Estimation de la

biodiversité
microbienne
BIO2405 – TP – 11 Mars 2019
Démo Naíla Barbosa da Costa
(naila.barbosa.da.costa@umontreal.ca)

Source: https://www.dunyaatlasi.com/bakteri-nedir-yapisi-nasildir-cesitleri-nelerdir/
Qui est là ?
Photo: Marek Okon
Qui est là ?
Photo: Nuno Antunes
Qui est là ?
Photo: Patricia Coroi
Qui est là ?

Source: https://www.bbc.com/news/technology-42251421
Qui est là ? Une question de biodiversité
• Combien d’espèces ? Quelles espèces ?
• Combien d’individus par espèce ?
Qui est là ? Une question de biodiversité
• Combien d’espèces ? Quelles espèces ?
• Combien d’individus par espèce ?

Macroorganismes: on les compte !

Qui est là ? Une question de biodiversité
• Combien d’espèces ? Quelles espèces ?
• Combien d’individus par espèce ?

Macroorganismes: on les compte ! Microorganisme: on les séquence !

ATG
Et comment faire ça ?
• Si on a une communauté diverse (pas une culture asénique), il faut
isoler les différentes espèces avant ou après le séquençage d’ADN
Avant le séquençage : cultiver ou pas cultiver ?

Bottleneck (-99%)

Parks D. 2017 Nature Microbiology: Behind the paper.

 Méthodes indépendantes de la cultivation

● La première étape c’est l’extraction de l’ADN total

Extraction
 Méthodes d’isolation d’espèces de bactérie
• Isolation avant séquençage (de Sanger)
• Community fingerprinting
• DGGE (Électrophorèse sur Gel en Gradient Dénaturant)
• RFLP (Polymorphisme de Longueur des Fragments de Restriction)

accuracy-in-next-generation-sequencing-ngs/
https://www.thermofisher.com/blog/behindthebench/what-is-
Méthodes d’isolation d’espèces de bactérie
• Isolation après séquençage (de Nouvelle Génération, ou NGS)
• Bioinformatique
• Estimer des OTUs (Operational Taxonomic Units): clusters de 97% d’identité, peuvent inclure des
erreurs de séquençage
• Récupérer des ASVs (Amplicon Sequence Variants), séquences identiques, les erreurs de
séquençage sont estimés auparavant

https://www.thermofisher.com/blog/behindthebench/what-is-accuracy-
in-next-generation-sequencing-ngs/
 Qui est là ? Comment le savoir ? ATG

• Il faut amplifier par PCR un gène présent dans tous les organismes étudiés
• Gène conservé dans chaque espèce, mais avec des régions variable à travers
les espèces

&
 ATG
Par exemple: le gène ARNr 16S
• Sous-unité de l’ARNr, avec des régions variables et préserves (où les
amorces se lient)

23S

16S
http://biologianet.uol.com.br/biologia-celular/ribossomos.htm
 ATG
Autres exemples…
• Pour les microorganismes eucaryotes
• Le ITS (Internal Transcribed Spacer) – champignons
• Le gène de la sous-unité 18S d’ARNr
• Le COI (cytochrome c oxidase I) de l’ADN mitochondrial

http://www.emforma.net/11966-mitocondria

28S

18S
https://www.istockphoto.com/ca/illustrations/algae-
cell?sort=mostpopular&mediatype=illustration&phrase=algae%20cell

http://biologianet.uol.com.br/biologia-celular/ribossomos.htm
 Qui est là ? Une question de biodiversité
• Combien d’espèces ? Quelles espèces ?
è le gène ARNr 16S nous dit !

• Combien d’individus par espèce ?

è comme on a fait une PCR, on estime l’abondance relative, basé sur
le nombre des copies du gène ARNr 16S

23S

16S
http://biologianet.uol.com.br/biologia-celular/ribossomos.htm
Qui est là ? Une question de biodiversité
• Biodiversité alpha
• Estimation de diversité à chaque échantillon (e.g. nombre d’espèces)
• Index de Shannon (H) : considère le nombre d’espèces à chaque échantillon et
l’équitabilité spécifique (abondance différentielle d’individus chez chaque espèce)

1 2

H1 > H2
Qui est là ? Une question de biodiversité
• Biodiversité beta
• Variation dans la composition de la communauté entre les différents échantillons
• Variation temporelle ou spatiale

1 2 1 2

Jour 1 Jour 10

La diversité beta a augmenté avec le temps

 Allons-y aux exemples réels !

Qui est là ?

Lac salé alcalin au Pantanal brésilien (2013) – Photo Naíla

 Allons-y aux exemples réels !

Qui sont là ?

