Vous êtes sur la page 1sur 71

UNIVERSITE CHEIKH ANTA DIOP DE DAKAR

FACULTE DES SCIENCES ET TECHNIQUES

DEPARTEMENT DE BIOLOGIE ANIMALE

Anne : 2009-2010 Numro : 55

AMELIORATION DES SOLS CULTIVES AVEC DE LA


BOUE DE STATIONS DEPURATION DE PIKINE ET
CAMBERENE : IMPACT SUR LA DIVERSITE
BACTERIENNE DU SOL.

Mmoire de diplme de master II en Biologie Animale


Spcialit : Gntique Des Populations
Prsent et soutenu le 30 Novembre 2010
Par

Sidy Diakhat

N le 18-10-1984 Dakar

Membres du jury :

Prsident : Pr Danamou Mounport Professeur titulaire, UCAD


Membres : Dr Farma Ndiaye Ciss Chercheur ISRA
Dr Dominique Masse Directeur de Recherche, IRD
Dr Yacine Badiane Ndour Chercheur ISRA
Dr Pape Mback Sembne Matre de Confrences, UCAD
CE TRAVAIL EST DEDIE A :

MA MERE

ET

M ON FRERE

i
RESUME

Lobjectif de ce travail tait de voir linfluence de lapport de la boue active et stabilise sur
la structure gntique de la communaut bactrienne totale et nitrifiante (AOB) et la viabilit
des pathognes (Salmonelles et vibrions) dans les sols amends. Des chantillons de sol et de
boues ont t prlevs respectivement dans la zone des Niayes de Pikine et des stations
dpuration de Pikine et Cambrne. Les sols ont t amends raison de 2 g de boues pour
100 g de sol puis incubs pendant 21 jours 30C. Les analyses microbiologiques ont t
effectues T0, T7, T14, T21 et T28 jours par la mthode prsence-absence. Les analyses
molculaires ont t faites par la technique de la PCR-DGGE T0 et 21 jours dincubation.
Les rsultats obtenus montrent une absence des bactries pathognes recherche (Salmonella
spp et vibrio spp) dans les chantillons de sols tmoins et amends (0 UFC/25g). Lapport de
la boue a entrain une modification de la structure gntique de la communaut bactrienne
totale avec une grande diversit dans les sols amends avec de la boue stabilise, cependant la
boue active augmente la densit de certaines communauts bactriennes. Du fait la vitesse de
croissance assez lente des AOB la dure dincubation de 21 jours ne nous a pas permis
dobserver des changements remarquables dans la structure gntique de cette communaut
nitrifiante.

Mot cls : Diversit bactrienne, Boue active et stabilise, PCR-DGGE, AOB, Pathognes,
Niayes.

Abstract

The aim of this study was to see the influence of the contribution of activated sludge and
stabilized on the genetic structure of the total community and nitrifying (AOB) and the
viability of pathogens (Salmonella and vibrio) in amended soils. Samples of soil and sludge
were collected respectively in the Niayes Pikine and wastewater treatment plants and Pikine
Cambrne. The soils were amended with 2 g of sludge per 100 g soil and incubated for 21
days at 30 C. Microbiological analysis were performed at T0, T7, T14, T21 and T28 days by
the presence absence method. Molecular analyses were made by the technique of PCR-DGGE
at T0 and 21 days of incubation. The results show an absence of pathogenic bacteria sought
(Salmonella spp and Vibrio spp) in soil samples amended and witnesses (0 UFC/25g). The
contribution of the mud has caused a change in the genetic structure of the total bacterial
community with great diversity in soils amended with sludge stabilized; however, activated
sludge creates a density of certain bacterial communities. Because the growth rate slow

ii
enough for the AOB incubation period of 21 days does not allow us to observe remarkable
changes in the genetic structure of the nitrifying community.
Keywords: Microbial diversity, Activated and stabilized sludge, PCR-DGGE, AOB,
pathogens, Niayes.

iii
Remerciements

Ce travail a t ralis au Laboratoire dEcologie Microbienne des Sols et Agrosystmes


Tropicaux (LEMSAT) qui est un labo commun IRD-ISRA-UCAD.

Jexprime ma profonde gratitude Mme YACINE NDOUR BADIANE pour mavoir


propos ce sujet et de ne mnager aucun effort pour avoir mis ma disposition tous les
moyens ncessaires sa ralisation.

Je remercie Monsieur Dominique Masse directeur du LEMSAT pour les critiques et


suggestions apportes pour la russite de ce travail. Mes sincres remerciements vont
lendroit de Monsieur Pape Mback Sembne pour ses enseignements, son ouverture, sa
disponibilit et ses conseils, mais aussi au Pr Danamou Mounport pour avoir accept de juger
ce travail et pour ses enseignements de qualit en Gntiques des populations.

Mention spciale Madame Mariama Mbodj Gueye pour ses conseils, sa disponibilit et sa
prcieuse contribution dans ma formation en biologie molculaire et dans la russite de mon
stage lITA. Je tiens remercier galement, Dr Mame Farma Ndiaye CISSE, Maimouna
Mboup, Moussa Ndinor, Komi Assigbetss, Ndye Hlne Diallo, Thierno Sow , Abdoulaye
Badiane Amadou Lamine DIENG ; Adja Basse et Cheikh Beye de lITA pour leur soutien et
leur encouragement. Mes remerciements vont lendroit de lensemble du personnel
technique du LEMSAT : Amadou DIOP dit Traor, Lamine SAGNA, Moustapha San,
Mahcor Diouf, Omar FAYE, Mme Fatou GUEYE Saliou FAYE, Eli Diatta Blaise Man
pour la joie et la bonne humeur permanente qui rgnaient dans le labo.

Jen profite pour remercier chaleureusement tous les tudiants je veux nommer Amadou
Gueye Michel Norbert Kor Ndim Fall Sidy Tounkara Mbaye Didhiou Isseu Ciss Ndye
Ndague Niang.

Je ne saurai terminer cette partie sans avoir une pense pieuse lgard de Feu Madame
Ngon Keita du laboratoire de Microbiologie de lITA pour mavoir accueilli mais aussi pour
le suivi quotidien des mes activits en Microbiologie que la terre lui soit lgre.

Loin davoir cit tout le monde je souhaite que tous ceux, de prs ou de loin qui ont ensoleill
mes annes universitaires trouvent ici ma reconnaissance pour leur gentillesse, leur
disponibilit, leur confiance et leur sourire.

i
Sommaire

INTRODUCTION .................................................................................................................... 1

CHAPITRE I : SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE............................................................ 3

I.1Les diffrents types de boues .............................................................................................. 4

I.1.1.Les boues actives ............................................................................................................ 4

I.1.2.Les boues stabilises ........................................................................................................ 6

I.2. Les lments constitutifs des boues dpuration ............................................................. 7

I.3.Teneur des boues en micro-organismes pathognes ........................................................ 7

I.3.1 Les micro-organismes primaires dorigine fcale......................................................... 8

I.3.2 Les micro-organismes secondaires prsents initialement ............................................ 8

I.4.Les agents pathognes ........................................................................................................ 9

I.4.1. LES SALMONELLES ................................................................................................... 9

I.4.1.1.Caractres gnraux ..................................................................................................... 9

I.4.1.2.Classification phylogntique (Watson, 1989) ......................................................... 10

I.4.2. LES VIBRIONS ............................................................................................................ 10

I.4.2.1.Caractres gnraux ................................................................................................... 10

I.4.2.2.Classification phylognique ....................................................................................... 10

II.ETUDE DE LINFLUENCE DES BOUES DE STATIONS DEPURATION SUR LE


SOL .......................................................................................................................................... 10

II.1.La nitrification................................................................................................................. 11

Figure 4 : Processus de la minralisation et la nitrification de lazote organique ........... 12

II.3. Les caractristiques des Ammonia oxidizing bacteria (AOB) ................................... 12

CHAPITRE II : MATERIEL ET METHODES ................................................................. 14

I.LE MATERIEL ................................................................................................................... 15

I.1.PRESENTATION DE LA ZONE DETUDE ................................................................ 15

I .2.LE MATERIEL BIOLOGIQUE .................................................................................... 15

I.2.1.Le sol ............................................................................................................................... 15

ii
I.2. 2. La boue de station dpuration .................................................................................. 16

I.3. Incubation des sols amends avec de la boue ................................................................ 17

II. Mesures analytiques .......................................................................................................... 17

II.1.Mesures du pH des chantillons .................................................................................... 17

II.2. Recherche des micro-organismes pathognes ............................................................. 17

II.2.1. Recherche des Salmonelles ......................................................................................... 17

II.2.2. Recherche des bactries du genre Vibrio .................................................................. 19

II.3.ANALYSE MOLECULAIRE DES COMMUNAUTES BACTERIENNES :.......... 21

II.3.1. Extraction de lADN total des chantillons............................................................... 21

II.3.1.1. Lyse physique des cellules bactriennes ................................................................. 21

II.3.1.2.Prcipitation et purification ..................................................................................... 21

II.3.1.3.Quantification de lADN ........................................................................................... 22

II.3.2. Etude de la structure gntique de la communaut bactrienne totale ................. 22

II.3.2.1.Principe ...................................................................................................................... 22

II.3.2.1.1.LA PCR ................................................................................................................... 23

II.3.2.1.2.LA DGGE ............................................................................................................... 23

II.3.2.2.Mthodologie de PCR-DGGE .................................................................................. 24

II.3.2.2.1. Amplification de lADN par PCR ........................................................................ 24

II.3.2.2.2.Electrophorses en gradient de dnaturation (DGGE) ...................................... 27

II.4. Analyse des gels DGGE ................................................................................................. 28

RESULTATS ET DISCUSSION .......................................................................................... 29

III.RESULTATS .................................................................................................................... 30

III.1.pH des sols amends ...................................................................................................... 30

III.2.Analyse des pathognes ................................................................................................. 31

III.3. STRUCTURE DE LA COMMUNAUTE BACTERIENNE TOTALE ................... 31

III.4. Structure des communauts bactriennes nitritantes (AOB) ................................... 34

IV. DISCUSSION GENERALE DES RESULTATS .......................................................... 36

iii
IV.1.Analyses des pathognes................................................................................................ 36

IV.2. Effet de lamendement et de lincubation sur la diversit bactrienne. .................. 37

IV.2. 1.Structure gntique de la communaut bactrienne totale.................................... 37

IV.4.Structure des communauts bactriennes nitritantes (AOB) .................................... 38

CONCLUSION ET PERSPECTIVES ................................................................................. 40

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ............................................................................. 42

iv
LISTE DES ABREVIATIONS

ADN : Acide dsoxyribonuclique


ADNr : Acide dsoxyribonuclique ribosomique
BET : Bromure dthidium
BSA : Bovine Serum Albumin
CO2 : Dioxyde de carbone
dNTP : Dsoxyribonuclosides TriPhosphate
EDTA : Ethylne Diamine-Tetra-actic Acid
g: Gramme
H: Heure
m2 Mtre carr
m: Mtre
mg Milligramme
mM : Millimolaire
min : Minute
MO : Matire Organique
N : Azote
NH3 : Ammoniac
NO3- : Ion nitrate
pb : paires de bases
PCR : Polymerase Chain Reaction
pH : Potentiel hydrogne
qsp : quantit suffisante pour
s: Seconde
TBE Tris borate EDTA
UV : Ultra-Violet
UFC : Unit formant colonie
STEP : Station dEpuration
m : Micromtre
l : Microlitre
%: Pourcentage
C : Degr Celsius

v
TABLE DES ILLUSTRATIONS

Listes des Figures

Figure1 : Schma de fonctionnement dune station dpuration.4

Figure 2 : Processus de traitement des eaux uses urbaines6

Figure 3 : Schma dun procd boues actives (Station dpuration de Pikine).7

Figure 4 : Processus de la minralisation et la nitrification de lazote organique13

Figure 5 : Sites de prlvements des chantillons...16

Figure 6 : la boue active de Pikine dans un lit de schage....17

Figure 7 : Schma de la Procdure dtude.18

Figure 8 : schma montrant laugmentation exponentielle de la quantit


d'ADN cible chaque cycle de PCR24
Figure9 : description Schmatique de la DGGE.25

Figure 10 : Structure gntique de la communaut bactrienne totale Toj


et aprs 21 jours dincubation T21jours. 32
Figure 11 : Dendrogramme de similarit (UPGMA) obtenus partir
du profil DGGE de la communaut bactrienne totale des sols amends.33
Figure 12: Structure gntique de la communaut nitrosante
To j et aprs 21 jours dincubation34
Figure 13 : Dendrogramme de similarit (UPGMA) obtenus partir
des profils DGGE des AOB dans les sols amends. ..35

vi
Liste des Tableaux

TABLEAU I : Composition gnrale des boues dpuration (Source ADEME) 8

TABLEAU II : Principaux agents pathognes d'intrt sanitaire pouvant


tre retrouvs dans les boues rsiduaires (sources EPA, 1992)..9
TABLEAU III : Interprtation de la galerie en sel ..22

TABLEAU IV : Cycles thermiques damplification par PCR de la rgion


V3 du gne 16S de lADNr .26
TABLEAU V: les diffrentes tapes du cycle thermique pour
lamplification de lADNr 16S des bactries totales..28
TABLEAU VI : les diffrentes tapes du cycle thermique pour
lamplification de lADNr 16S des bactries totales28

