régions claires) après avoir reçu le gène du récepteur. Ce résultat
permet d'espérer que l'on pourra traiter un jour, par thérapie génique, les personnes
atteintes d'une maladie génétique analogue et qui se manifestepar un excèsde cholestérol.
chiens et, si ces expériences réussissent,
nous essaierons de traiter des patients
humains.
Greffés dans le cerveau, des fibro-
blastes modifiés génétiquement pour-
raient également corriger des déficits de
neurones et traiter des maladies
aujourd'hui incurables. En effet, le cer- pourraient sécréter des protéines qui dif-
veau est particulièrement difficile à trai- fuseraient dans les cellules nerveuses.
ter, car de nombreuses substances circu- Les résultats préliminaires sont encou-
lant dans le sang sont bloquées par les rageants. Fred Gage, de l'Université de
barrières qui l'entourent ; en outre, on ne San Diego, a montré que des implants qui
peut en retirer sans risques des neurones. sécrètent le facteur de croissance du nerf
En théorie, des fibroblastes modifiés (NGF) stimulent la croissance des neu-
rones, dans le cerveau de rats. Les neu-
rones régénérés sont ceux qui sont
endommagés par la maladie d'Alzheimer,
bien que le rôle du facteur de croissance
du nerf ne soit pas démontré dans cette
maladie. Parallèlement on étudie sur des
animaux atteints d'une maladie de
Parkinson expérimentale, des implants qui
synthétisent la L-dopa, un précurseur de la
dopamine, le neuromédiateur incriminé
dans cette maladie ; personne ne sait exac-
tement quelle est l'origine de la maladie
de Parkinson, mais les déficits en dopa-
mine y participent certainement. On étu-
die aujourd'hui la stabilité des fibroblastes
modifiés, dans la peau ou dans le cerveau.
Nouvelles recrues de la thérapie
génique, les cellules de foie pourraient se
révéler très utiles dans le traitement de
nombreuses maladies génétiques dues à
des anomalies de ces cellules. Récemment
deux équipes ont réussi à introduire le gène
du récepteur des lipoprotéines de faible
densité (LDL) dans des cellules de foie, et à
leur faire synthétiser des récepteurs biolo-
giquement actifs. Les cellules provenaient
de lapins Watanabe, qui sont atteints d'une
déficience génétique en récepteursdes LDL,
comme le sont les personnes souffrant
d'hypercholestérolémie familiale, une
maladie qui prédisposeaux infarctus.

Les gènes en aérosols ?

On a également injecté à des lapins

Watanabe des complexes composés du
gène du récepteur des LDL et d'une pro-
téine qui conduit ce gène vers les cellules
du foie : une telle injection permet d'évi-
ter le prélèvement chirurgical de cellules
du foie. La protéine codée par le gène
injecté a été détectée dans l'organisme
des lapins traités-tout comme dans des
cultures de cellules-mais sa synthèse
n'a été que temporaire. La stabilité du
gène sera sans doute améliorée, les
recherches sur les cellules du foie ayant
tout juste commencé.
D'autres types de cellules pourraient
également véhiculer des gènes thérapeu-
tiques dans l'organisme. Ainsi les rétro-
5. DES CELLULESDE LA PEAUportant un gène thérapeutique sécrètentle produit de ce
virus pourraient transporter des gènes
gène dans le sang quand elles sont placées dans une matrice de collagène et implantées
dans le derme(en haut). Lors d'une expérienceavec des souris, des fibroblastes contenant jusque dans les cellules endothéliales, qui
le gène du facteur IX humain (une protéine sécrétée par le foie et qui assure la coagulation) tapissent les artères : ces cellules sont en
ont formé une masse bien vascularisée et ont synthétisé le facteur IX humain pendant deux contact plus direct que les fibroblastes
semaines environ (courbe du bas). Depuis cette première expérience, on a obtenu des avec le sang et elles pourraient y libérer
implants de fibroblastesqui ont libéré desprotéines étrangèrespendant bien plus longtemps. plus rapidement leurs produits.

6. LES PREMIÈRES MALADIES qui seront traitées
ciences d'un seul gène, déjà cloné. Pour pratiquer un tel traitement, on devra prélever des
cellules au patient, y introduire le gènethérapeutique, puisles réintroduire dans l'organisme.
De même, on cherche à injecter un
gène sain codant la dystrophine (un com-
posant structurel des muscles) directe-
ment dans les muscles de souris atteintes
d'une maladie analogue à la dystrophie
musculaire de Duchenne. On a des rai-
sons d'espérer que les gènes s'exprime-
ront : d'autres gènes, injectés dans les
muscles d'animaux vivants, ont libéré
des protéines pendant plusieurs mois,
bien que l'ADN introduit n'ait pas été
intégré aux chromosomes. Peut-être trai-
tera-t-on aussi la mucoviscidose, une
maladie pulmonaire héréditaire, en intro-
duisant les gènes sains dans des rétrovi-
rus directement inhalés sous forme
d'aérosols ?
Enfin la thérapie génique pourrait
conférer à des cellules des propriétés
qu'elles n'ont pas naturellement et qui leur
permettraient de mieux résister à diverses
par thérapie génique sont dues aux défi-
maladies. Ainsi Steven Rosenberg et ses
collègues de l'Institut américain du cancer
ont montré que des lymphocytes prélevés
dans une tumeur et cultivés avec de
l'interleukine 2 (un activateur des lympho-
cytes T) combattent certains cancers
quand ils sont réintroduits dans l'orga-
nisme ; ils espèrent augmenter encore les
capacités naturelles des « cellules infiltrant
les tumeurs» (TIL), en y introduisant le
gène codant le facteur nécrosant de
tumeur, une molécule stimulant vigoureu-
sement le système immunitaire. Ce facteur
a une activité antitumorale marquée, mais,
normalement, il n'est pas produit par les
lymphocytes T. Les études cliniques
devraient commencer prochainement.
Un autre groupe essaie de faire pro-
duire par divers types de cellules le CD4,
une molécule présente à la surface des
lymphocytes T infectés par le virus du
SIDA. Le virus infecte ces cellules parce
qu'une protéine de son enveloppe externe
se lie au récepteur CD4. La sécrétion
dans le sang d'une grande quantité de
molécules libres de CD4 pourrait leurrer
le virus qui s'y fixerait et épargnerait les
lymphocytes qui portent ce récepteur
CD4. On le voit : les projets d'applica-
tion de la thérapie génique sont nom-
breux et les stratégies variées. Certains
chercheurs ne veulent-ils pas, même,
faire sécréter aux cellules endothéliales
des facteurs qui éviteraient la coagulation
sanguine dans les artères des patients
opérés du coeur?
L'idée d'introduire des gènes afin de
corriger des maladies héréditaires ou
d'autres troubles est radicalement nou-
velle. Est-ce la raison pour laquelle la thé-
rapie génique a progressé plus lentement
qu'on ne l'escomptait ? Les organismes
actuels sont le résultat de millions
d'années d'Évolution, et l'on ne doit pas
s'attendre à introduire facilement dans des
cellules des gènes nouveaux qui s'expri-
meraient comme les gènes d'origine.
Cependant la thérapie génique ne
s'imposera que si les généticiens trouvent
des moyens pour que les gènes s'expri-
ment correctement et durablement dans
l'organisme. Ils sont sur la bonne voie :
on a montré qu'il était important d'intro-
duire des séquences activatrices des
gènes dans les rétrovirus ; on recherche
des moyens de réintroduire dans l'orga-
nisme les cellules modifiées (des cellules
de foie par exemple), de prolonger la sur-
vie des cellules implantées, et d'isoler les
cellules souches humaines, qui remplace-
raient les cellules de moelle étudiées
aujourd'hui.
Simultanément on devra confirmer
l'innocuité des vecteurs rétroviraux par
des études sur l'animal, et améliorer
encore la sécurité de la thérapie génique :
bien que les rétrovirus ne se répliquent
pas, ils pourraient être cancérogènes.
Enfin on doit continuer à chercher
d'autres vecteurs que les rétrovirus et
améliorer la spécificité de l'insertion des
gènes thérapeutiques.
La médecine aura considérablement
progressé quand on saura traiter définit-
vement les maladies génétiques, et les
efforts actuels sont indubitablement
nécessaires, mais ces traitements ne
seront pas une panacée : beaucoup de
maladies ne sont pas d'origine génétique,
mais environnementales, dues à des
infections microbiennes qui se propagent
en raison d'une hygiène insuffisante, de
la pollution de l'eau, de la malnutrition
ou d'autres facteurs qui échappent à la
génétique.
UN ESPOIR POUR
MYOPATHES
LES
introduire dans les cellules anormales
des gènes normaux qui suppléeraient les
gènes déficients et coderaient les pro-
téines indispensables,tel est le but de la
thérapie génique ; celle-ci fait naître
quelques espoirs pour les malades atteints
de pathologies devant lesquelles les méde-
cins sont démunis. Une équipe anglo-amé-
ricaine a obtenu des résultats prometteurs :
Gyula Acsadi et ses collègues de
l'Université du Wisconsin, en collaboration
avec George Dickson et ses collègues de
Londres, ont introduit une partie du très
long gène qui code la dystrophine
humaine dans des muscles de souris dites
mdx, atteintes d'une mutation qui en fait
un bon modèle animal pour la dystrophie
de Duchenne ; ils ont constaté que les cel-
lules musculaires, initialement incapables
de synthétiser la dystrophine, en assuraient
la synthèse aprèsce transfert de gène.
La dystrophie musculaire de
Duchenne touche uniquement les garçons
(environ un individu sur 3 500) et entraîne
une destruction progressive, mais fatale,
des muscles squelettiques et cardiaque.
On sait que la dystrophine est une pro-
téine qui ressemble beaucoup à la spec-
trine et à l'alpha-actinine, qui sont des
protéines du cytosquelette, l'armature des
cellules ; elle interagit avec certaines glyco-
protéines membranaires mais on ignore
encore quel est son rôle précis : peut-être
stabilise-t-elle les membranes cellulaires,
ou assure-t-elle l'ancrage des glycopro-
téines sur les membranes. L'absence de
dystrophine dans un muscle aboutit à une
nécrose importante de ce tissu (la dystro-
phine est normalement présente dans
tous les muscleset dans les neurones mais
un déficit en dystrophine ne se traduit pas
nécessairement par un retard mental).
L'équipe anglo-américaine a injecté
dans un muscle de souris mutantes mdx,
I'ADN complémen-taire du gène normal
de la dystrophine. Le gène de la dystro-
phine est le plus long gène connu (deux
millions de bases), et il aurait été difficile
de l'injecter directement. En revanche,
!'ADN complémentaire de ce gène est
dépourvu d'introns (des séquences non
codantes) et il contient seulement les
séquences codantes, soit 11 000 bases.
Après son injection dans un muscle
fémoral, un pour cent des fibres proches
du point d'injection ont synthétisé le
produit normal du gène, la dystrophine.
Cette technique, qui permet la syn-
thèse de dystrophine dans les fibres mus-
culaires, serait d'un intérêt thérapeutique
vital pour les personnes souffrant de la
maladie de Duchenne. Cependant, elle ne
sera applicable que si la proportion de
fibres qui synthétisent ! a dystrophine aug-
mente, la concentration devant être 10 à
50 fois supérieure à celle obtenue pour
que les muscles recouvrent un fonction-
nement normal. En outre, seules les cel-
lules proches du point où sont injectés les
ADN complémentaires synthétisent la dys-
trophine, et il conviendra de déterminer le
nombre des piqûres qui uniformiseraient
la concentration en dystrophine. Les cher-
cheurs ont également réussi à «renormali-
ser)) des cellulescardiaques de souris mdx.
Un autre traitement est à l'étude
chez la souris, qui consiste à compenser
la nécrose des cellules musculaires par
l'injection de myoblastes de souris nor-
males : l'injection de 100 000 cellules
normalise la synthèse de dystrophine
dans 30 à 40 pour cent des fibres.
Cependant il s'agit encore d'une répara-
tion localisée à proximité de la zone
d'injection ; en outre, cette intervention
nécessite de cultiver des myoblastes nor-
maux en grande quantité et présente les
La dystrophine (en vert clair) est localisée dans la membrane des cellules muscu-
laires normales (à gauche) ; les cellules musculaires des patients atteints
maladie de Duchenne ne synthétisent pas de dystrophine (à droite). Ces photogra-
phies (grossissement 200) ont été prises par F. Tomé (INSERM U1531/CNRS A614).
risques inhérents à toute greffe, notam-
ment les risques d'infections liés à
l'emploi de substances qui, pour limiter
les phénomènes de rejet, diminuent l'effi-
cacité du système immunitaire.
Existe-t-il des vecteurs que le sang
répandrait dans tout l'organisme, mais
qui, contrôlés par des promoteurs spéci-
fiques, s'exprimeraient uniquement dans
les muscles et dans le cerveau ? Michel
Perricaudet, à l'Institut Gustave Roussy,
Pascale Briand, à l'Institut Cochin de
génétique moléculaire, et leurs collègues
étudient surtout l'adénovirus, un vecteur
potentiel, tandis que Hélène
Gilgenkrantz et ses collègues de l'équipe
de Jean-Claude Kaplan, à l'Unité INSERM
129 dirigée par Axe Kahn, s'intéressent
au promoteur cérébral et au promoteur
musculaire du gène de la dystrophine : le
premier contrôle l'expression dans les
neurones, le second dans les muscles.
Si l'ADN complémentaire de la dys-
trophine était précédé de son promo-
teur spécifique, la synthèse de la protéine
n'aurait lieu que dans les cellules cibles
(les cellules musculaires ou les neurones)
et on éviterait ainsi une expression géné-
rale de la protéine. Parallèlement à leur
étude des promoteurs de la dystrophine,
ces chercheurs vont suivre les cons6-
quences, sur les souris transgéniques
mdx traitées par thérapie génique, d'une
production de dystrophine dans tout
l'organisme.
Enfin, Jamel Chelly, également de
l'Unité INSERM 129,a mis au point une
de la
méthode qui lui permet d'étudier les
anomalies du gène de la dystrophine en
analysant, chez les patients, le produit de
la transcription du gène de la dystro-
phine, sanspratiquer une biopsie muscu-
laine. Le gène de la dystrophine s'expri-
mant uniquement dans les muscles et
dans le cerveau, on pensait que le trans-
crit du gène (le produit de la transcrip-
tion du gène, c'est-à-dire l'ARN messager)
et le produit du gène (la protéine elle-
même) ne pouvaient être détectés que
dans ces tissus. Or J. Chelly a découvert
que tous les types cellulaires, notamment
certaines cellules sanguines (les lympho-
blastes) ou les cellules du tissu conjonctif
(le tissu qui entoure tous les organes),
contiennent une très faible proportion
de ces transcrits. En multipliant in vitro
ces «transcrits illégitimes», par la
méthode d'amplification des gènes (PCR),
J. Chelly réussit à les détecter en dépit
de leur très faible abondance initiale (une
molécule pour 500 à I 000 cellules).
Cette méthode présente deux inté-
rêts : le prélèvement de ces cellules est
plus aisé et moins traumatique qu'une
biopsie musculaire ; l'analyse permet de
savoir si le transcrit recherché est pré-
sent ou absent, normal ou délété. Or les
mutations que portent les transcrits illégi-
times reflètent les mutations présentes
sur le gène incriminé.