Lac salé alcalin au Pantanal brésilien (2013) – Photo Naíla Fig. 1 (Costa et al. 2016 JPR)
Qui est là ?
• Diversité de cyanobactéries
• 3 lacs salés au Pantanal brésilien
• 3 campagnes sur le terrain (2 période sèche et 1 période pluvieuse)
• ARNr 16S (séquençage de Sanger, séparation d’espèces par DGGE et RFLP)
• Comparaison avec la microscopie

10 µm
10 µm
Anabaenopsis elenkinii Arthrospira platensis
 Fév.2011 Oct.2011 Avril.2012
P10 P12 P13 P10 P12 P13 P10 P12 P13

DGGE 11
14
17 28

11B
18

Biodiversité de bandes sur

le gel DGGE: 12
52

9 19 29 38
- Saison de pluves 1 13 30
31
53
2 20 32 44 47
(oct.2011) plus diverse que 3
4 21
22
33
34
45
48
49
54
55
23 35
la saison sèche (fév.2011 et
avr.2012) 5 36
39
40
46B 50
10 15
46
- Chaque bande détachée a 6
7 16
24
25
26
37 41
42
43

été sequencée pour obtenir 8 27 51

leur identification
Gel de polyacrylamide
Sybr Gold (colorant)
Gradient 40-70%
6% dénaturant
80v, 949 min
 RFLP I1
12M11 12M12 12M13 12M14 12M15 12M16 12M17

• Chaque profil de RFLP correspond à un clone qui

correspond à une séquence d’ADN (16S) amplifié de
l’échantillon du lac A8 A8 C8 A8 E8 A8 F8=B1
• Les clones différents sont séquencés (Sanger), et on
estime la biodiversité alpha
• Une autre fois, j’ai confirmé que la saison sèche a
Id après séquençage:
été la moins diverse 12M18 12M19
12M1 – Nithzchia thermalis
12M4 – Synechococcus sp.
12M9 - Nithzchia frustulum
A8 C8 12M13 - uncultured cyano.
12M15 - Nithzchia thermalis
12M17 - Anabaenopsis
elenkinii
 La microscopie
• Anabaenopsis et Arthrospira ont été les espèces le plus abondantes, mais on ne les ai jamais
trouvés cohabitant le même lac à la même saison
• Quand on avait la forme végétative d’une, on a trouvé seulement la forme de non-végétative
de l’autre
• Ce résultat a été possible seulement grâce à la microscopie (la séquence d’ADN n’est pas
différente entre la forme végétative ou dormante des cyanobactéries)

Forme végetative
de l’Anabaenopsis

10 µm
Hormogonium de
l’Arthrospira
 Mais il faut qu’on avance !
• La microscopie n’est pas toujours une
possibilité
• On ne peut pas voir toutes les espèces au microscope optique
• La taxonomie n’est pas facile: travail laborieux et on a besoin
des spécialistes
• Les méthodes de fingerprinting demandent du
temps
• Avec le Séquençage de Nouvelle Génération, on Chaque puit a un barcode que nous
peut traiter plus d’échantillons au même temps permettre de combiner tous les
échantillons pour séquencer
(au moins 96)
 Large Experimental Array of Ponds (LEAP)

Bassins éxperimentales
(mésocosmes) remplis avec l’eau
du Lac Hertel

http://gonzalezlab.weebly.com/leap.html Quebéc (Canada)

 Conception expérimentale

Gradient d’herbicide (RoundUp)

Dose létale
Peu d'engrais de RoundUp

Trop d'engrais

Jours de l’expérience
Jour 0 : aucunne pesticide addicioné
Jour 5 : prémier jour de traitement
Jour 33 : deuxième jour de traitement

Jour 43 : dernier jour de traitement (tous les bassins ont reçu une concentration létale de l’herbicide, sauf 2 contrôles)

11 échantillons prises pendant 8 semaines (avant, après et entre les traitements)

Résultat de l’analyse taxonomique du gène ARNr 16S

Roundup (dose létale) Treatment effect: less diversity

(+) Proteobacteria (orange)
Roundup (forte dose = (-) Verrucomicrobia (vert)
20mg L-1)
(-) Bacteroidetes (bleu)
Altération de la diversité
alpha et beta
Altération de la diversité
alpha et beta

Réduction de la diversité alpha, Premier contact avec

RoundUp en grand
différenciation par rapport à la concentration
composition précédente (↑beta)
Conclusion
• Découvrir “quels microorganismes sont là” peut être très laborieux !

• Une fois qu’on le sait, on peut explorer comment la biodiversité répond aux
divers facteurs (saisonnalité, perturbations anthropiques etc)

• En général, la biodiversité est un bon indicateur de la façon dont les espèces

sont affectées par des changements environnementaux