TABLEAU VII : Valeurs des ph des sols avant et aprs apport de la boue.30

TABLEAU VII : Rsultats de lanalyse des pathognes .31

vii
ANNEXES

Annexe 1 : prparation des solutions dextraction dADN

Annexe 2 : Composition des solutions utilises

Annexe 3 : protocole dextraction de lADN total du sol

Annexe 4 : Protocole de la DGGE

viii
INTRODUCTION

1
En Afrique et au Sngal en particulier les activits agricoles urbaines et pri-urbaines se
dveloppent pour rpondre au besoin alimentaire croissant de la ville. Cependant la quantit
trs importante de dchets produits par la population citadine constitue un problme quil
convient de grer. Lagriculture peut tre une rponse ce dfi environnemental travers la
valorisation des produits organiques rsiduaires issus du traitement de ces dchets. Dans la
rgion de Dakar, lagriculture urbaine qui se dveloppe dans un contexte de fort dficit
hydrique, de pauvret des sols et de faible disponibilit des terres due une forte urbanisation,
est pratique de faon intensive. Cette intensification consiste utiliser beaucoup dengrais ou
de produits rsiduaires organiques trs riches en matire organique pour augmenter leur
production. Les eaux uses directement recueillies ont t pendant longtemps utilises sans
aucun traitement pralable par les marachers de la zone des Niayes. Actuellement lutilisation
de la boue issue du traitement de ces eaux uses dans les stations dpuration a mis fin cette
pratique. Les boues issues du traitement des eaux uses sont constitues d'eau et de matires
sches contenant des substances minrales et organiques (Dudowski, 2000). La matire
organique permet daugmenter la fertilit des sols avec comme corollaire la possibilit de
maintenir une production agricole soutenue et durable. Ces matires organiques stimulent
lactivit biologique dans ces sols et augmentent la disponibilit en lments fertilisants. Les
bactries ont une importance considrable dans la dynamique des matires organiques des
sols et les cycles biogochimiques. Ils interviennent dans les cycles du carbone ou de lazote.
Les boues contiennent galement des micro-organismes pathognes dont les plus importants
sont les salmonelles dans le groupe des bactries et qui sont lorigine des gastro-entrites
(Sahlstrom et al., 2004). Ces microorganismes pathognes peuvent contaminer les cultures
marachres, lors de lusage des boues. Do la ncessit, de rechercher la prsence
ventuelle de ces bactries dans ces boues issues de station dpuration et de suivre leur
volution dans les sols amends avec ces produits rsiduaires organiques. En fait, le sol
reprsente un important rservoir de germes avec environ 108-109 bactries par gramme de
sol. Cependant, la majorit de ces bactries ne sont encore ni identifies ni caractrises, car
elles demeurent rcalcitrantes aux techniques de microbiologie classique par culture sur
milieu glos (Rappe & Giovannoni, 2003). Les nouvelles techniques de la biologie
molculaire permettent de contourner cet obstacle (McHardy & Rigoutsos, 2007). Cette
technique consiste extraire lADN partir dchantillons de sols (le mtagnome), de
lamplifier et de lanalyser pour caractriser la structure dune communaut bactrienne
complexe (Ramette, 2009).

1
Ce mmoire se propose dtudier limpact de lapplication de boues urbaines issues du
traitement des eaux uses sur les sols cultivs. Notre tude sinscrit dans le contexte du projet
ISARD qui vise promouvoir le recyclage des produits rsiduaires organiques (PRO) pour
augmenter les productions agricoles via lintensification des processus cologiques se
droulant dans les sols tout en limitant les risques poss par ces pratiques.

Lobjectif gnral de ce travail est dtudier limpact de lamendement des sols cultivs avec
de la boue urbaine sur les communauts microbiennes du sol.

Il sagira :

- dtudier limpact de ses boues sur la communaut microbienne totale des sols et sur
les communauts spcifiques des bactries ammonium-Oxydantes (AOB) ;
- et de rechercher la prsence des bactries pathognes dans ces boues, et de suivre leur
volution dans les sols aprs incubation.

Les hypothses suivantes ont soutenu nos recherches :

La rponse des communauts bactriennes du sol varie en fonction la qualit de la


boue apporte.
Lapport de la boue de stations dpuration affecte la structure gntique des (AOB)
prsentes dans le sol amend
La rsistance ou persistance des germes pathognes dans les sols amends dpend de
ltat de dgradation de la boue urbaine.

Ce mmoire est divis en quatre parties :

- La premire partie est consacre la synthse des connaissances sur les boues
urbaines, les bactries pathognes et celles impliques dans le processus de la
nitrification ;
- La deuxime partie dcrit la zone dtude, et met en vidence le matriel et les
mthodes danalyse utilises ;
- La troisime partie prsente les rsultats obtenus lissu de la recherche des bactries
pathognes dune part et dautre part ceux issus de lanalyse de la structure gntique
des communauts microbiennes tudies.
- Et la quatrime partie dgage la conclusion et les perspectives de ce travail.

2
CHAPITRE I : SYNTHESE
BIBLIOGRAPHIQUE

3
On appelle boues dpuration les sdiments rsiduaires issus du traitement des eaux uses.
Les boues dpuration urbaines rsultent du traitement des eaux uses domestiques qui
proviennent de lactivit des particuliers et ventuellement des rejets industriels dans les
rseaux des collectivits aprs avoir suivi un pr-traitement obligatoire (document de synthse
Aprifel). Les eaux uses sont collectes puis achemines vers les stations dpuration o elles
sont traites. En fin de traitement, la sortie de la station, leau pure est rejete vers le
milieu naturel et il reste les boues rsiduaires qui sont composes deau et de matires sches
contenant des substances minrales et organiques (Dudowski 2000). Ainsi les boues issues du
traitement de ces eaux concentrent une charge qui est fonction de diffrents facteurs :

Le mode de traitement au niveau de la station dpuration.


Ltat de sant de la population relie ce rseau.
Les diffrentes structures relies (hpitaux, abattoirs).

Figure1 : Schma de fonctionnement dune station dpuration (source ADEME)

I.1.Les diffrents types de boues

Selon le type de traitement appliqu aux eaux uses, on distingue :

I.1.1.Les boues actives

Elles sont obtenues partir des procds biologiques cultures libres les bactries se
dveloppent dans des bassins aliments dune part en eaux uses traiter et dautre part en
oxygne par des apports dair. Les bactries en suspension dans leau des bassins sont donc en

4
contact permanent avec les matires polluantes dont elles se nourrissent et avec loxygne
ncessaire leur assimilation. Le traitement consiste dgrader les impurets grce une
biomasse puratrice, laquelle doit tre fourni de loxygne ncessaire son dveloppement.

Biomasse Biomasse
puratrice

Eaux Eaux
rsiduaires purifies

Oxygne Gaz
rsiduaires

Figure 2 : Processus de traitement des eaux uses urbaines

La biomasse utilise dans le traitement des eaux uses constitue un cosystme trs simplifi,
ne faisant appel qu des micro-organismes. Elle est constitue dtres vivants de petite taille
infrieure au millimtre, microflore de bactries et dune microfaune danimaux protozoaires
et mtazoaires proches des vers, ces tres sy trouvent de trs fortes concentrations de
lordre de 1011 1012 par litre pour les bactries et 106 108 par litre pour la microfaune. (Gaid
2008). Les principes de fonctionnement diffrent suivant que lobjectif est de traiter le
carbone ou le carbone et lazote et/ou le phosphore : en pratique, il sagit de permettre la
slection des espces de bactries capables soit de transformer le carbone en CO2, soit de
transformer lazote en nitrates puis les nitrates en azote gaz (N2), soit de stocker le phosphore.
Dans tous les cas, la sparation de leau traite et de la masse des bactries (que lon appelle
boues) se fait dans un ouvrage spcifique appel "clarificateur".
Pour conserver un stock constant et suffisant de bactries dans le bassin de boues actives,
une grande partie des boues extraites du clarificateur est renvoye dans le bassin.
Une petite partie de ces boues, correspondant laugmentation du stock pendant une priode
donne, est vacue du circuit des bassins daration et dirige vers les units de traitement
des boues : cette fraction des boues constitue les boues en excs . (Figure 2)

5
Oxygne

Bassin daration CLARIFICATEUR Eau CLARIFIEE


Eau brute

Boues actives
recircules
Boues en excs

Lits de schage

Figure 3 : Schma dun procd boues actives (Station dpuration de Pikine)

I.1.2.Les boues stabilises

Les boues se prsentent au dpart sous forme liquide et avec une forte charge en matire
organique hautement fermentescible. Ces deux caractristiques sont gnantes quelle que soit
la destination des boues et imposent la mise en place dune filire de traitement, cest--dire
une suite organise de procds qui agissent de faon complmentaire.
Le traitement de stabilisation biologique a pour objectif de rduire la fermentescibilit des
boues pour attnuer ou supprimer les mauvaises odeurs. Elle se fait soit par voie arobie (en
prsence d'oxygne) dans les bassins d'aration ou dans des bassins de stabilisation arobie,
soit par voie anarobie (absence d'oxygne) dans des digesteurs avec production d'un biogaz
riche en mthane. Dans le premier cas, on obtient des boues arobies ou stabilises
arobies , dans le second cas des boues digres , encore appeles anarobies ou
stabilises anarobies (Cas de la station dpuration de Cambrne).

La boue traite devra donc prsenter une ou plusieurs des proprits suivantes :

Un tat stabilis objectivement apprci par un critre li son aptitude gnrer des
nuisances olfactives.

Un tat hyginis mesur par un niveau de contamination en germes types (Entrobactrie,


virus, salmonelles et ufs dhelminthes).

6
Une texture solide permettant sa tenue en tas 30C sur un site ou un bout de champ. (Gaid ,
2008).

I.2. Les lments constitutifs des boues dpuration

Le tableau I indique le pourcentage des lments fertilisants ainsi que le pourcentage de la


matire organique contenue dans les boues.

TABLEAU I : Composition gnrale des boues dpuration (Source ADEME, 1999)

Matires et indicateurs Quantit


MATIERE SECHE (MS) 2 95 % selon la siccit

MATIERE ORGANIQUE (MO) 50 70 % de la MS

TENEUR EN Azote 3 9 % de la MS
MATIERE
MINERALE
Phosphore 4 6 % de la MS

Rapport
CARBONE/AZOTE 5 12

La disponibilit du phosphore, de l'azote, et du taux de matire organique des boues est


conditionne par le procd de traitement utilis dans la station. Par leur composition, les
boues, une fois pandues, augmentent le rendement des cultures. Elles contiennent des
nutriments pour les cultures et servent damendement organique et calcique pour amliorer les
proprits physiques et chimiques du sol. Des micro-organismes prsents en grand nombre
dans le sol digrent en partie les matires organiques apportes par les boues et les
transforment en lments minraux disponibles pour la plante. Une autre partie des matires
organiques est incorpore au sol et contribue l'entretient d'une structure favorable au
dveloppement des racines.

I.3.Teneur des boues en micro-organismes pathognes


Les quantits des diffrents micro-organismes pathognes dans les boues varient en fonction :
- de la nature des rejets recueillis par le rseau (domestiques, industriels,)

7
- de ltat sanitaire de la population raccorde,
- des traitements effectus sur les eaux et les boues.

Les boues dpuration contiennent des micro-organismes vivants en provenance des eaux
uses et des processus de traitement.
Seule une infime partie dentre eux prsente un danger infectieux pour lhomme et les
animaux : ils sont dits pathognes.
Les micro-organismes pathognes sont de quatre types : les virus, les bactries les parasites
les champignons.

I.3.1 Les micro-organismes primaires dorigine fcale.

Les rejets des eaux de vannes et pluviales dans le rseau sont la source dune charge
microbienne et parasitaire dans les effluents urbains traits au niveau des stations dpuration.
Ainsi les boues issues du traitement de ces eaux concentrent cette charge qui est fonction de
diffrents facteurs cits plus haut. Ces pathognes prsents dans ces boues sont susceptibles
de disparaitre au cours dun traitement biologique thermique etc. ( ADEME, 1999)

I.3.2 Les micro-organismes secondaires prsents initialement

Ils se dveloppent surtout au cours du compostage. Ce sont des champignons et des bactries
msophiles et thermophiles qui jouent un rle dans la dgradation de la matire organique lors
de la phase de maturation.

Tableau II : les micro-organismes pathognes des boues stations dpuration

Principaux agents pathognes d'intrt sanitaire


pouvant tre retrouvs dans les boues rsiduaires (sources ADEME, 1999)

Micro-organismes Pathologie
Bactries
Salmonella sp Salmonellose (gastro-entrite)
Shigella sp Dysenterie bacillaire
Yersinia sp Gastro-entrite
Vibrio cholerae Cholra
Escherichia coli (souches pathognes) Gastro-entrite
Pseudomonas aeruginosa Gastro-entrite, infections diverses

8
Virus Enteriques
Virus de lhpatite A et E* Hpatite infectieuse
Rotavirus Gastro-entrite
Rovirus Infection respiratoire, gastro-entrite
Astrovirus Gastro-entrite
Protozoaires
Cryptosporidium sp Gastro-entrite
Giardia intestinalis Diarrhe
Entamoeba histolytica Dysenterie
Balantidium coli Diarrhe et dysenterie
Toxoplasma gondii Toxoplasmose
Helminthes
Ascaris lumbricodes Troubles gastro-intestinaux
Trichuris trichiura Diarrhe, douleurs abdominales
Toxocara sp Diarrhe, douleurs abdominales
Taenia sp Nervosit, insomnie, troubles digestifs

I.4.Les agents pathognes

I.4.1. LES SALMONELLES

I.4.1.1.Caractres gnraux

Les salmonelles sont des bactries entriques en forme de btonnets, anarobies facultatives,
Gram ngatif, mobiles pour la plupart avec des flagelles pritriches, qui produisent du sulfure
dhydrogne. La nomenclature des salmonelles est particulirement complexe. La notion
despce est peu employe pour le genre Salmonella et on rfre plutt au srotype. Ce genre
contient plus de 2 000 srotypes diffrents (Centre dexpertise en analyse environnementale
du Qubec, 2007). Les salmonelles peuvent se trouver dans les sols et les eaux, et dans
plusieurs rsidus. Le genre Salmonella contient plusieurs srotypes pathognes pour lhumain
et les animaux. Ils prsentent un pourcentage en G+C de 50 53% (Bourgeois et al ; 1998).