LES MINI-COCHONS l'effet du venin de cobra, qui inhibe le

complément et qui est un puissant anti-
coagulant. Hélas ses propriétés toxiques
DONNEURS D'ORGANES
en interdiraient l'usageprolongé.
On pourrait également éliminer-du
moins temporairement-les anticorps
naturels du receveur en épurant son
Les mini-cochons transgéniques pathogène pour le receveur, et les sang, en le «lavant» par exemple sur des
seront-ils un jour, pour l'homme, une femelles ont environ trois portées de 12 colonnes qui retiendraient les anticorps.
source d'organes destinés à la transplan-petits par an. Enfin, la physiologie et la Cette méthode favoriserait l'implantation
tation ? Peut-on «humaniser» ces ani-taille des organes d'homme et de porc de la greffe et laisserait à l'organisme le
maux, en introduisant dans leur génome sont voisines. temps de s'accoutumer à la présence du
des gènes humains, de manière à éviter Lors des xénogreffes, les anticorps greffon. Enfin, en agissant sur les cellules
toute réaction de rejet de la greffe ? du receveur rencontrent des antigènes endothéliales elles-mêmes, D. Houssin
Les xénogreffes, où les organes trans-étrangers, d'autant plus différents des tente de masquer les antigènes du gref-
plantés proviennent de donneurs ani-siens que l'espèce donneuse est phylogé- fon au moyen de molécules qui se fixent
maux, ont été essayéesau début du siècle, nétiquement plus éloignée ; une réaction aux antigènes étrangers et empêchent
sans succès, puis des tentatives ont mar-immunitaire spécifique aboutit à l'activa- les anticorps du receveur de s'y lier. Ce
qué les années 1960 : un patient survécuttion des cellules endothéliales du greffon, stratagème éviterait le rejet hyperaigu.
neuf mois avec un rein de chimpanzé, un cellules qui recouvrent les parois de tous Une autre façon de leurrer le rece-
autre, deux mois avec un greffon de les vaisseaux. Les cellules endothéliales veur consiste à humaniser le donneur en
babouin. En 1984, un nouveau-né survé-au repos sécrètent diverses molécules introduisant dans son génome des gènes
cut 15 jours avec un coeur de babouin. En anti-coagulantes, de sorte que, lorsque le humains. D. White a obtenu une quaran-
1992, un foie de babouin fut greffé sur un, fonctionnement est normal, le sang ne taine de mini-cochons dont le génome
homme qui survécut deux mois coagule pas. Au contraire, lorsque les contient un gène codant une protéine
Ces greffes sont rejetées : I'homme a cellules endothéliales sont activées, d'inhibition du complément humain : les
des mécanismes de défense qui le ren-I'équilibre est rompu et diverses molé- cellules endothéliales ne seraient pas
dent intolérant aux éléments étrangers, cules tendent à coaguler le sang qui cir- activées, et la première étape de rejet
même à des greffes humaines. Ces rejets cule dans le greffon. En outre des molé- des xénogreffes serait évitée. Quant à
de xénogreffes sont si intenses (en cules adhésives,qui servent à l'interaction David Sachs, à Charlestown, il a modifié
quelques heures, voire en quelques et à la communication entre les cellules, génétiquement des porcs auxquels il a
minutes) qu'on les qualifie d'hyperaigus. sont aussi libérées. Cette cascade d'évé- transféré des gènes codant les molécules
Au cours des transplantations entre nements aboutit à l'asphyxie de l'organe, du «soi humain» ; les tissus de ces ani-
espèces voisines, les phénomènes de qui, privé de sang, meurt. maux ne devraient pas déclencher le
rejet sont moins aigus et l'on pourrait On éviterait ce type de réaction, soit mécanisme de rejet des allogreffes, parce
envisager de greffer des organes de pri-en agissant directement sur le receveur que l'hôte ne les reconnaîtrait pas
mates, les plus proches de l'homme. pour qu'il ne reconnaisse pas le donneur, comme étrangers. Reste à déterminer
Toutefois les espèces anthropomorphes, soit en traitant ou en modifiant généti- combien de gènes seront nécessaires
tels les gorilles ou les chimpanzés sont quement le donneur, afin de lui conférer pour qu'un organisme adopte un organe
en voie de disparition et pour les autres, des caractères du receveur. prélevé sur un mini-cochon.
tels les babouins, leurs organes sont trop Dans le premier cas, on empêcherait Cette porte ouverte sur les xéno-
petits. En outre, des espèces proches de la coagulation du sang dans le greffon en greffes ne doit pas faire oublier, comme
l'homme pourraient lui transmettre des court-circuitant au moins l'une des réac- le souligne Bernard Charpentier, de
virus pathogènes, tions responsables de l'activation des cel- l'hôpital de Bicêtre, que les allogreffes de
Devant ces difficultés, David White lules endothéliales. Ainsi, Didier Houssin rein réussissent aujourd'hui 92 fois sur
et ses collègues de Cambridge, se sont et ses collèguesde l'Hôpital Cochin s'inté- 100, et qu'il faudra du temps pour obte-
intéressés aux minicochons. Cette ressent au complément, un ensemble de nir les mêmes résultats avec les xéno-
espèce familière n'est pas trop proche de protéines qui luttent contre les infections, greffes.
l'homme de sorte que l'on devrait éviter et qui s'associentaux anticorps pour acti-
le risque de contamination par un virus ver les cellules endothéliales. Ils étudient Marie-ThérèseLANDOUSY
 Le contrôle
de l'expression des
Claude
Les gènes et leurs messages sont les cibles de nouveaux
inhibiteurs sélectifs, les oligonucléotides. Ceux-ci
permettraient de lutter contre les dérèglements
génétiques, les virus pathogènes et les parasites.
LAPLUPART des médica- fixent plus sur les protéines, produits de
ments interagissent avec la traduction de l'information génétique,
des protéines et inhibent mais qui agissent directement sur l'infor-
leur fonction. C'est le cas mation génétique. L'examen des diffé-
de de nombreux composés rentes étapes de l'expression des gènes
qui se fixent sur les récepteurs des cel- révèle les différentes cibles possibles et
lules nerveuses ; ces récepteurs sont des la sélectivité des effets escomptés.
protéines, présentes à la surface des neu-
rones, qui transmettent vers l'intérieur de Du gène à la protéine
ces cellules l'information résultant de
leur liaison avec un neuromédiateur. Pour accomplir ses fonctions au sein
C'est également avec des protéines d'un organisme vivant, la cellule utilise
qu'interagissent certaines drogues antitu- l'information codée par l'enchaînement
morales qui décomposent les cellules en des nucléotides de l'ADN. Chaque nucléo-
détruisant les filaments qui constituent le tide est composé d'un groupe phosphate,
squelette de ces cellules. Des enzymes d'un sucre (le désoxyribose), lui-même
participant au métabolisme du cholestérol lié à un cycle aromatique appelé base
sont également des protéines qu'atta- nucléique. II existe quatre nucléotides
quent des médicaments limitant la que l'on représente par la première lettre
concentration en cholestérol dans le sang. du nom de la base : (A) adénine, (T) thy-
Dans certains cas, les mécanismes mine, (G) guanine, (C) cytosine. Chaque
d'action sont plus complexes. Des médi- nucléotide est attaché au suivant par une
caments antitumoraux qui se fixent sur la liaison entre les groupes phosphate et les
double hélice d'ADN, support de l'infor- sucres. L'ADN est constitué de deux
mation génétique, agissent par l'intermé- chaînes de ce type qui s'enroulent l'une
diaire d'enzymes, les topoisomérases, qui autour de l'autre pour former une double
jouent un rôle important dans le métabo- hélice. Les deux hélices sont liées l'une à
lisme des acides nucléiques : ainsi un l'autre par des liaisons faibles entre les
complexe ternaire topoisomérase-ADN- bases, les liaisons hydrogène, qui assu-
drogue antitumorale paraît être l'entité rent la cohésion de l'ensemble. L'adénine
active qui conduit à la destruction de s'apparie à la thymine et la guanine se lie
l'ADN et à la mort de la cellule. On sait à la cytosine. Les deux chaînes sont com-
aussi que les stéroïdes modulent l'expres- plémentaires. La formation de ces
sion de certains gènes en se fixant sur des « paires »A-T et G-C assure une reproduc-
récepteurs intracellulaires qui activent la tion fidèle de l'enchaînement des nucléo-
transcription. Dans ce cas également, une tides lors de la division d'une cellule :
protéine sert d'intermédiaire entre le chaque chaîne de la double hélice est
médicament et le gène. recopiée de sorte que les deux doubles
Depuis plusieurs années, les cher- hélices ainsi formées sont identiques (aux
cheurs élaborent des substancesqui ne se erreurs de la « recopie » près).
gènes
Hélène, Nguyen T. Thuong
L'ADN de chaque cellule humaine
renferme environ quatre milliards de
paires de bases. Ce long filament (envi-
ron deux mètres), très fin (son diamètre
est de 20 milliardièmes de mètre), est
divisé chez l'Homme en 46 fragments de
longueurs inégales, chaque fragment
étant replié sur lui-même au sein d'un
chromosome, un peu à la manière d'un fil
sur une bobine ; dans la cellule,
l'ensemble des 46 chromosomes est
contenu dans le noyau dont le diamètre
est de l'ordre de dix micromètres ; au
cours de la fécondation de l'ovule par le
spermatozoïde, chaque partenaire fournit
la moitié des chromosomes.
Dans la double hélice d'ADN, l'ordre
d'enchaînement des nucléotides définit
l'information génétique. Cette informa-
tion est segmentée en unités : les gènes.
Chaque gène est constitué de quelques
centaines,à quelques dizaines de milliers
de paires de bases, et renferme l'informa-
tion nécessaire à la synthèse d'une des
protéines dont la cellule a besoin pour
fonctionner. Cette synthèse se fait par
l'intermédiaire de l'ARN messager (une
chaîne d'acide ribonucléique complé-
mentaire de l'une des chaînes d'ADN d'un
gène, avec, à la place du désoxyribose, le
ribose et à la place de la thymine, l'ura-
cile). L'ARN messager transporte l'infor-
mation génétique du noyau vers le cyto-
plasme, où se trouve le ribosome qui
fabrique la protéine.
Plusieurs laboratoires découvrirent, à
la fin des années 1970, que les gènes
étaient eux-mêmes segmentés : pour
reconstituer un message exploitable, la
cellule doit remettre bout à bout des frag-
ments d'information qui ne sont pas
contigus dans l'ADN. Après la transcrip-
tion de l'une des chaînes de l'ADN en
ARN, ce dernier est découpé, et les frag-
ments codant la protéine (les exons) sont
assemblés,tandis que ceux ne renfermant
pas cette information (les introns) sont
éliminés. Ce phénomène de maturation se
déroule dans le noyau de la cellule. Après
 la maturation, l'ARN pré-messager est comme des enzymes, d'où le nom de seule au sein de l'information génétique
converti en ARNmessager, qui est trans- « ribozyme » qui leur a été donné. La syn- de la cellule. Malheureusement la
porté hors du noyau pour atteindre le thèse et l'étude de ces ribozymes comme séquence des quatre milliards de nucléo-
cytoplasme où se déroule la traduction du agents de blocage de la traduction des tides de l'ADN humain n'est pas connue.
message. Avant sa sortie du noyau, I'ARN ARNmessagersest en cours dans de nom- La détermination de ce «texte» est
messager subit encore une série de modi- breux laboratoires. II est encore trop tôt une entreprise de longue haleine : il fau-
fications qui doivent permettre de l'iden- pour établir une comparaison précise des dra 6 000 livres de 300 pages chacun
tifier : un « chapeau »est ajouté à l'une efficacités relatives des ribozymes et des pour écrire l'enchaînement des quatre
des extrémités, tandis qu'à l'autre extré- oligodésoxyribonucléotides antisens dans milliards de lettres de l'ADN, avec seule-
mité est attachée une queue constituée le contrôle de l'expression des gènes. ment les quatre symboles A, T, G, C.
d'une succession d'adénines. Pourvu de Pour l'instant un millième environ du
ces attributs, I'ARN messager sera Les oligonucléotides texte est connu (quelques millions d'uni-
reconnu en tant que tel par la machinerie antisens tés), et la seule information que nous pos-
de traduction du ribosome. sédions sur l'ensemble de ce texte est la
On voit qu'entre le gène et la pro- La première question est évidemment fréquence des plus proches voisins.
téine, il existe une série d'étapes au cours de savoir quelle longueur minimale et Cette connaissance est cependant suf-
desquelles il est possible d'agir pour quelle séquence doit avoir un oligonu- fisante pour estimer qu'un oligonucléo-
empêcher l'information génétique de cléotide pour s'associer à une cible et une tide comprenant entre 10 et 15 unités
s'exprimer : la transcription de l'ADN en
ARNpré-messager, l'épissage de celui-ci,
les modifications qu'il subit avant d'être
un « réel » ARNmessager, la migration de
cet ARNmessager du noyau vers le cyto-
plasme, la traduction, enfin, qui donne
naissance à la protéine. Cependant il
n'est pas possible d'intervenir de façon
sélective sur l'expression d'un seul gène,
à chacune de ces étapes. Par exemple,
l'épissage est réalisé par une machinerie
encore imparfaitement connue, mais qui
agit sur tous-ou presque tous-les ARN
pré-messagers. Son inactivation ne
conduira donc pas à un effet spécifique.
Il apparaîtque seul l'enchaînement des
nucléotides de l'ARN messager, du gène
lui-même ou des sites d'épissage de l'ARN
pré-messager (les jonctions entre les
introns et les exons) peut constituer une
cible spécifique d'un gène ; en intervenant
directement sur ces cibles, on pourrait
empêcher la synthèse d'une protéine et
d'une seule au sein de la cellule. Une telle
stratégie existe : elle consiste à fabriquer
un court segment d'acide nucléique (un
oligonucléotide) capable de se fixer par
complémentarité sur la séquenced'ADN ou
d'ARN choisie pour cible ; en face de A, T
(U), G ou C sur la cible se trouveront res-
pectivement T (U), A, C ou G sur l'oligo-
nucléotide. Pour des raisonsde commodité
de la synthèse chimique, la plupart des
études effectuées jusqu'à présent ont
considéré des oligodésoxyribonucléotides ;
des progrès récents permettent aujourd'hui
de synthétiser des oligoribonucléotides, où
le ribose remplace le désoxyribose.
Certains oligoribonucléotides présen-
tent un intérêt particulier : en se fixant
sur un ARN messager, ils induisent une
coupure de ce dernier. La découverte
d'une activité catalytique des ARN a été 1. DANS LE NOYAUDE LA CELLULE,l'ADN est transcrit en ARN, qui est ensuite traduit en
couronnée par l'attribution du prix Nobel protéines dans le cytoplasme. Afin de bloquer la production de protéines néfastes pour
de chimie à Thomas Cech et Sydney l'organisme, on insère un oligonucléotide formé de 10 à 15 bases, qui se fixe sur la
Altman en 1989. Ces ARN se comportent séquencecorrespondantedel'ARN messageret empêchesa traduction.
 sens) : les deux chaînes de la double
hélice d'ADN sont orientées en sens oppo-
sés. Un oligonucléotide complémentaire
d'un ARN messager est donc synthétisé
antiparallèlement à la cible choisie.
Les oligonucléotides antisens sont
devenus des outils importants dans la
panoplie des techniques que peuvent uti-
liser les biologistes pour comprendre le
rôle joué par un gène au sein d'une cel-
lule vivante. Ces outils ont le mérite de la
simplicité. Il existe en effet des appareils
automatiques de synthèse d'oligonucléo-
tides, la purification de ces derniers étant
facile quand leur taille est petite, ce qui
est le cas pour les oligonucléotides anti-
sens. Les problèmes majeurs résultent de
la sensibilité des oligonucléotides à des
enzymes, les nucléases,qui les découpent
en nucléotides, et à leur pénétration diffi-
cile à travers la membrane qui entoure les
cellules vivantes.
2. SITES POSSIBLES D'ACTION d'un oligonucléotide au cours des étapes successives de
Au cours des dernières années, une
l'expression d'un gène. L'oligonucléotide peut s'associer avec la double hélice d'ADN en
activité de recherche intense s'est atta-
formant une triple hélice (1) ; il bloque alors la transcription. Il peut aussi se fixer sur un
chée à résoudre ces deux problèmes. II
fragment d'ADN lors de l'ouverture crééepar l'ARN polymérase (2) ou provoquer un arrêt
prématuré de la transcription par fixation sur le pré-ARN lors de sa formation (3). L'oligo- est relativement facile de rendre les oli-
gonucléotides résistant aux nucléases en
nucléotidepeut bloquer l'épissage de l'ARN pré-messager en se liant à des jonctions intron-
(4) se fixer sur l'ARN messager (5) et empêcher son passage à travers la changeant la nature chimique
membrane, de
exon ou
du noyau versle cytoplasme.L'oligonucléotide peut aussi sefxer sur l'ARN en divers sites, l'enchaînement phosphate-sucre ou celle
où il empêchel'association de cet ARNavec les facteurs d'initiation (6), l'assemblage des du sucre lui-même, ou encore en modi-
sous-unitésdu ribosome sur le codon d'initiation (7) ou la traduction de l'ARN messager (8). fiant l'orientation (I'anomérie) de la base
nucléique par rapport au sucre.
Faire traverser la membrane cellu-
laire par les oligonucléotides est, en
nucléotidiques devrait trouver une cible Ces expériences n'ont pas retenu revanche, beaucoup plus difficile. Cette
unique dans une cellule vivante, ce qui a l'attention, à l'époque, et il fallut attendre membrane est constituée de phospholi-
été vérifié par une série d'expériences 1985 pour voir fleurir les études utilisant pides au sein desquels sont ancrées de
réalisées sur des cellules en culture. La les oligonucléotides pour bloquer sélecti- nombreuses protéines. Les phospholi-
première application fut décrite par une vement l'expression d'un gène unique au pides forment une double couche, avec
équipe américaine, celle de Paul sein des cellules vivantes. Ces oligonu- leurs têtes polaires dirigées vers l'exté-
Zamecnik, qui démontra en 1978 qu'il cléotides ont été nommés « antisens » pour rieur et vers l'intérieur de la cellule, la
était possible d'empêcher le développe- exprimer le fait que l'enchaînement des partie lipidique hydrophobe formant un
ment d'un virus du poulet (le virus du nucléotides qui les constitue est complé- double feuillet qui n'est pas en contact
sarcome de Rous) en incubant les cellules mentaire de l'ARN messager qui porte avec l'eau du milieu où baigne la cellule.
infectées avec un oligonucléotide de l'information et possède donc un «sens». Les oligonucléotides ont une charge
13 unités. Dans ce cas, la cible visée fut Rappelons également que l'enchaînement négative égale au nombre de leurs
évidemment l'information génétique du des nucléotides dans une chaîne d'acide groupes phosphate, qui sont chargés et
virus et non celle de la cellule infectée. nucléique possède une orientation (un très hydrophiles : les oligonucléotides tra-
versent donc difficilement la partie
hydrophobe de la membrane cellulaire.
Ils pénètrent dans les cellules par une
voie qui n'est pas une simple diffusion au
travers de la membrane. Ce passage
s'effectue vraisemblablement par endocy-
tose : une protéine fixe l'oligonucléotide
à l'extérieur de la cellule et favorise une
invagination de la membrane par laquelle
l'oligonucléotide pénètre dans la cellule.
Des expériences récentes indiquent
qu'un tel récepteur pourrait exister sur
3. UN OLIGONUCLÉOTIDE s'associeà une séquencecomplémentairede l'ARN; cet oligonu- toutes les cellules. On favorise le passage
cléotide comporte,à une extrémité, un agent intercalant (en orangé) qui stabilise l'associa- transmembranaire des oligonucléotides
tion oligonucléotide-ARNréactif
;(représenté
à l'autre extrémité, un groupement par des en les rendant plus hydrophobes, par
ciseaux) coupe l'ARN et le rend inopérant. exemple en neutralisant les charges néga-
 tives des phosphates ou en attachant des
substituants hydrophobes, tels le choles-
térol ou des groupements aromatiques.
Bernard Lebleu et ses collaborateurs, à
Montpellier, ont démontré que l'attache-
ment de l'oligonucléotide à un polymère,
la poly-L-lysine, favorise également la
pénétration dans les cellules. Il reste
cependant beaucoup de chemin à parcou-
rir si l'objectif visé est le développement
de substances ayant des applications thé-
rapeutiques ; nous y reviendrons.
Quand l'objectif est d'utiliser l'oiigo-
nucléotide comme outil génétique, il
existe des moyens plus « radicaux »de le
faire pénétrer dans une cellule, par
exemple par micro-injection ou par
« électroporation ». Dans le premier cas,
une solution de l'oligonucléotide est pla-
cée dans une seringue et de très petits
volumes de cette solution (quelques
dizaines de milliardièmes de litre) sont
injectés, soit dans le cytosol (la partie de
la cellule comprise entre le noyau et la
membrane externe), soit dans le noyau.
L'électroporation consiste à appliquer
une impulsion électrique brève (quelques
millionièmes de seconde) à des cellules
placées dans un milieu contenant l'oligo-
nucléotide : la décharge électrique per-
fore la membrane externe des cellules,
qui laisse alors pénétrer les substances
contenues dans le milieu de culture. Les
pores se referment après la fin de
l'impulsion, et la majeure partie des cel-
lules continuent à vivre malgré ce trau-
matisme ; l'oligonucléotide se retrouve
alors dans le cytosol de la cellule.
Ces deux méthodes ont été appli-
quées, mais seule la première a donné des
informations précieuses sur le fonction-
nement de certains gènes, notamment
avec de « grosses »cellules comme les
ovocytes, fécondés ou non, où les micro-
injections et les études biochimiques
ultérieures sont plus faciles à conduire.
L'utilisation des oligonucléotides
comme outils de génétique moléculaire
est complémentaire de celle des ARNanti-
sens. Dans cette dernière stratégie, un
fragment de l'ADN d'un gène est inséré
dans un ADN vecteur en sens opposé de
son sens normal et, lors de la transcrip-
tion de ce vecteur, l'un des brins de son
ADN est copié en ARN. L'insertion du
fragment de gène à l'envers conduit à la
fabrication d'un ARNqui est complémen-
taire de l'ARN messager fabriqué à partir
du gène lui-même. Cet ARNantisens peut
donc se fixer sur le message et en empê-
cher la traduction.
Les deux stratégies « antisens »(oligo-
nucléotide de synthèse et ARN) sont fon-
dées sur la même idée d'une association
très sélective de l'antisens avec sa
séquence complémentaire sur l'ARN mes-
sager. Dans le premier cas, l'antisens est
ajouté au milieu de culture des cellules
(ou micro-injecté) ; dans le second cas,
c'est la cellule elle-même qui produit
l'ARN antisens à partir d'une construction
génétique qu'il faut introduire au préa-
lable dans la cellule. Le choix de l'une ou
l'autre stratégie dépend beaucoup de la
cible visée, du type de cellules utilisées...
et des compétences du laboratoire où se
déroulent les études. L'utilisation de
constructions d'ADN plasmidique permet
de développer la seconde stratégie anti-
sens : les cellules produisent elles-mêmes
l'ARN antisens à partir de l'ADN plasmi-
dique. Certaines thérapies géniques pour-
raient appliquer cette stratégie.
Les cibles des oligo-
nucléotides
De nombreux exemples d'utilisation
d'oligonucléotides naturels ou modifiés
dans les systèmes biologiques ont été
publiés au cours des dernières années. Les
cibles visées sont soit des gènes normaux
de la cellule dont on veut comprendre le
rôle, soit des gènes anormalement expri-
més, par exemple les oncogènes respon-
sables de la transformation des cellules
normales en cellules tumorales.
Les virus constituent une autre cible
de choix puisque l'information génétique
propre au virus est différente de celle de la
cellule infectée et que la stratégie des anti-
senspermet de toucher l'une sans affecter
4 LE VIRUSDE LA GRIPPEa son information génétique constituée d'un ensemble de huit
ARNdifférents, contenus à l'intérieur de la particule virade, mais les extrémités de ces ARN
(en rouge) sont identiques sur une douzaine de nucléotides. Ces extrémités peuvent être
attaquées par le même oligonucléotide.
l'autre. Parmi les virus humains, celui de
l'herpès, celui de la grippe et, bien sûr, le
virus VIH responsable du SIDAont été les
cibles d'oligonucléotides antisens. Dans le
cas du virus de l'herpès, l'information
génétique est portée par un ADNen double
hélice d'environ 150 000 paires de bases.
L'équipe de Paul Ts'o et de Paul
Miller, à Baltimore, a synthétisé des oli-
gonucléotides modifiés (des oligométhyl-
phosphonates non chargés) qui se fixent
sur la jonction intron-exon de l'ARN pré-
messager correspondant à l'un des gènes
exprimés immédiatement après l'infec-
tion des cellules. En empêchant la matu-
ration de l'ARN pré-messager, l'oligonu-
cléotide empêche la production de l'ARN
messager et, par voie de conséquence, la
fabrication de l'une des protéines dont le
virus a absolument besoin pour pour-
suivre son cycle infectieux.
Le virus de la grippe présente une
particularité : son information génétique
est constituée d'un ensemble de huit ARN
différents, tous contenus à l'intérieur de
la particule virale ; cependant l'extrémité
de ces ARN est identique sur douze
nucléotides. En utilisant des oligonucléo-
tides portant un substituant aromatique à
leur extrémité et dirigés contre la région
commune aux huit ARN, nous avons pu
empêcher le développement du virus
dans des cellules en culture. Cette étude,
réalisée en collaboration avec A. Zérial,
de Rhône-Poulenc Santé, a démontré la
sélectivité des oligonucléotides.
Il existe trois types de virus de la
grippe, désignés par A, B et C. Chaque
5. EN CULTURE,des cellules vivantes sont coloréespar le cristal
violet. En présencedu virus de la grippe de typeA ou de type B, les
cellules meurent et ne fixent plus le colorant. Quand on ajoute l'oli-
gonucléotide adapté à la séquence cible des ARN d'un virus de type
A à la solution du virus, le virus est inhibé et les cellules survivent,
comme l'indique la coloration mauve. En revanche, sur la
séquence du virus de type B, I'oligonucléotide ne peutformer
qu'une partie des paires de bases (4 sur7), et l'intercalant aroma-
tique (ici un noyau acridine) ne peut s'insérer entre deux plateaux
de bases pour stabiliser le complexe formé. L'oligonucléotide n'est
pas suffisamment lié aux ARN du virus pour l'inactiver, et les cel-
lules meurent.

