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Utilisation de la méthode Premi-test pour la détection de résidus

antibactériens dans la viande de lapins : choix du muscle, étude de l’effet


temps/congélation, comparaison des méthodes d’extraction des jus à
température ambiante ou après passage au bain-marie.

S. BOUCHER1, E. BOUSQUET2, B. ARMANGE2, J.M. FABRE3


1
LABOVET CONSEIL (Réseau Cristal) - BP 539 85505 Les Herbiers Cedex, France
2
VIRBAC France – 13e rue LID – 06517 CARROS Cedex, France
3
PHYLLUM - Buroparc III - Rue de la Découverte - 31675 LABEGE Cedex, France

Résumé. La méthode Premi®Test n’est pas très employée pour les viandes de lapins et quelques interrogations
demeurent :
- Quelles pièces anatomiques peuvent être prises comme échantillon représentatif ?
- Quelles sont les meilleures techniques d’extraction des jus pour obtenir des échantillons représentatifs ?
- Quel est l’effet de la congélation sur la conservation de certaines molécules ?
Les auteurs analysent par Premitest ou HPLC la viande de lapins traités ou non avec une association de TMP
Sulfadiméthoxine ou d’oxytétracycline. Ils montrent que la détection est indépendante du morceau choisi, que
pour des raisons de protocole, il est possible de laisser la viande décongeler à température ambiante ou de la
décongeler au bain-marie sans altérer les résultats de l’essai et qu’on ne note pas de différences significatives
lorsque l’analyse est réalisée après 18 semaines de congélation à -20°C.
Abstract. Utilisation of the Premi-test method to detect antibacterial residues in rabbit meat: choice of the
muscle, study of the effect time/freezing, comparison of the juices extraction methods at ambient
temperature or after water-bath. The Premi®Test method is not frequently used for rabbit meat, and
unanswered questions remain:
Which piece can be considered as representative samples?
Which are the best techniques of juice extraction to obtain representative samples?
What is the effect of freezing on the preservation of some molecules?
The authors analyse by Premitest or HPLC the meat of rabbits that have either been treated or not with an
association of TMP Sulfadiméthoxine or oxytétracycline. They show that detection is independent of the piece
chosen, that for practical reasons it is possible to let the meet de-freeze either at ambient temperature or to water
bath without affecting the results, and that no significant difference is recorded when the analysis is conducted
after 18 weeks of freezing at -18°C.
Introduction nés de mères non traitées. Ils recevaient une
®
La méthode Premi Test est une méthode officielle alimentation et une eau de boisson sans antibiotique.
(DGAL / SDRRCC/N2006-8240) de détection des Trois lots d’animaux étaient constitués : 2 animaux
antibactériens dans les jus de viande dans de "blancs" (sans traitement), 8 animaux avec un
nombreux pays (Okerman 1998, Beverley 2001, Fabre traitement A (Oxytétracycline) et 8 avec un traitement
2003, Stead et al. 2005). Elle est très employée pour B (Triméthoprime et Sulfadiméthoxine). Les animaux
le bovin, le porc, les volailles (Fabre et al. 2004) et traités étaient abattus par groupe de 2 à différents
parfois utilisée sur la viande de lapins. Cependant, la stades après le dernier traitement.
composition de cette viande et sa faible jutosité nous 1.2. Premitest.
ont amenés à procéder à quelques essais pour La méthode Premi®Test est normée (certificat
connaître les limites de détection du test sur les AFNOR : DSM-28/1-06/06) (Gaudin et al. 2006,
viandes de lapin. Gaudin et al. 2008). Le test consistait à extraire 100
Le protocole proposé devait permettre de répondre à microlitres de jus de viande mis à incuber avec des
trois questions : géloses et un indicateur coloré bleu contenant des
Quelles pièces anatomiques peuvent être prises Bacillus stearothermophilus pendant 20 mn. Après
comme échantillon représentatif d’un animal ? rinçage, l’ensemble ainsi qu’un témoin négatif étaient
Quelles sont les meilleures techniques d’extraction placés à 64°C pendant quelques heures ce qui
des jus ? permettait de tuer les autres bactéries non résistantes à
Quel est l’effet de la congélation sur la conservation la chaleur. Un témoin négatif était réalisé à partir de
de certaines molécules ? jus de viande de lapin élevé spécifiquement sans
antibiotique. Dès que le virage coloré du témoin
1. Matériel et méthodes négatif était fait (la gélose devenait jaune), on pouvait
1.1. Animaux. lire l’ensemble à l’aide d’un Premi®Scan, afin de
Il s’agissait de lapins de chair conventionnels de s’affranchir des aléas liés à la vision humaine (Stead
souche Hycole jamais traités avec des antibactériens, et al. 2005). Le test a une sensibilité pour