9
I.4.1.2.Classification phylogntique (Watson, 1989)

Domaine : Eubacteria

Phylum XII : Proteobacteria

Classe : Gammaproteobacteria

Ordre : Enterobacteriales

Famille : Enterobacteriaceae

I.4.2. LES VIBRIONS

I.4.2.1.Caractres gnraux

Les bactries du genre Vibrio appartiennent la famille des Vibrionaceae. Ce sont de


petits bacilles, de formes frquemment incurves dites en virgule , extrmement mobiles.
L'espce la plus connue du genre Vibrio est Vibrio cholerae : agent responsable du cholra. Il
y a une vingtaine d'espces du genre Vibrio.

I.4.2.2.Classification phylognique :

Domaine : Eubacteria

Phylum XII : Proteobacteria

Classe : Gammaproteobacteria

Ordre : Vibrionales

Famille : Vibrionaceae

II.ETUDE DE LINFLUENCE DES BOUES DE STATIONS DEPURATION SUR LE


SOL

Les boues dpuration prsentent un intrt agronomique rel du fait de la prsence de matire
organique, dazote et de phosphore et dun rapport carbone/azote favorable. Mais pour
valoriser des boues, il faut la fois respecter lenvironnement, rechercher le cot le plus faible
possible et la solution technique la plus satisfaisante. Les boues reprsentent un apport de
matire fertilisante trs bon march en comparaison avec les engrais chimiques (document de
synthse comit Aprifel). Ce faible cot constitue un atout majeur de cette pratique. Les

10
matires organiques sont utilises dans les sols comme substrat nergtique par les micro-
organismes htrotrophes contribuant ainsi la minralisation de ces matires (Parnaudeau ,
2005). La dcomposition commence par une simplification molculaire. Outre les molcules
carbones intactes qui restent dans le sol, une partie du carbone organique est, en condition
arobie, minralis sous forme de CO2. Paralllement, une autre partie est transitoirement
incorpore dans la biomasse microbienne, qui fait lobjet elle aussi de biodgradation. Enfin,
une dernire fraction est progressivement stocke sous forme de matire organique stable.
Lazote associ au carbone dans les molcules organiques est quant lui ammonifi sous
forme de NH4+ (minralisation de lazote organique), une fraction de cette forme minrale de
lazote pouvant tre assimil par les micro-organismes pour leur croissance : il sagit dune
r-organisation de lazote minral, appele galement immobilisation. Il est possible
cependant que lenvironnement soit pauvre en azote minral, ou que la matire organique ne
soit pas suffisamment riche en azote, pour permettre la croissance microbienne. Cette dernire
tant ainsi une contrainte, les besoins en nergie sont galement limit, et par consquent
limite la minralisation du carbone organique (Recous et al., 1995). Lazote du sol prsent
sous forme de NH4+ est ensuite nitrifi par des populations microbiennes spcifiques (les plus
connues tant Nitrosomonas et Nitrobacter). Lammonium peut galement tre volatilis vers
latmosphre sous forme de NH3. Enfin les nitrates produits peuvent tre perdus par
lixiviation ou dnitrification suivant les conditions du milieu, ou absorbs par les cultures.

II.1.La nitrification

La nitrification est un processus principalement respiratoire et arobie responsable de


loxydation de lammonium en nitrite (nitritation), puis du nitrite en nitrate (nitratation)
(Prosser, 1986). Ces deux tapes successives sont ralises par deux types de bactries
diffrentes :

Les bactries nitreuses ou nitritantes ou nitrosantes (genres Nitrosococcus, Nitrosomonas,


Nitrospira, Nitrosovibrio).

Les bactries nitriques ou nitratantes (genres Nitrobacter, Nitrospira, Nitrospina,


Nitrococcus).

Ainsi les bactries impliques dans le processus de nitrification sont taxonomiquement peu
diversifies et regroups dans la famille des Nitrobacteriaceae. Il sagit des bactries Gram
ngatif, de petite taille et prsentant une mobilit variable. Parmi ces bactries nous

11
retrouvons les bactries oxydant lammoniaque (AOB) qui jouent un rle important dans la
transformation du NH3 en NO2-.

Figure 4 : Processus de la minralisation et la nitrification de lazote organique

II.3. Les caractristiques des Ammonia oxidizing bacteria (AOB)

Le groupe des bactries ammonium-oxydantes (AOB) runit plusieurs genres, eux-mmes


composs de plusieurs espces. Dans ce groupe, Bock et al (1989) et Teske et al (1994) ont
dfini les genres suivants Nitrosomonas (10 espces), Nitrospira (5 espces) Nitrosococcus (3
espces) Nitrosolobus (2 espces) et Nitrosovibrio (2 espces) appartiennent la sous-classe
des Protobactries. Les AOB ont t proposs comme des organismes modles en
cologie microbienne (Kowalchuk et Stephen, 2001) et sont souvent utiliss comme
indicateurs des perturbations de sol (Hastings et al., 1997 ; Stephen et al., 1999 ; Philips et al.,
2000 ; Chang et al., 2001 ; Oved et al., 2001 ; Nyberg et al., 2006). Horz et al (2004) ont
dmontr que les communauts des AOB taient modifies par plusieurs changements
globaux tels que laugmentation du CO2 atmosphrique, la temprature les dpts dazote etc.
Ces organismes sont uniques dans leur capacit utiliser la conversion de l'ammoniac en
nitrites comme source d'nergie unique (Kowalchuk & Stephen ; 2001). Cette image a un peu
chang dans les dernires annes, comme il a pu tre dmontr que l'oxydation d'ammoniac
peut tre effectu non seulement par AOB, mais aussi par AOA (archaeae oxydant
lammoniaque) qui pourraient tre dtects dans le sol (Leininger et al., 2006). Cependant, le
rle de ce dernier groupe dans le cycle dynamique de lazote nest pas bien connu. Ltude de
la structure des AOB de la sous-classe des -Proteobacteria revt une importance capitale du
fait de leur rle dindicateur dorganismes mais aussi de leur importance dans le cycle de
lazote. Le pH des sols est bien connu comme tant un facteur primordial dans la croissance et
lactivit des AOB dans ces cosystmes (Prosser & Embley, 2002) cit par Enwall et al
(2007) et ces derniers ont montr dans leur tude que lors dune diminution du pH,

12
lammoniac sionise pour former lammonium et la variation observe dans le potentiel de
loxydation de lammoniac est susceptible dtre directement dtermin par le pH contrlant
ainsi la disponibilit de lammoniac do son impact la fois sur labondance et lactivit de
ces bactries. Les bactries nitrifiantes ont une croissance et une activit optimale pour un pH
compris entre 6,6 et 8 (Paul & Clack, 1989). Cependant dans la nature, ces bactries peuvent
tolrer des gammes de pH plus larges, notamment des pH acides (Josserand & Bardin, 1981).
Le pH joue un rle dterminant dans la prfrence des micro-organismes pour une des formes
dazote. Une baisse de pH favorise labsorption de lammonium (Heller, 1969). Paul et Clark
(1989) ont montr quil existait une corrlation entre la production de nitrate et le pH. Le taux
de nitrification dans les sols cultivs diminue en dessous du pH 6 et devient ngligeable en
dessous de pH 4,5. Aux pH levs, loxydation de lammonium en nitrite puis en nitrate est
inhibe. Dans les eaux uses, la bactrie nitrosante la plus commune serait Nitrosomonas
(Watson et al., 1989 ; Wagner et al., 1995 ; Princic et al., 1998 ; Okabe et al., 1999). Sur les
30 % de bactries nitrosantes des biofilms autotrophes (au lieu de 10 % pour les biofilms
htrotrophes), 96 % sont des Nitrosomonas de trois genres diffrents (Nitrosomonas
europaea, Nitrosomonas eutropha et Nitrosomonas halophila), (Okabe et al., 1999 ).
Nitrosospira multiformis a galement t dtecte au sein des boues autotrophes, mais leur
densit cellulaire ne reprsentait que la moiti de celle des Nitrosomonas (Okabe et al.,
2004).

13
CHAPITRE II : MATERIEL
& METHODES

14
I.LE MATERIEL

I.1.PRESENTATION DE LA ZONE DETUDE

Les stations dpuration qui produisent les boues se situent dans les localits de Pikine et de
Cambrne dans la rgion de Dakar (figure 5).

Le sol est prlev dans une parcelle non cultive de la zone maraichre des Niayes dans la
localit de Pikine.

SITE DETUDE

Figure 5 : Sites de prlvements des chantillons

I .2.LE MATERIEL BIOLOGIQUE

I.2.1.Le sol

Les sols du Sngal sont classs parmi les sols ferrugineux tropicaux (Dubois, 1948). Ces sols
sont typiques des zones soudano-sahliennes ayant une saison pluvieuse de trois quatre
mois avec une pluviomtrie annuelle infrieure un mtre et une saison sche dau moins huit
mois (Duchaufour, 1960).

Le sol tudi est un sol agricole de type Dior: appellation locale donne aux sols ferrugineux
dont la texture est majoritairement sableuse, gnralement trs pauvres en matire organique

15
avec un fort caractre filtrant vis--vis de leau (Ndao, 2008). Le sol que nous avons utilis
pour notre exprimentation a t prlev au niveau de lhorizon de surface (0 - 10 cm) dune
parcelle non cultive et nayant jamais t amend avec de la boue de stations dans la zone
maraichre de Pikine. Sur cette parcelle denviron 150 m2, 2 chantillons composites ont t
prlevs constitus de 6 sous-chantillonnages distants denviron 2 m.

Le sol est sch lair, broy et tamis 2 mm puis stock lair ambiant pour la suite de
lexprience.

I.2. 2. La boue de station dpuration

Figure 6 : la boue active de Pikine dans un lit de schage

La station de Pikine ne produisant que des boues actives (le processus de digestion ntant
pas encore mis en uvre), nous avons prlev des chantillons de boues actives sur la station
de Pikine, boues utilises par les agriculteurs installes autour de la station, et des boues
stabilises sur la station dpuration des eaux uses de Cambrne. Dans chacune des
situations (2 stations), 3 lits de schage (surface de 250 m) ont t identifis. Sur chacun de
ces lits, 6 chantillons distants denviron 4 m sont prlevs et runis en un seul chantillon
composite. Nous avons donc constitus 6 chantillons de boues : 3 boues actives provenant
de la station de Pikine et 3 boues stabilises provenant de la station de Cambrne. Les boues,
dans un tat avancs de schage au moment du prlvement, ont t broyes puis tamises

16
250 m. La poudre obtenue est conserve au frais la temprature de 4C jusqu son
utilisation.

I.3. Incubation des sols amends avec de la boue

Les chantillons incubs dans des pots sont constitus dun chantillon de sol de 200g
mlang avec 4 g de boue. Chaque chantillon a t rpt 3 fois. Des mesures sont effectues
7 jours dintervalles (T0j, T7j, T14,j T21j et T28j) pour les analyses microbiologiques et
T0j et T21 jours pour les analyses molculaires (Figure 7). Ces analyses tant destructrices,
on a donc au dpart un total de 45 chantillons incubs ltuve pendant 28 jours 30C.

Recherche
des
Structure pathognes.
gntique
(Salmonelles
des AOB (T0 et Vibrio ) (T0
et T21j) T28j)

Structure
gntique de la
communaut
bactrienne totale
(T0 et T21j)

Figure 7 : Schma de la Procdure dtude

II. Mesures analytiques

II.1.Mesures du pH des chantillons

La mesure du pH dun sol permet de dfinir son tat dacidit ou dalcalinit. Le pH a t


mesur par le ratio 1 :2,5 (poids sur volume) avec de leau. Ainsi on dtermine le pH de la
suspension forme laide dune lectrode combine un pH-mtre Mettler Toledo 320.

Pour lensemble des analyses, 3 rptitions de mesures ont t ralises.

II.2. Recherche des micro-organismes pathognes

II.2.1. Recherche des Salmonelles

17
La recherche des Salmonelles dans les chantillons environnementaux a t ralise en
collaboration avec lInstitut de Technologies Alimentaires (ITA) et comprend plusieurs tapes
successives par rfrence la norme (AFNOR NF V 08-052):

Pr-enrichissement non slectif : 25g de notre chantillon sont pess dans un sachet
Stomacher dans lequel on ajoute 225 ml deau peptone tamponne. Le mlange est
homognis dans un appareil appel Stomacher 400 Laboratory Blender puis lensemble est
incub 37 pendant 16 20 h.

Enrichissement dans deux milieux slectifs liquides : A cet effet 0,1ml de la suspension
mre est plac dans 10 ml de bouillon Rappaport Vassiliadis et incub 42 pendant 18 24h.
Le Rappaport Vassiliadis est un milieu denrichissement slectif pour les salmonelles.
Paralllement 1ml de la mme suspension mre est plac dans 10 ml de bouillon MKTTn
(Muller-Kaufmann TetraThionate novobiocine) encore appel BKT (Bouillon Muller-
Kaufmann TetraThionate novobiocine) et le mlange est incub 37 pendant 18 24h.

Isolement sur milieu slectif solide Hektoen: Avec une pipette Pasteur boutonne, une
suspension du bouillon est ensemence dans le milieu Hektoen en faisant des stries sous une
hotte flux laminaire (TelSTAR AV -100). Les boites ensemences sont ensuite incubes
pendant 24 48 h 37C ltuve. La lecture de ces boites permet didentifier la prsence ou
labsence des salmonelles qui sont des colonies bleues avec ou sans centre noir (production de
H2S). Les colonies suspectes de salmonelles sont soumises trois tests dont les deux premiers
sont prsomptifs et la dernire pour une confirmation car incluant les deux premiers tests :

Test Ure-Indole.