type de virus possède huit ARN, mais
l'extrémité commune differe d'un type à
l'autre. L'oligonucléotide complémen-
taire de l'extrémité commune des virus
de type A inhibe leur développement ; il
est en revanche sans effet sur un virus de
type B dont la séquence cible n'est pas
complémentaire. Ces expériences démon-
trent que l'oligonucléotide agit en se
fixant sur les ARN viraux et non pas en
interférant avec une fonction cellulaire
nécessaireau développement du virus.
La présence du cycle aromatique atta-
ché à l'extrémité des oligonucléotides est
indispensable pour que le virus de la
grippe soit inhibé. L'idée originale qui a
présidé à cette modification de l'oligonu-
cléotide reposait sur le gain de stabilité
conféré par le cycle aromatique, qui peut
s'insérer entre deux paires de bases suc-
cessives de la mini-double hélice formée
par l'oligonucléotide avec sa séquence
complémentaire, d'où le nom d'intercalant
donné à de telles substances.Développées
par le Centre de biophysique moléculaire
d'Orléans, et par le Laboratoire de biophy-
sique du Muséum national d'histoire natu-
relle, ces molécules mixtes oligonucléo-
tide-intercalant se sont révélées actives
dans différents systèmesbiologiques.
Nous venons de voir qu'une molécule
de cette famille inhibait le développement
du virus de la grippe dans des cellules en
culture. Philippe Verspieren et Jean-
Jacques Toulmé du Laboratoire de biophy-
sique du Muséum national d'histoire natu-
relle ont démontré qu'un conjugué
oligonucléotide-intercalant provoquait la
mort des trypanosomes en culture. Ces
parasites unicellulaires, responsablesde la
maladie du sommeil, présentent une parti-
cularité qui rappelle celle que nous avons
mentionnée précédemment pour le virus
de la grippe : tous les ARNmessagers du
parasite possèdent une partie commune de
39 nucléotides à leur extrémité. Un seul
oligonucléotide, dirigé contre cette partie
commune, devrait empêcher la fabrication
de toutes les protéines du parasite : c'est ce
qui a été vérifié, d'abord en extrayant les
ARNmessagerset en analysant leur traduc-
tion dans un tube à essais,puis sur le para-
site lui-même en culture. Comme dans le
cas du virus de la grippe, l'inhibition n'a
lieu que si l'oligonucléotide est attaché à
un agent intercalant. Ce dernier agit en sta-
bilisant le complexe formé par l'oligonu-
cléotide avec sa cible, mais aussien favori-
sant sa pénétration à l'intérieur du parasite
et en le protégeantcontre les nucléases,qui
le dégradent à partir de son extrémité.
Les avantages conférés par l'attache-
ment d'un agent intercalant à l'extrémité
de l'oligonucléotide se retrouvent dans
les expériences visant à bloquer l'expres-
sion d'un gène, dans une cellule en, cul-
ture. Ester Saison, du Laboratoire de bio-
physique du Muséum national d'histoire
naturelle, en collaboration avec l'équipe
de Bruno Tocqué, de Rhône-Poulenc
Santé, a démontré qu'un conjugué oligo-
nucléotide-intercalant dirigé contre un
oncogène humain, le gène Ha-ras, arrê-
tait la croissance de cellules tumorales où
ce gène était activé par une mutation.
L'attachement d'un groupe hydrophobe à
l'autre extrémité de l'oligonucléotide
permet d'en amplifier l'effet. Des expé-
riences récentes in vivo ont confirmé ce
résultat : l'injection d'oligonucléotides
antisens dirigés contre l'oncogène Ha-ras
bloque la croissance de tumeurs mam-
maires humaines greffées sur des souris
athymiques (privées d'une partie du sys-
tème immunitaire).
Diverses expériences réalisées sur le
virus du SIDAont mis en jeu des oligonu-
cléotides dirigés contre plusieurs régions
de l'ARN viral ou des ARNmessagerscor-
respondants. L'information génétique du
VIH est contenue dans un ARN à chaîne
unique de quelque 9 200 nucléotides.
Après infection, cet ARN est d'abord
transformé en une double hélice d'ADN
grâce à une enzyme que possède le virus,
appelée transcriptase inverse ; cet ADN
 s'intègre ensuite au sein de l'un des chro-
mosomes de la cellule infectée. Il peut
alors rester silencieux, ou s'exprimer
lorsque les lymphocytes T infectés sont
stimulés. Son expression passe par une
étape de transcription, comme pour les
autres gènes cellulaires, puis par des
étapes de maturation commandées par
certaines des protéines virales. Les ARN
messagers produits sont alors traduits
comme ceux de la cellule hôte. L'utilisa-
tion d'oligonucléotides naturels ou modi-
fiés a montré que les deux dernières
étapes (maturation et traduction) pou-
vaient être bloquées spécifiquement.
Certains oligonucléotides, notamment
des oligophosphorothioates, où un atome
d'oxygène lié au phosphore est remplacé
par un atome de soufre, empêchent le
développement du viH par un mécanisme
très différent de l'effet « antisens » défini
précédemment. Les oligophosphoro-
thioates sont en effet de très bons inhibi-
teurs de la transcriptase inverse du virus
et ils se fixent également sur le récepteur
des lymphocytes T4 CD4) (appelé que le
VIH utilise pour se fixer, puis pour péné-
trer à l'intérieur de ces cellules. Ces
résultats démontrent que d'autres cibles
que les acides nucléiques, notamment des
protéines, peuvent fixer des oligonucléo-
tides et conduire à des effets inattendus et
fort intéressants au point de vue fonda-
mental et appliqué.
L'effet persistant
de l'oligonucléotide
Revenons au mécanisme d'action des
oligonucléotides « antisens ».
Une observa-
tion faite par Christian Cazenave, cher-
cheur dans notre laboratoire, devait nous
inciter à réviser l'hypothèse initiale du
mécanismed'action, selon laquelle la fixa-
tion de l'oligonucléotide sur sa cible ARN
messagerétait un obstacle physique suffi-
sant pour en empêcher la traduction. Dès
1985, C. Cazenave avait montré qu'en
micro-injectant simultanément dans un
ovocyte de xénope (un crapaud Sud-afri-
cain) un ARNmessager, celui de la bêta-
globine de lapin, et un oligonucléotide
complémentaire d'une partie de cet ARN,
la synthèsede bêta-globine était sélective-
ment inhibée, même quand la mesure était
faite 24 heures après la micro-injection.
Toutefois il démontrait parallèlement que
l'oligonucléotide était dégradé très rapide-
ment (en quelques dizaines de minutes) à
l'intérieur de l'ovocyte.
Comment alors pouvait-on expliquer
que l'effet de l'oligonucléotide soit
observable au bout de 24 heures ? Seule
une destruction (irréversible) de l'ARN
messager, induite par fixation de l'oligo-
nucléotide et se produisant dans les pre-
mières dizaines de minutes, expliquait
cette observation ; cette destruction est
l'oeuvre d'une nucléase présente dans
toute cellule vivante, appelée ribonu-
cléase H (RNase H), qui reconnaît spéci-
fiquement une double hélice constituée
d'une chaîne d'ARN et d'une chaîne
d'ADN, et coupe seulement la chaîne
d'ARN. Les oligonucléotides utilisés dans
l'expérience précédente étant constitués
de désoxyribonucléotides, le complexe
formé avec un ARN messager est reconnu
par la RNase H, qui dégrade l'ARN, empê-
chant ainsi toute synthèse protéique.
Des expériences réalisées simultané-
ment dans d'autres systèmes de traduc-
tion devaient démontrer le rôle essentiel
joué par la RNase H dans l'inhibition de
la traduction des ARN messagers. De
nombreuses modifications rendent les
oligonucléotides inaptes à induire la
dégradation des ARNmessagers. C'est le
cas des oligonucléotides synthétisés avec
les anomères alpha des nucléotides,
comme l'ont démontré les laboratoires de
Bernard Lebleu et Jean-Louis Imbach à
Montpellier, celui de Claude Paoletti à
Villejuif et le nôtre à Paris. C'est égale-
ment le cas des oligophosphonates. Seuls
les oligophosphorothioates se sont révé-
lés compatibles avec l'activité de la
RNase H, comme l'a démontré le labora-
toire de Jack Cohen du National Institute
of Health, à Bethesda.
Comme ces oligophosphorothioates
sont beaucoup plus résistants aux
nucléases que les oligonucléotides natu-

6. EPFETS D'UN OLIGONUCLÉOTIDE lié à un agend intercalant, icitration de l'oligonueléotide dans les trypanosomes.La photographie
un dérivé de l'acridine, sur les trypanosomes vivants. La photogra- de droite de la même culture, prise 48 heures plus tard, montre
phie de gauche montre des trypanosomes en culture, immédiate- l'effet létal sur les trypanosomes de l'oligonucléotide lié à l'interca-
ment après l'ajout du conjugué oligonucléotide intercalant. Sur la lant, qui s'est fixé sur les ARN messagers du trypanosome, et a ainsi
photographie centrale, la fluorescence de l'acridine révèle la péné- empêchéleur traduction enprotéines.
 rels, ils constituent d'excellents outils
pour inhiber la synthèse d'une protéine et
d'une seule. Grâce à sa longue durée de
vie, une seule molécule d'oligophospho-
rothioate peut induire la dégradation de
plusieurs molécules d'ARN messager. La
synthèse de la protéine correspondante est
alors inhibée de façon apparemment cata-
lytique, c'est-à-dire que la concentration
en oligomère requise pour inhiber 50 pour
cent de la synthèse protéique (de l'ordre
d'un milliardième de mole par litre) est
inférieure à celle de l'ARN messager cible.
Cependant les phosphorothioates ne
représentent pas la panacée dans le monde
des antisens. Malgré les remarquables
propriétés que nous venons de décrire, ils
exercent des effets non spécifiques sur la
synthèse protéique à des concentrations
relativement faibles (micromolaire) ; de
plus, ils pénètrent plus difficilement dans
les cellules que leurs homologues naturels
et se fixent sur d'autres cibles, comme
l'ont démontré les expériences sur le VIH
mentionnées précédemment.
7. LES CALCULS DES CONFIGURATIONS
agent intercalant (ici un dérivé de l'acridine) attaché à l'oligonucléotide (à gauche) s'insère
entre deux plateaux de bases de la double hélice formée.
Les résultats des expériences déga-
gent le schéma suivant : (1) quand l'oli-
gonucléotide est capable d'induire une
destruction de l'ARN cible par la RNase H,
la synthèseprotéique est inhibée de façon
irréversible ; (2) quand l'oligonucléotide
(modifié) n'induit pas l'activité RNase H,
il peut néanmoins avoir un effet (phy-
sique) sur la synthèse protéique à condi-
tion d'être dirigé soit vers la région située
en amont du site d'initiation de la traduc-
tion sur l'ARN messager, soit vers une
région d'épissage de l'ARN pré-messager.
Dans ces derniers cas, les concentrations
requises sont supérieures à celles néces-
saires lorsque la RNase H est active. Un
oligonucléotide dirigé contre une région
située en aval du site d'initiation de la
traduction ne semble avoir aucune chance
d'empêcher la machinerie de traduction
(le ribosome) de poursuivre son chemin
s'il n'induit pas une coupure du message
par la RNase H.
Le rôle joué par la RNase H dans
l'inhibition de la traduction des ARNmes-
D'ÉNERGIE MINIMALE montrent comment un
sagers par des oligonucléotides suggère
aux chercheurs de nouvelles stratégies
pour inhiber spécifiquement l'expression
des gènes. Les modifications chimiques
qui rendent les oligonucléotides résistants
aux nucléases, mais ne permettent plus à
la RNase H d'agir sur l'ARN cible, parais-
sent a priori dépourvues d'intérêt dans la
stratégie « antisens ».Serait-il possible de
les améliorer en les rendant aptes à
induire eux-mêmes des réactions irréver-
sibles au niveau de leur cible ? Une telle
possibilité a été développée au cours des
années 1970 par l'équipe russe de Dmitri
Knorre et de Valentin Vlassov, à
Novossibirsk, qui a attaché à l'extrémité
d'un oligonucléotide un agent alkylant
capable d'établir une liaison covalente
avec certaines basesnucléiques de l'ARN
cible, notamment les guanines. Une autre
possibilité consiste à lier une « paire de
ciseaux » à l'extrémité de l'oligonucléo-
tide de façon qu'il coupe les liaisons inter-
nucléotidiques de la cible. Des complexes
métalliques, tels que ceux de l'acide éthy-
lène diamine tétra-acétique (EDTA)avec le
fer, de la phénanthroline avec le cuivre,
ou des porphyrines avec le fer, le cobalt
ou le manganèse, sont capables d'induire
des coupures localisées sur un ADNou un
ARNlorsqu'ils sont liés de façon covalente
à l'extrémité d'un oligonucléotide.
Cette approche a été développée par
plusieurs laboratoires depuis 1984 : celui
de Novossibirsk déjà nommé, ceux de
Leslie Orgel, à l'Institut Salk, de Peter
Dervan, de l'Université de technologie de
Californie, de David Sigman, de
l'Université de Los Angeles, aux États-
Unis, et le nôtre, en France.
Enfin une troisième stratégie pour
induire des réactions irréversibles à un
endroit précis d'une cible ARNa été mise
en oeuvredepuis 1986 par Trung Le Doan
et Danièle Praseuthdans notre laboratoire,
et par l'équipe de Paul Miller à Baltimore.
Elle repose sur l'utilisation de groupes
photoactifs attachés à l'extrémité de l'oli-
gonucléotide. Sous l'action de rayonne-
ments du proche ultraviolet ou du domaine
visible, une liaison covalente de l'oligonu-
cléotide avec la cible peut être photo-
induite. Nous avons également démontré
la possibilité de créer par irradiation des
coupureslocalisées de la cible, créant ainsi
des photo-endonucléasesartificielles.
Que la réaction de coupure soit induite
par activation chimique ou par voie photo-
chimique, ces nucléases artificielles peu-
vent être utilisées à d'autres fins que de
bloquer la traduction d'un ARNmessager ;
ces substancessont en particulier d'excel-
lents outils pour analyser l'accessibilité de
certaines séquencesnucléiques au sein de
structures complexes comme les associa-
tions d'acides nucléiques et de protéines ;
la formation de liens covalents entre l'oli-
gonucléotide et sa cible permet de créer un
dommage irréversible en un site précis
d'un acide nucléique et d'en étudier les
retentissementssur sa fonction biologique.
Les triples hélices
Les acides nucléiques à chaîne unique
comme les ARNmessagersne sont pas les
seules cibles des oligonucléotides : la
double hélice d'ADN elle-même peut se
lier à des oligonucléotides. Les séquences
d'ADN reconnues le plus facilement possè-
dent toutes les purines (A et G) sur la
même chaîne et donc toutes les pyrimi-
dines (T et C) sur l'autre. L'oligonucléo-
tide associé est alors constitué unique-
ment de pyrimidines : la thymine se fixe
sur l'adénine de la paire de basesA-T de
la double hélice ; la cytosine, à condition
d'être liée à un proton, se fixe sur la gua-
nine d'une paire G-C. Ces interactions
mettent en jeu des liaisons hydrogène, du
même type que celles qui assurent l'appa-
riement des bases A et T ou G et C dans la
double hélice. L'oligonucléotide s'enroule
autour de la double hélice, dans le grand
sillon. Son orientation est parallèle à la
chaîne de l'ADN qui porte les purines. Il se
forme donc localement une triple hélice.
La possibilité de former une hélice
triple avait été démontrée dès 1957 par
les chercheurs américains G. Felsenfeld,
D. Davis et A. Rich. Ils avaient décrit
une expérience utilisant des polyribonu-
cléotides de synthèse, mettant en évi-
dence l'association de deux chaînes
d'acide polyuridylique avec une chaîne
d'acide polyadénylique. Cette triple
hélice (polyA.2polyU) résultait de la for-
mation de liaisons hydrogène entre deux
uraciles et une adénine (l'uracile est
l'équivalent, dans les ARN, de la thymine
dans les ADN, le groupement méthyle de
cette dernière étant remplacé par un
atome d'hydrogène). De telles triples
hélices peuvent aussi se former avec des
polydésoxyribonucléotides.
La possibilité de fixer un oligonucléo-
tide sur une double hélice d'ADN en un
site précis ouvre de nombreuses perspec-
tives. Plusieurs laboratoires ont démontré
quasi simultanément que la formation
locale d'une triple hélice pouvait empê-
cher la reconnaissance de la séquence
cible par des protéines qui commandent la
transcription, et par des enzymes de res-
triction. Ces résultats ouvrent la voie
d'une nouvelle stratégie pour contrôler
l'expression des gènes, lors de leur trans-
cription, ou pour moduler la réplication
de l'ADN. Les études réalisées in vitro
démontrent qu'un tel contrôle est pos-
sible. Leur extension à des cellules en cul-
ture requiert l'utilisation d'oligonucléo-
tides résistants aux nucléases et dont le
temps de vie à l'intérieur des cellules soit
suffisant pour leur permettre d'atteindre
la cible dans le noyau, là où se trouve
l'ADN en cours de transcription ou de
réplication. Des oligonucléotides synthéti-
sés avec les anomères alpha des nucléo-
sides sont capables de se fixer sélective-
ment sur une double hélice d'ADN, en
formant localement une triple hélice.
L'affinité d'un oligonucléotide pour
une double hélice reste cependant assez
faible. Lorsque l'oligonucléotide contient
beaucoup de cytosines, la triple hélice
formée est plus stable quand le milieu
s'acidifie. En effet, la cytosine doit fixer
un proton afin de se lier à une paire de
basesG-C. Dans des conditions physiolo-
giques (pH neutre, entre 7 et 7, 4) la for-
mation de triple hélice est défavorisée,
mais l'attachement d'un noyau aroma-
tique à l'extrémité de l'oligonucléotide
permet de stabiliser cette interaction. Le
noyau aromatique peut s'intercaler à la
jonction entre la triple hélice et la double
hélice. Cette intercalation s'accompagne
d'une augmentation notable de la stabi-
lité des complexes formés, notamment
dans les conditions physiologiques.
Les oligonucléotides capables de se
fixer en triple hélice peuvent être substi-