13èmes Journées de la Recherche Cunicole, 17-18 novembre 2009, Le Mans.


l’oxytétracycline de 200 à 400 ppb (Limite Maximale chromatographie en semaine S18 sont envoyés pour
de Résidus – LMR 100 ppb) et de 25 - 50 ppb pour la réaliser les analyses, dès réception. Le test statistique
sulfadiméthoxine (LMR 100 ppb) (Braham 2001, choisi est le test de Khi2.
Geijp et al. 2009, Stead et al. 2009). Toutes les
2. Résultats
analyses en chromatographie (HPLC) ont été confiées
pour cet essai au Laboratoire Départemental de la 2.1. Résultat en fonction du lieu de prélèvement.
Vendée. Que l’on prenne le côté droit ou le côté gauche du
1.3 Protocole. lapin, on ne note pas d'effet « côté prélevé »
significatif (figures 2 et 3, Khi 2 = 0,72 ddl = 1).
Un lot de 8 animaux reçoit un traitement A à base
d’oxytétracycline injectable avec une galénique Figure 2. Différences selon le côté choisi
« longue action » (Terralon® : SC, 0.5ml/kg PV, soit
100 mg de matière active/Kg PV). Un autre lot de 8
animaux reçoit un traitement B à base de Gauche 50 26
Positifs
sulfadiméthoxine et de triméthoprime injectable Négatifs
(Bactotryl® : SC, 0.125ml/kg PV soit 23,34 mg de
Droit 52 24
sulfadiméthoxine et 5 mg de triméthoprime/Kg PV). 0 10 20 30 40 50 60 70 80
Les animaux sont traités le premier jour de la semaine
S1 (Semaine 1) à l’âge de 10 semaines. 2 lapins sans De même, on ne note pas d'effet lieu du prélèvement
traitement depuis au moins un mois sont sélectionnés. significatif (Khi2 = 0,96 ddl = 1) si on teste les
2 animaux traités avec un médicament donné sont différences éventuelles entre « morceaux » analysés
abattus (électronarcose et saignée) à des temps allant (figure 3).
de 2h, 24h, 48h, 72h, 96h ou 192 h après la fin du Figure 3. Résultat selon le « morceau » prélevé
traitement. Les animaux ont été découpés 3 heures
maximum après l’abattage. Sur chaque animal, on a
Rable 25 13
prélevé 6 morceaux de râble, 4 de cuisse, 2 des pattes
avant et 2 de l’abdomen (figure 1). Patte avant 24 14
Positifs
Figure 1. Notation des différents morceaux découpés Cuisse 28 10
Négatifs

Abdomen 25 13

0 10 20 30 40

2.2. Résultat en fonction de la préparation des


échantillons (figure 4 et 5).
Figure 4. Résultats après bain-marie en fonction du
délai avant abattage

10

6 Négatifs

4 Positifs
Tous les échantillons sont emballés séparément quand
2
la carcasse est refroidie (minimum 4 heures après
abattage) puis congelés. Les carcasses sont 0
Blancs 2h 24 h 48 h 72 h 96 h 192 h
accompagnées du numéro d’identification du lapin et
ne sont découpées que l’une après l’autre pour éviter
tout mélange. Les sachets sont identifiés au fur et à
mesure de l’ensachage. Figure 5. Résultats à température ambiante en
Les prélèvements sélectionnés sont analysés après fonction du délai avant abattage
décongélation au bain marie à 65°C sur certains
échantillons et après avoir laissé décongeler les 10

viandes à température ambiante sur d’autres pièces 8


anatomiques de même origine. Le jus est extrait par 6 Négatifs
pressage dans les deux cas. Tous les échantillons 4 Positifs
congelés à -20°C prévus pour l’analyse en
2
chromatographie en semaine S1 sont envoyés au
0
laboratoire qui réalise les analyses dès réception. Tous Blancs 2h 24 h 48 h 72 h 96 h 192 h
les échantillons congelés à -20 °C et gardés congelés
18 semaines, prévus pour l’analyse en