Ce test se fait sur milieu ure tryptophane, appel improprement milieu Ure Indole. Le
milieu Ure Tryptophane est un milieu synthtique complexe qui fournit un ensemble de
rsultats utiles l'identification de nombreux germes bactriens, notamment parmi les
Enterobacteriaceae. Il permet de dtecter une activit urase, enzyme hydrolysant lure.
Cette activit est directement dtectable par le suivi de l'alcalinisation. La coloration rouge
traduit une alcalinisation du milieu, suite l'hydrolyse de l'ure et une formation de carbonate
d'ammonium. Si le milieu garde sa couleur initiale (jaune orang), alors il n y a pas eu
dalcalinisation.

Pratiquement, il sagit de suspendre une ou deux colonies suspectes dans les tubes Ure
indole commercialiss, dajouter 0,3 ml deau physiologique et 2 3 gouttes dhuile de

18
vaseline. Le mlange est vortex puis incub 37C ltuve, en prsence dun tube tmoin.
Au bout de 24 heures, du ractif de Kovacs est rajout. Ce ractif contient du dimthyl-
amino-4-benzaldhyde ragit avec l'indole, et forme un compos color en rouge (anneau la
surface du milieu).

Les salmonelles sont Urase ngatif et Idole ngatif.

Test prsomptif (Kli-gler Hajna)

Ce test est bas sur la fermentation de glucose, du lactose, la production de gaz et de H2S. Il
est ralis en ensemenant par des stries les colonies suspectes sur le milieu de Kligler Hajna
(voir la composition en annexe 1). Les tubes ensemencs sont incubs en prsence dun tube
tmoin pendant 24 h 37C.

La production de glucose dans le fond du tube, du lactose ainsi que la prsence de bulles dair
peut tre lie la prsence dentrobactries.

La recherche est complte par lutilisation de la galerie APIE 20 E.

Test galerie API 20E

Une colonie suspecte est dpose dans 5 ml deau physiologique puis homognis laide
du vortex. La suspension est introduite dans chaque tube et cupule de la galerie puis incub
pendant 24h dincubation. Les ractions produites pendant cette priode se traduisent par des
virages colors spontans ou rvls par lajout de ractifs.

Les rsultats sont interprts laide du tableau de lecture et du catalogue analytique ou dun
logiciel didentification.

II.2.2. Recherche des bactries du genre Vibrio

La recherche des bactries du genre Vibrio est effectue partir du protocole provisoire de
dtection de Vibrio cholerae et Vibrio parahaemolyticus dans les produits de mer (Centre
Nationale de Rfrences des Vibrions et du cholra, Unit du cholra et des Vibrions, Institut
Pasteur, Paris Mai 2003).

Les chantillons sont ouverts et pess sous hotte (25 g). Les peses sont mises dans un sachet
Stomacher dans lequel on ajoute 225 ml deau peptone saline alcaline (EPSA). La solution
est homognise dans un appareil le Stomacher (Warring Blender 400). Les sachets sont

19
incubs pendant 18-24h 43 dans ltuve. Cest ltape de lenrichissement slectif, car
favorable aux bactries du genre Vibrio. Avec une pipette Pasteur boutonne, la suspension
est ensemence sur le milieu solide TCBS (Thiosulfate Citrate Bile Saccharose) et incube
pendant 24 48 h (la dure dincubation dpend de la taille des colonies) 37C. Sur un
milieu TCBS les Vibrio cholerae se prsentent sous formes de colonies jaunes, planes de
diamtre 2-3 mm tandis que les colonies centre verts ou bleu-vert, lisses, bombes, bords
incolores et de diamtre variant entre 2et 3 mm sont des suspectes dtre des colonies de
Vibrio parahaemolyticus.

Ainsi la lecture de nos diffrentes boites de Ptri nous permet de reprer des colonies
prsumes tre des vibrions, ces dernires sont alors isoles sur de la GN (glose nutritive) 2
% de NaCl. Ces nouvelles boites sont incubes pendant 18 24 h 37. Les souches pures
ainsi obtenues sont soumises au test de loxydase ainsi que dautres tests didentification. Ce
test est essentiel pour orienter l'identification des bacilles Gram -, le ractif utilis est le
chlorhydrate ou l'oxalate de N-dimthyl paraphnylne diamine (PDA). Ce dernier est
imprgn dans un disque appel disque oxydase. Ainsi une bactrie ayant cette enzyme
respiratoire donnerait en prsence de ce disque une coloration bleue pourpre pouvant tre
violette, au bout de 30 s par une raction doxydo-rduction. Si la raction est positive, on
passe lobservation microscopique en recherchant la morphologie (formes incurves) et la
mobilit (organismes trs mobiles) des bactries observes.

Les observations microscopiques sont suivies dune incubation des colonies suspectes dans
une galerie de tubes deau peptone alcaline contenant des concentrations croissantes de NaCl
(0, 3, 6, 8, 10%). Pour ce faire, une colonie suspecte est prleve et dpose dans un tube
contenant une solution de Tryptone dpourvu de sel. Le mlange est vortex et 0,1 ml de ce
mlange est dpos dans les diffrents tubes de la galerie. Les tubes alors sont incubs
pendant 18 24 h 37 C.

Les rsultats de la galerie sont obtenus en comparant les tubes ensemencs avec les tubes
tmoins dune part, et dautre part avec le tableau ci-dessous servant linterprtation de la
galerie. Sil ya une concordance, lon prpare un inoculum contenant les souches suspectes
que lon dpose dans la galerie API 20 E puis incub 37C pendant 24 h pour la
confirmation. Les rsultats sont obtenus en utilisant le tableau de lecture et lidentification est
obtenue laide du catalogue analytique.

20
Tableau III : Interprtation de la galerie en sel

Galerie en sel INTERPRETATION

0% 3% 6% 8% 10%

+ + +/- - - Vibrio cholerae

+/-* + + +/- +/- Vibrio parahaemolyticus

+/-* + +/- - - Vibrio vulnificus

+/-* + + + +/- Vibrio alginolyticus

* Lorsquelle existe la croissance est faible

II.3.ANALYSE MOLECULAIRE DES COMMUNAUTES BACTERIENNES :

II.3.1. Extraction de lADN total des chantillons

La technique utilise est drive de la mthode initialement dveloppe Porteous et al. (1997)
mais modifie pour tre applicable nos chantillons. Elle consiste en une lyse physique au
bead better des cellules, suivie dune srie de prcipitation et de purification de lADN
(annexe 3). Cette mthode dextraction directe permet dobtenir des chantillons dADN les
plus reprsentatifs des compositions bactriennes initiales (Holben et al., 1988 ). Elle se fait
en plusieurs tapes.

II.3.1.1. Lyse physique des cellules bactriennes

Dans des tubes eppendorf de 2 ml contenant 0,5 g de sol homognis tamis 200m la lyse
des cellules est effectue par agitation pendant 2 minutes au bead better une vitesse de
25 tours/s (Reatsch) en prsence de billes en verre et de 1 ml de tampon de lyse (0,25M NaCl,
EDTA 0,1M pH8). Cette agitation est alterne 2 fois avec une incubation 65C pendant 2
minutes au bain-marie. Aprs une centrifugation 13 000g pendant 15 minutes 4C, le
surnageant est rcupr dans des tubes eppendorf de 1,5ml.

II.3.1.2.Prcipitation et purification

LADN contenu dans le lysat cellulaire est prcipit -20C pendant 2 heures en ajoutant
75l dune solution dactate de potassium 5M et 250l de PEG (Poly Ethylne Glycol) 8000
40 %, puis rcupr par centrifugation pendant 15 minutes 13000g 4C. Le culot obtenu

21
est purifi en complexant les composs humiques avec 600 l dune solution de CTAB (NaCl
1,4M; EDTA 0,1M; CTAB 2%) et une incubation 68 pendant 15 minutes au bain-marie. Le
mlange est homognis par retournement manuel toutes les 2 minutes jusqu la dissolution
complte du culot. Un volume de 600l de chloroforme est ajout pour la dprotinisation, le
mlange est agit doucement et centrifug 13000g pendant 10 minutes temprature
ambiante. Le surnageant contenant lADN est rcupr dans un nouveau tube eppendorf.
LADN est ensuite concentr par plusieurs phases de prcipitation.

Une premire tape est faite par lajout de 600 l disopropanol suivie dune incubation -
20C pendant 15 minutes, et dune centrifugation 13000g pendant 15 minutes 4C. Le
surnageant est jet et une deuxime prcipitation est effectue avec 450l dactate
dAmmonium 2,5M et 1ml dthanol 95%. Le mlange est de nouveau plac -20C
pendant 15 minutes et centrifug 13000g pendant 15 minutes 4C. Le culot est rcupr et
lav avec 500l dthanol 70%, sch par vaporation sous vide, suspendu entre 10 et 50l
deau ultra pure en fonction de la taille du culot dADN et conserv -20C.

II.3.1.3.Quantification de lADN

La quantification de la concentration dADN dans nos extraits a t effectue laide dune


gamme talon (annexe1). Sur un gel dagarose 2%, 5l de chaque extrait ainsi que de la
gamme ont t dposs la migration se fait pendant 60 minutes 100 volts. Le calcul des
concentrations de nos extraits dADN sest fait avec le logiciel TotalLab TL120.

LADN ainsi extrait a servi aux tudes portant sur :

La structure de la communaut bactrienne totale du sol et du mlange sol- boue de stations


dpuration grce la variabilit des squences de la rgion V3 de lADN 16S).

La structure des AOB (Ammonia Oxidizing Bacteria) appartenant la sous classes des
Protobactries.

II.3.2. Etude de la structure gntique de la communaut bactrienne totale

II.3.2.1.Principe

La structure de la communaut bactrienne totale a t tudie par la mthode de la PCR-


DGGE (Polymerase Chain Reaction Denaturating Gradient Gel Electrophoresis).

22
II.3.2.1.1.LA PCR

La PCR (Mullis & Faloona, 1987) est l'amplification in vitro d'une squence connue d'ADN
double-brin (ADN matrice) par extension de deux amorces grce une ADN polymrase, en
prsence de doxynuclotides (dNTPs) et d'ions Mg2+. Elle permet dobtenir, partir d'un
chantillon dADN plus ou moins complexe et peu abondant, d'importantes quantits d'un
fragment d'ADN spcifique et de longueur dfinie afin dappliquer dautres techniques de
biologie molculaire (DGGE, clonage et squenage). Il s'agit de raliser une succession de
ractions de rplication d'une matrice double brin d'ADN. Chaque raction met en uvre deux
amorces oligonuclotidiques dont les extrmits 3 pointent l'une vers l'autre qui dfinissent
alors, en la bornant, la squence amplifier. (Figure 8)

Figure 8: schma montrant laugmentation exponentielle de la quantit d'ADN cible chaque


cycle de PCR.

II.3.2.1.2.LA DGGE

La DGGE (Denaturating Gradient Gel Electrophoresis) est une technique dempreinte


molculaire visant caractriser les communauts bactriennes via le polymorphisme de leur
ADN. Elle est base sur une sparation des produits PCR sur un gel dacrylamide gradient
de dnaturation form par des concentrations croissantes dure et de formamide. Les
squences amplifies sont spares en fonction de leur point de fusion. Ce point de fusion
dpend de leur composition en cytosine et guanine (% G+C). Les squences vont se dnaturer
et donc simmobiliser sur le gel diffrentes hauteurs. Pour viter une dnaturation complte
une squence compose de guanine et de cytosine (GC clamp) est ajoute la position 5

23
dune amorce de PCR. Ainsi en amplifiant par PCR un chantillon environnemental o
plusieurs espces diffrentes sont prsentes et en les soumettant la DGGE nous obtenons un
profil lectrophortique avec plusieurs bandes. Cette technique donne ainsi une ide de la
structure de la communaut bactrienne selon le nombre de bandes observes sur le gel.

Planche 9: description Schmatique de la DGGE

II.3.2.2.Mthodologie de PCR-DGGE

II.3.2.2.1. Amplification de lADN par PCR

Toutes les amplifications sont ralises laide du thermocycleur Gene AmpR PCR system
9700 (Applied, biosystem, Courtboeuf, France).

Etude de la structure gntique de la communaut bactrienne totale

La rgion la plus frquemment amplifie est celle codant pour lARN ribosomal 16S. La
principale caractristique de lADN codant pour lARNr 16S est quil possde des rgions trs
polymorphes permettant de caractriser les espces bactriennes do son utilisation pour les
tudes phylogntiques. Cette rgion existe chez toutes les bactries et elle prsente des
squences communes pouvant tre utilises comme initiatrices de lamplification (amorces
spcifiques). Pour ltude de la communaut bactrienne, nous avons ainsi utilis un couple
damorces bactriennes universelles ciblant la rgion V3 de lADNr 16S et ces amorces
gnrent des amplicons denviron 200 paires de bases.

24
Amorce 338f-GC (Ovreas et al., 1997) : 5 CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG
GCG GGG GCA CGG GGG G-ACT CCT ACG GGA GGC AGC AG 3

Amorce 518r (Muyzer et al., 1993) : 5-ATT ACC GCG GCT GCT GG- 3

LADN est amplifi par une PCR Touchdown o la temprature dhybridation diminue
de 0,5C de 65C jusqu 55C chaque cycle avec 0,5M final de chacune des amorces dans
un mlange lyophilis de Taq Ready-To-Go (Amersham-Biosciences, US) (voir annexe 3). Le
mlange ractionnel compos de 25l, est compos de :

Les amorces une concentration finale de 10M

LADN 1ng.