8. LA FIXATION D'UN OLIGONUCLÉOTIDE (en bleu) dans le grand

sillon de la double hélice d'ADN conduit à la formation d'une triple
hélice. Les basespyrimidiques (cytosine C et thymine T), en bleu, de
l'oligonueléotide se lient par des liaisons hydrogène aux paires de
basesG-C et A-T, dans le grand sillon. Pour que la triple hélice puisse
se former, il faut que toutes les purines (guanidineG et adénine A) de
la cible en rose se trouvent sur le même brin de la double hélice et,
naturellement, que toutes les pyrimidines, en vert, soient sur l'autre
brin. L'indication C+ signifie que la cytosine doit au préalable fixer un
proton pour former deux liaisons hydrogène avec G de la paire G-C.
 tués par des groupements activables chi-
miquement ou photochimiquement. En
attachant un chélate métallique (acide
éthylènediamine tétraacétique complexé
aux ions fer, phénanthroline complexée
aux ions cuivre), il est possible de provo-
quer une coupure des deux brins de la
double hélice à proximité de la séquence
choisie pour cible de l'oligonucléotide. Si
l'on suppose que les paires de bases de
l'ADN sont réparties de façon statistique,
une séquence de 17 paires de bases ne
devrait se retrouver en moyenne qu'une
seule fois dans le génome d'une cellule
humaine. Un oligonucléotide de 17 unités
reconnaissant une telle séquenceet armé
d'une paire de ciseaux ne devrait donc
couper l'ADN qu'en un seul site sur un
des chromosomes.
En réalité, il faut établir soigneuse-
ment les conditions de la réaction pour
qu'une telle spécificité soit atteinte. En
effet, l'oligonucléotide peut également se
fixer sur des séquences d'ADN ne diffé-
rant de la séquence cible que par une ou
quelques paires de bases. Toutefois cette
fixation sur les sites secondaires est
moins stable que sur le site parfaitement
complémentaire et il semble possible, en
choisissant une température ou une
concentration saline appropriée, de limi-
ter la fixation, et donc la coupure, à un
seul site. Cette possibilité a été démon-
trée sur un ADNde 50 000 paires de bases
(celui d'un bactériophage) par l'équipe
de Peter Dervan, à l'Institut de technolo-
gie de Californie, qui a utilisé un oligo-
nucléotide lié à un complexe EDTA-Fe.
Jean-Christophe François, dans notre
laboratoire, a utilisé un oligonucléotide
armé d'un complexe phénanthroline-
cuivre pour couper, avec une grande effi-
cacité (70 pour cent environ) et en un site
précis, l'ADN d'un virus du singe (SV40)
long de 5243 paires de bases : Cette étude
a en outre permis de démontrer que la
coupure se produit dans le petit sillon de
l'ADN, alors que l'oligonucléotide apporte
la phénanthroline dans le grand sillon. Ce
transfert d'information chimique entre les
deux sillons de la double hélice résulte
d'une intercalation de la phénanthroline à
la jonction double-triple hélice, puis à la
formation du complexe avec l'ion cuivre
dans le petit sillon, où se produit ensuite
la réaction chimique conduisant à la cou-
pure de la double hélice.
Les complexes métalliques ne sont
pas les seules paires de ciseaux dont nous
disposions pour couper la double hélice.
Une réaction photochimique utilisant un
dérivé de l'ellipticine, attaché à l'extré-
mité d'un oligonucléotide, permet égale-
ment de provoquer une telle coupure.
Au lieu de couper la double hélice
d'ADN, il pourrait être souhaitable
d'induire localement une réaction irréver-
sible qui bloquerait le déroulement d'un
processus biologique comme la transcrip-
tion ou la réplication. II est relativement
facile de modifier un nucléotide sur l'une
des chaînes de la double hélice en atta-
chant à l'extrémité de l'oligonucléotide un
groupe alkylant ou un dérivé capable de
se lier de façon covalente par irradiation.
Nous avons démontré, en collabora-
tion avec le laboratoire de Jean Lhomme,
à Grenoble, qu'il était possible de créer
un pont entre les deux chaînes de la
double hélice en utilisant un dérivé pho-
toactivable de la famille des psoralènes.
Irradié dans le domaine du proche ultra-
violet (aux longueurs d'onde comprises
entre 300 et 400 nanomètres), le psora-
lène forme des liaisons chimiques stables
avec deux thymines appartenant chacune
à l'une des chaînes de la double hélice.
L'oligonucléotide sert de vecteur pour
diriger le pontage entre les deux chaînes
vers une séquence qu'il a au préalable
reconnue et à laquelle il s'est lié. Il se
forme ainsi, après irradiation, un « point
tripler où la molécule de psoralène est
attachée en trois sites différents, d'une
part, à l'oligonucléotide vecteur et,
d'autre part, à chacune des deux chaînes
de la double hélice. Bien que les expé-
riences biologiques ne soient pas encore
très avancées, il est possible de prédire
que de tels points triples seront des obs-
tacles très difficiles à franchir pour les
enzymes impliquées soit dans la trans-
cription, soit dans la réplication de l'ADN.
Le champ d'application
des oligonucléotides
Ces développements récents montrent
que le champ d'application des oligonu-
cléotides est susceptible de s'élargir
considérablement dans les prochaines
années.La mise au point d'endonucléases
artificielles capables de couper les deux
chaînes de l'ADN permet d'envisager des
applications dans des domaines aussi
variés que la cartographie des gènes sur
les chromosomes ou l'introduction de
mutations sur des gènes préalablement
choisis. La fixation sur des séquences
définies et la production contrôlée de
modifications chimiques irréversibles en
des sites précis conferent aux oligonucléo-
tides une très grande spécificité dans leurs
effets biologiques.
Les données acquises au cours des
dernières années sur les oligonucléotides
« antisens »puis sur les oligonucléotides
«anti-ADN» fournissent une base ration-
nelle pour le développement d'approches
pharmacologiques nouvelles. Plutôt que
de viser les produits des gènes (c'est-à-
dire les protéines), de nouvelles classesde
substancesactives moduleraient l'expres-
sion des gènes eux-mêmes. Les premiers
essais cliniques ont débutés récemment
dans le domaine des infections virales
(VIH, herpès, papillomes) et celui du can-
cer, notamment les leucémies.
D'importantes modifications doivent
être apportées aux oligonucléotides pour
leur conférer des propriétés compatibles
avec une utilisation, soit par voie intra-
veineuse, soit par voie orale. L'améliora-
tion de leur stabilité vis-à-vis des
nucléases et de leur passage au travers
des membranes cellulaires retient l'atten-
tion d'un nombre croissant de labora-
toires universitaires et privés. De nom-
breuses études visent la protection des
oligonucléotides par encapsulation ou
leur ciblage vers des types cellulaires
donnés. La toxicité de ces substances
devra faire l'objet d'une étude approfon-
die, comme pour tout médicament.
L'approche utilisant les oligonucléo-
tides est très séduisante en raison de la
spécificité attendue de leurs effets biolo-
giques et de la généralité du champ de
leurs applications : toute information
génétique déchiffrée est une cible poten-
tielle. II est donc possible de diriger
sélectivement un oligonucléotide vers un
agent infectieux (virus, bactérie, champi-
gnons, parasites...) sans perturber le fonc-
tionnement de l'hôte.
Les oligonucléotides sont capables de
distinguer un gène portant une mutation,
même ponctuelle, d'un gène normal.
Toute affection liée à l'expression d'un
gène ayant subi une mutation est donc
potentiellement accessible à cette straté-
gie. C'est le cas des maladies d'origine
génétique, de certaines tumeurs dont
l'origine est liée à l'expression d'un
oncogène activé par mutation ou translo-
cation d'un chromosome à un autre.
Dans beaucoup d'autres pathologies,
la réduction de la vitesse de synthèse
d'une enzyme, par modulation de
l'expression du gène correspondant,
pourrait conduire à une diminution des
effets observés. C'est le cas, par exemple,
dans l'hypertension, l'hypercholestérolé-
mie, les processus inflammatoires...
La quasi-universalité d'une telle stra-
tégie, et sa très grande spécificité, expli-
quent les efforts de recherche actuels.
L'enjeu justifie que des chercheurs de
talent dans des domaines très variés, de la
chimie à la pharmacologie, allient leurs
efforts pour tenter de convertir cette
approche en réalité thérapeutique.
 L'origine

de l'Homme

Jan Klein, Naoyuki Takahata et Francisco Ayala

Les groupes tissulaires humains se sont diversifiés

bien avant l'apparition d'Homo sapiens.

DESCENDONS-NOUS d'unun greffon issu d'un autre individu : ils

Le complexe majeur
d'histocompatibilité
(CMH)est de loin la partie
la plus variable du génome.
Chez l'homme, ce complexe,
nommé HLA,se trouve sur
le chromosome 6 (en haut).
Sur la carte des gènes (au
centre), chaque rectangle
représente un locus. Cha-
que couleur correspond à
un groupe fonctionnel : les
gènes de classe I sont en
vert et ceux de classe 11en
rouge. Les allèles connus
des locus DRB1,DRB2et
DRB3sont indiqués, dans
cet encadré, au-dessous
de chaque locus ; les sym-
boles représentent le nom
du locus (comme DRB1),
suivi du nom de l'allèle
marqué d'un astérisque
(par exemple, *0101).
petit groupe d'indivi-
dus, voire d'une seule
femme, ou d'une popu-
lation
plus importante
de quelque 10 000 membres ? De récents
travaux ont indiqué que l'espèce humaine
et d'autres espèces seraient issues de regroupés dans une même région chro-
petites populations ancestrales, mais
l'étude des gènes qui permettent au sys-
tème immunitaire de reconnaître les pro-
téines étrangères à l'organisme aboutit à
une conclusion opposée.
L'histoire de la reconnaissancedu soi
a commencé il ya plus de 50 ans, lorsque infectieux. Lors de leur synthèse à l'inté-
l'anatomo-pathologiste londonien Peter
Gorer découvrit que la plupart des cel-
lules de chaque individu portent à leur
surface un ensemble de marqueurs molé-
culaires. Ces marqueurs, qui caractérisent
chaque individu d'une espèce, détermi-
nent la compatibilité tissulaire, c'est-à-
dire la capacité d'un organisme à tolérer
ont été nommés « molécules d'histocom-
patibilité ». Puis Gorer démontra que,
parmi ces nombreuses molécules d'histo-
compatibilité, certaines ont un effet pré-
dominant sur la compatibilité tissulaire ;
les gènes qui codent ces molécules sont
mosomique, le complexe majeur d'histo-
compatibilité (CMH).
Nous savons aujourd'hui que le rôle
physiologique des gènes et des protéines
du CMH n'est pas le rejet des greffes,
mais la lutte contre les micro-organismes
rieur des cellules, les protéines du CMHse
lient à de courts peptides, qu'elles expo-
sent ensuite à la surface cellulaire. La
plupart de ces peptides sont des frag-
ments de protéines issues de l'organisme
(peptides du «soi»), mais les protéines du
CMH qui s'assemblent dans des cellules
infectées se lient également à des pep-
 tides issus de la dégradation des pro-
téines du micro-organisme infectant
(peptides du «non-soi»).
Certaines cellules immunitaires, les
lymphocytes T, surveillent en perma-
nence la surface des autres cellules de
l'organisme, ignorant les cellules qui ne
présentent que des peptides du soi, mais
se liant aux cellules dont les protéines du
CMH exposent des peptides du non-soi.
Les lymphocytes T distinguent le soi du
non-soi grâce à des récepteurs qui sont
complémentaires de structures formées
par la combinaison de protéines du CMH
et de peptides du non-soi. La liaison de
ces récepteurs à leur structure complé-
mentaire active les lymphocytes T, qui
déclenchent alors un ensemble complexe
de réactions destinées à détruire les cel-
lules infectées et leurs intrus. Lors d'une
greffe d'organe, d'autre part, les lympho-
cytes T perçoivent comme étrangères les
protéines du CMHdu greffon et attaquent
ce dernier.
En 1980, le prix Nobel de médecine a
été décerné à Jean Dausset, qui a caracté-
risé le système d'histocompatibilité
humain, nommé HLA (pour Human
Leucocyte Antigen, c'est-à-dire antigène
leucocytaire humain). Ce complexe est
composé de plus de 100 gènes, qui occu-
pent une région chromosomique longue
de plus de quatre millions de paires de
bases(les bases sont les sous-unités de la
molécule d'ADN, dont les chromosomes
sont composés). Seuls quelques-uns de
ces gènes codent des molécules qui pré-
sentent des peptides aux lymphocytes T.
D'autres commandent la dégradation des
protéines en peptides et le transport des
peptides à travers les membranes ;
d'autres encore codent des molécules
immunitaires et d'autres enfin ont des
fonctions inconnues ou indépendantes de
la réaction immunitaire.
Parmi les gènes du CMH, les deux
classes I et 11diffèrent par leurs struc-
tures et par leurs fonctions. Nous ne
considérerons ici que le gène DRB1 de
classe II, présent chez l'homme et
d'autres primates, mais la plupart de nos
conclusions valent pour les autres gènes
fonctionnels du CMH.
Pour expliquer qu'un organisme
rejette systématiquement les greffons
provenant d'un donneur qui n'appartient
pas à sa famille, on a supposé que
chaque individu possède des peptides du
CMH différents. Grâce aux méthodes
modernes de génie génétique, on a
confirmé cette hypothèse en analysant
les gènes du CMH : chaque locus (chaque
site de localisation d'un gène) fonction-
nel du CMHprésente de nombreux allèles,
ou versions différentes du même gène
(un locus est comparable à une position
de chiffre d'un affichage numérique sur
une montre, les chiffres effectivement
affichés correspondant aux différents
allèles). Comme un chromosome com-
porte plusieurs locus du CMH et que
chaque locus possède de nombreux
allèles, de très nombreuses combinaisons
d'allèles sont théoriquement possibles
(plus de mille milliards).
En fait, le nombre de possibilités est
inférieur, mais il en existe assez pour que
deux individus non apparentés, pris au
hasard, n'aient jamais tous leurs allèles
du CMH identiques. Dans la plupart des
autres systèmes génétiques, au contraire,
chaque locus possède soit un allèle
unique (les chiffres affichés sont immo-
biles), soit un nombre restreint d'allèles,
dont l'un est fréquent et les autres relati-
vement rares. On nomme polymorphisme
l'existence de plusieurs allèles fréquents
pour un même locus.
Le polymorphisme du CMH n'est pas
la seule particularité de ce système : alors
que, dans la plupart des gènes, les allèles
d'un locus donné ne different que par un
ou quelques nucléotides, certains allèles
du CMH présentent plus de 100 nucléo-
tides différents.
Examinons maintenant le phénomène
de spéciation, au cours duquel une espèce
parentale se dissocie en plusieurs espèces
filles. Si ces dernières se formaient à par-
tir d'un petit nombre d'individus, voire
d'une seule femelle, alors les polymor-
phismes s'établiraient à nouveau après
chaque spéciation et seraient postérieurs
aux espèces: imaginons un sac contenant
20 000 billes (les individus) de 40 cou-
leurs différentes (les allèles), représen-
tées en proportions égales ; si l'on tire
100 billes au hasard, la probabilité
d'obtenir, dans l'échantillon (la nouvelle
espèce), une bille de chaque couleur est
très faible (0,02 précisément).
La coalescence des gènes
Un argument plus précis en faveur de
l'origine relativement récente du poly-
morphisme est fourni par la théorie de la
coalescence en génétique des popula-
tions. Tout comme les êtres humains, les
gènes ont leurs « arbres généalogiques ».
En théorie, on peut retracer la généalogie
de n'importe quelle paire de gènes
« neutres » choisie au hasard dans une
population, jusqu'au moment de leur
«coalescence» en un gène ancestral
unique (un gène est dit neutre lorsqu'il ne
confère aucun avantage sélectif par rap-
port à d'autres gènes). Le nombre moyen
de générations que l'on doit remonter
 pour arriver au gène ancestral est égal au
double de la « population efficace »,c'est-
à-dire au double environ du nombre des
géniteurs. Par exemple, si la population
ancestrale comportait 10 000 individus et
si la durée de vie moyenne d'une généra-
tion est de 20 ans, la coalescence de deux
gènes neutres actuellement présents dans
la population humaine daterait d'il y a
environ 400 000 ans (le produit de
2 x 10 000 par 20). Comme l'Homo
sapiens archaïque est sans doute apparu
il y a plus de 500 000 ans, le polymor-
phisme humain serait apparu alors que
notre espèce s'était déjà individualisée.
Si les gènes du CMHévoluent selon la
théorie de la coalescence, leur polymor-
phisme supérieur fait supposer que leurs
mutations sont bien plus fréquentes que
celles des autres gènes : dans un même
temps, les gènes du CMH se diversifie-
raient bien plus que les autres gènes.
Cette hypothèse sur l'origine du poly-
morphisme du CMH a été proposée il y a
15 ans, mais J. Klein a toujours pensé
qu'elle s'opposait aux faits.
Vers la fin des années 1970, à
l'Institut de biologie Max Planck de
Tübingen, Bernhard Arden, Edward
Wakeland et J. Klein ont découvert des
allèles du CMH identiques chez deux
espèces de souris qui ont divergé il y a
deux millions d'années. Cette découverte
très surprenante, chez des espèces où la
1. LA RÉACTION IMMUNITAIRE
commencelorsqu'une molécule du CMH(en gris), synthéti-
sée dans toutes les cellules, fixe un peptide(en rouge). Le complexe ainsi formé migre à la
surface de la cellule, où illymphocytes
est présentéT.aux
Ces derniers ignorent les com-
plexes si le peptide est un fragment d'une protéinepropre à l'organisme ; en revanche, ils
se lient aux complexesqui portent un peptide étranger et s'activent alors.
diversité du CMHest au moins équivalente
à celle observée chez l'homme, indiquait
que les gènes du CMH n'évoluaient pas
plus rapidement que les autres.
En 1980, J. Klein proposa que la
grande variabilité chimique des allèles du
CMH provenait non pas de leur fréquence
de mutation élevée, mais d'une transmis-
sion du polymorphisme entre les espèces
ancestrales et des espèces filles. Dans
cette hypothèse, le polymorphisme de la
plupart des allèles du CMHaurait été trans-
mis tout au long de la période de spécia-
tion, et le temps moyen de coalescence
des allèles du CMHserait bien supérieur à
la durée de vie des espèces.
Cette hypothèse du polymorphisme
transspécifique fut corroborée directe-
ment en 1988, lorsque des biologistes ont
comparé les séquencesdes allèles du CMH
d'espèces apparentées. J. Klein et Felipe
Figueroa, à Tübingen, et E. Günther, de
l'Université de Göttingen, ont découvert
des allèles qui s'étaient formés avant la
séparation des lignées sanguines qui ont
conduit à la souris domestique et au rat
de laboratoire, séparation estimée à plus
de 10 millions d'années. Puis l'ancien-
neté des allèles du CMH des rongeurs et
des primates a été confirmée dans de
nombreux autres laboratoires d'Europe et
des États-Unis.
On a notamment observé le polymor-
phisme transspécifique en étudiant deux
allèles humains (du locus DRB1) qui dif-
ferent plus entre eux que de leurs équiva-
lents chez le chimpanzé. Les différences
entre allèles sont mesurées par leur dis-
tance génétique, égale à la proportion de
nucléotides différents. Avec les quatre
allèles du locus DRB1, on construit un
arbre génétique où la longueur des
branches est proportionnelle aux dis-
tances génétiques, et où les gènes séparés
par les distances les plus courtes sont
voisins (voir l'encadré page 114). Cet
arbre indique que les deux allèles
humains ont divergé à partir d'un gène
ancestral commun avant la séparation de
l'homme et du chimpanzé, il y a plus de
quatre millions d'années. Mieux encore,
J. Klein et ses collègues ont découvert
d'autres allèles humains du CMH qui ont
divergé avant la séparation des prosi-
miens et des primates anthropoïdes, il y a
plus de 65 millions d'années. Durant
cette période, les spéciations ont été
nombreuses, et le polymorphisme du CMH
semble s'être transmis au cours de cha-
cune d'elles.
L'ancienneté des lignées alléliques
du CMHs'oppose à la théorie de la coales-
cence, selon laquelle tous les allèles
humains ne dateraient que de 400 000
ans. En 1990, l'un de nous (N. Takahata)
a étudié la faille de cette théorie : les
gènes du CMH ne seraient pas neutres,
mais soumis à une « sélection d'équi-
libre», une forme de sélection qui
conserve dans une population des allèles
plus longtemps que si ces derniers évo-
luaient au hasard. En reformulant la théo-
rie de la coalescence pour tenir compte
des gènes soumis à une sélection,
N. Takahata a montré que l'ancienneté de
la coalescence est proportionnelle à
l'intensité de la sélection : plus la sélec-
tion est forte, plus la coalescencede deux
lignées de gènes est ancienne. Selon ses
calculs, les temps de coalescencemoyens
des allèles du CMH seraient de plusieurs
millions d'années.
A. Hughes et Masatoshi Nei, à
l'Université de Houston, ont confirmé
indirectement que les gènes fonctionnels
du CMH sont soumis à une sélection
d'équilibre. Ils ont tout d'abord distingué
les mutations de nucléotides qui ne chan-
gent pas les acides aminés codés par les
gènes (mutations « synonymes ») et les
mutations qui modifient les acides ami-
nés (mutations « non synonymes »).
Comme toutes les mutations se produi-
sent avec la même fréquence, qu'elles
soient synonymes ou non, le rapport
entre ces deux types de mutations (rap-
port gamma) serait égal à un si les muta-
tions étaient évolutivement neutres.
Sélections positive
et négative