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Lorsqu’on compare les résultats après traitement des Figure 8. Résultats S1 après traitement tétracyclines
viandes au bain marie ou à température ambiante, on en fonction du délai avant abattage
les trouve comparables (Khi 2 = 0,63 / ddl = 1). On
note 34% de positifs en « Bain marie » et 37% en
20
"Température ambiante". Il n’y a aucune différence
15
significative sur les échantillons "extrêmes" et un peu Négatifs
10
plus de positifs à 48h en "température ambiante". Positifs
5
2.3. Résultat en fonction du temps de congélation 0
pris en compte (figures 6 et 7). 2h 24 h 48 h 72 h 96 h 192 h

Lorsqu’on compare avec la méthode HPLC les


résultats obtenus en semaine 18 après congélation
pour les deux traitements, on note que les cinétiques Figure 9. Résultats S1 après traitement sulfamides en
sont satisfaisantes ce qui fait de ce test une bonne fonction du délai avant abattage
référence pour l’analyse des échantillons en
Premi®Test. 20
Figure 6. Résultats HPLC semaine 18 après 15
traitement tétracyclines en fonction du délai avant N égat if s
10
abattage Po sit if s
5
0
100000
2 h 24 h 48 h 72 h 9 6 h 19 2 h
10000

1000

100 Figure 10. Résultats S18 après traitement


10
tétracyclines en fonction du délai avant abattage
1
2h 24 h 48 h 72 h 192 h
5
4
3 Négatifs
Figure 7. Résultats HPLC sem 18 après traitement 2 Positifs
sulfamides en fonction du délai avant abattage 1
0
100000 2h 24 h 48 h 72 h 96 h 192 h

10000

1000 Figure 11. Résultats S18 après traitement sulfamides


100 en fonction du délai avant abattage
10
5
1
4
2h 48 h 96 h 192 h
3 Négatifs
2 Positifs
1
Les Premi®Test réalisés en semaine 1 (sans période 0
de congélation) après préparation au bain marie 2h 24 h 48 h 72 h 96 h 192 h
(figure 8 et 9) peuvent être comparés aux Premi®Test
réalisés après 18 semaines de congélation après
préparation au bain marie également (figure 10 et 11).
On note alors des résultats identiques à ceux obtenus 2.4. Comparaison entre Premi®Test et HPLC en
en frais pour les points suivants : S18 (tableau 1 et 2).
- Aucun négatif 2 h après traitement Lorsqu’on compare la méthode Premi®Test et la
- Aucun positif 192 h après traitement chromatographie à partir des échantillons gardés
Bien qu’on ait l’impression pour les sulfamides qu’il congelés jusqu’en semaine 18 et qu’on les analyse
y a un peu plus de positifs après congélation longue après décongélation au bain marie (tableau 1 et 2), on
durée, et inversement pour les tétracyclines il n’y a ne note aucun négatif 2 heures après traitement ce qui
pas de différence significative (Khi 2 = 0,32 / ddl = 1) fait de Premi®Test un bon outil de détection des
et pas de différence sur les extrêmes. animaux en cours de traitement. Nous n’avons pas
non plus de positif 192 h après traitement ou lorsque