0,5l de BSA (Bovine Serum Albumine)

TaqReady- to-go (PuRe taqTM Ready- to-go) (voir annexe 3)

Les cycles damplifications sont consigns dans le tableau suivant :

Tableau IV : Cycles thermiques damplification par PCR Touchdown de la rgion V3 du


gne 16S de lADNr

Nombre de cycles temprature temps

Dnaturation 94 2 min

Dnaturation 94 30 s

Hybridation 20 Cycles 65 30 s

Elongation 72 1 min

Dnaturation 94 30 s

Hybridation 10 Cycles 55 30 s

Elongation 72 1 min

Fin de synthse 72 15 min

25
Etude de la structure gntique des AOB (Ammonia Oxidizing Bacteria)

Ltude de la communaut bactrienne nitritante repose sur la mthode de la nested PCR .


Il sagit dune PCR en deux tapes successives, avec deux couples damorces diffrents, le
second liant des squences situes lintrieur du premier amplicon. La premire PCR a pour
but damplifier lADNr 16S total des bactries en utilisant les couples damorces fd1 (5-
AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3) et rd1 (5-AAGCTTAAGGAGGTGATCCAGCC-3)
(Weisburg et al., 1991).

Le mlange ractionnel de 25l est compos de :

Les amorces une concentration finale de 10 M

LADN 1 ng

0,5l de BSA (Bovine Serum Albumine)

TaqReady- to-go (PuRe taqTM Ready- to-go) (annexe 3)

Cette PCR gnre des fragments denviron 1500 pb, ces derniers sont utiliss comme matrice
pour une seconde amplification avec un couple damorces spcifiques aux AOB. Il sagit des
amorces CTO189f-GC (5-clamp-GGAGRAAAGYAGGGGATCG-3) et CTO654r (5-
CTAGCYTTGTAGTTTCAAACG-3) dcrits par Kowalchuk et al. (1997). Cette dernire
amplification gnre des fragments denviron 465 pb.

Le mlange ractionnel de 25l est compos de :

Les amorces une concentration finale de 10 M

LADN 0,5 ng.

TaqReady- to-go (PuRe taqTM Ready to-go).

Les conditions damplification de lADN total sont composes de 35 cycles prcds dune
dnaturation 94C pendant 5min. Chaque cycle comporte une phase de dnaturation (1min
94C), une phase dhybridation (45s 57C) et une phase dlongation (1min 30s 72)
(Tableau V). Puis sajoute une phase supplmentaire dlongation 72C pendant 15 min.
Pour lamplification avec les couples spcifiques aux AOB, les conditions sont les mmes
que prcdemment sauf pour la temprature dhybridation qui est de 55C. (Tableau VI).

26
Tableau V: les diffrentes tapes du cycle thermique pour lamplification de lADNr 16S
des bactries totales.

NOMBRE DE CYCLES TEMPERATURE TEMPS

Dnaturation 94 5 min

Dnaturation 94 1min

Hybridation 35 Cycles 57 45 s

Elongation 72 1 min 30s

Fin de synthse 72 15 min

Tableau VI : les diffrentes tapes du cycle thermique pour lamplification de lADNr


16S des bactries totales.

NOMBRE DE CYCLES TEMPERATURE TEMPS

Dnaturation 94 5 min

Dnaturation 94 1min

Hybridation 35 Cycles 55 45 s

Elongation 72 1 min 30s

Fin de synthse 72 15 min

La taille des fragments (465 pb) est contrle en dposant 3l de produit PCR avec 3l de
bleu de charge dans les puits dun gel dagarose 1%. La migration se fait 100 volts
pendant 25 min. Le gel est ensuite color au BET pendant 20 minutes puis rinc dans de leau
pendant 10 minutes et il est photographi sous la table UV.

II.3.2.2.2.Electrophorses en gradient de dnaturation (DGGE)

Dans cette tude, 15 l de produits PCR sont dposs sur un gel 8% dacrylamide-Bis
acrylamide [40% (37.5 :1)] constitu dun gradient dnaturant compris entre 45% et 70%

27
(voir annexe 3) une temprature de 60. La migration a t ralise avec le systeme Ingeny
phorU dans un tampon TAE 1X pendant 18 heures 100V. A la fin de la migration, le gel
est color au BET pendant 20 minutes sous une lgre agitation puis rinc leau
dminralise pendant 10 min. lacquisition des profils dADN sest faite lordinateur
laide du logiciel Bio-Capt ( Vilbert Lourmat , France) puis analys avec le logiciel Totallab
(TL 120 v 2006).

II.4. Analyse des gels DGGE

Pour lanalyse des profils DGGE, nous avons utilis le logiciel TotalLab (TL120, version
2006 ; Digilab, Inc USA) pour tracer les dendrogrammes de similarits en calculant le
coefficient de Dice (intervalle de confiance de 0,05%) avec la mthode de lalgorithme
UPGMA (Unweighted Pair-Group Method Algorithm).

28
RESULTATS &
DISCUSSION

29
III.RESULTATS

III.1.pH des sols amends

Le tableau ci-dessous donne les diffrentes valeurs du pH des sols tmoin et amends avec de
la boue de dpuration.

Tableau VII : Valeurs des ph des sols avant et aprs apport de la boue

Nombre de jour Traitements pH


dincubation

Tmoin sol 7,45

T0 Sol+boue active 7,15

Sol + boue stabilise 6,96

Tmoin sol 6,84

T21 Sol+boue active 6,27

Sol + boue stabilise 6,10

Lapport de la boue a modifi la valeur du pH des sols. Cette modification va dans le sens
dune diminution qui est dautant plus grande lorsque la boue est stabilise. Ces valeurs sont
comprises entre 6,10 et 7,45 donc optimales pour le dveloppement des bactries ammonium-
oxydantes.

30
III.2.Analyse des pathognes

Les rsultats issus de lanalyse des pathognes sont consigns dans le tableau ci-dessous :

Tableau VIII : Rsultats de la recherche des pathognes

Micro-organismes Nombre de jour Traitement des sols OBSERVATION


recherchs dincubation
Tmoin sol 0 UFC/25g
T0 Sol+boue active
SALMONELLES Sol + boue stabilise
& Tmoin sol 0 UFC/25g
VIBRIONS T21 jours Sol+boue active
Sol + boue stabilise
La recherche des pathognes qui portait sur deux types de bactries : Salmonella spp et vibrio
spp na pas aboutit des UFC (unit formant colonie) sur les 45 chantillons traits.

31
III.3. STRUCTURE DE LA COMMUNAUTE BACTERIENNE TOTALE

La figure ci-dessous reprsente la photo du gel obtenu aprs lectrophorse sur gel
dacrylamide. Lanalyse du profil DGGE des chantillons montre une nette diffrence lie
aux diffrents traitements, mais aussi en fonction du temps (figure 10)

Gradient dnaturant T0 J T21J

45% M A B 1 B2 B3 C1 C2 C3 A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3
1

2
3

4 5
6
7

8 9
11

10 12

13
14

15

70%

M= Marqueur A= Sol tmoin A1=Sol tmoin 1+ boue active 1


A2=Sol tmoin 2+ boue active 2
B1=Sol tmoin 1+ boue active 1
A3=Sol tmoin 3+ boue active 3
B2=Sol tmoin 2+ boue active 2 B3=Sol tmoin 3+ boue active 3
B1=Sol tmoin 1+ boue active 1
C1=Sol tmoin 1+bouestabilise1 C2=Sol tmoin 2+ boue stabilise 2
B2=Sol tmoin 2+ boue active 2 T21 jours
C3=Sol tmoin 3+ boue stabilise T0 jour B3=Sol tmoin 3+ boue active 3
C1=Sol tmoin 1+ boue stabilise 1
C2=Sol tmoin 2+ boue stabilise 2
C3=Sol tmoin 3+ boue stabilise 3

Figure 10 : Structure gntique de la communaut bactrienne totale To j et aprs 21 jours


dincubation T21jours

32
Figure 11 : Dendrogramme de similarit (UPGMA) obtenus partir du profil DGGE de
la communaut bactrienne totale des sols amends.

Une analyse base sur le dendrogramme de similarit montre, dune part que lapport de la
boue stabilise ou active entrane de profondes modifications de la structure de la
communaut bactrienne et dautre part, ces modifications varient au cours du temps. En effet
nous distinguons deux grands clusters, le premier regroupant les sols T0, et le second, les
sols incubs pendant 21j. Ces deux clusters ont 50% de diffrence. Au sein de chaque cluster,
les sols tmoins se distinguent nettement des sols traits, avec environ 35% de diffrence. De
mme, la communaut bactrienne des sols traits avec la boue stabilise forme un cluster
montrant environ 5% de diffrence avec les sols traits avec de la boue active.

Ces diffrences sont dues laugmentation du nombre de bandes dans les sols traits avec de
la boue active et stabilise par rapport aux sols tmoin. A T0 certaines bandes (2 et 13) sont
spcifiques aux sols traits avec de la boue stabilise. De mme ces nouvelles bandes sont
essentiellement situes dans la partie haute et moyenne du gel, correspondant ainsi une
communaut faible pourcentage en bases G+C.

33
Au bout de 21 jours dincubation, les nouvelles bandes qui apparaissent sont cette fois ci dans
la partie basse du gel correspondant une communaut haut pourcentage en bases G+C
(bandes 14 et 15). Par ailleurs, certaines bandes communes (4,6, 8 et 10) au sol tmoin et aux
sols traits ont leur intensit qui augmente dans les sols traits aussi bien avec de la boue
active quavec la boue stabilise. Cependant, cette intensit apparat plus forte dans les sols
mlangs avec de la boue active. Lintensit des bandes mme tmoigne dune augmentation
de la densit de la communaut reprsente par ces bandes mais qui ne peut tre mesur ce
niveau.

III.4. Structure des communauts bactriennes nitritantes (AOB)

Lanalyse du dendrogramme de similarit montre deux clusters majeurs, lun regroupant les
chantillons de sol amend puis incub pendant 21jours (T21j), lautre correspondant aux
chantillons de sol amend et non incub (T0j) (figure 13). Ces deux clusters prsentent 25%
de diffrence. Au sein de chaque cluster, les sols amends avec de la boue se diffrencient des
sols tmoins. Cette diffrence est toutefois plus marque dans les chantillons de sols
amends avec de la boue et incubs pendant 21jours. En effet on retrouve respectivement 10%
et 15% de diffrence entre le sol tmoin et les sols mlangs avec de la boue active ou
stabilise.

Ces diffrences sont notamment dues laugmentation de lintensit des bandes au bout de
21jours dincubation. Par ailleurs, certaines bandes disparaissent (D et E) chez les
chantillons traits avec de la boue stabilise T21jours. (Figure 12)

On note la particularit de la communaut A qui est prsente et dominante dans tous les
chantillons de sol et sol amend.

34
T0 j T21j

M A B1 B2 B3 C1 C2 C3 A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3

Figue 12 : Structure gntique de la communaut nitritante To j et aprs 21 jours


dincubation T21jours

Figure 13: Dendrogramme de similarit (UPGMA) obtenus partir des profils DGGE
des AOB dans les sols amends. (Lgende voir figure 4)

35
IV. DISCUSSION GENERALE DES RESULTATS

IV.1.Analyses des pathognes

Nos analyses ont montr labsence de Salmonelles et des bactries du genre Vibrio dans les
sols amends avec de la boue urbaine quelque soit son tat dans le processus dpuration.
Ceci peut sexpliquer par le traitement appliqu (bassins daration pour la boue active et
digesteurs pour la boue stabilise) aux boues solides et surtout avec la boue stabilise dont le
passage de ces PRO dans les digesteurs peuvent limiter voir liminer ces pathognes. Ces
rsultats viennent confirmer ceux dautres auteurs (Robert et al., 1994 ; Zaleski et al., 2005)
qui ont montr galement que le nombre des pathognes diminuait quand les sols sont
amends avec de la boue de station dpuration. Daprs ces auteurs, leffet du traitement subi
par la boue a une action relle sur les pathognes dans la mesure o les boues hyginises
peuvent tre pandues sans innocuit car ntant plus considr comme des dchets car ayant
des teneurs limits de certains pathognes tel que les salmonelles les entrovirus et les ufs
dhelminthes. Par ailleurs, certains facteurs tels que la temprature et le taux de dessiccation
entrainent une diminution du nombre de salmonelles et des coliformes fcaux qui sont des
indicateurs des germes pathognes. En outre la rduction de la densit des populations
bactriennes et virales est observe dans des conditions de sol sec (Samantamaria et al.,
2003). Une autre hypothse quant labsence des salmonelles et Vibrio dans nos sols
amends peut tre expliqu par leur absence dans les eaux uses brutes. Cette hypothse
aurait pu tre confirme ou pas si les mmes analyses avaient t faites sur les eaux uses
brutes. De telles analyses nous auraient permis de voir limpact rel du traitement des eaux
uses par les stations dpuration sur les pathognes.

Enfin, nous pouvons expliquer cette absence totale par un biais de la mthodologie qui passe
par la culture in vitro. Mme si ces germes sont cultivables, la culture in vitro est une
technique qui prsente des limites. Ainsi durant ces dernires annes de nouvelles mthodes
de dtection des salmonelles dans les chantillons environnementaux ont t mis au point
pour mieux affiner les recherches (CEAEQ, 2007).

Nous mettons cependant des rserves sur nos rsultats. En effet, la non dtection des ces
micro-organismes pathognes dans les boues ne signifie pas une absence totale des
pathognes car selon Sahlstrom et al (2004) les salmonelles sont frquemment isols dans les
boues brutes et les boues traites et sont prsentes dans les boues digres en nombre
relativement faible.

36
IV.2. Effet de lamendement et de lincubation sur la diversit bactrienne.

IV.2. 1.Structure gntique de la communaut bactrienne totale

Lapport de boue stabilise ou active dans le sol a entran des changements au niveau de la
structure des communauts bactriennes, au bout de 21 jours tant au niveau de la diversit
bactrienne (richesse spcifique) que de la densit des communauts. Ces modifications
observes peuvent sexpliquer par la qualit de la matire apporte. En effet, plusieurs auteurs
ont montr que lapport de produits rsiduaires organiques induit tout dabord une croissance
de la population des micro-organismes dont lintensit et la dure dpendent de la nature du
substrat (Houot et al., 1998 ; Jedidi et al., 2004). La transformation de la matire organique
fait intervenir de manire temporelle un ensemble de micro-organismes. Lerch et al (1992)
montrent que dans les premires semaines, ce sont les sources de carbone telles que le
glucose, les acides amins qui sont prfrentiellement utilises, puis le substrat prdominant
devient les protines, ce que confirme galement (Hattori et Muka, 1986).