Or, si les mutations synonymes sont

généralement neutres, les mutations non
synonymes conferent parfois un avantage
évolutif qui conduit à une « sélectionposi-
tive » (rapport gamma supérieur à un) ou
un désavantagequi conduit à une « sélec-
tion négative » (rapport gamma inférieur à
un). Ainsi le rapport gamma révèle-t-il
l'existence éventuelle d'une sélection.
Les gènes du CMH comportent deux
parties : l'une spécifie les acides aminés
de la région de la protéine qui se lie aux
peptides (la région PBR, pour Peptide
Binding Region), l'autre spécifie le reste
de la protéine (région non-PBR).
A. Hughes et M. Nei ont découvert que
le rapport gamma est supérieur à un pour
le segment PBRdes gènes fonctionnels du
CMH, mais inférieur à un pour la région
non-PBR. Par conséquent, la sélection
naturelle favorise les mutations qui
entraînent un changement d'acide aminé
dans la partie des gènes qui spécifie la
région PBR (où l'on observe effective-
ment la majeure partie du polymor-
phisme du CMH),mais les défavorise dans
le reste des gènes.
En 1991, Adrian Hill et ses collègues
2. LA THÉORIEDE LA COALESCENCE analyse la généalogie des gènes. Ce diagramme
de l'Université d'Oxford ont proposé une
représenteune population de cinq individus portant chacun deux gènes (disques colorés).
preuve de l'existence d'une sélection En l'absence de sélection, le nombremoyen degénérations (lignes) séparant deux gènes de
positive pour les gènes du CMH en mon- leur ancêtrecommun serait égal à 10, soit le doublede l'effectif de la population étudiée.
trant que certains allèles du CMH humain
protègent contre le parasite du paludisme
Plasmodium falciparum. Ainsi la région
PBRdes protéines du CMH serait soumise espèce parentale (ainsi que la fréquence Pour estimer les temps de coalescence,
à une pression de sélection en faveur de des mutations et l'intensité de la pression on compare les séquencesnucléotidiques
sa diversification, qui protège les verté- de sélection), on pourrait estimer la taille des différents allèles du CMH, pour un
brés contre les nombreux parasites aux- de la population d'origine. locus donné, puis on calcule les distances
quels ils sont exposés. Cette pression de Supposons que nous ayons identifié génétiques entre ces allèles, et l'on
sélection permet aux lignées alléliques du plusieurs allèles du CMHdans une popula- rechercheensuite l'arbre généalogique cor-
CMH de se maintenir longtemps et d'être tion de taille donnée. Si nous parvenions à respondant.Yoko Satta, à Tübingen, a daté
transmises malgré les spéciations. dresser la généalogie de ces allèles, une les divers embranchements de cet arbre
Comme l'évolution de la diversité du remontée dans le temps montrerait d'abord généalogiqueen remarquant que les muta-
CMH dépend du nombre de géniteurs, on une coalescencede deux allèles, puis celle tions synonymes, sur de longues périodes,
suppose que les populations ont toujours de deux autres, et ainsi de suite jusqu'à ce se produisent dans les allèles du CMHavec
été assez grandes pour assurer la persis- que tous ces allèles convergent en un la régularité d'une horloge, puis en étalon-
tance des allèles, mais nous ignorons la allèle ancestral unique. Imaginons mainte- nant cette horloge à l'aide de fossiles.
taille des populations humaines ances- nant que nous venions d'observer une coa- Grâce à ce travail, on lit directement
trales, notamment lorsque l'espèce lescence et que nous attendions la sui- les dates de coalescence d'allèles sur
humaine est apparue. vante. Le temps d'attente est une variable l'arbre généalogique, ainsi que le nombre
En supposant que les spéciations se aléatoire qui peut théoriquement prendre d'allèles ancestraux ayant existé à tout
font à partir d'un petit nombre d'indivi- n'importe quelle valeur entre zéro et moment du passé. Connaissant le nombre
dus, on explique bien l'apparition des l'infini ; en réalité, certains temps d'attente d'allèles actuels du gène DRB1 du CMH,
espèces insulaires. Cependant ce cas est sont plus probables que d'autres, et l'on nous avons estimé que la population
particulier ; on ne dispose généralement estime leur probabilité à partir de la taille humaine comptait près de 100 000 indi-
d'aucune information directe sur la taille de la population et du nombre d'allèles vidus il y a 500 000 ans. Avec d'autres
des populations à l'origine des espèces. ancestraux (plus ce nombre est grand, plus locus du CMH humain, on aboutit à des
Le polymorphisme des gènes du CMHper- la coalescence est rapide). Inversement, estimations similaires, et l'étude d'autres
met d'étudier indirectement la spéciation : quand on connaît le moment de la coales- espèces de primates, où le polymor-
si l'on connaissait le nombre d'allèles du cence et le nombre d'allèles ancestraux, on phisme du CMHest connu, indique égale-
CMH qu'une espèce fille a hérités d'une estime l'effectif de la population d'origine. ment des effectifs ancestraux notables.
Les «goulets
d'étranglement »
Toutefois ces estimations n'excluent
pas la possibilité d'un effondrement
occasionnel de la taille des populations,
par exemple à la suite d'épidémies ou de
famines. De tels bouleversements démo-
graphiques auraient produit des « goulets
d'étranglement » génétiques ne permet-
tant la transmission que d'un nombre res-
treint d'allèles. Les fléaux ne sont cepen-
dant pas les seules causes possibles de
goulets d'étranglement : lorsqu'un petit
groupe d'individus se sépare du reste de
la population, migre vers une autre
région et s'y développe, il peut évoluer
vers une nouvelle espèce.
Le comportement des gènes lors des
goulets d'étranglement est difficile à ana-
lyser mathématiquement, en raison de
l'importance des fluctuations aléatoires,
mais on peut étudier des simulations sur
ordinateur. A partir de 100 000 « indivi-
dus » porteurs de deux gènes chacun,
chaque gène présentant 40 « allèles » de
fréquence égale, l'ordinateur forme au
hasard un groupe de 1 000 gènes (500
individus), déterminant ainsi la première
« génération » du goulet d'étranglement.
À partir de ce groupe, il forme un
deuxième groupe de 1 000 autres gènes
(la deuxième génération), en remplaçant
à chaque fois le gène tiré au hasard par
un gène du même type. Après dix géné-
rations, l'ordinateur compte les allèles
restants et leur fréquence. En répétant
cette simulation, on obtient un échan-
tillon de situations à partir duquel on cal-
cule, pour chaque allèle, la probabilité de
passerle goulet d'étranglement.
On observe alors que l'ensemble des
40 allèles est transmis dans 60 pour cent
des simulations. Cependant, quand le
goulet est très étroit ou quand il persiste
pendant plusieurs générations, la proba-
bilité de transmission des 40 allèles
devient si faible que le polymorphisme
est perdu. Ces simulations révèlent donc
que la population originelle d'une espèce
ne peut pas compter moins de 500 géni-
teurs. En réalité, la taille minimale est
probablement bien supérieure, car nos
simulations conduisaient à une sous-esti-
mation : nous n'avons pris en compte que
les allèles d'un seul locus, et uniquement
ceux qui diffèrent dans la région PBR.
Ces estimations contredisent l'hypo-
thèse du développement des espèces à
partir de petites populations, où les fluc-
tuations aléatoires de la fréquence des
gènes amplifient les effets de la sélection
naturelle. Le polymorphisme du CMH
montre que les populations humaines
modernes ne sont pas issues d'un seul
individu (hypothèse de l'Eve originelle).

LES SUBDIVISIONS DES ARBRES GÉNÉALOGIQUES

Un polymorphisme transspécifique apparaît lorsqu'on diffère de son équivalent chez le chimpanzé. Si l'on convertit
compare le locus CMH-DRB1 de l'homme (HLA) et du ces différences en distances génétiques et qu'on les repré-
chimpanzé (Patr). Dans chaque espèce, deux allèles ont été sente, grâce à un algorithme, sous forme d'arbre généalogi-
comparés ; les allèles humains diffèrent plus entre eux (les que (en bas, a découvre
gauche), on que
ontles allèles
barres verticales, en haut, représentent les nucléotibes qui divergé bien avant la séparation de l'homme et du chimpanzé
diffèrent d'une séquence à l'autre) que chacun d'eux ne (en bas, à droite).
 En 1987, Rebecca Cann, de
l'Université de Berkeley, a publié les
résultats de son étude de l'ADN mitochon-
drial dans plusieurs populations humaines.
Son analyse ne fut ni la première ni la der-
nière de ce type, mais elle eut un grand
succèsen raison du terme « Èvemitochon-
driale», employé par l'auteur, qui fit
croire à beaucoup que tous les hommes
modernes étaient issus d'un seul individu.
En réalité, cette étude ne démontrait rien
de tel : elle montrait seulement-bien que
ce résultat soit également contesté-que
toutes les molécules d'ADN présentes dans
les mitochondries humaines actuelles pro-
viennent d'une molécule ancestrale que
portait une femme ayant vécu il y a
quelque 200 000 ans.
Cette conclusion, si elle était exacte,
ne signifierait pas que tous les êtres
humains sont issus d'un ancêtre unique
qui vivait il y a 200 000 ans ; elle indi-
querait seulement que tous les « allèles »
actuels de l'ADN mitochondrial provien-
nent d'une seule molécule ancestrale qui
existait à cette époque. Cependant,
comme l'ADN mitochondrial se transmet
en un seul bloc, on peut l'assimiler à l'un
des quelque 40 000 gènes humains, dont
on peut, en théorie, retrouver le gène
ancestral. Ces gènes ont existé à diffé-
rentes époques du passé. Les gènes du
CMH, nous l'avons vu, proviendraient de
gènes ancestraux ayant existé il y a plus
de 65 millions d'années.
L'expression «Ève mitochondriale» a
souvent fait raisonner en termes de
généalogie d'individus, ce qui est faux,
plutôt qu'en termes de généalogie de
gènes. Pourtant les résultats de R. Cann
et de ses collègues ne contredisent pas les
données concernant le CMH, pas plus
qu'ils ne démontrent l'existence d'un
goulet d'étranglement dans l'évolution
de l'espèce humaine.
L'étude du polymorphisme du CMH
révèle que, jadis, la lignée des hominidés
s'est séparée en au moins deux popula-
tions, dont l'une a produit l'Homo
sapiens moderne. La population dont
nous descendons comprenait au moins
500 géniteurs-en fait, elle en comptait
sans doute 10 000-, qui portaient déjà la
plupart des allèles et des lignées allé-
liques du CMH aujourd'hui présents dans
la population humaine. Si la population
ancestrale s'est scindée en plusieurs
petits groupes, ces derniers n'ont pas été
isolés et ont échangé continuellement des
gènes, préservant ainsi le polymorphisme
du CMH-qui autrement aurait pu dispa-
raître sous l'effet de la fluctuation aléa-
toire de la fréquence des gènes. Ce poly-
morphisme, qui nous protège à présent
3. SI LES ESPECES descendaient chacune d'une petite populaton fondatrice, le polymor-
phisme desdescendantsdevrait être faible. La population simplifiée représentée ici est réduite
au «goulet d'étranglement» que forment deux individus portant quatre allèles sur un seul
locus. Ces deux fondateurs ne transmettent que quatre allèles au maximum à leurs descen-
dants et aux nouvellesespècesqui en seraient issues.Dans le cas représentéici deux allèles
seulement sont transmis (les
disquesreprésentent les gènes,et les couleurs, les allèles).
des infections, est un héritage qui nous a Chez de nombreuses plantes, le pollen
été retransmis à travers d'innombrables déposé sur le stigmate ne peut germer ni
générations depuis 65 millions d'années. se développer dans le style du pistil
quand le pollen et le pistil expriment le
Le processus même allèle du locus d'auto-incompati-
de spéciation bilité. Ce locus comporte plusieurs
dizaines d'allèles.
L'étude du polymorphisme du CMH Thomas loerger, à l'Université de
ne révèle pas uniquement la taille de la l'Illinois, et Andrew Clark et Teh-Hui
population dont provient Homo sapiens. Kao, à l'Université de Pennsylvanie, ont
Elle devrait également indiquer la taille étudié les séquences nucléotidiques de
des tribus colonisatrices, lors des grandes différents allèles chez trois espèces de
migrations humaines qui ont peuplé Solanacées : une espèce de tabac décora-
l'Amérique, l'Australie, la Polynésie ou tif, un pétunia sauvage et une pomme de
le Japon. Plus généralement, le polymor- terre sauvage. Ayant observé que certains
phisme du CMHpermettra de mieux com- allèles d'une même espèce diffèrent
prendre la nature du processus de spécia- davantage entre eux que de leurs homo-
tion. Par exemple, on étudiera si les logues d'une autre espèce, ils ont conclu
changements évolutifs se produisent par que ces lignées alléliques sont apparues
petits à-coups, lors des spéciations (théo- avant la divergence de ces trois espèces,il
rie de l'«équilibre ponctué»), ou bien y a 27 à 36 millions d'années. Par consé-
s'ils ont lieu continuellement, tout au quent, les populations qui sont à l'origine
long de la vie des espèces. On devrait de ces espèces devaient également com-
également apprendre si les nouvelles porter un grand nombre d'individus.
espèces « bourgeonnent » à partir d'une Cette conclusion, très semblable à
espèce ancestrale qui survit à la spécia- celle qui permet de rattacher les allèles
tion, ou bien si les nouvelles espèces du CMH de l'homme et du chimpanzé à
résultent de transformations progressives un ancêtre commun, démontre l'étendue
d'espèces ancestrales qui disparaissent. des applications des études comparatives
D'autres polymorphismes génétiques de la diversité allélique. Ces études per-
pourraient également contribuer à mettent l'analyse de populations ayant
résoudre ces questions. Notamment les vécu il y a des millions d'années ; en
systèmes génétiques qui gouvernent outre, elles pourraient servir de base à
l'auto-incompatibilité chez les plantes une nouvelle discipline : la paléogéné-
présentent un polymorphisme important. tique des populations.
LES EMPREINTES
GÉNÉTIQUES
DES CRIMINELS
L empreinte génétique
permet
l'identification de criminels aussi fré-
quemment, et peut-être plus sûrement
que l'empreinte digitale. Nous pouvons
recourir à la biologie moléculaire dès lors
qu'un criminel laisse du matériel géné-
tique, c'est-à-dire des cellules qui ont un
noyau. Les empreintes génétiques sont
particulièrement utiles pour les viols, car,
dans ce cas, les empreintes digitales sont
rarement exploitables.
Les analyses biologiques sont effec-
tuées à la demande d'une autorité, selon
deux modes de saisine : la réquisition du
procureur de la République ou des
enquêteurs et l'expertise ordonnée par
le juge d'instruction. La fiabilité des résul-
Marie-Hélène Cherpin
tats dépend surtout du soin avec lequel
les échantillons sont prélevés sur le lieu
du crime et transportés jusqu'au labora-
toire sans être contaminés ou dégradés.
Les échantillons sont recueillis à partir
de taches de sang ou de sperme par des
inspecteurs de l'identité judiciaire, formés
aux techniques de prélèvements : ce sont
les « techniciens de la scène du crime » ;
les quantités sont souvent faibles, et l'état
de conservation parfois mauvais. Lorsque
l'indice prélevé est censé être du sang,
nous vérifions d'abord qu'il s'agit bien de
sang, par des réactions chimiques simples,
et que ce sang est humain. Puis nous
déterminons son groupe sanguin (A, B,
AB, ou 0) et son groupe Rhésus (positif
ou négatif). Ces analyses sont rapides et
peu coûteuses ; elles suffsent parfois à
exclure un suspect. Les prélèvements sur
les personnes vivantes (la victime d'un
viol et les suspects) sont effectués par
des personnes du milieu médical.
L'ADN est extrait des noyaux des cel-
lules (des globules blancs du sang ou des
spermatozoïdes). Si on nous demande un
résultat rapide (dans le cas d'une garde à
vue), nous amplifions (par la technique
d'amplification des gènes, dite PCR)les
gènes codant le système HLA (c'est-à-dire
codant les antigènes de surface des glo-
bules blancs) et nous déterminons leur
groupe (A, B, C ou D) ; il nous arrive
ainsi de disculper un suspect. Pour une
identification plus précise, nous analysons
le «polymorphisme de longueur des frag-
ments de restriction» (RFLP).
Le principe de cette technique
repose sur l'existence, dans la molécule
d'ADN, de régions non codantes formées
par la répétition d'une séquence nucléoti-
dique particulière, en un nombre d'exem-
plaires qui varie selon les individus.
Chacun de nous possède deux versions
(ou allèles) de ces portions d'ADN ; ces
allèles, hérités des parents, ne contien-
nent pas le même nombre de séquences
répétitives (polymorphisme) et sont donc
de longueurs différentes. Deux êtres
humains, qui ne sont pas jumeaux homo-
zygotes, n'ont pratiquement aucune
chance d'avoir les mêmes empreintes
génétiques pour l'ensemble des
séquences testées. La spécificité de ces
Ces empreintes génétiques visent à
identifier l'auteur d'un viol. Les gra-
duations indiquent la longueur des
fragments d'ADN, en icilobases (kb), du
plus long (en haut) ou plus court (en
bas). Les colonnes 2, 6 et 10 contien-
nent des marqueurs de tailles. Les
autres colonnes comportent des
échantillons d'ADN différents : un ADN
témoin dans la première colonne, l'ADN
du sang de la victime dans les colonnes
3 et 8, un mélange de deux ADN (celui
de la victime et celui de son agresseur)
provenant de prélèvements vaginaux
de la victime dans les colonnes 4 et S,
et l'ADN du sang du suspect dans la
colonne 7. Parmi les quatre bandes
observées dans le prélèvement vaginal,
on reconnaît les deux allèles de la vic-
time par comparaison avec son sang ;
les deux outres allèles sont comparés à
ceux du suspect, qui sont identiques.
Les soupçons se confirment. (Cliché
fourni par P. Fannardjan, ingénieur de
la Police scientifique).
 séquences répétitives constitue le fonde-
ment de nos examens.
Avant toute analyse de RFLP,nous
vérifions la qualité de l'ADN : si l'ADN est
dégradé, c'est-à-dire fractionné par des
micro-organismes ou divers facteurs phy-
siques (soleil) ou chimiques (détergents),
nous ne pouvons rien conclure sur les
longueurs des fragments. En revanche, si
l'échantillon est de bonne qualité, nous
fragmentons !'ADN grâce à une enzyme
de restriction, qui coupe la molécule en
des régions spécifiques.
Nous séparons ces fragments en
fonction de leur longueur, par électro-
phorèse. Ces fragments d'ADN sont
ensuite dénaturés et fixés sur une mem-
brane de nylon. On ajoute alors une
sonde spécifique : un brin d'ADN de
séquence connue, marqué par un éié-
ment radioactif ; la sonde s'hybride aux
segments d'ADN complémentaires. Une
autoradiographie révèle la position des
fragments qui incluent la séquence son-
dée. Si la sonde est «monolocus»,c'est-
à-dire si elle s'hybride à une séquence
présente en un site unique, on obtient,
sur un film photographique, deux bandes
au plus (les deux allèles). Nous compa-
rons ensuite les deux bandes du suspect
aux deux bandes du criminel.
La première méthode d'empreinte
génétique, mise au point en 1987 par
l'Anglais A. Jeffreys, utilisait des sondes
multilocus, dont la séquence correspond
à plusieurs sites ; on obtenait une multi-
tude de bandes. Les scientifiques préfè-
rent aujourd'hui les sondes monolocus :
L'HÉRITAGE GÉNÉTIQUE
DE L'ITALIE ANTIQUE
L'Italie est
un creuset de cultures dif-
férentes, résultant de mouvements de
populations aux origines très diverses.
Nous avons examiné l'histoire de l'identité
italienne à travers un point de vue original :
celui de la structure génétique. Cette
étude a été réalisée au sein du départe-
ment de génétique, de biologie et de chi-
mie médicale de l'Université de Turin, et
elle a confirmé combien l'empreinte géné-
tique est liée à l'histoired'un peuple, carac-
térisée notamment par la langue.
les résultats sont plus faciles à interpréter,
notamment en cas de mélange de maté-
riels génétiques (viol par exemple). Les
techniques évoluent au rythme des pro-
grès de la génétique moléculaire. Ainsi
l'amplification des génes est un outil inté-
ressant lorsque l'on a peu de matériel :
on a obtenu des empreintes génétiques
à partir de quelques cellules de la bouche
relevées sur des mégots. Les prochains
progrès du séquençage procureront
encore de nouvelles possibilités.
La méthode monolocus est utilisée en
France depuis 1990 ; les laboratoires de
police français ont ainsi traité quelque
600 cas, entre 1991 et 1993. Nous réali-
sons plusieurs empreintes génétiques sur
une même plaque d'électrophorèse : I'ADN
du criminel et celui des suspects subissent
les mêmes opérations, ce qui facilite la
comparaison ; un ADNtémoin connu per-
met de vérifier le bon déroulement de
l'analyse; des marqueurs de tailles servent
à étalonner les empreintes : ce sont des
segments d'ADN de longueurs connues,
marqués radioactivement, permettant de
relier la taille d'un fragment à sa distance
de migration lors de l'électrophorèse.
La probabilité pour que deux per-
sonnes prises au hasard possèdent un
allèle de même longueur est calculée à
partir d'études statistiques d'apparition
de ces allèles dans la population mon-
diale : cette probabilité est d'un million-
nième. Lors d'une identification, nous
employons en moyenne cinq sondes
successives,de façon à comparer environ
dix allèles du suspect avec ceux du crimi-
Alberto Piazza
Avant d'évoquer des différences
génétiques entre individus ou entre
populations, il convient de faire table
rase des préjugés. Si nous examinons les
patrimoines génétiques de deux individus
choisis au hasard, nous constatons, de
manière quasi certaine, qu'ils sont diffé-
rents. Dans le monde biologique, la
diversité constitue la règle et l'uniformité
l'exception. Par conséquent, la distinction
de « races » est un préjugé culturel, sans
fondement biologique. Nous distinguons
nel. Trouver deux individus de même
profil d'ADN devient alors fort impro-
bable (un cas sur un nombre supérieur à
la population mondiale).
Toutefois nous n'interprétons jamais
nos résultats : désigner un coupable n'est
pas notre rôle. Un tribunal peut rejeter
une expertise dans le cas, par exemple,
d'un décalage (band shift) entre
l'empreinte du criminel et celle de
l'accusé. Nous tentons d'éviter ces déca-
lages, propres à la technique d'électro-
phorèse, en traitant dans les mêmes
conditions et au même moment les
deux ADN du criminel et du suspect.
La réalisation, par cette technique, de
fichiers d'empreintes génétiques souffre
d'une incertitude quand les échantillons ne
sont pas étudiés simultanément. Les
Anglais produisent des bases de données
pour comparer à tout moment les
empreintes génétiques enregistrées à
celles d'un criminel ; ils introduisent des
barres d'erreur autour de la bande à ana-
lyser (plus ou moins trois pour cent).
Néanmoins, la création d'un tel fichier sys-
tématique représente un gros investisse-
ment, sansdoute disproportionné par rap-
port aux résultats attendus. À mon avis, la
seule manière de fabriquer un fichier fiable
sera d'utiliser le séquençage du génome ;
la question est donc prématurée, car le
génome n'est pas entièrement exploré.
Quand cela sera, il faudra ouvrir un nou-
veau débat éthique, politique et juridique.
Marie-HélèneCHERPIN coordonne
les laboratoires de la Police scientifique.
les personnes selon leurs caractères
visibles : la couleur de peau, la forme et
la dimension du visage, la stature, etc.,
qui constituent les caractères anthropo-
métriques ; or les gènes qui déterminent
ces caractères représentent une propor-
tion dérisoire de l'ensemble des gènes
d'une personne. En outre, les caractères
anthropométriques dépendent de l'envi-
ronnement et, par conséquent, varient
plus selon la géographie que selon l'his-
toire d'un peuple.
Nous avons choisi d'étudier un
caractère invisible tel que le groupe san-
guin, de manière à éviter tout préjugé
culturel. Toutefois, la fréquence d'un
groupe sanguin, de même que les carac-
tères anthropométriques, peut être
influencée par des facteurs de l'environ-
nement tels que le climat ou la propaga-
tion d'une maladie. Ces facteurs « sélec-
tifs » n'ont pas le même effet sur tous les
 1. Carte tricolore de la répartition, en Italie, des gènes cor-
respondant aux groupes sanguins et tissulaires (ABO, Rhésus,
MNS, Kell, HP, HLA, soit 40 allèles). Lo première composante
principale extraite de ces données apparaît en vert, la
deuxième en bleu, et la troisième en rouge.
2. Carte des principales langues parlées en Italie à la fin du
VIe siècle avant notre ère. Les zones plus sombres correspon-
dent aux régions où la colonisation grecque était particuliè-
rement importante. On retrouve une structure similaire
pour les dialectes régionaux.