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les lapins reçoivent un aliment « blanc », ce qui nous protocole, il est possible de laisser la viande
amène à écrire qu’il n’y a pas de faux positifs en décongeler à température ambiante ou de la
Premi®Test dans les conditions testées. Certains décongeler au bain-marie sans altérer les résultats de
animaux ont des taux de résidus de tétracyclines l’essai. En outre, on ne note pas de différence
supérieurs aux LMR et ne sont pas détectés en significative lorsque l’analyse est réalisée après 18
Premi®Test. La limite de sensibilité du Premi®Test semaines de congélation. Mais, si cette méthode
est supérieure à la LMR pour cette molécule. bactériologique globale est peu onéreuse, elle ne peut
Tableau 1. Comparaison entre Premi®Test et HPLC être envisagée que comme une première approche,
en S18 pour les tétracyclines qualitative et non quantitative. En effet, pour
déterminer avec assurance les teneurs en antibiotiques
Oxytétracycline 2h 24h 48h 72h 192h Blanc et leur nature dans une viande donnée, il est
+ 4 4 0 0 0 0 nécessaire de l’analyser par HPLC.
Premi
Références
test - 0 4 4 2 4
0 BEVERLEY, S, SHARMAN M. 2001. Improvement to the
screening of antimicrobial drug residues in food by the use
>LMR 2 2 2 2 0 0 of Premi®Test. Vet. Sci. : Vol. 70 – Avril.
<LMR 0 0 0 0 2 2 BRAHAM, R., BLACK, W. D., CLAXTON, J., AND YEE, A. J., 2001,
HPLC A rapid assay for detecting sulfonamides in tissues of
1190 5952 1310 slaughtered animals. J. Food Protection, 64, 1565–1573.
428/
valeurs 5/15 /257 /119 <20 <25 FABRE, J.-M. 2003. Des Méthodes de recherche
593
000 1 1 d'antibiotiques dans la viande se développent en France.
La Semaine Vétérinaire °1105, Juillet P 25 26
Tableau 2. Comparaison entre Premi®Test et HPLC FABRE, J.-M.; MIRCOVICH, C.; MORETAIN, E. G. J.-P.;
en S18 pour les sulfamides BENETEAU, E.; MARTINEAU, G.-P. 2004. Résidus
d'antibiotiques dans la viande de porc et de volaille en
Sulfadiméthoxine 2h 48h 72h 192h Blanc France: situation actuelle et évaluation d'un nouveau test
Premi positif 4 2 0 0 0 de détection. Bulletins des GTV, janvier février, p 21
test négatif 0 4 4 4 4 GAUDIN V., FABRE J-M., RAULT A. 2006. Validation AFNOR
des méthodes alternatives d’analyse – Application à la
HPLC >LMR 2 2 0 0 0 détection des résidus d’antibiotiques et autres molécules
<LMR 0 0 2 2 2 à effet antibactérien dans les produits agroalimentaires
valeurs 6712/ 254/7 33/87 <20nd Rapport d’étude préliminaire pour la validation AFNOR du
5870 18 Premi Test® Code d’étude : VV - Février
GAUDIN V., JUHEL-GAUGIN M., MORETAIN JP., SANDERS
3. Discussion P., 2008. AFNOR validation of PremiTest, a
microbiological-based screening tube-test for the
A l’issue de ces essais, l’objectif est de disposer d’un detection of antimicrobial residues in animal muscle
ensemble de recommandations opérationnelles et de tissue. Food Additives and Contaminants, Vol. 25, No.
modes opératoires pour la mise en œuvre la plus 12., pp. 1451-1464.
performante possible du Premi®Test sur les viandes GEIJP EML., DE BRUIJN FMP., DE GOEIJEN F., STARK J., 2009.
de lapin. Dans l'ensemble, les résultats apparaissent Determination of residues in spiked samples and incured
très cohérents. Le Premi®Test donne de bons tissue using the Premi®test. Site www.dsm.com consulté
en mai 2009.
résultats, indépendants du lieu de prélèvement, de la
OKERMAN, L., DE WASCH, K., AND VAN HOOF, J., 1998,
méthode de préparation des échantillons congelés ou Detection of antibiotics in muscle tissue with
de la durée de conservation des échantillons congelés. microbiological inhibition tests : effects of the matrix.
Par rapport à la chromatographie, on ne note aucun Analyst, 123, 2361–2365.
faux positif. Cependant, dans les conditions de l’essai, STEAD S. L., SHARMAN M., STARK J, GEIJP E.M.L. 2009.
il existe une sensibilité du Premi®Test à des seuils Improvements to the Screening of Antimicrobial Drug
Residues in Food by the use of the PremiTest Site
plutôt supérieurs à la LMR pour certains www.dsm.com consulté en mai 2009.
antibiotiques, notamment, dans notre essai, pour
STEAD S., RICHMOND S.,SHARMAN M., STARKJ. GEIJP E. 2005.
l’oxytétracycline (Stead et al. 2004). Toute analyse A new approach for detection of antimicrobial drugs in
Premi®Test à titre libératoire des viandes de lapins food Premi®Test couples to scanner technology.
abattus doit donc être confirmée par dosage HPLC. Analytica Chimica Acta, 529 p83-88
STEAD S., SHARMAN M., TARBIN J.A., GIBSON E., RICHMOND S.,
Conclusion
STARK J., GEIJP E. 2004. Meeting maximum residue limits:
Le Premi®Test est un test facile à mettre en œuvre. Il an improved screening technique for the rapid detection of
a toute son utilité dans la détection de lapins en cours antimicrobial residues in animal food products. Food
Additives and Contaminants, Vol. 21, No. 3, p216–221
de traitement. La détection semble indépendante du
morceau choisi pour le test. Pour des raisons de

13èmes Journées de la Recherche Cunicole, 17-18 novembre 2009, Le Mans.