Le pH peut aussi tre un facteur qui a influenc la structure des communauts bactriennes
comme lont montr Enwall et al (2007). Cependant dans notre tude lapplication des boues
To comme T21jours nont pas entran des variations significatives du pH et donc ce
paramtre na certainement pas eu une grande influence.

Nos rsultats ont galement montr, quau bout de 21 jours dincubation, le degr de
modification de la communaut bactrienne tait plus important en prsence de boue
stabilise par rapport la boue active, respectivement 30% et 25% de diffrence avec le sol
tmoin. Ceci peut sexpliquer par la nature de la matire organique apporte, la boue active
tant beaucoup plus riche en matire organique dgradable que la boue stabilise.

Les deux bandes (14 et 15) situes environ 60% du gradient de dnaturant pourraient tre
des actinomyctes bactries ayant un pourcentage lev en G+C (Crawford et al., 1988 ;
MacCarthy 1987). La plupart d'entre elles se trouvent dans le sol et sont actifs dans la
dcomposition des matires organiques matriaux dans le sol, y compris la lignine et d'autres
polymres rcalcitrants, et peuvent dgrader les dchets agricoles et urbains (Crawford et
al.,1988 ; MacCarthy 1987). Cependant des apports rpts de boues peuvent entraner une
augmentation de la biomasse microbienne des sols (abondance), mais il semblerait que cela
diminue la diversit fonctionnelle des populations (Anaya et al., 1999 ; Banerjee et al., 1997).
De telles modifications court terme dans la composition des communauts bactriennes ne

37
sont pas observes par Crecchio et al (2001) dans les sols fertiliss avec des dchets urbains
composts.

IV.4.Structure des communauts bactriennes nitritantes (AOB)

Nos rsultats ont montr que le traitement na pas eu un grand impact sur la communaut
bactrienne nitrosante (AOB). En effet, les communauts bactriennes des sols T0 et T21
prsentent plus de 80% de similitude. Ces rsultats peuvent sexpliquer par la dure
dincubation de nos sols. En effet, les AOB sont connus pour leur croissance lente, une
incubation plus longue peut tre ncessaire pour observer des changements de structure de ces
communauts. Nos rsultats sont ainsi en phase avec ceux de Avrahami et al (2003) qui ont
pu montrer quune incubation relativement courte dun chantillon de sol des concentrations
diffrentes en ammonium na pas influenc la structure des AOB. Des rsultats similaires ont
galement t obtenus par Mendum et al (1999) en tudiant la structure des AOB dans un sol
fertilis et un sol non fertilis sur une priode de 6 semaines. De mme Le Roux et al (2007)
nont observ des changements dans la structure gntique de cette communaut quau bout
de 5 mois suite lapplication de la technique du pturage dans une prairie. Ce qui corrobore
nos rsultats par rapport la dure de lincubation. Par contre, une tude long terme ralise
par Chu et al (2007) a dmontr que la fertilisation azote augmente le nombre de bandes
des profils DGGE, indiquant une diversit accrue de la communaut des AOB
lamendement azote. La temprature dincubation (30C) na pas affect la structure de cette
communaut. En effet Malchair et al (2009) ont montr quaprs 4 16 mois
dexprimentation que laugmentation de 3C par rapport la temprature ambiante na
entrain aucun changement dans composition gntique de cette communaut bactrienne.

Nos analyses DGGE ont aussi montr une bande trs intense prsente dans tous nos
chantillons (bande A). Ceci a t obtenue galement par Diallo et al (2005) avec cependant
une diminution de sont intensit aprs 140 jours dincubation, confirmant par ailleurs leffet
de la dure dincubation sur la structure de ces communauts nitrosantes. La bande intense
pourrait tre attribu une communaut de bactrie appartenant aux bactries du genre
Nitrosospira car tant le plus reprsent dans le sol en gnral (Kowalchuk et al., 1997;
Kowalchuk et al., 1998; Stephen et al.,1998 ; Bruns et al.,1999 ;Mendum et al.,1999 ;
Kowalchuk et al., 2000 ; Hastings et al., 2000; Philips et al.,2000), et les sols acides en
particulier (Stephen et al., 1998 ; Laverman et al 2000) qui sont favorables au dveloppement

38
de la souche nitrosospira. Un squenage nous permettra de dire avec certitude les espces qui
constituent cette communaut.

Une limite de nos analyses est constitue par laptitude des amorces CTO (CTO189f-GC et
CTO 654r). Elles ont t dcrites par Kowalchuk et al (1997) et utilises pour cibler les AOB
mais ont t remises en cause par les tudes de Cbron et al (2004) montrant leur faible
sensibilit spcificit. Ces auteurs sont plus favorables lutilisation des amorces qui ciblent
le gne amoA codant pour la sous-unit alpha de lammonium mono-oxygnase (AMO) qui
est lenzyme cl de toutes les bactries ammonium oxydantes arobies (Stephen et al., 1999).
Toutefois, en comparant les amorces CTO et amoA, Nicolaisen et Ramsing (2002) nont
trouv aucune diffrence significative entre ces deux types damorces.

Bien quelle soit adapte ltude la structure des communauts bactriennes la technique de
la PCR-DGGE prsente toutefois des limites telle que la taille des squences tudier
(Muyzer et al., 1996) elle ne tient pas compte des fragments suprieurs plus 800 pb. Certains
auteurs estiment quils existent un seuil de dtection de lespce par rapport labondance
totale de lchantillon considr dont la valeur de la densit de la population varie de 0,4 1,6
% (Muyzer et al.,1993 ; Casamayor et al., 2000).

39
CONCLUSION ET PERSPECTIVES

Lensemble des tudes que nous avons eu mener dans le cadre de ce travail nous ont permis
de comparer la structure des communauts bactriennes totales, la structure des bactries
ammonium-oxydantes (AOB), dune part et dautre part dvaluer la prsence de micro-
organismes pathognes dans un sol amend avec de la boue de station dpuration . Il ressort
de ces expriences la forte sensibilit des micro-organismes et en particulier les bactries la
boue de stations dpuration notamment la boue active o lon na not une grande richesse
spcifique en termes de nombre de bande DGGE. Les rsultats de lanalyse microbiologique
nont pas indiqu de prsence de salmonelles ou de vibrions. Il apparat donc que ce produit
rsiduaire organique prsente une certaine innocuit vis--vis de ces pathognes et pourrait
tre autoris une exploitation agricole.

A lissue de cette tude plusieurs perspectives peuvent tre envisageable notamment le


squenage de la bande 4 de la communaut totale et la bande dominante (bande A) des
communauts nitrosantes. Il est galement important de prolonger la dure de lincubation
plus ou moins long terme pour suivre lvolution de la diversit des communauts
microbiennes. La ncessit de complter ltude sur les pathognes par la recherche des
entrovirus et des ufs dhelminthes qui sont avec les salmonelles les indicateurs de la qualit
du traitement des boues dans la rduction des pathognes et donc leur pandage sans
innocuit pour la sant publique et lenvironnement.

40
Rsum : Lobjectif de ce travail tait dvaluer linfluence de lapport dans les sols de la
boue active et stabilise provenant de stations dpuration des eaux uses sur la structure
gntique de la communaut bactrienne totale et nitrifiante (AOB), ainsi que sur la viabilit
des pathognes de lhomme (Salmonelles et vibions). Des mlanges de sol prlevs dans la
zone des Niayes et de boues ont t incubs in vitro pendant 21 jours 30C. Les analyses
microbiologiques ont t effectues T0 T7 T14 T21 et T28 jours par la mthode prsence
absence. Les analyses molculaires ont t faites par la technique de la PCR-DGGE T0 et
21 jours dincubation. Les rsultats obtenus montrent une absence totale de bactries
pathognes recherche (Salmonella spp et Vibrio spp) dans les chantillons de sols tmoins et
amends (0 UFC/25g) quelque soit la dure dincubation. Lapport de la boue a entran une
modification de la structure gntique de la communaut bactrienne totale avec une
augmentation relative de la diversit dans les sols en prsence de boue stabilise ;
lintroduction de boue active en revanche augmenterait la densit de certaines communauts
bactriennes. Concernant les bactries nitrifiantes, leffet de lapport de boues est nettement
moins marqu ; la vitesse de croissance assez lente des AOB et la dure dincubation trop
courte pourrait lexpliquer.

Mot cls : Diversit bactrienne, Boue active, Boue stabilise, PCR-DGGE, AOB,
Pathognes, Niayes.

Abstract: The aim of this study was to assess the effect of the amendment on soils of
activated or stabilized biosolids on the genetic structure of the total and ammonium oxidizing
(AOB) bacterial community, and also on the viability of human pathogens as Salmonella or
vibions. Mixtures of soil from the Niayes fields and sludges collected in wastewater treatment
plants at Pikine and Cambrne were incubated for 21 days at 30 C. Microbial analysis were
performed at T0 T7 T14 T21 and T28 days by the presence absence method. Molecular
analyses were performed at T0 and 21 days of incubation by the PCR-DGGE technique. The
results showed the absence of pathogenic bacteria (Salmonella spp and Vibrio spp) whatever
the time of incubation or the sludge supply. The total bacterial community structure changed
when mud was supply. The diversity was greater in soils amended with stabilized sludge;
however, the activated sludge seemed to increase the density of some bacteria species. No
change was noticed on the AOB structure that would be due to the relative slow growth rate
of this bacteria and the insufficient short time of incubation to reveal an impact on AOB
communities structure. Keywords: Microbial diversity, Activated and stabilized sludge,
PCR-DGGE, AOB, soil pathogens, Niayes.

41
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

ADEME et Facult de Pharmacie de Nancy (1999). Les agents biologiques d'intrt sanitaire des
boues d'puration urbaines. Connatre pour agir. Guides et cahiers techniques. Collection
Valorisation agricoles des boues d'puration. ADEME Ed. Paris. 183 p.

ADEME .1999 Utilisation des dchets organiques en vgtalisation. Guide de bonnes pratiques
(CEMAGREF - ADEME). Collection Connatre pour agir. 150 p. ADEME dition Paris.

AFNOR NF V 08-052. 1997. Microbiologie alimentaire. Recherche des Salmonella. Mthode de


routine. AFNOR NF V08-052, Mai 1997. 24 p.

Anaya, C., Forgas, J., Agut, M. et Calvo, M.A. 1999. Study of microfungal species in a calcareous
soil treated with sewage sludge, p. 323-327, In eds. Berthelin, et al. Effect of mineral-organic-
micro-organisms interactions on soil and freshwater environment. Kluwer Academic / Plenum
Publishers, New York, USA.

Avrahami, S., Liesack, W., Conrad, R 2003. Effects of temperature and fertilizer on activity and
community structure of soil ammonia oxidizers. Environ. Microbiol. 5, 691- 705.

Banerjee, M.R., Burton, D.L., Depoe, S. 1997. Impact of sewage sludge application on soil
biological characteristics. Agriculture, Ecosystems and Environment 66:241-249.

Bock, E., Koops, H.P. and Harns H.,1989. Nitrifying bacteria. In : Autotrophic bacteria, pp 81-96.
Schlegel HG. Et Bowien B. (ed) Springer Verlag, Berlin.

Bourgeois, C.M., Mescle, J.F., Zucca, J.1998. Microbiologie alimentaire 1, Aspect


microbiologique de la scurit et de la qualit des aliments. (2 ed) Dans la Collection Sciences
et Techniques Agro-alimentaires. Lavoisier TEC&Doc, pp. 12-42.
Bruns, M.A., Stephen, J.R., Kowalchuk, G.A., Prosser, J.I., Paul, E.A., 1999. Comparative
diversity of ammonia oxidizer 16S rRNA gene sequences in native, tilled, and successional
soils. Applied and Environmental Microbiology 65, 29943000.
Casamayor, E.O., Schfer H., Baneras L., Pedrs-Ali, C. 2000. Identification of and spatio-
temporal differences between microbial assemblages from two neighboring sulphurous lakes :
comparison by microscopy and denaturing gradient gel electrophoresis. Applied and
Environmental Microbiology, 2000, Vol 66, N2, pp. 499-508.
Cebron, A.,Coci, M., Garnier, J., Laanbroek, H.J. (2004). Denaturing gradient gel electrophoresis
(DGGE) Analysis of ammonia-oxidizing bacteria community structure in the lower seine