gènes ; par conséquent, nous pouvons
réduire l'effet de l'environnement, en
étudiant un grand nombre de gènes.
Nous avons réuni des données sur un
ensemble de 40 allèles (diverses formes
d'un gène) correspondant aux groupes
sanguinsABC et Rhésus,ainsi qu'aux sys-
tèmes MNS,Kell, HP et HLA.Ces données
ont été recensées depuis les années
1960, et elles ne portent que sur des
individus résidant au même endroit
depuis au moins deux générations. À
notre grande satisfaction, la variabilité
génétique observée reflète l'histoire des
diverses populations qui se sont succédé
en Italie.
Comment
analyser en même temps
la variabilité de nombreux gènes ? Une
méthode statistique, appelée « analyseen
composantes principales», permet de
réduire le nombre de variables d'un
ensemble de données pour n'en extraire
que les caractéristiques essentielles.
Nous avons ainsi isolé trois composantes
principales des fréquences géniques et,
par un procédé d'interpolation, nous en
avons déterminé les valeurs sur un
réseau dense, de manière à reconstituer
une image détaillée de l'Italie. Nous
avons associé une couleur à chaque
composante principale : le vert pour la
première, le bleu pour la deuxième et le
rouge pour la troisième. L'intensité d'une
couleur quantifie la composante princi-
pale associée. Puis nous avons superposé
les trois cartes correspondantes, de
manière à restituer sur une carte unique
la distribution des 40 gènes étudiés.
Nous n'avons pas pris en compte la
Sardaigne : si nous avions inclus les don-
nées concernant la Sardaigne, celle-ci
aurait une couleur intense et l'Italie conti-
nentale, une coloration pâle et uniforme,
tant les composantes génétiques sont
différentes. En fait, la Sardaigne mérite
d'être étudiée séparément.
La carte tricolore de l'ltalie montre
clairement une variation continue des
fréquences géniques le long de l'axe
Nord-Sud, et donc une différenciation
graduelle, selon cette direction, des
40 gènes examinés. De nombreux évé-
nements peuvent avoir contribué à cette
différenciation. Les plus récents, et non
les moindres, sont les migrations inté-
rieures d'après-guerre.
On décèle une modification des fré-
quences géniques après une période
équivalant à une génération (20 ans envi-
ron). Toutefois, excepté si une popula-
tion subit un génocide tel que celui des
Indiens d'Amérique, ces altérations de
fréquences géniques ont un effet
durable. Elles s'accompagnent d'une
croissance démographique, qui n'est
mesurable qu'après de nombreuses
générations. Une simulation de la distri-
bution des fréquences géniques en
Europe a montré que le flux de gènes
introduit par les migrations anciennes
laisse une trace visible après des millé-
naires (un millénaire, 50 générations
environ, est un intervalle de temps court
comparé à l'évolution de l'espèce
humaine).
Nous interprétons la variation des
fréquences géniques le long de l'axe
Nord-Sud par l'influence génétique de la
Grande Grèce sur l'histoire de l'ltalie.
Cette hypothèse est confirmée par la
répartition des fréquences géniques des
populations européennes actuelles : les
régions méridionales sont génétiquement
plus proches de la population grecque
que ne le sont les régions d'ltalie septen-
trionale et centrale.
Notre interprétation est renforcée
par l'estimation du nombre de colons
grecs installés en Italie, et de leur rapport
au nombre de colonisés. Selon les histo-
riens démographes, la Grèce atteignait le
million d'habitants à la fin de l'Age du
bronze (il y a 3 000 ans), ce qui repré-
sente une densité moyenne trois fois
plus élevée que dans le reste de
l'Europe. Entre I 000 et 400 avant J.-C.,
alors que la population européenne pas-
sait de 10 à 20 millions, la population de
la Grèce triplait : elle atteignait trois mil-
lions. La population de l'Italie était la plus
dense après celle de la Grèce : il y avait
quatre millions d'Italiens en 400 avant
J.-C., dont un million et demi dans les
colonies grecques de Sicile. En supposant
que plus de dix pour cent des colons
grecs étaient réellement d'origine
grecque, nous calculons que, avant la
domination de Rome, un habitant de la
péninsule italienne sur 12 était grec. Les
caractéristiques génétiques grecques se
sont donc vraisemblablement introduites
par l'Italie méridionale.
La
carte tricolore révèle également
une variation génétique qui résulterait
des caractéristiques des Etrusques. La
civilisation étrusque est une composante
très importante de l'histoire de l'ltalie.
L'historien Denys d'Halicarnasse, au
le siècle avant notre ère, situait cette
population dans le Nord du Latium et en
Toscane. Cette hypothèse est confirmée
par la présence d'habitats étrusques dans
cette région. La culture étrusque a suc-
cédé à la culture villanovienne, qui
marque le début de la métallurgie du fer
en Italie (il y a 3 000 ans) et qui se carac-
térise par ses rites funéraires : les villano-
viens incinéraient leurs morts et plaçaient
leurs cendres dans des umes biconiques
qu'ils enterraient.
Les plus anciennes inscriptions
étrusques, dont l'alphabet est proche du
grec, datent du Vlll'siècle avant notre
ère ; en outre, contrairement au latin et
à la plupart des langues italiques,
!'étrusque ne semble pas appartenir aux
langues indo-européennes, introduites en
Europe il y a environ 5 000 ans. Après
leur défaite contre les Grecs à la bataille
de Cumes, en 474 avant J.-C., les
Étrusques comptaient entre 300 000 et
400 000 habitants, soit environ 15 pour
cent des populations non colonisées par
les Grecs.
II est également intéressant d'obser-
ver la similitude génétique entre la
Vénétie et la région du Latium actuel.
Une explication de cette ressemblance
fondée sur des études linguistiques a été
proposée par Giacomo Devoto et, plus
tard, par Aldo Luigi Prosdocimi ; selon
eux, la population vénétique, parvenue
en Italie au cours du deuxième millénaire
avant J.-C., aurait incité les groupes eth-
niques établis dans l'actuelle Vénétie (les
Protolatins) à émigrer vers le Sud, dans
le Latium ; ces derniers seraient les
ancêtres des Latins.
Nous
observons, au Nord de la
carte, une autre composante de la varia-
bilité génétique de l'Italie, que nous
avons appelée «ligure», car elle distingue
la descendance des anciens Ligures des
autres Italiens. La population ligure, pro-
bablement une des plus anciennes
d'Europe occidentale, occupait un terri-
toire beaucoup plus vaste que celui qui
porte aujourd'hui son nom. Elle pourrait
descendre du même groupe « méditerra-
néen» que certaines populations
actuelles du Proche-Orient et du
Caucase, et peut-être même que les
Basques. Malheureusement, nous avons
peu de données sur la langue figure. Son
origine indo-européenne, à mi-chemin
entre le celtique et l'italique, est très
ancienne : elle est antérieure au Vl'siècle
avant notre ère, époque où les Celtes
occupaient ta plaine du Pô. Il pourrait
également exister une composante ligure
en Sicile.
Sous le «pôle» ligure, la carte trico-
lore révèle une zone de couleur claire.
Cette zone correspond à un pôle linguis-
tique appelé «italique oriental», dont les
inscriptions sont parmi les plus anciennes
d'Italie (VIIe siècle avant J.-C.). D'après
des études archéologiques menées au
Picenum, au bord de l'Adriatique, les plus
anciens Italiques d'origine non latine se
seraient installés dans cette région :
d'une part, les Osques auraient occupé la
côte adriatique, puis se seraient dirigés
vers les deux versants des Apennins,
c'est-à-dire vers les actuelles Campanie
et Calabre ; d'autre part, les Ombriens,
d'origine plus récente, ont occupé la
région du même nom.
Les régions habitées par les possibles
descendants des Osques (les Picentes de
la région des Marches), la Campanie et la
Calabre apparaissent sur notre carte,
dans la même nuance de couleur ; les
populations de ces régions pourraient
donc avoir les mêmes ancêtres. Hélas, si
la diffusion de la langue osque en Italie
centrale est bien documentée, nous
ignorons en revanche la taille des popu-
lations qui parlaient cette langue.
À ce
stade de notre analyse,j'espère
avoir convaincu le lecteur que t'ttatie est,
du point de vue génétique, une mosaïque
de groupes ethniques. Toutefois, deux
interrogations demeurent : quels événe-
ments ont conduit à la formation de cette
répartition ? Comment se sont succédé
ces événements ?
La réponse à la première question
est simple. La technique statistique choi-
sie réduit l'influence de l'environnement
car les conditions de vie, au sein de la
péninsule ou à l'intérieur des îles, ne dif-
fèrent pas assez pour déterminer simul-
tanément les nombreux gènes étudiés.
La variabilité génétique observée est
donc certainement le reflet de l'histoire
du peuplement. Des petits groupes eth-
niques se sont succédé dans diverses
régions ; chaque groupe a contribué à la
variabilité des fréquences géniques en
apportant son propre échantillon de
gènes (effet du fondateur et effet de
dérive génétique). À la suite d'une
implantation, des échanges entre les
groupes ont atténué les différences, de
sorte que la variabilité est continue entre
des régions limitrophes.
Quant à la seconde interrogation,
nous n'avons pas assez de connaissances
archéologiques pour dater les mouve-
ments des populations préhistoriques.
Nous sommes cependant convaincus
que la romanisation de l'Italie et de
l'Europe n'a pas notablement modifié la
structure génétique des populations
conquises. La colonisation romaine a,
certes, modifié les systèmes politiques,
administratifs, commerciaux et urbains,
mais elle n'a pas conduit à un génocide
(contrairement à la colonisation euro-
péenne des Aménques).
Ainsi la langue imposée, le latin, ne
s'est pas entièrement substituée aux
autres : chaque région italienne possède
encore son dialecte, qui comporte des
« vestiges »de la langue des ancêtres. Les
dialectes d'origine ocque de l'Italie méri-
dionale se seraient mélangés au latin. Au
contraire, la langue étrusque aurait été si
différente du latin, qu'elle ne pouvait se
mêler à lui : le latin l'aurait alors rempla-
cée, ce qui expliquerait que le toscan (et
donc l'italien) est plus proche du latin
que les autres dialectes. Enfin, les dia-
lectes nord-occidentaux, de l'Émilie-
Romagne au Piémont-en excluant tou-
tefois la Vénétie-, auraient une origine
commune celte et ligure, antérieure à
notre ère.
Ces arguments linguistiques confir-
ment l'hypothèse d'une structure eth-
nique ancienne, à la base de notre inter-
prétation, qu'étayent encore les
nombreuses analogies entre notre carte
tricolore de répartition des gènes et la
carte des langues de l'Italie pr6-romaine.
Alberto PIAZZAest chercheurenseignant
ou départementde génétique,
de biologieet de chimiemédicale
de l'Universitéde Tunn.
Des gènes
L'arbre des apparentements
humaines est analogue à celui
les langues parlées dans le monde.
IL Y A plus de 40 ans, lorsque
j'étudiais la génétique des bac-
téries dans le laboratoire de
Ronald Fisher, à l'Université de
Cambridge, mes collègues
étaient passionnés de modèles mathéma-
tiques. C'est pourquoi je conçus un projet
si ambitieux qu'il paraissait presque fou :
la recherche du berceau des populations
humaines et la reconstitution des voies de
migration par lesquelles elles s'étaient
dispersées sur le Globe, à partir de la
détermination du degré de parenté des
populations actuelles et de l'établisse-
ment d'un arbre généalogique complet.
Ce but est presque atteint. En analy-
sant les données génétiques humaines
accumulées lors des 50 dernières années,
ainsi que des résultats mettant en oeuvre
des techniques génétiques récentes, mes
collègues et moi avons dressé la carte de la
répartition géographique de plusieurs cen-
taines de gènes, et nous en avons déduit
les filiations des populations humaines.
Cet arbre concorde avec un autre arbre
établi sur la base de données génétiques
entièrement différentes, mais pour un
1. ETHNIESEr LANGUES.
et des langues
entre les populations
des relations entre
nombre plus restreint de populations, ainsi
qu'avec un arbre des familles de langue
récemment obtenu. Les gènes, les popula-
tions et les langues semblent avoir simul-
tanément divergé au cours de migrations
qui, probablement à partir de l'Afrique,
auraient gagné l'Asie, puis l'Europe, le
Nouveau Monde et le Pacifique.
Pour déterminer l'histoire des popu-
lations humaines à partir de leur arbre
généalogique, on admet que la différence
(ou distance) génétique entre deux popu-
lations est d'autant plus grande que leur
séparation est plus ancienne (en suppo-
sant que toutes les autres forces évolu-
tives sont égales par ailleurs).
Les hommes sont parfois classés en
groupes ethniques, ou « races »(bien que
ce terme ait une connotation détestable en
insinuant une hiérarchie raciale), mais on
trouve difficilement une définition précise
de ces groupes ethniques, car ces derniers
évoluent et se chevauchent parfois.
Heureusement la classification des langues
nous aide à retrouver leurs relations.
Durant la majeure partie de sa préhis-
toire et de son histoire, l'espèce humaine
Luigi Luca Cavalli-Sforza
était organisée en tribus, c'est-à-dire en
groupes de personnes étroitement appa-
rentées ; ces affiliations tribales sont
encore très importantes dans les sociétés
traditionnelles. Comme il existe une cor-
respondance étroite entre affiliation tri-
bale et affiliation linguistique, les langues
permettent d'identifier les tribus ; ensuite
on établit une classification approxima-
tive des populations.
La situation est plus complexe dans les
sociétés urbaines. Aussi, pour simplifier
notre étude, nous ne nous sommes intéres-
sés qu'aux populations indigènes, c'est-à-
dire celles qui étaient déjà présentes sur
leur territoire actuel avant les grandes
migrations qui ont suivi les explorations de
la Renaissance. Les distances génétiques
entre les populations actuelles ne peuvent
être calculées sur la base de la seule pré-
sence ou absencede caractèresgénétiques,
car chaque population possède presque
tout le répertoire des gènes existants. Ce
qui différencie les populations, c'est la fré-
quence observéedes divers gènes.
Le facteur Rhésus
Ce phénomène apparaît nettement
dans le cas du facteur Rhésus (Rh), cet
antigène des globules rouges du sang
humain qui existe sous deux formes (posi-
tive ou négative). Ce caractère est déter-
miné par un seul gène et, pour des raisons
 de santé publique, il a été étudié dans des
milliers de populations : les médecins doi-
vent identifier les femmes Rhésus négatif
et dont le foetus est Rhésus positif, afin de
leur administrer, immédiatement après
l'accouchement, un traitement immunolo-
gique qui prévient la formation par l'orga-
nisme maternel d'anticorps qui agiraient
contre les enfants qui seraient conçus ulté-
rieurement. Le gène de l'antigène Rhésus
négatif estfréquent en Europe, plus rare en
Afrique et en Asie de l'Ouest, et presque
absent en Asie de l'Est et chez les popula-
tions indigènes d'Amérique et d'Australie.
On estime l'apparentement entre
deux groupes ethniques en soustrayant les
pourcentages d'individus Rhésus négatif
de ces deux groupes : par exemple, les
Anglais (16 pour cent d'individus Rhésus
négatif) diffèrent des Basques (25 pour
cent) de 9 pour cent, et des Asiatiques de
l'Est de 16 pour cent : la différence supé-
rieure, dans le second cas, correspond
probablement à une séparation antérieure.
En pratique, les généticiens effectuent
des opérations un peu plus complexes
que la soustraction afin d'obtenir des dis-
tances génétiques qui reflètent au mieux
l'histoire évolutive des populations.
Quand une même population est scindée
en plusieurs groupes qui sont totalement
isolés les uns des autres, par exemple, ces
groupes se différencient génétiquement
même en l'absence de mutations et de
sélection naturelle : le hasard seul modi-
fie leurs fréquences géniques par un
mécanisme de «dérive génétique».
En l'absence de forces évolutives
particulières, la distance génétique entre
deux populations augmente régulière-
ment au cours du temps : elle est d'autant
plus grande que la divergence entre ces
populations est plus ancienne. Les dis-
tances génétiques peuvent-elles alors être
une sorte d'horloge qui daterait les évé-
nements de l'histoire humaine ?
Difficilement, car des analyses statis-
tiques montrent qu'un seul gène (tel le
gène Rhésus) est insuffisant pour fournir
une chronologie précise. Pour déterminer
les distances génétiques, on doit calculer
des moyennes sur de nombreux gènes et,
idéalement, on devrait comparer les
résultats obtenus à ceux qui provien-
draient d'autres ensembles de gènes. Fort
heureusement, on connaît des milliers de
gènes, bien que peu d'entre eux aient été
étudiés dans de nombreuses populations.
Les distances génétiques conduisent à
plusieurs types d'arbres généalogiques. Il
y a 27 ans, Anthony Edwards, de
Cambridge, et moi avons publié un arbre
qui reliait 15 populations en nous fondant
sur le principe du « chemin génétique
minimal ». Comme l'indique le nom de ce
principe, dû à A. Edwards, l'arbre établi
est celui dont la longueur totale des
branches est minimale. Lorsqu'on le pro-
jette sur une carte du monde afin que ses
extrémités soient situées sur les habitats
actuels des populations, cet arbre corres-
pond à peu près aux migrations anciennes
reconstituées par les anthropologues.
On ignore si le chemin génétique
minimal est la meilleure méthode pour
construire un arbre à partir des données
génétiques. D'autres méthodes pourraient
donner des longueurs de branches plus
proportionnelles au temps écoulé et pro-
curer ainsi une meilleure estimation des
dates de séparation des divers groupes.
On définit la racine de l'arbre reliant les
populations à un groupe extérieur, par
exemple au groupe des chimpanzés, dont
l'espèce humaine semble s'être séparée il
y a cinq à sept millions d'années. Si l'on
admet que la vitesse d'évolution est iden-
tique sur les différentes branches, leur
longueur pourrait être proportionnelle au
temps écoulé depuis leur individualisa-
tion. Cependant de tels arbres sont erro-
nés si toutes les branches n'ont pas évo-
lué à la même vitesse.
Les vitesses d'évolution
On minimise les erreurs en utilisant
des modèles mathématiques qui permet-
tent d'estimer les vitesses d'évolution. Le
modèle d'évolution que nous avons uti-
lisé est le plus simple : il postule que
deux branches évoluent à la même vitesse
quand la dérive génétique est la princi-
pale force évolutive et quand les popula-
tions ont la même taille en moyenne. La
première hypothèse a été démontrée par
plusieurs observations indépendantes, et
la secondeest rendue probable lorsqu'on
choisit les populations de façon adéquate.
Les vitesses d'évolution ont des chances
d'être constantes pour les grandes popu-
lations vivant sur de vastes territoires
depuis leur installation originale.
Avec Paolo Menozzi, de Parme, et
Alberto Piazza, de Turin, j'ai établi une
méthode d'analyse commune de l'histoire
et de la géographie des gènes humains.
Durant 12 ans, nous avons analysé les
données génétiques accumulées au cours
des 50 dernières années sur plus de 100
caractères génétiques différents, prove-
nant d'environ 3 000 échantillons issus
de 1 800 populations ; la plupart de ces
échantillons comportaient des centaines
ou des milliers d'individus. Ces données
(que nous nommons l'« ensemble clas-
sique ») sont dérivées des protéines, les
produits des gènes.
Nous avons comparé ces données à
un second ensemble : des données molé-
culaires sur les séquences nucléotidiques
de l'ADN, c'est-à-dire les gènes eux-
mêmes (et non les caractères génétiques
exprimés par les individus). La plupart de
ces données moléculaires ont été collec-
tées durant sept ans par mes collègues de
l'Université de Stanford et par l'équipe
de Kenneth et de Judith Kidd, de
l'Université Yale. La qualité des nou-
velles données est supérieure à celle de
l'ensemble classique, mais elles provien-
nent de 100 fois moins de populations.
Néanmoins, chaque fois que nous avons
pu les comparer, ces données molécu-
laires concordaient parfaitement avec les
données de l'ensemble classique.
Un berceau africain
Notre premier résultat confirme
l'étude des fossiles et des vestiges cultu-
rels humains : l'Afrique fut le berceau de
l'espèce humaine. En effet, les distances
génétiques entre les Africains et les non-
Africains sont les plus grandes de toutes,
ce qui se comprend si la divergence afri-
caine a été la première et la plus ancienne.
La distance génétique entre les
Africains et les non-Africains est environ
le double de la distance entre les
Australiens et les Asiatiques, qui est elle-
même plus de deux fois supérieure à la
distance entre les Européens et les
Asiatiques. Les paléo-anthropologues ont
déterminé des dates de séparation de ces
2. CETTECARTEmontre que le facteur Rhésus négatif est le plus fréquent dans la popula- logues s'accordent sur l'origine africaine
tion basque et de moinsen moins fréquent vers l'Est. Par conséquent, les Basques auraient du genre Homo, il y a 2, 5 millions
conservéles caractèresd'une population européenne primitive, qui se serait ultérieurement d'années, et si les fossiles découverts mon-
mélangéeaux immigrants d'origine asiatique.
diverses populations qui sont proportion- du nombre de mutations et non plus à
nelles aux distances génétiques : les partir des fréquences des gènes.
Asiatiques se sont séparés des Africains L'utilisation d'une horloge mitochon-
il y a 100 000 ans, les Australiens des driale, correspondant au nombre de muta-
Asiatiques il y a 50 000 ans, et les tions qui se sont accumulées dans les
Européens des Asiatiques il y a entre gènes mitochondriaux et non aux varia-
35 000 et 40 000 ans. Dans ces exemples, tions des fréquences géniques, impose le
les distances génétiques sont des hor- recours à des hypothèses différentes de
loges biologiques admissibles. celles que nous avons considérées.
Allan Wilson et ses collègues de Notamment l'équipe d'A. Wilson a sup-
l'Université de Berkeley ont daté l'arbre posé que les mutations des gènes mito-
humain à partir de données génétiques chondriaux se produisent à des fréquences
différentes des nôtres, et leurs résultats constantes au cours du temps. La racine
ont confirmé les nôtres. L'équipe de de l'«arbre mitochondrial» est plus facile
Berkeley a étudié les quelques gènes qui à dater que celle de l'«arbre nucléaire» : il
sont codés par l'ADN mitochondrial (les suffit de comparer cet arbre à un groupe
mitochondries sont les organites cellu- extérieur-celui des chimpanzés, dans
laires qui produisent l'énergie cellulaire). l'étude d'A. Wilson-qui s'est séparé à
À Stanford,
nous avions aussi commencé une date approximativement connue.
à étudier les gènes mitochondriaux, mais
nos méthodes étaient moins précises. L'Ève africaine
L'hérédité mitochondriale est parti-
culière. Alors que chaque individu reçoit L'arbre mitonchondrial établi à
autant de gènes nucléaires de son père Berkeley présente une plus grande diffé-
que de sa mère, les gènes mitochondriaux renciation en Afrique que partout ailleurs :
sont transmis presque exclusivement par par conséquent, ce serait en Afrique que
la mère : cette transmission quasi unilaté- l'ADN mitochondrial humain aurait évolué
rale simplifie le calcul des distances le plus longtemps. On a même fait remon-
génétiques. En outre, les mutations des ter cet ADN mitochondrial à une seule
gènes mitochondriaux sont beaucoup femme, I'« Ève »africaine, mais nous ver-
plus fréquentes que les mutations des rons plus loin que ce terme est inappro-
gènes nucléaires, de sorte que l'on peut prié. En comparant l'ADN mitochondrial
calculer les distances génétiques à partir humain à celui des chimpanzés, les géné-
ticiens ont daté la racine de cet arbre, puis
estimé la date de divergence des divers
embranchements ; en outre, ils ont estimé
que l'ancêtre africaine avait vécu il y a
150 000 à 200 000 ans, ce qui confirmait
nos résultats, obtenus par une approche
très différente. Depuis, cette datation a été
révisée, mais elle reste antérieure à la date
que nous avons estimée pour la diver-
gence des populations africaine et asia-
tique, il y a 100 000 ans environ. Il est
logique qu'elle soit antérieure, car les
deux dates sont celles d'événements diffé-
rents : l'un est la naissance d'une femme,
et l'autre la scission d'une population à
laquelle appartenait cette femme.
Cependant une équivoque est née de
l'emploi du nom d'« Ève » pour désigner
l'ancêtre d'où nous tirons notre ADN
mitochondrial : rien ne prouve qu'il y ait
jamais eu une époque où une seule
femme vivait sur la Terre ; de nom-
breuses autres femmes vivaient à la
même époque, mais leurs gènes mito-
chondriaux auraient disparu.
Certaines des conclusions précédentes
sont controversées. Si les paléo-anthropo-
trent que l'Homo sapiens, d'anatomie sem-
blable à la nôtre, est apparu en Afrique, ou
à proximité, il y a 100 000 ans environ,
tous les spécialistesn'adoptent pas la théo-
rie d'un exode à partir de l'Afrique ; cer-
tains avancent que l'Homme moderne est
apparu bien plus tôt et simultanément dans
plusieurs populations de l'ancien monde.
Les migrations humaines
Les études de génétique des popula-
tions nous informent sur l'histoire des
migrations et sur l'origine des populations
actuelles. La confrontation de nos résultats
avec ceux des linguistes est prometteuse.
En général, les migrations résultent
des changements de l'environnement qui
sont soit des contraintes, soit des opportu-
nités. À plusieurs reprises, les popula-
tions d'hominidés, puis d'êtres humains
se sont développées-probablement après
des progrès culturels-et ont alors colo-
nisé de nouveaux territoires. Les vestiges
archéologiques (des ossements et des
outils de pierre, essentiellement) sem-
blent confirmer que le berceau des homi-
nidés était l'Afrique ; de là, les hominidés
auraient migré, probablement il y a un
million d'années, vers l'Asie, via l'isthme
de Suez, puis de l'Asie vers l'Europe.
La reconstitution de l'étape suivante
est plus difficile parce que les résultats
dépendent de l'époque à laquelle on
considère que l'Homme moderne est
apparu. Cette apparition est incontesta-
blement antérieure aux premières migra-
tions de l'Asie vers le continent améri-
cain, migrations qui n'ont pu se produire
que lorsque le détroit de Béring s'est

3. LES GÈNES ET LES PIERRES racontent la même histoire. Le pre-génétiques plus récentes révèlent deux voies de migration de
mier arbre génétique établi (en rouge) a été projeté sur une carte l'Afrique vers l'Asie (les flèchesjaunes) ; toutefois certains trajets
du monde, de sorte que sesextrémitéssoient situéessur les habitats restent encore mal connus. On a indiqué, à côté de ces voies de
actuels des populations indigènes (les points rouges). Des études migration, les dates des premières colonisations.

4. AU COURS DU TEMPS, les populations subissent une différencia-sur ordinateur (à droite). Lorsque les deux moitiés d'une population
tion génétique, comme celle qui figure dans cet arbre généalogique se séparent, elles ont des fréquences géniques égales, mais le temps
d'une famille ethnique (à gauche). Cette dérive génétique est simuléeet le hasard modifient parfois ces fréquences dans des sens opposés.
 asséché et que le climat s'est adouci.
Quant à la colonisation de l'Australie et
des îles du Pacifique, elle doit être assez
récente, puisqu'elle n'eut lieu qu'après la
découverte de la navigation maritime.
L'Australie semble avoir été colonisée
par des groupes venant d'Asie du Sud-
Est, il y a 40 000 à 60 000 ans. Le peuple-
ment du continent américain est plus diffi-
cile à dater : en Alaska, le premier vestige
connu de présence humaine remonte à
près de 15 000 ans, alors qu'en Amérique
du Sud l'occupation humaine semble plus
ancienne (entre 15 000 et 35 000 ans). Les
résultats de nos études génétiques indi-
quent que la colonisation de l'Amérique
date de 30 000 ans environ.
L'Europe, enfin, fut balayée par de
nombreuses vagues migratoires, mais les
vestiges des premières occupations ont
subsisté. En 1954, à Londres, Arthur
Mourant réalisa l'une des premières
études de la géographie des gènes en pro-
posant que les Basques étaient les plus
anciens habitants d'Europe, qui auraient
conservé une partie de leur constitution
génétique primitive malgré leurs contacts
avec les immigrants ultérieurs. Cette
hypothèse se fondait sur les analyses du
gène Rhésus négatif, qui est beaucoup
plus fréquent chez les Basques que chez
tout autre population dans le monde.
Cette théorie fut confirmée par des ana-
lyses d'autres gènes et par des études lin-
guistiques : la langue basque differe nota-
blement des langues des peuples voisins.
L'analyse des variations génétiquesen
Europe a permis d'élaborer un modèle de
la colonisation de l'Europe : les premiers
agriculteurs du néolithique, venus du
Moyen-Orient, apportèrenten Europe leurs
gènes, leur culture et leurs langues indo-
européennespar un processusd'expansion.
Les ancêtres des Basques, à l'extrémité de
ce chemin migratoire, se mélangèrent peu
aux nouveaux immigrants.
Cependant, l'analyse génétique des
populations ne permet de reconstituer
que les migrations qui ont eu un impact
génétique décelable. Ainsi, avant les
Portugais et les Espagnols, les Vikings
ont établi de brèves colonies en
Amérique, mais leur contribution géné-
tique locale n'a pas été déterminée.