42
river: Impact of Paris wastewater Effluents. Applied and Environmental Microbiology,
pp.6726-6737.
Centre dexpertise en analyse environnementale du Qubec, Recherche des salmonelles :
mthode prsence/absence, MA. 700 Sal-PA 1.0, Rv. 1, Ministre du Dveloppement
durable, de lEnvironnement et des Parcs, 2007, 25 p.
Chang, Y.-J., Anwar Hussain, A.K.M., Stephen, J.R., Mullens, M.D., White, D.C., Peacock, A.,
2001. Impact of herbicides on the abundance and structure of indigenous b-subgroup
ammonia-oxidizer communities in soil microcosms. Environmental Toxicology and
Chemistry 20, 24622468.
Chu, H., Fujii, T., Morimoto, S., Lin, X.,Yagi, K., Hu, J., Zhang, J.(2007). Community Structure of
Ammonia-Oxidizing Bacteria under Long-Term Application of Mineral Fertilizer and
Organic Manure in a Sandy Loam Soil. Applied and Environmental Microbiology,73: 485
491
Comit Scurit Alimentaire de lAprifel : Les boues dpuration : Document de synthse
Crawford, D. L. 1988. Biodegradation of agricultural and urban wastes, p.433439. In M.
Goodfellow, S. T. Williams, and M. Mordarski (ed.), Actinomycetes in biotechnology.
Academic Press, Ltd., London, United Kingdom.
Crecchio, C., Curci, M., Mininin,R., Ricciuiti, P., Ruggiero, P. 2001. Short-term effects of
municipal solid waste compost amendments on soil carbon and nitrogen content, some
enzyme activities and genetic diversity. Biology and fertility of soil. 34:311-318.
Diallo, M.D. (2005). Effet de la qualit des litires de quelques espces vgtales sahliennes sur la
minralisation de lazote. These de doctorat, Universit cheikh Anta Diop.
Dubois, J. (1948). les sols du Sngal. Confr. Agric . des sols, Bull. Agric. Dc., pp.789-797.
Dudkowski, A. Epandage agricole des boues. 2000. Le Courrier de lenvironnement de LInra.
41 :134-135.
Duchaufour, P. 1960. Introduction la science de sol : sol, vgtation, environnement. 6me
dition. 331p.
Enwall, K., Phillipot, L., Hallin, S., 2005. Activity and composition of the denitrifying
bacterial community respond differently to long-term fertilization. Applied and
Environmental Microbiology 71, 8335-8343.
Gad, A. 2008. Traitements des boues. Ed Techniques Ingnieurs. C 5221.
Hastings, R. C., M. T. Ceccherini, N. Miclaus, J. R. Saunders, M. Bazzicalupo, and A. J.
McCarthy. 1997. Direct molecular biological analysis of ammonia oxidizing bacteria

43
population in cultivated soil plots treated with swine manure. FEMS Microbiol. Ecol. 23:45
54.
Hattori, H. & Mukai, S. 1986. Decomposition of sewage sludges in soil as affected by their
organic matter composition. Soil Science & Plant Nutrition 32:421-432.
Heller, G. (1969). Biologie vgtale. II. Nutrition et mtabolisme. Masson. Paris.578p.
Holben, W.E., Jannsson, J.K., Chelm, B.K., Tiedje, J.M. 1988. DNA probe method for the
detection of specific microorganism in the soil bacterial community. Appl.Environ.Microbiol.
54: 703-711
Horz, H.-P., Barbrook, A., Field, C.B., Bohannen, B.J.M., 2004. Ammonia-oxidizing bacteria
respond to multifactorial global change. Proceedings of the National Academy of Sciences of
the United States of America 101, 1513615141.
Houot, S., Delaitre, G. et Bourgeois, S. 1998. Simulation of the behaviour of sewage sludges in a
soil: variation with sludge treatment, p. 293-304, In eds. Martinez, J. et Maudet, M.-N. 8th
International conference on management strategies for organic waste use in agriculture, Vol.
1. FAO and Cemagref Editions, Rennes, France.
Jedidi, N., Hassen, A., van Cleemput, O. et M'Hiri, A. 2004. Microbial biomass in a soil amended
with different types of organic wastes. Waste Management & Research 22:93-99.
Josserand, A & Bardin, R. (1981). Nitrification en sol acide. I : mise en vidence de germes
autotrophes nitrifiants (genre nitrobacter) dans un sol forestier sous rsineux. Revue
dEcologie et de Biologie du sol, 18 : 435-445.
Kowalchuk, G.A., Stephen, J.R., 2001. Ammonia-oxidizing bacteria: a model for molecular
microbial ecology. Annual Review of Microbiology 55, 485529.
Kowalchuk, G.A., Stephen, J.R., De Boer, Prosser, J.I., Embley, T.M., Woldendorp, J.W.,
1997.Analysis of ammonia-oxidising bacteria of the -subdivision of the class proteobacteria
in coastal sand dunes by denaturing gradient gel electrophoresis and sequencing of PCR-
amplified 16S ribosomal DNA fragments. Applied and Environmental Microbiology 63,
1489-1497.
Kowalchuk, G.A., Bodelier, P.L.E., Heilig, G.H.J., Stephen, J.R., Laanbroek, H.J., 1998.
Community analysis of ammonia-oxidising bacteria, in relation to oxygen availability in soils
and rootoxygenated sediments, using PCR, DGGE and oligonucleotide probe hybridisation.
FEMS Microbiol. Ecol. 27, 339 350.
Kowalchuk, G.A., Stienstra, A.W., Heilig, G.H.J., Stephen, J.R., Woldendorp, J.W., 2000.
Molecular analysis of ammonia-oxidising bacteria in soils of successional grasslands of the
Drentsche A (The Netherlands). FEMS Microbiology Ecology 31, 207215.

44
Laverman, A.M., Zoomer, H.R., van Verseveld, H.W., Verhoef, H.A., 2000. Temporal and spatial
variation of nitrogen transformations in a coniferous forest soil. Soil Biology and
Biochemistry 32, 16611670.
Leininger, S., Urich, T., Schloter, M., Schwark, L. Qi, J.,Nicol, G.W. et al. (2006). Archaea
predominate among ammonia-oxidizing prokaryotes in soils. Nature 442: 806809.
Lerch, R.N., Barbarick, K.A., Sommers, L.E., Westfall, D.G. (1992). Sewage sludge proteins
as labile carbon and nitrogen sources. Soil Science Society of America Journal 56:1470-1476.
Le Roux, X., Poly, F., Currey, P., Commeaux, C.,Hai, B., Nicol, G.W., Prosser, J.I., Schloter, M.,
Attard, E., Klumpp, K. 2007. Effects of aboveground grazing on coupling among nitrifier
activity, abundance and community structure. The ISME Journal (Nature) 2 : 221232.
Malchair, S., De Boeck, Lemmens H.J., C.M.H.M, Ceulemans, R., Merckx R., Nijs, I., Carnol, M.
(2009). Diversityfunction relationship of ammonia-oxidizing bacteria in soils among
functional groups of grassland species under climate warming. Applied Soil Ecology 44 :15
23
McCarthy, A. J. (1987). Lignocellulose-degrading actinomycetes. FEMS Microbiol. Rev. 46:145
163.
McHardy, A.C. & Rigoutsos, I. (2007). What's in the mix: phylogenetic classification of
metagenome sequences samples. Curr Opin Microbiol. 10: 499-503.
Mendum, T.A., Sockett, R.E., Hirsch, P.R., (1999). Use of molecular and isotopic techniques to
monitor the response of autotrophic ammoniaoxidizing populations of the b-subdivisions of
the class proteobacteria in arable soils to nitrogen fertilizer. Applied and Environmental
Microbiology 65, 41554162.
Mullis, K.B. & Fallona, F.A. (1987). Specific synthesis of DNA in-vitro via a polymerase-catalysed
chain reaction. Methods Enzymol. 155: 335-350.
Muyzer, G., E.C. deWaal., A. G. Uitterlinden. (1993). Profiling of complex microbial populations
by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction-amplified
genes coding for 16S rRNA. Appl. Environ. Microbiol. 59:695700.
Muyzer, G., Hottentrager, S., Teske, A., Wawer, C. (1996). Denaturing gradient gel
electrophoresis of PCR -amplified 16S rDNA - a new molecular approach to analyse the
genetic diversity of mixed microbial communities. Molecular Microbial Ecology Manual, ,
Vol 3.4.4, pp. 1-23.
Nicolaisen, M. H., and N. B. Ramsing. (2002). Denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE)
approaches to study the diversity of ammonia-oxidizing bacteria. J. Microbiol. Methods
50:189203.

45
Ndao, T. (2008). Etudes des principaux paramtres permettant une valuation des risques
dexposition des oprateurs lors de lapplication de traitement phytosanitaire en culture
marachre et cotonnire au Sngal. Thse de doctorat. Facult universitaire des sciences
agronomiques de Gembloux .Belgique.
Nyberg, K., Schnurer, A., Sundh, I., Jarvis, Hallin, S. (2006). Ammonia oxidizing communities in
agricultural soil incubated with organic waste residues. Biology and Fertility of Soils 42 : 315-
323.
Okabe S., Satoh H., Watanabe Y. (1999). In situ analysis of nitrifying biofilms as determined by in
situ hybridisation and the use of microelectrodes. Appl. Environ. Microbiol. 65: 3182-3191
Okabe S., Kindaichi T., Satoh H. (2004). Analysis of size distribution and areal cell density of
ammonia-oxidizing bacterial microcolonies in relation to substrate microprofiles in biofilms.
Biotechnol. Bioeng. 85: 86-95.
Oved , T., Shaviv, A., Goldrath, T., Mandelbaum, R.T., Minz, D. (2001). Influence of Effluent
Irrigation on Community Composition and Function of ammonia-oxidizing bacteria in Soil.
Applied and Environmental Microbiology 67:3426-3433.
Ovreas, L., Forney, L., Daae, F. L. & Torsvik, V. (1997). Distribution of bacterioplankton in
meromitic lake saelenvannet, as determined by denaturing gradient gel electrophoresis of
PCR amplified gene fragments coding for 16S r RNA. Applied and Environmental
Microbiology, 63 :3367-3373.
Parnaudeau, V. (2005). Caractristiques biochimiques de produits organiques
rsiduaires, prdiction et modlisation de leur minralisation dans les sols. Thse de doctorat,
Prpare lINRA, Unit dAgronomie Laon-Reims-Mons, Rennes.
Paul, E.A. & Clark, F.E. (1989). Soil microbiology and Biochemitry. Academic Press, INC.275p.
Phillips, C.J., Harris, D., Dollhopf, S.L., Gross, K.L., Prosser, J.I., Eldor, A.P. (2000). Effects of
agronomic treatments on structure and function of ammonia-oxidizing communities. Applied
and Environmental Microbiology 66: 54105418.
Porteous, L.A., Seidler, R.J.& Watrud, L.S. (1997). An improved method for purifying DNA from
soil for PCR amplification and molecular ecology applications. Molecular ecology 6, 787-
791.
Prosser, J.I (1986). Nitrification. IRL PRESS, OXFORD, 217 p.
Prosser, J.I., Embley, T.M., 2002. Cultivation-based and molecular approaches to characterisation
of terrestrial and aquatic nitrifiers. Antonie van Leeuwenhoek 81:165179.

46
Princic A., Mahne I., Megusar F., Paul E., Tiedje J. (1998.) Effects of pH and oxygen and
ammonium concentrations on the community structure of nitrifying bacteria from wastewater.
Appl. Environ. Microbiol. 64: 3584-3590.
Rappe, .M.S. & Giovannoni, S.J.( 2003). The uncultured microbial majority. Annu Rev Microbiol.
57: 369-394.
Ramette, A. (2009). Quantitative community fingerprinting methods for estimating theabundance
of operational taxonomic units in natural microbial communities. Appl Environ Microbiol. 75:
2495-2505.
Recous, S., Robin, D., Darwis, D & Mary, B. (1995). Soil inorganic N availability: effect on maize
residue decomposition. Soil Biology and Biochemisty, 27 1529-1538.
Riemann, L. & Middelboe, M. (2002). Stability of bacterial and viral community compositions in
Danish coastal waters as depicted by DNA fingerprinting techniques. Aquatic Microbial
Ecology, 27: 219-232.
Robert, M., Cambrier, P., Juste, C. (1994). Conditions de lutilisation des boues de stations
dpuration en agriculture. Cahiers Agriculture. 3 :285-294
Sahlstrom, L., Aspa, A., Bagge, E., Tham,M. L. D., Albihn, A. (2004). Bacterial pathogen
incidences in sludge from Swedishsewage traitement plants. Water Res. 38: 1989-1994.
Samantamaria, J., Toranzos, A.G. 2003. Enteric pathogens and soil: a short review. Int Micobiol.
6: 5-9.
Stephen, J.R., Kowalchuk, G.A., Bruns, M.-A.V., McCaig, A.E., Phillips, C.J., Embley, T.M.,
Prosser, J.I. (1998). Analysis of beta-subgroup Proteobacterial ammonia oxidizer populations
in soil by denaturing gradient gel electrophoresis analysis and hierarchical phylogenetic
probing. Appl. Environ. Microbiol. 64, 2958 2965.
.
Stephen, J.R., Chang, Y.-J., Macnaughton, S.J., Kowalchuk, G.A., Leung, K., Flemming, C.A.,
White, D.C. (1999). Effect of toxic metals on indigenous soil b-subgroup proteobacterium
ammonia oxidizer community structure and protection against toxicity by inoculated metal-
resistant bacteria. Applied and Environmental Microbiology 65, 95101.
Teske, A.,Elm, E., Regan, J. M., Toze, S., Rittmann, B.E. & Stahl, D.A. (1994). Evolutionary
relationships among ammonia and nitrite oxidizing bacteria. J Bact., 176: 6623-6630.
Wagner, M., Rath G., Amann R., Koops H.P., Schleifer K.H. (1995). In situ identification of
ammonia oxidizing bacteria. Syst. Appl. Microbiol. 18: 251-264.

47
Watson, SW., Bock E., Harms H., Koops H.P., Hooper A.B. (1989). Nitrifying bacteria, pp. 1808-
1834. In J. T. Staley, M. P. Bryant, N. Pfennig, J.G. Holt (ed), Bergeys manual of systematic
bacteriology, vol. 3. The Willams and Wilkins Co., Baltimore, Md.
Weisburg, W.G., Barns, S.M., Pelletier, D.A., Lane, D.J. (1991). 16S ribosomal DNA
amplification for phylogenetic study. Journal of Bacteriology 173, 697703.
Zaleski, K. J., K. L. Josephson, C. P. Gerba, and I. L. Pepper. (2005). Survival, growth, and
regrowth of enteric indicator and pathogenic bacteria in biosolids, compost, soil, and land
applied biosolids. J. Residuals Sci. Technol. 2:4963.