La concordance
des arbres génétique
et linguistique

Ayant observé une étonnante corres-

pondance entre la répartition des gènes et
celle des langues, nous avons cherché des
cas où une langue ou une famille de
 langues permettait d'identifier une popu-
lation génétique. Par exemple, les
quelque 400 langues de la famille ban-
toue, au centre et au Sud de l'Afrique,
correspondent étroitement aux frontières
tribales et aux affiliations génétiques de
ces tribus. Joseph Greenberg, à
l'Université Stanford, a proposé une
explication de cette correspondance dans
les années 1950, et il a convaincu la plu-
part des spécialistes. Les langues ban-
toues dériveraient d'une seule langue ou
d'un petit nombre de dialectes très
proches, parlés par les premiers agricul-
teurs de l'Est du Nigeria et du Cameroun.
Quand ces agriculteurs ont ensuite migré
vers l'Afrique centrale et vers le Sud de
l'Afrique, il y a 3 000 ans ou plus, leurs
langues ont divergé sans toutefois oblité-
rer leur origine commune. Comme cette
explication vaut aussi pour leurs gènes, le
mot bantou-qui désignait initialement
une famille linguistique-est aujourd'hui
également appliqué au groupe génétique.
En 1988, nous avons publié un arbre
représentant l'apparentement génétique
et linguistique de 42 populations du
Globe : la correspondance entre les grou-
pements génétiques et linguistiques de
ces populations est flagrante. À de rares
exceptions près, les familles linguistiques
semblent d'origine récente dans cet arbre.
En outre, deux équipes de linguistes ont
regroupé les familles de langues en
« superfamilles » qui s'accordent avec nos
résultats génétiques. Ainsi se trouve véri-
fiée une conjecture proposée par Darwin,
en 1859, dans son fameux ouvrage De
l'origine des espèces au moyen de la
sélection naturelle : on peut prévoir
l'évolution linguistique des populations à
partir de leur arbre génétique.
Pourquoi les évolutions linguistique
et génétique sont-elles si parallèles ? La
réponse est dans l'histoire des popula-
tions et non dans la génétique, car, si les
gènes ne déterminent pas le langage, les
circonstances qui entourent la naissance
des individus déterminent la langue
qu'ils apprendront. Inversement les diffé-
rences linguistiques peuvent créer ou ren-
forcer des barrières génétiques entre les
populations, bien qu'elles ne soient pas la
cause première du parallélisme. L'his-
toire humaine est ponctuée par des scis-
sions de populations en sous-groupes qui
s'installent parfois loin de leur lieu d'ori-
gine ; les gènes et les langues de chaque
sous-groupe évoluent tout en conservant
la trace de leur origine commune, de
sorte que la correspondance entre les
gènes et les langues est inévitable.
Les séparations complètes-lorsque,
par exemple, un sous-groupe migre vers
un nouveau continent-sont rares, mais
des montagnes ou des océansne sont pas
indispensables pour isoler deux popula-
tions : l'étude génétique de nombreuses
espècesanimales ou végétales montre que
la distance suffit. Puisque les échanges
entre deux populations sont d'autant plus
importants que ces populations sont géo-
graphiquement proches, la distance géné-
tique entre deux populations devrait aug-
menter avec la distance géographique. Il
en va de même pour les langues.
Lorsqu'aucune barrière ne bloque les
échanges, les variations génétiques et lin-
guistiques sont continues ; inversement la
présenced'un obstacle à la migration pro-
voque une discontinuité dans les variations
génétiqueset linguistiques.
Les substitutions
de langues
et de gènes
La correspondance entre les
langues et les gènes souffre de deux
exceptions : la substitution de
langues et la substitution de gènes.
La première résulte de l'abandon
d'une langue ancestrale au profit
d'une nouvelle langue-celle
d'immigrants, de conquérants ou
d'une nouvelle élite culturelle ; une
telle substitution linguistique est
d'autant plus rare que la nouvelle
langue diffère davantage de la
langue originelle. Le basque est un
cas extrême de langue ayant survécu
durant des milliers d'années, alors
que les langues des populations voi-
sines ont constamment évolué.
La substitution des gènes, géné-
ralement partielle, se produit lorsque
deux populations se mélangent.
Quand ce mélange est progressif, il
modifie dans la même proportion la
fréquence relative de tous les gènes.
Alors que la substitution génique est
graduelle, la substitution linguistique
obéit généralement à la loi du tout ou
rien. En effet, une langue conserve son
intégrité ancestrale même lorsqu'elle
emprunte beaucoup de mots à une autre
famille ou à une autre sous-famille lin-
guistique. Les linguistes admettent, par
exemple, que l'anglais dérive d'une sous-
famille germanique malgré ses emprunts
au français, au grec et au latin. Ce sont les
structures syntaxiques et le vocabulaire
de base qui définissent la langue.
La différence entre la substitution
génique et la substitution linguistique a
une conséquence importante : une mino-
rité conquérante imposera à une majorité
conquise une nouvelle langue, qui se sub-
stituera à l'ancienne, mais les nouveaux
gènes ne se substitueront aux anciens
qu'en proportion des deux populations :
ainsi les Hongrois parlent une langue ori-
ginaire de l'Oural, qui leur fut imposée
par les conquérants magyars au Moyen
Âge, mais la plupart de leurs gènes sont
d'origine européenne, et la population
actuelle ne présente que des traces
infimes de gènesmagyars.
Les substitutions complètes de gènes
sont rares, mais nous en avons découvert
au moins un exemple dans nos arbres
génétique et linguistique : les Lapons, qui
vivent au Nord de la Scandinavie, parlent
aussi une langue ouralique, mais leurs
gènes semblent résulter d'un brassage
entre des populations mongoles de
Sibérie et des populations scandinaves,
5. UN ÉCHANTILLONDE SANGdestiné à une analyse sée dans le monde entier (bien
génétique est prélevé par l'auteur sur une femme de la la mode italienne
tribu des Pygmées Aka africains.
dont la contribution est majoritaire. Ce
brassage transparaît dans la chevelure et
dans la couleur de peau des Lapons, qui
passent par toutes les nuances claires et
foncées. De même, les Éthiopiens résul-
teraient d'un mélange génétique entre des
populations africaines, qui prédominent,
et des populations caucasoïdes d'Arabie.
Même limité, un apport de gènes pro-
duit un effet important s'il se poursuit
suffisamment longtemps. Par exemple,
les Américains d'origine africaine possè-
dent aujourd'hui 30 pour cent de gènes
d'origine européenne ; cette proportion
aurait été obtenue si cinq pour cent envi- gistes, d'autre part, devraient profiter du
ron des Noirs américains s'étaient unis
avec un Américain d'origine européenne,
à chaque génération depuis l'introduction
de l'esclavage en Amérique et en consi-
dérant tous les métis comme noirs. Si ce
métissage se poursuit au même rythme
durant un millier d'années, il ne restera
pas grand-chose de la composante géné-
tique africaine originelle en Amérique.
En définitive, il est même surprenant
que la correspondance entre les gènes et
les langues subsiste en dépit des substitu-
tions génétique et linguistique. Cette
conservation est partiellement due au fait
que notre étude ne porte que sur des
populations indigènes, mais des études
récentes confirment l'existence de la cor-
respondance à une échelle microgéogra-
phique. Par exemple, notre arbre géné-
tique des premiers Américains concorde
avec la classification des langues du
Nouveau-Monde établie récemment
par J. Greenberg, qui distingue trois
grandes familles linguistiques : ces
deux études, menées indépendam-
ment à partir de données diffé-
rentes, montrent que la colonisation
du continent américain résulte d'un
petit nombre de migrations dis-
tinctes et successives.
En fait, les gènes et la culture
sont probablement liés pour une
autre raison : dans les sociétés tradi-
tionnelles que nous avons étudiées,
la transmission de la culture reste
essentiellement verticale (des
parents aux enfants). Alors que les
gènes se transmettent toujours verti-
calement, la culture est transmise à
la fois verticalement, de génération
en génération, et horizontalement,
entre personnes non apparentées.
Par exemple, à chaque saison, la
haute couture parisienne est diffu-
que
commence aussi à
s'imposer). Aujourd'hui la trans-
mission horizontale prend une
importance croissante, alors que,
dans les sociétés traditionnelles, la trans-
mission est essentiellement verticale, ce
qui rend ces sociétés plus conservatrices.
Les substitutions génétique et linguis-
tique, avec leurs lois particulières, sont
plus que des exceptions à notre modèle :
elles peuvent fournir de précieuses infor-
mations sur l'évolution des populations
et des langues et sur le développement de
la culture humaine. Leur étude compléte-
rait utilement notre travail, et les anthro-
pologues auraient intérêt à se mettre à
l'ouvrage avant que les populations indi-
gènes ne perdent leur identité. Les biolo-
Projet d'étude du génome humain pour
recenser la diversité génétique humaine
avant qu'elle ne disparaisse.
 GÉNÉTIQUE
LA
DES POPULATIONS
t faut rendre hommage aux orga-
nismes de recherche français tels que le
Centre d'étude du polymorphisme
humain et le Généthon, et à l'Association
française contre les myopathies : malgré
des moyens inférieurs à ceux déployés
aux États-Unis, organismes ont beau-
ces
coup progressé dans l'étude du génome
humain. Désormais, nous savons localiser
n'importe quel gène sur un chromo-
some. L'étape suivante de la cartographie
portera sur le séquençage complet, c'est-
à-dire la connaissance de l'ensemble des
chromosomes humains à la paire de
bases près.
Néanmoins, lire l'information géné-
tique ne signifie pas la comprendre. Les les fréquences d'apparition de ces gènes
gènes dont nous connaissons la fonction
ne représentent qu'une infime partie de
!'ADN, moins de cinq pour cent selon
certaines estimations. II reste à détermi-
ner le rôle des fragments de !'ADN qui ne
codent pas de protéines, et
dont certains interviennent
probablement dans l'organi-
sation des chromosomes,
notamment lors des cassures
et des recombinaisons.
Le séquençage du
génome ne résoudra pas
toutes les énigmes. Qu'est-ce
qui fait que l'on est plus ou
moins grand, plus ou moins
basané, que l'on a une ten-
sion artérielle plus ou moins
élevée ? Ces difficiles ques-
tions sont l'objet de la géné-
tique physiologique et de la
biométrie, l'étude statistique
des caractères quantitatifs.
Nous avons quelques rares'
pistes : ainsi, des gènes
déclenchant des sécrétions
plus ou moins élevées de cer-
taines molécules (enzymes
ou hormones) interviennent
dans le risque d'infarctus,
mais le mécanisme généralde
1. La diversité génétique du système HLA à travers le monde.
la génétique des caractères
Cette «analyse en coordonnées principales)) reconstitue les
quantitatifs reste incompris.
degrés d'apparentement
actuelles en fonction de leurs fréquences d'apparition
L étude
statistique du gènes HLA, A et B. (Figure fournie par A. Sanchez-Mazas,
patrimoine génétique des Laboratoire de génétique et biométrie de l'Université de
populations permet égale- Genève).
André Langaney
ment de reconstituer l'histoire du peu-
plement des différentes régions du
Globe. L'espèce humaine constitue une
population naturelle (c'est-à-dire sans sang à travers le monde pour observer
sélection artificielle, malgré quelques ten- les fréquences des groupes sanguinsABO
tatives heureusement avortées) et
d'apparition récente. Par conséquent,
presque toutes les variantes des gènes
sont présentes dans toutes les popula-
tions humaines. Cette omniprésence a
été la grande surprise de la génétique
des populations humaines. Nous ne
connaissons pas des gènes spécifiques de
Noirs, de Blancs, de Jaunes; nous avons
répertorié une liste de gènes communs à
toutes les populations humaines ; seules
varient selon les populations. Il n'est pas
exclu que nous trouvions un jour les
gènes responsables des différences de
couleur de peau, de taille : cela concerne
la génétique quantitative que nous avons
de 35 populations
évoquée. Néanmoins, nous ne disposons
actuellement d'aucun marqueur géné-
tique absolu, c'est-à-dire de gènes à la
fois présents chez tous les individus
d'une population et absents de toutes
les autres populations du monde. Le fait
est patent : aucune classification raciale
ne permet de caractériser les individus
par des présences ou absences de gènes.
Puisque les fréquences des gènes
varient d'une population à l'autre, il fallait
étudier cette variation. Avant guerre, des
immunologistes sont partis prélever du
et Rhésus. Ces études, peu précises, ont
été reprises dans les années 1960 et
1970, notamment en France, par des
chercheurs autour de Jean Bernard,
Jacques Ruffié et Jean Dausset.
Aujourd'hui, les banques de données
génétiques portent sur des centaines de
milliers de personnes à travers le monde ;
les généticiens des populations disposent
d'une bonne cartographie des fréquences
géniques à analyser.
Dès les années 1970, l'Américain
Newton Morton, s'inspirant des travaux
du Français Gustave Malécot, a montré
que la variation des fréquences géniques
à travers le monde dépend d'abord de la
distance géographique entre
les populations. Quelle mer-
veilleuse simplicité ! Plus les
populations sont éloignées,
plus les fréquences de leurs
gènes sont différentes, et
ceci indépendamment de
leur aspect physique. Par
exemple, les Polynésiens et
les Mélanésiens paraissent
différents, mais leurs fré-
quences géniques sont voi-
sines ; or ces populations
vivent près l'une de l'autre.
À l'inverse, les Canaques
en
Nouvelle-Calédonie ressem-
blent aux Bantous du Sud-
Ouest africain, mais leurs
fréquences géniques diffè-
rent énormément. Du point
de vue génétique, les
Canaques sont orientaux :
ils sont plus proches des
Chinois qu'ils ne sont
proches des Africains.
Cette grande décou-
verte a permis d'aborder les
lois de variation des fré-
mondiales
des quences des gènes à la sur-
face de la planète. Deux
mécanismes déterminent les
corrélations entre la varia-
tion des fréquences géniques et la géo-
graphie : l'essaimagedes groupes d'indivi-
dus issus d'une population unique, à l'ori-
gine des différentes populations ; puis les
échanges de migrants entre ces popula-
tions qui ont lissé leurs différences.
La carte de la répartition mondiale
des gènes humains révèle l'existence
d'un noyau central, constitué de l'Afrique
de l'Est, l'Afrique du Nord, le Proche-
Orient, et la péninsule indienne. Les
populations de ce noyau central présen-
tent une grande diversité physique et
possèdent la totalité des gènes de la pla-
nète, avec presque les mêmes fré-
quences. Nous en concluons qu'elles
sont sans doute les descendantes
directes d'une population unique, la
population fondatrice de l'ensemble de
l'espèce humaine actuelle.
il y a 50 000 à 100 000 ans, des
groupes de migrants ont quitté cette
population, pour aller vers l'Orient et
l'Océanie, puis vers l'Europe et
l'Amérique, enfin vers l'Afrique de
2. Carte de répartition des langues bantoues et ouest-africaines.
l'Ouest et du Sud : chacun de ces
groupes a emporté un échantillon de
gènes puisé dans le répertoire d'origine.
Ces petits groupes ont fondé des popu-
lations qui présentent des différences
dues à ces échantillonnages successifs.
Après ces implantations premières,
les migrations se sont perpétuées. Dans
les années 1940, Gustave Malécot a
prévu l'influence des migrations sur la
répartition des gènes. Newton Morton a
confirmé sa théorie : il a observé, à la
surface des continents, ce que l'on
appelle techniquement des gradients de
gènes. En d'autres termes, la fréquence
d'un gène donné croît ou décroît conti-
nûment d'une extrémité à l'autre d'un
continent. Par exemple, de l'Ouest de
l'Europe à l'Est de l'Asie, la fréquence du
gène B des groupes sanguins ABO aug-
mente progressivement.
Les migrations auraient atténué les
irrégularités apparues lors de la répartition
initiale des chasseurs-cueilleurs. Après le
Néolithique et l'invention de l'agricuiture,
il y a 10 000 ans, les densités de popula-
tion ont été multipliées par un facteur
vingt environ. Les populations sont alors
entrées en contact et les échanges ont
lissé les variations des fréquences
géniques à la surface de la planète.
La
loi : «plus on vit loin, plus on est
différent génétiquement » semble véri-
fiée. Luigi Luca Cavalli-Sforza et Alberto
Piazza ont montré l'existence d'une
seconde corrélation, confirmée par notre
groupe de chercheurs de l'Université de
Genève : les variations des fréquences
géniques dépendent aussi des apparte-
nances linguistiques des populations. Au
début, les résultats de L. L. Cavalli-Sforza
me laissaient sceptique. À l'époque, le
groupe genevois travaillait sur le peuple-
ment et les variations des fréquences
géniques en Afrique sub-saharienne. J'ai
proposé à Alicia Sanchez-Mazas,qui éta-
blissait notre banque de données, de
comparer les caractéristiques immunolo-
giques et la langue des populations
répertoriées. À ma grande surprise, elle a
obtenu un schéma qui séparait les
groupes linguistiques. En fait, ce résultat
est facile à interpréter : à l'évidence, la
langue ne détermine pas les gènes et les
gènes ne déterminent pas la langue, mais
la diversité des langues est liée, de même
que la diversité des fréquences géniques,
à l'histoire du peuplement
La colonisation actuelle de l'Afrique
noire est récente (moins de 25 000 ans
sans doute) : aussi la population du
groupe linguiste « Niger-Congo » (com-
prenant les Bantous et les Ouest-
Africains) est-elle linguistiquement et
génétiquement homogène, bien que
répartie sur une surface considérable,
depuis Dakar dans l'Ouest-africain,
jusqu'au Cap en Afrique du sud. Dans ce
cas, les échanges avec les populations
voisines n'ont pas encore lissé les diffé-
rences génétiques. Cette situation est
assez exceptionnelle : en Europe, la loca-
lisation géographique est plus importante
que la répartition selon les groupes lin-
guistiques, parce que les échanges entre
les populations, plus anciens, ont été plus
importants.
Ces
diverses observations géné-
tiques militent en faveur de l'existence
d'une population unique originelle, pré-
sente il y a 100 000 ans. En revanche, la
localisation de cette population d'origine
reste hypothétique. Je ne crois pas que
les théories du berceau africain des
humains modernes soient prouvées.
L'histoire du peuplement africain est
incertaine ; nous disposons de fossiles

africains très anciens (80 000, 100 000
ans), mais nous manquons d'informations
sur la période 80 000-25 000 ans.
D'après les données génétiques, les
Africains sub-sahariens actuels ne sont
probablement pas les descendants
directs de la population originelle : les
fréquences géniques des populations
Ouest et Sud-africaines ne sont pas
représentatives de l'ensemble des popu-
lations humaines. Ils sont probablement
issus de populations qui auraient quitté
l'Afrique du Nord, de l'Est ou le Proche-
Orient pour peupler cette partie de
l'Afrique, il y a 20 000 ans.
La génétique nous apprend que les
populations se déplaçaient beaucoup, et
échangeaient suffisamment leurs gènes
pour qu'aucune d'entre elles n'ait acquis
une spécificité génétique comparable à
celle d'une race animale. Quant aux dif-
férences physiques, nous savons qu'elles
apparaissent rapidement : en sélection
artificielle animale, la couleur de la peau
ou la taille change en dix générations ;
20 millénaires (un millier de générations)
suffisaient sans doute à changer la mor-
phologie ou les couleurs de peau dans la
Préhistoire.
L'homme a subi de grandes transfor-
mations : depuis l'australopithèque de
l'Afar, qui est peut-être l'ancêtre com-
mun du chimpanzé et de l'homme, son
cerveau a acquis des facultés que n'ont
pas les autres primates. Nous expliquons
aussi les différences physiques entre
populations par l'existence de transfor-
mations. Ainsi la couleur moyenne de
peau des populations varie en fonction
de l'ensoleillement à la surface de la pla-
nète ; cette corrélation peut sans doute
s'expliquer par un effet de sélection natu-
relle : nous savons que la synthèse de la
vitamine D dans l'organisme dépend de
l'action des rayons solaires ultraviolets,
qu'une carence en vitamine D favorise le
rachitisme, et que les peaux sombres
bloquent une partie de ce rayonnement ;
dans les conditions préhistoriques, on ne
pouvait donc pas être foncé dans les
zones peu ensoleillées, sans risquer le
rachitisme. De même, on ne pouvait sans
doute pas être blanc longtemps dans les
régions tropicales, pour des raisons que
l'on ignore, peut-être liées au risque de
mélanomes (cancers de la peau déclen-
chés par les rayons ultraviolets).
L'homme continue à se transformer :
la taille moyenne des hommes du Moyen
Âge était inférieure à celle des hommes
d'aujourd'hui (témoins les armures de
l'époque). Toutefois, à l'échelle de la vie
humaine, ces transformations ne sont
guère perceptibles.
Les
progrès de la médecine géné-
tique peuvent-ils, doivent-ils modifier
notre patrimoine génétique ? II faut faire
la part des choses. Que quelques cen-
taines de femmes fassent des enfants à
70 ans, ce serait spectaculaire, mais sans
intérêt. Bien sûr, il est scandaleux que la
Sécurité sociale finance des expériences
spectacles dans le domaine de la pro-
création humaine ; il est révoltant de
développer un marché de la fécondation
in vitro, quand on a plein de gamins aban-
donnés, et que l'on n'a pas su voter une
loi sur l'adoption. Cependant, tout cela
n'est qu'anecdotique, pour la génétique
des populations, et ne changera pas le
patrimoine génétique de l'espèce.
En revanche, des maladies terribles
telles que la mucoviscidose ou la myopa-
thie tuent chaque jour. Le seul espoir de
millions de malades à travers le monde
réside dans la thérapie génique. Or on
veut interdire les thérapies géniques ger-
minales, avant même de savoir les faire ;
on élimine, a priori, toute possibilité de
réparation d'un gène détériorant, suscep-
tible de transmettre une maladie géné-
tique à nos enfants. La notion de respect
du patrimoine génétique est ridicule,
voire mystique. La nature est la première
à ne pas respecter les patrimoines géné-
tiques, qui se cassent, se recollent,
chaque fois que l'on fabrique des cellules
sexuelles.
Par ailleurs, les modifications géné-
tiques d'agents pathogènes sont dange-
reuses, en particulier pour ceux qui bri-
colent des armes biologiques. On a fait
des essais fort risqués. On s'aperçoit, o
posteriori, que ce n'était peut-être pas si
dangereux, car les organismes génétique-
ment modifiés, même les bactéries et les
virus, semblent avoir peu de chances de
survivre dans un environnement naturel.
Les risques liés à la génétique exis-
tent, mais ils sont anodins, comparés aux
périls que notre espèce affronte depuis
des millénaires, et surtout, comparés aux
risques militaires et environnementaux.
André LANGANEY est chercheur
au Laboratoire de génétique
et biométrie
(Musée de l'Homme, Universitéde Genève).
AUTEURS
La structure des gènes
Pierre CHAMBONest professeur de biochi-
mie à la Faculté de médecine Louis Pasteur de
l'Université de Strasbourg, et dirige le
Laboratoire de génétique moléculaire des euca-
ryotes du CNRS. Cet article est extrait de Pour
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Pierre CHAMBON,Exposés sur la génétique,
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pour la Société Cetus, en 1983. Il est consultant
en biologie moléculaire et en technologie
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Deborah ERICKSONest journaliste à la
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Le contrôle
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Claude HÉLÈNEest membre de l'Académie
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de biophysique au Muséum national d'histoire
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Poulenc. Nguyen T. THUONGest directeur de
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Jan KLEIN dirige la division d'immunogé-
nétique de l'Institut Max Planck de biologie de
Tübingen et est professeur à l'École de méde-
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