48
Annexe1 : Composition des solutions

Le bouillon Rappaport Vassiliadis


Composition chimique en g/l
Peptone de Soja : 4,5
Chlorure de sodium : 7,200
Chlorure de magnsium : 13,58
Vert malachite : 0,036
Phosphate mono potassique : 1,260
Phosphate di potassique : 0,180
pH final : 5,2 2
Prparation
Dissoudre 26,8d de poudre dans 1 l deau distille ou deau physiologique. Faire bouillir si
ncessaire pour la dissolution. Repartir dans les tubes et striliser lautoclave 121 pendant
15mn.
Kli-Gler Hajna
Protose peptone 20,0
Chlorure de sodium 5,0
Extrait de levure 3,0
Sulfate de fer 0,2
Thiosulfate de sodium 0,3
Lactose 10,0
Glucose 1,0
Rouge phnol 0,024
Agar 11,0
pH final 7,4 0,2 25
Preparation
Suspendre 53,5g dans 1l deau distille. Chauffer jusqu dissolution complte rpartir dans
les tubes et striliser lautoclave 121 pendant 15 mn

Bouillon Muller Kauffman


Composition chimique en g/l
Sels biliaires 4,78

I
Extrait de viande 4,30
Peptone de casine 8,60
Chlorure de sodium 2,60
Carbonate de calcium 38,7
Sulfate de sodium anhydre 30,5 (*1)
pH final 8,0 0,2 25
(*1) quivaut 47,80 g/l de thiosulfate de sodium
Prparation
Dissoudre 22,4g dans 250 ml deau distille strilise
Ajouter dans chaque tube :
20 ml de bouillon MKTTn
5g diodure de potassium
4g diode
10 ml de supplment slectif au vert brillant et Novobiocine.
TCBS glose
Composition chimique en g/l

Extrait de levure 5,0


Peptone 10,0
Citrate de sodium 10,0
Thiosulfate de sodium 10,0
Oxgall 8,0
Sucrose 20,0
Chlorure de sodium 10,0
Citrate de fer 1,0
Bleu de Thymol 0,04
Bleu de Bromothymol 0,04
Agar 15,0
pH final 8,4 0,2 25
Prparation
Suspendre 89,1g dans 1l deau distille. Porter bullition jusqu dissolution complte.
Ne pas autoclaver
Glose HEKTOEN

II
Composition chimique en g/l
Protose peptone 12,0
Lactose 12,0
Extrait de levure 3,0
Sels biliaires 9,0
Saccharose 12,0
Chlorure de sodium 5,0
Salicine 2,0
Thiosulfate de sodium 5,0
Citrate dammonium ferrique 1,5
Fuchsine acide 0,1
Bleu de Bromothymol 0,065
Agar 14
pH final 7,5 0,2 25
Prparation

Suspendre 75,5 g dans 1l deau distille. Porter bullition jusqu dissolution complte.
Ne pas autoclaver

GELOSE NUTRITIVE

Composition chimique en g/l :


Peptone 5,0
Extrait de viande 3,0
Agar 15,0
pH final 7,0 0,2
Prparation :
Suspendre 23g dans 1l deau distille. Porter bullition jusqu dissolution complte,
striliser lautoclave pendant 15 mn 121.

III
Eau Peptone Tamponne
Composition chimique en g/l :
Tryptone 10,0
Chlorure de sodium 5,0
Phosphate disodique anhydre 3,5
Dihydrognophasphate de potassium 1,5
pH final 7,0 0,2 25
Prparation
Suspendre 20,2 g dans 1l deau distille. Chauffer jusqu dissolution totale. Repartir la
solution dans les tubes et striliser lautoclave 121 pendant 15 mn.
ANNEXE 2
Prparation des solutions dextraction dADN
Tampon de lyse: 0.25M NaCl ; 0.1 M EDTA ; pH 8
Peser 1.461 g de NaCl (MM= 58.44) et ajouter 20 ml dEDTA pH 8 (ou peser 3.722g
dEDTA et ajuster le pH 8).

CTAB 2% Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide: 1.4M NaCl; 0.1 M EDTA ; 2% CTAB

Peser 8.18g de NaCl et 3.722 g dEDTA, faire dissoudre dans de leau distille.

Complter 100 ml avec de leau distille. Filtrer 0,2 m. Ajouter 2g de CTAB. Autoclaver

Conserver la temprature ambiante.

PEG 8000 40%

Peser 10 g de PEG (PolyEthylne Glycol). Ajouter environ 10 ml deau progressivement car le


volume augmente quand le CTAB se dissout. Complter 25 ml. Conserver 4C.

Actate de potassium 5M :

Peser 49.07g de KAc (MM =98.14); faire dissoudre dans de leau distille. Complter 100
ml. Filtrer 0,2 m. Conserver 4C.

Actate dammonium 2,5M :

Peser 19.27g de NH4 Ac (MM=77.08), faire dissoudre dans de leau distille. Complter
100 ml. Filtrer 0.2 m. Conserver 4C.

TE (Tris-EDTA) 1X :

Tris-HCl 10 M

IV
EDTA 1 mM

Ajuster le pH 8,5

EDTA : Ethylene Diamine Tetra Acetique acide.

Autres solutions

Bleu de charge 10 X

Bleu de bromophnol 0,25% (p/v)

Glycrol 30%

EDTA 10 mM

H2O qsp

A utiliser au 1/10me

Tampon TBE (Tris-borate) 10X

Tris-base 121 g

Na2EDTA, H2O 18,51 g

Acide borique 55g

H2O qsp 1 litre

Filter, striliser lautoclave

BET (Bromure dthidium): Solution 1 mg.l-1

Tampon TAE 50X

Tris-base 242.2g

Na2EDTA (pH8) 18.51g

Acide actique glacial 57.1 ml

H2O qsp 1 litre

V
Solutions pour gel 8% dacrylamide/Bis-acrylamide 40%

Ractifs Dnaturants
Dradients 45% 70%
acrylamide/bis 40% 20 ml 20 ml
TAE 50 X (ml) 2 ml 2 ml
Formamide (ml) 18 ml 18 ml
Ure (g) 18,9 g 29,4 g
Glycrol 2% 2%
Qsp H2O 100 ml

ANNEXE 3: Procdure dExtraction dADN

Lextraction de lADN total du sol est ralise sur un chantillon d sol broy et sch.

Lyse physique : 0,5g de sol est mis en prsence de billes de zirconium striles (0,1
mm) et 1 ml de tampon de lyse (NaCl 0,25 M et EDTA 0,1 M, pH8) filtr et strilis. On
alterne 2 fois 2 minutes de lyse physique laide de lagitateur beadbetter (25 tours/sec) et 2
minutes dincubation au bain-marie 65C. Lchantillon est ensuite centrifug 15 min
13000 g 4C et lon rcupre le surnageant.

Prcipitation: LADN est prcipit avec lactate de potassium 5 M (75 l) auquel on


ajoute 250 l de PEG 8000 40%, qui permet dalourdir lADN (les volumes indiqus sont
pour 600 l de surnageant), pendant au moins 1 h 20C. Lchantillon est ensuite
centrifug 15 minutes 4C 13000 g.

Purification CTAB: On jette le surnageant et lon ajoute au culot 600 l de CTAB 2%


(1,4 M NaCl ;0,1 M EDTA; 2% CTAB). On laisse incuber 65C en mlangeant toutes les
deux (2) minutes jusqu ce que le culot soit entirement dissout. Le CTAB fait prcipiter les
polysaccharides.

Extraction: On ajoute 600 l de chloroforme, aprs agitation du mlange, on spare


les phases par centrifugation 13 000g pendant 10 minutes et temprature ambiante. Ainsi
on distingue une phase aqueuse surnageante contenant les acides nucliques en solution, une
phase organique au fond du tube et linterface un gteau de protines prcipites. On
recueille la phase aqueuse.

Prcipitation: LADN est prcipit par 600 l disopropanol : on mlange et on laisse


incuber 15 min -20C. Lchantillon et ensuite centrifug 15 min 13 000g.

VI
Pr-purification: On jette le surnageant, le culot est remis en suspension par 450 l
dactate dammonium (2,5M), et on ajoute 1 ml dthanol absolue. On laisse prcipiter 15
min 20C puis on centrifuge (15 min 13 000g).

Lavage: On ajoute 0,5 ml dthanol 70C et lon centrifuge nouveau 13 000g


pendant 5 min. On jette le surnageant et on vapore le culot sous vide.

Rcupration de lADN: LADN extrait est resuspendu dans un volume variant entre
10 et 50 l de tampon TE 1X suivant la taille du culot dADN. LADN est enfin conserv
20C avant toute utilisation

Quantification de lADN.

Il sagit de connatre la concentration en ADN dans chaque chantillon, afin de


dterminer la mme quantit apporter pour lamplification par PCR.

Sur un gel dagarose 2% on fait migrer 5 l dchantillon mlangs avec 3 l de bleu de


charge ainsi 10 l de chacun des gammes-talons. Les gammes-talons sont des ADN dont les
concentrations sont connues:

G1 : 6,25 ng dADN dans 10 l

G2 : 12,5 ng dADN dans 10 l

G3 : 25 ng dADN dans 10 l

G4 : 50 ng dADN dans 10 l

G5 : 100 ng dADN dans 10 l

G6 : 200 ng dADN dans 10 l

Aprs coloration au bromure dthidium (BET 1g/ml), la concentration en ADN de nos


extraits est ensuite dtermine grce au logiciel TotalLab.

Composition de la Taq ready-to-go pour un volume final de 25 l

Taq DNA polymrase 2,5U

VII
DNTP 200 M

Tris-HCl 10 mM, pH 9

KCl 50 mM

MgCl2 1.5 mM

BSA

ANNEXE 4 : PREPARATION DGGE

Prparation du gel

- Mesurer 30 ml de low lprouvette et le verser dans le tube Falcon low

- Mesurer 30 ml de high avec la mme prouvette et le verser dans le tube Falcon high
Mettre 500 l de Bleu dans le high (cest le low qui vient diluer le high)

- Mettre 60 l de TEMED dans chaque tube

- Vrifier que le robinet de la pompe gradient est ferm

- Mettre 120 l dAPS dans le low (la polymrisation commence) et verser dans le
compartiment de gauche

- Ouvrir lgrement le robinet pour faire partir la bulle cre suite au versement du low

- Mettre 120 l dAPS dans le high et verser dans le compartiment de droite

- Allumer la pompe et attendre que le mnisque du high soit lgrement sous celui du low
puis lentement ouvrir le robinet de communication

Coulage du gel

Le coulage du gel se fait laide dune aiguille de seringue fixe au bout dun tuyau

- Laisser couler quelques gouttes, arrter la pompe, placer laiguille au milieu entre les 2
plaques et remettre la pompe en marche.

- Surveiller pendant que le gradient se forme (dure 10 min) pour prvenir les ventuelle
fuites.

- Rincer les 2 tubes Falcon, laisser les autres solutions porte de main dans la glace au cas
o il y aurait un problme.

- Une fois le gel coul, chasser les bulles dair en le soulevant puis en replaant tout
doucement le peigne.

VIII
- Laisser polymriser 1 heure

- Rincer la pompe abondamment et la dmonter.

Prparation des chantillons dposer

- Sortir les produits PCR (stocks -20C)

- Ajouter le bleu de charge spcial DGGE aux chantillons (15 l pour 25 l), afin de les
alourdir et de visualiser le front de migration.

- Conserver 4C avant de dposer.

Prparation de lappareillage

- Desserrer les vis de lappareil.

- Pousser fort lespaceur vers le bas pour librer lespace et laisser passer le tampon qui devra
tre en contact avec le gel.

- Resserrer doucement les vis sans craser le gel

- Placer le support dans la cuve en linclinant pour chasser les bulles dair sous le gel

- Placer llectrode rouge droite, la noire gauche, mettre le bouton sur jaune Low Voltage

- Fixer le tuyau en silicone la cuve

- Mettre le bouton rond de la pompe (sur le ct) sur la position ouvert , attendre que la
cuve se remplisse et le remettre sur ferm

- Vrifier que le niveau de tampon est INGENY phorU2

- Retirer le peigne tout doucement

- Rincer les puits avec la pipette (P 100) afin dliminer les traces dacrylamide (2 3fois)

- Remettre les puits droits avec le cne de la pipette.

Dpt des chantillons

- Centrer les chantillons au milieu du gel pour viter au maximum les effets de bord,
mlanger chaque chantillon avant de le dposer dlicatement

- Dposer marqueurs de chaque ct et bleu de charge dans les puits des extrmits

- Placer le couvercle de la cuve, brancher les lectrodes au gnrateur (position 3), mettre
meter selector sur 3 et le bouton vert 3 sur 100 Volts.

IX
- Mettre le boulon sur rouge High voltage HV

- Au bout de 10 15 minutes, mettre la pompe en route.

Migration

18 heures 100 Volts, temprature du TAE (1 X) 60C.

Rcupration du gel

- teindre lappareil, le gnrateur, dbrancher les lectrodes et le tuyau en silicone

- Sortir lappareil en le vidant

- Dvisser et sortir les plaques en soulevant par lespaceur, les placer dans le bac BET rempli deau

- Enlever la petite plaque, puis lespaceur

- Couper le ct du gel o lon a commenc dposer (en haut droite)

- Faire des mouvements de vague pour dtacher le gel, puis enlever la grande plaque

Coloration

- Placer trs dlicatement le gel dans un bac contenant du SYBR GREEN (1/20).

- Laisser colorer 30 minutes sous agitation

- Sortir le gel, le mettre dans leau et laisser sous agitation pendant 10 min

Prise de la photo du gel

- Sortir le gel et le placer sous la lampe UV

- Ouvrir le Logiciel BIOCAPT

- Mettre au point, cliquer sur temps dintgration puis sur arrt acquisition pour
prendre la photo, annoter la photo, enregistrer et imprimer.